蛋白激酶B抑制剂的新用途.pdf

本发明涉及一种蛋白激酶B抑制剂在制备缓解炎症疼痛药物中的应用。本发明将三个剂量的Akt IV在BmK I注射前30分钟注入大鼠鞘内L5-L6骶骨间隙，研究不同剂量Akt IV在实验性自发痛、阵发性痛觉大发作、双侧机械痛敏和单侧热痛敏等现象中的缓解作用。该项发明建立在实验性动物炎症痛模型上，为研究Akt信号途径相关的镇痛分子机制及研发新型镇痛药物提供了依据。

1.  在蛋白激酶B抑制剂在制备缓解炎症疼痛药物中的应用。

蛋白激酶B抑制剂的新用途
技术领域
本发明涉及蛋白激酶B抑制剂的新用途。
背景技术
疼痛分为生理性疼痛和病理性疼痛。前者是机体保护机制，而病理性疼痛通常发病机制复杂，病程长，恢复慢，往往长期持续，因此也可称为慢性痛，可由外伤、感染、炎症和肿瘤等各种病因引起，导致患者机体功能失调、康复困难以及精神抑郁，已成为当前危害人们健康和影响人们生活质量的重要原因。其临床症状表现为自发痛（Spontaneous pain），痛觉过敏(Hyperalgesia)和异常疼痛(Allodynia)等。自发痛指无外来刺激自发产生的疼痛；痛觉过敏为机体对伤害性刺激产生夸大的痛反应；而异常疼痛则指非伤害性刺激（如轻触）便可产生强烈的疼痛感受。此外，发生于损伤区的痛敏称为原发性痛敏（Primary hyperalgesia），包括机械和热痛敏；发生于邻近损伤区的痛敏称为继发性痛敏(Sencondery hyperalgesia)；机体损伤对侧的痛觉过敏称为镜像痛敏(Mirror image hyperalgesia)。炎症是引起慢性痛的最主要的病因之一，导致损伤区红（redness）、肿（swelling）、热（warmth）、痛（pain）等表征，有时病灶去除或损伤痊愈后疼痛依然存在。目前慢性痛在临床上仍然缺乏有效的缓解策略，现有的药物如吗啡、非甾体类抗炎药等存在成瘾、镇痛效果不佳及毒副作用等问题。然而，当前镇痛新药的开发存在新药物分子发现困难，分子机理难以阐述及临床前评估推进缓慢等问题，使得开发现有药物库，利用已知药物寻求新的镇痛策略成为亟待之策。
为了模拟人类慢性痛的临床症状，前人建立了若干不同类型的炎症痛和神经病理痛实验动物模型。虽然不同动物模型所模拟的临床症状有所不同，其致病机制也可能有着天壤之别。但其临床症状主要都表现为自发痛、痛觉过敏和触诱发痛。我们从东亚钳蝎粗毒中分离纯化得到单一成份BmK I，经大鼠足底皮下注射可剂量依赖性地诱发大鼠产生痛反应。经长期研究积累，已成为国内外认可的经典炎症痛模型。利用这一炎症痛模型，可同时模拟诸多临床病征，并为理解致病机制，筛选新型抗炎镇痛药物提供良好的研究载体。
Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，又被称为蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）。Akt是PI3K/Akt信号通路的重要因子，在细胞生长与存活中起着关键作用，与多种肿瘤的发生密切相关。临床上已经将阻断该通路作为治疗癌症的新策略，因此已筛选出多个有效的小分子Akt抑制剂。辉瑞、默克公司等公司均有报道已经展开Akt抑制剂作为治疗药物的临床前实验，虽然还未有此类药物上市，但是其已是药物开发的重点方向。Akt IV一种具有细胞渗透性的脂类小分子，能够可逆性地结合于Akt上的ATP结合位点，阻止Akt与PI3K（磷脂酸肌醇-3-激酶，phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）的结合，从而阻断Akt信号通路。
发明内容
本发明的目的之一在于提供蛋白激酶B抑制剂在制备缓解炎性疼痛药物中的应用。
目前报道表明Akt激酶在多种疼痛动物模型中存在异常表达的现象。由此我们认识到Akt信号通路除了参与肿瘤发生，其在痛觉的中枢调控中也有关键性的作用。我们的研究已经证实了Akt信号通路参与BmK I诱导的炎症痛，Akt IV作为Akt激酶的抑制剂可以有效抑制BmK I诱导炎症痛动物模型的疼痛反应。表明Akt IV能够为制备治疗炎症痛药物中的应用。
上述的炎症痛模型涉及实验性自发痛相关反应、实验性镜像机械痛敏和热痛敏。
本发明将Akt抑制剂Akt IV在BmK I注射前30分钟鞘内注入大鼠脊髓L5-L6间隙，观察Akt IV对大鼠自发痛行为、双侧机械痛敏和热痛敏的缓解情况。实验表明，5μg /10μl和10μg /10μl浓度剂量的Akt IV均可显著抑制大鼠的每5分钟自发缩足反射次数，2小时总的缩足反射次数，2小时总的添咬抬足时间以及2小时内的痛觉大发作次数。且Akt IV对大鼠自发痛行为的抑制作用可持续至少2小时。而1μg/10μl浓度的Akt IV对上述痛行为无明显抑制效应。诱发痛方面，5μg/10μl和10μg/10μl的Akt IV均可剂量依赖性地抑制BmK I诱导的镜像机械痛敏和单侧热痛敏，而不影响对侧热痛敏。1μg/10μl的Akt IV对诱发痛的抑制差异不显著。
本发明中采用天然蝎毒素BmK I构建的诱导实验性炎症痛模型，新颖之处在于该模型不仅能够稳定的模拟临床常见的自发痛、热痛敏、机械痛敏等症状，更能很好的模拟临床镜像机械痛症状和阵发性痛觉大发作症状，较其他模型的镇痛研究有着更高的研究价值。
附图说明
图1为大鼠鞘内注射不同剂量Akt IV后缓解自发缩足反应持续时程。
图2为大鼠鞘内注射不同剂量Akt IV后减少痛觉大发作总次数。
图3为大鼠鞘内注射不同剂量Akt IV后减少自发缩足总次数。
图4为大鼠鞘内注射不同剂量Akt IV后减少抬足舔咬总时间。
图5为大鼠鞘内注射不同剂量Akt IV后缓解损伤侧机械痛敏。
图6为大鼠鞘内注射不同剂量Akt IV后缓解对侧机械痛敏。
图7为大鼠鞘内注射不同剂量Akt IV后缓解损伤侧热痛敏。
图8为大鼠鞘内注射不同剂量Akt IV后不影响对侧正常热痛敏。
具体实施方式
BmK I诱导炎症痛模型建立实验请参见Bai ZT, Liu T, Jiang F, Cheng M, Pang XY, Hua LM, Shi J, Zhou JJ, Shu XQ, Zhang JW, Ji YH. Phenotypes and peripheral mechanisms underlying inflammatory pain-related behaviors induced by BmK I, a modulator of sodium channels. Exp. Neurol., 226 (2010) 159–172.
实施例一：不同剂量Akt IV缓解大鼠自发痛觉相关反应的观察
在铺有一面玻璃镜的桌上放一高75 cm支架，架上置一20×20×30cm³透明有机玻璃盒子，自桌上的镜中观察大鼠足底给药后的反应。药物注射前，将大鼠提前30 分钟置于盒中适应实验环境。足底注射BmK I后，动物放回检测盒，持续观测自发痛行为。以每5分钟自发抬足次数、痛觉大发作（如嘶叫等）次数、抬脚总次数、舔咬抬足时间来评价伤害性自发痛反应。Akt IV给药方式为BmK I注射前30分钟分别在大鼠鞘内L5-L6间隙注射剂量分别为1μg、5μg、10μg 的10μl药品体系。Akt IV对大鼠每5分钟自发抬足次数、痛觉大发作行为、抬脚总次数以及抬足添咬总时间的缓解情况详见图1~图4。
结果表明，5μg /10μl和10μg /10μl浓度剂量的Akt IV均可显著抑制大鼠的自发缩足反射次数，抬脚总次数、舔咬抬足时间以及痛觉大发作次数。Akt IV对大鼠自发痛行为的抑制作用可持续至少2小时。1μg/10μl浓度的Akt IV对上述痛行为无明显抑制效应。自发痛相关反应可很好的模拟临床急性痛症状，阵发性痛觉大发作行为可以很好的模拟临床阵发性痛觉发作症状。
实施例二：不同剂量Akt IV缓解大鼠双侧机械痛的观察
实例一中自发痛基本消失后，将大鼠置于在钢丝网格(1cm²)上的有机玻璃盒(20×20×30 cm³)中。用一系列Von Frey 纤维(58011, Stoelting Co., USA) （从0.6到26 g）来测量机械缩足反射阈值。当大鼠注射侧后足接触地面并正常负重时即可测量。从网格下刺激动物注射侧后肢足底中心皮肤，每根纤维弯曲至适当程度停留2-3秒，两次测量间隔10秒。Von Frey纤维的刺激强度由小到大。如果没有缩足反射，使用更大克数的纤维继续测量，测量最大值为26 g。取能引起50%缩足反应的最小克数值为机械缩足反射阈值。机械痛阈值取毒素注射后4小时、8小时的时间点进行采集。Akt IV对大鼠双侧机械痛敏的缓解情况详见图5～图6。
结果表明，5μg/10μl和10μg/10μl浓度剂量的Akt IV均可有效抑制BmK I诱导的双侧机械痛敏。1μg/10μl的Akt IV对双侧机械痛敏的抑制差异不显著。诱发的双侧机械痛敏可有效模拟临床镜像痛症状。
实施例三：不同剂量Akt缓解大鼠热痛敏的观察
将一个20×20×30 cm3的有机玻璃罩放置在一块厚度为2 毫米的玻璃板上，大鼠置于其中，玻璃下方是热痛刺激仪的卤素灯照射头(150 W, 24 V，西安风岚器械厂出品，RTY-3型）。照射头距玻璃板的下表面调至3 cm，照射光圈直径调至3 mm照射在玻璃板下方。热刺激直接施加在大鼠后足足心。测量自动切断时间为15秒，以免损伤组织。同一位点重复测量5次。同一位点测量每两次间隔至少10分钟，不同位点测量每两次间隔5分钟。测三次，取平均值作为热缩足反射阈值。 热痛阈值取毒素注射后4小时、8小时的时间点进行采集。Akt IV对大鼠热痛敏的缓解情况详见图7～图8。
结果表明，5μg/10μl和10μg/10μl浓度剂量的Akt均可有效抑制BmK I诱导的单侧热痛敏，并且不影响对侧热痛阈值。1μg/10μl的Akt IV对双侧热痛敏的抑制差异不显著。诱发的热痛敏可有效模拟临床热痛觉过敏症状。