测试抗细菌粘附组合物的方法 发明背景
用清洁剂清洗人类皮肤与同时能够除菌联系在一起已经有一百多年了。但是，皮肤清洗制剂在除菌方面，无论是其定性的还是定量的效果，都没有展示给其消费公众一个可见的证明。用放射性标记细菌，然后再在皮肤样品上清点残留放射性标记的数量，这当然不是一个可被接受的方法。
相似的，人们可能对如何防止细菌粘附到各种身体细胞上也存在不断增长的兴趣。文献USP5,002,759指出了抑制一种链球菌的生脓原粘附到位于口腔内的一种特殊细胞上。另一份文献，USP5,683,991，特别指出了通过应用特殊的半乳糖醛酸抑制大肠杆菌(E.coli)粘附到消化道上皮细胞和泌尿生殖道上皮细胞。EP806935A指出利用一种糖类或其衍生物作为抗粘附剂，用于抵抗包括细菌，寄生虫和原生动物在内的许多有害物粘附到细胞表面，譬如，皮肤，粘膜，体孔，伤口，眼睛和头发。USP5,416,075公开了一种水包油乳状剂的用途，这种乳状剂包含一种在其亲水部分头部末端具有生物特殊部分的两亲性分子。这些组合物可应用于皮肤。其头部基团抑制了细菌粘附到皮肤上。
然而，这一方法的效果并没有迅速可见的证明。
这样的方法现在已经被发现了。其速度快。能可见的证实任何这类确实的或者假设的有效组合物的效果。而且，它对许多可以传播到皮肤上的细菌有效。
发明概述
根据这项发明，有一种可以可见地证明抗菌粘附组合物有效性的方法，该方法包括：
a．用潜在的或者已知的抑制细菌粘附的组分处理皮肤；
b．该皮肤接触细菌，使细菌沾附到皮肤上；
c．该皮肤接触细菌生长支持培养基，可选择地，事先在其中加入或者后来在其中加入一种有助于可见的检测细菌菌落的化合物或者混合物。
应当指出，大多数人通常能够检测到生长在琼脂平板或者其他支持培养基上的细菌菌落，并且能成功的比较有大量细菌生长的培养基与有轻度或者中度细菌生长的培养基。这样的细菌作为有色的小团是肉眼可见的，无需使用另外的用于可见检测的培养基。这样的细菌包括粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，金黄色葡萄球菌(Straphylococcus aureus)，荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，绿脓杆菌(Pseudomonas aeroginosa),Bacteroidesasaccharolytics和产黑素拟杆菌(bacteroidesmelaninogenicus)。
然而，细菌生长培养基中常常含有特定的组分，这些组分可以特异的支持某种细菌的生长，并使细菌出现可见的颜色。此外，培养基中还可以含有其他特定化合物，把这种特定的化合物加在生长培养基中，可以在有其他细菌存在的情况下选择性的使特定细菌着色。
本发明更深层的方面是一种方法，该方法不仅可以可见地评估潜在的或者已知的抑制细菌吸附组合物的相对有效性，包括上述用于评价的每种细菌吸附组合物的a,b和c三步，还可以就每一所述的组合物，测试和比较皮肤上的可见菌落数量。
发明详述
被抑制而不能吸附到皮肤上的细菌样品包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis),Corynebacterium minutissimum，大肠杆菌(Escherichia coli)，猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholeraesuis)和粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，以及其他在这项申请中提到的细菌。
这项测试简单易行，它为估算皮肤上细菌的可见数量提供了一个简单的方法。把一块皮肤接触可能能抑制细菌吸附的被测试组合物，这种皮肤包括但不局限于来自机体的外植皮肤，或者来自动物和人体的其他来源的皮肤，合成皮肤等，例如手。在相似的部分皮肤上进行对照试验，对照组合物中不含有被测试组合物中所含有的所谓的抑制细菌粘附的成分。例如，在一块皮肤(一只手)上使用含有细菌粘附抑制剂的肥皂组合物。在另一只手上，使用不含有该细菌粘附抑制剂的肥皂组合物。每只手都接触一种特定细菌或者多样的细菌，抑制细菌粘附组合物被认为对这种特定细菌或者多样的细菌是有功效的。过一段时间，用手接触可以支持细菌生长的细菌生长支持固体培养基，或者接触可以容易地加入细菌生长所需养分的培养基。生长支持培养基的一个例子是琼脂。在培养基中事先混合或者在适当时间之后加入足够量的生长营养成分，这可以使得从皮肤转移过来的各种各样的细菌生长起来。经过一段细菌生长所需的适当时间之后，时间长短至少部分地依赖于温度，菌的种类等，带菌的培养基就可以被可见的评定了。
如前所述，具有正常视力的人可以看到细菌菌落，并且可以区分生长的各种水平，比如大量生长，中度生长。这没有使用任何附加的视觉效果，即细菌没有任何天然颜色。前面提到，有些细菌确实具有天然的颜色。另外，因为许多细菌当生长在含有特定养分的培养基中时，可以产生色素，所以可以根据营养生长物质的特性使细菌菌落带有颜色。这样的培养基在性质上是可以有选择性和有差别的。例如，下述培养基可以使以下的细菌具有颜色色素：
·在伊红美蓝琼脂培养基上，大肠杆菌(Escherichia coli)产生带有特有的绿色金属光泽的菌落。这种营养培养基含有这样一些成分：蛋白胨，乳糖，磷酸氢二钾，曙红Y(Eosin Y)，亚甲基蓝(Methylene Blue)，琼脂，pH值6.8。
·在甘露醇盐琼脂培养基上，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)产生带有特有的黄色的菌落。这种营养培养基在每升纯水中含有以下成分：
酪蛋白胰酶消化物 5.0g
动物组织胃蛋白酶消化物 5.0g
牛肉提取物 1.0g
氯化钠 75.0g
酚红 0.025g
琼脂 15.0g
·一种大肠杆菌感受态菌株E.coli HB101在含有X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷酶)，IPTG(异丙基-β-硫代半乳糖-吡喃糖苷)的LB(Luria-Bertani)培养基上可以产生蓝色菌落。LB培养基含有细菌用胰蛋白胨，酵母提取物，NaCl，琼脂和水。
·胰胨豆胨琼脂培养基
组合物：每升纯水中的近似配方
酪蛋白胰消化物 15.0g
大豆粉胃酶消化物 5.0g
氯化钠 5.0g
琼脂 15.0g
在这种培养基上，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)产生红色菌落。
·下列肠细菌在特殊的培养温度下也可以产生色素*：生物体 菌落颜色 有色菌落
(培养温度℃) ％成团肠杆菌 黄 76-89(Enterobacter agglomerans)斯氏欧文氏菌 黄(27) 90-100(Erwinia stewartii)赫氏埃希氏菌 黄 90-100(Escherichia hermannii)发光致病杆菌 黄，橙或红(25)90-100(Xenorhabdus luminescens)波氏致病杆菌 褐 90-100(Xenorhabdus poinarii)
*Manual of Clinical Microbiology，第六版，459页
还有更多的含有特殊化合物或者混合物的这种培养基，这些培养基可以与生长中细菌巧妙复杂的酶代谢物发生反应或者相互作用，产生可用于鉴定细菌的可见颜色。WO9739103,FR2708286,FR2708285和WO9409152公开了这样的化合物，这几项专利的发明人都是Alain Rambach。一种含有这样的色原体(chromogen)的典型的培养基例示如下，这种培养基可以以脱水粉末形式从CHROM agarCompany,Paris,France购得。
组合物：
·蛋白胨
·肉类提取物
·酵母提取物
·琼脂
·色原体(一种辛酸脂，特别是吲哚辛酸)40-200mg/l
在这种培养基上，Salmonnella产生蓝色菌落。
·在CHROMMagar指示培养基上，各种各样的细菌菌落有不同的颜色。例如：
大肠杆菌(E.coli) 粉红色
肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae) 金属蓝色
肠杆菌属(Enterobacter species) 金属蓝色
金黄色葡萄球菌(Staph.aureus) 白色至黄色
弗氏柠檬酸细菌(Citrobacter freundii) 金属蓝色
肠球菌属(Enterococcus species) 青绿色
(Ref.J.Clin.Microbiol.36(4):990-994,1998)。
根据培养基上肉眼可见的细菌数量评定结果：培养基上肉眼可见的细菌菌落数量越少，抑制细菌粘附组合物越有效用，与之相反，培养基上肉眼可见的细菌菌落数量越多，抑制细菌粘附组合物越没有效用。
这里所用到的皮肤这个词是指，顶层皮肤(即角化层)和这层的所有成分，包括细胞的和非细胞的(即生物分子)，比如蛋白质，糖类，脂类等。
任何一种潜在的或者已知的抑制细菌粘附到皮肤上的成分，都可以用这种方法来评估。前面所讨论的组合物，除了能抑制细菌粘附到皮肤上之外，都在美国暂时申请60/087,533和60/087,532中有公布，在此引入作为参考文献。这些组合物是一些组合物，这种组合物包括表面活性剂与能达到抑制细菌粘附效果含量的硅氧烷，例如聚二甲基硅氧烷(dimethicone)，或者表面活性剂与能达到抑制细菌粘附效果含量的烃类成分，例如矿脂，minerol oil，石蜡等，或者表面活性剂与能达到抑制细菌粘附效果含量的硅氧烷和烃类成分的混合物。一种阴离子聚合物可以与硅氧烷，或者烃类成分，或者这二者同时出现在其中。各种各样的其他成分也可以出现在其中，比如香料；抗微生物材料，例如Triclosan或者trichlorocarbanilides等。但是，抗微生物材料，例如Triclosan或者triclocarban可以不必加入。
这种方法可以用于已知的与未知的抑制细菌吸附组合物之间的相互比较或者对比，或者它们与对照组合物之间的相互比较或者对比。
可以通过任何形式的接触把细菌转移到皮肤，例如，皮肤接触皮肤，或者皮肤接触带有这样细菌的表面，比如，门把手，水龙头，电话，桌面等。当细菌有足够大的浓度时，甚至能够通过空气形式传播。
把细菌从皮肤转移到生长支持培养基上，可以通过简单地把带菌的皮肤表面接触培养基表面。把手按到琼脂培养基的表面就是这种转移的一个例子。
通过在细菌最适生长温度下进行培养，并在事先没加有养分的支持生长培养基中加入养分，细菌便可以生长成各种各样的菌落。经过这些细菌生长所必需的一段时间之后，这段时间的长短至少部分取决于温度，pH值，细菌类型等，无需前面所述的包括培养基或者化合物在内的颜色帮助，就可以直接看到细菌。然而，如果需要的话，这些有助于观测的附加方法还是可以使用的。
以下是发明的一些实例。这些实例试图阐明本发明具有广泛的特性，并且没有不适当的限制性。
实例1
三十个被试者参与了这项研究。在开始研究之前，被试者经过一周时间的清洗，在这期间以及在整个研究期间，他们避免用任何有抗细菌标志的产品，例如抗细菌肥皂，碗盘清洗剂，洗液，面霜，滑石粉等，以及去头屑洗发香波。
测试当天，被试者的手经过70％乙醇清洗以除去污染的细菌，并在空气中干燥。技术员清洗被试者的每只手四次或者一次。清洗过程包括用肥皂洗15秒钟，用带有手套的手涂肥皂泡45秒钟，流动的温水水龙头下清洗10秒钟。对于多次清洗，在下一次清洗前，手要在空气中干燥。
被试者把每只手轻轻地放在事先污染了200μl(约106)标记细菌粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)(ATCC14756)的塑料盘表面。两个总重约480克的物体放置于手上，以提供平均的压力。手放在塑料盘表面5秒钟。接着，被试者尽快轻轻地把他们的每只手放置于事先倾倒了Microbial Content Agar的印手板上以转移细菌。技术员对被试者的手和手指施以轻压10秒钟。用作重物的相同物体被放在手上以提供平均的压力，手放在琼脂板上保持30秒钟。被试者的手经用70％异丙醇浸泡3分钟净化消毒。
琼脂平板于35-37℃培养过夜。平板由三位鉴定人根据以下尺度估算：
0-没有细菌生长
1-非常少量细菌生长
2-少量细菌生长
3-中度细菌生长
4-许多细菌生长
5-非常多细菌生长
6-极度细菌生长
只有粉色菌落被估算。采用半分来描述整分之间的分数。
把三位鉴定人给每块平板的分数取平均值。利用鉴定人的平均分数，在5％的显著性水平上采用成对t测验来判断是否在产品之间存在显著性references。
表1细菌挑取评估(Bacteria Pick-up Ecaluation)：测试样品/安慰剂
鉴定人分数的平均值+-标准差
(每次研究n=15)
洗4次 洗1次
安慰剂a 3.8±1.0 3.5±1.0
测试样品b 2.8±1.0 2.0±1.8
p值 ≤0.05 ≤0.05
a重量百分比：肥皂77.5％，游离脂肪酸9.5％，水8.4％。
b重量百分比：肥皂74.3％，游离脂肪酸9.2％,polyquat60.12％,triclocarban0.25％，矿脂3.5％,dimethicone0.1％，水8.3％。
根据数据所示，测试样品显著地抑制了细菌粘附到皮肤上。
问题登记：
P5/25,L25 Straphylococcus aureus拼写错误，应为Staphylococcus aureus，未修改，现译作金黄色葡萄球菌。
P5/25,L26 Pseudomonas aeroginosa拼写错误，应为Pseudomonas aeruginosa，未修改，现译作绿脓杆菌。
P8/25,L24 metabolities拼写错误，应为metabolites(代谢物)，未修改。
P9/25,L33 minerol oil拼写错误，应为mineral oil(矿物油)，未修改。
P10/25,L9 or skin surface，应为or surface，未修改。
P11/25,L32 references拼写错误，应为differences，未修改。
P12/25,L9 polyquat60.12％，是否应为polyquat 0.12％？未修改。