作为Janus激酶抑制剂的环丁烷和甲基环丁烷衍生物相关申请
本申请要求2010年2月18日提交的标题为“作为Janus激酶抑制剂
的环丁烷和甲基环丁烷衍生物”的美国临时申请第61/305,630号的优先
权。本说明书全文中提及的任何专利、专利申请和参考文献的内容的全
文据此以引用的方式并入本文。
发明领域
本发明涉及环丁烷和甲基环丁烷衍生物，以及它们的盐类、组合物
和使用方法。这些化合物是可用于JAK相关疾病治疗的Janus激酶(JAK)
抑制剂，所述疾病包括，例如炎性和自身免疫失调，以及癌症和骨髓增
生性失调。
发明背景
蛋白激酶(PK)是调控多种重要生物过程的一组酶，所述生物过程
尤其包括细胞生长、存活和分化、器官形成和形态发生、新血管形成、
组织修复和再生。蛋白激酶通过催化蛋白质(或底物)的磷酸化而执行
其生理功能，并且由此在多种生物环境下调控所述底物的细胞活性。除
在正常组织/器官中的功能外，许多蛋白激酶还在包括癌症在内的许多人
类疾病中发挥更特定的作用。蛋白激酶的一个亚类(亦称为致癌蛋白激
酶)在失调时可导致肿瘤形成和生长，并且进一步参与肿瘤维持和发展。
迄今为止，致癌蛋白激酶是癌症干预和药物开发的蛋白质靶的最大的和
最引人注目的组之一。
所述Janus激酶(JAK)家族在对参与免疫应答的细胞的增殖和功
能的细胞因子依赖性调控中发挥作用。目前有四种已知的哺乳动物JAK
家族成员：JAK1(亦称为Janus激酶-1)、JAK2(亦称为Janus激酶-2)、
JAK3(亦称为白细胞Janus激酶；JAKL；L-JAK和Janus激酶-3)和TYK2
(亦称为蛋白酪氨酸激酶2)。所述JAK蛋白的大小介于120与140kDa
之间并且包含7个保守的JAK同源(JH)结构域；其中的一个是功能性
的催化激酶结构域并且另一个是伪激酶(pseudokinase)结构域，其发挥
调控功能和/或作为STAT的停泊位点发挥作用。
在所述JAK激酶的水平上阻断信号转导有望开发对炎性疾病、自身
免疫疾病、骨髓增生性疾病和人类癌症的治疗，以上仅举数例。所述JAK
激酶的抑制还被预期在罹患皮肤免疫失调(诸如银屑病和皮肤敏化)的
患者中具有治疗益处。
因此，为治疗癌症和其它疾病而开发新型和更为有效的药物持续地
需要抑制诸如Janus激酶这样的激酶的新型或改良药剂。本文所述的化
合物、盐类和组合物面向这些需求和其它目的。
发明内容
本发明提供了化合物，其为3-环丁基-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-
基)-1H-吡唑-1-基]丙腈或其药学上可接受的盐类。在一些实施方案中，
前述化合物是R或S对映异构体。
本发明进一步提供了化合物，其为3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-
基)-1H-吡唑-1-基)-3-(3-甲基环丁基)丙腈或其药学上可接受的盐类。本发
明进一步包括前述化合物的各种立体异构体，包括R和S对映异构体以
及顺式和反式几何异构体。
本发明进一步提供了本文所述的任意环丁基或甲基环丁基化合物
的磷酸盐。
本发明进一步提供了组合物，其包含本文所述的化合物或其药学上
可接受的盐以及至少一种药学上可接受的载体。
本发明进一步提供了在患者中治疗JAK相关疾病或失调的方法，所
述方法包含对所述患者施用治疗有效量的本文所述的化合物或其药学
上可接受的盐。
本发明进一步提供了本文所述的化合物或其药学上可接受的盐类
以用于治疗。
本发明进一步提供了本文所述的化合物或其药学上可接受的盐类
用于药物制备的用途，所述药物用于治疗。
本文进一步还提供了在患者中治疗自身免疫疾病的方法，所述方法
包括对所述患者施用治疗有效量的本发明的化合物或其药学上可接受
的盐。在一个实施方案中，所述自身免疫疾病是皮肤失调、多发性硬化
症、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、幼年型关节炎、I型糖尿病、
狼疮、炎性肠病、克罗恩病(Crohn’s disease)、重症肌无力、免疫球蛋
白肾病、心肌炎或自身免疫甲状腺失调。在另一个实施方案中，所述自
身免疫疾病是类风湿性关节炎。在又一个实施方案中，所述自身免疫疾
病是皮肤失调，诸如特应性皮炎、银屑病、皮肤敏化、皮肤刺激、皮疹、
接触性皮炎或变应性接触性敏化。
在另一方面，本文提供了在患者中治疗癌症的方法，所述方法包括
对所述患者施用治疗有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，所述癌症是实体瘤。在另一个实施方案中，所述癌
症是前列腺癌、肾癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、甲状腺癌、卡波济氏肉瘤
(Kaposi’s sarcoma)、卡斯特莱曼病(Castleman’s disease)或胰腺癌。
在又另一个实施方案中，所述癌症是淋巴瘤、白血病或多发性骨髓瘤。
在又另一方面，本文提供了在患者中治疗骨髓增生性失调的方法，
所述方法包括对所述患者施用治疗有效量的本发明的化合物或其药学
上可接受的盐。在一个实施方案中，所述骨髓增生性失调(MPD)是真
性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)、原发性骨髓纤维
化(PMF)、伴骨髓化生的骨髓纤维化(MMM)、慢性髓性白血病(CML)、
慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、嗜酸细胞增多综合征(HES)、
原发性骨髓纤维化症(IMF)、系统性肥大细胞病(SMCD)或后真性红
细胞增多/原发性血小板增多骨髓纤维化(Post-PV/ET MF)。
在另一方面，本文提供了在患者中治疗炎性疾病的方法，所述方法
包括对所述患者施用治疗有效量的本发明的化合物或其药学上可接受
的盐。
在又另一方面，本文提供了在患者中治疗器官移植排异的方法，所
述方法包括对所述患者施用治疗有效量的本发明的化合物或其药学上
可接受的盐。
在又另一方面，本文提供了在患者中治疗干眼的方法，所述方法包
括对所述患者施用治疗有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的
盐。
发明详述
本发明特别提供了JAK抑制化合物：
3-环丁基-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈(结
构式I)及其药学上可接受的盐类。
本发明进一步提供了化合物(R)-3-环丁基-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧
啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈(结构式I-R)和(S)-3-环丁基-3-[4-(7H-吡咯
并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈(结构式I-S)及其药学上可接受
的盐类。
本发明进一步提供了JAK抑制化合物3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶
-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(3-甲基环丁基)丙腈(结构式II)及其药学上可接
受的盐类。
本发明进一步提供了结构式II的化合物的顺式和反式异构体。这些
顺式和反式异构体是：
3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(反式-3-甲基环
丁基)丙腈(结构式II-反式)；以及
3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(顺式-3-甲基环
丁基)丙腈(结构式II-顺式)。
本发明进一步提供了结构式II的化合物的R和S对映异构体。这些
R和S异构体是：
(3R)-3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(3-甲基环丁
基)丙腈(结构式II-R)；以及
(3S)-3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(3-甲基环丁
基)丙腈(结构式II-S)。
本发明进一步提供了结构式II的化合物的R/反式、R/顺式、S/反式
和S/顺式异构体。这些异构体是：
(3R)-3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(反式-3-甲
基环丁基)丙腈(结构式II-R/反式)、
(3S)-3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(反式-3-甲
基环丁基)丙腈(结构式II-S/反式)、
(3R)-3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(顺式-3-甲
基环丁基)丙腈(结构式II-R/顺式)，
(3S)-3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(顺式-3-甲
基环丁基)丙腈(结构式II-S/顺式)。
上文描述的化合物在本文称作“本发明的化合物”。在此处和它处，
在化合物名称和化合物结构之间存在分歧的情况下，以所述化学结构为
准。
本发明进一步提供了前述任意化合物的药学上可接受的盐类。在一
些实施方案中，所述药学上可接受的盐是磷酸盐。
本文所述的化合物是非对称的(如，具有一个或多个立体中心)。
除非另行指明，否则所有的立体异构体，诸如对映异构体和非对映异构
体，均是预期的。包含受到非对称取代的碳原子的本发明化合物可以以
旋光活性的或外消旋的形式进行分离。关于如何制备旋光活性形式的方
法在本领域中是已知的，诸如通过对外消旋混合物的拆分或通过立体选
择性合成来制备。本文所述的化合物中还可以存在几何异构体，并且全
部这些稳定的异构体均涵盖于本发明中。本发明的化合物的顺式和反式
几何异构体被描述并且可以以异构体混合物的形式或以实质上分离的
异构体形式进行分离。在能够发生立体异构(如，旋光和/或几何异构化)
的化合物以其结构或名称指称而未提及特定的R/S或顺式/反式构型的
情况下，其意在涵盖所有这些异构体。例如，根据上文描述的结构式I
和II被理解为在该分子允许这些异构化的程度上包括R和S异构体以及
包括顺式和反式异构体。
可通过本领域中已知的大量方法中的任意方法拆分外消旋混合物
或分离旋光和/或几何异构体混合物，所述方法包括色谱方法(如，手性
柱色谱)或分步重结晶。
本发明的化合物还可包括互变异构形式。互变异构形式产生于单键
与其邻近的双键的交换，其伴随着质子的同步迁移。互变异构形式包括
质子异变型互变异构体，其为具有相同经验式和总电荷的异构质子化状
态。示例性质子异变型互变异构体包括酮-烯醇对、酰胺-亚胺酸对、内
酰胺-内酰亚胺对、酰胺-亚胺酸对、烯胺-亚胺对，以及质子可占据杂环
系统的两个或更多个位置的环状形式，例如1H-和3H-咪唑、1H-、2H-
和4H-1，2，4-三唑、1H和2H-异吲哚以及1H-和2H-吡唑。
本发明的化合物和盐类可与其它分子(诸如溶剂和水分子)共同存
在以形成水合物和溶剂化物。
本发明的化合物和盐类还可包含其中存在的原子的所有同位素。同
位素包括具有相同原子序数但不同质量数的原子。例如，氢的同位素包
括氚和氘。
在一些实施方案中，本发明的化合物及其盐类基本上是分离的。“基
本上是分离的”意指所述化合物至少部分地或基本上与其形成或其被检
测到的环境相分离。部分的分离可包括，例如富含本发明的化合物或盐
的组合物。基本上分离可包括组合物，其包含重量比至少约50％、至少
约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约
97％或至少约99％的本发明化合物或其盐。
本文使用的短语“药学上可接受的”指在合理医学判断下适用于接触
人类组织和动物的组织而无过量毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或
并发症的化合物、盐类、物质、组合物和/或剂量形式，其对应于合理的
收益/风险比率。
本发明还包括本文所述的化合物的药学上可接受的盐类。本文所使
用的短语“药学上可接受的盐类”指的是所公开的化合物的衍生物，其中
通过将存在的酸或碱部分转化成其盐的形式而修饰母体化合物。药学上
可接受的盐类的实例包括但不限于碱性残基诸如胺类的矿物酸盐或有
机酸盐；酸性残基诸如羧酸的碱金属盐或有机盐；等等。本发明的药学
上可接受的盐类包括所形成的母体化合物的常规无毒盐类，其形成于，
例如由无毒的无机或有机酸形成的盐类。可通过常规化学方法从包含碱
性或酸性部分的母体化合物合成本发明的药学上可接受的盐类。通常可
通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学当量的适当碱或酸在水中
或在有机溶剂中或这两者的混合物中反应而制备这些盐类。适当盐类的
名录可见于Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack
Publishing Company，Easton，Pa.，1985，p.1418和Journal of
Pharmaceutical Science，66，2(1977)，其各自以引用的方式全文并入本
文。
方法
本发明的化合物和盐类可抑制一种或多种Janus激酶(JAK)的活
性。本发明的化合物所结合和/或抑制的JAK包括所述JAK家族的任意
成员。本发明的化合物抑制JAK1和JAK2的活性。
本发明的另一方面涉及在个体(如，患者)中治疗JAK相关疾病或
失调的方法，其通过对需要该治疗的个体施用治疗有效量或剂量的本发
明的化合物或盐类或其药物组合物而进行。JAK相关疾病可包括任意疾
病、失调或病状，其直接或间接地关联于所述JAK的表达或活性，包括
过表达和/或异常活性水平。JAK相关疾病还可包括可通过调控JAK活
性预防、缓解或治愈的任意疾病、失调或病状。
JAK相关疾病的实例包括涉及免疫系统的疾病，其包括，例如器官
移植排异(如，同种异体移植物排异和移植物抗宿主病)。
JAK相关疾病的另外实例包括自身免疫疾病，诸如多发性硬化症、
类风湿性关节炎、幼年型关节炎、银屑病性关节炎、I型糖尿病、狼
疮、银屑病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、重症肌无力、免
疫球蛋白肾病、自身免疫甲状腺失调等。在一些实施方案中，所述自
身免疫疾病是自身免疫性大疱性皮肤病，诸如寻常型天疱疮(PV)或大
疱性类天疱疮(BP)。
JAK相关疾病的另外实例包括过敏性病状，诸如哮喘、食物过敏、
特应性皮炎和鼻炎。JAK相关疾病的另外实例包括病毒性疾病，诸如爱
泼斯坦-巴尔病毒(Epstein Barr Virus)(EBV)、乙型肝炎、丙型肝炎、
HIV、HTLV 1、水痘-带状疱疹病毒(VZV)和人乳头瘤病毒(HPV)。
JAK相关疾病或病症的另外实例包括皮肤失调，诸如银屑病(例
如，寻常型银屑病)、特应性皮炎、皮疹、皮肤刺激、皮肤敏化(如，
接触性皮炎或变应性接触性皮炎)。例如，包括某些药物在内的特定物
质在局部应用时可导致皮肤敏化。在一些实施方案中，本发明的至少
一种JAK抑制剂与导致不希望的敏化的药剂的共同施用或顺序施用可
有助于治疗这些不希望的敏化或皮炎。在一些实施方案中，通过局部
施用本发明的至少一种JAK抑制剂治疗了所述皮肤失调。
在进一步的实施方案中，所述JAK相关疾病是癌症，其包括特征
在于实体瘤的癌症(如，前列腺癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、乳腺
癌、肺癌、头颈部癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、卡波济氏肉瘤、卡
斯特莱曼病、黑色素瘤等)、血液癌症(如，淋巴瘤、白血病，诸如急
性成淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病(AML)或多发性骨髓瘤)
以及皮肤癌，诸如皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)和皮肤B细胞淋巴瘤。
示例性皮肤T细胞淋巴瘤包括塞泽里综合征(Sezary syndrome)和蕈样
肉芽肿病。
JAK相关疾病可进一步包括特征为突变体JAK2的表达的疾病，诸
如在所述伪激酶结构域上具有至少一个突变的JAK2(如，
JAK2V617F)。
JAK相关疾病还可进一步包括骨髓增生性失调(MPD)，诸如真性
红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)、伴骨髓化生的骨髓
纤维化(MMM)、慢性髓性白血病(CML)、慢性骨髓单核细胞性白血
病(CMML)、嗜酸细胞增多综合征(HES)、系统性肥大细胞病(SMCD)
等。在一些实施方案中，所述骨髓增生性失调是原发性骨髓纤维化
(PMF)或后真性红细胞增多/原发性血小板增多骨髓纤维化
(Post-PV/ET MF)。
另外的JAK相关疾病包括炎症和炎性疾病。示例性炎性疾病包括眼
睛的炎性疾病(如，虹膜炎、葡萄膜炎、巩膜炎、结膜炎或相关疾病)、
呼吸道的炎性疾病(如，包括鼻和鼻窦在内的上呼吸道，诸如鼻炎或鼻
窦炎，或者下呼吸道，包括支气管炎、慢性阻塞性肺病等)、炎性肌病，
诸如心肌炎，以及其它炎性疾病。
本文所述的JAK抑制剂可进一步用于治疗缺血再灌注损伤或相关
于炎性缺血事件(诸如中风或心脏停搏)的疾病或病状。本文所述的JAK
抑制剂可进一步用于治疗厌食症、恶病质或疲劳，诸如由癌症导致或与
之相关的疲劳。本文所述的JAK抑制剂可进一步用于治疗再狭窄、硬化
性皮炎(sclerodermitis)或纤维化。本文所述的JAK抑制剂可进一步用
于治疗组织缺氧或星形胶质增生相关的病状，诸如，例如糖尿病性视网
膜病、癌症或神经退行性变。参见，例如Dudley，A.C.等，Biochem.J.2005，
390(Pt 2)：427-36以及Sriram，K.等J.Biol.Chem.2004，279(19)：19936-47。
2004年3月2日电子出版。本文所述的JAK抑制剂可用于治疗阿尔兹
海默氏病。
本文所述的JAK抑制剂可进一步用于治疗其它炎性疾病，诸如全身
炎性反应综合征(SIRS)和败血性休克。
本文所述的JAK抑制剂可进一步用于治疗痛风以及由于，例如，良
性前列腺肥大或良性前列腺增生所导致的增大的前列腺体积。
本文所述的JAK抑制剂以及能够影响IL-6和STAT3信号传导的其
它JAK抑制剂可进一步用于治疗炎症相关的增殖性疾病。已经表明炎症
关联于特定类型癌症的发生。例如，已经表明罹患炎性肠病诸如溃疡性
结肠炎的患者具有远为更高的风险患上结肠直肠癌。这些类型的炎症相
关癌症已被命名为结肠炎相关性癌症(CAC)。几项研究已经表明
IL-6/STAT3信号传导参与促进CAC。例如，在CAC的动物模型中，STAT3
肠上皮细胞缺陷的小鼠具有减小的肿瘤尺寸和发病率。Bromberg等，
“Inflammation and cancer：IL-6and STAT3 complete the link”，Cancer Cell，
15：79-80(2009)。使用IL-6缺陷的小鼠获得了类似的结果，与野生型小
鼠相比其发生较少和更小的腺瘤。Grivennikov等，“IL-6and STAT3 are
required for survival of intestinal epithelial cells and the development of
colitis-associated cancer”，Cancer Cell，15：103-111(2009)。还参见，Bollrath
等，“gp 130-Mediaed STAT3 activation in enterocytes regulatres cell
survival and cell-cycle progression during colitis-associated tumorigenesis”，
Cancer Cell，15：91-102(2009)；以及Kortylewski等，“Regulation of the
IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment”，
Cancer Cell，15：114-123(2009)。
因此，在一些实施方案中，本发明的JAK抑制剂和影响IL-6/STAT3
信号传导的JAK抑制剂可用于治疗炎症相关癌症。在一些实施方案中，
所述癌症与炎性肠病相关。在一些实施方案中，所述炎性肠病是溃疡性
结肠炎。在一些实施方案中，所述炎性肠病是克罗恩病。在一些实施方
案中，所述炎症相关癌症是结肠炎相关性癌症。在一些实施方案中，所
述炎症相关癌症是结肠癌或结肠直肠癌。在一些实施方案中，所述癌症
是胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、腺癌、小肠癌或直
肠癌。除本文提供的化合物外，可用于治疗炎症相关癌症的示例性JAK
抑制剂包括描述于US 2006/0106020；US 2006/0183906；US
2007/0149506；US 2007/0135461；US 2008/0188500；US 2008/0312258；
US 2008/0312259；以及美国系列号第12/270,135号中的JAK抑制剂。
可在动物模型中针对治疗炎症相关癌症的潜在效力测试JAK抑制
剂。例如，可通过总结于Grivennikov等，“IL-6and STAT3 are required for
survival of intestinal epithelial cells and the development of
colitis-associated cancer”，Cancer Cell，15：103-111(2009)之中的方法在经
处理的(如，使用JAK抑制剂处理)或未经处理的小鼠中诱导CAC。
可通过测量体重和监测直肠出血和腹泻迹象而跟踪疾病的发生。在处死
所述动物后，除去远端结肠部分以用于分析。
在一些实施方案中，本文所述的JAK抑制剂可进一步用于治疗干眼
病。本文所使用的“干眼病”意在涵盖国际干眼病工作组(the Dry Eye
Workshop)(DEWS)最近的官方报告中所总结的疾病状态，所述报告将
干眼病定义为“引起不适、视觉扰乱和泪液膜不稳定的症状的眼泪和眼表
面的多因素疾病，对所述眼表面具有潜在损伤。其伴随着所述泪液膜提
高的渗透压和所述眼表面的炎症。”Lemp，“The Definition and
Classification of Dry Eye Disease：Report of the Definition and
Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop”，The
Ocular Surface，5(2)，75-922007年4月，其以引用的方式全文并入本文。
干眼病有时还指干燥性角膜结膜炎。在一些实施方案中，所述干眼病的
治疗包括缓解干眼病的特定症状，诸如眼部不适、视觉扰乱、泪液膜不
稳定、眼泪高渗透压以及眼表面的炎症。JAK抑制剂对于治疗干眼病的
用途提供于2009年10月1日提交的美国系列号第12/571,834号中，其
以引用的方式并入本文。
在进一步的方面，本发明提供了治疗结膜炎、葡萄膜炎(包括慢性
葡萄膜炎)、脉络膜炎、视网膜炎、睫状体炎、巩膜炎、巩膜外层炎或
虹膜炎的方法；治疗相关于角膜移植、LASIK(激光辅助原位屈光性角
膜成形术、屈光性角膜切削术或LASEK(激光辅助上皮下屈光性角膜成
形术)的炎症或疼痛的方法；抑制相关于角膜移植、LASIK、屈光性角
膜成形术或LASEK的视觉敏锐度的损失的方法；或在对其有需求的患
者体内抑制移植排异的方法，所述方法包括对所述患者施用治疗有效量
的结构式I的化合物或其药学上可接受的盐或N-氧化物。在一些实施方
案中，使用所述化合物或其药学上可接受的盐类或N-氧化物对将要进行
选自角膜移植、LASIK、屈光性角膜成形术和LASEK的手术的患者进
行术前施用。在一些实施方案中，所述化合物或其药学上可接受的盐或
N-氧化物在所述手术期间或之后抑制或减少了炎症或疼痛。在一些实施
方案中，在所述手术前约1天至约2天施用所述化合物或其药学上可接
受的盐或N-氧化物。在一些实施方案中，使用所述化合物或其药学上可
接受的盐或N-氧化物对已经进行了选自角膜移植、LASIK、屈光性角膜
成形术和LASEK的手术的患者进行术后施用。在一些实施方案中，抑
制视觉敏锐度损失意为减少视觉敏锐度的损失。在一些实施方案中，所
述术后或术前治疗减少了所述手术后的结痂和纤维沉积。在一些实施方
案中，抑制视觉敏锐度损失意为所述患者维持了视觉敏锐度。在一些实
施方案中，抑制排异意为所述化合物或其药学上可接受的盐或N-氧化物
具有免疫压制性，由此而预防了所述角膜移植的总体排异。
在一个实施方案中，本文提供了在受试者中治疗癌症的方法，其包
括对所述受试者施用3-环丁基-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡
唑-1-基]丙腈、其异构体或其药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，
本文提供了在受试者中治疗骨髓纤维化的方法，其包括对所述受试者施
用3-环丁基-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈、其异
构体或其药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，本文提供了在受试
者中治疗类风湿性关节炎(RA)的方法，其包括对所述受试者施用3-
环丁基-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈、其异构体
或其药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，本文提供了在受试者中
治疗真性红细胞增多症(PV)的方法，其包括对所述受试者施用3-环丁
基-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈、其异构体或其
药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，本文提供了在受试者中治疗
原发性血小板增多症(ET)的方法，其包括对所述受试者施用3-环丁基
-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈、其异构体或其药
学上可接受的盐类。在另一个实施方案中，本文提供了在受试者中治疗
实体瘤的方法，其包括对所述受试者施用3-环丁基-3-[4-(7H-吡咯并
[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈、其异构体或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，本文提供了在受试者中治疗银屑病的方法，其包
括对所述受试者施用3-环丁基-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡
唑-1-基]丙腈、其异构体或其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，本文提供了在受试者中治疗癌症的方法，其包
括对所述受试者施用3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-
基)-3-(3-甲基环丁基)丙腈、其异构体或其药学上可接受的盐。在另一个
实施方案中，本文提供了在受试者中治疗骨髓纤维化的方法，其包括对
所述受试者施用3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(3-甲
基环丁基)丙腈、其异构体或其药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，
本文提供了在受试者中治疗类风湿性关节炎(RA)的方法，其包括对所
述受试者施用3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(3-甲基
环丁基)丙腈、其异构体或其药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，
本文提供了在受试者中治疗真性红细胞增多症(PV)的方法，其包括对
所述受试者施用3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(3-甲
基环丁基)丙腈、其异构体或其药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，
本文提供了在受试者中治疗原发性血小板增多症(ET)的方法，其包括
对所述受试者施用3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(3-
甲基环丁基)丙腈、其异构体或其药学上可接受的盐。在另一个实施方案
中，本文提供了在受试者中治疗实体瘤的方法，其包括对所述受试者施
用3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(3-甲基环丁基)丙
腈、其异构体或其药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，本文提供
了在受试者中治疗银屑病的方法，其包括对所述受试者施用3-(4-(7H-吡
咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(3-甲基环丁基)丙腈、其异构体或
其药学上可接受的盐。
本文所使用的术语“接触”指的是在体外系统中或在体内系统中将指
明的部分合在一起。例如，使JAK“接触”本发明的化合物包括将本发明
的化合物施用于具有JAK的个体或患者，诸如人，以及例如将本发明的
化合物引入包含细胞或纯化的制剂的样品，所述细胞或纯化的制剂包含
所述JAK。
本文使用的可互换使用的术语“个体”或“患者”指的是任何动物，包
括哺乳动物，优选地是小鼠、大鼠、其它啮齿类、兔、犬、猫、猪、牛、
绵羊、马或灵长类，并且最优选地是人。
本文所使用的短语“治疗有效量”指的是活性化合物或药剂的量，该
量在组织、系统、动物、个体或人中引起研究人员、兽医、医师或其它
临床人员所寻求的生物或医药反应。
本文所使用的术语“进行治疗”或“治疗”指的是以下一种或多种：(1)
预防所述疾病；例如，在个体中预防疾病、病状或失调，所述个体可能
易感于所述疾病、病状或失调但尚未经受或表现出所述疾病的病理或症
候；(2)抑制所述疾病；例如，在个体中抑制疾病、病状或失调，所述
个体正在经受或表现出所述疾病、病状或失调的病理或症候；以及(3)
缓解所述疾病；例如，在个体中缓解疾病、病状或失调，所述个体正在
经受或表现出所述疾病、病状或失调的病理或症候(即，逆转所述病理
和/或症候)，诸如降低疾病的严重性。
在适当的和便利的情况下，如未另行指明，所述术语“用途”分别包
括任意一种或多种本发明的下列实施方案：在治疗失调中的用途；对于
制造用于治疗失调的药物组合物的用途，如在制造药物中的用途；将本
发明的化合物用于治疗这些疾病的方法；用于治疗这些疾病的具有本发
明化合物的药物制剂；以及用于治疗这些疾病的本发明的化合物。特别
地，待治疗的并且因此而对于本发明的化合物的使用是优选的疾病选自
与JAK激酶活性相关的疾病。
联合疗法
可结合本发明的化合物或盐类使用一种或多种另外的药剂以治疗
JAK相关疾病、失调或病状，所述药剂诸如，例如化疗剂、抗炎剂、类
固醇、免疫抑制剂，以及Bcr-Abl、Flt-3、RAF和FAK激酶抑制剂，诸
如，例如WO 2006/056399中所描述的那些，或者其它治疗剂。可同时
或先后对患者施用所述一种或多种另外的药剂。
示例性化疗剂包括蛋白酶体抑制剂(如，硼替佐米)、沙利度胺、
雷利米得(revlimid)以及DNA损伤剂诸如美法仑、多柔比星、环磷酰
胺、长春新碱、依托泊甙、卡莫司汀等。
示例性的类固醇包括皮质类固醇，诸如地塞米松或泼尼松。
示例性Bcr-Abl抑制剂包括在美国专利第5,521,184号、WO
04/005281和WO 2005/123719中公开的属和种类的化合物及其药学上可
接受的盐类。
示例性的适当Flt-3抑制剂包括在WO 03/037347、WO 03/099771和
WO 04/046120中公开的化合物及其药学上可接受的盐类。
示例性的适当RAF抑制剂包括在WO 00/09495和WO 05/028444中
公开的化合物及其药学上可接受的盐类。
示例性的适当FAK抑制剂包括在WO 04/080980、WO 04/056786、
WO 03/024967、WO 01/064655、WO 00/053595和WO 01/014402中公
开的化合物及其药学上可接受的盐类。
在一些实施方案中，本发明的一种或多种化合物可结合包括伊马替
尼在内的一种或多种其它激酶抑制剂使用，特别是用于治疗对于伊马替
尼或其它激酶抑制剂具有抗性的患者。
在一些实施方案中，本发明的一种或多种JAK抑制剂可结合化疗剂
用于治疗癌症，并且与对所述化疗剂单独的反应相比所述JAK抑制剂可
潜在地改善所述治疗反应而不加剧所述化疗剂的毒性作用。例如，用于
治疗多发性骨髓瘤的示例性的另外药剂可包括但不限于，美法仑、美法
仑加泼尼松[MP]、多柔比星、地塞米松和万珂(Velcade)(硼替佐米)。
用于治疗多发性骨髓瘤的进一步的另外药剂包括Bcr-Abl、Flt-3、RAF
和FAK激酶抑制剂。叠加或协同效应是将本发明的JAK抑制剂与另外
的药剂相结合的理想结果。此外，在使用本发明的JAK抑制剂进行治疗
下可逆转多发性骨髓瘤对诸如地塞米松这样的药剂的抗性。所述药剂可
以与本发明的化合物组合于单一的或连续的剂型中，或所述药剂可作为
独立剂型同时或顺序施用。
在一些实施方案中，将诸如地塞米松这样的皮质类固醇结合至少一
种JAK抑制剂对患者施用，其中间歇性地施用地塞米松而非连续施用。
在一些进一步的实施方案中，可在骨髓移植或干细胞移植之前、期
间和/或之后对患者施用本发明的一种或多种JAK抑制剂与其它治疗剂
的组合。
在一些实施方案中，至少一种另外的治疗剂可与干眼病和其它眼部
失调的治疗关联使用。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是醋酸肤
轻松(Retisert)或利美索龙(AL-2178，Vexol，Alcon)。在一些实施方
案中，所述另外的治疗剂是环孢霉素(Restasis)。在一些实施方案中，
所述另外的治疗剂是皮质类固醇。在一些实施方案中，所述皮质类固醇
是曲安西龙(triaminolone)、地塞米松、肤轻松、可的松、泼尼松或
flumetholone。
在一些实施方案中，所述另外的治疗剂选自DehydrexTM (Holles
Labs)、Civamide(Opko)、透明质酸钠(Vismed，Lantibio/TRB Chemedia)、
环孢霉素(ST-603，Sirion Therapeutics)、ARG101(T)(睾酮，Argentis)、
AGR1012(P)(Argentis)、依卡倍特钠(ecabet sodium)(Senju-Ista)、
吉法酯(gefarnate)(Santen)、15-(s)-羟基二十碳四烯酸(15(S)-HETE)、
cevilemine、强力霉素(ALTY-0501，Alacrity)、米诺环素、iDestrinTM
(NP50301，Nascent Pharmaceuticals)、环孢菌素A(Nova22007，
Novagali)、土霉素(耐久霉素，MOLI1901，Lantibio)、CF101
((2S，3S，4R，5R)-3，4-二羟基-5-[6-[3-(碘苯基)甲基氨基]嘌呤-9-基]-N-甲
基-氧杂环戊烷-2-氨基甲酰，Can-Fite Biopharma)、voclosporin(LX212
或LX214，Lux Biosciences)、ARG103(Agentis)、RX-10045(合成resolvin
类似物，Resolvyx)、DYN15(Dyanmis Therapeutics)、来格列酮
(rivoglitazone)(DE011，Daiichi Sanko)、TB4(RegeneRx)、OPH-01
Ophtalmis Monaco)、PCS101(Pericor Science)、REV1-31(Evolutec)、
Lacritin(Senju)、雷巴米特(Otsuka-Novartis)、OT-551(Othera)、PAI-2
(宾夕法尼亚大学和Temple大学)、毛果芸香碱、他克莫司、吡美莫司
(AMS981，Novartis)、依碳酸氯替泼诺(loteprednol etabonate)、利妥昔
单抗、地夸磷索四钠(diquafosol tetrasodium)(INS365，Inspire)、KLS-0611
(Kissei Pharmaceuticals)、脱氢表雄酮、阿那白滞素、依法利珠单抗
(efalizumab)、霉酚酸钠、依那西普(Embrel)、羟氯喹、NGX267
(TorreyPines Therapeutics)或沙利度胺。
在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是抗血管形成剂、胆碱能激
动剂、TRP-1受体调节剂、钙通道阻断剂、黏液素促分泌素(mucin
secretagogue)、MUC1刺激物、钙调神经磷酸酶抑制剂、皮质类固醇、
P2Y2受体激动剂、毒蕈碱样受体激动剂、另一种JAK抑制剂、Bcr-Abl
激酶抑制剂、Flt-3激酶抑制剂、RAF激酶抑制剂和FAK激酶抑制剂，
诸如，例如，描述于WO 2006/056399中的那些。在一些实施方案中，
所述另外的治疗剂是四环素衍生物(如，米诺环素或强力霉素)。
在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是舒缓滴眼液(亦称为“人造
泪液”)，其包括但不限于，包含聚乙烯醇、羟丙基甲基纤维素、甘油、
聚乙二醇(如PEG400)或羧甲基纤维素的组合物。人造眼泪可通过补
偿所述泪液膜下降的湿润和润滑能力而帮助治疗干眼病。在一些实施方
案中，所述另外的治疗剂是溶粘液药物，诸如N-乙酰基-半胱氨酸，其
可与粘蛋白相互作用并因此而降低所述泪液膜的粘度。
在一些实施方案中，所述另外的治疗剂包括抗生素、抗病毒剂、抗
真菌剂、麻醉剂、抗炎剂包括甾体类和非甾体类抗炎、以及抗过敏剂。
适当的药物的实例包括氨基糖甙类诸如阿米卡星、庆大霉素、妥布拉霉
素(tobramycin)、链霉素、奈替米星以及卡那霉素；氟喹诺酮类，诸如
环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、洛美沙星、左氧氟沙星以
及依诺沙星；萘啶类；磺胺类；多粘菌素；氯霉素；新霉素；巴龙霉素
(paramomomycin)；多粘菌素E甲磺酸盐；杆菌肽；万古霉素；四环素
类；利福平及其衍生物(“利福平类”)；环丝氨酸；β-内酰胺；先锋霉素类；
两性霉素类；氟康唑；氟胞嘧啶；游霉素；咪康唑；酮康唑；皮质类固
醇；双氯芬酸；氟吡洛芬(flurbiprofen)；酮咯酸；舒洛芬(suprofen)；
comolyn；洛多酰胺(lodoxamide)；左卡巴斯汀(levocabastin)；
naphazoling；安他唑啉；pheniramimane或氮杂内酯(azalide)抗生素。
药物制剂和剂量形式
当作为药物使用时，本发明的化合物和盐类可以以药物组合物的形
式施用。这些组合物可通过制药领域中众所周知的方式制备并且可通过
多种途径施用，取决于是否需要局部或全身治疗以及取决于待治疗区
域。施用可以是局部的(包括透皮、表皮、眼部以及对粘液膜，其包括
鼻内、阴道和直肠递送)、肺部的(如，通过粉末或气溶胶的吸入或吹
入，包括通过雾化器进行；气管内或鼻腔内)、口腔的或者肠胃外的。
肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、肌内注射或输注；或
者颅骨内施用如鞘内施用，或心室内施用。肠胃外施用可以是单次浓注
剂量的形式或者是，例如，通过连续灌流泵进行。用于局部施用的药物
组合物和制剂可包括透皮贴片、药膏、洗液、乳霜、凝胶、滴液、栓剂、
喷剂、液体和粉末。常规的药物载体、水溶液、粉末或油性基质、增稠
剂等可能是必需的或是理想的。涂布的安全套、手套等也可能是有用的。
本发明还提供了药物组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的
载体(赋形剂)相结合的本发明的一种或多种化合物以作为活性成份。在
制备本发明的组合物中，活性成份一般与赋形剂混合、以赋形剂稀释或
封装于诸如胶囊、药囊、纸或其它容器的形式的载体中。当所述赋形剂
用作为稀释剂时，其可以是固体、半固体或液体物质，其可作为所述活
性成份的媒介物、载体或介质发挥作用。因此，所述组合物可以是片剂、
丸剂、粉末、锭剂、药囊、扁囊剂、酏剂、悬液、乳液、溶液、糖浆、
气溶胶(作为固体或处于液体介质中)、包含例如最高达10重量％的所
述活性化合物的药膏、软胶囊和硬胶囊、栓剂、无菌注射液和无菌包装
粉末。
在制备制剂过程中，在与其它成份结合之前所述活性化合物可经研
磨以提供适当的颗粒大小。如果所述活性化合物是基本上不溶的，可将
其研磨至低于200目的颗粒大小。如果所述活性化合物是基本上可溶于
水的，可通过研磨调整所述颗粒大小以在所述制剂中提供基本上均一的
分布，如约40目。
可使用已知的研磨方法(诸如湿研磨)研磨本发明的化合物以获得
适用于片剂形式和适用于其它制剂类型的颗粒大小。本发明的化合物的
精细分割(纳米颗粒化)的制剂可通过本领域中已知的方法制备，例如，
参见国际专利申请第WO 2002/000196号。
适当的赋形剂的一些实例包括，乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘
露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、海藻酸盐、黄芪胶、明胶、硅酸钙、
微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆和甲基纤维素。所述
制剂可进一步包括：润滑剂诸如滑石、硬脂酸镁和矿物油；湿润剂；乳
化剂和悬浮剂；防腐剂诸如羟基苯甲酸甲酯和丙酯；甜味剂；以及芳香
剂。可使用本领域中已知的方法配制本发明的组合物以在对所述患者施
用后提供所述活性成份的快速、持续或延迟的释放。
可以以单位剂型配制所述组合物，各剂量包含约5至约1000mg(1
g)的所述活性成份，更通常的情况下包含约100至约500mg的所述活
性成份。所述术语“单位剂型”指的是物理上离散的单元，其适于作为单
位剂量用于人受试者和其它哺乳动物，各单元包含与适当的药物赋形剂
相结合的预定量的活性物质，所述量根据计算产生所需的疗效。
所述活性化合物可在广泛的剂量范围内有效并且通常以药学上有
效量施用。但是，应当了解，实际上被施用的所述化合物的量通常应由
医师根据相关情况决定，所述情况包括待治疗病状、所选定的施用途径、
施用的实际化合物、个体患者的年龄、体重和反应、所述患者症状的严
重性等等。
为制备诸如片剂这样的固体组合物，将主要活性成份与药物赋形剂
混合以形成固体预制组合物，其包含本发明的化合物的均质混合物。当
提及这些预制组合物为均质时，所述活性成份一般均匀地分散于整个所
述组合物中从而使所述组合物可容易地细分为等效单位剂型，诸如片
剂、丸剂和胶囊。随后将该固体预制剂细分为上述类型的单位剂型，其
包含，例如，约0.1至约1000mg的本发明的活性成份。
可包被或以其它方式复合本发明的片剂或丸剂以提供产生延长其
作用的益处的剂型。例如，所述片剂或丸剂可包含内剂量组分和外剂量
组分，后者是在前者之上的壳层的形式。所述两种组分可通过肠溶层分
隔，所述肠溶层用于在胃中抵御崩解并且使所述内层组分完整地进入十
二指肠或使其延迟释放。多种物质可被用于该肠溶层或包衣，这些物质
包括大量的聚合酸类以及聚合酸类与诸如虫胶、十六烷醇和醋酸纤维素
这样的物质的混合物。
本发明的化合物和组合物可并入其中用于口服或通过注射施用的
液体形式包括水溶液、适当调味的糖浆、水或油悬浮液和食用油(诸如
棉籽油、芝麻油、椰油或花生油)的调味乳液以及酏剂和类似的药物媒
介物。
用于吸入或吹入的组合物包括处于药学上可接受的水性溶剂或有
机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液，以及粉末。液体或固体组合物可
包含上文所述的适当的药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，为
达到局部或全身效果，所述组合物通过口腔或鼻腔呼吸途径施用。可通
过使用惰性气体雾化组合物。可从所述雾化设备直接吸入雾化的溶液，
或者可将所述雾化设备连接于面罩支架或间歇正压呼吸机。可从以适当
方式递送所述制剂的设备经口腔或鼻腔施用溶液、悬液或粉末组合物。
施用于患者的化合物或组合物的量应根据施用什么、施用目的(诸
如预防或治疗)、患者的状态、施用方式等变化。在治疗应用中，可对
已经患有疾病的患者施用组合物，所述组合物的量足以治愈或至少部分
地阻止所述疾病及其并发症的症状。有效量应取决于受治疗的疾病状态
以及负责的临床医师根据诸如疾病严重性、患者的年龄、重量和基本状
况等这样的因素作出的判断。
施用于患者的组合物可以是上文所述的药物组合物的形式。这些组
合物可通过常规灭菌技术进行消毒，或可进行无菌过滤。水溶液可经包
装进行原样使用或进行冻干，所述冻干制剂在施用前与无菌水性载体结
合。所述化合物制剂的pH一般应为3至11，更优选地为5至9，并且
最优选地为7至8。应当了解特定的前述赋形剂、载体或稳定剂的使用
应导致药物盐类的形成。
根据例如，进行所述治疗的特定用途、所述化合物的施用方式、所
述患者的健康与病状以及制定处方的医师的判断，本发明的化合物的治
疗剂量可有所变化。本发明的化合物在药物组合物中的比例或浓度可根
据多种因素而变化，其包括剂量、化学特性(如，疏水性)和施用途径。
例如，本发明的化合物可提供于水性生理缓冲溶液中，其包含约0.1至
约10％w/v的所述化合物用于肠胃外施用。某些典型剂量范围是约1
μg/kg至约1g/kg体重每天。在一些实施方案中，所述剂量范围是约0.01
mg/kg至约100mg/kg体重每天。所述剂量很可能取决于诸如所述疾病
或失调的类型和发展程度、特定患者的整体健康状态、被选定的化合物
的相对生物学效力、赋形剂的配制及其施用途径这样的可变因素。可通
过来自体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线推算有效剂量。
在一些实施方案中，本发明的化合物或其药学上可接受的盐作为眼
用组合物而施用。因此，在一些实施方案中，所述方法包括施用所述化
合物或其药学上可接受的盐与眼科上可接受的载体。在一些实施方案
中，所述眼用组合物是液体组合物、半固体组合物、插入物、薄膜、微
颗粒或纳米颗粒。眼用组合物详述于2009年10月1日提交的美国序列
号第12/571,834号，其以引用的方式并入本文。
应进一步了解，出于清楚的目的而描述于独立的实施方案的文字中
的本发明的特定特征也可在单一的实施方案中组合提供。相反地，出于
简化目的在单一实施方案的文字中描述的本发明的各种特征也可以独
立提供或以任意适当的亚组合提供。
除本文描述之外的本发明的那些以外，本发明的多种修改对于本领
域的技术人员是显而易见的。本申请书中提及的各个文献的全文以引用
的方式并入本文。
本发明将通过具体实施例的方式进行更为详尽地描述。下列实施例
出于说明的目的而提供，并且并非意在通过任何方式限制本发明。本领
域的技术人员应容易地认识到多种非关键性参数，其可被改变或修改而
产生实质上相同的结果。
实施例
实施例1
(R或S)-3-环丁基-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]
丙腈
步骤1.环丁基甲醛
在-78℃下将处于二氯甲烷(100mL)中的二甲亚砜(34.6mL，0.488
mol)溶液加入至处于二氯甲烷(700mL，10mol)中的草酰氯(20.6mL，
0.244mol)内。10分钟后，加入处于二氯甲烷(100mL)中的环丁基甲
醇(Aldrich，17.5g，0.203mol)并且在-78℃下将所产生的混合物搅拌
30分钟。随后加入处于二氯甲烷(100mL)中的三乙胺(140mL，1.0mol)
溶液并且将所述混合物搅拌5小时，使温度逐渐暖至室温(rt)。使用水
进行终止后，分离所述混合物。将所述有机层用水洗涤(2×)，盐水洗
涤，在硫酸钠上干燥并且过滤。蒸馏滤液，收集86-92℃的馏分以获得
所述醛(18.6g，54.4％)。
步骤2.3-环丁基丙烯腈
在0℃下向处于四氢呋喃中的1.00M的叔丁醇钾(116mL，0.116
mol)溶液中逐滴加入处于四氢呋喃(200mL)中的氰甲基膦酸二乙酯
溶液(Aldrich，19.7mL，0.122mol)。将反应物升温至室温并且随后在
0℃下再度冷却。向所述反应混合物中加入处于四氢呋喃(100mL)中
的环丁基甲醛溶液(参见步骤1，18.6g，0.110mol)。使所述反应物升
温至室温(室温)并且在室温下搅拌过夜。使用水进行终止后，使用乙
醚萃取所述混合物。将合并的有机层用水洗涤，盐水洗涤，干燥并且蒸
发至干燥。在硅胶上纯化粗混合物，使用处于己烷中的0至40％EtOAc
洗脱以获得所需产物(5.30g，44.7％)。对C7H10N(M+H)+的LCMS计
算值：m/z＝108.1；测定值：108.1。
步骤3.(R)-3-环丁基-3-[4-(7-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲
基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈和(S)-3-环丁基
-3-[4-(7-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-
基)-1H-吡唑-1-基]丙腈
向处于乙腈(124mL，2.37mol)中的4-(1H-吡唑-4-基)-7-{[2-(三甲
基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(参见，美国公开号第
US 2007/0135461号，15.6g，0.050mol)加入3-环丁基丙烯腈(5.30g，
0.050mol)，随后加入1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(3.70mL，0.025
mol)。在室温下搅拌所产生的混合物过夜，随后蒸发至干燥。在硅胶上
纯化所述混合物，使用处于己烷中的0至60％EtOAc洗脱从而获得以外
消旋混合物存在的所需产物(16g，76％)。对C22H31N6OSi(M+H)+的
LCMS计算值：m/z＝423.2；测定值：423.0。使用手性HPLC(柱：ChiralCel
OJ-H，30×250mm，5μm；流动相：30％乙醇/70％己烷；流速：24mL/min)
分离所述外消旋混合物以产生两种对映异构体。在手性分析HPLC(柱：
ChiralCel OJ-H，4.6×250mm，5μm；流动相：30％乙醇/70％己烷；流速：
0.8mL/min)上：第一峰保留时间：6.6分钟；第二峰保留时间：8.1分
钟。
步骤4.(R或S)-3-环丁基-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡
唑-1-基]丙腈
在装配以搅拌条、冷凝器和氮气入口的500mL圆底烧瓶内装入乙
腈(55mL)、水(4.8mL)和(R或S)-3-环丁基-3-[4-(7-{[2-(三甲基甲硅
烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈(来
自步骤3的手性分离的第二峰，2.8g，6.6mmol)。加入四氟硼酸锂(7.50
g，0.078mol)。所产生的混合物经升温以回流过夜，冷却至室温并且在
5分钟内逐份加入处于水(9.78mL)中的3.00M的氢氧化铵而调节pH
至9-10。在30分钟后，通过RP-HPLC(XBridge C1830×100mm柱，
注射体积5mL(～50mg/注射)，使用包含0.15％NH4OH的乙腈/水的梯
度以60mL/min的流速洗脱)纯化所产生的混合物以产生处于游离碱形
式的所需产物(1.51g，77.96％)。对C16H17N6(M+H)+的LCMS计算值：
m/z＝293.2；测定值：293.1。1H NMR(300MHz，CD3OD)δ8.65(1H，
s)，8.59(1H，s)，8.34(1H，s)，7.50(1H，d，J＝3.6Hz)，6.94(1H，d，
J＝3.6Hz)，4.69(1H，m)，3.07～2.97(3H，m)，2.21(1H，m)，1.97～1.84
(5H，m)ppm.ee 98.8％。
从对应于获自步骤3中的手性分离的第一峰的化合物起始以相同的
方式可以制备另一种对映异构体。
实施例2
(3R或3S)-3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(反式
-3-甲基环丁基)丙腈磷酸盐
步骤1.3-亚甲基环丁烷羧酸
向装配以冷凝器的圆底烧瓶中加入3-亚甲基环丁基甲腈
(BePharma，10.0g，0.107mol)。向所述烧瓶中加入处于乙醇(112mL)
和水(88mL)中的氢氧化钾(24.1g，0.365mol)溶液并且在100℃下
加热所述混合物。约2小时后，氨发生终止并且在减压下蒸发所述溶剂
至干燥。将所述固体物质溶于水中(75mL)，在冰浴中冷却，并且使用
浓盐酸将其酸化至pH约1。使用二氯甲烷对所产生的上层萃取两次。合
并有机层并且在无水硫酸镁上干燥。有机溶剂去除以产生所需的粗产物
(11.8g，97.67％)。
步骤2.N-甲氧基-N-甲基-3-亚甲基环丁烷甲酰胺
向处于二氯甲烷(100mL)中的3-亚甲基环丁烷羧酸(步骤1，5.88
g，52.4mmol)中加入草酰氯(Aldrich，5.33mL，62.9mmol)，随后加
入催化量的二甲基甲酰胺(DMF)。在室温下搅拌反应物2h，随后蒸发
至干燥。将粗酸酰基氯溶于二氯甲烷(200mL)中。向所产生的溶液中
加入N，O-二甲基羟胺盐酸盐(Aldrich，6.14g，62.9mmol)，随后在0℃
下逐滴加入三乙胺(TEA)(21.9mL，0.157mol)。在室温下搅拌所述反
应物过夜，并且滤去TEAHCl盐。使用1N的HCl洗涤滤液，随后以重
碳酸钠水溶液和盐水洗涤，并且在硫酸镁上干燥并蒸发至干燥。将粗酰
胺(7.30g，89.7％)直接用于下一步中。对C8H14NO2(M+H)+的LCMS
计算值：m/z＝156.1；测定值：156.3。
步骤3.3-亚甲基环丁烷基甲醛
在-15℃下向处于乙醚(200mL)中的四氢铝锂悬浮液(2.18g，57.5
mmol)内逐滴加入处于四氢呋喃(75mL)中的N-甲氧基-N-甲基-3-亚
甲基环丁烷甲酰胺溶液(步骤2，7.14g，46.0mmol)。在0至-15℃下
搅拌所述反应物30分钟，随后使用硫酸氢钾水溶液终止。使用乙醚萃
取所产生的混合物。使用盐水洗涤合并的有机层，在硫酸镁上干燥并且
蒸发。将所述粗产物(6.70g，151.5％)直接用于下一步。
步骤4.3-(3-亚甲基环丁基)丙烯腈
在0℃下向处于四氢呋喃中的1.00M的叔丁醇钾(48.3mL，48.3
mmol)溶液中逐滴加入处于四氢呋喃(80mL)中的氰甲基膦酸二乙酯
溶液(Aldrich，8.19mL，50.6mmol)。将反应物升温至室温并且随后在
0℃下冷却。向所述反应混合物中加入处于四氢呋喃(40mL)中的3-
亚甲基环丁烷基醛(步骤4，4.42g，46.0mmol)。使所述反应物升温至
室温并且随后在室温下搅拌过夜。使用水进行终止后，使用乙醚萃取所
述混合物。将合并的有机层使用水洗涤，盐水洗涤，干燥并且蒸发至干
燥。将粗混合物(5.90g，107.7％)直接用于下一步。
步骤5.3-(3-亚甲基环丁基)-3-[4-(7-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]
甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈
向处于乙腈(57.4mL)中的4-(1H-吡唑-4-基)-7-{[2-(三甲基甲硅烷
基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶溶液(参见，美国公开号第US
2007/0135461号，7.25g，23.0mmol)加入3-(3-亚甲基环丁基)丙烯腈(步
骤4，2.74g，23.0mmol)，随后加入1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯
(3.44mL，23.0mmol)。在室温下搅拌所产生的混合物整个周末，随后
蒸发至干燥。在硅胶上纯化残余物，使用处于己烷中的0至80％EtOAc
洗脱以产生所需产物(6.0g，60.1％)。对C23H31N6OSi(M+H)+的LCMS
计算值：m/z＝435.2；测定值：435.4。
步骤6.(3R或3S)-3-(反式-3-甲基环丁基)-3-(4-(7-((2-(三甲基甲硅烷
基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)丙腈
在氢气球压力下在0.6g的10％Pd/C存在的情况下对处于100mL
甲醇中的3-(3-亚甲基环丁基)-3-[4-(7-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲
基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈的混合物(步骤5，
4.0g，9.2mol)进行1h的氢化。滤去催化剂后，将滤液蒸发至干燥并
且在硅胶上纯化，使用处于己烷中的0至100％EtOAc洗脱以产生反式
和顺式异构体混合物形式的所需产物。对C23H33N6OSi(M+H)+的LCMS
计算值：m/z＝437.3；测定值：437.4。在手性HPLC柱上对所述产物进
行两次纯化。第一次HPLC分离(柱：ChiralCel OD-H，30×250mm，5μm；
流动相：15％乙醇/85％己烷；流速：28mL/min)产生A和B两个级分。
级分A是一种对映异构体的顺式/反式混合物。保留时间：10.51分钟。
级分B是另一对映异构体的顺式/反式混合物，其表现出两个不可分的
峰，保留时间13.05分钟和13.92分钟。对所述第一级分(A)进行进一
步的手性HPLC分离(柱：ChiralPak IA，20×250mm，5μm；流动相：
10％乙醇/90％己烷；流速：15mL/min)以产生两个峰A1和A2，一个
峰对应于顺式并且另一个峰对应于反式。根据手性分析HPLC(柱：
ChiralPak IA，4.6×250mm，5μm；流动相：15％乙醇/85％己烷；流速：
1.0mL/min)：第一峰(A1)保留时间：11.79分钟；第二峰(A2)保留
时间：12.78分钟。对所述第二级分(B)进行手性HPLC分离(柱：ChiralPak
IA，20×250mm，5μm；流动相：15％乙醇/85％己烷；流速：5mL/min)
以产生两个峰A1和A2(各峰为800mg，19.9％)。随后通过nOe表明
B1是该另一种对映异构体的顺式异构体并且表明B2是该另一种对映异
构体的反式异构体。根据手性分析HPLC(柱：ChiralPak IA，4.6×250mm，
5μm；流动相：15％乙醇/85％己烷；流速：1.0mL/min)：第一峰(B1)
保留时间：12.48分钟；并且第二峰(B2)保留时间：14.16分钟。
步骤7.(3R或3S)-3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-
基)-3-(反式-3-甲基环丁基)丙腈
在装配以搅拌条、冷凝器和氮气入口的500mL圆底烧瓶内充以乙
腈(9.69mL)、水(0.84mL)和3-(反式-3-甲基环丁基)-3-[4-(7-{[2-(三
甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]
丙腈(0.60g，1.4mol)(来自前述步骤的手性分离的B2(即，第二级分
的第二峰))。加入四氟硼酸锂(1.31g，13.7mmol)。所述混合物经升温
以回流过夜，随后在室温下在5分钟内逐份加入处于水中的7.2M的氢
氧化铵(0.71mL，5.1mmol)而调节pH至9-10。在室温下搅拌所述反
应物2h。通过过滤除去固体，并且在RP-HPLC上(XBridge C1830×100
mm柱，注射体积5mL(～50mg/注射)纯化，使用包含0.15％NH4OH的
乙腈/水的梯度以60mL/min的流速洗脱以产生游离碱形式的所需产物。
对C17H19N6(M+H)+的LCMS计算值：m/z＝307.2；测定值：307.4。1H NMR
(500MHz，DMSO-d6)δ12.08(1H，s)，8.78(1H，s)，8.68(1H，s)，8.36
(1H，s)，7.59(1H，d，J＝3.0Hz)，6.99(1H，d，J＝3.0Hz)，4.78(1H，
m)，3.12(2H，m)，2.88(1H，m)，2.30(1H，m)，2.06(1H，m)，1.88(1H，
m)，1.74(1H，m)，1.44(1H，m)，1.08(3H，d，J＝7.0Hz)ppm.ee 93.3％。
从对应于步骤6中级分A的化合物起始以相同的方法可以制备该另
一种对映异构体。
步骤8.(3R或3S)-3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-
基)-3-(反式-3-甲基环丁基)丙腈磷酸盐
在60℃下向处于异丙醇(5.83mL)的(3R或3S)-3-(反式-3-甲基环
丁基)-3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)丙腈溶液(步骤7，
0.275g，0.898mmol)内加入处于1.0mL异丙醇中的磷酸(96.8mg，
0.987mmol)。搅拌1h后，将所述混合物冷却至室温。滤去沉淀物并进
行空气干燥，随后使用乙醚冲洗并进一步空气干燥以产生所需的磷酸盐
产物(330mg，90.9％)。
实施例3
(3R或3S)-3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(顺式
-3-甲基环丁基)丙腈磷酸盐
步骤1.(3R或3S)-3-(顺式-3-甲基环丁基)-3-(4-(7-((2-(三甲基甲硅烷
基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)丙腈
在装配以搅拌条、冷凝器和氮气入口的500mL圆底烧瓶内装入乙
腈(8.1mL)、水(0.70mL)和(3R或3S)-3-(顺式-3-甲基环丁
基)-3-[4-(7-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-
基)-1H-吡唑-1-基]丙腈(0.50g，1.1mmol)(来自实施例2的步骤6中
描述的手性分离的B1(即，第二级分的峰1))。加入四氟硼酸锂(1.10g，
11.4mmol)。所述溶液经升温以回流过夜。随后在室温下在5分钟内向
所述溶液内逐份加入处于水中的氢氧化铵溶液(7.2M，0.59mL，4.3
mmol)以调节pH至9-10。在室温下搅拌所述反应物2h。通过过滤除
去固体，并且在RP-HPLC上(XBridge C1830×100mm柱，注射体积5
mL(～50mg/注射)，使用包含0.15％NH4OH的乙腈/水的梯度以60
mL/min的流速洗脱)纯化滤液以产生所需产物。对C17H19N6(M+H)+的
LCMS计算值：m/z＝307.2；测定值：307.4。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)
δ12.08(1H，s)，8.75(1H，s)，8.68(1H，s)，8.36(1H，s)，7.59(1H，d，
J＝3.0Hz)，6.99(1H，d，J＝3.0Hz)，4.66(1H，m)，3.11(2H，m)，2.66
(1H，m)，2.20(2H，m)，1.88(1H，m)，1.42(2H，m)，0.97(3H，d，J
＝6.0Hz)ppm.ee 99.8％。
从对应于来自实施例2的步骤6的级分A的化合物起始以相同的方
法可以制备另一种对映异构体。
步骤2.(3R或3S)-3-(4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-
基)-3-(顺式-3-甲基环丁基)丙腈磷酸盐
在60℃下向异丙醇(4.87mL)中的(3R或3S)-3-(顺式-3-甲基环丁
基)-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈溶液(步骤1，
0.23g，0.751mmol)内加入处于1.0mL异丙醇中的磷酸(80.9mg，0.83
mmol)。将所述混合物搅拌2h，随后使其冷却至室温。滤去沉淀物并进
行空气干燥，随后使用乙醚冲洗并进一步空气干燥以产生所需的磷酸盐
产物(300mg，98.8％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.08(1H，s)，
8.75(1H，s)，8.65(1H，s)，8.34(1H，s)，7.58(1H，d，J＝2.4Hz)，6.97
(1H，d，J＝2.4Hz)，4.63(1H，m)，3.09(2H，m)，2.64(1H，m)，2.18
(2H，m)，1.86(1H，m)，1.40(2H，m)，0.96(3H，d，J＝6.4Hz)ppm。
实施例A：体外JAK激酶分析。
根据描述于Park等，Analytical Biochemistry 1999，269，94-104中的下
列体外分析针对JAK靶的抑制性活性测试本文的化合物。使用杆状病毒
在昆虫细胞中表达具有N末端His标签的人JAK1的催化结构域(氨基
酸837-1142)、JAK2的催化结构域(氨基酸828-1132)和JAK3的催化
结构域(氨基酸781-1124)并进行纯化。通过测量生物素化肽的磷酸化
而分析JAK1、JAK2和JAK3的催化活性。通过均相时间分辨荧光
(HTRF)检测磷酸化肽。在包含酶、ATP和在具有100mM NaCl、5mM
DTT和0.1mg/mL(0.01％)BSA的50mM Tris(pH 7.8)缓冲液中500
nM肽的反应物中测量化合物对于各激酶的IC50。所述反应物中的ATP
浓度对于JAK1是90μM、对于JAK2是30μM并且对于JAK3是3μM。
反应在室温下进行1小时并且随后使用处于分析缓冲液内的20μL 45
mM EDTA、300nM SA-APC、6nM Eu-Py20(Perkin Elmer，Boston，MA)
终止反应。对铕标记抗体进行40分钟结合并且在Fusion读板仪(Perkin
Elmer，Boston，MA)上测量HTRF信号。实施例1、2和3的化合物据发
现对于JAK1具有低于2nM的IC50值并且对于JAK2具有低于1nM的
IC50值。
实施例B：细胞分析
根据下列细胞分析中的至少一种分析测试了本文的一种或多种化
合物对JAK靶的抑制活性。
以6000细胞每孔(96孔格式)将依赖于细胞因子并且因此而依赖
于JAK/STAT信号转导以生长的癌细胞系接种于RPMI 1640、10％FBS
和1nG/mL的适当细胞因子中。在DMSO/培养基(终浓度0.2％的DMSO)
中将化合物加入所述细胞并且在37℃，5％CO2下孵育72小时。使用
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)并继之以
TopCount(Perkin Elmer，Boston，MA)评估化合物对于细胞活力的效果。
使用非JAK驱动的细胞系以相同的分析读数平行地测量化合物的潜在
脱靶效果。所有的实验均一式两份地进行。
还可使用上述细胞系检测化合物对于JAK激酶及潜在下游底物(诸
如STAT蛋白、Akt、Shp2或Erk)的磷酸化的效果。可在过夜细胞因子
饥饿(overnight cytokine starvation)后进行这些实验，随后进行与化合
物的预孵育(2小时或更低)和约1小时或更短的细胞因子刺激。随后
从细胞中提取蛋白质并且通过本领域的技术人员所熟悉的技术进行分
析，所述技术包括使用可将磷酸化和总蛋白加以区分的抗体进行的
Western印迹或ELISA。这些实验可使用正常或癌细胞以研究化合物对
于肿瘤细胞存活生物学的活性或对于炎性疾病的调节剂的活性。例如，
关于后者，可使用诸如IL-6、IL-12、IL-23或IFN这样的细胞因子以刺
激JAK激活，其导致STAT蛋白的磷酸化并且潜在地导致转录谱(通过
试验或qPCR技术分析)或蛋白质如IL-17的产生和/或分泌。可使用本
领域的技术人员常用的技术测量化合物抑制这些细胞因子介导的效应
的能力。
还可在设计用于评估其针对突变JAK的潜力和活性的细胞模型中
测试本文的化合物，例如，见于骨髓增生性疾病中的JAK2V617F突变。
这些实验通常利用了细胞因子依赖的血液谱系细胞(如BaF/3)，其中异
位地表达了野生型或突变体JAK激酶(James，C.等，Nature
434：1144-1148；Staerk，J.等，JBC 280：41893-41899)。终点包括化合物对
于细胞存活、增殖以及磷酸化的JAK、STAT、Akt或Erk蛋白的效应。
本文的特定化合物已经或可以针对其抑制T细胞增殖的活性进行评
估。这种分析可被认为是第二细胞因子(即，JAK)驱动的增殖分析并
且也是免疫抑制或免疫激活的抑制的过简化分析。下文是对如何进行这
些实验的简要描述。使用Ficoll Hypaque分离方法从人全血样品中制备
外周血单核细胞(PBMC)并通过淘析从PBMC获得T细胞(级分2000)。
可在37℃下以2×106细胞/ml的密度将新分离的人T细胞在培养基中(补
充以10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI 1640)
维持最多达2天。对于IL-2刺激的细胞增殖分析，首先使用终浓度为
10μg/mL的植物血凝素(PHA)处理T细胞72小时。使用PBS洗涤一
次后，将6000细胞/孔接种于96孔平板中并且在100U/mL人IL-2
(ProSpec-Tany TechnoGene；Rehovot，Israel)存在的情况下使用处于所
述培养基中的不同浓度化合物进行处理。在37℃下孵育所述平板72小
时并且使用CellTiter-Glo Luminescent试剂根据制造商推荐方案
(Promega；Madison，WI)估测所述增殖指数。
实施例C：体内抗肿瘤效力
可在免疫低下小鼠中的人肿瘤异种移植物模型内评估本文的化合
物。例如，可使用INA-6浆细胞瘤细胞系的致癌变体对SCID小鼠进行
皮下接种(Burger，R.等，Hematol J.2：42-53，2001)。可将携带肿瘤的动物
随机分为药物处理组和媒介处理组，并且可通过多种常用途径施用不同
剂量的化合物，所述途径包括口腔、i.p.或使用可植入泵的连续输注。使
用测径器随时间跟踪肿瘤生长。此外，可在处理开始后的任意时间采集
肿瘤样品用于上文所述的分析(实施例B)以评估化合物对于JAK活性
和下游信号传导途径的效应。此外，可使用由其它已知激酶(如Bcr-Abl)
驱动的异种移植物肿瘤模型(诸如K562肿瘤模型)评定化合物的选择
性。
实施例D：小鼠皮肤接触迟发型超敏反应测试
还可在T细胞驱动的小鼠迟发型超敏反应测试模型中测试本文的化
合物的(抑制JAK靶的)效力。所述小鼠皮肤接触延迟型超敏(DTH)
反应被认为是临床接触性皮炎以及其它T淋巴细胞介导的皮肤免疫失调
诸如银屑病的有效模型(Immunol Today.1998Jan；19(1)：37-44)。小鼠
DTH与银屑病共有多种特征，包括免疫性浸润、炎性细胞因子的伴随性
提高以及角质细胞过度增殖。此外，有效于在临床中治疗银屑病的多个
类的药剂在小鼠中也是所述DTH反应的有效抑制剂(Agents
Actions.1993Jan；38(1-2)：116-21)。
在第0天和第1天，通过使用所述抗原2，4-二硝基氟苯(DNFB)
对其去毛腹部进行局部应用而敏化Balb/c小鼠。在第5天，使用工程千
分尺测量耳部厚度。记录该测量值并用作基线。随后通过总计20μL(内
耳廓上10μL并且外耳廓上10μL)浓度为0.2％的DNFB的局部应用刺
激所述动物的双耳。刺激后二十四至七十二小时，再度测量耳朵。在整
个敏化和刺激阶段(第-1天至第7天)或在所述刺激阶段之前和全程中
(通常为第4天的下午至第7天)给以使用所述测试化合物进行的处理。
全身性或局部地(所述治疗的对耳部的局部应用)施用所述测试化合物
(不同浓度下)的处理。通过与未进行所述处理的情况下相比耳部肿胀
的减低而显示所述测试化合物的效力。导致20％或更高的降低的化合物
被认为是有效的。在一些实验中，所述小鼠受刺激但未经敏化(阴性对
照)。
可通过免疫组织化学分析证实所述测试化合物的抑制性效果(抑制
所述JAK-STAT途径的激活)。所述JAK-STAT途径的激活导致功能性转
录因子的形成和活化。此外，免疫细胞的内流以及角质细胞的增殖提高
还应在所述耳部中提供可受到研究和定量的独特的表达谱变化。使用与
磷酸化STAT3特异性地相互作用的抗体(克隆58E12，Cell Signaling
Technologies)对经福尔马林固定和石蜡包埋的耳部切片(在所述刺激阶
段后采集于所述DTH模型中)进行免疫组织化学分析。为进行比较，
在所述DTH模型中使用测试化合物、媒介物或地塞米松(用于银屑病
的临床有效治疗)处理小鼠耳部或不进行任何处理。测试化合物和地塞
米松可定性和定量地产生类似的转录变化，并且所述测试化合物和地塞
米松均可降低浸润细胞的数目。所述测试化合物的全身和局部施用均可
产生抑制性效果，即，浸润细胞数目的降低和转录变化的抑制。
实施例E：体内抗炎活性
可在设计用于重复单一或复合炎症反应的啮齿类或非啮齿类模型
中评估本文的化合物。例如，可使用关节炎的啮齿类模型评估进行预防
性或治疗性给药的化合物的治疗潜力。这些模型包括但不限于小鼠或大
鼠的胶原诱导型关节炎，大鼠佐剂诱导型关节炎以及胶原抗体诱导型关
节炎。包括但不限于多发性硬化症、I型糖尿病、葡萄膜视网膜炎、甲
状腺炎、重症肌无力、免疫球蛋白肾病、心肌炎、气道敏化(哮喘)、
狼疮或结肠炎在内的自身免疫疾病也可用于评估本文的化合物的治疗
潜力。这些模型在本研究领域中是公认的并且为本领域的技术人员所熟
知(Current Protocols in Immunology，第3卷，Coligan，J.E.等，Wiley
Press.；Methods in Molecular Biology：第225卷，Inflammation Protocols.，
Winyard，P.G.与Willoughby，D.A.，Humana Press，2003)。
实施例F：干眼病、葡萄膜炎和结膜炎治疗的动物模型
可在本领域的技术人员已知的一种或多种干眼病临床前模型中评
估化合物，所述模型包括但不限于，兔伴刀豆球蛋白A(ConA)泪腺模
型、东莨菪碱小鼠模型(皮下或透皮)、肉毒菌小鼠泪腺模型或导致眼
腺体功能失调的多种自发啮齿类自身免疫模型(如，NOD-SCID、MRL/lpr
或NZB/NZW)中的任一模型(Barabino等，Experimental Eye Research
2004，79，613-621和Schrader等，Developmental Opthalmology，Karger
2008，41，298-312，各文献全文以引用的方式并入本文)。这些模型中的
终点可包括眼腺体和眼睛(角膜等)的组织病理学并且可能包括经典的
希尔默试验(Schirmer test)或其修饰形式(Barabino等)，其测量了泪
液的产生。可通过以多种施用途径(如全身或局部)给药而评估活性，
所述施用可在可检测疾病存在之前或之后开始进行。
可在本领域的技术人员已知的一种或多种葡萄膜炎临床前模型中
评估化合物。这些模型包括但不限于，实验性自身免疫葡萄膜炎(EAU)
模型和内毒素诱导型葡萄膜炎(EIU)的模型。EAU实验可在兔、大鼠
或小鼠中进行并可涉及被动或主动免疫。例如，多种视网膜抗原中的任
意抗原可用于使动物对相关免疫原敏化，此后可以使用相同的抗原对动
物进行眼激发。所述EIU模型更为急性并且涉及脂多糖在亚致死剂量下
的局部或全身施用。EIU和EAU的终点均可包括内窥镜检验，组织病理
学以及其它。Smith等对这些模型进行了综述(Immunology and Cell
Biology 1998，76，497-512，其以引用的方式全文并入本文)。通过以多种
施用途径(如全身或局部)给药而评估活性，所述施用可在可检测的疾
病存在之前或之后开始。上文列出的一些模型还可发展出巩膜炎/巩膜外
层炎、脉络膜炎、睫状体炎或虹膜炎，并且因此而可用于研究化合物对
于这些疾病的治疗性处理的潜在活性。
还可在本领域的技术人员已知的一种或多种结膜炎临床前模型中
评估化合物。这些模型包括但不限于，使用豚鼠、大鼠或小鼠的啮齿类
模型。所述豚鼠模型包括使用了主动或被动免疫和/或使用如卵清蛋白或
豚草这样的抗原的免疫激发方案的模型(在Groneberg，D.A.等，Allergy
2003，58，1101-1113中进行综述，其全文以引用的方式并入本文)。大鼠
和小鼠模型在总体设计上类似于豚鼠中的模型(同样由Groneberg所综
述)。可通过以多种施用途径(如全身或局部)给药而估测活性，所述
施用可在可检测的疾病存在之前或之后开始。这些研究的终点可包括但
不限于，例如，对眼组织(诸如结膜)的组织学、免疫学、生物化学或
分子分析。
除本文描述的那些之外，本发明的多种修改对于本领域的技术人员
应是显而易见的。本申请书中提及的各个文献的全文以引用的方式并入
本文。