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破骨细胞相关受体
                          发明领域

    本发明涉及新颖的基因，此处称作“破骨细胞相关受体”基因或“OSCAR”，及其基因产物。OSCAR基因是由破骨细胞特异性表达的。相应的，本发明也涉及通过鉴定特异性表达OSCAR基因或基因产物的细胞而鉴定和分离破骨细胞的方法。

    OSCAR基因和基因产物也涉及调节或调整破骨细胞的成熟。相应的，本发明进一步涉及调节或抑制破骨细胞的成熟和/或活性的方法和组合物。这些方法在如治疗与破骨细胞相关的疾病如骨质疏松症和骨硬化症方面是有用的。因此，本发明涉及治疗这类疾病的方法和组合物。

    本发明也涉及用于化合物鉴定的筛选方法，所述这些化合物可与OSCAR基因或基因产物结合和/或调节OSCAR基因或基因产物的活性，从而可用来调节破骨细胞地成熟和/或活性。可利用这些筛选方法来进行鉴定的、从而也包括在本发明的范围之内的化合物包括OSCAR配基和跨膜信号接合体。

                            发明背景

    骨的发育和稳态在很大程度上是由两种不同的细胞类型控制：成骨细胞和破骨细胞。骨基质是由分布于已有的骨基质上并向其表面存储新鲜层的细胞即成骨细胞分泌的。成熟的破骨细胞是单核细胞/巨噬细胞起源的多核细胞，它们可重新吸收钙化的骨基质。一般情况下，这两种细胞类型的活性紧密协调以维持生物体内骨的结构和完整性。然而，对调节这两种细胞的活性的机理理解甚少，并且很多都是未知的。

    多种疾病和紊乱与异常的骨生长或骨质的异常增加或减少有关。例如，骨硬化症是骨基质加厚，这与破骨细胞成熟缺陷，从而不能对骨进行吸收相关(见，如Kong et al.，Nature，1999，397：315-323；Soriano et al.，Cell 1991，64：693-702；Iotsova et al.，Nat.Ned.1997，3：1285-1289)。相反，骨质疏松症的疾病特征为破骨细胞活性升高，这样造成骨极度多孔，易骨折，并且愈合缓慢。已知其他多种涉及异常骨生长和吸收或与异常骨生长或吸收相关的疾病和紊乱，包括佩吉特病、成骨不全、骨纤维发育不良、磷酸酶过少症、原发性甲状旁腺功能亢进症、关节炎及牙周疾病等。另外，骨上或远离骨的多种恶性肿瘤，如乳腺癌、肺癌、前列腺癌、甲状腺癌及肾癌中的骨骼转移、恶性肿瘤的体液性高钙血症及多发性骨髓瘤可诱导骨质溶解。

    这些疾病和紊乱代表了美国和其他国家在公共卫生方面的主要忧虑。例如，据估计，有其中妇女占80％的1千万美国人已遭受骨质疏松症的痛苦，另1千万个体骨质偏低，从而提高了它们患病的危险。

    因此，我们需要可用于鉴定细胞如成骨细胞和/或破骨细胞(如细胞和组织样品中的)并可调节或调整这些细胞的活性的方法和组合物。我们也需要可对与骨异常生长和吸收相关的疾病和紊乱，包括上述疾病，进行治疗的方法和组合物，例如可通过调节成骨细胞和破骨细胞活性来进行治疗。本发明致力于满足现有技术中的这些需求和其他需求。

                            发明简述

    通过提供与涉及骨组织生长、发育、修复、吸收降解或稳态相关过程的方法和组合物，本发明克服了现有技术中的上述和其他问题，因此，其在调节这些过程方面是有用的。例如，本发明中的方法在治疗与骨组织异常生长、发育、修复、吸收、降解、吸收或稳态相关的紊乱(也即“骨生长相关紊乱”)方面是有用的。这些紊乱的示例包括，但并不局限于骨质疏松症和骨硬化症。这些紊乱的其他非限制性示例包括佩吉特病、成骨不全、骨纤维发育不良、磷酸酶过少症、原发性甲状旁腺功能亢进症、关节炎、牙周疾病及骨质溶解(如由于恶性肿瘤而导致的)。

    特别的，本发明提供了由破骨细胞表达的新颖的多肽，此处称作OSCAR多肽。本发明中的OSCAR多肽也可调整破骨细胞的生长和成熟及与破骨细胞相关的活性，如骨组织的吸收。

    在某些优选的实施方案中，本发明提供的OSCAR多肽是由鼠破骨细胞表达的鼠科动物(也即小鼠)多肽。例如，在一个实施方案中，本发明提供的OSCAR多肽含有图2B中所示氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。在另一实施方案中，本发明提供的OSCAR多肽含有图1C中所示氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。而在另一优选实施方案中，本发明提供的OSCAR多肽含有图26B和27B中所示氨基酸序列(分别为SEQID NO：29和31)。在另一优选实施方案中，本发明提供的OSCAR多肽为人多肽。例如，在优选的实施方案中，本发明的OSCAR多肽是由图7A-D所示基因组序列(SEQ ID NO：12)编码的多肽。在某些特别优选的实施方案中，本发明中的OSCAR多肽包括图3B(SEQ ID NO：7)、图4B(SEQ ID NO：9)、图5B(SEQ ID NO：11)、图24B(SEQ ID NO：25)或图25B(SEQ ID NO：27)中所示氨基酸序列。在其他实施方案中，本发明提供的包括融合多肽在内的多肽包括与全长OSCAR多肽的一或多个结构域相对应的氨基酸序列，如全长OSCAR多肽的信号肽序列、IG样结构域序列、跨膜结构域序列、胞质尾结构域序列或它们的任意结合(如图1C、3B、4B、5B、24B、25B、26B和27B中所示多肽的序列和SEQ ID NO：3、7、9、11、25、27、29和31分别给出多肽的序列)。在其他实施方案中，本发明提供了OSCAR多肽的变体。特别的，本发明提供了由在定义的杂交条件下可与OSCAR多肽(如图1C、2B、3B、4B、5B、24B、25B、26B和27B中所示多肽和SEQ ID NO：3、7、9、11、25、27、29和31分别所示多肽)的互补体进行杂交的核酸编码的多肽。

    本发明另外提供了可编码本发明中的OSCAR多肽的核酸，包括如含有图1A-B、2A、3A、4A、5A、24A、25A、26A和27A(分别为SEQID NO：1-2、4、6、8、10、26、28、30和32)中提供的核苷酸序列及图7A-D(SEQ ID NO：12)中所示基因组OSCAR核酸序列的核酸。本发明进一步提供包括这些核酸的载体和宿主细胞、与那些OSCAR多肽特异性结合的抗体及OSCAR核酸。本发明也涉及这类OSCAR多肽、核酸和抗体的片段。

    此外，本发明也涉及并提供了用于检测和鉴定本发明中的OSCAR核酸和OSCAR多肽的筛选方法，其包括用于检测细胞中、细胞表面(如在细胞表面表达的OSCAR)、细胞培养物中(如在细胞培养介质中)、细胞培养提取物或细胞裂解物中OSCAR核酸及OSCAR多肽的存在或表达的筛选方法。这些方法包括用于检测和鉴定OSCAR多肽和核酸变体的方法，如：含有一或多个氨基酸替代、缺失或插入的OSCAR多肽；或编码含有一或多个氨基酸替代、缺失或插入的OSCAR多肽的核酸。可利用这些方法进行鉴定的其他变体OSCAR多肽和核酸包括同源OSCAR多肽和核酸(如源自其他种生物体，优选源自哺乳动物生物体如人的OSCAR多肽和核酸)。因此，本发明的某些部分中提供了这些变体OSCAR多肽和核酸，以及与其特异性结合的抗体，及其片段。

    本发明进一步提供了用于鉴定与本发明的OSCAR核酸或本发明的OSCAR多肽特异性结合的化合物的方法(如筛选方法)。可利用这些筛选方法进行鉴定的化合物包括小分子(如分子量小于2KD的分子，优选分子量小于1KD的分子)和包括蛋白质、肽和多肽在内的大分子。可利用这些筛选方法进行鉴定的化合物进一步包括细胞内化合物，如与OSCAR基因或OSCAR基因产物(如与OSCAR核酸或OSCAR多肽)特异性结合的天然配基。此外，提供了鉴定干扰OSCAR多肽和特异性结合配偶(如OSCAR特异性配基)间、或OSCAR核酸和特异性结合配偶间的相互作用的化合物的其它筛选检测方法。因此，这样的筛选检测方法是本发明的组成部分。此外，可利用这些检测法鉴定的化合物，包括结合化合物(如OSCAR特异性配基)及可干扰OSCAR特异性结合相互作用的化合物也是本发明的组成部分。

    另一方面，本发明提供了用于调节破骨细胞活性的方法。这些方法一般包括将破骨细胞与可调节OSCAR基因(例如，OSCAR基因的表达)或OSCAR基因产物的活性的化合物进行接触。这些方法中选用的化合物包括可抑制OSCAR信号传导、从而抑制破骨细胞活化(如成熟)的OSCAR拮抗剂、及可促进OSCAR信号传导和/或破骨细胞成熟及破骨细胞活性的OSCAR激动剂(包括OSCAR特异性配基)。这些方法也可包括将破骨细胞与化合物(如反义链、核酶、三螺旋形成核酸或其他小化合物)接触从而增强或抑制细胞对OSCAR基因或OSCAR基因产物的表达。这些方法也包括提高破骨细胞活性的方法，如通过将破骨细胞同可与OSCAR基因产物结合和/或提高OSCAR基因产物活性的化合物进行接触。在此方法的一个优选实施方案中，将破骨细胞与OSCAR特异性配基进行接触。

    本发明的方法进一步包括降低破骨细胞的活性的方法。这些方法包括将破骨细胞与可抑制或降低OSCAR基因产物的活性的化合物进行接触。在某些优选实施方案中，这些化合物可为能够抑制或干扰OSCAR特异性配基与OSCAR基因产物间的结合的化合物。例如，在一个优选实施方案中，化合物包括可与OSCAR基因产物或OSCAR特异性配基结合从而抑制OSCAR特异性配基与OSCAR基因产物间的结合的抗体。在另一优选实施方案中，化合物包括一或多个可溶性OSCAR多肽的氨基酸序列，最优选的包括含有OSCAR多肽的配基结合结构域(如细胞外和/或信号序列结构域)的氨基酸序列。在一尤其优选的实施方案中，进行给药的化合物包括含有与免疫球蛋白的Fc区域或其他小分子结合的这些氨基酸序列的可溶性融合多肽。

                          图表简述

    图1A-1C展示了鼠OSCAR基因的1.8kb(图1A；SEQ ID NO：1)和1.1kb(图1B；SEQ ID NO：2)剪接变体的cDNA序列。每个序列的起始密码子(ATG)和终止密码子(TGA)以加粗的字体标出。图1C(SEQ ID NO：3)给出了由这两个cDNA转录物编码的OSCAR多肽序列。

    图2A-2B展示了OCL178克隆中包含的鼠OSCAR片段的cDNA序列(图2A；SEQ ID NO：4)。图2B(SEQ ID NO：5)给出了相应于SEQ ID NO：3的161-265位氨基酸残基的氨基酸序列的、由此克隆编码的OSCAR多肽片段的氨基酸序列。

    图3A-3B展示了人OSCAR基因及其基因产物的C18同工型的cDNA序列(图3A；SEQ ID NO：6)和预测的氨基酸序列(图3B；SEQ ID NO：7)。

    图4A-4B展示了人OSCAR基因及其基因产物的C16同工型的cDNA序列(图4A；SEQ ID NO：8)和预测的氨基酸序列(图4B；SEQ ID NO：9)。

    图5A-5B展示了人OSCAR基因及其基因产物的C10同工型的cDNA序列(图5A；SEQ ID NO：10)和预测的氨基酸序列(图5B；SEQ ID NO：11)。

    图6展示了图1C(SEQ ID NO：3)所示鼠OSCAR多肽序列的氨基酸序列及图3B(SEQ ID NO：7)所示人OSCAR多肽的C18同工型的氨基酸序列比对。鼠OSCAR多肽序列和人OSCAR多肽序列分别命名为mOSCAR(上面的线)和hOSCAR(底部的线)。

    图7A-7D给出了人染色体19克隆CTD-3093(GenBank编号为AC012314.5；GI：7711547)的117001-124920位核苷酸残基的序列(SEQ ID NO：12)，其中的人OSCAR基因是利用BLASTN算法分离出来的。人OSCAR基因的外显子序列用大写字母给出。人OSCAR基因的翻译(也即蛋白编码)区域以下划线标出。

    图8A-8B展示了对利用从骨髓衍生化巨噬细胞(图8A)和骨髓衍生化破骨细胞(图8A)中获得的总cDNA探针对从消减(subtraction)(鼠OC-MΦ)cDNA文库中随机选择的250个克隆中筛选的质粒DNA进行的Southern印迹分析。

    图9展示了Northern印迹检测结果，其中从鼠OSCAR片段OCL178(上)、破骨细胞特异性基因TRAP(中)及破骨细胞特异性基因组织蛋白酶K(下部)获得的标记cDNA分别与源自骨髓衍生巨噬细胞(BMM)、骨髓衍生破骨细胞(BMOC)和骨髓衍生树突细胞(BMDC)的mRNA进行杂交。

    图10展示了Northern印迹杂交结果，其中源自鼠OSCAR片段OCL178(上)、破骨细胞特异性基因TRAP(中)和组织蛋白酶K(下)的标记cDNA与源自包括肌肉、肾脏、大脑、心脏、肝、肺、肠、胸腺、脾、淋巴结及破骨细胞(OCL)在内的多种不同的组织的mRNA进行了杂交。

    图11A-11C展示了Northern印迹杂交结果，其中将源自鼠OSCAR片段OCL178的标记cDNA与源自骨髓衍生巨噬细胞(BMM)和破骨细胞(OCL)的mRNA进行杂交，并与通过体外TRANCE处理使其分化为类破骨细胞的RAW264.7细胞(RAW)的mRNA进行比较。图11A对比了源自巨噬细胞和破骨细胞的mRNA的Northern印迹杂交和TRANCE给药后0、3和24小时后提取的RAW264.7细胞(RAW)的mRNA的Northern印迹杂交。图11B展示了TRANCE给药后1、2、3、4天的RAW264.7细胞mRNA的Northern印迹杂交。图11C对比了从头盖骨和长骨组织中提取的mRNA的Northern印迹杂交和骨髓衍生破骨细胞(BMOC)mRNA的Northern印迹杂交。

    图12A-12B展示了利用标记的鼠OSCAR核苷酸探针对EcoR I和Bgl II消化过的小鼠(图12A)和人(图12B)基因组DNA进行的Southern印迹杂交分析。

    图13A-13B对原代成骨细胞进行的FACS分析，其中首先要利用同工型对照组人IgG1(图13A)或可溶性OSCAR-Ig融合多肽(图13B)对这些原代成骨细胞进行染色，随后利用PE缀合的抗人IgG1抗体进行染色处理。

    图14展示了一图表，其给出了在可溶性OSCAR-Ig融合多肽(■)或人IgG1(□)存在下，骨髓细胞与成骨细胞共培养且利用所指示的量的维生素D3进行处理时观察到的TRAP(+)多核破骨细胞的数量。

    图15A-15C图示了动力学实验数据，其中，TRAP(+)多核破骨细胞的数量是在维生素D3(□)、维生素D3和可溶性OSCAR-Ig融合多肽(◇)、或维生素D3和对照组IgG1多肽(○)存在的情况下孵育6、7、8和9天后的破骨细胞前体和破骨细胞(图15A-C)共培养物进行计数得到的。在图15A-B中，总骨髓细胞指破骨细胞前体，而在图15C中，共培养实验选用的是M-CSF-依赖型骨髓悬浮细胞。图15B是一条线图，其指示了在共温育实验中温育7天后观察到的TRAP(+)多核破骨细胞的数量。

    图16A-16J是利用鼠骨髓细胞和破骨细胞的共培养物进行的牙质吸收检验(见，Tamura et al，J.bone Miner.Res.1993，8：953-960)的图片。图16A-16E是TRAP(+)破骨细胞在牙质切片上的光学显微照片。图16F-16J是将细胞取出后相应的牙质切片光学显微照片。这些显微照片中，黑染色指示其中的牙质已被吸收的区域。详细来讲，图16A和16F分别展示了单独温育在生长培养基中的TRAP(+)细胞和牙质切片。图16B和16G是在维生素D3存在的情况下进行温育的TRAP(+)细胞(图16B)和牙质切片(图16G)的光学显微照片。与维生素D3和可溶性鼠OSCAR-Ig融合多肽共温育的TRAP(+)细胞和牙质切片的光学显微照片分别在图16C和16H中有示。图16D和16I是与维生素D3和TR-Fc融合多肽共温育的TRAP(+)破骨细胞(图16D)和牙质切片(图16I)的照片。图16E和16J分别为与维生素D3和对照组IgG1融合多肽共温育的TRAP(+)细胞和牙质切片的光学显微照片。

    图17是给出了从图16A-16J中展示的牙质吸收数据得到的定量结果的条形图。吸收坑数目是通过对牙质切片进行计数得到的，其中鼠破骨细胞前体和成骨细胞的共培养物在单独的生长培养基(“培养基”)中进行温育、与维生素D3(“Vit.D3)共温育、与维生素D3和OSCAR-Ig(Vit.D3+OSCAR-IgG)共温育、或与维生素D3和对照组IgG1多肽(Vit.D3+IgG)共温育。

    图18A和18B展示了利用人单核细胞培养物进行实验得到的数据，其中对这些细胞在下列情况下进行培养：(a)单独的M-CSF(“M”)；(b)M-CSF和TRANCE(“MT”)；(c)M-CSF，TRANCE和可溶性人OSCAR-Ig融合多肽(“MT+hOSCAR-IgG”)；M-CSF，TRANCE和可溶性鼠OSCAR-Ig融合多肽(“MT+mOSCAR-IgG”)；(c)M-CSF，TRANCE和对照组IgG1多肽(“MT+IgG”)；及(d)M-CSF，TRANCE和TR-Fc融合多肽(“MT+TR-Fc”)。在温育5天(图18A)和10天(图18B)后对每个培养物中的TRAP(+)多核破骨细胞进行计数。

    图19A-19F展示了在下列情况下温育5天的人单核细胞的光学显微照片：M-CSF存在的情况下(图19A)；M-CSF和TRANCE存在的情况下(图19B)；M-CSF，TRANCE和可溶性人OSCAR-Ig融合多肽存在的情况下(图19C)；M-CSF，TRANCE和可溶性鼠OSCAR-Ig融合多肽存在的情况下(图19D)；M-CSF，TRANCE和TR-Fc融合多肽存在的情况下(图19E)；及M-CSF，TRANCE和人IgG1多肽存在的情况下(图19F)。在图19B和19F中，多核TRAP(+)破骨细胞用箭头标出。

    图20A-20F展示了在下列情况下温育5天的人单核细胞培养物的光学显微照片：M-CSF存在的情况下(图20A)；M-CSF和TRANCE存在的情况下(图20B)；M-CSF，TRANCE和可溶性人OSCAR-Ig融合多肽存在的情况下(图20C)；M-CSF，TRANCE和可溶性鼠OSCAR-Ig融合多肽存在的情况下(图20D)；M-CSF，TRANCE和TR-Fc融合多肽存在的情况下(图20E)；及M-CSF，TRANCE和人IgG1多肽存在的情况下(图20F)。在图20B和20F中，多核TRAP(+)破骨细胞用箭头标出。

    图21A-J是利用人单核细胞进行的牙质吸收检验(Tamura etal.，J.bone.Miner.Res.1993，8：953-960)的光学显微照片。图21A-E是培养在牙质切片上的TRAP(+)人破骨细胞的显微照片。图21F-J是去除细胞后相应的牙质切片的显微照片。这些显微照片中的黑染色区表示此处的牙质已为吸收。更详细的讲，图21A和21F分别展示在单独M-CSF存在的情况下温育的TRAP(+)人细胞和牙质切片。图21B和21G是在与M-CSF和TRANCE共温育时的TRAP(+)人细胞(图21B)和相应的牙质切片(图21G)的显微照片。图21C和21H分别展示了在可溶性鼠OSCAR-Ig融合多肽存在时温育的TRAP(+)人细胞的显微照片。图21D和21I分别是与TR-Fc融合多肽共温育时TRAP(+)人细胞(图21D)和相应的牙质切片(图21I)的显微照片。图21E和21J是与IgG1多肽共温育时TRAP(+)人细胞(图21E)和相应的牙质切片(图21J)的显微照片。

    图22A-22F展示了鼠成骨细胞和骨髓细胞共培养物在以下条件下培养6天后的显微照片：单独生长培养基(图22A)、存在维生素D3(图22B)、存在维生素D3和人OSCAR-Ig融合蛋白(图22C)、存在维生素D3和鼠OSCAR-Ig融合蛋白(图22D)、存在维生素D3和TR-Fc融合多肽(图22E)、存在维生素D3和人IgG1多肽(图22F)。

    图23图示了从图22A-22F展示的鼠共培养物实验中得到的定量数据。特别的，给出了上文描述的图22A-22F中每个共培养物的成熟TRAP(+)多核破骨细胞数。

    图24A-B展示了人OSCAR基因及其基因产物的S1剪接变体的cDNA序列(图24A，SEQ ID NO：26)和预测的氨基酸序列(图24B，SEQ ID NO：25)。每个序列的起始(ATG)和终止(TGA)密码子用大写字母标出。

    图25A-B展示了人OSCAR基因及其基因产物的S2剪接变体的cDNA序列(图25A，SEQ ID NO：28)和预测的氨基酸序列(图25B，SEQ ID NO：27)。每个序列的起始(ATG)和终止(TGA)密码子用大写字母标出。

    图26A展示了鼠OSCAR基因的M3剪接变体的cDNA序列(图26A，SEQ ID NO：30)。每个序列的起始(ATG)和终止(TGA)密码子用大写字母标出。图26B(SEQ ID NO：29)中显示了由两种cDNA转录物编码的OSCAR多肽序列。

    图27A展示了鼠OSCAR基因的M4剪接变体的cDNA序列(图27A，SEQ ID NO：32)。每个序列的起始(ATG)和终止(TGA)密码子用大写字母标出。图27B(SEQ ID NO：31)中显示了由两种cDNA转录物编码的OSCAR多肽序列。

                           发明详细描述

    本发明涉及此处称为“破骨细胞相关受体”或OSCAR基因的新颖基因及其基因产物。在此处第一次描述的OSCAR基因及其基因产物是在破骨细胞中特异表达的。此外，申请人也发现存在破骨细胞表达的、此处称为“OSCAR配基”或“OSCAR-L”的OSCAR特异性配基。本发明的OSCAR特异性配基也可由其他细胞来表达，这些细胞包括如鼠胚胎成纤维细胞、鼠NIH3T3成纤维细胞、鼠ST-2类成骨细胞、水貂肺上皮细胞、大鼠UMR106类成骨细胞、人HEK293和HEK293T细胞、hFOB1.19和猴子COS-1细胞。OSCAR配基可与OSCAR基因产物结合。在下文实施例描述的实验中，将为成熟的破骨细胞与表达OSCAR配基的成骨细胞接触可有效的刺激包括增加成熟的多核成骨细胞的数目在内的成骨细胞成熟。然而，对OSCAR基因产物的可溶性融合蛋白给药抑制了OSCAR配基与这些破骨细胞表达的OSCAR多肽的结合，从而抑制了破骨细胞的成熟。因此，OSCAR基因及其基因产物可用于调节(也即提高或降低)破骨细胞的活性，因此，其在如治疗与包括骨硬化症和骨质疏松症在内的异常骨生长相关的疾病和紊乱的方法中是有用的。

    一般来讲，OSCAR多肽是由与下文描述的OSCAR核酸序列的互补体发生杂交的基因编码的多肽。通常，本发明中的全长OSCAR多肽的表观分子量约为35kDa或约为40kDa。本发明中的OSCAR多肽也如下文实施例中所述对破骨细胞的成熟进行调节。

    OSCAR多肽进一步表征为免疫球蛋白超家族成员，包括两个免疫球蛋白结构域和一个跨膜结构域，这在下文中有详细描述。因此，在优选的实施方案中，本发明中的OSCAR多肽与其他免疫球蛋白和多肽，如鼠PirA和牛FcαR具有氨基酸序列同源性和/或氨基酸序列同一性。例如，但没有限制本发明的意图，利用BLASP算法(标准参数)对NCBI蛋白数据库进行搜索以对与图1C中所示特定的OSCAR多肽类似的多肽进行鉴定，结果表明，此多肽与鼠PirA6(GenBank编号为AAC53217.1)具有26.4％的序列同一性，而与多肽牛FcαR(GenBank编号为P24071)具有24.2％的序列同一性。

    OSCAR多肽也可由其在细胞中的表达方式进行表征。特别的，除那些已对其进行转化以表达OSCAR多肽的宿主细胞外，OSCAR多肽优选的为破骨细胞特异性表达，而优选的不为其他细胞类型所表达。特别的，本发明的OSCAR多肽优选的不为包括巨噬细胞和树突细胞在内的其他骨髓衍生细胞表达。

    在一特定实施方案中，本发明的OSCAR多肽是源自鼠科动物(也即小鼠)细胞或具有源自鼠细胞的肽的氨基酸序列。例如，本发明中的鼠OSCAR多肽可包含图1C(SEQ ID No：3)中所示氨基酸序列。此序列含有相应于至少5个不同结构域的序列：信号肽序列(含有SEQ ID NO：3的1-16位氨基酸残基)、两个类Ig结构域序列(分别含有SEQ ID NO：3的17-122和123-228位氨基酸残基)、跨膜结构域(含有SEQ ID NO：3的229-247位氨基酸残基)和胞质尾结构域序列(含有SEQ ID NO：3的248-264位氨基酸残基)。

    在该具体实施方案中的多个方面中，成熟的OSCAR多肽缺乏信号肽序列。因此，在另一特定的实施方案中，本发明的OSCAR多肽包括与图1C(SEQ ID NO：3)所示序列的17-264位氨基酸残基相对应的氨基酸序列。在另外的实施方案中，本发明中的可溶性OSCAR多肽缺乏跨膜结构域和(在绝大多数实施方案中)胞质尾结构域。相应的，在其他特定实施方案中，本发明中的OSCAR多肽包括与图1C(SEQID NO：3)所示序列的17-228位氨基酸残基及，任选地，248-264位氨基酸残基相对应的氨基酸序列。

    在其他特定实施方案中，本发明的OSCAR多肽是源自人细胞的多肽或基本上相应于源自人细胞的多肽。例如，本发明的人OSCAR多肽可含有此处称做“C18人OSCAR同工型”、含有图3B(SEQ ID NO：7)中所示氨基酸序列的多肽的氨基酸序列。优选的，如图3B(SEQID NO：7)所示，C18人OSCAR氨基酸序列的97位氨基酸为丝氨酸(Ser或S)。然而，在另一个示范性实施方案中，此序列的97位氨基酸可为异亮氨酸(Ile或I)。C18人OSCAR氨基酸序列也包括与至少4个结构域相对应的氨基酸序列，所述四个结构域与上文描述的、图1C(SEQ ID NO：3)描述的鼠OSCAR多肽的四个结构域相对应。特别的，C18人OSCAR同工型包括信号肽序列(含有SEQ IDNO：7的1-18位氨基酸残基)、两个类Ig结构域序列(分别含有SEQ ID NO：7的19-123和124-229位氨基酸残基)、跨膜结构域(含有SEQ ID NO：7的230-248位氨基酸残基)及胞质尾结构域序列(含有SEQ ID NO：7的249-263位氨基酸残基)。

    另外，本发明的人OSCAR多肽可含有此处称做“C16人OSCAR同工型”、含有图4B(SEQ ID NO：9)中所示氨基酸序列的多肽的氨基酸序列。而在另一个特定实施方案中，本发明的人OSCAR多肽可含有此处称做“C10人OSCAR同工型”、含有图5B(SEQ ID NO：11)中所示氨基酸序列的多肽的氨基酸序列。优选的，如图5B(SEQ IDNO：11)所示，C10人OSCAR氨基酸序列的86位氨基酸为丝氨酸(Ser或S)。然而，在另一个示范性实施方案中，此序列的86位氨基酸可为异亮氨酸(Ile或I)。这些人OSCAR多肽含有与至少4个结构域相对应的氨基酸序列，所述四个结构域与上文描述的、图1C(SEQ ID NO：3)中的鼠OSCAR多肽及图3B(SEQ ID NO：7)中的C18人OSCAR同工型的四个结构域相对应。

    特别的，C16人OSCAR同工型包含信号肽序列(含有SEQ IDNO：9的1-18位氨基酸残基)、两个类Ig结构域序列(分别含有SEQ ID NO：9的19-127和128-233位氨基酸残基)、跨膜结构域(含有SEQ ID NO：9的234-252位氨基酸残基)及胞质尾结构域序列(含有SEQ ID NO：9的253-267位氨基酸残基)。

    特别的，C10人OSCAR同工型包含信号肽序列(含有SEQ IDNO：11的1-13位氨基酸残基)、两个类Ig结构域序列(分别含有SEQ ID NO：11的14-112和113-218位氨基酸残基)、跨膜结构域序列(含有SEQ ID NO：11的219-237位氨基酸残基)及胞质尾结构域序列(含有SEQ ID NO：11的238-252位氨基酸残基)。

    如上文对本发明的鼠OSCAR多肽所述，在这些实施方案的多个方面中，成熟的人OSCAR多肽可缺乏信号肽序列。因此，在其他特定实施方案中，本发明中的人OSCAR多肽可含有相应于图3B(SEQ IDNO：7)中所示序列的19-248位氨基酸残基、图4B(SEQ ID NO：9)中所示序列的19-252位氨基酸残基、图5B(SEQ ID NO：11)中所示序列的14-252位氨基酸残基的氨基酸序列。在另外的实施方案中，本发明中的可溶性人OSCAR多肽缺乏跨膜结构域和(在绝大多数实施方案中)胞质尾结构域。相应的，在其他特定实施方案中，本发明中的OSCAR多肽可包含对应于下述残基的氨基酸序列：(1)图3B(SEQ ID NO：7)所示序列的19-229位氨基酸残基，及，任选地，249-263位氨基酸残基；(2)图4B(SEQ ID NO：9)所示序列的19-233位氨基酸残基，及，任选地，234-252位氨基酸残基；或(3)图5B(SEQ ID NO：11)所示序列的14-218位氨基酸残基，及，任选地，219-237位氨基酸残基。

    在其他替代实施方案中，本发明中的OSCAR多肽是与图1C(SEQID NO：3)、图3B(SEQ ID NO：7)、图4B(SEQ ID NO：9)、图5B(SEQ ID NO：11)、图24B(SEQ ID NO：25)、图25B(SEQ IDNO：27)、图26B(SEQ ID NO：29)及图27B(SEQ ID NO：31)中的所示OSCAR多肽序列具有至少25％，或至少30％，至少50％，更优选至少70％，更优选至少75％，甚至更优选至少90％同一性的多肽。

    在其他实施方案中，本发明的OSCAR多肽包含有此处描述的全长OSCAR多肽的片段(如SEQ ID NO：3、7、9或11所示的片段)。例如，下文的实施例描述了编码含有图2B(SEQ ID NO：5)描述的氨基酸序列的全长OSCAR基因产物的片段的OSCAR基因片段(称做OCL178)。全长OSCAR基因产物的其他示范性片段为多肽含有上文针对全长OSCAR多肽描述的多个结构域中的一个(如含有信号肽序列结构域、类Ig结构域、跨膜结构域或胞质尾结构域的氨基酸序列的片段)或含有这些结构域之一的一部分的片段的多肽。全长OSCAR多肽的其他片段包括含有上文就全长OSCAR多肽所述的两个或多个结构域的任何结合的片段，如含有相应于选自由信号肽序列结构域、类Ig结构域(如SEQ ID NO：3、7、9或11的第一或第二个类Ig结构域)、跨膜结构域或胞质尾结构域组成的组中的两或多个结构域的氨基酸序列的片段。

    这样的OSCAR多肽片段对如构建下文定义的多种融合多肽来讲是有用的。例如，包含有信号肽结构域的融合多肽可用来使宿主细胞将融合多肽靶向分泌到培养基中以对其进行提取和纯化。含有跨膜结构域的融合多肽可用于使融合多肽在细胞表面表达。在优选的实施方案中，包含全长OSCAR多肽的一或多个类Ig结构域的融合多肽可用于合成可与类Ig结构域特异性结合的抗体，并用于检测破骨细胞表面上的OSCAR表达。另外，可合成能与OSCAR配基结合的包含OSCAR类Ig结构域的可溶性融合多肽。这样的融合多肽在下文实施例中有描述，并且是有用的，例如作为OSCAR配基的竞争物，减少破骨细胞的数量和降低其活性方面。因此，本发明的OSCAR多肽包括含有OSCAR基因产物或其片段的序列的融合多肽。

    OSCAR核酸可以是DNA或RNA分子及含有下文描述的任意修饰(如修饰的碱基和/或主链)的核酸分子。在一优选实施方案中，这些核酸与编码本发明的OSCAR多肽的编码序列具有至少50％、更优选至少75％、更更优选至少90％序列同一性；例如图1A-B(SE ID NO：1-2)中或图3A、4A、5A、24A、25A、26A或27A(分别为SE IDNO：6、8、10、26、28、30和32)中任一所示编码序列。或者，本发明中的OSCAR核酸可为编码与如图1C中(SE ID NO：3)或图3B、4B、5B、24B、25B、26B或27B(分别为SE ID NO：7、9、11、25、27、29和31)中任一所示OSCAR多肽序列具有至少25％、更优选至少50％、更更优选至少70％、更更优选至少75％、甚至更优选至少90％同一性的多肽的核酸。

    或者，在下文所示反应条件下，编码OSCAR多肽的核酸可与这样的编码序列的互补体或这样的编码序列的片段进行杂交。例如，下文实施例描述了对利用琼脂糖凝胶电泳确定的表观长度分别为4.0kb、1.8kb和1.0kb的OSCAR mRNA分子进行的鉴定，所述OSCAR mRNA分子可与包含在克隆OCL178中并在图2(SEQ ID NO：4)中所示OSCAR片段进行杂交。

    本发明中的OSCAR核酸包括已对其进行加工或“剪接”从而从OSCAR基因组序列中去除了内含子序列的核酸，如由其衍生的mRNA和cDNA。另外，OSCAR核酸也可以是未进行加工的核酸，例如含有内含子和外显子序列的基因组OSCAR序列、未剪接的OSCAR mRNA序列和由其衍生cDNA序列。

    例如，图7A-D描述了含有人OSCAR基因序列的人染色体19克隆CTD-3093(GenBank编号为AC01234.5；GI：771547)的一个区域的核苷酸序列(SEQ ID NO：12)。以前对存在包含有这一人染色体序列区域的OSCAR基因组序列是未知的，此处是第一次对其进行描述。因此，本发明的OSCAR核酸中包括这些OSCAR基因组序列。特别的，图7A-D中所示基因组序列(SEQ ID NO：12)包括外显子序列，这些外显子序列被或可能被转录成编码本发明的OSCAR基因产物的RNA。这些外显子序列在图7A-D中以大写字母标出。图7A-D中所示基因组序列(SEQ ID NO：12)也包括内含子序列和5′-和3′-未加工区域(UPR)，所有这些在图7A-D中以小写字母标出。特别的，图7A-D和SEQ ID NO：12所示OSCAR基因组序列包括表1所示内含子和外显子结构域。

    表1：人OSCAR(SEQ ID NO：12)的内含子/外显子范围

    核苷酸残基              区域

    1-767                   5′-UPR

    768-841                 Exon 1

    842-1818                Intron 1

    1819-1851               Exon 2

    1852-1997               Intron 2

    1998-2009               Exon 3

    2010-4439               Intron 3

    核苷酸残基           区域

    4440-4742            Exon 4

    4743-5013            Intron 4

    5014-5295            Exon 5

    5296-5809            Intron 5

    5810-6499            Exon 6

    6500-7920            3＇-UPR

    因此，本发明中的OSCAR核酸分子包括基因组OSCAR核酸分子。这样的基因组OSCAR核酸分子包括含有图7A-D(SEQ ID NO：12)中所示OSCAR基因组序列的核酸分子。本发明中的基因组OSCAR核酸分子也包括含有与全长OSCAR基因组序列的一或多个外显子或内含子相对应的序列的核酸分子，包括含有如与图7A-D中所示及在上文表1中特别所示一或多个外显子和内含子序列相对应的核酸序列的核酸分子。

    本发明中的OSCAR核酸也包含全长OSCAR序列的片段。例如，在优选的实施方案中，这样的OSCAR核酸片段包含与全长编码OSCAR核酸序列的至少10个核苷酸、优选至少15个核苷酸及更优选20个核苷酸序列相对应的核苷酸序列。在一特定实施方案中，这些片段与图1A-B、2A、3A、4A、5A、24A、25A、26A或27A(分别为SE ID NO：1-2、4、6、8、10、26、28、30和32)中的OSCAR编码序列的一部分(如至少10、15或20个核苷酸)相对应。在其他优选实施方案中，OSCAR核酸片段含有至少10个、优选至少15个及更优选至少20个核苷酸的序列，所述序列在下文详细描述的条件下可与全长OSCAR核酸序列，如图1A-B、2A、3A、4A、5A、24A、25A、26A或27A(分别为SE ID NO：1-2、4、6、8、10、26、28、30和32)中的任一OSCAR核酸序列或这些全长OSCAR序列的互补体进行杂交。本发明中的OSCAR核酸片段也可包含与OSCAR基因组序列(如图7A-D中描述的及SEQ ID NO：12中所示序列)的至少10、15或20个核苷酸的序列相对应的核苷酸序列。或者，OSCAR核酸片段可包含在下文详细描述的条件下可与OSCAR基因组序列(如图7A-D中描述的及SEQ IDNO：12中所示基因组序列)、OSCAR基因组序列的一或多个外显子或内含子(如图7A-D中展示的和上文表1中描述的外显子和内含子)或这样的OSCAR基因组序列的互补体进行杂交的、含有至少10、15或20个核苷酸的序列。

    包含这些片段的核酸分子在如作为寡核苷酸探针和引物以对OSCAR基因进行检测或扩增方面是有用的。然而，寡核苷酸片段也可用做反义核酸、三螺旋形成寡核苷酸或用作核酶。然而，本发明中含有OSCAR序列的一或多个片段的核酸分子也可以是OSCAR基因产物的全长编码序列。

                              定义

    一般定义。在本发明的上下文和每个术语应用的特定上下文范围内，本说明书中应用的术语在本领域中一般具有它们的常规含义。在下文或本发明的其他部分对某些术语进行了讨论以在对本发明的设备与方法描述及如何对其施行并进行利用方面为实施者提供额外的指导。

    术语“与骨生长有关的紊乱”、“与骨生长相伴随的紊乱”、“骨生长紊乱”、“骨生长疾病”及其多种变化在此处一般指任何与骨组织异常生长、修复发育、吸收、吸收、降解或稳态相关的疾病或紊乱。因此，与骨生长相关的紊乱包括与个体骨质异常增加及异常减少相关的疾病和紊乱。另外，本发明中的与骨生长相关的紊乱可包括，但并不局限于与破骨细胞活性异常(如增加或减少)相关的紊乱。本发明中的与骨生长相关的紊乱进一步包括与成骨细胞活性异常(如增加或减少)相关的紊乱。可利用本发明中的方法和组合物进行诊断或治疗的与骨生长相关的紊乱的示例包括骨质疏松症、骨硬化症、佩吉特病、成骨不全、骨纤维发育不良、磷酸酶过少症、原发性甲状旁腺功能亢进症、关节炎、牙周疾病和骨髓瘤血液疾病。另外，在骨中或远离骨的多种恶性肿瘤，如乳腺癌、肺癌、前列腺癌、甲状腺癌及肾癌中的骨骼转移、恶性肿瘤的体液性高钙血症及多发性骨髓瘤可诱导骨质溶解。

    与骨生长相关的紊乱可能与OSCAR核酸、基因产物或多肽有直接或间接的关系。这些紊乱包括与OSCAR基因或其基因产物的异常合成或表达相关的紊乱，也包括OSCAR基因及其基因产物的异常活性(如升高或降低)导致的疾病和紊乱，如与OSCAR基因或其基因产物的异常生物活性相关的紊乱。本发明中与OSCAR相关的其他紊乱包括那些同与OSCAR基因、OSCAR基因产物或OSCAR多肽相互作用的另一种化合物(如天然配基或其他细胞化合物)的异常合成、表达或异常活性相关的紊乱。此外，本发明中与OSCAR相关的紊乱包括这样一些紊乱，它们本身不是由OSCAR基因或基因产物的异常合成、表达或异常的活性引起的或与之相关，但可利用能对OSCAR基因、OSCAR基因产物或OSCAR多肽的合成、表达或其活性进行调节(如升高或降低)的方法或可对能与OSCAR基因、OSCAR基因产物或OSCAR多肽相互作用的化合物(如天然配基或其他细胞化合物)的合成、表达或其活性进行调节的方法进行治疗。

    正如此处所用的，术语“分离的”指将所述物质从其正常存在的环境中提取出来。因此，分离的生物物质可不含细胞组分，也即此物质存在或从中制备的细胞中的组分。对核酸分子来讲，分离的核酸包括PCR产物、分离的mRNA、cDNA、或限制性片段。在另一实施方案中，分离的核酸优选的是从其存在的染色体中切割下来的核酸，更优选的是该核酸分子不与其处于染色体上时包含的基因上游或下游的非调控、非编码区或其它基因相连。而在另一实施方案中，分离的核酸分子缺乏一或多个内含子。分离的核酸分子包括插入到质粒、粘粒、人工染色体等中的序列。因此，在一特定实施方案中，重组体核酸是分离的核酸分子。分离的蛋白可与在细胞内与之相关的其他蛋白或核酸或蛋白和核酸相关联，或如其为与细胞膜相关的蛋白时可与细胞膜相连。分离的细胞器、细胞或组织是已从其存在的生物体的解剖学位点中取出的细胞器、细胞或组织。分离的物质可为，但不一定为纯化的物质。

    正如此处所用的，术语“纯化的物质”指在减少或消除不相关的物质，也即污染物存在的条件下，分离出来的物质，而这些污染物包括获得此纯化物质的环境中的天然物质。例如，纯化的蛋白优选的基本上不含细胞中与其相关联的其他蛋白或核酸；纯化的核酸分子优选的基本上不含它所存在的细胞中的蛋白或其他不相关的核酸。正如此处所用的，术语“基本上不含”是用于物质分析检验操作的上下文中。优选的，基本上不含污染物的纯化物质的纯度至少为50％，更优选至少90％，更更优选至少99％。可利用色谱、凝胶电泳、免疫检验、组成分析、生物学检验及本领域中的其他方法来对纯度进行评定。

    本领域中的纯化方法是众所周知的。例如，可利用沉淀、色谱(包括制备性固相色谱法、寡核苷酸杂交及三螺旋色谱)、超速离心及其他方法对核酸进行纯化。可利用多种方法，包括，但并不局限于制备性园盘凝胶电泳、等电聚焦、HPLC、反相HPLC、凝胶过滤、离子交换和分配色谱法、沉淀和盐析色谱法、萃取法和逆流分配等对多肽和蛋白质进行纯化。对某些用途来讲，优选的在重组体系中对多肽进行制备，而在此重组体系中，蛋白含有可促进纯化的额外的序列标记，如，但并不局限于多聚组胺酸序列或与抗体特异性结合的序列，如FLAG和GST。随后，可利用在合适的固相基质上进行色谱从宿主细胞粗裂解物中纯化多肽。另外，可利用针对蛋白或其衍生肽的抗体作为纯化试剂。可利用包括离心、基质分离(如尼龙羊毛分离)、淘选法和其他免疫选择技术、耗竭法(如污染细胞的互补体耗竭法)及细胞分拣(如荧光活化细胞分拣术[FACS])在内的多种技术对细胞进行纯化。其他纯化方法也可选用。纯化的物质可含有约少于50％、优选约少于75％、最优选约少于90％的与其最初相关联的细胞组分。“基本纯化的”指利用本领域中已知的常规纯化技术能够取得的最高纯度。

    此处所用的“样品”指可对其进行检验以确定OSCAR多肽或OSCAR核酸存在与否从而如评估转基因动物中的基因治疗或表达或者对特异性表达OSCAR基因及其基因产物的细胞，如破骨细胞进行鉴定的生物学物质。这样的样品可从包括组织、血液和包括循环造血干细胞(如可对其进行蛋白质或核酸检测)在内的血液细胞、多种渗漏液、脑脊液流体(CSF)、腹水及细胞培养物在内的任何来源中获得。在优选的实施方案中，样品是从骨髓中获得的。

    非人动物包括，但并不局限于，实验室动物如小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠等；家养动物如猫和狗；及农场动物如绵羊、山羊、猪、马及母牛，尤其是用人或鼠OSCAR进行转基因操作的这样的动物。

    在优选实施方案中，考虑到测定的性质或精确度，术语“大约”和“大致”一般指数量测定中可以接受的误差程度。典型的，示范性误差程度为给定值或给定值范围的20％之内，优选在10％之内，更优选在5％之内。另外，尤其是在生物体系中，术语“大约”和“大致”可指在一数量级内的值，优选在5倍于给定值之内的值，更优选在2倍于给定值之内的值。如果没有另外的声明，此处所示数值为大约值，意指没有清楚的表达时可对术语“大约”和“大致”进行推断。

    术语“分子”指含有一或多个原子的不同的或可区分的物质结构单位，包括如多肽和多核苷酸。

    分子生物学定义。按照本发明，本领域中的熟练技术人员可应用传统的分子生物学、微生物学和重组DNA技术。在文献中有对这些技术的详细解释。见，如Sambrook，Fitsch&Maniatis，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Second Edition(1989)ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork(此处称为“Sambrook et al.，1989”)：DNA Colning：APractical Approach，Volumes I and II(D.N.Glover ed.1985)；Oligonucleotide Sythesis(M.J.Gait.1984)；NucleicAcid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins，eds.1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，ed.1986)；ImmobilizedCells and Enzymes(IRL Press，1986)；B.E.Perbal，APractical Guide to Molecular Colning(1984)；F.M.Ausubelet al.(eds，)，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley&Sons，Inc.(1994)。

    术语“多聚体”指由重复性连接在一起的两或多个构件(“单体”)组成的任何物质或化合物。例如，“二聚体”指其中有两个构件连接在一起的化合物；“三聚体”指其中有三个构件连接在一起的化合物；等。

    此处所用的术语“多核苷酸”或“核酸分子”指含有能支持碱基通过氢键结合到典型的多核苷酸上的主链的多聚体分子，其中，多聚体主链以一定方式支持碱基从而允许在多聚分子和典型的多核苷酸(如单链DNA)间以特定方式进行氢键结合。这些碱基通常为次黄嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷和胸腺嘧啶核苷。多聚体分子包括“双链”和“单链”DNA和RNA，以及其主链修饰(如甲基膦酸酯键)。

    因此，“多核苷酸”或“核酸”序列一般指DNA和RNA中的一系列核苷酸碱基(也称为核苷酸)，是两或多个核苷酸的链。核苷酸序列常常携带遗传信息，包括用于细胞器制备蛋白质和酶的信息。此术语包括基因组DNA、cDNA、RNA、任何通过合成和遗传操作得到的多核苷酸，包括有义和反义多核苷酸。其包括单链和双链分子，也即DNA-DNA、DNA-RNA及RNA-RNA杂合体及碱基与氨基酸主链缀合而形成的“蛋白核酸”(PNA)。其也包括含有修饰碱基如硫代尿嘧啶、硫代鸟嘌呤及氟代尿嘧啶的核酸。

    此处的多核苷酸侧翼可含有天然的调节序列，或与包括启动子、增强子、反应元件、信号序列、多聚腺苷酸化序列、内含子、5′-和3′-非编码区域等在内的异源序列。也可通过本领域中的多种已知方法对核酸进行修饰。这些修饰的非限制性示例包括甲基化作用、“加帽”、利用类似物替代一或多个天然核苷酸、以及核苷酸间修饰如那些不带电的连接(如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺、氨基甲酸酯等)和带电的连接(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)。多核苷酸可含有一或多个额外的与其共价连接的部分，例如蛋白质(如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)、插入物(如吖啶、补骨脂素等)、螯合物(如金属、放射性金属、铁、氧化的金属等)及多种烷化剂等。可通过形成甲基或乙基磷酸三酯或烷基亚磷酰胺连接来对多核苷酸进行衍生化。此外，也可利用能够直接或间接提供可检测信号的标记对多核苷酸进行修饰。典型的标记包括放射性同位素、荧光分子、生物素等。下文对本发明进行的描述中提供了可施行的修饰的其他非限制性示例。

    “多肽”是指称作氨基酸的化学标准部件通过称为肽键的化学键相互连接在一起形成的链。术语“蛋白质”指含有基因编码的或由此基因直接或间接转录得到的核酸分子(如mRNA或cDNA)编码的氨基酸残基的多肽。任选的，蛋白质可缺乏由基因或mRNA编码的某些氨基酸残基。例如，基因或mRNA分子可编码由最终蛋白质上切制下来，因而并不构成其部分的N末端氨基酸残基序列(如信号肽)，包括酶在内的蛋白或多肽可为“天然”的或“野生型”的，意指其为天然的；或其可为“突变体”、“变体”、或“修饰后的”，意指其为制备的、修饰的、衍生化的，或在一些方面与天然蛋白或另一变体有些不同或有一些改变。

    概括来讲，“配基”是与另一分子结合的分子。在优选的实施方案中，配基是可溶性分子或两分子中的小分子或二者皆可。另一分子称为“受体”。在优选的实施方案中，配基及其受体都是细胞生成的分子(优选蛋白质或多肽)。在特别优选的实施方案中，配基是可溶性分子，而受体是整合膜蛋白(也即在细胞表面表达的蛋白)。然而，哪个分子是配基和哪个分子是受体间的差异可以是任意的，例如在一实施方案中，本发明的OSCAR多肽和OSCAR特异性配基都为或似乎都为整合膜蛋白。

    配基和其受体的结合经常是细胞内信号传导中的一步。典型的配基-受体相互作用包括，但并不局限于激素与激素受体的结合(如雌激素与雌激素受体的结合)及神经递质与神经元表面上的受体之间的结合。

    此处所用的多核苷酸“扩增”指利用聚合酶链式反应(PCR)来提高DNA序列混合物中的特定DNA序列的浓度。对PCR的描述可见Saiki et al.，Science 1988，239：487。

    DNA的“化学法序列分析”指如Maxam和Gilbert法(Maxam-Gilbert序列分析；见Maxam&Gilbert，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1977，74：560)所述的方法，其中DNA是利用各碱基特异性反应进行切割的。

    DNA的“酶法序列分析”指如本领域中众所周知的Sanger法(Sanger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1977，74：5463)或对其变化后的方法，其中利用DNA聚合酶对单链DNA进行了拷贝并随机进行终止。

    “基因”指编码功能性“基因产物”的核苷酸序列。一般来讲，基因产物是功能性蛋白。然而，基因产物也可为细胞中的另外类型的分子，例如RNA(如tRNA或rRNA)。对于本发明中的目的来讲，基因产物也指可在细胞中发现的mRNA序列。例如，按照本发明，基因表达水平测定可与mRNA水平测定相对应。基因也可包含调节(即非编码的)序列及编码序列。典型的调节序列包括确定如基因表达条件的启动子序列。基因的转录区域也可包括包含内含子、5′-非翻译区域(5′-UTR)和3′-非翻译区域(3′-UTR)在内的非翻译区域。

    “编码序列”或“编码”表达产物如RNA、多肽、蛋白质或酶的序列，指当进行表达时可产生RNA、多肽、蛋白质或酶的核苷酸序列；也即，该核苷酸序列“编码”RNA或编码所述多肽、蛋白质或酶的氨基酸序列。

    “启动子序列”指能够结合细胞内RNA聚合酶并起始转录下游(3′方向)编码序列的DNA调节区域。对于对本发明进行确定这一目的来讲，启动子序列在3′末端与转录起始位点相连并且向上游(5′方向)延伸以包括启动背景水平之上的可检测水平转录必需的最少数量的碱基或元件。在启动子序列内可发现转录起始位点(如通过利用核酸酶S1进行作图很容易就可发现)及负责与RNA聚合酶结合的蛋白结合结构域(共有序列)。

    当RNA聚合酶将编码序列转录为RNA中时，细胞中的编码序列即是在转录和翻译控制序列的“控制之下或与其“可操作性的连接”，随后所述RNA进行tRNA剪接(如果含有内含子)，并且如果此序列编码蛋白质，可将其翻译为蛋白质。

    术语“表达”指允许或引起基因或DNA序列中的信息的显现，例如通过激活与对应的基因或DNA序列的转录和翻译相关的细胞功能来制备RNA(如rRNA或mRNA)或蛋白质。细胞表达DNA序列以形成“表达产物”如RNA(如rRNA或mRNA)或蛋白质。表达产物本身如生成的RNA或蛋白质也可称为由细胞表达的。

    术语“转染”指将一外源导入细胞中。术语“转化”指将“外源”(也即外来的或细胞外的)基因、DNA或RNA序列导入宿主细胞中，这样宿主细胞可表达导入的基因或序列以制备所需的物质，在本发明中，一般是由导入的基因或序列编码的RNA，也可以是由导入基因或序列编码的蛋白质或酶。可将导入的基因或序列称为“克隆的”或“外源的”基因或序列，其可包括调节或控制序列(如细胞遗传方法中应用的起始序列、终止序列、启动子序列、信号序列、分泌序列或其他序列)。基因或序列可包括非功能性序列或具有未知功能的序列。接受和表达所导入DNA或RNA的宿主细胞是已进行了转化的细胞，是一个“转化体”或“克隆”。导入宿主细胞的DNA或RNA可取自任何来源，包括与宿主细胞同属或同种的细胞或与宿主细胞不同属或种的细胞。

    术语“载体”“克隆载体”及“表达载体”指通过其可将DNA或RNA序列(如外源基因)导入宿主细胞从而转化宿主细胞并促进导入序列的表达(如转录和翻译)的工具。载体可包括质粒、噬菌体、病毒等，在下文对其有更详细的讨论。

    “盒”指能够编码插入载体中确定的限制性位点的表达产物的DNA编码序列或DNA片段。盒限制性位点被设计成保证盒以适当阅读框架中插入。一般来讲，外源DNA被插入到载体DNA的一或多个限制性位点，并且随后由载体随同可投递的载体DNA引入到宿主细胞中。携带有插入的或添加的DNA的DNA片段或序列，例如表达载体，也可称做“DNA构建物”。“质粒”是一种普通载体，一般来讲其为完备的双链DNA分子，通常是细菌起源并可很容易的接受额外(外源)DNA且可很容易的导入适当的宿主细胞中。包括质粒和真菌载体在内的大量载体可在多种真核宿主和原核宿主中复制和/或表达。术语“宿主细胞”指对其进行筛选、修饰、转化、生长或利用或以任何方式进行操作以通过该细胞生产物质等的生物体细胞。例如，宿主细胞可为进行操作后可表达特定基因、DNA或RNA序列、蛋白质或酶的细胞。宿主细胞可进一步用于下文描述的筛选或其他检测。可对宿主细胞进行体外培养或在非人动物(如转基因动物或瞬时转染的动物)的一或多个细胞中进行培养。

    术语“表达体系”指适当条件下的宿主细胞和相容载体，例如用于在载体携带并导入宿主细胞的外源DNA编码的蛋白的表达的宿主细胞和相容载体。普通表达体系包括大肠杆菌宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细胞如Sf9、Hi5或S2细胞及杆状病毒群载体、果蝇属细胞(Schneider细胞)和表达体系、及哺乳动物宿主细胞和载体。例如，可在PC12、COS-1、或C2C12细胞中表达OSCAR。其他合适的细胞包括CHO细胞、Hela细胞、293T(人肾脏细胞)、小鼠原代成肌细胞及NIH3T3细胞。

    术语“异源的”指多种非天然存在的元件的结合。例如，本发明包括含有rRNA序列及并非为rRNA序列部分的异源RNA序列的嵌合RNA分子。在上下文中，异源RNA序列指并非天然定位于核糖体RNA序列内的RNA序列。或者，异源RNA序列可为天然定位于核糖体RNA序列内的RNA序列，但存在于天然状况下并不存在的rRNA序列位点内。正如另一示例，异源DNA指并非天然定位在细胞中或并非天然定位于细胞的染色体位点上的DNA。优选的，异源DNA包括细胞的外源基因。异源表达调节元件指可操作性的连接到天然状况下与之不相关的不同的基因上的调节元件。

    术语“突变体”及“突变”指遗传物质如DNA的任何可检测到的变化或这样的变化的任何方法、机理或结果。其包括对基因结构(如DNA序列)进行改变的基因突变、利用突变方法得到的任何基因或DNA、以及修饰后的基因或DNA序列表达的表达产物(如RNA、蛋白或酶)。术语“变体”也可用于指修饰后的或改变了的基因、DNA序列、RNA、酶、细胞等；也即任何突变体。例如，本发明涉及变改后的或“嵌合的”RNA分子，而这些分子含有通过插入并非rRNA序列的天然组成部分的异源序列或并非天然定位于rRNA序列位置处的异源序列而得到的rRNA序列。这样的嵌合RNA序列及编码他们的DNA或基因在此处也称为“突变体”序列。

    正如此处所用的，术语“寡核苷酸”指与基因组DNA分子、cDNA分子或mRNA分子编码基因、mRNA、cDNA或其他感兴趣的核酸进行杂交的含有一般至少10个、优选至少15个、更优选至少20个、但优选不超过100个核苷酸的核酸。可利用如32P-核苷酸或已与标记物如生物素或荧光染料(如Cy3或Cy5)共价缀合的核苷酸对寡核苷酸进行标记。在一个实施方案中，可将标记的寡核苷酸用做探针来检测核酸的存在。在另一实施方案中，寡核苷酸(对其中一或两个寡核苷酸已进行了标记)可用做PCR引物以用于克隆全长OSCAR或OSCAR片段或用于检测编码OSCAR的核酸的存在。在一优选实施方案中，本发明寡核苷酸可与OSCAR DNA分子形成三股螺旋。一般来讲，可利用合成方法，优选利用核酸合成仪进行寡核苷酸制备。因此，可制备含非天然磷酸酯类似物键，如硫代酯键等的寡核苷酸。

    本发明提供了可用于抑制OSCAR基因的表达或其基因产物表达的反义核酸(包括核酶)。“反义核酸”可为在胞质条件下与RNA或DNA分子中的互补碱基进行杂交以抑制后者的作用的单链核酸分子。如果RNA是信使RNA转录物，那么反义核酸就是对应转录物或mRNA干扰性互补核酸。正如此处所用的，“反义”广义的包括RNA-RNA相互作用、RNA-DNA相互作用、三螺旋相互作用、核酶和RNase-H介导的阻滞。可利用重组基因编码反义核酸分子以在细胞中表达(如美国专利NO.5,814,500；美国专利NO.5,811,234)或通过合成方法(如美国专利NO.5,780,607)对其进行制备。下文提供了本发明的反义核酸分子的具体示例。

    除上述的核酸部分之外，本发明中合成寡核酸的非限制性具体示例包括含有硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基磷酸酯、短链烷基或环烷糖间连接或短链杂原子或杂环糖间连接的寡核苷酸。最优选的是那些含有CH2-NH-O-CH2、CH2-N(CH3)-O-CH2、CH2-O-N(CH3)-CH2、CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2和O-N(CH3)-CH2-CH2主链的寡核苷酸(其中磷酸二酯是O-PO2-O-CH2)。美国专利NO.5,677,437描述了杂原子寡核苷连接。含有氮的连接子或基团也可用于制备寡核苷酸类似物(美国专利NO.5,792,844和5,783,682)。美国专利NO.5,637,684描述了磷酸酰胺和硫代磷酸酰胺寡聚化合物。本发明也包括有含有吗啉代主链结构的寡核苷酸(美国专利NO.5,034,506)。在其他实施方案中，诸如肽核酸主链中，寡核苷酸的磷酸二酯主链可以被聚酰胺主链取代，其中碱基直接或间接与聚酰胺主链上的氮杂原子进行结合(Nielsen et al.，Science 254：1497.1991)。其他的合成寡核苷酸可含有在2′位置上包含下列基团之一的取代糖基：OH、SH、SCH3、F、OCN、O(CH2)nNH2或O(CH2)nCH3(其中n为从1约到10)、C1-C10低级烷基、取代的低级烷基、烷基芳基或芳烷基、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、O-烷基、S-烷基或N-烷基、O-链烯基、S-链烯基或N-链烯基、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷基芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、荧光素、RNA切割基团、报告基团、插入物、可提高寡核苷酸药物动力学特性的基团、以及具有类似特性的取代基团。寡核苷酸也可含有替代五呋喃糖基的糖基类似物如环丁基或其他碳环形基团。寡核苷酸分子中可含有除腺嘌呤核苷酸、胞嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸及尿嘧啶核苷酸外的核苷酸单位如次黄嘌呤核苷酸。

    当单链核酸分子在适当温度和溶液离子强度条件下可与另一核酸分子退火结合，那此核酸分子与该另一核酸分子如cDNA、基因组DNA或RNA是“可杂交的”(见Sambrook et al.，上文)。温度和离子强度条件确定了杂交的“严格性”。对同源核酸的初步筛选来讲，可选用与55℃的Tm(熔解温度)相对应的低严格性杂交条件，例如，5xSSC、0.1％SDS、0.25％牛奶，不含甲酰胺；或30％甲酰胺、5xSSC、0.5％SDS。中等严格性的杂交条件与更高Tm相对应，例如40％甲酰胺及5xSCC或6xSCC。高严格性杂交条件与最高的Tm相对应，例如50％甲酰胺及5xSCC或6xSCC。SCC指0.15M NaCl和0.015M柠檬酸钠。杂交要求两核酸含有互补序列，虽然依赖于杂交的严格性，碱基间的错配也是可能的。核酸杂交的适当严格性依赖于核酸长度和互补程度这两个本领域中众所周知的变量。两核苷酸序列的类似程度或同源性越高，则含有这些序列的杂合核酸的Tm值越高。核酸杂交的稳定性(对应于较高的Tm)依下列次序降低：RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNA。对于长度超过100个核苷酸的杂合体来讲，已经导出了Tm的计算公式(见Sambrook et al.，上文，9.50-9.51)。对与更短的核酸也即寡核苷酸来讲，错配的位置变得更重要，并且寡核苷酸的长度确定了其特异性(见Sambrook et al.，上文，11.7-11.8)。可进行杂交的核酸的最小长度至少约为10个核苷酸，优选至少约15个核苷酸，更优选的长度至少为约20个核苷酸。

    在一特定实施方案中，术语“标准的杂交条件”指Tm为55℃并利用上文提出的条件。在一优选实施方案中，Tm为60℃；在一更优选实施方案中，Tm为65℃。在一特定实施方案中，“高严格性”指杂交和/或洗脱条件为在68℃下的0.2XSSC中，在42℃下的50％甲酰胺、4XSSC中，或可达到与在上述两条件下达到的杂交水平相当的杂交水平的条件。

    寡核苷酸的适当杂交条件(如寡核苷酸探针或引物的杂交条件)一般与全长核酸的杂交条件(如全长cDNA的杂交条件)不同，这是因为寡核苷酸的熔解温度较低。因为寡核苷酸的熔解温度依赖于所涉及的寡核苷酸序列的长度，因此适当的杂交温度就要依所选用的寡核苷酸而变化。典型的温度可为37℃(适用于含有14个碱基的寡核苷酸)、48℃(适用于含有17个碱基的寡核苷酸)、55℃(适用于含有20个碱基的寡核苷酸)、60℃(适用于含有23个碱基的寡核苷酸)。寡核苷酸的典型的适当杂交条件包括利用6xSSC/0.05％焦磷酸钠溶液或其他可取得相当的杂交水平的条件进行清洗。

                          OSCAR多肽

    本发明的OSCAR多肽的定义如上文所述。一优选的OSCAR多肽包括长约264个氨基酸残基的序列，并优选的包括长约16个氨基酸残基的信号肽序列。在另一实施方案中，本发明的OSCAR多肽可含有长约248个氨基酸残基的序列且不包括信号肽序列。此两实施方案中的多肽的预测分子量(由氨基酸序列计算得来)分别约为28.7KDa和27.0KDa。在其他实施方案中，可利用如糖基化作用对本发明中的OSCAR多肽进行修饰。在这些实施方案中，OSCAR多肽的表观分子量与单独利用氨基酸序列计算得到的分子量可能有差异。例如，在优选的实施方案中，OSCAR多肽的表观分子量为35KDa或40KDa(由例如SDS-PAGE测定)。

    如上文所指出的，本发明的OSCAR多肽的特征也在于他们在破骨细胞中的表达方式。特别的，除了那些经过操作，例如按照本下文描述的方法进行操作后可表达OSCAR多肽的宿主细胞外，本发明的OSCAR基因和基因产物优选的仅在破骨细胞中表达。特别的，本发明的OSCAR多肽优选的不在包括巨噬细胞和树突细胞在内的其它骨髓衍生细胞中表达。此外，本发明的OSCAR多肽优选的不在包括但并不局限于肌肉、肾脏、大脑、心脏、肝脏、肠、胸腺、脾和淋巴细胞在内的其他生物体细胞或组织中表达。然而，我们应该理解，本发明中的OSCAR多肽可在利用如含有编码OSCAR多肽的核苷酸序列的载体转化过的这些和其他类型细胞中表达。

    本发明的OSCAR多肽的特征也在于他们特殊的生物活性。特别的，如在下文实施里中所证明的，这些多肽可调节破骨细胞的成熟和活性。例如，在成骨细胞存在条件下，对本发明的OSCAR多肽给药可降低破骨细胞的成熟和活性(可通过如多核破骨细胞数量减少来确定)。虽然不希望局限于任何特定理论或作用机理，但相信这样的多肽可与成骨细胞产生的OSCAR配基竞争性结合。这样的OSCAR配基一般与破骨细胞表达的OSCAR多肽结合，以诱导那些破骨细胞的成熟。因此，通过与OSCAR配基竞争性结合，额外的OSCAR多肽给药实际上防止了破骨细胞的配基刺激作用。

    或者，当由破骨细胞表达时，本发明的OSCAR多肽的特征也在于与OSCAR配基结合后其提高破骨细胞成熟和/或破骨细胞活性的能力。

    在一特定实施方案中，本发明的OSCAR多肽包括图1C(SEQ IDNO：3)中的氨基酸序列。此鼠OSCAR多肽含有对应于至少5个不同的结构域的序列：信号肽序列(包含SEQ ID NO：3的1-16位氨基酸残基)、两个类Ig结构域序列(分别包括SEQ ID NO：3的17-122和123-228位氨基酸残基)、跨膜结构域序列(包含SEQ ID NO：3的229-247位氨基酸残基)及胞质尾结构域序列(包含SEQ ID NO：3的248-264位氨基酸残基)。我们应该理解，用来描绘这些结构域的特定氨基酸残基数目是大约值。

    在另一特定实施方案中，本发明的OSCAR多肽包括人OSCAR多肽的氨基酸序列。特别的，本发明提供了人OSCAR多肽的至少5种同工型(即变体)。这些变体在此处分别指C18人OSCAR同工型(图3B和SEQ ID NO：7中给出)、C16人OSCAR同工型(图4B和SEQ IDNO：9中给出)、C10人OSCAR同工型(图5B和SEQ ID NO：11中给出)、人OSCAR同工型S1(图24B和SEQ ID NO：25中给出)和人OSCAR同工型S2(图25B和SEQ ID NO：27中给出)。

    因此，在一特定实施方案中，本发明的OSCAR多肽包括图3B(SEQ ID NO：7)中所示氨基酸序列。此C18人OSCAR同工型包括与至少5个不同的结构域相对应的序列：信号肽序列(包含SEQ IDNO：7的1-18位氨基酸残基)、两个类Ig结构域序列(分别包括SEQ ID NO：7的19-123和124-229位氨基酸残基)、跨膜结构域序列(包含SEQ ID NO：7的230-248位氨基酸残基)及胞质尾结构域序列(包含SEQ ID NO：7的249-263位氨基酸残基)。

    在另一特定实施方案中，本发明的OSCAR多肽包括图4B(SEQ IDNO：9)中所示氨基酸序列。此C16人OSCAR同工型包括与至少5个不同的结构域相对应的序列：信号肽序列(包含SEQ ID NO：9的1-18位氨基酸残基)、两个类Ig结构域序列(分别包括SEQ ID NO：9的19-127和128-233位氨基酸残基)、跨膜结构域序列(包含SEQID NO：9的234-252位氨基酸残基)及胞质尾结构域序列(包含SEQID NO：9的253-267位氨基酸残基)。

    在另一特定实施方案中，本发明的OSCAR多肽包括图5B(SEQ IDNO：11)中所示氨基酸序列。此C10人OSCAR同工型包括与至少5个不同的结构域相对应的序列：信号肽序列(包含SEQ ID NO：11的1-13位氨基酸残基)、两个类Ig结构域序列(分别包括SEQ IDNO：11的14-112和113-218位氨基酸残基)、跨膜结构域序列(包含SEQ ID NO：11的219-237位氨基酸残基)及胞质尾结构域序列(包含SEQ ID NO：11的238-252位氨基酸残基)。

    在另一特定实施方案中，本发明的OSCAR多肽包括图24B(SEQID NO：25)中所示氨基酸序列。而此实施方案缺乏上述方案中的跨膜结构域。

    在另一特定实施方案中，本发明的OSCAR多肽包括图25B(SEQID NO：27)中所示氨基酸序列。而此实施方案缺乏上述方案中的跨膜结构域。

    在其他实施方案中，本发明的OSCAR多肽含有全长OSCAR多肽如图1C、3B、4B、5B、24B、25B、26B和27B(分别为SEQ ID NO：3、7、9、11、25、27、29和31)中所示全长多肽的一或多个结构域的氨基酸序列。因此，例如，本发明的OSCAR多肽包括含有相应于针对上述SEQ ID NO：3、7、9和11中所示任一OSCAR多肽所述的信号肽序列、任一类Ig结构域、跨膜结构域或胞质结构域的氨基酸序列的多肽。本发明的OSCAR多肽进一步包括含有相应于这些单独结构域的任何结合的氨基酸序列的多肽。我们应该理解，用来描绘这些结构域的特定氨基酸残基数目是大约值。

    本发明的OSCAR多肽也包括含有全长OSCAR多肽的表位，如图1C、3B、4B、5B、24B、25B、26B和27B(分别为SEQ ID NO：3、7、9、11、25、27、29和31)中所示全长OSCAR多肽的表位的氨基酸序列的多肽。OSCAR多肽表位代表多肽上的可制备抗体并结合抗体的位点。因此，含有OSCAR表位的氨基酸序列的多肽对于制备针对OSCAR蛋白的抗体来讲是有用的。优选的，表位含有长度至少为5个氨基酸残基，更优选的至少10、15、20、25或50个氨基酸残基的序列。因此，本发明中含有OSCAR蛋白表位的OSCAR多肽优选的含有相应于OSCAR多肽序列的至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少50个氨基酸残基的氨基酸序列。例如，在其中表位为图1C、3B、4B、5B、24B、25B、26B和27B(分别为SEQ IDNO：3、7、9、11、25、27、29和31)中所示OSCAR多肽的表位的某些优选实施方案中，OSCAR多肽含有相应于图1C、3B、4B、5B、24B、25B、26B和27B(分别为SEQ ID NO：3、7、9、11、25、27、29和31)中所示序列的至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少50个氨基酸残基的序列的氨基酸序列。

    此处也提供了包括在本发明的OSCAR多肽之内的其他片段。例如，下文实施例提供了可编码图2B(SEQ ID NO：5)中所示多肽序列的、称为OCL178的克隆。此多肽与图1C(SEQ ID NO：3)所示全长多肽的161-265位氨基酸残基的序列相对应。这些片段也包括在本发明的OSCAR多肽之内。

    本发明的OSCAR多肽也包括全长OSCAR多肽(如SEQ ID NO：3、7、9、11、25和27)的类似物和衍生物。本发明的OSCAR多肽的类似物和衍生物具有与上述OSCAR多肽相同的特性或同源的特性。

    例如，可提供OSCAR多肽的截短的形式。这些截短的形式可包括具有特定缺失的OSCAR多肽在内。例如，在特定实施方案中，可从OSCAR多肽的氨基酸序列中缺失与全长OSCAR多肽的一或多个结构域(如信号序列结构域、一或多个类Ig结构域、跨膜结构域或胞质尾结构域)相对应的氨基酸残基。在优选的实施方案中，本发明的截短的OSCAR多肽是其中信号序列结构域被缺失或去除，也即不含信号序列结构域的多肽。

    在某些实施方案中，衍生物是具有功能性活性的，也即其可展示与本发明中全长野生型OSCAR多肽相关联的一或多种功能活性。

    可制备OSCAR嵌合融合多肽，其中融合蛋白的OSCAR部分具有OSCAR多肽的一或多种特性。因此，这样的融合多肽代表了本发明中的OSCAR多肽的实施方案。典型的OSCAR融合蛋白包括包含全长、衍生的或缩短的OSCAR氨基酸序列的OSCAR融合蛋白，及含有OSCAR多肽序列的片段(如与表位或一或多个结构域相对应的片段)的OSCAR融合蛋白。这些融合多肽也可含有标记多肽的氨基酸序列，例如FLAG、组氨酸标记、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、血球凝集素或人IgG的Fc部分。在其他实施方案中，可通过细菌蛋白如β-半乳糖苷酶来对OSCAR多肽进行表达。此外，OSCAR融合多肽可含有能够提高多肽，溶解性的氨基酸序列如巯基还原酶(thioreductase)氨基酸序列或一或多个免疫球蛋白(如IgG1或IgG2)的序列。

    OSCAR类似物或变体也可通过对编码核酸分子进行修饰如通过替代、添加或缺失来制备。这些改变的核酸分子优选的编码具有类似功能的分子(也即执行一或多项OSCAR功能或具有一或多种OSCAR生物活性的分子)。因此，在一特定实施方案中，OSCAR多肽类似物是功能保守性变体。

    多肽的“功能保守性变体”是那些对多肽中的特定氨基酸残基进行了改变但并没有改变多肽的整体构象和/或功能(或生物活性)的变体。这些改变包括，但并不局限于利用具有类似特性如类似的极性、氢键键合能力、酸性、碱性、疏水性、芳香性等特性的氨基酸来对氨基酸进行替代。例如，但并不没有限制本发明的意图，精氨酸、组胺酸和赖氨酸是亲水碱性氨基酸并可相互替换。类似的，可利用亮氨酸、蛋氨酸或缬氨酸来替代疏水氨基酸异亮氨酸。预期这些变化对蛋白或多肽的表观分子量或等电点影响很小或没有影响。

    除此处明确鉴定为保守氨基酸的氨基酸外，蛋白或多肽的变体间的氨基酸残基可能有另外一些不同。因此，任何两个具有类似功能的OSCAR多肽间的蛋白或氨基酸序列相似程度百分比可不同。一般来讲，按照排序方案如CLUSTER法和/或MEGALIGN算法进行的确定，不同OSCAR多肽变体间的蛋白或氨基酸序列相似程度可为70％-99％。如通过BLAST或FASTA算法所确定的，“功能保守性变体”也包括至少具有50％、、优选至少75％、更优选至少85％及更优选至少90％氨基酸同一性的多肽。优选的，这样的功能保守性变体也具有与可与其进行对比的天然多肽相同或类似的特性、功能或生物活性。需要进一步指出的是，本发明的功能保守性变体不仅包括本发明的全长OSCAR多肽的变体(如包含图1C、3B、4B、5B、24B、25B、26B和27B(分别为SEQ ID NO：3、7、9、11、25、27、29和31)中所示序列的OSCAR多肽变体)，也包括经修饰的OSCAR多肽(如截短和缺失)的功能保守性变体或全长OSCAR蛋白的片段(如与结构域或表位相对应的片段)的功能保守性变体。

    在其他实施方案中，OSCAR多肽类似物是OSCAR多肽的等位基因变体或突变体。当用于描述多肽时，术语等位基因变体或突变体指由等位基因变体或突变体基因编码的多肽。因此，本发明的等位基因变体和突变体OSCAR多肽是由本发明的OSCAR核酸分子的等位基因变体或突变体编码的。

    在其他实施方案中，OSCAR多肽类似物是源自相同种生物体的基本同源的多肽(如等位基因变体)或源自另外种生物体的基本同源的多肽(如直向同源多肽)，优选源自另外的哺乳动物种如小鼠、人、大鼠、兔、仓鼠或豚鼠的的基本同源的多肽。然而，本发明的OSCAR同系物可为源自包括狗、猫、绵羊、山羊、猪、马、母牛、鸡及爪蟾等在内的任何种的OSCAR。例如，图3B(SEQ ID NO：7)中的OSCAR多肽序列是人OSCAR直向同源物，并与图1C(SEQ ID NO：3)中的鼠OSCAR多肽具有同源性。图6中展示的对这两个氨基酸序列进行的排序证明此两序列具有相当的序列同一性。特别的，C18人OSCAR同工型(图6中的hOSCAR，SEQ ID NO：7)的多肽序列与鼠OSCAR多肽序列(图6中的mOSCAR，SEQ ID NO：3)具有74.6％(即约75％)的同一性。

    正如此处所用的，以多种语法形式和拼写变化的术语“同源的”指可理解为具有“共同的进化起源”的蛋白质，包括源自超家族(如免疫球蛋白超家族)的蛋白质和源自不同种的同源蛋白质间的关系。见如Reeck et al.，Cell 1987，50：667)。源自不同的生物种的相对应的蛋白质就称为直向同源蛋白。正如序列相似性所反映出的，同源的和直向同源蛋白以及他们的编码基因具有序列同源性。这些序列相似性可通过如序列相似性百分数(如氨基酸序列同一性或同源性百分数)或通过保守位点处的特异性氨基酸残基或基序的存在来进行指示。

    所有语法形式的术语“序列相似性”指核酸序列或氨基酸序列间的同一性程度或一致性。除非此处另外指明，术语“同源的”仅指序列相似性，并没有必要涉及共同的进化起源。

    在一特定实施方案中，若在一或多个高度保守的结构域中，或对于等位基因而言是整个氨基酸序列中，利用此处公开的一种算法确定出两个多肽具有至少35-40％、优选至少约60％及更优选至少约90％或95％类似，那这两个多肽序列就是“基本同源的”或“基本类似的”。可用于对比氨基酸或核酸序列的序列对比方法包括BLAST法(如BLAST P、BLAST N、BLAST X)、FASTA、DNA Strider、GCG(Genetics Computer Group.Program Manual for the GCGPackage，Version 7，Madison，Wisconsion)pileup program等。除非另有声明，此处所有的序列对比是利用这些算法提供的缺省参数来施行的。这些序列的实施例是特定OSCAR基因和基因产物的等位或生物种变体，例如图1C、3B、4B、5B、24B、25B、26B和27B(分别为SEQ ID NO：3、7、9、11、25、27、29和31)中描述的OSCAR多肽序列的等位或生物种变体。利用序列数据库中的标准软件来对序列进行对比就可对基本同源的序列进行鉴定。

    在其他实施方案中，OSCAR多肽(包括类似物和同源物)是由如在确定的条件下进行的Southern杂交实验中与编码OSCAR多肽的核酸分子的互补体可进行杂交的核酸分子所编码的多肽。例如，在一特定实施方案中，OSCAR多肽的类似物和/或同源物包括由如在含有50％甲酰胺和5X或6X SSC的高严格杂交条件下与OSCAR核酸序列的互补体可进行杂交的核酸分子编码的氨基酸序列，所述OSCAR核酸序列是例如图1A、1B、2A、26A和27A(分别为SEQ1、2、4、30和31)及图3A、4A、5A、24A和25A(分别为SEQ ID NO：6、8、10、26和28)中所示任何编码序列。在其他实施方案中，OSCAR多肽类似物和/或同源物包含有由在中度严格性杂交条件下(也即含有5X或6XSSC的40％甲酰胺)或低严格性杂交条件(如在5X SSC、0.1％SDS、0.25％牛奶、无甲酰胺、30％甲酰胺、5X SSC或0.5％SDS)下与OSCAR核酸序列(如图1A、1B、2A、3A、4A、5A、24A、25A、26A和27A中所示及分别在SEQ ID NO：1-2、4、6、8、10、26、28、30和31中的编码序列)的互补体进行杂交的核酸分子编码的氨基酸序列。

    在其他实施方案中，也可通过如利用在下文描述的OSCAR多肽的氨基酸序列基础上设计的简并寡核苷酸引物进行PCR来分离变体OSCAR基因，以鉴定包括类似物、同源物和直向同源蛋白在内的变体。

    本发明的OSCAR多肽衍生物进一步包括，但并不局限于磷酸化OSCAR、肉豆蔻酰化OSCAR、甲基化OSCAR及其他进行化学修饰的OSCAR。本发明的OSCAR多肽也包括标记变体，如利用碘或磷(见如EP372707B)或其他可检测的分子如，但并不局限于生物素、荧光染料(如Cy5或Cy3)、与金属离子复合的螯合基团、发光团或荧光团、金胶体、如胶乳珠或附着到水溶性聚合物上的颗粒进行放射性标记的变体。

    在特定情况下对OSCAR核酸或多肽生物活性组分进行化学修饰可提供额外的益处。见，如于1970年12月18日授予Davis等人的美国专利4,179,337。也可参见Abuchowski等在Enzymes as drugs(J.S.Holcerberg and J.Roberts，eds.1981)第367-383页上的文章。在Francis，Focus on Growth Factors 1992，3：4-10，Mediscript：Mountview Court，Friern Barnet Lane，London N20，OLD，UK中有描述蛋白质修饰和融合蛋白的综述文章。

                         OSCAR核酸

    本发明的OSCAR核酸分子的定义也如上文所述，并包括DNA和RNA分子以及含有上述任何修饰(如修饰的碱基和/或主链)的核酸分子。一般来讲，OSCAR核酸分子包括编码OSCAR多肽的核酸序列、编码OSCAR多肽的核酸序列的互补体，及其片段。因此，在一优选实施方案中，本发明的OSCAR核酸分子包括编码图1C(SEQ ID NO：3)中所示氨基酸序列的核苷酸序列，例如图1A和1B(分别为SEQID NO：1和2)所示特别的OSCAR核酸序列。在另一优选实施方案中，本发明的核酸分子包括编码图26B(SEQ ID NO：29)中所示氨基酸序列的核苷酸序列，例如图26A(SEQ ID NO：30)中所示特别的OSCAR核酸序列。而在另一优选实施方案中，本发明的核酸分子包括编码图27B(SEQ ID NO：31)中所示氨基酸序列的核苷酸序列，例如图27A(SEQ ID NO：32)中所示特别的OSCAR核酸序列。

    在另一优选实施方案中，本发明OSCAR核酸分子包括编码图3B(SEQ ID NO：7)中所示、上文描述的C18人OSCAR同工型的氨基酸序列的核苷酸序列，包括图3A(SEQ ID NO：6)中所示特别的OSCAR核酸序列。优选的，典型的OSCAR序列(也即图3A和SEQ ID NO：6中展示的典型序列)的第328位核酸为鸟嘌呤。然而，在一典型的替代实施例中，第328位核酸为胸腺嘧啶。

    在另一优选实施方案中，本发明的OSCAR核酸分子包括编码图4B(SEQ ID NO：9)中所示、上文描述的C16人OSCAR同工型的氨基酸序列的核苷酸序列，包括图4A(SEQ ID NO：8)中所示特别的OSCAR核酸序列。而在另一优选实施方案中，本发明的OSCAR核酸分子包括编码图5B(SEQ ID NO：11)中所示、上文描述的C10人OSCAR同工型的氨基酸序列的核苷酸序列，包括图5A(SEQ ID NO：10)中所示特别的OSCAR核酸序列。

    在另一优选实施方案中，本发明的OSCAR核酸分子包括编码图24B(SEQ ID NO：25)中所示、上文描述的S1人OSCAR同工型的氨基酸序列的核苷酸序列，包括图24A中所示特别的OSCAR核酸序列。而在另一优选实施方案中，本发明的OSCAR核酸分子包括编码图25B(SEQ ID NO：27)中所示、上文描述的S2人OSCAR同工型的氨基酸序列的核苷酸序列，包括图25A(SEQ ID NO：28)中所示特别的OSCAR核酸序列。

    而在另一实施方案中，本发明的OSCAR核酸分子包括编码OSCAR多肽的一或多个结构域(如信号肽结构域、一或多个类Ig结构域、跨膜结构域或胞质尾结构域)的核酸序列或编码OSCAR多肽的结构域的任何结合的核酸序列。

    本发明的OSCAR核酸分子也包括OSCAR基因的基因组OSCAR核苷酸序列。例如，图7A-D(SEQ ID NO：12)给出了包含人OSCAR基因的核苷酸序列的、源自人染色体19的区域的核苷酸序列。因此，包括这些核苷酸序列的核酸分子也包含在本发明的OSCAR核酸范围之内。例如，在一个实施方案中，本发明的OSCAR核酸包括源自上文表1中描述的及图7A-D例示的一或多个内含子或外显子的核苷酸序列。在其他实施例中，本发明的OSCAR核酸分子包括源自OSCAR基因的外显子和/或内含子的结合的核苷酸序列。

    本发明的OSCAR核酸分子也可包括编码OSCAR多肽片段(如表位)的核酸序列。这些片段包括，如编码图2A(SEQ ID NO：4)中所示核酸序列的多核苷酸，以及编码图2B(SEQ ID NO：5)中所示多肽序列的其他核酸序列。

    本发明的OSCAR核酸分子也包括含有修饰后的多肽(如具有氨基酸替代、缺失或截短的OSCAR多肽)及OSCAR多肽变体(包括源自同种或不同生物体的类似物和同源物)的编码序列的核酸分子。在优选的实施方案中，这些核酸分子与OSCAR编码核苷酸序列，如图1A-B、3A、4A、5A、7A-D、24A、25A、26A和27A(分别为SEQ IDNO：1-2、6、8、10、12、26、28、30和32)中所示编码序列具有至少50％、优选至少75％及更优选至少90％的序列同一性。或者，本发明的核酸分子也可为在如确定的条件下进行的Southern印迹杂交检验中与OSCAR核酸分子可进行杂交的核酸分子。例如，在一特定实施方案中，标记的OSCAR cDNA与包括1.65kb EcoR I片段和5.5kb BgII片段在内的一或多个人基因组片段进行杂交。

    在一特定实施方案中，本发明的OSCAR的核酸分子包括在包括50％甲酰胺和5X或6X SSC的高度严格的杂交条件下可与OSCAR核酸序列，例如图1A-B、3A、4A、5A、7A-D、24A、25A、26A和27A(分别为SEQ ID NO：1-2、6、8、10、12、26、28、30和32)中所示任何编码序列的互补体可进行杂交的核苷酸序列。在其他实施方案中，核酸分子在中等严格的杂交条件(如含有5X或6X SSC的40％甲酰胺)或低严格性杂交条件(如在5X SSC，0.1％SDS、0.25％牛奶、不含甲酰胺、30％甲酰胺、5X SSC或0.5％SDS中)下与OSCAR核酸序列(如图1A-B、3A、4A、5A、7A-D、24A、25A、26A和27A中所示编码序列)的互补体进行杂交。尤其优选的杂交条件包括42℃下在低严格性杂交缓冲液(如30％甲酰胺、10mM Tris、pH7.6、2.5xDenhardt’s溶液、5xSSC、0.5％SDS及1.5mg/ml超声处理后的鲑鱼精子DNA)中进行杂交，随后在50℃下利用低严格性冲洗缓冲液(如0.5xSSC和1％SDS)进行冲洗。例如，下文实施例对实验进行了描述，其中小鼠的核酸片段和人基因组DNA与源自OSCAR克隆OSL178(SEQ ID NO：4)的OSCAR核酸序列进行了杂交。因此，这些基因组序列是本发明的OSCAR核酸序列的组成部分。

    或者，本发明的核酸分子可在相同定义的杂交条件下与编码全长OSCAR多肽的核苷酸序列的片段的互补体，如图2A(SEQ ID NO：4)中所示片段的互补体或与编码图2B(SEQ ID NO：5)中描述的OSCAR多肽片段的另一核酸分子进行杂交。例如，下文实施例描述对可与包含在克隆OCL178中的图2A(SEQ ID NO：4)所示的OSCAR核酸片段进行杂交的、表观长度为4.0kb、1.8kb和1.1kb的OSCAR mRNA分子进行的鉴定。实施例也描述了对可与OCL178核酸杂交的鼠和人基因组DNA片段进行的鉴定。因此，这些核酸是本发明的OSCAR核酸分子的典型实施方案。

    在其他实施方案中，本发明的核酸分子包含全长OSCAR序列的片段。例如，在优选实施方案中，这些OSCAR核酸片段包括与含有全长编码OSCAR核苷酸序列的至少10个核苷酸、优选至少15个核苷酸和更优选至少20个核苷酸的序列相对应的核苷酸序列。在特定实施方案中，这些片段对应于图1A-B、3A、4A、5A、7A-D、24A、25A、26A和27A(分别为SEQ ID NO：1-2、6、8、10、12、26、28、30和32)中的所示OSCAR编码序列的部分(如至少10、15或20个核苷酸)，或对应于编码图1C、2B、3B、4B、5B、24B、25B、26B和27B(分别为SEQ ID NO：3、5、7、9、11、25、27、29和31)中所示多肽序列的其他核苷酸序列的部分。

    在其他优选实施方案中，OSCAR核酸片段包括与全长编码OSCAR核酸序列(如图1A-B、3A、4A、5A、7A-D、24A、25A、26A和27A(分别为SEQ ID NO：1-2、6、8、10、12、26、28、30和32)中的序列)或其片段(如图2A及SEQ ID NO：4中所示序列)互补的和/或可与之进行杂交的、至少含有10个、优选至少15个、更优选至少20个核苷酸的序列。这些寡核苷酸的合适的杂交条件在上文有描述，并且包括在6x SSC/0.05％焦磷酸钠溶液中冲洗。因为寡核苷酸的熔解温度依赖于寡核苷酸序列的长度，因此，合适的杂交温度将依选用的寡核苷酸分子而变动。典型的温度为37℃(适用于含有14个碱基的寡核苷酸)、48℃(适用于含有17个碱基的寡核苷酸)、55℃(适用于含有20个碱基的寡核苷酸)、60℃(适用于含有23个碱基的寡核苷酸)。

    本发明的核酸分子也包括“嵌合的”OSCAR核酸分子。这些嵌合核酸分子是含有至少一个OSCAR核酸序列(其可为上述的任何全长或部分的OSCAR核酸序列)并且至少含有一个非OSCAR核酸序列的多核苷酸。例如，非OSCAR核酸序列可为源自另一非OSCAR基因、不与天然OSCAR基因正常相连的调节序列(如启动子序列)。非OSCAR核酸序列也可为编码另一非OSCAR多肽如FLAG、组氨酸标记、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、血细胞凝集素、β-半乳糖苷酶、巯基还原酶或免疫球蛋白的一或多个结构域(如Fc区域)的编码序列。在优选实施方案中，本发明的嵌合核酸分子编码了本发明的OSCAR融合蛋白。

    含有这些片段的核酸分子是有用的，例如，其可作为寡核苷酸探针和引物(如PCR引物)来检测和扩增其他可编码OSCAR多肽的核酸分子，包括可编码OSCAR多肽变体如OSCAR类似物或同源物的基因。本发明中的寡核苷酸片段也可用于如作为反义核酸、三螺旋形成寡核苷酸或作为核酶，来如调节细胞中的OSCAR基因表达或转录水平。

    本发明中的OSCAR核酸分子，不管是基因组DNA、cDNA或其他，都可从包括如鼠和人cDNA或基因组文库在内的来源中分离出来。获得OSCAR基因的方法在本领域中是众所周知的，如上文所述(见如Sambrook et al.，1989，上文)。

    可利用本领域中已知的标准方法从克隆DNA(如从DNA文库)中获得DNA，优选从利用该蛋白质高表达水平的组织制备的cDNA文库(例如破骨细胞文库，因为这些细胞证明具有最高OSCAR表达水平)中来获得。在一优选实施方案中，如下文实施例中所述，从“消减”文库中获取DNA，来富集由特定细胞类型特异性表达的基因的cDNA文库。例如，如在下文实施例中所述，构建了破骨细胞-巨噬细胞消减文库，其中源自破骨细胞的且也由巨噬细胞表达的cDNA的主要部分已去除。利用这样的消减文库可提高分离由破骨细胞特异性表达的而巨噬细胞并不表达的基因(如OSCAR基因)的cDNA的可能性。在其他实施方案中，可利用化学合成、cDNA克隆、或通过克隆从感兴趣的细胞中纯化的基因组DNA或其片段来制备文库。(见如，Sambrook et al.，1989，上文；Glover D.M.ed.1985，DNAColning：A Practical Approach，MRL Press，Ltd.，Oxford，U.K.Vols I and II)。

    源自基因组DNA的克隆编码区域之外还可含有调节区域和内含子DNA区域。源自cDNA的克隆一般不含有内含子序列。不管来源如何，应将基因分子克隆到适当载体中以对此基因进行增殖。可利用多种方法对含有感兴趣的OSCAR基因的特定DNA片段进行鉴定。例如，可对下文示范的OSCAR基因的一部分进行纯化并标记来制备标记探针(Benton&Davis，Science 1977，196：180；Grunstein&Hogness，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1975，72：3961)。这些与探针具有基本的同源性的片段，如源自另一个体的等位变体可进行杂交。在一特定实施方案中，可选用最高严格性的杂交条件来鉴定同源OSCAR基因。

    可基于基因的特性进行进一步筛选，如基因是否编码具有此处公开的OSCAR蛋白的等电点、电泳、氨基酸组成、部分或完全的氨基酸序列、抗体结合活性、或配基结合特征的蛋白质产物。因此，可在其表达产物的物理、化学、免疫学、或功能特性的基础上通过检测法来检测基因的存在。

    其他可编码与OSCAR基因编码的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的DNA序列可用于本发明实践中。这些序列包括，但并不局限于等位变体、种变体、序列保守变体及功能性变体。特别的，本发明的核酸序列包括功能保守变体和序列保守变体。核酸的功能保守变体是那些编码上文定义的多肽的功能保守性变体的核酸。核酸的序列保守性变体是那些具有不同的多核苷酸序列但编码相同氨基酸序列的变体。

    也可导入氨基酸替代来替代一具有尤其优选的特性的氨基酸。例如，可将Cys导入含有另一Cys的二硫桥可能位点。

    可通过本领域中多种已知的方法来生成编码本发明的OSCAR衍生物和类似物的基因。可在基因或蛋白质水平进行能够制备这些OSCAR衍生物和类似物的操作。例如，可利用本发明中已知的多种策略来对克隆的OSCAR基因序列进行修饰(Sambrook et al.，1989，上文)。可利用限制性核酸内切酶在适当的位点对序列进行切割，如果需要，随后进行进一步酶法修饰、分离和体外连接。在制备可编码OSCAR衍生物或类似物的基因中，应该注意保证修饰后的基因在编码所需活性的基因区内维持与OSCAR基因相同的翻译阅读框架，而不为翻译终止信号所打断。

    此外，可对OSCAR编码核酸序列进行体内或体外诱变以产生和/或破坏翻译、起始和/或终止序列，或在编码区域中产生变异和/或形成新的限制性核酸内切酶位点或破坏已经存在的限制性核酸内切酶位点，从而进一步促进体外修饰。也可进行修饰以导入限制性位点并促进OSCAR基因克隆入表达载体中。可选用本领域中已知的诱变技术，其包括，但并不局限于体外定点突变(Hutchinson，C.，et al.，J.Biol.Chem.253：6551，1978；Zoller and Smith，DNA 3：479-488，1984；Oliphant et al.，Gene 44：177，1986；Hutchinson，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83：710，1986)及利用TAB连接物(Pharmacia)等。PCR技术优选的用于定点突变(见Higuchi，1989，“Use PCR to engineer DNA”，in PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification，H.Erlich，ed.，Stockton Press，Chapter 6，pp.61-70)。

    随后将鉴定并分离的基因插入适当的克隆载体中。可选用本领域中已知的大量载体-宿主体系。可能的载体包括，但并不局限于质粒或修饰的病毒，但载体体系必需与选用的宿主细胞相容。载体的示例包括，但并不局限于大肠杆菌、细菌噬菌体如λ-衍生物、或质粒如pBR322衍生物或pUC质粒衍生物如pGEX载体、pmal-c、pFLAG、pKK质粒(Clonetech)、pET质粒(Novagen，Inc.，Madision，WI)、pRSET或pREP质粒(Invitrogen，San Diego，CA)或pMAL质粒(New England Biolabs，Beverly，MA)等。可通过如将DNA片段连接到含有互补粘性末端的克隆载体中来完成向克隆载体中的插入。然而，如果克隆载体中不存在可使DNA片段化的互补限制性位点，则可对DNA分子末端进行酶法修饰。或者，可通过将核苷酸序列(连接子)连接到DNA末端上来产生任何所需的位点，而这些连接子可含有编码限制性核酸内切酶识别序列的、化学合成的特异寡核苷酸。

    可通过转化、转染、感染、电穿孔等将重组体分子导入宿主细胞中，这样就可产生基因序列的多个拷贝。优选的，克隆后的基因包含在穿梭载体质粒上，可提供在克隆细胞如大肠杆菌中的扩增，并且易于纯化，以便随后插入到适当的表达细胞系中(如果需要的话)。例如，通过将大肠杆菌质粒的序列与酵母2m质粒的序列连接，可制备能够在多种类型生物体中进行复制的穿梭载体，以在大肠杆菌和酿酒酵母中进行复制。

                      OSCAR多肽的表达

    可将编码OSCAR的核苷酸序列、或抗原片段、其衍生物或类似物、或包括其嵌合蛋白在内的功能活性衍生物插入到适当的表达载体，也即含有对于插入的蛋白编码序列进行转录和翻译来讲必要的元件的载体中。因此，可将编码本发明的OSCAR的核酸操作性的连接本发明的表达载体的启动子。可在这些调节序列的控制之下，对cDNA和基因组序列进行克隆和表达。这些载体可用于功能性或功能失活的OSCAR多肽。

    可在重组体表达载体上提供必需的转录和翻译信号。

    可能的宿主-载体体系包括但并不局限于利用表达质粒转染的或利用病毒(如痘苗病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒等)感染的哺乳动物细胞体系、利用病毒(如杆状病毒)感染的昆虫细胞体系、微生物如含有酵母菌载体的酵母菌、或利用噬菌体、DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌。载体的表达元件的强度和特异性是变化的。依赖于选用的宿主-载体体系，可选用任何合适的转录和翻译元件。

    可通过本领域中已知的任何启动子/增强子元件来控制OSCAR蛋白的表达，但这些调节元件在选用于表达的细胞中必需是功能性的。可用于控制OSCAR基因表达的启动子包括，但并不局限于巨细胞病毒(CMV)启动子(美国专利NO.5,385,839和NO.5,168,062)、SV40早期启动子区域(Benoist and Chambon，1981，Nature 290：304-310)、包含在劳氏肉瘤病毒3′长末端重复中的启动子(Yamamoto，et al.，Cell 22：787-797，1980)、疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagner et al.，Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1441-1445，1981)、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster etal.，Nature 296：39-42，1982)、原核表达载体如b-内酰胺酶启动子(Villa-Komaroff，et al.，Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-3731，1978)、或tac启动子(DeBoer，et al.，ProcNatl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25，1983)也可见“UsefulProteins from recombinant bacteria，242：74-94，1980”、源自酵母菌或其他真菌的启动子元件如Gal4启动子、ADC(乙醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子、展示造血组织特异性的转录控制区域，特别是：在髓样细胞中处于活性状态的β珠蛋白基因控制区域(Mogram et al.，Nature 315：338-340，1985；Kollias et al.，Cell 46：89-94，1986)、造血干细胞分化因子启动子、红细胞生成素受体启动子(Maouche et al.，Blood，15：2557，1991)等。

    的确，可利用任何类型的质粒、粘粒、YAC或病毒载体制备可导入希望表达OSCAR基因产物的细胞或组织中的重组体核酸构建物。或者，其中在特定类型细胞或组织中表达重组体OSCAR基因产物时，可选用能够选择性感染感兴趣的细胞类型或组织类型的病毒载体。

    在另一实施方案中，本发明通过利用非内源启动子来控制细胞中内源OSCAR基因的表达从而提供了OSCAR多肽的表达方法。细胞中的内源OSCAR基因是本发明中通常(天然)存在于细胞基因组中的OSCAR基因。然而，非内源启动子是可用于控制基因表达但一般不或天然地不与内源OSCAR基因相连的启动子或其他核苷酸序列。作为示例，同源重组方法可应用(优选的利用本发明中的不编码蛋白质的OSCAR核酸序列)来在靠近内源OSCAR基因的区域中插入可扩增基因或其他调节序列。随后，插入的序列可用于如提供具有较细胞中正常的OSCAR基因表达要高的水平的OSCAR基因表达或克服内源OSCAR调节序列中可防止正常水平的OSCAR基因表达的一或多个突变(如在破骨细胞中)。这些同源重组方法在本领域中是众所周知的。见，如Skoultchi在1991年5月16日公布的、国际专利号为WO 91/06666的专利、Chappel在1991年7月11日公布的、国际专利号为WO 91/099555的专利及Kucherlapati和Campbell在1990年12月29日公布的、国际专利号为WO 90/14092的专利。

    可通过收集培养物流体来获得可溶性形式的蛋白，也可通过如变性剂处理或如果需要可利用超声处理及上述的其他机械方法来使包含体溶解从而得到可溶性形式的蛋白。可利用多种技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、等电聚焦、二维凝胶电泳、层析(如离子交换、亲合层析、免疫亲合层析以及sizing column Chromatography)、离心、溶解性差异、免疫沉淀、或通过其他标准的蛋白质纯化技术来分离溶解的或可溶性的蛋白。

                            表达载体

    多种宿主/表达载体结合可用于表达本发明中的DNA序列。有用的表达载体，例如可由染色体、非染色体及合成DNA序列区段组成。合适的载体包括SV40衍生物及已知的细菌质粒，例如大肠杆菌质粒col E1、pCR1、pBR322、pMa1-C2、pET、pGEX(Smith et al.，Gene67：31-40，1988)、pMB9及他们的衍生物、质粒如RP4；噬菌体DNA如多种噬菌体1衍生物如NM989、及其他噬菌体DNA如M13和丝状单链噬菌体DNA；酵母菌质粒如2m质粒或其衍生物；对真核细胞有用的载体如在昆虫和哺乳动物细胞中有用的载体；源自质粒与噬菌体DNA的结合的载体，例如进行了修饰以利用噬菌体DNA或其他表达控制序列的质粒；等。

    优选的载体是病毒载体，如慢病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺伴随病毒、痘苗病毒、杆状病毒及其他具有所需的细胞趋性的重组体病毒。因此，可利用病毒载体或通过DNA的直接导入将编码功能性或突变体OSCAR蛋白或其多肽结构域片段的基因进行体内、离体或体外导入。可通过病毒载体或受体配基、或利用组织特异性启动子、或两者来使转基因载体靶向特定细胞从而达到其在靶组织中的表达。在1995年10月公开的、国际专利号为WO 95/28494的专利中有对靶向基因投递的描述。

    按照本发明，可利用如OSCAR特异性抗体(也即与OSCAR基因产物特异性结合的抗体)或利用OSCAR结合配偶如OSCAR特异性配基使载体特异性靶向到破骨细胞上。也可利用OSCAR结合配偶的片段(例如肽或多肽片段)，尤其是含有OSCAR结合序列的片段使载体特异性靶向到破骨细胞上。这些方法可用于将表达任何基因的载体靶向到破骨细胞上，这些载体包括但并不局限于表达OSCAR特异性反义核酸或OSCAR特异性核酶的载体。

    类似的，以OSCAR多肽作为靶向实体，本发明也允许特异性靶向破骨细胞和真核成纤维细胞以及其他细胞表面上表达OSCAR特异性配基或OSCAR结合配偶的细胞(例如NIH3T3、ST2、Mlg、UMR106、HEK293、HEK293T、hFOB1.19及COS-1细胞)。

    通常用于体内或离体靶向和治疗方法的病毒载体为基于DNA的载体和逆转录病毒载体。构建和利用病毒载体的方法在本领域中是已知的(见如，Miller and Rosman，BioTechniques，7：980-990，1992)。优选的，病毒载体是复制缺陷型的，也即他们不能在靶细胞中自主复制。一般来讲，用于本发明领域范围内的复制缺陷型病毒载体的基因组缺乏对病毒在感染细胞中进行复制来说必需的至少一个区域。可利用本领域中的熟练技术人员已知的任何技术除去(整个或部分)这些区域或使这些区域成为非功能性区域。这些技术包括完全去除、替代(利用其他序列，尤其是通过插入的核酸)、向必需(对复制来讲)区域部分删除或添加一或多个碱基。利用基因操作技术或利用诱变试剂处理可在体外(在分离的DNA上)或原位施行这些技术。优选的，复制缺陷型病毒保留有其对包被病毒颗粒来讲必需的基因组序列。

    DNA病毒载体包括减毒的或缺陷型DNA病毒，例如但并不局限于单纯疱疹病毒(HSV)、人乳头瘤病毒、Epstein Barr病毒(EBV)、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)等。优选完全或基本完全缺乏病毒基因的缺陷型病毒。缺陷型病毒在导入细胞中后是不具有感染性的。使用缺陷型病毒载体能够特定的、局部区域对细胞进行给药，而不用担心载体会感染其他细胞。因此，可对特定组织进行特异性靶向。特定载体的示例包括，但并不局限于缺陷型疱疹病毒1(HSV1)载体(Kaplitt et al.，Molec.Cell.Neurosci.2：320-330，1991)、缺乏糖蛋白L基因的缺陷型疱疹病毒载体(PatentPublication RD371005A)、或其他缺陷型疱疹病毒载体(1994年9月29日公开的，国际专利号为WO 94/21807的专利、1994年4月2日公开的、国际专利号为WO 92/05263的专利)；减毒的腺病毒载体如Stratford-Perricaudet等描述的载体(J.Clin.Invest.90：626-630，1992；也见La Salle et al.，Science 259：988-990，1993)；以及缺陷型腺伴随病毒载体(Samulski et al.，J.Virol.61：3096-3101，1987；Samulski et al.，J.Virol.63：3822-3828，1989；Lebkowski et al.，Mol.Cell.Biol.8：3988-3996，1988)。

    很多公司商业生产病毒载体，这些公司包括，但并不局限于Avigen，Inc.(Alameda，CA；AAV载体)、Cell Genesys(FosterCity，CA；逆转录病毒，AAV载体，和慢病毒载体)、Clontech(逆转录病毒和杆状病毒载体)、Genovo，Inc.(Sharon Hill，PA；腺病毒和AAV载体)、Genvec(腺病毒载体)、IntroGene(Leiden，Netherlands；腺病毒载体)、Molecular Medicine(逆转录病毒、腺病毒、AAV和疱疹病毒载体)、Norgen(腺病毒载体)、OxfordBioMedica(Oxford，United Kingdom；慢病毒载体)和Transgene(Strasbourg，France；腺病毒载体、痘苗病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体)。

    在另一实施方案中，可以裸DNA的形式通过脂质转染法、或利用其他转染促进因子(肽、聚合物等)将载体导入体内。合成的阳离子脂质可用于制备对编码标记物的基因进行体内转染的脂质体(P54，L22-24)。在核酸转移中有用的脂质化合物和组合物在国际专利WO 95/18863和WO 96/17823及美国专利NO.5,459,127中有描述。可将脂质化学偶联到其他分子上以用于靶向用途(见Mackey etal.，上文)。可将被靶向的肽如激素或神经递质、以及蛋白如抗体、或非肽分子化学偶联到脂质体上。其他分子对于促进体内核酸分子转染是有用的，例如阳离子寡肽(如国际专利WO 95/21931)、源自DNA结合蛋白的肽(如国际专利WO 96/25508)、或阳离子性聚合物(如国际专利WO 95/21931)。

    也可能以裸露的DNA质粒的形式对载体进行体内导入。可利用本领域中已知的方法如电穿孔、微注射、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、利用基因枪、或利用DNA载体输送器(transporter)将用于基因治疗的裸露的DNA载体导入感兴趣的宿主细胞中(见如，Wuet al.，J.boil.Chem.267：963-967，1992；Wu and Wu，J.Biol.Chem.263：14621-14624，1988；Hartmut et al.，Canadian Patent Application No.2,012,311，filed March 15，1990；Williams et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：2726-2730，1991)。也可选用受体介导的DNA投递方法(Curiel et al.，Hum.Gene Ther.3：147-154，1992；Wu and Wu，J.Biol.Chem.263：4429-4432，1987)。美国专利NO.5,580,859和5,589,466公开了在哺乳动物中、在不利用转染促进剂的条件下对外源DNA序列进行投递。最近，已描述了利用相对低的电压而高效率进行体内DNA转移的技术，称为电转移(Mir et al.，C.P.Acad.Sci.，321：893，1998；WO 99/01157；WO 99/01158；WO 99/01175)。

    优选的，对体内给药来讲，将病毒载体如腺病毒载体与适当的免疫抑制处理结合应用来避免病毒载体和转染细胞的免疫失活。例如，可给予免疫抑制性细胞因子，如白细胞介素-12(Il-12)、干扰素-g(INF-γ)、或抗CD4抗体进行给药以阻断对病毒载体的体液或细胞免疫反应(见如Wilson，Nature Medicine，1995)。在这方面，应用进行了工程操作从而表达最低数量抗原的病毒载体是有益的。

                       针对OSCAR的抗体

    对于诊断和细胞内调节OSCAR活性来讲，抗OSCAR抗体是有用的，如下文所述。按照本发明，包括融合蛋白在内的重组制备或化学合成的OSCAR多肽及其片段、衍生物或类似物可用做免疫原来制备可识别OSCAR多肽的抗体。这些抗体包括，但并不局限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库。这些抗体优选的特异于(也即特异性结合)人OSCAR或鼠OSCAR。然而，抗体可特异于源自一些其它物种生物体，优选哺乳动物种的OSCAR直向同源蛋白。抗体可识别OSCAR的突变体形式或野生型OSCAR或二者皆可。

    可利用本领域中已知的多种方法来制备抗OSCAR多肽或其衍生物或类似物的多克隆抗体。对于抗体制备来讲，可通过注射OSCAR多肽、或其衍生物(如融合蛋白或片段)来对包括但并不局限于兔、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等在内的多种宿主动物进行免疫。在一个实施方案中，OSCAR多肽或其片段可缀合到免疫原的载体上，如牛血清白蛋白(BSA)或匙孔血蓝蛋白(KLH)上。依赖于宿主种类，可利用包括但并不局限于弗氏完全或不完全佐剂、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚、以及可能有用的人佐剂如BCG(Bacille Camette-Guerin)和小棒状杆菌(Corynebacteriumparvum)在内的多种佐剂来提高免疫反应。

    对于制备直接抗OSCAR多肽、其片段、类似物或衍生物的单克隆抗体来讲，可选用任何可通过在培养基中提供连续的细胞系来制备抗体分子的技术。这些技术包括但并不局限于Kohler和Milstein最初开发的杂交瘤技术(Nature 1975，256：495-497)，及trioma技术、人B细胞杂交瘤技术(P56，L22-23)、以及制备人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole et al.，in Monoclonal Antibodies andCancer therapy，Alan R.Liss，Inc.，1985，pp.77-96)。在本发明另外的实施方案中，可在不含细菌的动物中制备单克隆抗体(国际专利No.WO 89/12690)。实际上，按照本发明，可选用通过将特异于OSCAR多肽的小鼠抗体分子的基因与具有适当的生物学活性的人抗体分子的基因剪接在一起从而制备嵌合抗体的技术(Morrison etal.，J.Bacteriol.1984，159：870；Neuberger et al.，Nature1984，312：604-608；Takeda et al.，Nature 1985，314：452-454)；这些抗体都在本发明的范围之内。这样的人或人源化的嵌合抗体优选的用于对人疾病或紊乱(下文有描述)进行治疗，这是由于人或人源化抗体本身较异种抗体更不可能诱导免疫反应，尤其是过敏反应。

    可利用已知的技术来产生含有抗体分子的独特型的抗体片段。例如，这些片段包括，但并不局限于：可利用胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab′)2片段、通过还原F(ab′)2片段的二硫桥而产生的F(ab′)片段、以及通过木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子而产生的Fab片段。

    按照本发明，可对单链抗体制备技术(美国专利NO.5,476,786、5,132,405和4,946,778)进行改变来制备OSCAR多肽特异性单链抗体。本发明一额外实施方案利用了Fab表达文库构建技术(Huse et al.Science 1989，246：1275-1281)以快速而容易的鉴定对OSCAR多肽、或其衍生物或类似物具有所需特异性的单克隆Fab片段。

    在抗体的制备和应用中，可利用本领域中已知的技术，如放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附检测法)、“三明治”免疫检测法、免疫放射量测定法、凝胶扩散沉降反应、免疫扩散检验、原位免疫检验(如利用胶体金、酶或放射性同位素)、Western印迹、沉淀反应、凝集检验(如凝胶凝集检验、血球凝聚检验)、补体结合检验、免疫荧光检验、蛋白A检验及免疫电泳检验等完成所需抗体的筛选或测试。在一个实施方案中，通过对一抗上的标记进行检测而对抗体结合进行检测。在另一实施方案中，通过对二抗或试剂与一抗的结合进行检测从而对一抗进行检测。在进一步的实施方案中，对二抗进行标记。本领域中已知有许多方法可用于在免疫检验中对结合进行检测，并且这些都包括在本发明的范围之内。例如，为了筛选可识别OSCAR多肽的特异性表位的抗体，实验人员可对产生的杂交瘤进行检验，以获得与含有此表位的OSCAR多肽片段相结合的产物。对于筛选特异于特定种动物OSCAR多肽的抗体来讲，实验人员可在与这些种动物物种细胞表达的或从这些种动物细胞中分离的OSCAR多肽进行的阳性结合的基础上进行筛选。

    前述的抗体可用于本领域中与OSCAR多肽的定位和活性相关的方法，如利用上述的或本领域中已知的检测技术来进行的Western印迹、OSCAR多肽原位成像、测定其在适当的生理样品中的水平等中。如美国专利NO.5,679,582中所描述的，这些抗体也可用于测定配基结合的检验中。在生理条件如pH约为7-8及生理离子强度下，一般来讲抗体可很容易的进行结合。在缓冲溶液中存在载体蛋白可对测定起稳定作用。虽然对最佳条件的干扰，如增加或降低离子强度、温度、pH、或添加去污剂或离液盐有一定的耐受性，但这些干扰会降低结合的稳定。

    在其他实施方案中，利用淘选或相关的免疫吸附技术，抗OSCAR抗体也可用于分离可表达OSCAR多肽的细胞，如破骨细胞。

    在特定实施方案中，可产生对OSCAR多肽活性有促进或拮抗作用的抗体。特别的，细胞内单链Fv抗体可用于调节(抑制)OSCAR活性(Marasco et al.，Proc.Natl.acad.Sci.U.S.A.1993，90：7889-7893；Chen.，Mol.Med.Today 1997，3：160-167；SpitzKijma et al.，Pharmacol.Ther.1995，68：247-267)。可利用下文针对配基检验描述的方法来对这些抗体进行检验。

    如下文筛选检验部分中所描述的，抗体也可用于产生免疫毒素。

                   利用转基因动物进行体内检验

    可制备转基因动物以评定OSCAR，尤其是人OSCAR诱导的信号传导的分子机理。这些哺乳动物为筛选或检验侯选药物提供了优良的模型。因此，可制备人OSCAR“敲入”哺乳动物从而比利用人更为详细的评估此体系的分子生物学。也可在“敲除”动物上对化合物和疾病进行评估，例如对能够补偿OSCAR活性中的缺陷的化合物进行鉴定。这些技术都允许在细胞基因组中的天然位置上对他们的遗传信息的单个单位进行操作，并在终末分化生物体背景中对操作结果进行检验。可利用包括，但并不局限于对胚胎干(ES)细胞进行修饰及向囊胚细胞中进行异核注射在内的任何方法制备转基因动物。

    “敲入”哺乳动物是其中的内源基因为异源基因所替代的哺乳动物(Roamer et al.，New Biol.1991，3：331)。优选的，不管是对表达基因进行评估还是对同源基因的功能进行评估(其中的基因可为报告基因；见Elegant et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1998，95：11987)，异源基因被“敲入”到感兴趣的位置，从而将异源基因表达与从适当启动子开始的转录联系在一起。其也可利用突变体重组位点(Araki et al.Nucleic Acids Res 1997，25：868)或PCR(Zhang and Handerson，Biotechniques 1998，25：784)，通过同源重组、转座子(Westphal and Leder，Curr Biol 1997，7：530)来完成。

    “敲除哺乳动物”是指在其基因组中含有已经利用基因打靶方法(见如美国专利NO.5,777,195和5,616,491)使其失活的特定基因的哺乳动物(如小鼠)。敲除哺乳动物包括杂合子敲除(也即一缺陷型等位基因和一野生型等位基因)和纯合突变体。制备敲除哺乳动物首先需要向命名为胚胎干细胞的未分化细胞中导入用于抑制特定基因表达的核酸构建物。随后将此细胞注射到哺乳动物胚胎中。随后将含有整合细胞的哺乳动物胚胎移植到妊娠期代孕母亲体内。Zhou等(Genes and Development，1995，9：2623-34)对PPCA敲除鼠进行了描述。

    术语“敲除”指部分或完全抑制细胞中内源DNA序列编码的至少部分蛋白的表达。术语“敲除构建物”指设计来降低或抑制细胞内内源DNA序列编码的蛋白的表达的核酸序列。用做敲除构建物的核酸序列一般包括(1)源自待抑制的基因的某些部分(外显子序列、内含子序列、和/或启动子序列)的DNA及(2)用于对细胞中存在的敲除构建物进行检测的标记序列。将敲除构建物插入到细胞中，并在特定位点与细胞的基因组DNA整合以防止或中断天然DNA序列的转录。这样的插入一般是通过同源重组(也即当敲除构建物插入到细胞中并进行重组从而敲除构建物整合到内源DNA中的相应位置上时，敲除构建物中与内源DNA序列同源的区域相互杂交)来进行的。敲除核酸序列可包括(1)待抑制的基因的一或多个外显子和/或内含子的完全或部分序列，(2)待抑制的基因的完全或部分启动子序列，或(3)他们的结合。一般来讲，将敲除构建物插入到胚胎干细胞(ES细胞)中并通常利用同源重组将其整合到ES细胞基因组DNA中。随后，将此ES细胞注射并整合到正在发育的胚胎中。

    短语“基因的破坏”及“基因破坏”指将核酸序列插入到天然DNA序列的一个区域(一般为一或多个外显子)和/或基因的启动子区域中，从而相比于基因的野生型或天然序列而言减少或避免基因的表达。例如，可制备含有编码抗生素抗性基因的DNA序列的核酸构建物，此抗性基因插入到与待破坏的DNA序列(启动子和/或编码区域)互补的DNA序列中。当随后将此核酸构建物转染到细胞中时，构建物就会整合到基因组DNA中。因此，许多细胞后代将至少在一些细胞中不再表达此基因或以降低的水平来表达此基因，这是因为现在此基因已经为抗性基因所破坏。

    一般来讲，对同源重组来说，当将敲除构建物导入ES细胞基因组DNA(下文有讨论)中时，DNA长度至少约为1千碱基(kb)，优选3-4kb，从而为重组提供足够的互补序列。

    含有已经敲除或敲入或二者皆施行的两或多个基因的哺乳动物包括在本发明的范围之内。可通过重复此处的敲除构建物产生方法或通过使各具有单基因敲除的哺乳动物杂交并选择具有双敲除基因型的哺乳动物，可产生本发明中的哺乳动物。

    可利用多种体系，如tet-阻遏物体系(见美国专利NO.5,654,168)或Cre-Lox体系(见美国专利NO.4,959,317和NO.5,801,030)来制备受调控的敲除动物。

    在另一系列实施方案中，产生了转基因动物，其中(i)人OSCAR被稳定的插入到转基因动物基因组中，和/或(ii)内源OSCAR基因失活并被他们的人对应部分替代(见如，Coffman，Semin.Nephrol.1997，17：404；Esther et al.，Lab.Invest.1996，74：953；Murakami et al.，Blood Press.Suppl.1996，2：36)。可利用侯选化合物对这些动物进行处理并对神经元发育、神经元变性或侯选治疗化合物的效率进行监测。

                        应用和使用

    此处描述了OSCAR基因序列(包括全长OSCAR基因序列的片段)、OSCAR多肽(包括全长OSCAR蛋白和OSCAR融合多肽的片段)及针对OSCAR核酸和OSCAR多肽(包括全长OSCAR基因和蛋白的片段)的抗体的多种应用和使用。这些应用可包括，如预测和诊断应用以评估与OSCAR基因、OSCAR基因产物或OSCAR多肽相关联的、与骨生长相关的紊乱，包括对患有这样的紊乱或具有患这样的紊乱的倾向的个体进行鉴定。此外，这些应用可包括治疗与OSCAR基因、OSCAR基因产物或OSCAR多肽相关的紊乱的方法及用以鉴定可调节OSCAR基因、OSCAR基因产物、OSCAR多肽或他们的结合的合成、表达或活性的化合物(包括天然配基和其他细胞化合物)的筛选方法。

    如下文实施例中所证明的，本发明的OSCAR基因、基因产物和多肽的特征在于他们可调节破骨细胞成熟从而调节骨组织生长、修复、发育、吸附、降解和稳态的能力。因此，在优选方案中，本发明中的OSCAR核酸和多肽以及针对这种OSCAR核酸和多肽的抗体可用于：预测和诊断应用以对具有骨生长紊乱或骨生长紊乱倾向的个体进行鉴定；治疗与骨生长相关的紊乱的方法；用于鉴定可调节破骨细胞成熟和/或活性的化合物(包括天然配基和其他细胞化合物及合成的化学化合物)及鉴定可调节骨生长、修复、发育、吸附、降解或稳态的化合物(包括天然配基和其他细胞化合物及合成的化学化合物)的筛选方法。

                            诊断应用

    多种方法可用于对与骨生长相关的紊乱如骨硬化症和骨质疏松症进行诊断和预后评估，以及对具有这些紊乱倾向的个体进行鉴定。这些方法利用了如上文所述OSCAR核酸和多肽(包括片段、嵌合体和其融合物)以及针对这些多肽的抗体之类的试剂。例如，这些试剂可特异性的用于：(1)检测细胞中OSCAR基因的复制或缺失、OSCAR基因突变的存在、或检测相对于未受影响状态(也即在不具有与骨生长相关的紊乱或此倾向的个体中)而过高或过低表达的OSCAR基因产物(如OSCAR、mRNA)的表达；(2)相对于未受影响状态下的丰度，检测OSCAR基因产物的过高或过低的丰度；及(3)相对于未受影响的状态，检测异常OSCAR基因产物活性。

    在优选实施方案中，这些试剂可用于诊断与骨生长相关的紊乱如骨硬化症或骨质疏松症或对个体产生与骨生长相关的紊乱的倾向进行评定。

    在优选实施方案中，此处描述的方法是利用预先包装的诊断试剂盒来施行的。这些试剂盒可包含本发明中的至少一种特异性OSCAR核酸或OSCAR特异性抗体。试剂盒和其包含的任何试剂可用于如临床条件下，以对表现出异常如与骨生长相关的紊乱(如骨硬化症或骨质疏松症)的患者进行诊断。

    包含有源自个体的有核细胞(或任何细胞类型)的样品可在这些诊断方法中用作基因组核酸的来源并检测OSCAR基因的突变。包含有其中OSCAR基因可表达的任何类型细胞或任何类型组织的样品可用于这些诊断方法中，如用于检测OSCAR基因或OSCAR基因产物(如OSCAR蛋白)的表达及鉴定可表达OSCAR基因或OSCAR基因产物的细胞，尤其破骨细胞。例如，在优选实施方案中，细胞对OSCAR基因或OSCAR基因产物进行表达表明此细胞为破骨细胞。

    检测OSCAR核酸。对于检测OSCAR突变或检验样品中的OSCAR核酸序列的水平来讲，可以应用多种方法。例如，利用本领域中已知的多种技术和源自任何有核细胞的核酸可对OSCAR基因中的突变进行检测。可按照对本发明中的熟练技术人员来说众所周知的标准核酸制备技术来分离核酸。

    OSCAR核酸序列可用于这些生物样品的杂交或扩增检验中以检测与OSCAR基因结构相关的异常。这些方法可检测到的典型的异常包括点突变、单核苷酸多态性(SNPs)、插入、缺失、倒位、易位和染色体重排。可用于检测这些异常的典型检验包括Southern分析、荧光原位杂交(FISH)、单链构象多态性分析(SSCP)及聚合酶链式反应(PCR)分析。

    作为一个示例，但没有限制本发明的意图，对OSCAR基因特异性突变进行检测的诊断方法包括在适于这些试剂与它们在样品核酸中的互补序列进行特异性退火或杂交的条件下，将从样品中获得的核酸(包括重组体DNA分子、克隆基因或其简并变体)与含有一或多种标记核酸试剂，如重组体OSCAR DNA分子、克隆基因或其简并变体的样品进行接触和温育。优选的，这些核酸试剂的长度至少为15-30个核苷酸。温育完成后，去除所有的未退火结合或未杂交的核酸。如果这些分子存在，那么随后就能检测到这些已经进行杂交的核酸的存在，并可将与核酸试剂退火结合的OSCAR基因序列的退火模式与正常(也即野生型)OSCAR基因序列的退火模式进行对比，以确定是否存在OSCAR基因突变。

    在这样的检测方案的优选实施方案中，可将源自感兴趣的细胞类型或组织的核酸固定化到如固体支持物，如膜或塑料表面(如在微滴定板或聚苯乙烯珠)上。温育完成后，可轻易的去除未退火的、标记的OSCAR核酸试剂，并可利用本领域中众所周知的标准技术来对保留的、退火的、标记的OSCAR核酸试剂进行检测。

    用于在患者样品或其他细胞来源中检测OSCAR基因特异性核酸的替代诊断方法可包括如通过PCR(见如美国专利NO.4,683,202中的实验实施方案中)对它们进行扩增、并随后利用本领域中的熟练技术人员众所周知的技术来对扩增后分子进行检测。可将产生的扩增序列与那些仅含有正常拷贝的OSCAR基因的预期扩增产物进行比较从而确定样品中是否存在OSCAR突变。

    其他众所周知的基因定型技术也可用于鉴定携带有OSCAR突变的个体。这些技术包括，利用限制性片段长度多态性(RFLPs)。其他的DNA多态性分析方法可用于利用在限制性酶位点间存在的可变数量的短串联重复DNA序列对OSCAR突变进行鉴定。例如，美国专利NO.5,075,217描述了基于短串联重复模块中的长度多态性的DNA标记。这些模块的平均间隔约为30-70kb。如此紧密间隔的标记物展示出高频率的共遗传，并且其在鉴定包括如OSCAR基因内的突变在内的遗传突变及在对与如OSCAR基因内的遗传突变相关的疾病和紊乱进行诊断方面是非常有用的。

    本发明的诊断和预后方法也包括OSCAR基因表达水平检测方法。例如，可从已知或怀疑表达OSCAR基因的细胞类型或组织，如破骨细胞中分离RNA，并利用如上文所述的杂交或PCR技术对其进行检验。分离的细胞可为如源自细胞培养物或源自患者的细胞。对源自细胞培养物中的细胞进行分析是有用的，如用于检测化合物对OSCAR基因的表达的影响，或证实这些细胞属于可表达OSCAR基因的特定细胞类型。例如，下文实施例证明OSCAR基因是在破骨细胞中特异性表达的。因此，OSCAR基因水平检测法对确定细胞(源自细胞培养物或源自个体如患者)是否为破骨细胞来讲是尤其有用的。

    在此检测方案的优选实施方案中，由感兴趣的RNA分子合成了cDNA分子(如通过逆转录)。随后，cDNA中的序列可用做核酸扩增反应如PCR的模板。在这种测定的逆转录和扩增步骤中用做合成起始试剂(如引物)的核酸试剂优选的选自此处描述的OSCAR核酸序列或其片段。优选的，核酸试剂至少长约9-30个核苷酸。利用如用于检测的放射性标记或荧光标记的核苷酸来施行扩增反应。另外，可制备足够的扩增产物，使得获得的产物可利用标准的溴乙啶或其他染色方法观察到。

    也可原位(也即直接在固定化的和/或冰冻的患者组织的组织切片上)施行本发明的OSCAR基因表达检测，从而免除了核酸纯化这一步。OSCAR核酸试剂可用做此原位方法的探针或引物(见如Nuovo，PCR In Situ Hybridization：Protocols and Application，1992，Raven Press，New York)。或者，如果可获得足够量的合适的细胞，则可进行标准的Northern印迹以通过检测OSCAR mRNA水平来确定OSCAR基因表达水平。

    检测OSCAR基因产物。本发明中的诊断和预后方法也包括包含用于检测OSCAR蛋白或其他包括功能性保守变体或其片段在内的OSCAR多肽水平的方法。针对未损伤的、野生型的或突变OSCAR基因产物或抗OSCAR基因产物的功能性保守变体或肽片段的抗体可用做与骨生长相关紊乱如骨硬化症和骨质疏松症的诊断和预后试剂。这些试剂可用于如检测OSCAR基因产物合成或表达水平中的异常，或用于检测OSCAR基因产物的结构、时间表达或物理定位中的异常。抗体和免疫检测法，如此处下文描述的抗体和免疫检测法也具有重要的体外应用，可用于评估对骨生长相关紊乱如骨硬化症和骨质疏松症的治疗效力。例如，抗体或抗体片段可用于对可能的治疗化合物进行体外筛选，以确定化合物对OSCAR基因表达及OSCAR多肽生产的影响。可鉴定出对OSCAR相关紊乱可能具有有益效用的化合物，并且可通过这些检验来确定这些化合物的治疗有效剂量。

    体外免疫检验可用于评估对OSCAR相关紊乱进行的基于细胞的基因治疗的效力。例如，针对OSCAR多肽的抗体可用于体外确定已进行了遗传工程操作从而能生成OSCAR多肽的细胞内获得的OSCAR基因或多肽表达水平。这些方法可用于检测细胞内基因产物，优选的利用细胞裂解物或提取物进行，以检测细胞表面上的OSCAR基因产物的表达，或用于检测分泌到细胞培养基中的OSCAR基因产物。这样的评估可用于确定获得体内治疗效力所需的转化细胞数，并优化基因替代方法。

    一般来讲，可利用这些方法进行分析的组织或细胞类型包括已知能够表达OSCAR基因产物的组织或细胞，如破骨细胞。可应用蛋白分离方法，如Harlow和Lane描述的那些方法(Antibodies：A.Laboratory Manual，1988，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York)。这些分离的细胞可为源自细胞培养物或个体(如怀疑具有OSCAR相关紊乱的患者或怀疑具有患OSCAR相关紊乱的倾向的患者)的细胞。

    作为示例，抗体或抗体片段可用于检测OSCAR基因产物、OSCAR基因产物的变体或其片段的存在，例如通过利用荧光标记抗体的免疫荧光技术，结合光学显微镜、流式细胞分析或荧光计检测法进行。这些技术尤其优选的用于检测细胞表面的OSCAR基因产物。

    抗体或其片段也可用于组织学，如在免疫荧光或免疫电子显微镜技术中来原位检测OSCAR基因产物。原位检测可通过从患者中取出组织学标本(如组织样品)并对其应用本发明的标记抗体或此抗体片段来完成。抗体或抗体片段优选的通过将其覆盖到待检测生物学样品上来进行应用。通过这些应用方法，我们可能不仅能够对待检测组织中OSCAR基因产物的存在进行检测，而且能够对待检测组织中基因产物的分布进行检测。本领域中的熟练技术人员可很容易的对本领域中众所周知的组织学方法进行修饰，无需过多实验即可完成这样的原位检测。

    OSCAR基因产物的免疫检验一般包括在能够特异性结合OSCAR基因产物(包括如功能性保守变体或其肽片段)的可检测标记抗体存在情况下对生物学样品(如生物学流体、组织提取物、新收获的细胞或细胞裂解物)进行温育。随后，可利用本领域中众所周知的任何技术来检测结合的抗体。

                           筛选检验

    利用下文所述的筛选方法可对与OSCAR基因产物结合或相互作用的化合物，包括与OSCAR基因产物相互作用的细胞内化合物(如蛋白质或蛋白的部分)、OSCAR基因产物的天然和合成配基、干扰OSCAR基因与其他化合物(如与天然配基或细胞内化合物)的相互作用的化合物、及调节OSCAR基因的活性(如通过调节OSCAR基因的表达水平)或OSCAR多肽或其他OSCAR基因产物的活性(如生物活性)的化合物，进行鉴定。例如，此处描述的筛选检测法可用于鉴定与OSCAR基因的启动子或其他调节序列结合从而调节OSCAR基因表达水平的化合物(见如Platt，J.Biol.Chem.1994，269：28558-28562)。

    可利用这些筛选检测法进行鉴定的化合物的种类包括，但并不局限于小分子(如分子量小于2kd的有机或无机分子，优选分子量小于1kd，和/或能够穿过血脑屏障或进入适当的细胞中并影响OSCAR基因及OSCAR调节路径中涉及的其他基因的表达)及大分子(如分子量大于2kd的分子)。可利用这些筛选检测法进行鉴定的化合物也可包括肽和多肽。例如，可溶性肽、组合文库中的融合肽成员(如Lam etal.，Nature 1991，354：82-84和Houghten et al.，Nature 1991中描述的)；通过组合化学法获得的文库中的成员，如D-和/或L-构型氨基酸分子文库；磷酸肽如随机或部分简并的定向磷酸肽文库成员(见如Songyang et al.，Cell 1993，72：767-778)；抗体，包括但并不局限于多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、抗独特型抗体、嵌合抗体或单链抗体；抗体片段，包括但并不局限于FAb、F(ab′)2、FAb表达文库片段和其表位结合片段。

    如下文实施例中所证明的，OSCAR基因产物可调节破骨细胞的成熟和活性，此外，化合物如OSCAR基因产物的配基具有调节OSCAR基因产物的活性的能力，因而其能够调节破骨细胞的成熟和/或活性。因此，可利用此处描述的筛选方法进行鉴定的化合物在调节破骨细胞的活性及，特别的在调节骨组织生长、修复、发育、降解、吸收、修复或稳态方面是有用的。因此，可利用此处描述的筛选方法进行鉴定的化合物可用于如通过调节破骨细胞的活性和/或通过调节骨组织的生长、修复、发育、吸收、降解、修复或稳态而治疗与骨生长相关的紊乱。

    对结合化合物进行检测。可很容易的设计体外体系以鉴定能够与本发明中的OSCAR基因产物进行结合的化合物。这些化合物在如调节野生型OSCAR基因产物的活性或调节突变体或其他变体OSCAR基因产物的活性方面是有用的。

    一般来讲，这些筛选方法包括在一定条件下制备含有OSCAR基因产物和检测化合物的反应混合物并给予足够的时间来使两化合物相互作用(如结合)，从而形成可检测到的复合体。此检验法可通过多种不同的方法来施行。例如，一实施方案包括将OSCAR多肽或检测化合物锚定在固相上并在反应最后和去除(如通过冲洗)未结合的化合物后对固相上的OSCAR多肽和检测化合物复合体进行检测。例如，在此方法的一个优选实施方案中，可将OSCAR基因产物锚定在固相表面上并将标记化合物(如按照上文描述的方法进行标记)与此表面进行接触。在OSCAR基因产物和检测化合物间可形成复合体的充分条件下，对检测化合物温育足够长的时间后，从表面去除(如通过冲洗)未结合的检测化合物分子并对保留的标记分子进行检测。

    在另一替代实施方案中，将一或多个不同的检测化合物的分子附着到固相上，从而标记的OSCAR多肽分子可与其接触。在这样的实施方案中，不同检测化合物的分子优选的附着到固相上的特定位置，这样可通过确定结合的OSCAR多肽在固相或表面上的定位来检测与OSCAR多肽结合的检测化合物。

    对与OSCAR相互作用的化合物进行检验。已知的多种蛋白质-蛋白质相互作用检测方法也可用于检测和/或鉴定与OSCAR基因产物相互作用的蛋白质。例如，可选用共免疫沉淀、通过梯度或色谱柱进行的交联和共纯化以及本领域中已知的其他技术。可利用这些检验法进行鉴定的蛋白包括，但并不局限于细胞外蛋白如OSCAR特异性配基以及细胞内蛋白如信号转导蛋白。

    作为示例，但并没有限制本发明的意图，可应用表达克隆检测法来鉴定OSCAR特异性配基和其他与OSCAR基因产物特异性相互作用的蛋白。在这些检验法中，可从表达OSCAR特异性配基(如成骨细胞、胚胎成纤维细胞、NIH细胞、3T3细胞、ST2细胞、Mlg细胞、UMR106细胞、HEK293细胞、HEK293T细胞、hFOB 1.19细胞和猴COS-1细胞)的任何细胞系中产生cDNA表达文库。可将源自这些表达文库中的克隆转染或感染到不能正常表达OSCAR特异性配基的细胞，如B细胞淋巴瘤系(如CH12细胞、A20.25细胞或LBB1细胞)中。利用编码OSCAR特异性配基的克隆转染的细胞随后可表达此基因产物，并可利用标准技术如FACS或利用其上连接有OSCAR多肽(如OSCAR-Fc融合多肽)的磁珠来对其进行鉴定和分离。

    或者，也可利用本领域中众所周知的免疫沉淀技术从包括上述可表达OSCAR-L的细胞系在内的细胞系中分离OSCAR特异性配基。

    也可利用上述针对鉴定OSCAR结合化合物描述的筛选检测法对OSCAR特异性配基进行分离。例如，可将OSCAR-Fc融合多肽结合或附着到固体表面上，并且将标记的化合物(如侯选OSCAR配基)在足以使OSCAR-Fc融合多肽和检测化合物间形成复合体的反应条件下与表面接触足够长的时间。随后可从表面上去除(如通过冲洗)未结合的检测化合物并对保持结合的标记化合物进行检测。

    一旦对蛋白进行分离后，就可利用标准方法来对这些检测法中检测到的蛋白进行鉴定。例如，利用本领域中众所周知的技术，如Edman降解技术(见如Crighton，1983，Proteins：Structuresand Molecular Principles，W.H.Freeman&Co.，New York，pages34-49)，对与OSCAR基因产物相互作用的蛋白的至少部分氨基酸序列进行确定。

    一旦对这些蛋白进行了鉴定，它们的氨基酸序列可用来指导生成寡核苷酸混合物，从而对编码这些蛋白的基因序列进行筛选，例如利用上文描述的标准的杂交或PCR技术。见如上文Ausubel及PCRProtocol：A Guide to Methods and Application，Innis et al.，eds.，Academic Press，Inc.，New York(1990)对生成这样的寡核苷酸混合物及在筛选检验中的使用的技术进行的描述。

    其他可同时鉴定编码与OSCAR多肽相互作用的蛋白的基因的方法在本领域中是已知的。例如，可利用标记的OSCAR多肽探测表达文库。

    作为另一示例但并没有限制本发明的意图，对杂交体系可用于检测在体内与OSCAR基因产物相互作用的蛋白。简单来讲，利用这样的体系可构建编码两种杂合蛋白的质粒：其中一种杂合蛋白优选的包含有融合到OSCAR基因产物上的转录激活剂蛋白的DNA结合结构域。另一种杂合蛋白优选的包括第一种杂合蛋白中使用的转录激活蛋白的活化结构域，并融合到未知蛋白上，该未知蛋白是由重组到质粒文库中作为cDNA文库的一部分的cDNA编码的。将DNA结合结构域融合质粒和cDNA文库共转化到酿酒酵母菌株或其他含有报告基因(如HBS、lacZ、HIS3或GFP)的合适的生物体中。优选的，此报告基因的调节区域包含有两杂合蛋白的转录活化部分的结合位点。在这样的双杂交体系中，单独存在两种杂合蛋白中的任何一种是不能活化报告基因的转录的。特别的，DNA结合结构域杂合蛋白不能活化转录，这是因为其不能定位到必须的活化功能上。相同的，活化结构域杂合蛋白不能活化转录，这是因为其不能定位到报告基因上的DNA结合位点上。然而，两杂合蛋白间的相互作用重构了功能性转录激活剂蛋白并对报告基因进行表达。因此，在如下文详细叙述的双杂交体系中，只需对报告基因的基因产物的表达进行检测，就可检测OSCAR多肽(也即融合到转录激活剂的DNA结合结构域中的OSCAR多肽)和检测多肽(也即融合到转录激活剂的DNA结合结构域中的蛋白)间的相互作用。

    按照本领域中已知的任何合适的技术可制备得到在这样的双杂交检测法和其他检测法中用于筛选的cDNA文库。作为特别的和非限制性的示例，可将cDNA片段插入到载体中，使之与GAL4的转录活化结构域翻译性地融合，并且与“饵”OSCAR-GAL4融合质粒共转化到酿酒酵母菌株或其他含有由包含有GAL4活化序列的启动子驱动的HIS3基因的合适的生物体中。源自cDNA文库中、融合到GAL4转录活化结构域上的蛋白将重构活化GAL4蛋白，从而驱动HIS3基因的表达，而此GAL4转录活化区域可与OSCAL-GAL4融合物的OSCAR多肽相互作用的。可通过它们在含有半固体琼脂但缺乏组氨酸的培养基上的生长来对表达HIS3基因的菌落进行检测。随后，从这些菌株中纯化cDNA、对其进行序列分析并利用其来鉴定可与OSCAR多肽相互作用的编码蛋白。

    一旦对可结合本发明的OSCAR基因产物的化合物进行了鉴定，那在这些方法中描述的筛选方法也可用于鉴定可结合这些结合化合物的其他化合物(如小分子、肽和蛋白)。这些化合物可用于调节与OSCAR相关的生物活性，如通过与OSCAR配基结合或与结合配偶结合来调节，并可用于防止其与本发明中的OSCAR基因产物进行相互作用。例如，可对这些化合物抑制OSCAR-Fc与表达OSCAR-L的细胞系(见，上文)的结合的能力进行检测。

    对干扰OSCAR-配基相互作用的化合物进行检测。下文所示示例证明本发明中的OSCAR基因产物可与一或多种分子(也即配基)进行体内相互作用。破坏或干扰此结合相互作用的化合物在调节OSCAR基因产物活性方面是有用的，这在下文示例中也进行了证明。特别的，这些化合物可调节破骨细胞的成熟或活性，从而可用于调节骨组织的生长、修复、发育、吸收、降解或稳态，或对与骨生长相关的紊乱进行治疗。

    这样的化合物包括，但并不局限于按照上文描述的筛选检测法进行鉴定的化合物，鉴定可与OSCAR基因产物结合的化合物，包括此处描述的多种典型种类的化合物在内。

    一般来讲，用于鉴定可干扰OSCAR基因产物和结合配偶(如配基)间的相互作用的化合物的检测法涉及在足以使OSCAR基因产物与其结合配偶结合并形成复合体的反应条件下制备含有OSCAR基因产物和其结合配偶的检测反应混合物并给予足够的时间。为了检测化合物的抑制活性(也即抑制结合复合体的形成或破坏已形成的复合体的能力)，检测化合物优选的包含在检测反应混合物中。在一个示范性实施方案中，检测化合物从最开始就与OSCAR基因产物和其结合配偶一起包含在检测反应混合物中。然而，或者，可在添加了OSCAR基因产物及其结合配偶后的稍晚一些时候将检测化合物添加到检测反应混合物中。在优选的实施方案中，也可制备不含有检测化合物的一或多种对照反应混合物。一般来讲，对照反应混合物含有与检测反应混合物中相同的OSCAR基因产物和结合配偶，但不含检测化合物，对照反应混合物中也可含有检测反应混合物中不含有的安慰剂，以代替检测化合物。随后可在反应混合物中对OSCAR基因产物和结合配偶间形成的复合体进行检测。在不存在检测混合物的情况下(如在对照反应混合物中)形成了这样的复合体，但在检测混合物存在的情况下没有形成这样的复合体，表明检测混合物是可干扰或调节OSCAR多肽和结合配偶间的相互作用的化合物。

    可以异质或均质形式对可调节OSCAR基因产物和结合配偶间的相互作用的化合物进行检验。异质检验一般涉及将OSCAR基因产物或结合配偶锚定到固相上并在反应的最后对锚定到固相上的化合物进行检测。因此，这样的检测法与上文针对检测和/或鉴定OSCAR核酸和基因产物及检测或鉴定OSCAR结合配偶描述的固相检验相类似。确实，无需过多实验，本领域中的那些熟练技术人员即会清楚意识到可对上文描述的检验法的多种原理和技术进行修改并应用于此处描述的固相检验中，以对可调节OSCAR基因产物和结合配偶间的相互作用的化合物进行鉴定。

    不管选用的具体检验如何，反应物添加到反应混合物中的顺序是可变的：例如，可鉴定通过竞争干扰OSCAR基因产物和结合配偶间相互作用的化合物，或鉴定可破坏预先形成的结合复合体的化合物。通过在检测化合物存在的情况下进行反应，可对通过竞争来干扰OSCAR基因产物和结合配偶间的相互作用的化合物进行鉴定。特别的，在这样的检验法中，可在添加OSCAR基因产物和结合配偶之前或与其同时向反应混合物中添加检测化合物。可通过在复合体形成后向反应混合物中添加检测化合物来对可破坏预先形成的OSCAR基因产物和结合配偶复合体的检测化合物进行检验。

    此处描述的筛选检测法也可利用与全长OSCAR多肽或蛋白的部分相对应的肽或多肽、或利用包含这些肽或多肽序列的融合蛋白来进行实施。例如，可利用相应于可与配偶(如配基“结合位点”)结合的全长OSCAR多肽的特定区域或结构域的肽或多肽，对用于鉴定可调节OSCAR多肽和结合配偶间的相互作用的化合物的筛选方法进行实施。例如，在一实施方案中，可利用含有与全长OSCAR多肽的细胞外结构域相对应的氨基酸序列(如包含SEQ ID NO：3中所示OSCAR多肽的1-228位氨基酸残基的序列)的多肽(或其融合物)来实施筛选检验法。

    本领域中已知多种方法可用于鉴定OSCAR多肽的特异性结合位点。例如，可通过对OSCAR基因进行诱变并如上所述筛选结合破坏来鉴定结合位点。在这样的检验中，也可对编码结合配偶的基因进行诱变，以对可补偿OSCAR基因突变引起的破坏的突变进行鉴定。随后对这些突变进行的序列分析可揭示与两蛋白的结合区域相对应的突变。

    在另一替代实施方案中，利用此处上文描述的方法可将蛋白(如OSCAR蛋白或OSCAR蛋白的蛋白结合配偶)锚定到固体表面或支持物上。按照上文描述的结合检测法，可利用蛋白水解酶处理与锚定到固体表面上的蛋白相结合的另一标记蛋白，并且其片段可与结合到固体表面上的蛋白相互作用。冲洗后，处理后的蛋白质的短的标记肽片段仍然与锚定蛋白相连。可对这些肽进行分离，并且可利用氨基酸序列对产生这些肽的全长蛋白的区域进行鉴定。

    在另一实施方案中，也可通过筛选可调节OSCAR多肽(如OSCAR-Fc融合多肽)与表达OSCAR特异性配基的细胞，如成骨细胞、胚胎成纤维细胞、NIH细胞、3T3细胞、ST2细胞、Mlg细胞、UMR106细胞、HEK293细胞、HEK293T细胞、hFOB 1.19细胞和COS-1细胞间的结合的化合物来鉴定可干扰OSCAR-配基相互作用的化合物。

                      治疗方法和药物制剂

    本发明中的OSCAR核酸分子、多肽或抗体可用于如调节破骨细胞的成熟和活性。此外，可与本发明中的OSCAR核酸或多肽结合的化合物、可调节OSCAR基因表达的化合物、及可干扰或调节OSCAR核酸或多肽与结合化合物(如与天然配基)间的结合的化合物在如调节破骨细胞成熟或活性的方法中是有用的。因此，这些化合物也可用于调节与破骨细胞活性相关的过程，如骨组织的生长、修复、发育、吸收、降解及稳态。这些方法对治疗与骨生长相关的紊乱，如骨质疏松症、骨硬化症等尤其有用。

    例如，可与本发明的OSCAR基因产物结合的化合物(如OSCAR配基)可增强OSCAR活性、刺激破骨细胞成熟，从而增强与破骨细胞相关的活性。因此，这些化合物可用于治疗需要对破骨细胞活性进行活化的状况。例如，因为破骨细胞是吸收钙化骨基质的细胞，所以可增强OSCAR活性并诱导破骨细胞成熟的化合物在治疗伴随有骨质水平异常高或升高的骨生长相关紊乱如骨硬化症方面是有效的。或者，如通过干扰OSCAR基因产物和配基间的相互结合作用来降低OSCAR活性的化合物可降低破骨细胞的成熟和与破骨细胞相关的活性。因此，这些化合物可用于治疗需要对破骨细胞活性降低的状况。例如，可降低OSCAR活性的化合物可用于治疗伴随有骨质水平异常低或降低的骨生长相关紊乱，如骨质疏松症。

    这些方法可用于确定化合物是否实际上增加或减少了如组织样品中的破骨细胞的数量。因此，这些方法可用于监测特定治疗是否对破骨细胞活性产生了所需要的影响。

    或者，可通过对个体(如动物模型或患者)的骨质进行监测并确定经过治疗骨质是否增加或减少来确定治疗的有效性。

    抑制方法。调节破骨细胞成熟或活性的方法仅包括给药以一或多种可调节OSCAR基因表达、OSCAR基因产物合成或OSCAR基因产物活性的化合物，从而对破骨细胞的成熟或活性进行调节(如增加或减少)。同样的，调节(如增加或降低)骨生长、修复、发育、吸收、降解或稳态的方法可仅包括施用可调节OSCAR基因表达、OSCAR基因产物合成或OSCAR基因产物的活性的一或多种化合物。优选的，施用所述一或多种化合物直至按照所需达到了对骨生长、修复、发育、吸收、降解或稳态的调节。

    在展示可调节OSCAR核酸的活性、表达或合成的能力的化合物中有反义分子、核酶和三螺旋分子。可对这些分子进行设计以降低或抑制野生型OSCAR核酸和多肽，或靶向突变体OSCAR核酸或多肽。

    反义RNA和DNA分子可通过与靶mRNA分子杂交并避免蛋白质翻译来直接阻断mRNA的翻译。反义法包括设计与靶基因mRNA互补的寡核苷酸。反义寡核苷酸将与互补的靶基因mRNA转录物结合并避免翻译进行。绝对互补虽然是优选的，但并非必须的。

    与核酸的部分“互补的”序列指具有充分的互补性、能与核酸进行杂交形成稳定的双螺旋的序列。核酸的杂交能力依赖于序列互补程度和反义核酸的的长度。然而，一般来讲，杂交核酸越长，其可含有更多的碱基错配并仍旧形成稳定的双螺旋(或在三螺旋方法中形成三螺旋)。可通过如标准方法来确定杂交复合体的变性温度，很容易的确定错配的耐受程度。

    在一优选实施方案中，与OSCAR基因的非编码区域互补的寡核苷酸可用在反义方法中以抑制内源OSCAR mRNA分子的翻译。反义核酸优选的至少长为6个核苷酸，更优选的长为约6-50个核苷酸。在特定实施方案中，寡核苷酸的长度至少为10、至少为15、至少为20、至少为25或至少为50个核苷酸。

    一般来讲，优选的，首先进行体外研究，以对反义寡核苷酸抑制基因表达的能力进行定量。优选的，这些研究利用可区分反义基因抑制和寡核苷酸的非特异性生物学效用的对照组。同样优选的，这些研究将靶RNA或蛋白的水平与内部对照RNA或蛋白水平进行对比。此外，我们也考虑将利用反义寡核苷酸获得的结果与利用对照寡核苷酸获得的结果进行对比。优选的，对照组寡核苷酸的长度大约与检验寡核苷酸相同，寡核苷酸序列与反义序列间的差异不超过用以防止其与靶序列进行特异性杂交所必须的差异。

    虽然可以选用与靶基因编码区域序列互补的反义核苷酸，但优选的是那些与转录的非翻译区域互补的核苷酸序列。

    反义分子优选的被递送至体内表达靶基因的细胞，如破骨细胞。已经开发了多种方法来将反义DNA或RNA投递到细胞中。例如，可将反义分子直接注射到组织位点，或利用设计来靶向感兴趣的细胞(如与在靶细胞表面上表达的受体或抗原特异性结合的肽或抗体相连接的反义分子)的经修饰反义分子可进行系统给药。

    在优选的实施例中，得到的细胞内反义核酸分子的浓度足以抑制内源mRNA的翻译。例如，一优选的方法应用了重组体构建物，其中的反义寡核苷酸是置于强pol III或pol II启动子的控制之下的。利用这样的构建物来转染患者体内的靶细胞会使得可形成与内源靶基因转录物互补的碱基对的单链RNA大量转录，从而防止靶基因mRNA的翻译。例如，可将如上文所述的载体导入细胞，从而使得例如为细胞所吸收并指导反义RNA的转录。只要可对其进行转录并产生所需要的反义RNA，这样的载体可保持游离体状态或整合到染色体中。可利用本领域中标准的重组DNA技术来构建这样的载体。载体可以是可用于在哺乳动物细胞中进行复制和表达的质粒、病毒或本领域中已知的其他载体。可利用本领域中已知的在特定细胞类型(如哺乳动物细胞的破骨细胞，例如人破骨细胞)起作用的任何启动子对编码反义RNA的序列进行表达。例如，上文针对重组体OSCAR核酸表达所讨论的任何启动子也可用于表达OSCAR反义核酸。

    设计来催化切割靶基因mRNA转录物的核酶分子也可用于防止靶基因mRNA的翻译，从而防止靶基因产物的表达(见如国际专利NO.WO 90/11364；Sarver，et al.，Science 1990，247：1222-1225)。

    核酶是能够催化对RNA的特异性切割的酶RNA分子(参见Rossi，Current Biology 1994，4：469-471)。核酶的作用机理包括核酶分子与互补靶RNA的序列特异性杂交，随后进行核酸内切酶切割。核酶分子的组成必须包括与靶基因mRNA互补的一或多个序列，且必须包括负责RNA切割的、众所周知的催化序列。有关此序列，可参见如美国专利NO.5,093,246。

    虽然在位点特异性识别序列切割mRNA的核酶可用于破坏靶基因mRNA，但优选使用锤头核酶。锤头核酶在与靶mRNA形成互补碱基对的侧翼区所指示的位点切割mRNA。唯一的要求是靶mRNA具有下列两个碱基的序列：5′-UG-3′。构建和产生锤头核酶的方法在本领域中是众所周知的，并在Myers，1995，Molecular Biology andBiotechnology：A Comprehensive Desk Reference，VCHPublishers，New York(特别见图4，833页)和Haseloff andGerlach，Nature 1988，334：585-591中有更详细的描述。

    优选对核酶进行工程操作，使其切割识别位点定位在接近靶基因mRNA的5′末端，也即提高效率并使非功能性mRNA转录物的细胞内积累最小化。

    本发明中的核酶也包括RNA核酸内切酶(以下称为“Cech型核酶”)如Tetrahymena thermophila(嗜热四膜虫)中天然存在的核酸内切酶(已知如IVS或L-19 IVS RNA)及Thomas Cech及其同事进行广泛描述的核酸内切酶(Zaug等，Science 1984，224：574-578；Zaug和Cech；Science 1986，231：470-475；Zaug等，Nature1986，324：429-433，国际专利申请公开WO 88/04300；Been和Cech，Cell 1986，47：207-216)。Cech型核酶具有可与靶RNA序列杂交的8碱基对活性位点，随后在此对靶序列进行切割。本发明包括那些可靶向靶基因中的8碱基对活性位点序列的Cech型核酶。

    在反义方法中，核酶可包括经修饰的寡核苷酸(如可提高稳定性、寻靶作用等)并应将核酶投递到体内表达靶基因的细胞中。优选的投递方法包括使用在强组成性pol III或pol II启动子控制下编码核酶的DNA构建物，这样转染后的细胞将会产生足够量的核酶来破坏内源靶基因信息并对翻译进行抑制。与反义分子不同，因为核酶为催化性的，所以其效率的发挥只需要较低量的细胞内浓度。可利用上文描述的任何载体将这样的构建物导入细胞中。

    通过利用靶向同源重组(如见Smithies，et al.，Nature 1985，317：230-234；Thomas and Capecchi，Cell 1987，51：503-512；and Thompson et al.，Cell 1989，5：313-321)失活或“敲除”靶基因活或启动子也可降低内源靶基因的表达。例如，在含有或不含可选择标记和/或负选择标记的情况下，可选用侧翼为与内源靶基因(靶基因的编码区或调节区)同源的DNA的非功能性突变靶基因(或根本不相关的DNA序列)来转染可体内表达靶基因的细胞。通过靶向同源重组插入DNA构建物可使靶基因失活。这样的方法特别适用于农业领域，其中对ES(胚胎干)细胞进行的修饰可用于产生含有失活的靶基因的动物后代(如见Thomas and Capecchi，1987 andThompson，1989上文)。然而，只要利用适当的病毒载体可对重组DNA构建物直接给药或靶向到要求的位点上，那就可对此方法进行适当的修饰从而用于人。

    或者，通过靶向与靶基因的调节区域(也即，靶基因的启动子和/或增强子)互补的脱氧核糖核苷酸序列，使之形成可防止体内靶细胞中靶基因转录的三螺旋结构，即可降低内源靶基因的表达。(通常，见Helene，Anticancer Drug Des.1991，6：569-584；Heleneet al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.1992，660：27-36；and Maher，Bioassays 1992，14：807-815)。

    可用于三螺旋形成以抑制转录的核酸分子应为单链分子并由脱氧核糖核苷酸组成。这些寡核苷酸的碱基组成应该设计为可通过Hoogsteen碱基配对法则促进三螺旋形成，这一般要求在双螺旋的一条链上含有大小相当的嘌呤或嘧啶串。核苷酸序列可以基于嘧啶碱基，从而在产生的三螺旋三条相关链上形成TAT和CGC+三联体。富含嘧啶的分子在平行方向上提供了与双螺旋的一条链的富含嘌呤区域间的碱基互补性。此外，可选择富含嘌呤，例如含有一串G残基的核酸分子。这些分子将会与富含GC对的DNA双螺旋(其中绝大多数嘌呤基是定位在被靶向双螺旋的单链上)形成三螺旋，从而造成GGC三联体横跨三螺旋中的三条链。

    或者，通过产生所谓的“switchback”核酸分子可增加靶向形成三螺旋的可能序列。Switchback分子是以5′-3′、3′-5′交替方式合成的，这样它们首先与双螺旋的第一条链碱基配对，然后与另一条链配对，从而避免了必须在双螺旋的一条链上含有大小相当的嘌呤或嘧啶串。

    在其中选用了此处描述的反义分子、核酶和/或三螺旋分子来抑制突变体基因表达的情况下，有可能此技术如此高效的降低或抑制正常靶基因等位基因产生的mRNA的转录(三螺旋)和/或翻译(反义，核酶)，从而有可能出现正常靶基因产物的浓度较正常表型所必须的浓度低得多的情况。在这些情况中，为了保证维持靶基因活性基本正常的水平，因此，可利用下文描述的基因治疗方法将编码和表达靶基因多肽并展示正常靶基因活性的核酸导入细胞中，选用的核酸分子不含对反义分子、核酶或三螺旋处理敏感的序列。另外，在靶基因编码细胞外蛋白的情况中，为了维持靶基因活性的必须水平，所以优选的共施用正常靶基因蛋白。

    基因治疗。在其中的紊乱是由OSCAR基因突变造成的情况中，治疗方法包括为个体提供野生型OSCAR核酸分子或编码具有正常生物活性的OSCAR多肽的核酸分子，以使紊乱症状得到缓解。

    或者，在其中的紊乱是由OSCAR基因突变造成的情况中，治疗方法包括对患者移植或提供已进行修饰以表达野生型OSCAR基因产物或具有正常生物学活性的OSCAR基因产物的细胞，如破骨细胞或成纤维细胞，以使紊乱症状得到缓解。

    按照本发明，可选用本领域中可得的任何基因治疗方法。对于基因治疗方法的一般回顾来讲，可见Goldspiel et al.，ClinicalPharmacy 1993，12：488-505；Wu and wu，Biotherapy 1991，3：87-95；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.1993，32：573-596；Mulligan，Science 1993，260：296-932；Morgan andAnderson，Ann.Rev.Biochem.1993，62：191-217；and May，TIBTECH 1993，11：155-215。特别的，在这些基因治疗方法中可选用上文针对表达细胞内OSCAR核酸所描述的任何病毒和非病毒载体。

    本领域中普遍已知的重组DNA技术也可用于这样的基因治疗方法中，例如参见在Ausubel et al.(eds.)1993，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley&sons，New York；Kriegler，1990，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual，Stockton Press，New York；and Dracopoli et al(eds.)，1994，Current Protocols in Human Genetics，John Wiley&Sons，NewYork中描述的方法。

    在本发明的基因治疗的一方面中，选用了包括此处描述的任何表达载体在内的治疗载体，其中含有可在适当的宿主细胞中表达功能性OSCAR基因产物的核酸序列。特别的，载体优选的含有包含有启动子的核酸序列，而此启动子可操作性的连接了本发明的功能性OSCAR多肽的编码序列。启动子可为可诱导的启动子、组成性启动子，并且任选地，可为组织特异性启动子。在另一实施方案中，载体含有核酸分子，其中OSCAR核酸序列的侧翼区为可在基因组中的所需位点促进同源重组的区域，从而提供OSCAR基因产物的染色体内表达(见如Koller and Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1989，86：8932-8935；Zijlstra et al.，Nature 1989，342：435-438)。

    在其中对个体给药以载体的实施例中(例如，在调节破骨细胞活性如骨生长、修复、发育、吸收、降解或稳态的方法中)，可直接或间接将载体投递到个体中。直接的载体投递方法包括直接将个体暴露于载体或投递体系中。在间接投递方法中，首先利用载体对细胞进行体外转化(如在细胞培养物中)，随后将转化后细胞移植到患者体内。这样的直接和间接投递方法也分别称作体内和离体基因治疗方法。

    在这样的基因治疗方法中应用的核酸的准确形式和用量依赖于特定应用，如特定类型的疾病及所要达到的效用的严重程度、患者状态等。本领域中的熟练技术人员可对应用于特定应用或治疗的核酸的适当的形式和用量进行确定。

    抗-OSCAR抗体治疗。如下文特定实施例中所证明的，本发明中的OSCAR基因产物在破骨细胞中是优势表达或专有表达的。因此，本发明中的治疗方法也包括利用与OSCAR基因产物特异性结合的抗体来靶向和短暂消除破骨细胞。这些治疗方法对其中需要对破骨细胞介导的骨吸收进行抑制的疾病和紊乱如骨硬化症的治疗是尤其需要。

    在这些治疗方法中可选用上文描述的、可特异性结合本发明OSCAR多肽的任何抗体。例如，在这些方法中选用的治疗抗体可为与细胞毒性分子(如放射性同位素或毒素如蓖麻毒蛋白)缀合的全长抗体或其片段。抗体可随后用于将细胞毒性特异性地靶向到靶细胞(也即破骨细胞)上。

    在这些方法的另一实施方案中，抗体的内源功能(也即由抗体的Fc部分介导的功能)为如通过抗体介导的细胞毒性等清除靶破骨细胞。这些基于抗体的治疗方法在本领域中已是众所周知的。

    在其他实施方案中，细胞内抗体(也成为“intrabodies”)可用于调节OSCAR基因产物的活性。利用细胞内抗体来调节细胞内蛋白的活性在本领域中是众所周知的，并对大量不同的体系进行了描述(见如Marasco，Gen Ther.1997，4：11；Chen et al.，Hum.GeneTher.1998，9：1627)，这些体系包括(但不局限于)病毒感染(见如Marasco，Gen Ther.1998，9：1627)和其他感染疾病(见如Rondon et al.，Annu.Rev.Microbiol.1997，51：257)，以及癌基因如p21(见如Cardinale et al.，FEBS Lett.1998，439：197-202；and Cochet et al.Cancer Res.1998，58：1170-6)、myb(见如Kasono et al.，Biochem Biophys Res Commun.1998，251：124-30)、erbB-2(见如Graus-Porta et al.，Mol CellBiol.1995，15：1182-91)等。

    药物制剂。可以治疗上有效的剂量对已确定能够影响OSCAR基因表达或OSCAR基因产物活性的化合物给药，从而调节破骨细胞成熟或与破骨细胞相关的活性；或者这些化合物可以治疗上有效的剂量给药以调节个体骨组织的生长、修复、发育、吸收、降解或稳态。因此，术语治疗上有效的剂量指足以取得这样的活性调节和/或缓解与骨组织生长相关的紊乱如骨硬化症和骨质疏松症的症状化合物剂量。

    可利用标准的药物程序，如细胞培养物检验或利用实验动物来确定LD50和ED50，由此确定化合物的毒性和治疗效力。参数LD50和ED50在本领域中是众所周知的，指可分别使群体产生50％死亡率和50％治疗效用的化合物的剂量。毒性效果和治疗效果的剂量比称作治疗指数，并可表达为LD50/ED50。优选那些展示高治疗指数的化合物。虽然可选用展示毒性副作用的化合物，然而在这样的情况中，尤其优选的选用那些将这些化合物特异性靶向到待影响的组织的位点上的投递体系，这样就可使对其他细胞、组织或器官可能造成的损害最小化并降低副作用。

    从细胞培养物检验或动物研究中获得的数据可用于确定用于人的剂量范围。本发明的治疗方法中应用的化合物的剂量优选的在包括ED50浓度，但很少或无毒性(如小于LD50的浓度)的范围内。在任何应用中的特定剂量是可变动的，这依赖于各种因素，如应用的特定剂量形式、给药路径、个体(如患者)状况等。

    最开始从细胞培养物检验中估计治疗有效的剂量，并在动物模型中系统阐述以获得包括IC50在内的循环浓度范围。化合物的IC50浓度指可取得对症状的最大抑制的一半(如从细胞培养物检验中确定的)时的浓度。可利用这些信息来较精确的确定用于特定个体，如人患者的合适剂量。

    对血浆中化合物的测定可通过技术如高效液相色谱(HPLC)或气相色谱对个体如患者进行常规检测。

    可利用一或多种生理上可接受的载体或赋形剂通过传统方法制备本发明中应用的药物组合物。

    因此，可配制化合物和它们的生理上可接受的盐和溶剂化物来通过吸入法或吹入法(通过嘴或鼻子)、或口服、经口腔、肠胃外或经直肠给药。

    对于口服给药来讲，可利用药物上可接受的赋形剂如结合因子(与预先明胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)、填料(如乳糖、微晶体纤维素或磷酸氢钙)、润滑剂(如硬脂酸镁、滑石或硅石)、崩解剂(如土豆淀粉或淀粉羟乙酸钠)、或润湿剂(如十二烷基硫酸钠)通过传统方法将药物组合物制备为如片剂或胶囊的形式。片剂可以用本领域众所周知的方法包衣。用于口服给药的液体制剂可以如溶液、糖浆或悬浮液形式存在，或以干燥产品形式存在，在给药前以由水或其他合适的载体配制。这样的液体制剂可利用药物上可接受的添加剂如悬浮剂(如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化可食脂肪)、乳化剂(如卵磷脂或阿拉伯胶)、非水载体(如杏仁油、油酯、乙醇或分级分离的植物油)、防腐剂(如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或抗坏血酸)、通过传统方法进行制备。这些制剂也可适当含有缓冲盐、调味剂、着色剂和增甜剂。

    用于口服给药的制剂可适于制备成可对活性化合物进行控制释放的形式。对于经口腔给药来讲，组合物可以通过传统方法制备的片剂或锭剂形式存在。对于吸入法给药来讲，本发明选用的化合物可以适当的推动剂如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体，从压力保持装置或雾化器中以气雾剂喷雾的形式很方便的给药。在应用增压气雾剂的情况下，可通过提供一阀门来投递确定量，从而确定其剂量单位。可制备含有由化合物和适当的粉末基质如乳糖或淀粉组成的粉末混合物的、在吸入器或吹入器中应用的胶囊或柱如明胶柱。

    可对化合物进行制备以通过注射，如大丸剂注射或连续输注进行肠胃外给药。用于注射给药的制剂可以单位剂量形式如在安瓿瓶中或添加有防腐剂的多剂量容器中存在。这些组合物可在油或水载体中以如悬浮液、溶液或乳化剂的形式存在，并可含有配制因子如悬浮、稳定和/或分散剂。或者，在应用前，活性成分可以是粉末形式，在使用前以适当的载体如无菌的、不含热原的水重溶。

    化合物也可制备成用于直肠给药的组合物如栓剂或滞留灌肠剂，如含有传统的栓剂基质如可可脂或其他甘油脂的灌肠剂中。

    除前述的制剂之外，这些化合物也可制备为贮存制剂。这样的长效作用制剂可通过移植(如皮下或肌肉内)或肌肉内注射来给药。因此，例如，这些化合物可与适当的聚合或疏水物质(如在可接受的油中用作乳化剂)或离子交换树脂、或作为相对可溶性衍生物如相对可溶性盐配制在一起。

    如果需要，可将这些组合物置于可包含有一或多个含有活性成分的单位剂量形式的组件或分样器中。组件可如含有金属或塑料箔，例如发泡组件。此组件或分样器可伴随有给药说明。

                              实施例

    本发明也通过特定实施例对本发明进行了描述。然而，说明中应用的这些实施例仅仅是例示性的，并没有限制本发明的范围和任何示范性术语的意图。同样的，本发明并不局限于此处描述的任何特别优选的实施例。的确，在阅读了此说明后，本发明的多种修饰和变化对本领域中的熟练技术人员是显而易见的，并可在不偏离本发明的精神和范围的前提下进行实施。因此，本发明仅受附加权利要求及其等同范围所限制。

    实施例1：对鼠OSCAR基因进行分离和定性

    本实施例描述了对编码在破骨细胞中特异性表达的类免疫球蛋白(Ig)受体的新颖cDNA片段的分离。本实施例提供了新颖的基因和基因产物，此处称为OSCAR。

                            材料和方法

    制备破骨细胞和巨噬细胞。如所描述的从4-8周龄C57BL/6雄性小鼠中分离骨髓细胞(Wani et al.，Endocrinology 1999，140：1927-1935)。无菌条件下将腿节和胫节取出。切除骨末端，通过利用无菌31号注射针头注射BSS溶液而使骨髓细胞冲出。为了获得单细胞悬浮液，利用塑料巴斯德吸管对骨髓细胞进行搅动。在利用筛过滤后，利用Gey′s溶液处理骨髓细胞。将骨髓细胞洗涤两次，重新悬浮在含有10％FBS的α-MEM中，在750ml烧瓶中的M-CSF(5ng/ml)中以细胞密度1×106个细胞/ml培养骨髓细胞24小时。24小时后，收获未贴壁细胞并将它们重新悬浮在相同的培养基中。向100mm培养皿中添加10ml悬浮液(3×107个细胞)以制备破骨细胞和巨噬细胞。向巨噬细胞中添加M-CSF(30ng/ml)，而对破骨细胞使用hM-CSF(30ng/ml)、mTRANCE(1ug/ml)和PGE2(1uM)。在第3天对培养物进行饲养，并在利用PBS冲洗两次后在第4天收获贴壁细胞。如所描述的，从骨髓前体中产生成熟的树突细胞(Inabaet al.，J.Exp.Med.1992，176：1693-1702)。

    从骨髓细胞中分离RNA。利用TRIZOL(GIBCO)直接从培养皿中分离源自破骨细胞和巨噬细胞的总RNA。利用oligotex mRNA试剂盒(QIAGEN)从总RNA中分离poly A mRNA。利用乙醇对poly A mRNA的洗脱液进行沉淀并重新悬浮在利用DEPC处理过的蒸馏水中。利用UV分光光度计确定poly A mRNA的浓度。

    从头盖骨和长骨中分离RNA。收集3天龄小鼠的头盖骨，利用PBS冲洗，并利用TRIZOL处理。收集4周龄雌性小鼠的长骨，冷冻，利用Bessman组织粉碎器(Fisher)将其粉碎，并利用TRIZOL处理。按照操作手册(GIBCO)，利用TRIZOL从组织样品中收获总RNA。

    产生消减cDNA文库。按照操作手册(CLONTECH)，利用PCR选择的消减试剂盒，通过从骨髓的破骨细胞和巨噬细胞中取得的polyA mRNA制备消减cDNA文库。将经过消减法处理的cDNA直接插入到pCR2.1 TA克隆载体(INVITROGEN)中。在14℃下连接过夜后，将连接混合物转化到大肠杆菌XLIIB感受态细胞中。将这些细胞置于含有X-gal和IPTG以及氨苄青霉素的LB板中。随机挑选了250个白色克隆用于小量制备培养。

    鉴定破骨细胞特异性基因。利用QIAprep spin miniprep试剂盒(QIAGEN)分离含有经消减片段的质粒DNA样品。利用EcoR I消化后，用琼脂糖凝胶分离DNA，并转移到尼龙膜(NEN)上，利用源自破骨细胞和巨噬细胞的32P标记cDNA进行探测。如前所述，以随机的六聚物作为引物，利用总RNA合成32P标记的总cDNA探针(Sambrooket al.，1989，上文)。

    尼龙膜在杂交缓冲液(50％甲酰胺、150mM磷酸钠、pH6.8、2XDenhardt’s溶液、250mM NaCl、1％SDS、1mM EDTA和10％PEG 8，000)中预杂交4小时。向其中添加变性后的DNA探针并杂交16个小时。如前所述，对滤膜进行冲洗并进行放射自显影(Sambrook etal.，1989，上文)。选择出与破骨细胞探针进行选择性杂交的样品以进行进一步的分析。

    Northern分析。如已有的描述(Sambrook et al.，1989，上文)，利用Northern杂交缓冲液(50％甲酰胺、50mM磷酸钠、pH6.8、5X Denhardt’s溶液、5X SSC和3mg/ml超声处理的鲑鱼精子DNA)进行Northern印迹分析。按照操作手册(GIBCO)，利用TRIZOL收获源自不同细胞类型和组织样品的总RNA。对OCL178、全长TRAP和组织蛋白酶K cDNA进行标记并用作探针。

                         结果与讨论

    分离OSCAR的cDNA片段。破骨细胞(OC)和巨噬细胞(MΦ)是源自骨髓前体细胞的。既然OC和MΦ是源自可能的共同前体细胞，我们按照操作手册(CLONTECH)，利用PCR选择消减试剂盒来构建消减cDNA(鼠OC-MΦ)文库。为了鉴定OC特异性基因，从250个克隆中纯化含有经消减片段的质粒DNA、消化、在琼脂糖凝胶上分离、转移到尼龙膜(NEN)上、并利用源自OC或MΦ的32P标记cDNA进行探测(图8)。鉴定到一个称为OCL178的克隆，其在破骨细胞中较巨噬细胞中具有更高度的表达。此克隆确定为新颖基因片段，此处称为OSCAR。

    OSCAR在OC中特异性表达，但不在MΦ和树突细胞(DC)中特异性表达。为了检测OCL178是否源自在破骨细胞中特异性表达的基因，将源自OC和MΦ的mRNA与32P标记的OCL178进行杂交。如图9所示，OCL178片段检测到3种不同的mRNA，表观大小分别为4.0kb、1.8kb和1.0kb。在源自骨髓的OC(BMOC)细胞中特异性地检测到OSCAR的表达，而在源自骨髓的MΦ(BMM)细胞中却没有。此外，没有在源自骨髓的DC(BMDC)中检测到OSCAR表达，该DC与OC和MΦ源自同一前体。TRAP和组织蛋白酶K在本领域中认为是破骨细胞特异性标记，这是因为在OC中检测到它们的表达，而在MΦ中没有检测到(Minkin，C.，Calcif.Tissue Int.，1982，34：285；Ek-Rylander，et al.，Biochem J.1997，321：305-11；Chambers，et al.，Cell Tissue Res.，1985，241：671-675；Lacey，et al.，Cell，1998，93：165-176)。然而，与OSCAR不同，TRAP和/或组织蛋白酶K的表达也可在BMDC中检测到(见图9)。因此，OSCAR在破骨细胞中的表达较TRAP或组织蛋白酶K更具特异性，这表明OSCAR基因和其基因产物是破骨细胞特异性标记，优于本领域中的其他标记物(如TRAP和组织蛋白酶K)。

    OSCAR在OC中特异性表达，而在其他细胞中不表达。为了确定OSCAR mRNA表达的特异性，利用Northern分析对源自多种组织的mRNA进行了分析(图10)。如图10所示，在OC(OCL)中检测到了OSCAR mRNA的特异性表达，而在包括肌肉、肾脏、大脑、心脏、肝、肺、肠、胸腺、脾、淋巴结在内的其他所测组织中没有检测到OSCAR mRNA表达。相反，在源自其他细胞类型(也即源自除破骨细胞外的组织中的细胞)的mRNA中检测到了在本领域中认为是OC特异性标记的TRAP或组织蛋白酶K mRNA。因此，此结果进一步证实了OSCAR表达是破骨细胞特异性的，并且OSCAR基因及其基因产物是更好的破骨细胞特异性标记。

    OSCAR在体内和体外分化的细胞中表达。已经证明在利用TRANCE处理后RAW264.7细胞在体外分化为破骨细胞样细胞(Hsu et al.，Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.1999，96：3540-3545)。如图11A-C中所展示的，Northern印迹杂交分析证明这些细胞在处理后48小时内也表达OSCAR。4天后，当细胞已经完全分化后，OSCAR表达是最高的。

    此外，虽然在上述多种组织(如肌肉、肾脏、大脑、心脏、肝、肺、肠、胸腺、脾、淋巴结)中没有检测到OSCAR的表达，但在对富含破骨细胞的组织如头盖骨和长骨进行的Northern印迹分析中检测到了OSCAR mRNA(图11C)。

    因此，OSCAR在分化的破骨细胞中表达，并进一步地，不管是在体内或体外分化的，这样的细胞均有表达。

    实施例2：OSCAR编码新颖的类免疫球蛋白(Ig)受体

    本实施例描述了对含有编码全长鼠OSCAR多肽的序列的cDNA分子进行的分离和定性。

                         材料与方法

    生成小鼠cDNA文库。按照操作手册(STRATAGENE)，利用从源自骨髓的成熟破骨细胞中取得的poly A mRNA制备了小鼠cDNA文库。通过已描述的方法(Sambrook et al.，1989，上文)，利用OCL178插入物来从此文库中筛选分离全长OSCAR cDNA。

    氨基酸序列分析。全长鼠OSCAR氨基酸序列用于检索NCBI蛋白数据库中的同源蛋白序列。利用缺省参数通过BLAST族算法(Altschul et al.，Nucleic acids Res.1997，25：3389-3402；Altschul et al.，1990，J.Mol.Biol.1990，215：403-410)进行检索。

                          结果与讨论

    利用OCL178来筛选源自鼠骨髓破骨细胞的cDNA文库。按照标准的序列分析技术，对与上文实施例1中描述的长为1.8kb和1.0kb的OSCAR cDNA相对应的克隆进行分析。这些克隆的cDNA序列分别在图1A(1.8kb OSCAR cDNA)和图1B(1.0kb OSCAR cDNA)及SEQ IDNO：1和2中描述。对这两个核酸序列进行的比较表明，这两个克隆仅在3′非翻译区域有差异。每个克隆编码相同的预测氨基酸序列，如图1C(SEQ ID NO：3)中所示。对含有上述4.0kb OSCAR cDNA的克隆进行的序列分析表明，该克隆编码相同的多肽，但衍生自含有源自OSCAR基因组序列的内含子序列的未加工(也即未剪接)OSCARmRNA。

    对OCL178克隆进行的序列分析进一步证实，包含在此克隆中的cDNA与全长OSCAR cDNA序列的片段相对应。特别的，包含在OCL178中的OSCAR核酸序列(图2A，SEQ ID NO：4)与编码图1C(SEQ IDNO：3)中所示OSCAR多肽第161-165位氨基酸残基的全长鼠OSCARcDNA序列的片段相对应。此特定片段氨基酸序列也分别在图2B和SEQ ID NO：5中给出。

    对预测的鼠OSCAR多肽进行的氨基酸序列分析表明，OSCAR是含有264个氨基酸残基的新颖的类Ig受体。全长鼠OSCAR多肽含有信号肽序列(相应于1-16位氨基酸残基)、两个类Ig结构域序列(分别相应于17-122和123-228位氨基酸残基)、单链跨膜结构域序列(相应于229-247位氨基酸残基)及一个短胞质尾序列(相应于248-264位氨基酸残基)。应该理解，用于划分这些单独的结构域的氨基酸残基数目是大约值。

    利用BLAST族算法在NCBI核酸和蛋白数据库中对同源序列进行的检索进一步证实图1A-C(SEQ ID NO：1-3)中所示OSCAR核酸和多肽序列是新颖的。在这些数据库中没有检测到与此处描述的鼠OSCAR序列相对应的核酸或蛋白序列。然而，OSCAR多肽序列确实展示出与其他两个类Ig受体具有显著的序列同源性。特别的，利用BLAST族算法对NCBI蛋白数据库进行的搜索结果表明，鼠OSCAR多肽(图1C，SEQ ID NO：3)与鼠PirA(编号AAC53217.1)具有26.4％的同一性，而与牛FcαR蛋白(编号P24071)有24.2％的同一性。

    OsCAR多肽序列的跨膜结构域展示出与包括上文所述的PirA和牛FcαR在内的其他类Ig受体具有氨基酸序列相似性。此外，在OSCAR多肽的跨膜序列中存在保守精氨酸(图1C和SEQ ID NO：3中的第231位氨基酸序列)表明具有与跨膜信号传导接合体基序相关的结合活性。可很容易的对这些信号接合体进行鉴定，例如通过鉴定与OSCAR多肽或与优选的包含有整个跨膜序列或其部分的OSCAR多肽片段(见上文的筛选检测)共免疫沉淀的蛋白来完成。

    已知类Ig受体参与表达这些受体的细胞的发育和/或功能调节。此外，类Ig受体活性是通过通常在类Ig结构域处与特异性配基进行结合来介导的。因此，对图1C和SEQ ID NO：3中所示鼠OSCAR多肽进行的序列分析支持了OSCAR与OSCAR特异性配基(此处称为OSCAR-L)相互作用以及此相互作用可调节破骨细胞的成熟和功能这一发现。

    实施例3：鼠和人基因组DNA与鼠OSCAR cDNA杂交

    本实施例公开了对可与鼠OSCAR cDNA进行杂交的人基因组DNA进行的鉴定。进一步通过此处描述的BLAST搜索对人OSCAR基因组DNA进行定性。

    材料和方法

    Southern印迹分析。42℃下，在低严格性杂交缓冲液(30％甲酰胺、10mM Tris、pH7.6、2.5X Denhardt’s溶液、5X SSC、0.5％SDS、1.5mg/ml超声处理的鲑鱼精子DNA)中进行为时16小时的Southern印迹分析。在50℃下，利用低严格性冲洗溶液(0.5XSSC、1％SDS)对膜冲洗两次，每次20分钟。

                        结果与讨论

    鼠OSCAR源自单基因。利用EcoR I或Bg II限制性酶对鼠基因组DNA进行消化，并利用编码图1C(SEQ ID NO：3)中所示全长鼠OSCAR多肽序列的32P标记cDNA进行Southern印迹分析。7.0kb长的EcoR I片段和5.0kb长的Bg III片段与OSCAR探针发生杂交(图12A)。这些结果表明，在上文描述的、在对4.0kb、1.8kb和1.0kb可变剪接cDNA中鉴定到的鼠OSCAR序列是鼠单基因的可变剪接转录物。

    人基因组DNA与鼠OSCAR核酸进行杂交。也利用EcoR I或Bg II限制性酶对人基因组DNA进行消化，并利用与用于分析鼠基因组DNA(上文)相同的全长OSCAR cDNA探针和杂交条件对其进行Southern印迹杂交分析。鼠OSCAR cDNA探针与人基因组DNA的长约1.65kb的EcoR I片段和长约5.5kb的Bg III片段进行杂交(图12B)。因此，也存在可利用与本发明的鼠OSCAR核酸分子进行杂交而进行检测和鉴定的人OSCAR同源物。

    对人OSCAR基因进行鉴定和定性。利用缺省参数通过BLAST算法搜索NCBI核酸数据库并鉴定与图1A-B(SEQ ID NO：1-2)中所示鼠OSCAR cDNA序列同源的序列。这些数据库不仅含有多种已知人基因的核酸序列，也含有部分人基因组序列。

    BLAST搜索表明，包含在人染色体19克隆CTD-3093(GenBank标号AC012314.5；GI：771547)中的核苷酸序列的部分与鼠OSCARcDNA序列具有同源性。因此，人OSCAR基因定位在此染色体上。通过将人染色体19序列与鼠OSCAR cDNA序列进行对比，鉴定了人基因组OSCAR核酸序列中的外显子。

    图7A-D和SEQ ID NO：12给出了含有新颖的人OSCAR基因的人染色体19区域的核苷酸序列。特别的，图7A-D和SEQ ID NO：12中所示核苷酸序列与源自保存在GenBank数据库中的人染色体19克隆CTD-3093(GenBank标号AC012314.5；GI：771547)的序列上第117001-124920位核苷酸的序列相对应。包含在此染色体区域中的新颖的OSCAR基因组序列的外显子在图7A-D中以大写字母标出，而OSCAR基因中的内含子序列以小写字母标出。此新颖的OSCAR基因组序列的内含子/外显子边界的核苷酸数目也在上文表1中给出，针对的是SEQ ID NO：12中所示的核苷酸残基数。

    为了进一步对人OSCAR基因进行定性，利用与上文描述的那些筛选鼠cDNA文库类似的技术筛选衍生自人破骨细胞的cDNA文库。鉴定到人OSCAR的三个剪接变体或同工型。这三个同工型在此处分别称为C18人OSCAR同工型、C16人OSCAR同工型和C10人OSCAR同工型。这3个同工型的cDNA序列分别在图3A和SEQ ID NO：6(C18OSCAR同工型)中、图4A和SEQ ID NO：8(C16人OSCAR同工型)中以及图5A和SEQ ID NO：8(C10人OSCAR同工型)中给出。这三个同工型编码的OSCAR多肽的预测的氨基酸序列在此处的图3B和SEQ ID NO：7(C18人OSCAR同工型)中、图4B和SEQ ID NO：9(C16人OSCAR同工型)中以及图5B和SEQ ID NO：11(C10人OSCAR同工型)中给出。后来对这些序列进行了重新的序列分析，并得到证实，其中仅仅有很少的序列分析更正。特别的，确定了人OSCAR C18同工型的cDNA(在图3A和SEQ ID NO：6中所示)的第328位核酸残基为鸟嘌呤(G)，而不是最开始确定的胸腺嘧啶。此更正导致了在C18剪接变体的预测的氨基酸序列(在图3B和SEQ IDNO：7中所示)中有微小变化，其中97位氨基酸残基为丝氨酸(S或Set)，而不是最开始预测的异亮氨酸(I或Ile)。更正后的C18同工型的核酸和氨基酸序列分别在本发明的图3A和3B以及SEQ IDNO：6和7中列出。

    类似的，确定了人OSCAR C10同工型的cDNA(图5A和SEQ IDNO：10中所示)的第295位核酸残基为鸟嘌呤(G)，而不是最开始确定的胸腺嘧啶。此更正导致了在C10剪接变体的预测氨基酸序列(图5B和SEQ ID NO：11中所示)中有微小变化，其中86位氨基酸残基为丝氨酸(S或Ser)，而不是最开始预测的异亮氨酸(I或Ile)。更正后的C10同工型的核酸和氨基酸序列分别在本发明的图5A和5B以及SEQ ID NO：10和11中列出。

    对人和鼠OSCAR多肽序列(图6)进行的排序进一步证实这些序列具有非常高的水平的同源性。特别的，在此两序列中发现有74.6％(也即约75％)的同一性。

    实施例4：含有OSCAR的细胞外结构域的融合蛋白可调节破骨细胞的成熟及活性

    本实施例描述了含有本发明中的OSCAR氨基酸序列的特定融合蛋白。本实施例也描述了证明这些融合蛋白能够结合OSCAR特异性配基并可用于调节破骨细胞活性的预实验。

                           材料和方法

    FACS分析。按照在如Sharow，Chapters 5.1-5.2 in Currentprotocols in Immunology，Vol.I(Coligan et al.，eds.)JohnWiley&Sons，Inc；and by Kevin et al.，Chapter 5.3 inCurrent Protocols in Immunology，Vol.I(Coligan et al.，eds.)John Wiley&Sons，Inc中描述的常规方法进行FACS分析。

    制备融合蛋白。如下所述制备含OSCAR的细胞外结构域的融合蛋白。利用Herculase(STRATAGENE)通过PCR对相关的OSCAR结构域和人IgG1 Fc部分进行扩增。

    制备pcDNA中的OSCAR-Fc。利用称为5′-OSCAR-Met-RI和3′-OSCAR-Ec-Bgl ii(分别为SEQ ID NO：13-14)的引物，通过PCR从OSCAR cDNA质粒中扩增编码图1C(SEQ ID NO：3；氨基酸残基1-228)中所示鼠OSCAR多肽的细胞外结构域的核酸序列。利用EcoR I和Bg II对PCR产物进行消化。

    利用称为5′-人IgG1(SEQ ID NO：15)和3′-人IgG1(SEQID NO：16)的引物，通过PCR从人cDNA质粒中扩增人IgG1的Fc区。利用Bgl II和Xba I消化第二PCR反应的产物。随后将两次PCR反应的消化产物连接到利用EcoR I和Xba I消化过的pcDNA1表达载体上。

    选用的引物的核酸序列如下：

    5′-OSCAR-Met-RI：  5′-GGAATTCACCATGGTCCTGTCGCTGATACTC-3′

                                                        (SEQ ID NO：13)

    3′-OSCAR-Ec-Bglii：5′-GAAGATCTGTTTCCCTGGGTATAGTCCAA-3′

                                                        (SEQ ID NO：14)

    5′-Human IgG 1：   5′-GAGCCGCTCGAGGAATTCGTCGACAGATCTTGTGACA

                        AAACTCAC-3′                    (SEQ ID NO：15)

    3′-Human IgG1：    5′-GGCCGCTCTAGAACTAGTTCATTT-3′(SEQ ID NO：16)

    制备pMT/V5-His中的OSCAR-Fc。将OSCAR-Fc连接到经EcoR I和Xba I消化过的果蝇属表达载体pMT/V5-His(Invitrogen)中。

    制备pGEX6p-1中的GST-OSCAR。利用称为5′-OSCAR-Ec-HR(SEQ ID NO：17)和3′-OSCAR-Ec-STOP-Xho I(SEQ ID NO：18)的引物，通过PCR从OSCAR cDNA质粒中扩增编码图1C(SEQ IDNO：3；氨基酸残基1-228)中所示OSCAR多肽的细胞外结构域的核酸序列。利用EcoR I和Xho I对PCR产物进行消化，并利用EcoR I和Xho I将其连接到pGEX6p-1载体中。利用IPTG和X-gal诱导法(见如Sambrook et al.，1989，上文)在大肠杆菌BL21菌株细胞中转染并表达载体。

    选用的引物的核酸序列如下：

    5′-OSCAR-Ec-HR：5′-CCCAAGCTTGAATTCGACTTCACACCAACAGCG-3′

                                                        (SEQ ID NO：17)

    3′-OSCAR-Ec-    5′-CCGCTCGAGTCAGTTTCCCTGGGTATAGTCCAA-3′

    STOP-Xho I：                                        (SEQ ID NO：18)

    制备pGEX6p-1中的GST-F-OSCAR。利用称为5′-OSCAR-Ec-HR(SEQ ID NO：17，上文)和3′-OSCAR-Ec I-STOP-Xho I(SEQ IDNO：19)的引物，通过PCR从OSCAR cDNA质粒中扩增编码图1C(SEQ ID NO：3)中所示OSCAR多肽的第一个类Ig结构域(也即氨基酸残基17-122)的核酸序列。利用EcoR I和Xho I对PCR产物进行消化，并将其连接到pGEX6p-1载体中。利用IPTG和X-gal诱导法(见如Sambrook et al.，1989，上文)在大肠杆菌BL21菌株细胞中转染并表达载体。

    选用的引物的核酸序列如下：

    5′-OSCAR-Ec-HR：5′-CCCAAGCTTGAATTCGACTTCACACCAACAGCG-3′

                                                     (SEQ ID NO：17)

    3′-OSCAR-EcI-   5′-CCGCTCGAGTCAATCCGTTACCAGCAGTTC-3′

    STOP-Xho I：                                     (SEQ ID NO：19)

    制备pGEX6p-1中的GST-S-OSCAR。利用称为5′-OSCAR-Ec II-HR(SEQ ID NO：20)和3′-OSCAR-Ec-STOP-Xho I(SEQ ID NO：18，上文)的引物，通过PCR从OSCAR cDNA质粒中扩增编码图1C(SEQID NO：3)中所示OSCAR多肽的第二个类Ig结构域(也即氨基酸残基123-228)的核酸序列。利用EcoR I和Xho I对PCR产物进行消化，并将其连接到pGEX6p-1载体中。利用IPTG和X-gal诱导法(见如Sambrook et al.，1989，上文)在大肠杆菌BL21菌株细胞中转染并表达载体。

    选用的引物的核酸序列如下：

    5′-OSCAR-EcIII-RI：5′-GGAATTCGATCAGCTCCCCAGACCAT-3′(SEQ ID NO：20)

    3＇-OSCAR-Ec-       5′-CCGCTCGAGTCAGTTTCCCTGGGTATAGTCCAA-3′

    STOP-Xho I：                                          (SEQ ID NO：18)

    纯化OSCAR-Fc。利用所叙述的蛋白A色谱(见如Sambrook etal.，1989，上文)从培养上清液中纯化OSCAR-IgG。

    破骨细胞突变检验。如Suda等所述(Methods in Znzymolozy1977，228：223-35)，从野生型和TRANCE敲除小鼠的颅盖中分离破骨细胞。在破骨细胞和造血前体的共培养实验中，在1×10-7或1×10-8M 1α，25(OH)2D3存在下，在96孔平板中含有10％FBS的α-MEM中共培养骨髓细胞(1×105个细胞)和破骨细胞(1×104个细胞)。向培养物中加入20μg/ml OSCAR-IgG或人IgG1，以观察破骨细胞分化过程中OSCAR的作用。每隔3天利用新鲜的培养基来替代160ul旧培养基以此对培养物进行饲养。在培养6或7天后，如所描述的将细胞固定并对TRAP(SIGMA)染色(Wani et al.，Endocrinology1999，140：1927-1935)。对每孔中含有多于3个核的TRAP(+)多核破骨细胞进行计数。

                          结果与讨论

    OSCAR-L在成骨细胞表面上表达。利用同种型对照组人IgG1蛋白(图13A)或上文材料与方法部分描述的OSCAR-Ig融合多肽(图13B)对源自鼠颅盖的原代成骨细胞进行染色(也即温育)，随后与缀合PE的抗人IgG1抗体进行温育。随后对这些细胞进行FACS分析，以检测与这些细胞相关联的PE荧光的水平。结果展示在图13A-B中所示直方图中。特别的，对每个实验来讲，这些直方图表明了所观察到的具有特定PE-荧光水平(横轴)的细胞数目(纵轴)。具有所观察到的更高水平荧光的细胞指示那些细胞结合了更大量的PE缀合抗体。通过与结合到细胞表面的hIgG(图13A)或OSCAR-Ig(图13B)结合，如通过结合到OSCAR特异性配基上，与PE缀合的抗人IgG抗体可继之间接的结合到细胞上。

    相对于与IgG1对照组共培养的细胞上的荧光水平，当细胞与OSCAR-Ig融合多肽共温育时PE荧光水平显著增加。因此，数据证明成骨细胞表达了可与本发明中的OSCAR多肽特异性结合的化合物(也即OSCAR配基)。特别的，由于IgG1多肽不与成骨细胞结合，所以那些细胞表达的OSCAR配基特异性结合这些实验中选用的OSCAR-Ig融合多肽的OSCAR多肽序列上，而不与融合多肽的IgG1序列结合。

    在也利用维生素D3或甲状旁腺激素(已知分别能提高成骨细胞和破骨细胞的活性)处理成骨细胞的相同实验中，PE荧光水平没有显著的改变。因此，OSCAR配基的表达不受这些化合物的影响。

    添加OSCAR-Ig可调节破骨细胞的活性。施行一预实验来检测OSCAR多肽调节破骨细胞和/或成骨细胞活性的能力。如上文描述的破骨细胞成熟检验中所述，共培养鼠骨髓细胞和成骨细胞。在单一的、指定的时间点对共培养物进行的观察没有显示在利用同种型对照组人IgG1蛋白处理过的、TRAP染色的共培养物中观察到的成熟(也即多核的)破骨细胞。正如利用TRAP染色检测的，进一步利用维生素D3(100nM)和对照组IgG1蛋白处理骨髓和成骨细胞共培养物，诱导了多核破骨细胞形成。利用低剂量维生素D3(10nM)处理骨髓和成骨细胞共培养物可形成一些破骨细胞前体细胞，但利用TRAP染色没有检测到成熟的、多核破骨细胞。这些结果都是预期的结果，这要归因于已知维生素D3能激活成骨细胞中的TRANCE，从而诱导了破骨细胞的成熟。的确，在将TRANCE被敲除的成骨细胞与骨髓细胞共培养的对照实验中，利用相似水平的维生素D3进行处理没有对破骨细胞的成熟产生影响。

    相反，相对于上述的对照实验，利用维生素D3(10或100nM)和上文描述的OSCAR-Ig融合蛋白对共培养的细胞进行处理，导致成熟的、多核破骨细胞的数量明显增加。这些结果定量展示在图14中。

    观察到TRAP(+)多核细胞指示破骨细胞成熟。因此，OSCAR融合多肽存在下这些细胞数量增加表明在此特定预实验的特定条件下破骨细胞活性已在某些方面受到了调控。并没有限定于特定理论或作用机理的意图，我们认为这些实验中选用的可溶性OSCAR多肽竞争性结合成骨细胞表达的OSCAR特异性配基，从而防止了OSCAR特异性配基和骨髓细胞(如通过骨髓细胞中的破骨细胞前体细胞和未成熟破骨细胞表达)表达的OSCAR多肽间的相互作用。

    因此，从这些实验中得到的数据表明本发明中的OSCAR多肽和OSCAR特异性配基可用于调节破骨细胞的成熟和/或活性，从而调节与骨组织生长、发育、修复、降解、吸收或稳定相关的过程。

    实施例5：含有OSCAR的细胞外结构域的融合蛋白可抑制破骨细胞的成熟及活性

    本实施例描述了在可表明OSCAR能调节破骨细胞活性的预实验数据(见上文实施例4)之后进行的额外的、更确定的实验。特别的，提供了破骨细胞成熟动力学测定的数据。这些数据进一步对OSCAR融合多肽调节破骨细胞活性的能力进行了定性。

                        材料与方法

    制备和纯化OSCAR-Fc融合蛋白。如上文实施例4所述制备OSCAR-Ig融合蛋白。

    破骨细胞成熟的动力学测定。从野生型和TRANCE敲除小鼠中分离骨髓细胞和成骨细胞，并如上文实施例4所述将它们共培养在96孔板中。也制备了较普通共培养物含有更高密度破骨细胞特异性前体细胞的悬浮细胞培养物。简单来讲，悬浮细胞培养物是通过利用5ng/ml巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)处理总骨髓培养物(3×105个细胞)并随后清除产生的巨噬细胞而制备得到的。

    向培养物中添加10nM维生素D3以刺激破骨细胞成熟。向培养物中也添加20ug/ml OSCAR-Ig或人IgG1以观察OSCAR在破骨细胞分化过程中的作用。通过只添加10nM维生素D3(也即无OSCAR-Ig和IgG1)或在不添加维生素D3或蛋白的培养基中培养制备了对照组培养物。在培养至少6天后，如上文实施例4中所述，每天对每孔中的TRAP(+)多核细胞数目进行计数。

    牙质吸收检验。如前所述施行了作为骨吸收活性指示的牙质吸收检验。见如Tamura等，J.Bone Miner.Res.1993，8(8)：953-60，和Sudu等，Methods in Enzymology 1997，282：223-25。

    简单来讲，如上所述，在10nM维生素D3存在下，在牙质切片上制备了小鼠成骨细胞和骨髓细胞共培养物。向培养物中添加20ug/mlOSCAR-IgG或人IgG1，以观察OSCAR对破骨细胞活性的作用(也即骨或牙质吸收)。在单独存在10nM维生素D3(也即无OSCAR-Ig或IgG1)的条件下或在无维生素D3和融合蛋白存在的条件下，也在牙质切片上培养对照组培养物。

    在牙质切片上至少培养6天后，利用TRAP对细胞染色，以检测多核破骨细胞的数目。通过光学显微镜观察牙质切片上的吸收坑。

                        结果与讨论

    添加OSCAR-Ig减少了TRAP(+)多核细胞数。为了更好的对OSCAR怎样调节破骨细胞成熟和/或其活性进行定性，在存在或不存在OSCAR多肽的情况下，施行了至少几天时间的动力学实验以检测破骨细胞的成熟。动力学实验对于全面表征OSCAR对破骨细胞的作用是必要的，因为成熟的破骨细胞不能在细胞培养物中正常存活。因此，可由起始增加细胞培养物中观察到的成熟(如多核)破骨细胞的数目、随后由于成熟后破骨细胞死亡而数目降低来鉴定可刺激破骨细胞的因子。图15A-C展示了从利用鼠骨髓细胞和成骨细胞共培养物(图15A-B)和含有高密度破骨细胞特异性前体细胞的悬浮细胞培养物(图15C)进行的动力学实验获得的数据。

    如图15A中的定量展示，在约处理7天后，在总骨髓培养物中维生素D3刺激的破骨细胞成熟达到最高峰，这可由多核TRAP(+)细胞数目显示。然而，此起始增加后跟随的是分别在第8和第9天时活性迅速的增量减少。相反，相对于对照组实验，利用维生素D3和OSCAR-IG融合多肽处理共培养物，在第6-9天时形成的TRAP(+)细胞数目显著减少。

    图15B展示了表明处理后7天(刺激的破骨细胞成熟达到高峰)共培养物中存在的成熟(也即TRAP(+)，多核)细胞数目的条线图。当在单独维生素D3或维生素D3与对照IgG蛋白存在时对细胞进行培养，可显著增加成熟破骨细胞的数目(约150-200个细胞/孔)。在使用维生素D3和OSCAR-Ig融合蛋白的共培养物中，成熟破骨细胞的数目严重减少(也即少于50个细胞/孔)。

    悬浮细胞培养的动力学曲线(图15C)显示出在处理后7天时通过维生素D3诱导的TRAP(+)细胞数目类似的、但更为逐渐的增加，并至少持续至第9天。利用维生素D3和对照组人IgG1蛋白处理悬浮细胞培养物可如预期般产生相似的生长曲线。然而，利用维生素D3和OSCAR-Ig融合多肽处理悬浮细胞培养物显著抑制了破骨细胞的成熟，其抑制方式与图15A中展示的对骨髓细胞和破骨细胞共培养所观察到的抑制方式类似。

    OSCAR-Ig抑制了破骨细胞的牙质吸收。也如前所述进行牙质吸收检验实验(见如Yasuda et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998，95：3597-3602；and Tamura et al.，J.Bone Miner.Res.1993，8：953-960)，以便更详细的表征OSCAR对破骨细胞和/或成骨细胞活性的影响。更特别的，此检验检测了OSCAR对骨或牙质吸收的影响。图16A-E展示了在牙质切片上共培养的TRAP(+)染色鼠成骨细胞和骨髓细胞的光学显微照片。图16F-J展示了相应的牙质切片的光学显微照片。显微照片中的黑色染色区域表示切片上由于牙质已吸收而形成的凹处。

    正如所预期的，在不含维生素D3的情况下在牙质切片上共培养的细胞(图16A)很少或没有展示破骨细胞成熟，这是由缺乏TRAP(+)细胞所指示的。类似的，在相应的牙质切片上也没有显示任何吸收(图16F)。相反，当仅存在10-8M维生素D3(图16B)、或存在10-8M维生素D3和对照IgG蛋白(20ug/ml)(图16E)时，在牙质切片上的共培养物展示出TRAP(+)染色显著增加。在相应的牙质切片上也观察到指示牙质吸收的黑色染色区(分别为图16G和图16J)。这些吸收小坑与相应细胞培养物中的TRAP(+)染色区域相对应，这如预期的进一步证实了破骨细胞成熟提高与吸收增加相关。

    与在这些正对照中观察到的结果相反，在牙质切片上与10-8M维生素D3和OSCAR-Ig(20ug/ml)一起温育的共培养物很少或没有展示TRAP(+)染色(图16C)，并且很少或没有牙质吸收(图16H)。因此，利用OSCAR-Ig处理确实抑制了破骨细胞的活性，更具体的讲，抑制了骨或牙质的吸收。

    也进行了负对照实验，以证实利用OSCAR-Ig得到的实验结果。特别的，将成骨细胞和骨髓细胞的共培养物与10-8M维生素D3和鼠TRANCE抑制剂(mTR-Fc)这种已知的破骨细胞活性抑制剂进行共温育(Fuller et al.，J.Exp.Med.1998，188：997-1000)。正如所预期的，在这些共培养物中很少或没有发现TRAP(+)染色(图16D)，并且几乎没有牙质吸收(图16I)。

    图17展示了这些牙质吸收实验的定量结果。特别的，图中的条线图展示了每一成骨细胞和骨髓细胞共培养物切片上的牙质吸收坑的平均数。在单独与维生素D3(102.7±16.8)或与对照IgG1蛋白(114.7±22.2)进行温育的切片上，平均观察到超过100个坑。相反，与OSCAR-Ig进行温育时可抑制吸收10倍以上，在这些切片的每个切片上观察到少于10个吸收坑(7±2)。

    因此，从这些实验得到的数据进一步证实本发明中的OSCAR多肽和OSCAR特异性配基可用于调节破骨细胞成熟和/或活性，包括如可进行测定或估计(如通过此处描述的牙质吸收检验来进行测定或估计)的骨或牙质吸收这样的活性。特别的，不限定于任何特定理论或反应机理，这些实验中选用的可溶性OSCAR多肽被认为竞争性结合成骨细胞表达的OSCAR特异性配基，从而防止了激活骨髓细胞(如破骨细胞前体细胞及骨髓细胞中的未成熟破骨细胞)表达的OSCAR多肽。结果，通过OSCAR与其特异性配基结合而正常激活或刺激的破骨细胞成熟和活性受到了抑制。因此，利用本发明中的方法和组合物，可很容易的调节与破骨细胞活性相关的过程，包括但并不限于与骨组织生长、发育、修复、降解、吸收或稳态相关的过程。

    实施例6：OSCAR-Ig融合蛋白抑制破骨细胞成熟的能力在各生物种间具有交叉反应性

    上文实施例4和5描述了利用小鼠OSCAR核酸和氨基酸序列对可溶性OSCAR多肽(称为OSCAR-Ig或mOSCAR-Ig)进行制备和分离。这些实施例也证明利用可溶性OSCAR多肽可调节鼠细胞的成熟和活性。

    本实施例描述了利用人OSCAR核酸和氨基酸序列对可溶性OSCAR多肽(称为hOSCAR-Ig)进行制备和分离，并进一步证明利用此可溶性OSCAR多肽可调节人细胞的成熟和活性。所示数据表明OSCAR在不同生物种间是交叉反应性的。特别的，本实施例证明了利用可溶性鼠OSCAR多肽可调节人细胞的成熟和活性。类似的，也描述了利用人OSCAR多肽来调节鼠细胞的成熟和活性的用途。

                         材料和方法

    在pcDNA中制备hOSCAR-Fc。利用称为5′-hOSCAR-Met-Xho I和3′-hOSCAR-Ec-Hind III(分别为SEQ ID NO：21-22)的引物，通过PCR从hOSCAR cDNA质粒中扩增编码图3A(SEQ ID NO：6；氨基酸残基1-219)中所示人OSCAR多肽的细胞外结构域的核酸序列。利用Xho I和Hind III对PCR产物进行消化。

    通过利用称为凝血酶-S和凝血酶AS(分别为SEQ ID NO：23-24)的引物，进一步对上文产生的扩增产物进行扩增，从而在人OSCAR的末端插入凝血酶位点。

    利用称为5′-人IgG1(SEQ ID NO：15)和3′-人IgG1(SEQID NO：16)的引物，通过PCR从人cDNA质粒中扩增人IgG1的Fc区。利用Bgl II和Xba I消化第三次PCR反应的产物。随后利用Ex6和Xba I将两种PCR反应的消化产物连接到pcDNA1表达载体上。

    选用的引物的核酸序列如下：

    5′-hOSCAR-Met-XhoI：  5′-CCGCTCGAGACCATGGCCCTGGTGCTGAT-3′

                                                       (SEQ ID NO：21)

    3′-hOSCAR-Ec-HindIII：5′-CCCAAGCTTTGATCCTCCTCCGTCTTCCCAGCTGAT

                           GACCA-3′                   (SEQ ID NO：22)

    凝血酶-S：             5′-CCCAAGCTTCTGGTTCCGCGTGGATCCGCG-3′

                                                       (SEQ ID NO：23)

    凝血酶AS：             5′-CGCGGATCCACGCGGAACCAGAAGCTTGGG-3′

                                                       (SEQ ID NO：24)

    5′-人IgG1：           5′-GAGCCGCTCGAGGAATTCGTCGACAGATCTTGTGA

                           CAAAACTCAC-3′              (SEQ ID NO：15)

    3′-人IgG1：           5′-GGCCGCTCTAGAACTAGTTCATTT-3′(SEQ ID NO：16)

    制备pMT/V5-His中的hOSCAR-Fc。利用Xho I和Xba I将hOSCAR-Fc cDNA连接到果蝇属表达载体pMT/V5-His(Invitrogen)中。

    纯化hOSCAR-Fc。利用所描述的蛋白A色谱(见如Sambrook etal.，1989，上文)从培养物上清液中纯化hOSCAR-IgG。

    制备人单核细胞培养物。利用Leukopak滤膜通过连续过滤白细胞单采术(CFL)收集血液白细胞，随后对其进行逆流离心淘选，按大小分离到不同的馏分。含有约90％纯度的CD14+细胞的馏分为单核细胞。如Matsuzaki et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.1998，246(1)：199-204中所描述的，维持单核细胞并诱导其分化为人破骨细胞。

    鼠骨髓细胞培养物。如实施例4中所述制备鼠成骨细胞和骨髓细胞共培养物。

    牙质吸收检验。利用如上文描述而制备的人单核细胞培养物，按照常规方法(见实施例5和Tamura et al.，J.Bone Miner.Res.1993，8(8)：953-960)进行牙质吸收检验。

                         结果与讨论

    OSCAR-Ig抑制了人破骨细胞的成熟和活性。利用可溶性鼠和人OSCAR多肽(分别为mOSCAR-Ig和hOSCAR-Ig)进行了与上文实施例4和5中描述的实验相类似的实验，以对OSCAR多肽调节人细胞的成熟和/或活性的能力进行定性。特别的，在M-CSF(30ng/ml)、TRANCE(200ng/ml)和20ng/ml可溶性hOSCAR-Ig或mOSCAR-Ig存在下培养人单核细胞，并在培养5和10天后对TRAP(+)多核细胞进行计数。这些数据分别图示在图18A(培养5天后)和图18B(培养10天后)中。也进行了对照实验，其中人单核细胞是在仅仅存在M-CSF和TRANCE(也即无OSCAR-Ig)的条件下或在M-CSF、TRANCE和人IgG1多肽存在的条件下培养的。对于负对照来讲，人单核细胞是与仅仅M-CSF(也即无TRANCE和OSCAR-Ig)、及与M-CSF、TRANCE和已知的破骨细胞抑制剂TR-Fc共温育的(见上文实施例5)。

    正如所预期的，在仅与M-CSF(M)或与M-CSF、TRANCE和TR-Fc(MT+TR-Fc)共温育时很少或没有观察到TRAP(+)多核细胞。分别见图18A和18B中的1、5和6栏。相反，在人单核细胞仅与M-CSF和TRANCE(MT，图18A和18B中的2栏)或与M-CSF、TRANCE和IgG(MT+IgG，图18A和18B中的5栏)共温育时。然而，单核细胞与hOSCAR-IgG(图18A和18B中的3栏)共温育时抑制了升高的破细胞成熟水平。与mOSCAR-IgG(图18A和18B中的4栏)进行共温育也有类似的效用。但温育10天后在与mOSCAR-Ig的共培养物中观察到较与hOSCAR-Ig进行共温育的培养物中多一些的TRAP(+)多核细胞(分别为图18A和18B中的4和3栏)。然而，在培养10天后，在与mOSCAR-Ig共温育的培养物中的TRAP(+)多核细胞数较在人单核细胞仅仅与M-CSF和TRANCE或与IgG1进行共温育的培养物中观察到的TRAP(+)多核细胞数低一个数量级还要多。因此，人和鼠OSCAR多肽都能有效调节人破骨细胞的成熟和活性。

    图19(暴露5天后)和图20(暴露10天后)展示了这些细胞培养物的光学显微照片。与M-CSF和TRANCE(图19B和20B)共培养或与M-CSF、TRANCE和IgG1(图19F和20F)共培养的培养物中的多核细胞(如箭头所指示)较多，而在与hOSCAR-Ig(图19C和20C)或mOSCAR-Ig(图19D和20D)共温育的培养物的显微照片中有很少或没有多核细胞。

    也利用人单核细胞培养物来进行牙质吸收检验(如上文实施例5中所描述的)以进一步确定鼠OSCAR多肽在调节人破骨细胞活性方面的能力。图21A-J中展示了这些实验的结果。特别的，图21A-E展示了在30ng/ml M-CSF(图21A)、30ng/ml M-CSF和200ng/mlTRANCE(图21B)、M-CSF(30ng/ml)、TRANCE(200ng/ml)和20ug/ml mOSCAR-Ig(图21C)、M-CSF(30ng/ml)、TRANCE(200ng/ml)和5ug/ml TR-Fc(图21D)和M-CSF(30ng/ml)、TRANCE(200ng/ml)和20ug/ml hIgG1(图21E)存在的条件下，在牙质切片上培养的人单核细胞的光学显微照片。图21F-J分别展示了将在图21A-E中的细胞培养物冲洗掉后牙质切片的光学显微照片。这些显微照片中的黑色染色区表示牙质已为吸收后的坑。

    与在利用鼠细胞进行的牙质吸收实验(见实施例5和图17A-J)中观察到的类似，当人单核细胞与M-CSF(图21F)或TR-Fc(图21I)共培养时，很少或没有观察到牙质吸收。然而，当人单核细胞单独与TRANCE(图21G)或与TRANCE和对照IgG1多肽(图21J)共培养时观察到显著的吸收现象。然而，当人单核细胞与mOSCAR-Ig(图21H)共温育时，TANCE存在的情况下观察到的这种升高的吸收水平受到了抑制。

    因此，从这些实验中得到的结果证明，本发明中的OSCAR多肽，不仅包括人OSCAR多肽，而且包括源自其他生物种如小鼠的OSCAR多肽可调节人细胞(也即人破骨细胞)的成熟和活性。

    人OSCAR可与鼠细胞进行交叉反应。也进行了与上文描述的那些利用人单核细胞进行的实验相似的逆向实验，以此来研究人OSCAR多肽调节其他种生物体细胞的成熟和活性的能力。特别的，这些实验研究了hOSCAR-Ig多肽调节鼠破骨细胞成熟和活性的能力。这些实验基本与上文实施例4和5中描述的进行，利用鼠成骨细胞和骨髓细胞的共培养物。然而，在这些实验中，细胞培养物是与可溶性人OSCAR多肽(hOSCAR-Ig)而不是前述实施例中的可溶性鼠OSCAR多肽温育的。图22和23中展示了这些实验的结果。特别的，图22A-F展示了在与生长培养基(图22A)、维生素D3(图22B)、维生素D3和hOSCAR-Ig(图22C)或维生素D3和mOSCAR-Ig(图22D)共温育6天后TRAP染色的鼠细胞培养物的光学显微照片。也进行正和负对照实验，其中鼠细胞共培养物与维生素D3和IgG1多肽(图22F)或维生素D3和TR-Fc(图22E)进行温育。图23图示了针对每个培养物计数的TRAP(+)多核细胞数目。与我们在利用鼠细胞进行的其他实验中所观察到的相一致，相比于在仅与维生素D3或与维生素D3和对照IgG1多肽温育的共培养物中所观察到的数目，与维生素D3和鼠OSCAR多肽温育的共培养物明显含有较少的成熟破骨细胞。然而，有意思的是，与维生素D3和人OSCAR多肽温育的共培养物中具有类似水平的破骨细胞抑制作用。

    因此，本实施例中描述的实验证明，本发明中的OSCAR核酸和多肽是交叉反应性的，并可用于调节与获取OSCAR核酸或多肽的生物体种类相同或不同的生物体的破骨细胞成熟和/或活性。因此，本发明中的OSCAR多肽和核酸可用于在与获取OSCAR核酸或多肽的生物体种类相同或不同的生物体中调节与骨组织生长、发育、修复、降解、吸收或稳态相关的过程。

    本发明的范围并非限定于此处描述的特定实施方案。实际上，对本领域中的熟练技术人员来讲，除此处描述的这些实施例之外，从前述的说明和附图可对本发明做多种修饰，这些对它们来说是显而易见的。这些修饰在本发明的附加权利要求范围之内的。

    在本发明的说明书中引用并讨论了包括专利、专利申请和多种出版物在内的大量参考文献。对这些参考文献进行的引用和/或讨论仅仅是为了阐明本发明，并且也没有认可这些参考文献是此处描述的发明的“现有技术”。在本说明书中引用和讨论的所有文献在此处全文引用作为参考，并在某种程度上每篇文献是单独引用作为参考的。