抗大肠杆菌和沙氏门菌的禽类组合疫苗.pdf

本发明提供了一种疫苗组合物，其含有基因缺失突变体的鼠伤寒沙门氏菌微生物和基因缺失突变体的大肠杆菌微生物的组合，适合大量应用于家禽。本发明同时提供了一种安全有效保护家禽免于大肠杆菌和沙门氏菌感染和疾病损伤的方法。

权利要求书
1.  一种禽类疫苗组合物，其含有：免疫原性有效量的大肠杆菌的基因缺失突变微生物和鼠伤寒沙门氏菌的基因缺失突变微生物的组合，和药学上可接受的载体。

2.  根据权利要求1所述组合物，其中所述载体是适合用于组织或细胞培养基中的平衡盐溶液。

3.  根据权利要求1所述组合物，其中所述载体是蒸馏水。

4.  根据权利要求1所述组合物，其中所述免疫原性有效量是足以提供约5.0×102cfu到5.0×1010cfu的大肠杆菌的基因缺失突变微生物和约5.0×102cfu到5.0×1010cfu的鼠伤寒沙门氏菌的基因缺失突变微生物。

5.  根据权利要求1所述组合物，其中所述大肠杆菌的基因缺失突变微生物是大肠杆菌aroA-微生物。

6.  根据权利要求5所述组合物，其中所述微生物是具有ATCC PTA-5094的鉴定特征的大肠杆菌aroA-微生物。

7.  根据权利要求1所述组合物，其中所述鼠伤寒沙门氏菌的基因缺失突变微生物是鼠伤寒沙门氏菌aroA-微生物。

8.  根据权利要求7所述组合物，其中所述微生物是具有鼠伤寒沙门氏菌STM-1的鉴定特征的微生物。

9.  根据权利要求8所述组合物，其中所述大肠杆菌的基因缺失突变微生物是具有大肠杆菌aroA-PTA-5094的鉴定特征的微生物。

10.  根据权利要求9所述组合物，其中所述免疫原性有效量是足以提供约3.0×106cfu到6.0×106cfu的大肠杆菌aroA-PTA-5094和约2.0×106cfu到6.0×106cfu的鼠伤寒沙门氏菌STM-1的量。

11.  一种在家禽中预防或改善大肠杆菌和沙门氏菌感染或疾病的方法，其包括给所述家禽施用免疫原性有效量的大肠杆菌的基因缺失突变微生物和鼠伤寒沙门氏菌的基因缺失突变微生物的组合。

12.  根据权利要求11所述方法，其中所述家禽选自鸡、鸭、鹅、火鸡、矮脚鸡、鹌鹑、雉和鸽子。

13.  根据权利要求11所述方法，其中所述组合可以大量施用。

14.  根据权利要求11所述方法，其中所述组合中的大肠杆菌的基因缺失突变微生物是大肠杆菌aroA-微生物。

15.  根据权利要求14所述方法，其中所述微生物是具有大肠杆菌aroA-PTA-5094的鉴定特征的菌株。

16.  根据权利要求11所述方法，其中所述组合中的鼠伤寒沙门氏菌的基因缺失突变微生物是鼠伤寒沙门氏菌aroA-微生物。

17.  根据权利要求16所述方法，其中所述微生物是具有鼠伤寒沙门氏菌STM-1的鉴定特征的菌株。

18.  根据权利要求17所述方法，其中所述大肠杆菌的基因缺失突变微生物是大肠杆菌aroA-微生物。

19.  根据权利要求18所述方法，其中所述大肠杆菌微生物是具有大肠杆菌aroA-PTA-5094的鉴定特征的微生物。

20.  根据权利要求19所述方法，其中所述免疫原性有效量是足以提供约3.0×106cfu到6.0×106cfu的大肠杆菌aroA-PTA-5094和约2.0×106cfu到6.0×106cfu的鼠伤寒沙门氏菌STM-1的量。

说明书抗大肠杆菌和沙氏门菌的禽类组合疫苗
发明领域
本发明涉及抗沙氏门菌和大肠杆菌感染的组合禽类疫苗。特别地，本发明是有关用于家禽的分别含有沙氏门菌和大肠杆菌的突变减毒活菌株的疫苗组合物。本发明也涉及通过施用含沙氏门菌和大肠杆菌的减毒微生物的疫苗来预防包括鸡在内的家禽中的细菌性疾病的方法。
发明背景
在家禽业中，刚孵化的鸡特别容易受沙氏门菌的感染。这种细菌通过排泄物传播，幼龄动物可能通过该粪便或或许通过被污染了的加工饲料而感染，这将导致高死亡率并伴随着严重的经济后果。除了沙氏门菌，通过排泄物的污染的禽舍的环境也含有大量的大肠杆菌(E.coli)，通过呼吸道和肠道在家禽中导致了全身感染。这种大肠杆菌感染被称为大肠杆菌病。并发的菌血症发展为败血症并至死亡，或感染延伸到浆膜表面、心包膜、关节处和其他器官。因而大肠杆菌和沙氏门菌都对家禽业产生严重持续的威胁。
对沙氏门菌的治疗和预防策略包括卵黄接种来治疗沙氏门菌病，如在US6,231,871 B1中描述的那样。但是，卵黄接种的困难在于需要大型的家禽设备。大部分的孵卵缺少必要的复杂的特殊卵黄接种设备。关于大肠杆菌的感染，控制诱发感染和环境因素，并及早使用抗生素，这是减少禽舍中大肠杆菌存在量的一般公认的措施。遗憾的是，出现了对四环素、卡那霉素、新霉素、头孢金素、链霉素和红霉素高频率的耐药性。
尽管有商购的大肠杆菌活疫苗可用于抵抗火鸡的大肠杆菌病，但这些并不是都适合用于鸡的疫苗。而且，没有出现对包括鸡在内的家禽安全有效的用于抗沙氏门菌和大肠杆菌感染的组合疫苗，而且是经济施用的，如通过喷雾或饮用水大量应用在孵化后的鸡上。
因此，本发明的一个目的是提供对包括鸡在内的家禽安全有效的疫苗组合物，该组合物用于抵抗由包括鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的沙门氏菌和大肠杆菌(Eschierichia coli)引发的感染和疾病。
本发明的另一个目的是提供一种用于预防或改善由沙门氏菌(包括鼠伤寒沙门氏菌和其它的如肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)和海德尔堡沙门氏菌(S.heidelberg))和大肠杆菌在家禽中引发感染或疾病的方法。
本发明的特征是所述疫苗组合物适合大量应用，如通过饮用水或喷雾来施用。
本发明的优点是所述活疫苗组合物可以在宿主中引起细胞和体液免疫应答。
发明概述
本发明提供了一种安全有效的禽类疫苗组合物，其包含免疫原性有效量的大肠杆菌的基因缺失突变微生物和沙门氏菌的基因缺失突变微生物的组合物和药学上可接受的载体。
本发明也提供了一种用于预防和改善家禽中大肠杆菌和沙门氏菌感染或疾病的方法，其包括给所述家禽施用免疫原性有效量的大肠杆菌的基因缺失突变微生物和沙门氏菌的基因缺失突变微生物的组合。
本发明的其它目的和特征将在下面详细的说明书中了解到。
发明详述
家禽的禽类大肠杆菌疾病经常与包括血清型O78、O1、O2，和一些特殊的有毒未分型的菌株的大肠杆菌有关。感染一般通过呼吸道产生，经常接着引发或感染其它家禽群生疾病。对3到10周大的鸡来说，大肠杆菌病通常引发高热，并且有高的发病率和死亡率。禽类大肠杆菌病最严重的表现是败血症，其特征是心包炎、肝周炎和空囊炎。其它症状包括关节炎和蜂窝组织炎。分离自家禽中的大肠杆菌对一些药物如氨苄西林、氯霉素、土霉素、新美素、庆大霉素、呋喃西林、萘啶酸、多粘菌素B、磺胺类药有高频率的耐药性。但是，具有于2003年3月27日保藏在美国典型生物保藏中心(ATCC)保藏号为ATTCPTA-5094地鉴定特征的大肠杆菌aroA基因缺失突变微生物大肠杆菌aroA-可以安全有效的用于包括鸡在内的家禽的大肠杆菌病中。大肠杆菌aroA-PTA-5094疫苗免疫原，当给鸡施用时，会产生明显的细胞和体液免疫应答。此外，所述疫苗容易生产并且可以大规模施用，如喷雾或饮用水。该大肠杆菌aroA-PTA-5094疫苗及其构建体在同一申请人的未决的序列号为＿＿＿的专利申请中有描述，在此一并引入作为参考。另外，本发明还涉及其它的减毒活大肠杆菌基因突变体，包含缺失突变体，特别是aroA缺失突变体来作为所述组合疫苗的免疫原部分。
家禽中另一个明显的感染源来自包括鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)的沙门氏菌。刚孵化出的禽类很容易感染沙门氏菌，而且具有高的死亡率，这种孵化后立即发生的结果可带来严重的经济后果。很多沙门氏菌能在人类和其它动物引起感染，控制家禽中沙门氏菌的感染尤为重要。活的减毒的沙门氏菌疫苗已显示可以保护鸡(Cooper，等人，Microb.Pathog.，9：255-265，1990；Hassan和Curitis，Res.Micrbial.，141：839-950，1990)。重要的是，已发现具有保藏在澳大利亚官方分析实验室(Australian Govemment Analytical Laboratories)保藏号为N93/43266的鼠伤寒沙门氏菌STM-1的鉴定特征的无毒的鼠伤寒沙门氏菌aroA缺失突变微生物在抗沙门氏菌感染和疾病中特别有效。所述鼠伤寒沙门氏菌STM-1微生物及其构建物在US 6,231,871中有描述，在此被引入作为参考。另外，本发明还涉及其它减毒活沙门氏菌基因突变体，包括基因缺失突变体，特别是aroA缺失的突变体来作为所述组合疫苗的免疫原部分。
由于卵内和口服如强饲法接种可能是困难的和不方便的，优选的疫苗组合物应适合于如通过喷雾或饮用水而大量应用。同样，特别优选使用简单的疫苗组合物，其能够安全有效的抵抗家禽中大肠杆菌和沙门氏菌的感染和疾病。然而，任何多于一种的微生物与单一疫苗的组合物结合后，可能出现交叉影响，以至达不到微生物单独施用时所产生的免疫应答效果。因此，含有一种以上微生物的疫苗组合物不得不面临上述问题，预想得到期望的效果，实际上可能小于每种微生物单独施用时的效果。
另人惊讶的是，现在发现一种疫苗组合物对于由沙门氏菌和大肠杆菌引起的禽类疾病和感染是安全和有效的，其含有免疫原性有效量的大肠杆菌的基因缺失突变微生物和鼠伤寒沙门氏菌的基因缺失突变微生物的组合，以及药学上和接受的载体。优选的，本发明所述组合物含有作为抗原的能够在宿主中诱导细胞和体液免疫应答的活的减毒的微生物，同时即使是通过呼吸系统施用时其表明是安全的。这里所述安全应考虑可以使用经济有效的大规模应用手段如喷雾(如简单的喷雾)或饮用水，或两者，即使是在年龄非常小的时候。这一特征是重要的，因为通过幼禽的呼吸粘膜施用两种细菌免疫原会在动物身上出现一定的毒性效应。
组合疫苗中每种微生物的免疫原性有效量可能由于宿主的年龄、感染的程度、病原体的活力、施用的方式等而有所不同。一般来说，每个剂量单位合适的有效量可能是大约102到104菌落生成单位(cfu)，优选约5.0×102cfu到5.0×1010cfu，更优选约3.0×106cfu到6.0×106cfu的大肠杆菌的基因缺失突变微生物，和约102到1014cfu，优选约5.0×102cfu到5.0×1010cfu，更优选约2.0×106cfu到6.0×106cfu的鼠伤寒沙门氏菌的基因缺失突变微生物。
一个或两个剂量单位可以通过普通的技术人员来预测。如果选择两个剂量单位，那么在约孵出后一天接种然后在一到两周大时再接种。一个剂量单位最好是每只禽约0.5到1ml疫苗，但是这样的量可以优化以递送上面所描述的每种微生物的免疫原性有效量。
适合用于本发明所述组合物中的大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的基因缺失突变微生物可以是通过对氨基酸或维生素或其它必需分子的生物合成途径进行诱导突变来修饰的大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌微生物；优选该突变影响了一种或多种选自下列的氨基酸的生物合成：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；更优选对芳香族维生素的生物合成途径诱导突变；特别优选对aro途径诱导突变，更优选的是对aroA基因诱导突变。优选的大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌基因缺失的突变微生物的例子分别是，于2003年3月27日保藏在美国典型生物中心的编号为PTA-5094大肠杆菌aroA-微生物，和保藏在澳大利亚官方分析实验室保藏号为N93/43266的鼠伤寒沙门氏菌株STM-1，下面将表示为鼠伤寒沙门氏菌STM-1。
根据普通技术人员获得的信息和技术可以对作为本发明所述疫苗一部分的基因缺失的突变微生物进行连续传代。连续传代可以使得减毒株更适合作为疫苗的免疫原。预期大约需要最多10次的连续传代，优选约3到5次。
用于本发明所述疫苗组合物的药学可接受的载体可以是用于兽药学组合物的任何常规的液体载体；优选用于组织或细胞培养基如无菌磷酸缓冲盐溶液的平衡盐溶液，更优选蒸馏水。其它适合的基质包括乳化剂。普通的技术人员也可以配制本发明所述疫苗。当该疫苗通过饮用水应用时，脱脂干奶粉可以作为载体。该脱脂干奶粉对疫苗起稳定作用，并且可能中和了影响疫苗活力的一些微量矿物质的作用。
在实际操作中，大肠杆菌的基因缺失突变微生物可以组合鼠伤寒沙门氏菌的基因缺失突变微生物，该组合微生物可以使用液体载体混合并且可以通过喷雾或饮用水添加剂的方式施用。另外。每种微生物可以各自用液体载体混合后再组合在一起作为喷雾或饮用水添加剂施用，或同时施用。
因此，本发明也提供了预防或改善家禽大肠杆菌和沙门氏菌感染或疾病的方法，其包括施用家禽免疫原性有效量的大肠杆菌的基因缺失突变微生物和鼠伤寒沙门氏菌的基因缺失突变微生物的组合物。
适合用本发明所述方法的家禽包括鸡、鸭子、火鸡、鹅、矮脚鸡、鹌鹑、雉、鸽子等，优选商业价值高的鸡、鸭子、鹅和火鸡，更优选鸡和火鸡，特别优选鸡。
大肠杆菌的基因缺失突变微生物和鼠伤寒沙门氏菌的基因缺失突变微生物可以通过常规的方式施用，优选在家禽业中经济可行的方式如通过喷雾或饮用水大量施用。
用于本发明所述方法的大肠杆菌的基因缺失突变微生物和鼠伤寒沙门氏菌的基因缺失突变微生物可以是对氨基酸或维生素或其它必需分子的生物合成途径进行诱导突变来修饰的大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌微生物；优选该突变影响了一种或多种选自下列的氨基酸的生物合成：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；更优选对芳香族维生素的生物合成途径诱导突变；特别优选对aro途径诱导突变，更优选的是对aroA基因诱导突变。优选的大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的基因缺失突变微生物的例子分别是具有大肠杆菌aroA-PTA-5094和鼠伤寒沙门氏菌STM-1的鉴定特征的那些。
用于本发明所述方法的免疫原性有效量根据宿主的年龄和大小、感染的程度、病原体的活力、施用的方式等来确定。一般来说，合适的有效量是每剂量单位足以提供约102到1014cfu，优选约5.0×102cfu到5.0×1010cfu，更优选约3.0×106cfu到6.0×106cfu的大肠杆菌基因缺失突变微生物的量，和每剂量单位足以提供约102到1014cfu，优选约5.0×102cfu到5.0×1010cfu，更优选约2.0×106cfu到6.0×106cfu的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变微生物的量。
为了更好的理解本发明，提供以下的实施例。这些实施例仅仅是例证性的而不能在任何情况下理解为对本发明的范围或潜在的原理的限制。事实上，本发明不同的修饰，除了那些在此已说明和描述之外的，从下面的实施例和上述的说明书中本领域内的普通技术人员能够容易的实现。这样的修饰同样落入本发明附加的权利要求范围之内。
实施例1
AROA基因缺失的大肠杆菌突变体的构建
I)受体
亲本微生物是分离自1995年提交到Veterinary Laboratories Agency(VLA)，Addlestone，Surrey，UK并在VLA测定了血清型的禽类大肠杆菌病的临床病例的大肠杆菌禽类分离株。亲本株通过它在一天大的SPF鸡上的停留、侵袭、持久性和致病性，和在体外的抗生素敏感性的特征而选择。受体株通过将转化的供体(携带PNG101的大肠杆菌K12 S17λpir，缺失携带100bp的aroA)和野生型的亲本株(野生型大肠杆菌分离株EC34195)结合而产生。
II)缺失的特征
aroA基因，能编码3-磷酸烯醇丙酮酸莽草酸-5-磷酸酯合成酶，一种普遍芳香族生物合成途径的酶，它位于邻近serC-aroA操纵子的serC的启动子的末端。受体株aroA基因的缺失导致了需要芳香族代谢物，包括酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、对氨基苯甲酸酯(PABA)和2，3-二羟基苯甲酸酯。PABA，在脊椎动物组织没有发现的一种代谢物的需要，导致了体内生长的减慢。
III)aroA基因缺失的大肠杆菌突变体的构建
a)PCR引物设计引入SrfI和BglII限制性位点和终止密码子以扩增来自上述家禽大肠杆菌O78分离株的aroA基因的3’到5’端约650bp的两段分离的PCR产物。
b)这两段PCR产物都用BglII消化2小时，在100伏电压的条件下电泳1小时，切下带并分别用SephaGlas试剂盒纯化。
c)将等量体积的纯化的各PCR产物混合后连接成pCR2.1。
d)携带aroA的连接质粒转化成DH5α最大感受态细胞并通过限制性酶切图谱和PCR确定克隆。
e)分离从pCR2.1删除的完整的aroA基因通过EcorV和Spel切割然后纯化并连接到预消化过的(Spel)自杀载体(SacB，pKNG101)，转化成感受态大肠杆菌K12 S17λpir并通过限制性酶切图谱和PCR确定克隆。
f)整合体用供体(携带pKNG101的大肠杆菌K12 S17λpir，缺失携带100bp的aroA)与野生型大肠杆菌进行。
g)在37℃下温育48小时后出现菌落然后在添加了庆大霉素、链霉素和芳香族氨基酸(DL色氨酸、DL苯丙氨酸和DL酪氨酸各20mg/l)的最小培养基中分培。各个菌落通过PCR检测。保留产生野生型PCR产物和小了约100bp的突变体PCR产物用于进一步的研究。
h)单交换体在添加了10％蔗糖的LG-B肉汤在37℃并温和搅动培养16小时。连续稀释过夜的培养物然后放置在添加了10％蔗糖的LG-B培养皿上在37℃下温育16小时。
i)生长在含有10％蔗糖的LG-B培养皿上的菌落分别于37℃在LG-B、LG-B+庆大霉素、链霉素和最小培养基中分培16小时。将只生长在LG-B培养皿(双交换体)上的菌落在含有5％绵羊血的琼脂上分培并在4℃下保存。
IV)中间克隆载体
自杀载体(SacB，pKNG101)是中间克隆载体。整合体由供体(携带缺失了100bp的aroA的S17的PNG101)和野生型大肠杆菌构成。
实施例2
主种的制备
大肠杆菌aroA-株(实施例1构建的)培养在典型的大豆琼脂平板1次然后在典型的大豆肉汤中培养3次。培养物分布到玻璃小瓶中，密封并冻干。
实施例3
大肠杆菌基因缺失的突变微生物和鼠伤寒沙门氏菌基因缺失的突变微生物的组合在鸡中的抗大肠杆菌和沙门氏菌感染的效力的评价
在评价中，所使用的大肠杆菌基因缺失的突变微生物是在实施例1和2中所述大肠杆菌aroA-株，所使用的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失的突变微生物是在US 6,231,871 B1中描述制备的鼠伤寒沙门氏菌STM-1。
为了进行评价，将103只SPF白色来亨鸡不分性别的分成5组，2组每组25只、2组每组24只和1个对照组(不接种、没有变化)5只。摘掉翅膀的鸡被强迫放置在设计好的隔离室中。每个试验组放置在两个隔离室中，每个隔离室有12或13只鸡。
试验组A和B(接种)在1天大时用手控的喷雾器进行一般的喷雾接种。在1天大时，将试验组A和B中的鸡一起关在一个小的容器中并且给鸡群的头部进行喷雾接种E.col和鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变微生物组合疫苗，直到达到给出的标准剂量(每只鸡每0.5ml剂量含有5.0×106cfu的大肠杆菌aroA-PTA-5094和5.0×106cfu的鼠伤寒沙门氏菌STM-1)。每个疫苗，大肠杆菌aroA-PTA-509和鼠伤寒沙门氏菌STM-1，用无菌磷酸盐缓冲盐(PBS)稀释混合后接种。在2周大时，再使用饮用水途径对试验组A和B预先接种。在给鸡使用饮用水途径接种前先使其禁水3小时。前述的用于喷雾使用的两种疫苗加入测定的冷却蒸馏水直到最终滴度为5.0×106cfu每只疫苗的剂量(0.5ml每只鸡)。疫苗用水唯一的来源是饮用水。一旦疫苗用水用完，饮用者从该单元(隔离室)中移走并添加通常的饮用水源。
在6周大时，试验组A(接种过的)和试验组C(未接种的)的每只鸡通过气管内(IT)途径以每剂量滴度为5.89×108cfu的大肠杆菌078的有毒菌株攻击。同时，在6周大时，试验组B(接种过的)和试验组D(未接种的)通过口腔强饲法以每剂量滴度为4.01×106cfu的鼠伤寒沙门氏菌的抗萘啶酸菌株攻击。
试验组E没有接种和没有攻击(阴性对照组)。接种的和对照的鸡重新放置在隔离室中，直到完成研究。
所有的鸡都在兽医的照料下喂食和饮用可获得的任意的食物和水。鸡在攻击后观察7天。在攻击7天后，将所有存活的鸡进行尸体解剖并且试验组A和C用于检测是否存在有明显禽类大肠杆菌病损伤。表现出明显可见损伤如肝周炎、心包炎、空囊炎、蜂窝组织炎、或关节炎的没有存活的鸡，认为其呈大肠杆菌病阳性。数据显示在表I中。
试验组B和D用于检测鼠伤寒沙门氏菌在器官中的菌落形成。数据显示在表II中。
表I
大肠杆菌基因缺失的突变微生物和鼠伤寒沙门氏菌基因缺失的突变微生物的组合在鸡中抗大肠杆菌078和疾病*的效力评价
  ％具有明显损伤存活的鸡  试验组  接种途径  攻击途径  ％死亡率  Hepa  Cadb  Airc  Celld  Arthe  ％大肠杆菌病阳性率  A  C  E  简单喷雾  无  无  IT  IT  无  33.3  29.2  0  43.8  64.7  0  50.0  82.4  0  43.8  82.4  0  12.5  35.3  0  12.5  0  0  66.7  87.5  0
a肝周炎
b心包炎
c空囊炎
d蜂窝组织炎
e关节炎
*给鸡施用疫苗来预防与大肠杆菌感染有关的大肠杆菌病。
表II
大肠杆菌基因缺失的突变微生物和鼠伤寒沙门氏菌基因缺失的突变微生物的组合在鸡中的抗沙门氏菌感染和疾病*的效力评价试验组接途径攻击途径  ％鼠伤寒沙门氏菌阳性率器官  集合体肠  集合体直  内容物  B  D  E  简单喷雾/饮用水  无  无  OGa  OGa  无  32  68  0  80  100  0  68  92  0
a口腔强饲法
*给鸡施用疫苗来减少在包括肠和盲肠的内部器官中形成菌落的沙门氏菌。
表I和II的结果表明，由于施用了本发明所述组合疫苗，与大肠杆菌感染有关的大肠杆菌病和沙门氏菌感染的发生率都明显下降。在表II中，大幅度的减少了沙门氏菌的菌落形成，意味着较少的鸡被感染并因此很少发展为全身性疾病，并且很少将疾病传染给鸡的卵。