能在两种结构状态之间转换的肽及其用途 【技术领域】
本发明涉及肽，该肽在对刺激的存在或缺失产生应答时在两种结构状态之间转换。本发明还涉及本发明肽在检测刺激是否存在的测定中的用途。本发明还涉及构建本发明肽的方法。
背景技术
成功进行蛋白质和肽的设计需要与蛋白质的序列和结构相关的可靠规则。到目前为止的成功设计中，这主要倾向于反映在α螺旋尤其是卷曲螺旋结构上，α螺旋包括四螺旋束、平行二聚体卷曲螺旋或三聚体卷曲螺旋以及螺旋-转角-螺旋基序。这些早期的α螺旋设计得到了α螺旋肽的良好实验和理论模型的支持以及所带来的α螺旋结构的折叠规则发展的支持。也在努力进行β结构的折叠和设计的研究。但是，最近已经报道了小肽在溶液中折叠成高度集中的β结构；还在建立蛋白质中的序列和β结构之间地联系规则。
蛋白质内大的构象转换，也就是说大的相对移动或二级结构的变化，作为一种引发或介导蛋白质功能(及功能异常)的方式正在逐渐得到认可。例如，在作为丝氨酸蛋白酶自杀抑制剂的丝氨酸蛋白酶抑制剂中，对易切开键进行切割使天然环转化成β折叠的内部链(Lee，Park等，Natural Structural Biology(天然结构生物学)，3(6)：497～500，1996)。此构象改变使切割后的丝氨酸蛋白酶抑制剂与其靶点之间的相互作用得以牢固。重排成类似淀粉样蛋白结构的肽和蛋白质代表了转换的另一种类型，其中形成了β结构(Rochet和Lansbury等，Current Opinion inStructural Biology(结构生物学当代视角)，10(1)：60～60，2000)，不一定必需是β结构的未折叠多肽和折叠多肽转化成富含β折叠的纤维。涉及大螺旋结构重排的构象变化的典型实例是流感血凝素转化为病毒-宿主膜融合的活性形式成分(Skehel和Wiley等，Annual Review of Biochemistry(生物化学年度综述)，69：531～569，2000)。类似地，介导囊泡膜融合的某些SNARE-蛋白复合物(可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体-蛋白复合物)的装配受一个组件的天然构象的抑制，该天然构象在SNARE-蛋白复合物装配之前必须打开，(Munson等，Nature StructuralBiology(天然结构生物学)，7(10)：894～902，2000，Tochio等，Science(科学)，293(5530)：698～702，2001)。伴随着以下结构转变，蛋白寡聚体状态及进而的蛋白功能发生变化，所述结构转变包括三聚区的释放和装配、随后某些热休克转录因子与DNA的结合(Rabindran等，Science(科学)，259：230-234，1993)以及调节线粒体ATP合酶的IF1二聚体-四聚体的转换(Cabezon等，EMBO Journal(欧洲分子生物学组织杂志)，20(24)：6990～6996，2001)。国际专利申请WO99/11661公开了一种包含弹性体肽的蛋白质，其可以在温度升高时长度增加，但是蛋白质的总体结构没有改变。最后，pH的改变和与膜的接近引发了特定的大肠杆菌素结构域从水溶性的球形结构转换成膜内在蛋白质，然后可以根据所施加的膜电位在开放和关闭通道状态之间切换。
其他情况下，构象变化看起来是异常的或错误折叠的事件，并可导致疾病。例如，在阿尔茨海默痴呆和朊病毒疾病中，肽和蛋白质内的α至β结构转换参与淀粉样蛋白纤维的形成以及疾病的发作。Jarvet等(J.Am.Chem.Soc(美国化学协会杂志)，122，4261～4268，2000)讨论了阿尔茨海默肽片段Aβ(12～28)内的这种结构改变。
上述列出的实例可以认为是具有内部结构冲突的蛋白质，即可获得不同折叠状态的蛋白质序列，并且所表现的形式是由占优势的条件决定的。这看起来与Anfinsen认为的蛋白质采取热力学最稳定状态的假说相矛盾(Anfinsen等，Science(科学)，181：223～230，1973)。然而，这种观点并不新鲜：例如，长期以来认为淀粉样蛋白纤维的交叉β结构是所有多肽链的真正能量最低者；天然流感血凝素被描述为处于具有弹性的亚稳定构象，等待触发物捕获以便转化成融合态(Carr等，PNAS USA(美国国家科学院院刊)，94(26)：14306-14313，1997)；天然丝氨酸蛋白酶抑制剂被认为处于应激状态，经过靶蛋白酶的切割可以引发构象转换为松弛状态(Lee，Park等，Nature Structural Biology(天然结构生物学)3(6)：497-500，1996，Whisstock等，Trends in Biochemical Sciences(生物化学科学趋势)，23：63-67，1998)，某些SNARE的非活性形成被认为处于“关闭”的构象，此时无法接近SNARE的寡聚基序(Munson等，NatureStructural Biology(天然结构生物学)，7(10)：894～902，2000；Tochio等，Science(科学)，293(5530)：698～702，2001)。
考虑设计构象转换的途径之一是通过在单一序列中添加两种不同的结构基序从而在肽或蛋白质内建立结构冲突。在此途径中，并没有违反Anfinsen的蛋白质折叠的基本思想，只是采用另一种结构时一种序列基序将会受到抑制。发明人将这样的多肽称为具有序列和结构二元性。此前发明人已经介绍并检验了此观念。具体地说，Ciani等(J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，277，10150-10155，2002)设计了从α螺旋结构转换成β螺旋结构的肽。只有在冷却样品、使其pH降到pH2并等待数天的情况下才可能将肽的构象从β结构(类似淀粉样蛋白的纤维)重新转换为α螺旋。因而，这样的转换使得转换肽的实施方案在诊断等方面不实用，以致于差不多是无用的。
日本专利申请JP-A-7157499的摘要公开了一种显示为在α螺旋结构和β折叠结构之间可逆转换的肽。没有提供表明是可逆转换的数据而且也没有公开肽的序列。
Zhao等(Protein Science(蛋白质科学)，10，1113～1123，2001)公开了通过改变温度或pH，酵母粘附蛋白α凝集素可以可逆地从富含β的结构转变成混合的α/β结构。Reed等(Biochemistry(生物化学)，30，4521-4528，1991)公开了来源于gp120的CD4结合域的肽在极性条件改变后从α螺旋结构转变为β折叠结构。这些论文没有提供关于获取或设计其他转换肽的信息。
需要有一种肽，其在对刺激的存在或缺失产生应答时在两种不同的结构构象之间可逆地转换。优选在不必使蛋白质因加热或不可逆化学作用而变性的情况下，该肽可在两种不同的结构构象之间可逆地转换。
需要提供可用于检测多种不同刺激的存在的肽，这些刺激包括pH、氧化还原条件以及金属离子、抗原或配体的存在。也需要易于区分肽的不同结构构象的能力。
【发明内容】
本发明的第一方面提供了具有序列和结构二元性的肽，该肽在对刺激产生应答时，可以在可寡聚化的第一结构形式和单体形式的第二结构形式之间可逆地转换，其中该肽包含相互作用基序，该相互作用基序在对刺激产生应答时发生相互作用而形成键，从而使肽呈现第二结构形式。
本发明的第二方面提供了具有序列和结构二元性的肽，该肽在对刺激产生应答时，可以在第一结构形式和第二结构形式之间可逆地转换，其中该肽包含相互作用基序，该相互作用基序在对刺激产生应答时发生相互作用而形成键，从而使肽呈现第二结构形式；其中所述肽不在α螺旋结构和β折叠结构之间转换。
本发明(按照本发明第一方面和第二方面)的肽具有序列和结构二元性，从而肽可以呈现两种不同的结构形式，并在对刺激产生应答时在两种形式之间转换。由于所述肽可以在两种结构形式之间可逆转换，因此所述肽可用于检测刺激的存在与否，并监测刺激的水平变化。
所述肽可以在两种不同的结构形式间转换而不必因加热或化学反应如将pH降到pH2而使蛋白质变性。而且，结构形式间的转换还较快地发生，如少于1个或2个小时。
本文使用的术语“肽”指氨基酸的聚合物。肽可以是任意长度，但优选的长度为约20～400个氨基酸。肽的长度更优选为约30～200个氨基酸。此术语并不指或不包括肽的表达后修饰，如糖基化、乙酰化及磷酸化。肽的定义中包括含有一个或一个以上的氨基酸类似物(包括非天然氨基酸)的肽。
术语“序列和结构二元性”指肽具有与两种不同结构相容的序列。通常，这样的肽添加有2个不同的序列和结构基序，即第一序列和结构基序及第二序列和结构基序，使肽能呈现两种不同的结构。肽的第一序列基序优选为平行卷曲螺旋二聚体结构的卷曲螺旋基序。肽的第二序列基序优选为反平行卷曲螺旋单体结构的卷曲螺旋基序。
术语“可逆转换”用于表明肽可以在第一结构形式和第二结构形式间可逆地转换。因此肽可以从第一结构形式转换成第二结构形式，也可以从第二结构形式再转回第一结构形式。正如前面所指出，现有技术中大部分可以转换结构的肽只能从第一结构转换成第二结构，但是不能再转回第一结构。这样的现有技术中的肽不能被再利用，也不能用于监测刺激的水平变化，原因在于肽呈现第二种结构后就不再对刺激产生应答。
本发明的肽的第一和第二结构形式可以为任意的结构形式，只要可以充分地将其相互区别开来而使本领域的熟练技术人员能容易地确定肽是处于第一结构形式还是处于第二结构形式，优选能测定肽的第一结构形式和第二结构形式间的比率。本发明的第一方面、优选第二方面中，肽的第一结构形式发生寡聚化，而第二结构形式为单体。这是有利的，因为能够相对容易地将寡聚体和单体区别开来。测定肽是处于第一结构形式还是处于第二结构形式的适当方法包括圆二色光谱法和非变性PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳法)。脱落蛋白和酶也可用于检测蛋白质的构象变化(参见Ghosh等，J.Amer.Chem.Soc，122，5658-9，2000；Johnsson等，PNAS USA，91，10340-4，1994，和Hocker等，Nat.Struct.Biol.，8，32-36，2001)。
第一结构形式优选为连续的螺旋结构。在本发明的第一方面、优选本发明的第二方面中，肽的第一结构形式可以寡聚化。处于第一结构形式的肽可以形成异源寡聚体或同源寡聚体。处于第一结构形式的肽特别优选为平行的卷曲螺旋型同源二聚体。
第二结构形式优选为发夹结构。处于第二结构形式的肽特别优选为反平行的卷曲螺旋单体。
本文中使用的术语“相互作用基序”指对刺激产生应答时可以发生相互作用而形成一个或一个以上的共价键或非共价键的任意基序。优选相互作用基序发生相互作用而形成一个或一个以上的非价键。通过相互作用基序形成键，本发明的肽呈现第二结构形式。
相互作用基序可以互相邻近并位于肽的同一个单位内。例如，当相互作用基序为金属结合位点的一部分时，包含两个相互作用基序的金属结合位点或金属结合位点的一部分可以以单个单位形式位于肽内。或者，相互作用基序可以在肽的不同部分内。相互作用基序可以位于肽内的任意位置，只要其可以相互作用形成一个或一个以上的键即可。当相互作用基序以单个单元存在时，优选处于靠近肽中间的位置。当相互作用基序位于肽的不同部分时，优选位于肽的两个末端或接近末端。可以存在大量的相互作用基序，这些基序均相互作用而形成一个或一个以上的键。优选只有两个相互作用基序，而且优选它们位于肽的两个末端。
下面讨论相互作用基序的大量具体实例。
相互作用基序可以是半胱氨酸残基，其在对氧化环境这种刺激产生应答时形成二硫键。
相互作用基序可包含金属结合位点的多个部分，该多个部分在对相应金属离子存在这种刺激产生应答时形成非共价连接。合适的金属结合位点对于本领域熟练技术人员来说是已知的，包括锌指和镧系元素结合基序。可以将金属结合位点的一部分引入本发明肽的一部分中，并可将金属结合位点的第二部分引入本发明肽的第二部分中，其中当金属离子存在时，金属结合位点的这些部分借助金属离子发生相互作用形成一个或一个以上的键。
相互作用基序可以包含抗体分子的抗原结合位点的多个部分，该多个部分在对相应抗原存在这种刺激产生应答时形成非共价连接。本领域熟练技术人员已使用抗体分子的单链Fv片段来成功地结合抗原。另外，本领域熟练技术人员已将抗体分子的可变区导入蛋白质中。因此，本领域熟练技术人员可以利用已知技术轻易地将抗体分子的抗原结合区导入本发明的肽中。也可以包括抗体分子的适当构架区以确保抗原结合区的定向正确。由于几乎所有的抗原均可诱导抗体的产生，因此本发明的肽可用于检测几乎任意抗原的存在与否。正如前面所指出的金属结合位点那样，可以将抗原结合位点的多个部分导入本发明的肽中，其中当抗原存在时，这些抗原结合位点的多个部分发生相互作用而形成一个或一个以上的键。
相互作用基序可包含受体的配体结合位点的多个部分，该多个部分在对相应配体存在这种刺激产生应答时形成非共价连接。对于本领域熟练技术人员来说大量的配体结合位点是已知的，并且可以将配体结合位点的所需多个部分导入本发明的肽中。正如前面所指出，可以将配体结合位点的多个部分导入本发明肽中的不同位点，其中当配体存在时这些配体结合位点的多个部分发生相互作用而形成一个或一个以上的键。
正如前面所指出的，可以导致本发明的肽发生构象转换的刺激依赖于肽内的相互作用基序。刺激可以是一种特定氧化还原状态、金属离子、抗原或配体的存在或缺失。
本发明的一个特别优选实施方案中，根据本发明所述的肽具有如下序列：
X1-(Y)n-(abcdefg)m-abcdef((Z)p)g-(abcdefg)m-abcde-(Y)n-X2
其中：
X1和X2为能相互作用形成键的基序；
Y为能充当连接子的任意氨基酸；
n独立地选自0至20；
abcdefg为七残基序列基序；
m为1至20；
abcde为七残基序列基序的前5个残基；
Z为与所述肽的两种结构形式相容的氨基酸；和
p为1至6。
X1和X2可以是对刺激的存在或缺失产生应答时能相互作用形成一个或一个以上的键的任意基序。如前所述，所述一个或一个以上的键可以是共价键或非共价键。X1和X2可以代表上述的任意相互作用基序。优选X1和X2为能形成二硫键的氨基酸。特别优选X1和X2为半胱氨酸。
优选Y独立地选自甘氨酸、丝氨酸或β-丙氨酸。特别优选Y为甘氨酸，n为3。
术语“七残基重复序列”指能形成螺旋状卷曲螺旋结构的任意的七个氨基酸的重复序列。合适的七残基重复序列对于本领域熟练技术人员来说是已知的。
优选七残基序列的d为亮氨酸。如果所述肽的每4个七残基序列中仅有一个的a为赖氨酸、天冬酰胺或精氨酸，则更优选七残基序列的a独立地选自异亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸、天冬酰胺或精氨酸。如果在所述肽的一个七残基序列中a为仅有的赖氨酸，则特别优选七残基序列的a为异亮氨酸或赖氨酸。
已发现通过如前所述对a和d残基进行限制，可以形成编码特别适于形成双螺旋状卷曲螺旋结构的七残基重复序列。
还优选七残基重复序列的g和e残基带相反电荷，而且所述肽的C端这半部分中的g和e的极性与该肽的N端这半部分中的g和e的极性相反。已发现通过如前所述对g和e残基进行限制，所述七残基序列可以与形成平行卷曲螺旋二聚体结构和反平行卷曲螺旋单体结构相容。
m优选为1～5，最优选m为1或2。
Z可以是柔性氨基酸，即在合适的序列条件下，具有柔性足以能适应两种结构形式的氨基酸。具体地说，(Z)p能够形成部分卷曲螺旋结构，也能够形成反平行卷曲螺旋单体的发夹结构。Z优选独立地选自甘氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺。还优选p为4。特别优选的是(Z)p为Ala-Lys-Gln-Ala或Ala-Ala-Gln-Ala。
在本发明的具体实施方案中，本发明的肽具有下列序列：
CGGEIRALKYEIARLKQAKQAKIRALEQKIAALEGGC(CSP-3)；
CGGEIRALKYEIARLKQAAQAKIRALEQKIAALEGGC(CSP-6)；或
CGGEIRALKYEIARLKQAAQAKKRALEQKIAALEGGC(CSP-7)。
名称CSP-3、CSP-6和CSP-7来自于原始的设计过程，将该名称包含进来以与附图和实验部分相符合。
正如本领域熟练技术人员显而易见的那样，可对本发明肽的序列加以修饰以改变肽的特性。例如，可以对肽进行修饰，以便需要更强的刺激才能使构象转换，从而使肽可用于检测高水平的刺激。也可以对肽进行本领域技术人员所熟知的其他修饰，以提高其溶解度，等等。
本发明也提供了前述任一项权利要求的肽在测定刺激存在与否中的用途。
如前所述，本发明的肽可用于测定刺激的存在与否。所检测的刺激依赖于所用的上述特定的肽。
本发明提供了一种检测刺激的方法，该方法包括将本发明的肽与待测溶液一起温育，并测定所述肽在待测溶液中具有第一结构形式还是第二结构形式，其中如果所述肽呈现第二结构形式则待测溶液含有所述刺激。
可以使用任意技术来测量肽的结构改变。适当的技术包括圆二色光谱法、荧光淬灭法、荧光共振能量迁移(FRET)法和非变性PAGE法(特别是只有在一种结构形式时肽才发生寡聚化)。脱落蛋白和酶也可用于检测蛋白质的构象改变(见Ghosh等，J.Amer.Chem.Soc，122，5658-9，2000；Johnsson等，PNAS USA，91，10340-4，1994，和Hocker等，Nat.Struct.Biol，8，32-36，2001)。使用FRET时，可以将供体荧光团和受体荧光团加到肽的局部，使它们仅在一种构象状态下才互相接近。
本发明也提供了构建具有序列和结构二元性的肽的方法，该肽在对刺激产生应答时可以在第一种结构形式和第二种结构形式之间可逆地转换，所述方法包括：
(i)利用第一结构形式及第二结构形式的序列规则设计并制备肽，其中所述序列规则在肽内是叠加的；
(ii)在肽内提供对刺激应答时形成键的相互作用基序，其中所述键使第二结构形式稳定，并且其中当所述键不存在时第二结构形式不稳定，所述肽倾向于形成第一种结构形式。
第一结构形式和第二结构形式可以是任意的结构形式。本领域技术人员熟知各种结构形式的规则。例如，熟知以下结构形式的规则：平行卷曲螺旋二聚体、卷曲螺旋反平行单体、β折叠、卷曲螺旋三聚体和四聚体、四螺旋束、富含亮氨酸的重复序列、锌指等(Kajara等，Protein Science，11，1082-1090；和Woolfson，Current Opinion in Structural Biology，11，464-471，2001)。
该方法优选用于构建本发明第一方面或第二方面的肽。上述方法中所用术语的意义与说明书中前面所述意义相同。
本文中所使用的短语“序列规则是叠加的”指肽的序列同时满足第一结构形式的规则和第二结构形式的规则。这样就可以使肽采取第一结构形式和第二结构形式。
短语“使第二结构形式稳定”指对刺激应答时由相互作用基序形成的键尤其使第二结构形式稳定，从而使肽呈现第二结构形式。当不存在该键时，肽倾向于呈现第一结构形式。因此，对肽的序列进行设计以确保不存在该键时倾向于形成第一结构形式。确保肽的序列满足第一结构形式规则的程度高于满足第二结构形式规则的程度，这样就可以实现此目标。但是，在键形成之后，使肽的结构向有助于形成第二结构形式的方向稳定。所述肽具有结构冲突，而且键的存在与否控制着肽呈现哪一种构象。
现参考下列附图以实施例的方式说明本发明。
【附图说明】
图1显示了亮氨酸拉链的带状结构(2zta，二聚体化的卷曲螺旋)和来自丝氨酰tRNA合酶的螺旋臂(1ser，反向平行的双链卷曲螺旋)。
图2显示了CSP-1(图2A和图2B)和CSP-3(图2C和图2D)在还原及烷基化形式(实线)和分子内氧化形式(虚线)中的CD光谱和热解折叠曲线。
图3显示了经设计过程后CSP肽的还原及氧化变体的螺旋度和热稳定性汇总图。A、于222nm由CD信号的绝对值衡量的螺旋度。B、以热解折叠曲线的中点(TM)衡量的稳定性。十字交叉和实线为还原和烷基化的肽；圆圈和虚线为氧化的肽。
图4为显示在二硫赤藓糖醇(DTE)和β巯基乙醇(βME)存在的下完成还原所需时间的曲线图。
图5为显示肽CSP-3在DTE存在下构象转换的曲线图。
图6为显示肽CSP-3在βME存在下构象转换的曲线图。
【具体实施方式】
实施例
以特征为双螺旋状卷曲螺旋的七残基序列和相关序列基序作为基础进行设计。将末端残基设计为半胱氨酸，使得可以在不同的氧化还原状态下表达两种不同的序列基序。发明人的目的是在还原态时促进平行卷曲螺旋二聚体(亮氨酸拉链)的形成，而在分子内氧化态时促进反平行双螺旋状卷曲螺旋单体(螺旋发夹)的形成。以规范的亮氨酸拉链模板为起点，引入一些特性来促进交替的螺旋-发夹状态的形成。引入4个残基的插入片段以制备位于中心的非规范十一残基单位，这对于获得设计成功很重要；该插入片段提供了顺应螺旋发夹的柔性，同时又保持了与卷曲螺旋二聚体的相容性。通过此方法，成功构建了不同状态下具有与目的结构相一致的特性的稳定结构。
材料与方法
肽的合成
在使用标准Fmoc(9-芴甲氧羰基)化学法的先峰肽合成系统(PioneerPeptide Synthesis System，Perseptive biosystems公司)上合成肽。用反相HPLC(高效液相色谱)纯化，用MALDI-TOF质谱法(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法)确认其身份。纯化后的肽于pH2、-20℃保存，用280nm处的UV(紫外)吸收(e＝1490M-1cm-1)估计其浓度。于室温将100mM的肽溶液在0.1M含有6M盐酸胍的Tris-HCl(pH8.5)中搅拌过夜，以制备氧化的肽。烷基化的肽按如下方法制备：(1)将1mM的肽溶液于40℃在0.6M含有1.25％(体积比)2-巯基乙醇、8M脲和5mMEDTA(乙二胺四乙酸)的Tris-HCl(pH8.6)中温育1小时；(2)将所得还原肽溶液与0.75ml新鲜的0.36M碘乙酰胺溶液混合，并室温避光温育15分钟；(3)进行水透析。用MALDI-TOF质谱法确认半胱氨酸的化学修饰。
分析型超离心
于5℃用配备有An-60Ti转子的Beckman-Optima XL-I分析型超速离心机实施沉降平衡实验。将100mM～500mM的100ml肽溶液溶于含有0.1M KCl的25mM磷酸钾缓冲液(pH7)，以40000、47500/50000和55000/60000rpm的速度平衡48小时。利用Beckman-Optima XL-A/XLI-I数据分析软件(4.0版)的例行程序将表现出理想单个类型或单体-二聚体平衡体和固定单体分子量的数据同时进行拟合。通过其氨基酸序列计算肽的分子量(表2)和局部具体量(0.7417～0.7461)，将温度为5℃的缓冲液的粘度调为1.008mg/ml。
圆二色光谱法
用配备有Peltier温度控制器的JASCO J-715旋光分光计进行CD(圆二色性)测量。在ph7的25mM磷酸钾缓冲液中制备肽溶液，在1mm或1cm的石英杯中(同时进行搅拌)实施试验。于5℃以1nm间隔、1nm带宽和4秒应答时间的条件记录光谱。用2nm带宽，以1℃/min的变速记录热解折叠曲线，每1℃间隔求16秒的信号平均值。进行基线校正后，通过使肽键浓度的标准化将mdeg表示的椭圆率转换为摩尔椭圆率(degcm2dmol-res-1，度·厘米2/分摩尔)。
本研究的目的是设计一种肽，其构象可以经简单的化学修饰而发生转换。我们的目的构象是平行和反平行卷曲螺旋(见图1)，此具体实施例中转换的引发剂是分子内的二硫桥：位于序列末端的半胱氨酸残基可以保持还原态以有利于形成平行卷曲螺旋二聚体，或处于分子内氧化态以形成发夹结构并有利于形成反平行结构。同时可使用允许可靠地合理设计平行卷曲螺旋肽(尤其是亮氨酸拉链)的良好规则(Harbury等，Science，262(5138)：1401-1407，1993，Woolfson和Alber等，Protein.Sci，4(8)，1596-1607，1995，Pandya，Spooner等，Biochemistry，39(30)：8728-8734，2000，Ciani Hutchinson等，Journal of Biological Chemistry，277(12)：10150-10155，2002)。用于反平行卷曲螺旋的类似规则仅处于探索中(Oakley等，Current Opinion in Structural Biology，11(4)：450-457，2001，Walshaw等，Journal of Molecular Biology，307(5)：1427-1450，2001)。由于上述原因，设计转换的途径是迭代的：设计亲本肽，即卷曲螺旋转换肽-1(CSP-1)作为规范的二聚体亮氨酸拉链，随后顺序作一些小的改动以使反平行形式稳定，同时使平行(亮氨酸拉链)状态的去稳定作用最小化。使用圆形二色(CD)光谱法和分析型超速离心(AUC)法测定溶液中的各种不同迭代。以此方式就有可能引入并检验设计用于促进一种状态或另一种状态形成的修饰，并且以直接的方式实现该设计。当设计的特性在适当状态下与所需目的结构完全相容时，也就是处于还原态和氧化态的肽分别形成二聚体和单体并根据不同的氧化还原状态在二聚体形式和单体形式之间转换时，设计过程就算完成了。这些肽主要呈螺旋状，并且具有与形成独特、协同折叠类型相符的S形热解折叠转换。
结果与讨论
设计原理：
卷曲螺旋的疏水核心以成层的形式构成。卷曲螺旋的常见七残基序列基序abcdefg向核心贡献了每一个第1和第4位点(a和d)。在诸如目的亮氨酸拉链结构等平行同源二聚体卷曲螺旋中，每一层包含来自每一条链的镜象配对侧链，即同时为a或同时为d。这些位点的残基选择很大程度上决定了寡聚体状态的选择(Harbury等，Science，262(5138)：1401-1407，1993；Woolfson等，Protein Sci，4(8)1596-1607，1995；Walshaw等，Journal of Molecular Biology(分子生物学杂志)，307(5)：1427-1450，2001)。因此，将CSP-1设计为规范的亮氨酸拉链，其所有的d位点为亮氨酸，a位点中除了一个之外均为异亮氨酸，见表1；将其设计为二聚体而不是更高级别的寡聚体(Woolfson等，Protein Sci，4(8)，1596-1607，1995；Gonzalez等，Nature Struct.Biol，3(12)：1011-1018，1996)。
反平行双链卷曲螺旋的序列与结构之间的关系相比之下没有很好地确立。另外，在这些结构的核心内a:d和d:a配对结构交替排列(Oakley等，Current Opinion in Structural Biology，3(10)658-667，2001)。a:d和d:a配对的区别仅在于第一个标明的位置表示在线性序列中最先出现的残基。但是，在d位点的亮氨酸与大部分a位点的异亮氨酸的组合似乎与这类结构相容(Walshaw等，Journal of Molecular Biology，307(5)：1427-1450，2001)。a:d排列具有初始设计的明确结果：利用规范的七残基重复序列，氧化态CSP-1内的转角可以与abcd或defga相符。为了赋予更大的柔性，使用了后者(见表1)，其提供了从转角开始的交替d:a和a:d层。我们的目的是通过合适的转角设计和在末端安置半胱氨酸残基来实现这样的排列。对于CSP-1来说，所设计的转角依赖位于中心的a位点的赖氨酸：使此区内的螺旋结构去稳定，而且使局部序列成碱性(见表1)。
在肽的设计中还引入了螺旋间的电荷-电荷相互作用。在平行结构中，连续七残基重复序列的g和e残基在空间上互相靠近并位于核心残基的旁侧。以此为基础，许多设计使用带相反电荷的g:e配对，以实现特定的螺旋-螺旋相互作用(O’Shea等，Cell(细胞)，68(4)：699-708，1992；O’Shea等，Current Biology，3(10)：658-667，1993；Vinson等，Genes Dev，7(6)：1047-58，1993；Kohn等，Journal of Molecular Biology，283：993-1012，1998)。CSP-1设计中包括4个这样的g:e配对。但是在反平行卷曲螺旋中，g:g和e:e配对位于核心的旁侧(Monera等，Journal of BiologicalChemical Society(生物化学协会杂志)，268(26)：19218-19227，1993；McClain等，Journal of American Chemical Society，123(13)：3151-3152，2001；Oakley等，Current Opinion in Structural Biology，3(10)：658-667，2001)。为在两种目的结构中考虑到配对并促进有利的螺旋间的电荷-电荷相互作用，将CSP-1的N-端和C端g:e配对之间极性加以交换，即从N端向C端g:e配对为Glu:Lys、Glu:Lys、Lys:Glu、Lys:Glu。
最后，对于每一个肽，在卷曲螺旋序列的旁侧加上Gly-Gly-Cys三肽(见表1)，以便使其末端可以通过二硫键在分子内连接起来从而促进反平行状态的形成。
按如下方式获得肽的命名：所有卷曲螺旋交换肽均命名为CSP，均给予一个数字即CSP-#来表明设计迭代；均加上后缀“r”或“o”以分别指明末端是用还原并烷基化的末端Cys残基还是用氧化的分子内二硫键来研究。
亲本设计CSP-1的鉴定
平行卷曲螺旋模板设计，即CSP-1r按如下步骤确定：首先将CSP-1的自由Cys残基烷基化，以防在实验过程中氧化。在pH7，肽浓度为100μM时，CSP-1r几乎完全为螺旋状(利用圆二色性(CD)光谱法测定为90％，见图2A)。CD光谱法检查前，肽的热解折叠是可逆的，并表现为S形曲线，表明了协同转换(见图2B)。对于寡聚化系统来说，正如所预期的那样，解折叠是浓度依赖性的；10mM样品的转换中点TM为50℃(数据未显示)，而对于100mM的肽则升高到62℃。于pH7和5℃利用分析型超速离心(AUC)对CSP-1r进行沉降平衡分析，发现有单体-二聚体的平衡体(见表2)，其中对表现为理想单一类型的数据进行加权拟合后分子量为6885，而单体的分子量Mr为3761。单体-二聚体模型的拟合得到解离常数为33mM(见表2)。这些数据均与根据设计形成稳定卷曲螺旋二聚体的CSP-1r一致。
对还原(但没有烷基化)及烷基化的肽进行CD和AUC测定，测定结构具有很好的可比性(数据未显示)。
Cys残基的分子内氧化导致二硫交联发夹，即CSP-1o的形成，这一点已通过质谱和沉降平衡分析得以确定。对表现为理想单一类型的数据进行加权拟合，给出的分子量为3260，而单体的分子量Mr为3643(见表2)。CD测定表明CSP-1o的100mM样品只显示有限的部分折叠，与只有约20％螺旋一致(见图2A)。此信号随着温度的升高几乎没有变化(见图3b)，结构也几乎没有变化，最多是短暂的变化；这一行为并不因浓度的变化而变化。这些数据表明尽管CSP-1o是如设计的单体状，但肽的螺旋结构非常少，而且是暂时的，即CSP-1o不会按所设计的那样很好地形成螺旋发夹。
重新设计转角区：
CSP-1o折叠不好的可能原因之一是转角区太紧了。提供更大自由度的方法之一是仅仅增加环的长度(Efimov等，Protein Engineering(蛋白质工程)，4(3)，245-250，1991)。但是，环变长后易于使蛋白质变得不稳定(Nagi等，Folding&Design(折叠与设计)，2(1)：67-75，1997；Viguera等，Nature Structural Biology，4(11)：939-946，1997)。另外，在这些肽中的插入片段还得也与平行双链卷曲螺旋目标相容。因此，发明人选择了在CSP-1序列的中部加入4个残基。就完全螺旋化的二聚体目标来说，这样就潜在地额外加入了螺旋转角，并引入了十一个残基(十一残基)重复序列而取代了CSP-1中部的七个残基。已知多链平行卷曲螺旋可以允许这种十一残基的插入片段(Lupas等，TIBS(生物化学科学趋势)，21：375-382，1996；Brown等，Proteins-Structure Function and Genetics(蛋白质结构功能与遗传学)，26(2)：134-145，1996；Hicks等，Folding & Design，2(3)：149-158，1997；Burkhard等，Trends in Cell Biology(细胞生物学趋势)，11(2)：82-88，2001)。实际上，发明人最近已确定，对于位于其他基于七残基序列的卷曲螺旋中的1～6个残基的插入片段来说，4个残基的插入片段引起的去不稳定作用最小(Hicks等，J.Struct.Biol.，137，73-81，2002)。我们最初在CSP-2中检验了这一想法，即在CSP-1中第二个七残基序列的f位后加入四甘氨酸，其他序列保持不变(见表1)。
为了检验四甘氨酸插入片段是否改善了螺旋-发夹设计，发明人制备了二硫交联的CSP-2o并加以鉴定。沉降平衡分析表明溶液中单体类型的有效分子量与所期望的肽的有效分子量非常接近(见表2)。在与CSP-1o所用缓冲条件一样的情况下，CSP-2o的CD光谱表明有大约亲本肽两倍的螺旋信号([θ]222)(图3A)，从而推断CSP-2o约有40％螺旋。另外，CSP-2o的热解折叠具有S形转换，且中点为40±2℃(见图3B)。因此，四甘氨酸的插入片段如所期望的那样改善了结构和螺旋-发夹状态的稳定性。
但是经CD光谱测定该肽的还原形式CSP-2r只有部分折叠(与约20％螺旋一致，见图3A)。虽然如此，热解折叠转换显示后面部分为S形曲线，TM为22±2℃(见图3B)。但是沉降平衡分析表明四甘氨酸的插入片段即使在5℃也相当大地妨碍二聚体化作用。表现单个理想类型的数据拟合得最好，返回的分子量接近于所预期的单体分子量(见表2)。对于单体-二聚体的拟合不好，并且在10mM～100mM范围内解离常数很弱。
因此，CSP-2中的螺旋-发夹形式稳定了，但这是在破坏螺旋二聚体状态的情况下形成的。四甘氨酸促进发夹形成可能是因为四甘氨酸中断了连续的螺旋伸展，但同样因其柔性和较低的螺旋倾向性使螺旋二聚体去稳定。因此，设计的下一步需要改进螺旋二聚体的稳定性，同时保持中心区中的充分柔性以保持螺旋发夹的完整性。
十一肽插入片段的改良设计：
紧缩目的转角区并改善螺旋倾向性的简便步骤之一是用四丙氨酸取代四甘氨酸。这在我们的另一设计系统中可以很好地发挥作用(Hicks等，Journal of Structural Biology，137(1-2)：73-81，2002)，但仍相当大程度地使平行二聚体去稳定。因此，本发明人选择了仅用丙氨酸取代外面的两个甘氨酸。四肽插入片段的第二个位置可能为十一残基重复序列的埋在里面的h位点(Hicks等，Folding & Design，2(3)：149-158，1997；Harbury等，Science，282(5393)：1462-1467，1998)。以早期具有共有的七残基-十一残基-七残基序列的肽研究为基础，此位置上的Lys被替换，所述肽来自于蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)细胞骨架蛋白(Hicks等，Folding &Design，2(3)：149-158，1997)。发明人使第三位置为Gln来改善溶解度和螺旋倾向性。这样，在CSP-3中，GGGG插入片段由AKQA所取代。另外，发明人在螺旋二聚体中即新的h位点处引入另一可能包埋的赖氨酸，并进一步用Ile取代了原始设计中a位点处的赖氨酸(见表1)。
CD光谱表明相对于CSP-2r，CSP-3r的螺旋度提高约3倍(见图3A)。而且，此结构的热解折叠具有S形转换，其TM为40±2℃(见图3B)。CSP-3r的螺旋含量和稳定性呈浓度依赖性，沉降平衡分析揭示了解离常数为191mM的单体-二聚体平衡体。
相对于CSP-2o，处于氧化态的CSP-3o肽显示出螺旋度和热稳定性的微小提高(见图2C&D及图3A&B)，沉降平衡分析确认CSP-3o为单体形式(见表2)。
此阶段已确定了合理设计序列，在该序列中可获得两种目的结构(见图2C&D)。特别是对于CSP-3来说，当肽为100μM时，二聚体和螺旋-发夹结构之间的ΔTM仅为9℃。发明人进一步研究引入这些设计中的相互作用。这些实验的起点是CSP-3。
所设计的螺旋间盐桥的影响：
为了评价核心旁侧的带电荷残基对发夹状态的热稳定性的贡献，发明人制备了对照肽，在该对照肽中将e和g处的配对进行交换使得不利于反平行卷曲螺旋。请回想一下，亲本肽中引入了四个带相反电荷的g:e配对以有利于平行二聚体的形成，而且通过在肽的中途将它们的极性进行交换，即沿着序列的g:e配对为Glu:Lys、Glu:Lys、Lys:Glu和Lys:Glu，使它们与反平行螺旋发夹相容。为了保持与平行二聚体设计相容但在发夹中产生可能排斥的e:e和g:g相互作用，发明人将极性加以交换使得所有g:e配对均为Glu:Lys(CSP-4)或Lys:Glu(CSP-5)(见表1)。序列的其他部分保持不变。因此CSP-3、CSP-4、CSP-5的组成是一样的。发明人将对肽进行这种类型的重新设计称为变位突变。
CSP-4o和CSP-5o在AUC中均表现为单体(见表2)。在两种情况下，所述肽的螺旋度均比亲本CSP-3o的螺旋度有微小下降(见图3A)。但是，有趣的是，与CSP-3o相比，两种变位突变体均相当程度地去稳定，都下降了约20℃。这与改组实验(shuffling experiments)完全一致，使CSP-3o中存在的e:e和g:g配对带相反电荷的设计原则使反平行目的结构稳定。
但是，重新设计后的g:e相互作用对CSP-4r和CSP-5r的卷曲螺旋二聚体状态的影响是不同的。两种肽均形成螺旋二聚体(见图3A和表2)，但CSP-4r的热稳定性比CSP-3r的热稳定性高出约8℃，而CSP-5r的热稳定性则比亲本的低约12℃(见图3B)。对于CSP-4r和CSP-5r之间的热稳定性相差20℃，可能的解释包括：1)g:e配对的极性影响局部的螺旋偶极或螺旋加帽，但是，应该可以合理地推断该效应也会以类似的方式影响反平行状态，可是这一点却没发现。此外2)g:e处的Glu:Lys配对在能量上比相应的Lys:Glu配对更有助于平行二聚体状态。发明人支持第二种解释，因为在另一系统中也观察到了类似的效应，在该系统中他们计划检验卷曲螺旋肽中的静电相互作用(JM Shipway & DNWoolfson，未发表)。
已发现在产生图3B所示的数据时产生了系统误差。该误差导致图3B所示数据显示的肽稳定性与正确的值相差5℃。该误差并不影响结果的真正意义。
构建十一残基插入片段：
在试图使平行二聚体CSP-3a稳定时，我们决定用疏水残基取代h位的赖氨酸。尽管在h位置观察了不同种类的残基(Brown等，Proteins-Structure Function and Genetics，26(2)：134-145，1996；Hicks等，Folding & Design，2(3)：149-158，1997)，但是包含非规范十一残基区的二聚体卷曲螺旋极少有高分辨率结构的实例以有助于指导更精确地选择h位的残基；所述结构包括核苷酸交换因子GrpE(PDB识别子1dkg，(Harrison等，Science，276(5311)：431-435，1997)；中间丝蛋白中的波形蛋白的2B区(PDB识别子1gk4，(Strelkov等，EMBO Journal，21(6)：1255-1266，2002))。在两种情况下，h位点处侧链的a-b键直接指向对方。这与规范卷曲螺旋二聚体的a和d位点处的结节入孔(knobs-into-holes)包裹情况不同，在后者情况下，侧链形成并排的互补相互作用(Crick等，Acta.Cryst(结晶学报)，6，689-697，1953；O’Shea等，Science，254(5031)：539-44，1991；Harbury等，Science，262(5138)：1401-1407，1993；Walshaw等，Journal of Molecular Biology，307(5)：1427-1450，2001)。h位点处突出的侧链并可能不是理想的；实际上对GrpE和波形蛋白的卷曲螺旋进行的SOCKET分析(Walshaw等，Journal of Molecular Biology，307(5)：1427-1450，2001)表明，与规范的卷曲螺旋的接触面相比，非规范单位四周的包裹情况相当松弛。为此，发明人选择用小(而且有助于螺旋形成)的残基丙氨酸来代替CSP-3中的h位置，从而生成CSP-6设计迭代(见表1)。这样，CSP-6中规定的a、d和h位置均呈疏水性。与此一致，CSP-6r的螺旋度和热稳定性均显著高于其他含十一残基的设计CSP-2r和CSP-3r，而且与以纯七残基为基础的设计CSP-1r相当(见图3A和B)。重要的是，CSP-6r是类似前面设计的二聚体(见表2)。但是，有趣的是，二硫键交联的形式CSP-6o的螺旋度和稳定性与CSP-3o所记录的类似。结果是在100μM肽浓度测定时，这些肽在还原态和氧化态之间的热稳定性差值ΔTM从CSP-3迭代的约-10℃上升到CSP-6迭代的+22℃。
为了调节本发明的肽，需要降低目的构象状态之间的ΔTM。当然，因为还原并烷基化的肽会二聚体化，可以通过改变浓度来调节其热稳定性；实际上，处于10μM这样较低浓度的CSP-6r仍保持完全螺旋化的二聚体，但是TM则下降到61±2℃。虽然如此，为了通过重新设计来缩小CSP-6的ΔTM，发明人尝试通过用赖氨酸取代紧接着十一残基单位的a位点处的异亮氨酸而生成CSP-7(见表1)来使平行二聚体形式去稳定。正如所预期的那样，该取代同时损害了CSP-7r的螺旋度和热稳定性(见图3A&B)。氧化态CSP-7o的稳定性所受影响小一些。结果是，两种状态间的ΔTM从CSP-6的约+22℃下降到CSP-7的约-13℃。
CSP-3氧化形式向还原形式的构象转换研究
制备CSP-3的氧化形式(CSP-3o)达300μl(100μM)，如前所述进行波长扫描。记录222nm波长的摩尔椭圆率。为了诱导肽从氧化态向还原态的转换，加入二硫键的还原剂。用过量20倍(2mM)的两种还原剂DTE和β-疏基乙醇进行比较。
制备100μMCSP-3o和2mM还原剂的样品，使终体积达300μl，快速混合并立即启动定时扫描。记录加入还原剂后启动扫描所需时间。于222nm、20℃、4秒应答时间和10秒数据间距实施定时扫描，直到肽被完全还原，即不能再观察到螺旋度变化为止。
当实施完转换实验后对每一样品进行波长扫描(190～260nm)以记录还原肽的光谱。
在氧化样品中加入过量还原剂使限制构象的二硫键断裂并诱导氧化态向还原态转换。用CD光谱法的时程实验来研究转换反应(见图4)。
DTE存在时的构象转换比βME(β-疏基乙醇)存在时的快。用DTE时75分钟完成反应，而用βME时180分钟完成。
时程反应获得的数据用数据分析程序Origin(第11版)进行分析(见图5)。
用数据分析程序Origin将来自转换实施的数据拟合了一级反应的单指数曲线。曲线方程为：
y＝Ae-kt+B
其中A＝信号振幅
B＝初始信号
k＝速率常数
t＝时间
这样可以得出反应的速率常数(k)，其可以用于测定反应的半衰期(t1/2)，其方程如下：
t1/2＝ln2/k
对于用βME进行的还原实验，重复进行所述分析(见图6)。
DTE存在时的反应速度快于βME时的反应速度。这导致用DTE时的半衰期要短一些(见表3)。
这些结果表明肽CSP-3的构象可以从氧化态转换成还原态。
结论：
利用简单的序列对结构规则和迭代设计方法，发明人成功地构建了具有序列和结构双元性的肽，所述结构为螺旋二聚体和单体、螺旋发夹，也就是说在所述序列中，叠加有两种模式，一种与二聚体亮氨酸拉链相容，而另一种与反平行卷曲螺旋相容。在具体实施方案中，用二硫桥使末端交联起来而有助于螺旋-发夹状态的形成，同时另一方面保持末端半胱氨酸残基处于还原状可有助于卷曲螺旋二聚体的形成。设计过程的起点是规范亮氨酸拉链模板CSP-1，它是根据已确定的设计规则全新构建的。此肽如预期的那样在还原态时形成了二聚体螺旋结构，但在氧化态时折叠很差。在下一步中，发明人将位于中心的非七残基的单位引入肽内(CSP-2及更高)。在我们的设计过程中这对设计的成功非常重要。十一个残基(十一残基)单位可使螺旋发夹中的转角获得更好的柔性，但也与螺旋二聚体状态相容。需要构建一些十一残基/转角单位来优化目的基序的结构和稳定性，这可以通过少数几次迭代就可以实现。
对后面CSP-3、CSP-6和CSP-7的数据进行比较，显示这些设计非常有趣(见图3A&B)：还原二聚体形式显示的热稳定性的范围较宽(TM分别为40、75和34±2℃)，而氧化态的则窄得多(TM分别为50、47和53±2℃)。这样，当引入十一残基插入片段使进行的设计与螺旋-发夹目的结构相容时，该结构对序列变化的敏感性要低于螺旋二聚体这种形式。对此的合理解释是在发夹状态中十一残基主要作为转角将两个螺旋区系在一起，可能对结构的疏水核心没什么贡献。但是在二聚体形式中，十一残基的a、d和h位点的残基几乎肯定地确实有助于疏水接触面的形成，从而有助于结构的总体稳定性。该实例证明所试验种类的构象转换可以通过关注二聚体状态下的相互作用而加以调节。另一方面，CSP-6在发夹和二聚体形式之间的热稳定性差别最大(二聚体形式更稳定)。这样，对于处于氧化态的该肽，二聚体所形成的发夹状态可以说是目前所有设计中应力最强或最易破坏的，换句话说，当其从氧化态转换成还原态时需要获得比其他设计获得更多的稳定能量。因为发明人已经用二硫键作为引发剂设计了氧化还原转换，氧化态和还原态的稳定性差别可以提供调节该键的氧化还原电势的途径。利用同样的设计原则，可以研发在细胞生物学中应用的可调节型氧化还原传感器(Ostergaard等，EMBO Journal，20(21)：5853-5862，2001)。这里所陈述的设计也可用于构建对以下情况产生应答的构象转换，所述情况为溶液条件中更精细的变化如pH(Zhong等，Molecular Cell(分子细胞)，2(1)：101-108，1998；Skehel等，Annual Review of Biochemistry，69：531-569，2000；和Cabezon等，EMBOJournal，20(24)：6990-6996，2001)和小配体结合(Mizoue et al，CurrentOpinion in Structural Biology，12：459-463，2002)，这些可能打开设计基于肽的传感器的路线(Ghosh等，Journal of the American Chemical Society，122(23)：5658-5659，2000)。
前述所有引用的文献均以参考的方式引入本文。
表1、CSP设计的序列(连续迭代中的突变用粗体突出显示)设计迭代玛雅的命名 defgabcdefgabcdefghijkabcdefgabcdefga 1 CSP-2 CGGEIRALKYEIARLKQ----KKRALEQKIAALEGGC 2 CSP-4 CGGEIRALKYEIARLKQGGGGKKRALEQKIAALEGGC 3 CSP-3 CGGEIRALKYEIARLKQAKQAKIRALEQKIAALEGGC 4 CSP-5 CGGEIRALKYEIARLKQAKQAEIRALKQEIAALKGGC 5 CSP-6 CGGKIRALEYKIARLEQAKQAKIRALEQKIAALEGGC 6 CSP-7 CGGEIRALKYEIARLKQAAQAKIRALEQKIAALEGGC 7 CSP-8 CGGEIRALKYEIARLKQAAQAKKRALEQKIAALEGGC
表2、CSP设计的溶液相分子量及解离常数 设计 迭代 半胱氨酸的氧化 玛雅的命名 Mr 溶液中的MW(Da) (95％置信界限) KD(解离常数，μM) (95％置信界限) 1 还原并烷基化 氧化 CSP-2a CSP-2o 3761 3643 6885(6639，7127) 3260(3018，3495) 33(22，48) - 2 还原并烷基化 氧化 CSP-4a CSP-4o 3988 3872 3901(3708，4088) 3811(3642，3975) - - 3 还原并烷基化 氧化 CSP-3a CSP-3o 4143 4027 6652(6372，6925) 3522(3308，3731) 191(142，256) - 4 还原并烷基化 氧化 CSP-5a CSP-5o 4143 4027 6949(6715，7180) 3768(3563，3968) 77(57，103) - 5 还原并烷基化 氧化 CSP-6a CSP-6o 4143 4027 6819(6336，7286) 3810(3591，4023) 72(48，106) - 6 还原并烷基化 氧化 CSP-7a CSP-7o 4086 3970 7148(6931，7361) 3665(3535，3791) 34(24，48) - 7 还原并烷基化 氧化 CSP-8a CSP-8o 4101 3985 5481(5199，5755) 3295(3137，3449) 506(382，670) -
表3、构象转换的半衰期 还原剂 速率(k)(sec-1) t1/2(分钟) 1 2 1 2 均值 DTE 6.95×10-4 7.62×10-4 16.62 15.16 15.89±0.73 βME 2.25×10-4 2.24×10-4 51.30 51.36 51.43±0.13