以无活性胰岛素为骨架的含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的 抗栓新药 所属技术领域：生物化学与分子生物学，基因工程技术领域。
现有技术：
心脑血管疾病率已成为现代社会严重危害人类自身健康的一类疾病，包括高血压、冠心病、心肌梗塞、脑血栓等等。在治疗这类疾病的过程中，人类一直把追求更高效、专一、更易得的各类抗栓、溶栓药剂作为治疗、预防该类疾病的最佳途径。血栓的非正常性形成往往是导致此类疾病的根本环节[Peerschke，E.I.et al，(1980)Blood，55，841--847]，因而如何预防人体循环系统中血栓的非正常性形成也就成为科学界、医学界关注的焦点，从最初采用，至今仍被广泛使用的Aspirin阿斯匹林[Smith，J.B & Willis，A.L(1971)Nature，231，235-237]，到血栓烷合成酶抑制剂[Fitzgerald，G.A et al(1985)Circulation，72，1194-1201]，再到血栓烷受体拮抗剂[Stegmeier，K et al(1984)ThrombRes.35，379-395]，直至迄今被证明最为高效、专一的天然蛇毒去整合素，这方面的论文如Huang，T.F et al(1987)J.Biol.Chem，262，16157-16163；Huang T.F et al(1989)Biochemistry，28，661-666；Gan Z.R et al(1988)J.Biol.Chem，263，19827-19832]，走过了一条漫长道路。源自天然蛇毒、水蛭毒素的去整合素，是高效的血小板整合素GP IIb IIIa的拮抗剂，能竞争性地与纤维蛋白原结合GP IIb IIIa，从而抑制血小板-纤维蛋白与血小板-血小板之间的相互作用，抑制血小板在血管壁上的粘附与聚集，抑制血栓的形成。源自天然蛇毒、水蛭毒的去整合素多肽种类繁多，但它们都具有共同的结构特点与作用机制：(1)皆为短链多肽，分子量小，在10K Da以下；(2)都具有共同的保守序列，即RGD序列(精氨酸Arg-甘氨酸Gly-天冬氨酸Asp序列)，组成多肽的功能区；(3)RGD序列一般都位于短链多肽地突环区顶端，常有β折叠支持，位于分子表面，亲水性较强；(4)多肽分子的内部通常具有两对以上的二硫键。天然去整合素多肽对血小板聚集的抑制活性很高，IC50值一般在10-7M水平。但蛇毒资源有限，并且纯化工艺苛刻，严重限制了天然抗栓肽的实用性，目前主要用于科研中。因此目前国际上主要发达国家如美、日、德等以及一些跨国性大药厂纷纷希望用基因工程方法，基于天然去整合素的研究，设计、创造新型RGD-基因工程抗栓肽，将来用于科研、医疗临床领域。目前临床医疗用的抗栓剂主要还是Aspirin(阿斯匹林)，漯代他汀等化工制药，这类药有一定效果，但用药量大、副作用大。国际上基因工程抗栓剂的研究都处在实验室阶段，抗栓效果都不强。日本蛋白质工程研究所的Takao Yamada小组利用基因工程方法，在人溶菌酶基因的HincII位点插入体外合成的RGD序列编码位点的双链DNA片段形成一个含有RGD编码框的重组人溶菌酶基因，在酵母体系表达，纯化，得到RGD-人溶菌酶多肽，但该肽的抗栓生物活力远远低于天然抗栓肽，要低两百倍到五百倍[Takao Yamada，et al(1993)J.Biol.Chem，268，10588-10592；Takao Yamada et al(1994)Biochemistry，33，11678-11683].美国Smithkline Beecham制药公司的Grace Lee，Ronald Wetzel研究小组是以免疫球蛋白轻链可变区REI结构域为支架载体蛋白，构建了含有RGD序列的基因工程重组多肽。这些重组多肽有的没有表现出对血小板聚集抑制活性，有的表现出血小板聚集抑制活性，IC50在10-6M水平，这是迄今文献报道的基因工程重组RGD肽的最高活力。[Grace Lee et al(1993)ProteinEngineering，6，745-754]。德国科研人员Axel Knapp等选择水蛭素蛋白作为构建RGD多肽的载体蛋白，他们将重组多肽命名为Hirudisin，[Axel Knapp，etal(1992)，J.Biol.Chem，267，24230-24234]，Hiruisin的血小板聚集抑制活性的IC50值为6.5×10-5M，抗栓活力不高。
本发明利用胰岛素原分子与天然蛇毒去整合素的可比性：分子量小，具有多对二硫键，胰岛素原C肽构象类似RGD区，位于分子表面突环区，亲水性及柔性较好。同时基于目前对胰岛素结构性质的研究，C肽的置换被证明不影响胰岛素A、B链二硫键的正确形成，构象不会发生大的改变[Wei G & TangJ.G(1995)Biochemisty and Molecular Biology International，37，895-901]，将RGD序列置换胰岛素原的C肽，构建一种新型重组嵌合多肽，发挥RGD序列特有的功能，制造一种新型基因工程抗栓肽。为了确保该重组多肽的抗栓专一性，消除因载体蛋白而可能带来的副作用，我们选用A6，A1l双位点突变的胰岛素原作为构建RGD-人胰岛素的基因模板，消除RGD-人胰岛素的胰岛素降血糖活性，使构建的新型基因工程抗栓多肽是高效、专一的抗栓活性剂。
发明的目的：
本项研究开发的目的是结合天然蛇毒抗栓肽与胰岛素多肽的结构与功能特点，利用现代基因工程手段构建新型抗血栓形成的多肽分子，以用于血液生物学、药理学和临床医疗学的基础研究和实际临床应用中。上述制备出的RGD-胰岛素功能多肽是一种高效专一的抗栓肽，它的化学结构和性质证明它符合我们原定设计目的。
发明的内容与技术方案：
胰岛素原的C肽构象与天然蛇毒去整合素中RGD序列的构象相似，B链末端B30位点与A链A1位点之间空间距离约为7.5埃，因此设计嵌合RGD序列为：CRGDSC(半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-半胱氨酸)，该序列取自纤维粘结蛋白，是一种血源性，与血小板整合素有较强亲和力的多肽，能表现较强抗栓活性功能的RGD序列。用于构建重组抗栓多肽的模板基因为[Cys A6 Ser，Cys All Ser]-人胰岛素原基因，为本实验室自制[Dai Y，TangJ.G(1996)Biochimica et Biophysica Acta，1296，63-68]。所应用的基因工程方法为自行设计，是PCR方法的多步组合。1.构建嵌合RGD序列于设计位点的RGD-人胰岛素基因，再用分子克隆技术连接至温控诱导表达质粒pBV220的EcoRI与BamHI位点，转化E.coli strain DH5a，获得基因工程菌克隆。2.基因工程菌的培养与诱导。3.RGD-INS的分离纯化。4.进行抗栓活性与胰岛素生物活性方面的分析。这是一种新型基因工程重组抗栓肽，构建此重组抗栓肽的基因工程方案为：用于构建的基因工程方法共设计引物四条，应用PCR方法合成含有B链与CRGDSC六肽序列的编码框的DNA分子，第二轮PCR过程合成含有A链的编码框的DNA分子。第三轮PCR过程为构建RGD-INS重组多肽基因，将前二轮PCR过程合成的DNA分子连接，形成同时含有胰岛素B链、A链与CRGDSC六肽序列的编码框的DNA分子，CRGDSC序列位于B链B30与A链A1之间。实践证明，此基因工程方法优于目前国际上构建类似分子的PCR技术。[RitaGrandori et al，(1997)Protein Engineering，10，1099-1100]。
特点与应用：
上述基因工程RGD-INS抗栓多肽的化学结构不同于目前已知的所有天然蛇毒、水蛭抗栓肽以及其它具有抑制血栓形成功能的基因工程多肽。已证明其为一种新型抗栓多肽分子，不与已知其它功能相关多肽同源。其特点如下：
(1)RGD-INS有很强的抑制血小板聚集活性，IC50为0.35μM。
(2)基于胰岛素分子骨架，无蛇毒抗栓肽的外源蛋白免疫原性。
(3)基于A6，A11位点突变，无体内降血糖作用。
(4)来源为基因工程菌，不受天然资源限制，可高密度发酵培养工程菌。
(5)整个过程不使用有毒物质，不污染环境。
由于该基因工程抗栓肽能有效结合血小板整合素GP IIb IIIa，竞争性抑制纤维蛋白原与血小板的粘附，固而可以作为一种血小板拮抗剂应用在对细胞表面受体整合素与去整合素相互作用的血液生物学，细胞生物学及受体分子生物学研究中，同时在药理学、临床医疗中具有较为广阔的应用前景，可作为一种医用抗栓剂治疗心脑血管性疾病。
实施例
1.基因工程菌的高密度发酵培养与RGD-INS抗栓多肽基因的温控诱导表达
使用自动化监测酸碱pH、温度、溶液溶氧含量、营养补料等参数并能对其进行调节的发酵罐设备高密度发酵大量培养基因工程菌，(发酵罐为美国NewBrunswick Scientific公司出品，型号Bio Flo IV，体积10L)，挑取单菌落于3mlL B培养基(含0.5ug/ml Ampicilin)，30℃剧烈摇动培养12小时，然后转移到300ml L B培养基(含0.5ug/ml Ampicilin)，继续同样条件下培养12小时后，将细菌培养物倒入发酵罐6升M9发酵基质进行高密度发酵培养过程，M9基质含有30克Trypton，20克Yeast Extract(美国OXIOD公司出品)，53克Na2HPO4，11克K2HPO4，4克NH4Cl，2.0克NaCl，1.0克MgSO4，40毫克CaCl2，50克Clucose，250毫克Ampicilin，5毫升Anfi-Form，发酵培养过程的pH设置在7.0，溶氧量保持在50个单位以上，温度初始设置在30℃，补充养料为150克YeastExtract，200克Glucose溶于750毫升水中，在培养过程中以直线梯度均匀补充进去，100毫升/小时，当OD600达到20时，对发酵基质升温至42℃，启始诱导表达RGD-INS基因，温控诱导时间3-5小时，收集发酵培养的湿菌体，离心，菌体重量约为60克/升；
2、RGD-INS的分离纯化
将60克上述高密度发酵培养菌体悬浮于4倍体积STET溶液中(0.1MNaCl，10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA，5％Triton X-100)，用国产JY92-II型超声波细胞粉碎机对悬浮菌液超声处理8个循环，功率300W，每个循环超声破碎15秒，间隙10秒，将超声处理过的细菌裂解液离心(日本Hitachi公司出品)，RPR9-2型转子，10,000g加速度，沉淀约10克重，用包涵体裂解液溶解沉淀(0.1M Tris-HCl，pH8.0，0.02M NaCl，0.01M EDTA，8MUrea)，4℃搅拌10小时，再次以同样加速度离心，上清溶液中加入120毫克DTT，使其终浓度达到10mM，37℃静置反应2小时，取出用2倍体积的预冷水扩大溶液体积，以3N盐酸调节溶液pH至5.0附近进行等电点沉淀，4-5℃静置沉淀体系2小时，10,000g离心收集沉淀，转移至2升0.05N Gly-NaOH，pH10.8缓冲液中，重组反应24至36小时，对重组溶液超滤浓缩至20毫升以内，上样到事先用0.05NGly-NaOH，pH10.8缓冲液平衡好的24×100cm Sephadex G 50分子筛层析柱中(瑞典Pharmcia公司出品)，用同样缓冲液洗脱，室温条件，时间10小时，流速1.0ml/min，洗脱结果共分到两个主要的紫外吸收峰(280nm)(见附图2)，其中的A峰即含有RGD-INS，收集A峰洗脱液，调节12％NaCl盐析沉淀RGD-INS，把RGD-INS溶于0.02MTris-HCl，pH7.6，6M Urea溶液，上样到事先用同样溶液平衡的1ml体积Resource QTM离子交换快速蛋白液相色谱柱中(瑞典Pharmacia公司)，用0％-100％ 0.5MNaCl溶液梯度洗脱，时间30分钟，流速0.8ml/min，结果得到三个紫外吸收峰(280nm)(见附图3)，其中第三个紫外吸收峰即为RGD-INS，将第三峰收集液用脱盐柱Sephadex G 25脱盐后，冰冻干燥即为纯净的产品；用上述方法得到的RGD-INS用Native聚丙烯酰胺凝胶电泳测试为一条区带；上述结果得到氨基酸组成分析，质谱仪上做的质谱分析实验的进一步验证；质谱测出其准确分子量为6370.2，与按顺序分析结果计算得出的分子量6372吻合。(见图1)
3、血小板激活剂ADP刺激下的血小板聚集抑制实验研究RGD-INS的抗栓活性。实验用富含血小板血浆(简称PRP，Platelet Rich Plasma)取自Wistar小鼠与兔。测定由北京医科大学药理学研究室进行。该方法为测定药剂抗栓活性的常规方法，为卫生部规定和国际通用，用光浊度计监测反应过程中溶液体系中血小板聚集情况，透射光强度将随着血小板聚集率的下降而降低。用双蒸水溶解RGD-INS多肽，并配制不同浓度，用于监测对ADP刺激下血小板聚集的抑制情况。实验对照为不含任何多肽的双蒸水。整个反应过程用光浊度仪监测溶液透射光信号，并把光能转化为电信号，用笔描记录仪记录。(见附图4)。以RGD-INS的浓度为横坐标，RGD-INS与血小板作用后的光强信号与对照比值为纵坐标，绘制血小板聚集抑制曲线，并从中求出最大半数抑制IC50值，实验结果表明RGD-INS的IC50值为0.36×10-6M。目前研究表明天然蛇毒抗栓肽IC50值一般在10-7M，其它基因工程重组抗栓肽IC50值在10-5M或者更高浓度，实验结果表明我们构建的基因工程RGD-INS的血小板聚集抑制活性接近天然蛇毒抗栓肽的活性，是一种高效的基因工程抗栓肽。
4、RGD-INS的胰岛素受体结合实验与动物体内血糖测定分析。采用测定胰岛素活性的常规方法受体结合分析检测RGD-INS。使用r放射性计数器监测放射性标记的胰岛素与受体的结合被待测样品抑制情况，以待测样品浓度对数值作为横坐标，放射性标记胰岛素与受体结合形成的沉淀的r计数值为纵坐标，绘制竞争抑制曲线。实验对照采用天然非碘标胰岛素，绘制标准曲线。通过与天然胰岛素活力的比较判断待检测样品的胰岛素生物活性。实验结果表明，RGD-INS不表现胰岛素受体结合功能，浓度的改变不能影响沉淀放射性计数大小。动物体内实验是以兔子为实验动物，空腹兔子12小时，使兔子体内血糖水平维持在基础水平，抽血并分离血清，测定注射RGD-INS前血糖值，每两只兔子一组，一组注射RGD-INS，0.2unit/Kg；另一组注射天然胰岛素多肽，0.2unit/Kg，作为对照组。RGD-INS与天然胰岛素都用0.9％酸性生理盐水溶解。2小时后抽血并分离血清，测定血糖值。实验结果表明，注射天然胰岛素制剂的兔子体内注射后血糖值分别是注射前的68％与56％，血糖水平明显下降；注射RGD-INS的一组兔子注射后血糖值分别是注射前的98％与106％，基本上没有发生变化，血糖水平不下降。这些研究结果表明RGD-TNS虽是以[Cys A6 Ser，CysAll Ser]-胰岛素为骨架，但不表现胰岛素降血糖活性，在抗栓活性方面活力很高，因而我们构建的RGD-INS是一种高效专一的基因工程抗栓肽。
附图说明：
图1 RGD-INS的基因序列与多肽氨基酸序列
图2 分子筛层析分离纯化RGD-INS的图谱，其中A峰为抗栓活性肽RGD-INS所在峰
图3 含有RGD-INS的组分经Resource Qrm离子交换柱的进一步分离纯化，其中第三峰为纯净的RGD-INS。
图4 RGD-INS对血小板聚集抑制的抗栓活性实验记录图谱。
1-未加RGD-INS多肽的对照；
2、3、4-RGD-INS浓度分别为2×10-6M，1×10-6M，0.5×10-6M时对血小板
聚集抑制的溶液光浊度变化记录。
附氨基酸化学结构式简写符号文字说明：
NH2：氨基端，A：丙氨酸， C：胱氨酸， D：天冬氨酸， E：谷氨酸，
F：苯丙氨酸， G：甘氨酸， H：组氨酸， I：异亮氨酸， K：赖氨酸，
L：亮氨酸， M：甲硫氨酸， N：天冬酰胺， P：脯氨酸， Q：谷氨酰胺，
R：精氨酸， S：丝氨酸， T：苏氨酸， V：缬氨酸， W：色氨酸，
Y：酪氨酸， COOH：羧基端，-S-S-：二硫键。