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一种蛋白构象病细胞模型及其应用
    【技术领域】

    本发明涉及分子生物学领域中的一种细胞模型及其应用，特别是涉及蛋白构象病细胞模型及其应用。

    背景技术

    阿尔茨海默症(Alzheimer’s Disease，AD)、亨廷顿舞蹈综合症(Huntington’s disease，HD)、帕金森运动综合症(Parkinson’s disease，PD)、肌萎缩性(脊髓)侧索硬化(amyotrophiclateral sclerosis，ALS)等蛋白构象病是一类严重影响人类生命健康的疾病，这类疾病的一个共同特征是存在关键蛋白分子如AD中的Aβ42、HD中的不同长度多聚谷氨酰胺Poly(Q)n等的不正确折叠与聚集沉淀。蛋白折叠状态是一种非直观的、无法高通量鉴定的指标，为了对其方便、快捷、高效分析，必须将它转化为一种可直观分析的指标如抗性选择、颜色指示等。

    目前针对以上蛋白构象病，虽然存在各自独特的各种各样的细胞甚至动物模型(Holcomb L，Gordon MN，McGowan E，et al.Accelerated Alzheimer-type phenotype in transgenic micecarrying both mutant amyloid precursor protein and presenilin-1 transgenes.NatureMed，1998，4：97-100；Davies SW，Turmaine M，Cozens BA，et al.Formation of neuronalintranuclear inclusions underlies the neurological dysfunction in mice transgenic forthe HD mutation，Cell 1997，90：537-548)，但缺乏一种适用以上所有蛋白构象病的一种共同的细胞模型。此外，由于AD等蛋白构象病通常都是一种多因素、退行性疾病，并且涉及到一些主观性很强的症状，因此就象肿瘤、心血管疾病一样，一种真正意义上的“精确”、“完善”的动物模型几乎是不可能的，相反针对主要病理特征分子如Aβ42肽聚集沉淀的一种通用细胞模型地建立，对于AD等蛋白构象病的致病机理的研究、防治药物的筛选与设计，具有重要意义。

    发明创造内容

    本发明的目的是提供一种建立在大肠杆菌中的研究蛋白构象病关键蛋白分子折叠规律以及适合防治药物高通量筛选的蛋白构象病细胞模型。

    本发明所提供的蛋白构象病细胞模型，是含有报导质粒的大肠杆菌，所述报导质粒含有氯霉素乙酰转移酶CAT和β-半乳糖苷酶Lac-Z的α-片段双报导基因，且所述氯霉素乙酰转移酶CAT基因或β-半乳糖苷酶Lac-Z基因α-片段的上游框内融合有不同蛋白构象病相关靶蛋白分子及其衍生物的编码基因。

    在实际操作中，所述大肠杆菌可为大肠杆菌DH5α、DH5αMCR、JM109、JM109(DE3)或HB101等菌株。

    氯霉素乙酰转移酶CAT基因(GenBank accession number：E15555)或β-半乳糖苷酶Lac-Z基因的α-片段(Ullmann A，Jacob F，Monod J，Characterization by in vitrocomplementation of a peptide corresponding to an operator-proximal segment of thebeta-galactosidase structural gene of Escherichia coli.J Mol Biol.1967，24(2)：339-43)的上游框内融合有阿尔茨海默症关键蛋白分子Aβ42或其衍生物的编码基因；也可融合有亨廷顿舞蹈症关键分子不同长度多聚谷氨酰胺Poly(Q)n，其中，n可为7-103的正整数，如Poly(Q)10的编码基因(CAG/A)10。其中阿尔茨海默症关键蛋白分子是Aβ42，其编码基因序列(GenBank accession number：BC004369)，亨廷顿舞蹈症关键分子是不同长度多聚谷氨酰胺Poly(Q)n，其编码基因序列见(GenBank accession number：L12392)。

    本发明的蛋白构象病细胞模型可应用于研究蛋白构象病，如阿尔茨海默症、亨廷顿舞蹈症、镰刀形红细胞性贫血病、疯牛病、羊瘙痒病、传染性疯貂症、人类的克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease，CJD)、新型变种CJD(vCJD)、格斯特曼综合症(GSS)、致死性家族嗜睡症(FFI)、库鲁病(Kulu)、抑丝酶(serpins)异常相关疾病(如神经抑丝酶包含体家族性脑病(FENIB))等病症的致病机理。

    本发明的蛋白构象病细胞模型也可用于筛选防治蛋白构象病药物，如筛选蛋白构象病关键蛋白分子的聚集抑制剂、可溶性突变体、生物活性多肽和小分子化合物等，特别是阿尔茨海默症关键蛋白分子Aβ42聚集仰制剂、阿尔茨海默症关键蛋白分子Aβ42的可溶性突变体、亨廷顿舞蹈症关键分子不同长度多聚谷氨酰胺Poly(Q)n聚集仰制剂、Poly(Q)n的可溶性突变体、抑制Aβ42聚集的生物活性多肽和小分子化合物和抑制Poly(Q)n聚集的生物活性多肽和小分子化合物。

    蛋白构象病细胞模型的原理如图1所示：在CAT或Lac-Z的α-小片段的N-端融合一段外源蛋白，如果融合蛋白保持可溶状态，不会影响CAT或Lac-Z的α-小片段的活性即氯霉素抗性或α互补，而一种新生肽链的正确折叠，其N-端具有至关重要的作用。在目的蛋白-CAT或目的蛋白-Lac-Z的α-小片段融合蛋白中，如果N-端目的蛋白能正确折叠，势必会带动CAT或Lac-Z的α-小片段正确折叠表现为氯霉素抗性或α互补，反之，如果N-端不能正确折叠而是形成包含体则表现为氯霉素敏感或不能进行α互补。这样，根据氯霉素抗性或α互补的出现与否，即可对目的蛋白折叠状态进行指示，并据此对目的蛋白的折叠规律进行研究。

    如果目的蛋白是不同蛋白构象病的关键蛋白分子如Aβ42或Poly(Q)n及其衍生物等，利用不同形式Aβ42-CAT或Poly(Q)n-CAT或Aβ42-α-小片段融合蛋白或Poly(Q)n-α-小片段融合蛋白中Aβ42或Poly(Q)n的折叠状态与报告基因功能之间的相关性，即可建立AD、HD蛋白构象病的细胞模型，并可利用上述模型进行AD、HD等致病机理的研究和防治药物的高通量筛选。

    本发明利用蛋白折叠(可溶性)的遗传筛选模型(赵志虎，刘萱，张经余等，军事医学科学院院刊，2001，25：264)，通过不同蛋白构象病的关键蛋白分子与双报导基因的融合表达及其可溶性与报导基因功能相关性的分析，建立了一种蛋白构象病的细胞模型。利用该模型，可以对蛋白构象病关键蛋白分子的折叠规律及影响因素如氨基酸、分子伴侣与折叠辅助物(Partner)、pH、温度等单独或同时在胞内进行研究，可以进行阻止相关蛋白分子聚集沉淀的胞内特异性结合蛋白、生物活性多肽(Aptamer)、小分子药物的高通量筛选，具有重要理论意义和实践价值。此外，整个过程无需复杂仪器、昂贵试剂，对目的蛋白的结构也无须详尽了解，具有更加简便快捷、高效通用、可定性定量分析的特点。

    【附图说明】

    图1为本发明蛋白构象病细胞模型的原理图

    图2A为报告质粒pCAR图谱

    图2B为报告质粒pCAR的多克隆位点表达区域示意图

    图3为报告质粒pCAR的酶切、PCR鉴定电泳图

    图4为报告质粒pCAR的序列测定图谱

    图5为pWn-CAR的酶切鉴定电泳图

    图6为pMn-CAR的酶切鉴定电泳图

    图7为pQn-CAR的酶切鉴定电泳图

    图8为pQ16-CAR的序列测定图

    图9为含有不同质粒pWn-CAR的大肠杆菌JM109表达产物SDS-PAGE图

    图10为含有不同质粒pMn-CAR的大肠杆菌JM109表达产物SDS-PAGE图

    图11为含有不同质粒pQn-CAR的大肠杆菌JM109表达产物SDS-PAGE图

    图12为含有不同质粒大肠杆菌JM109的α-互补试验

    【具体实施方式】

    在下面的实施例中，所涉及的材料与方法如下：

    pET-22b(+)购自Invitro公司，pMal-p2X购自New England Biolab公司；克隆有APP基因的质粒pGEM-2(Koo EH，Sisodia SS，Cork LC et al.Differential expression of amyloidprecursor protein mRNAs in cases of Alzheimer’s disease and in aged nonhuman primates，Neuron.1990，4(1)：97-104)，含有不同长度多聚谷氨酰胺Poly(Q)n的质粒pQ103、pQ46(Krobitsch S，Lindquist，S.Aggregation of huntingtin in yeast varies with the lengthof the polyglutamine expansion and the expression of chaperone proteins.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000，97：1589-1594)。工具酶、常用生化试剂等为Biolab、Promega等公司及国产分析纯产品。常规分子生物学技术参见《分子克隆实验指南》(科学出版社，1992)。

    实施例1、报告质粒pCAR以及阳性对照质粒pCAT的构建

    1、报告质粒pCAR的构建

    (1)含有CAT报告基因的序列盒的PCR扩增与克隆

    以含有CAT基因的质粒pGVtac99(Robben J，Massie G，Bosmans E et al，An Escherichiacoli plasmid vector system that facilitates high level expression and purificationof heterologous peptides by fusion to active chloramphenicol acetyltransferase.Gene，1993，126：109-113)为模板，通过引物P1和P2(序列如下)进行PCR扩增。产物经1.5％琼脂糖电泳，得到预期大小的特异性扩增条带。Kpn I和Hind III消化PCR产物，纯化回收目的条带。

    以上述回收片段为模板，以P3和P2为引物，进行PCR扩增，得到含有CAT报告基因的完整序列盒的DNA片段。

    P1：5’-AAGGTACCGGTAGCGCGGGCAGTGCTGCGGGTTCTGGCGGTGTCGACATGGAGAAA-3’(SEQ ID№：1)

    P2：5’-CCAAGCTTGCCTGCAGGTCGACTCATTACGCCCCGCCCTGCCA-3’(SEQ ID №：2)

    P3：5’-GGCATATGGTGTAACTGAGTAGGTACCGGTAGCGC-3’(SEQ ID №：3)

    P4：5’-GGGAATTCATATGGAGAAAAAAATCACTGG-3’(SEQ ID №：4)。

    (2)报告质粒pCAR的构建

    步骤(1)中获得的CAT报告基因的完整序列盒的DNA片段经Nde I和Hind III酶切、回收，与用同样限制性内切酶处理并回收的pMal-p2X连接、转化；然后经KpnI和HindIII酶切鉴定、序列测定，结果如图3和图4所示， (请确认图4)表明得到与预期结果完全一致的报告质粒pCAR。图3中，1表示分子量标准(DL2000)；2表示pCAR经KpnI和HindIII酶切；3表示pCAT经KpnI和HindIII酶切；4表示pCAR的FCR；5表示pCAT的PCR。

    2、阳性对照质粒pCAT的构建

    以P4和P2为引物，以质粒pUC-CAT为模板，PCR扩增获得含有起始密码前没有终止密码和柔性Linker的单一CAT的DNA片断，Nde I、Hind III酶切、回收，与用同样限制性内切酶处理并回收的pMal-p2X连接、转化；经酶切鉴定、序列测定，得到与预期结果完全一致的阳性对照质粒pCAT(如图3)。此质粒用于单一CAT的表达，确定最高氯霉素的抗性和氯霉素乙酰基转移酶的活性，作为阳性对照。

    实施例2、一种蛋白构象病细胞模型

    蛋白构象病细胞模型是含有报告质粒pCAR的E coli DH5α。

    以质粒pMal-p2X为框架，通过在Nde I、Hind III位点之间插入含有终止密码、柔性Linker和CAT的序列盒，构建报告质粒pCAR。如图2A和2B所示，Nde I、Kpn I位点用于目的基因，如不同形式的Aβ42基因的插入；Nde I、Kpn I之间的三个不同阅读框架的终止密码可防止空白报告质粒发生CAT或β-半乳糖苷酶Lac-Z的α-小片段的表达导致背景“噪声”的出现；KpnI、第一个Sal I之间为一段13个氨基酸的柔性Linker，可以防止目的蛋白与报告基因CAT、β-半乳糖苷酶Lac-Z的α-小片段之间出现空间位阻现象以致报告基因失效；CAT上下游的各一个Sal I位点，便于CAT基因的酶切去除，以利第二个报告基因β-半乳糖苷酶Lac-Z的α-小片段发挥作用。

    实施例3、蛋白构象病AD、HD细胞模型的建立

    1、各种重组表达质粒的构建

    (1)含有不同拷贝的野生型Aβ42的质粒pWn-CAR的构建

    以含有淀粉样蛋白前体蛋白APP695序列的质粒pGEM-2(Koo EH，Sisodia SS，Cork LC etal.Differential expression of amyloid precursor protein mRNAs in cases of Alzheimer’sdisease and in aged nonhuman primates，Neuron.1990，4：97-104)为模板，以P5、P6为引物(序列如下)，PCR扩增得到约130bp的DNA条带。目的条带经Nde I、Kpn I酶切回收后，与用同样限制性内切酶处理的pCAR的连接、转化，经NdeI和HindIII酶切鉴定、序列测定的结果如图5中泳道1-4所示，表明得到含有一个拷贝的野生型Aβ42的正确克隆pW-CAR。图5中，1表示pW-CAR；2表示pW-CAR/NdeI+HindIII；3表示pW-CAR/NdeI+KpnI；4，8，9，13表示分子量标准(DL2000)；5表示pW2-CAR；6表示pW2-CAR/NdeI+HindIII；7表示pW2-CAR/NdeI+KpnI；10表示pW3-CAR/NdeI+KpnI；11表示pW3-CAR/NdeI+HindIII；12表示pW3-CAR；14表示pW4-CAR/NdeI+KpnI；15表示pW4-CAR/NdeI+HindIII；16表示pW4-CAR。

    以P7、P8为引物，以pW-CAR为模板，PCR扩增得到目的片段，目的片段经Nde I、EcoRI酶切，与用同样限制性内切酶处理过的质粒pW-CAR连接、转化，经NdeI和HindIII酶切鉴定、序列测定的结果如图5中泳道5-8所示，表明得到前后串联含有两个拷贝Aβ42的质粒pW2-CAR。

    以P5、P6为引物，以pW2-CAR为模板，PCR扩增。由于模板pW2-CAR中存在两个拷贝的Aβ42，发生126bp的移位后一条DNA链的第二个拷贝序列与另一条链的第一个拷贝序列仍能完全互补，因此扩增中可以产生串联三次、四次甚至更多次的多拷贝Aβ42的片断。

    PCR反应后，回收350bp和500bp左右的目的条带。目的条带经Nde I、Kpn I酶切回收后，与用同样限制性内切酶处理的pCAR的连接、转化，经NdeI和HindIII酶切鉴定、序列测定的结果如图5中泳道9-16所示，表明得到含有三个、四个拷贝的野生型Aβ42的正确克隆pW3-CAR(图5，泳道9-12)、pW4-CAR(图5，泳道13-16)。

    引物P5-P8的序列如下，在引物P7中，通过同义突变，去除了EcoR I位点。

    P5：5’-GGCATATGGATGCAGAATTCCGACATGAC-3’(SEQ ID №：5)

    P6：5’-AAGGTACCCGCTATGACAACACCGCCCAC-3’(SEQ ID №：6)

    P7：5’-GGCATATGGATGCAGAGTTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTTC-3’(SEQ ID №：7)

    P8：5’-CCGAATTCTGCATCCGCTATGACAACACCGCCCATG-3’(SEQ ID №：8)。

    (2)含有不同拷贝的突变型mAβ42(F19P)的质粒pMn-CAR的构建

    Aβ42第19位氨基酸由苯丙氨酸(Phe)突变为脯氨酸(Pro)，可以破坏β-折叠的形成，使Aβ42可溶性大大提高(Wood SJ，Wetzel R， Martin JD et al，Prolines and amyloidogenicityin fragments of the Alzheimer’s peptide Aβ42.Biochemistry，1995，34：724-730)。因此，可用来作为该验证细胞模型是否有效的阳性参照。

    以pW-CAR为模板，以P9、P10为引物，进行PCR扩增。回收目的片断，经EcoR I、Kpn I酶切后，与用同样限制性内切酶处理的pW-CAR连接、转化，酶切鉴定、序列测定的结果如图6中泳道1-3所示，表明得到含有突变mAβ42(F19P)的质粒pM-CAR。图6中，1表示pM-CAR/NdeI+HindIII；2表示pM-CAR/NdeI+KpnI；3，6，9表示分子量标准(DL2000)；4表示pM2-CAR/NdeI+HindIII；5表示pM2-CAR/NdeI+KpnI；7表示pM2-CAR；8表示pABPW-CAR；10表示pABPW-CAR/NdeI+KpnI；11表示pABPW-CAR/NdeI+KpnI。

    以pM-CAR为模板，以P5-P8为引物，采取与步骤1中完全相同的策略进行pM2-CAR的制备，并扩增、回收目的片断，经EcoR I、Kpn I酶切后，与用同样限制性内切酶处理的pM2-CAR连接、转化，酶切鉴定、序列测定的结果如图6中泳道4-7所示，表明得到含有2个不同拷贝串联重复突变mAβ42(F19P)的质粒pM2-CAR。

    引物P9、P10序列如下，其中在引物P9中将Phe的密码子(TTC)转换为Pro的密码子(CCG)，引入三个碱基的突变。

    P9：5’-CCGAATTCCGACATGACTCAGGATACGAAGTTCATCATCAAAAATTGGTGCCGTTTGCAGAAGATGTGGGTTC-3’(SEQ ID №：9)

    P10：5’-AAGGTACCCGCTATGACAACACGCCCCAC-3’(SEQ ID №：10)。

    (3)含有Aβ42结合肽ABP的质粒pABPW-CAR的构建

    Aβ42的异常折叠及其聚集导致淀粉样蛋白沉淀斑、老年斑的出现，在整个AD的发生、发展中起关键作用。因此，有人推测，如果引入一个短肽，使之能与Aβ42中影响折叠的几个关键氨基酸相结合，贝可以阻止Aβ42的异常折叠，提供AD预防与治疗的一种新途径(Soto C，Sigurdsson EM，Morelli L，et al.β-sheet breaker peptides inhibit fibrillogenesisin a rat brain model of amyloidosis：Implications for Alzheimer’s therapy.NatureMed.1998，4：822-826)。Aβ42 N端第17-20位氨基酸对于整个多肽形成β-折叠以及最终是否能产生淀粉样纤丝非常关键的。因此，可以将该区域的氨基酸序列通过与同源短肽结合加以封闭，从而阻止其折叠。基于以上现象，以这段关键性的氨基酸序列(LVFF)(Wood SJ，Wetzel R，Martin JD et al.Prolines and amyloidogenicity in fragments of theAlzheimer’s peptide Aβ42，Biochemistry，1995，34：724-730)为模板，并将其中的缬氨酸用脯氨酸(P)来取代，以增强其破坏β-折叠的能力，同时在短肽的末端添加一个带电荷的天冬氨酸(D)，以减少结合物的疏水相互作用，增强可溶性，设计序列为LPFFD短肽，命名为ABP。为考察Aβ42结合肽ABP对Aβ42的助溶效果，通过PCR将ABP克隆到Aβ42的上游。

    以P11、P6为引物，以pW-CAR为模板，PCR扩增得到目的条带。回收目的片断，经Nde I、Kpn I有限酶切后，与用同样限制性内切酶处理的pCAR连接、转化，酶切鉴定、序列测定的结果如图6中泳道8-11所示，表明得到含有Aβ42结合肽ABP的质粒pABPW-CAR。P11的序列如下：

    P11：5’-GGCATATGCTGCCGTTCTTCGATGCAGAATTCCGATGAC-3’(SEQ ID №：11)。

    (4)含有不同长度多聚谷氨酰胺Poly(Q)n的质粒pQn-CAR的构建

    谷氨酰胺的异常重复可以影响亨廷顿舞蹈症等多种相关疾病，而典型的CAG(编码谷氨酰胺)重复疾病的拷贝数一般来说大于40，所以以40为分界线构建了不同长度的克隆。

    以质粒pQ103、pQ46((Krobitsch S，Lindquist，S.Agregation of huntingtin in yeastvaries with the length of the polyglutamine expansion and the expression of chaperoneproteins.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000，97：1589-1594)为模板，以P12、P13为引物，PCR扩增，分别回收大小约300、130bp片断，经NdeI、KpnI酶切回收后，与用同样限制性内切酶处理的pCAR连接、转化，经酶切鉴定、序列测定的结果如图7中泳道2-7所示，表明得到含有97个谷氨酰胺的克隆pQ97-CAR(图7，泳道2-4)、pQ46-CAR(图7，泳道5-7)。图7中，1，8，11表示分子量标准(DL2000)；2表示pQ97-CAR/NdeI+HindIII；3表示pQ97-NdeI+KpnI；4表示pQ97-CAR；5表示pQ46-CAR；6表示pQ46-CAR/NdeI+KpnI；7表示pQ46-CAR/NdeI+HindIII；9表示pQ37-CAR/NdeI+HindIII；10表示pQ37-CAR/NdeI+KpnI。

    由于pQ103是以CAACAGCAGCAACAGCAA为单位的多个重复组成，如果上游引物固定(P12)，下游引物(P14)只包含上述一个重复单位和KpnI酶切位点，以pQ103为模板，以P12、P14为引物，在PCR过程中，下游引物P14就有可能随机与模板在不同位置进行配对，最终形成不同长度的产物，称为Q-pool或Q-smear，回收Q-pool，酶切、连接、转化，经过酶切、序列测定的结果如图7中泳道9-10和图8所示，表明分别得到含有37、16个谷氨酰胺的质粒pQ37-CAR(图7，泳道9-10)和pQ16-CAR(图8)。引物P12-P14序列如下：

    P12：5’-GGCATATGTCCCTCAAAAGCTTCCAACAG-3’  (SEQ ID №：12)

    P13：5’-AAGGTACCGCTAGCGCTGAATTCAGGTGGTGGCGGTTGTTGCTG-3’(SEQ ID №：13)

    P14：5’-AAGGTACCTTGTTGCTGTTGCTGCTG-3’(SEQ ID №：14)。

    2、不同克隆的诱导表达及表达蛋白在胞内的存在形式

    将步骤1中各重组表达质粒转化JM 109，挑取单菌落，活化，IPTG诱导表达5小时后，离心收集菌体，超声破菌后离心，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE。实验结果如图9和图10所示，表明正如预期一样，不同拷贝的野生型Aβ42在生理状态下，会聚集沉淀，而pW1-4-CAR的表达产物也主要存在于包含体中；可溶性突变体mAβ42(F19P)应不会聚集沉淀，而pM1-2-CAR的表达产物也在上清中占优势；根据设计，ABP应阻止Aβ42的聚集沉淀，同样pABPW-CAR表达量很高，并且出现在上清中，以上结果表明：不同形式Aβ42与报导基因融合，在大肠杆菌中的折叠状态(可溶与否)与其生理条件下在体内的存在形式完全一致。图9中，1表示蛋白分子量标准；2表示pW1-CAR超声破碎沉淀；3表示pW1-CAR超声破碎上清；4表示pW2-CAR超声破碎上清；5表示pW2-CAR超声破碎沉淀；6表示pW3-CAR超声破碎上清；7表示pW3-CAR超声破碎沉淀；8表示pW4-CAR超声破碎沉淀；9表示pW4-CAR超声破碎上清；箭头所指为目的条带。图10中，1表示蛋白分子量标准；2表示pM1-CAR超声破碎沉淀；3表示pM1-CAR超声破碎上清；4表示pM2-CAR超声破碎上清；5表示pM2-CAR超声破碎沉淀；6表示pABPW-CAR超声破碎上清；7表示pABPW-CAR超声破碎沉淀；箭头所指为目的条带。

    同样，对于不同长度的多聚谷氨酰胺Poly(Q)n，结果如图11所示，表明小于40个多聚谷氨酰胺在适当的菌中是以可溶的形式存在，而大于40个的在适当的宿主中正是以不溶的包含体形式出现的，这与生理条件下，含不同长度多聚谷氨酰胺的亨廷顿蛋白Ht在胞内的存在状态完全一致。图11中，1，4，10表示蛋白分子量标准；2表示pQ16-CAR超声破碎上清；3表示pQ16-CAR超声破碎沉淀；5表示pQ37-CAR超声破碎沉淀；6表示pQ37-CAR超声破碎上清；7表示pQ46-CAR全菌；8表示pQ46-CAR超声破碎上清；9表示pQ46-CAR超声破碎沉淀；11表示pQ97-CAR全菌；12表示pQ97-CAR超声破碎上清。

    3、不同克隆的氯霉素抗性测定

    将步骤1中各重组表达质粒转化入大肠杆菌JM109，挑取单克隆菌落，接入含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃震荡培养，过夜活化。次日，按1.5％接入同样抗性培养基中，振荡培养1.5小时左右，当OD600达到0.4-0.6时，加入IPTG(200mg/L)，37℃继续培养约1小时，以诱导CAT融合蛋白表达，然后涂固体平板培养基，按0.1％在培养基中加入氨苄青霉素、IPTG及不同浓度的氯霉素，过夜培养16小时，观察不同重组菌在不同的氯霉素浓度中的生长状况，结果如表1，表明不同拷贝野生型(Aβ42)n(n＝1，2，3，4)在IPTG诱导表达时，只有微弱的氯霉素抗性(100，50，50，＜50μg/ml)，相反可溶性突变体(mAβ42)1-2以及含有结合肽的Aβ42则表现明显的氯霉素抗性(350、＞750、＞750μg/ml)，以上结果与步骤2中不同形式Aβ42在大肠杆菌中表达时的分布情况(上清或沉淀)对照发现：可正确折叠(可溶)的突变体Aβ42，与报告基因氯霉素乙酰基转移酶CAT融合后，仍能正确折叠，并呈明较高的氯霉素抗性；相反，不能正确折叠的Aβ42，与CAT融合后，仍然沉淀聚集，对应的氯霉素抗性也低。同样，对于不同长度的多聚谷氨酰胺Poly(Q)n，也发现类似现象。

    以上结果表明：报告基因CAT的活性指标之一氯霉素抗性的确可以反映不同形式Aβ42、多聚谷氨酰胺Poly(Q)n在大肠杆菌中表达时的折叠状态(可溶与否)，可以用于定性分析。

    4、不同克隆的氯霉素乙酰转移酶CAT的活性测定

    为对不同形式Aβ42、多聚谷氨酰胺Poly(Q)n在胞内的存在形式进行定量分析，参考文献(颜子颖，王海林，《新编分子生物学实验指南》，科学出版社，1998，508-509)，采用有机溶剂抽提法对含有不同质粒的细菌在IPTG诱导后的氯霉素乙酰转移酶CAT的活性进行测定。结果如表1所示，表1中组别5-9表明不同形式的Aβ42、多聚谷氨酰胺Poly(Q)n，凡是预期可溶的，则具有较高的CAT活性；表1中组别1-4，10，11表明预期不溶的，则只有微弱的CAT活性。证实利用报导基因CAT的活性可以对不同形式Aβ42、多聚谷氨酰胺Poly(Q)n在大肠杆菌中表达时的折叠状态(可溶与否)进行定量分析。

    步骤2、3和4的结果初步表明：以CAT作为报导基因，通过目的蛋白与其框内融合，CAT的活性以真实反映不同蛋白构象病关键蛋白分子不同形式Aβ42、多聚谷氨酰胺Poly(Q)n在生理条件下的存在形式，并可利用CAT的活性进行定性(氯霉素抗性高低)、定量分析(氯霉素乙酰转移酶活性大小)，说明建立了蛋白构象病AD、HD的细胞模型，并可利用上述模型有效模拟蛋白构象病的关键病理特征。

    5、α互补实验

    为了进一步验证该细胞模型对于体内淀粉样蛋白多肽存在形式的模拟，利用载体携带的β-半乳糖苷酶基因进行了α互补实验。

    所构建的pCAR系列载体，可以编码的Lac-Z的α小片段，虽然单独表达无酶活性，但在适当的宿主如JM109、DH5α等中，可以与宿主编码的片段实现α-互补。由α-互补而产生LacZ+细菌易于识别。它们在生色底物X-gal存在下形成蓝斑。由此推出，如果目的片段可溶，则形成蓝色菌落；若目的片段形成包含体，则α-片段无可溶性，形成白色菌斑。

    用Sal I限制性内切酶消化步骤1中构建的各重组质粒，将CAT基因切掉，以避免它影响后面的α-片段的表达。然后，加入T4连接酶，连接过夜。涂板转化到宿主菌E coli DH 5α，培养后挑取转化的阳性克隆作α-互补实验。

    结果如图12所示，表明含有质粒pABPW/M1/M2-CAR的细胞显示蓝色，可以进行α互补；相反，含有质粒pWn-CAR的菌落则显示白色，无法进行有效的α互补。与步骤2、3对照，说明以Lac-Z的α小片段为报导基因，利用α互补现象，也可以对不同蛋白构象病的关键蛋白分子如不同形式Aβ42的折叠状态进行定性分析，并真实模拟这些关键蛋白分子在生理条件下的存在形式。

    6、β-半乳糖苷酶活性的检测

    参考文献(颜子颖，王海林，《新编分子生物学实验指南》，科学出版社，1998，508-509)，对含有不同质粒的细菌在IPTG诱导后的β-半乳糖苷酶的活性进行测定，以定量分析诱导表达后不同蛋白构象病关键蛋白分子如Aβ42等在胞内的折叠状态。结果如表1所示，表明不同形式的Aβ42、多聚谷氨酰胺Poly(Q)n，凡是预期可溶的，则具有较高的β-半乳糖苷酶活性(表

    表1、含有不同形式Aβ42表达质粒的氯霉素Cm抗性、CAT活性、β-半乳糖苷酶活性测定  实验  组别    表达    质粒    融合    蛋白  预期  可溶性最大Cm抗性  (μg/mL)  CAT的活性  (U/细胞)*  Lac-Z的活性    (U/细胞)*    1    pW-CAR    单拷贝Aβ42  不溶    100  30.64±253    10.11±4.24    2    pW2-CAR    双拷贝Aβ42  不溶    50  25.69±1.99    8.23±3.37    3    pW3-CAR    三拷贝Aβ42  不溶    50  25.37±3.49    7.62±5.54    4    pW4-CAR    四拷贝Aβ42  不溶    ＜50  7.94±4.12    22.32±2.97    5    pM-CAR    单拷贝mAβ42  可溶    350  150.21±13.79    69.55±3.64    6    pM2-CAR    双拷贝mAβ42  可溶    ＞750  280.02±18.63    105.20±20.47    7    pABPW-CAR    ABP-Aβ42  可溶    ＞750  440.91±29.54    158.15±21.76    8    pQ16-CAR    Poly(Q)16  可溶    450  60.11 ±9.16    22.46±7.64    9    pQ37-CAR    Poly(Q)37  可溶    300  36.26±7.35    15.23±5.17    10    pQ46-CAR    Poly(Q)46  不溶    150  14.15±3.76    4.26±1.18    11    pQ97-CAR    Poly(Q)97  不溶    ＜50  5.94±2.18    2.15±0.12    8    pCAT    CAT  可溶    750  410.78±31.17    1.01±0.43    9    pMal-p2x     -   -    ＜50  1.17±0.25    160.34±14.31

    注：*表示三次试验的结果

    1，组别5-9)；预期不溶的，则只有微弱的β-半乳糖苷酶活性(表1，组别1-4，10，11)。证实利用报导基因β-半乳糖苷酶的活性可以对不同形式Aβ42、多聚谷氨酰胺Poly(Q)n在大肠杆菌中表达时的折叠状态(可溶与否)进行定量分析。

    步骤2、5、6的结果初步表明：以β-半乳糖苷酶Lac-Z的α-小片断作为报导基因，通过目的蛋白与其框内融合，CAT的活性可以真实反映不同蛋白构象病关键蛋白分子不同形式Aβ42、多聚谷氨酰胺Poly(Q)n在生理条件下的存在形式，并可利用Lac-Z的活性进行定性(α互补)、定量分析(Lac-Z活性大小)。

                                      序列表

    <160>14

    <210>1

    <211>56

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>

    <400>1

     aaggtaccgg tagcgcgggc agtgctgcgg gttctggcgg tgtcgacatg gagaaa    56

    <210>2

    <211>43

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>

    <400>2

    ccaagcttgc ctgcaggtcg actcattacg ccccgccctg cca                   43

    <210>3

    <211>35

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>

    <400>3

    ggcatatggt gtaactgagt aggtaccggt agcgc                            35

    <210>4

    <211>30

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>

    <400>4

     gggaattcat atggagaaaa aaatcactgg                                 30

    <210>5

    <211>29

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>    

    <400>5

     ggcatatgga tgcagaattc cgacatgac                                  29

    <210>6

    <211>29

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>

    <400>6

     aaggtacccg ctatgacaac accgcccac                                  29

    <210>7

    <211>45

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>

    <400>7

     ggcatatgga tgcagagttc cgacatgact caggatatga agttc                45

    <210>8

    <211>39

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>

    <400>8

     ccgaattctg catccgctat gacaacaccg cccaccatg                       39

    <210>9

    <211>73

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>

    <400>9

    ccgaattccg acatgactca ggatacgaag ttcatcatca aaaattggtg ccgttgcag    60

    aagatgtggg ttc                                                      73

    <210>10

    <211>29

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>

    <400>10

    aaggtacccg ctatgacaac accgcccac                                     29

    <210>11

    <211>44

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>

    <400>11

    ggcatatgct gccgttcttc gacgatgcag aattccgaca tgac                    44

    <210>12

    <211>29

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>

    <400>12

    ggcatatgtc cctcaaaagc ttccaacag                                   29

    <210>13

    <211>44

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>

    <400>13

    aaggtaccgc tagcgctgaa ttcaggtggt ggcggttgtt gctg                  44

    <210>14

    <211>26

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>

    <400>14

    aaggtacctt gttgctgttg ctgctg                                      26