人工组合的抗菌工程多肽及其制备方法 一、技术领域
本发明涉及一种人工组合的抗菌工程多肽及其制备方法，通过制备由不同的细菌毒素和信号传导多肽的功能结构域组合成的工程多肽(Engineered peptide)来达到抗菌目的。
二、背景技术
细菌感染仍然是人类生命和健康的主要威胁，自磺胺和青霉素问世以来，人类陆续发明的抗菌素主要以通过抑制细菌胞壁合成，抑制或干扰细菌的核酸和蛋白质的代谢与合成等途径来达到抗菌目的，然而这些抗菌途径容易诱使细菌发生突变而产生抗菌素耐药性。因此人们一直在致力于开发新型地抗菌素。在细菌胞膜上直接形成离子通道而致细菌死亡是比较有前途的抗菌素开发方向之一。自然界中，为数不少的细菌毒素就是以这种机制来杀死细菌的，其模式标本就是大肠杆菌(Escherichia coli)分泌的一种毒素蛋白-大肠菌素(colicin)，1952年Jacob发现其能特异的杀死其他株系的大肠杆菌和相关株系的某些杆菌，如ShigellaSonnei(Jacob et a1，Sur 1a biosynthese d’une colicine et son mode d’action.Annals of the Pasteur Institute.83：295-315(1952))。1978年Finkelstein等发现可形成离子通道的大肠菌素可以在人工脂质双分子膜上形成电压依赖性离子通道，从而在根本上揭示了这一类细菌毒素的抗菌机制(Schein et al，Colicin Kacts by forming voltage-dependent channels in phospholipid bilayer membranes.Nature.276：159-163(1978))。1996年Qiu(丘小庆，专利发明人)和Finkelstein等揭示了大肠菌素Ia在人工脂质双分子膜上形成的离子通道开放和关闭时的跨膜立体结构(Qiu et al，Major transmembrane movement associated with colicinIa channel gating.J.Gen.Physiology.107：313-328(1996))，为在分子水平上设计和制备新型的抗菌素奠定了理论基础。
近二十年，人们逐渐发现细菌也具有随外界环境变化而分泌的信号传导多肽(pheromone)，其作用是调节细菌自身适应环境变化。而且细菌分泌信号传导多肽、制备信号传导多肽的胞膜受体及胞内调节蛋白的基因往往偶联在一起，协调的控制着细菌的生长和分裂。但该方向的研究一直进展缓慢，比如金黄色葡萄球菌的信号传导多肽，Agr D，一直到1995年才最后搞清楚是一个八肽(Ji et al，Cell densitycontrol of staphylococcal virulence mediated by an octapeptide pheromone.Proc Natl Acad Sci USA.92：12055-12059(1995))，1999年发现在金黄色葡萄球菌对数生长期的早期或中晚期加入人工合成的这种八肽可以刺激或抑制金黄色葡萄球菌的生长(Mayville et al，Structure-activity analysis of syntheticautoinducing thiolactone peptides from staphylococcus aureus responsiblefor virulence.Proc Natl Acad Sci USA.96：1218-1223(1999))。
如上所述，大肠菌素是一种理想的离子通道抗菌素，缺点是只能作用于大肠杆菌等革兰氏阴性杆菌。如果能够利用致病菌特有的信号传导多肽作为诱导物，将大肠菌素或其水性孔道结构域诱导至特定的细菌胞膜附近形成离子通道来杀伤该致病菌，应该是一种理想的抗菌素开发方向。
三、发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种能避免诱发细菌耐药性，提高杀菌能力的新型抗菌素及其制备方法。本发明的技术方案是：将可形成离子通道的大肠菌素(colicin El，Ia，Ib，A，B，N)或其水性孔道结构域(pore-forming domain)与靶细菌分泌的信号传导多肽(pheromone)组合成工程多肽。在该工程多肽里，可与靶细菌胞膜受体结合的信号传导多肽作为诱导物诱导大肠菌素通道结构域穿过细菌外膜与膜间隙到达靶细菌胞膜附近，然后大肠菌素水性孔道结构域在靶细菌胞膜上形成离子通道，使靶细菌胞内内容物泄漏，致靶细菌死亡，从而达到杀菌的目的。
工程多肽的制备方法采用专利发明人已发展成熟的技术路线(Qiu et al，Site-specific biotinylation of colicin Ia，a probe for protein conformationin the membrane.J Biol Chem 269：7483-7488(1994)，Qiu et al，Majortransmembrane movement associated with colicin Ia channel gating.J.Gen.Physiology.107：313-328(1996))。该技术路线的关键在于：利用点突变技术(美国Strategene公司Quick-change药箱)，将欲组合的细菌信号传导多肽基因插入到装载在工程质粒里的大肠菌素基因选定的位点上，制备成人工组合抗菌工程多肽的质粒，再对该突变质粒进行测序以便确认突变成功。最后将突变好的质粒转染到不含质粒的工程菌里制备多肽。
信号传导多肽与大肠菌素或其水性孔道结构域的组合方式可以有两种，将信号传导多肽或结合在大肠菌素或其水性孔道结构域的氨基端，或结合在羧基端，于是可以形成四种工程多肽。此外，可以通过改变信号传导多肽和大肠菌素或其水性孔道结构域的肽链的组成及结构来增强其抗菌活性或减少可能出现的副作用。由于这样的组合或改变将会增加或减少组成的工程多肽的氨基酸残基数量，因此其分子量将会在10000-63000范围内变动。
每一种致病菌都有自己独特的信号传导多肽，因此只要采用其独特的信号传导多肽与可形成离子通道的大肠菌素或其水性孔道结构域连接，就可以组合成一种特异的、对抗该致病菌的抗菌工程多肽。
本发明制备的人工组合的抗菌工程多肽优于传统抗菌素之处在于其不会诱使细菌产生传统的耐药性，众所周知，细菌可以通过突变产生β-内胺酶，减少摄入，变更药物作用位点等手段来改变其细胞壁结构，改变其蛋白质和核酸的代谢等对传统抗菌素产生耐药性。但是细菌却较难以通过突变来改变其细胞膜的磷脂双分子层的结构，而这恰好是本发明的独到之处，因为制备的工程多肽就是通过直接在靶细菌的胞膜上形成离子通道来杀菌的。
本发明的另一优点是有可能通过更换信号传导多肽来组成对抗产生该信号传导多肽的任何一种细菌的抗菌素。
四、附图说明
附图为金黄色葡萄球菌在LB培基中生长量随生长时间增多的生长曲线。不加入任何药物的金黄色葡萄球菌在数小时或十数小时后可以顺畅地经过对数生长期到达稳定生长期，被氨苄青霉素和本发明制备的抗金黄色葡萄球菌工程多肽所抑制的金黄色葡萄球菌却难以进入对数生长期。纵坐标为光密度读数，横坐标为时间。
附图l.抗菌工程多肽抗金黄色葡萄球菌生长显示图。显示金黄色葡萄球菌AgrD信号传导多肽组合在大肠菌素Ia羧基端上制备的抗菌工程多肽具有大致相当于氨苄青霉素的抗菌能力。符号标示：Δ对照(不加入任何药物)，×野生大肠菌素Ia(终浓度0.5μg/ml)，■抗菌工程多肽((终浓度0.5μg/ml)，◆氨苄青霉素(终浓度0.5μg/ml)。
附图2.又一种抗菌工程多肽抗金黄色葡萄球菌生长显示图。显示金黄色葡萄球菌AgrD信号传导多肽组合在大肠菌素Ia水性孔道结构域羧基端上制备的抗菌工程多肽具有相当于氨苄青霉素的抗菌能力。符号标示：◆对照(不加入任何药物)，■抗菌工程多肽((终浓度0.5μg/ml)，●氨苄青霉素(终浓度0.5μg/ml)。
五、具体实施方式实施例一：
本实施例是将金黄色葡萄球菌的Agr D信号传导多肽连接到大肠菌素Ia的羧基端上，制备成人工组合抗金黄色葡萄球菌工程多肽的质粒，将突变好的质粒转染到不含质粒的工程菌里，将菌大量繁殖(4L FAB，225rpm，37℃，6h)，离心沉淀菌体(4℃，6000g，20min)，取4℃、50mM硼酸缓冲液+2mM EDTA+2mM DTT 50-80ml悬浮菌体，超声破碎(4℃，40W，1-2min)，高速离心破碎菌体(4℃，50000-70000g，1.5h)，取上清加入硫酸链霉素沉淀DNA，4℃、50mM硼酸缓冲液+2mM EDTA+2mMDTT 2L透析过夜后，上清上样于CM离子交换柱，4℃、0.3M NaCl+50 mM硼酸缓冲液洗脱后得到了抗金黄色葡萄球菌工程多肽，分子量63,000。为证实该工程多肽的抗菌能力，将金黄色葡萄球菌(国家标准株25923，来自四川大学华西医院检验科细菌室)菌液5μl(108CFUS/ml)置入LB培基10ml中，225rpm，37℃孵育三小时后，加入该抗菌工程多肽(终浓度0.5μg/ml)，继续以225rpm，37℃孵育，每半小时采样经分光光度计(A595nm)比色测试，以氨苄青霉素(Ampicillin，终浓度5μg/ml)、野生大肠菌素Ia(终浓度0.5μg/ml)和不加入任何药物的金黄色葡萄球菌-LB培基作为对照(见附图1)，结果表明：该抗菌工程多肽具有大致相当于氨苄青霉素的抗金黄色葡萄球菌能力。实施例二：
本实施例是将金黄色葡萄球菌的Agr D信号传导多肽连接到大肠菌素Ia水性孔道结构域的羧基端上，制备质粒，再经过实例一中使用的技术步骤，得到了比实例一更小的抗金黄色葡萄球菌工程多肽，分子量13,000。为证实该工程多肽的抗菌能力，将金黄色葡萄球菌(国家标准株25923，来自四川大学华西医院检验科细菌室)菌液5μl(108CFUS/ml)置入LB培基l0ml中，225rpm，37℃孵育三小时后，加入该抗菌工程多肽(终浓度0.5μg/ml)，继续以225pm，37℃孵育，每一小时采样经分光光度计(A595nm)比色测试，以氨苄青霉素(Ampicillin，终浓度0.5μg/ml)和不加入任何药物的金黄色葡萄球菌-LB培基作为对照(见附图2)，结果表明：在对照组的金黄色葡萄球菌已进入稳定生长期之后，该抗菌工程多肽仍与氨苄青霉素一样有效的抑制了金黄色葡萄球菌的生长。实施例三：
本实施例是根据上述技术路线，我们将金黄色葡萄球菌的Agr D信号传导多肽连接到大肠菌素Ia水性孔道结构域的氨基端上，制备质粒，再经过实例一中使用的技术步骤，得到了比实例一更小的抗金黄色葡萄球菌工程多肽，分子量13,000。预实验显示该多肽具有抗金黄色葡萄球菌能力。实施例四：
本实施例是根据上述技术路线，我们将金黄色葡萄球菌的Agr D信号传导多肽连接到大肠菌素Ia的氨基端上，制备质粒后，再经过实例一中使用的技术步骤，得到了分子量为60000的工程多肽。预实验显示该多肽具有抗金黄色葡萄球菌能力。