重组Bet.v.1过敏原突变体及其方法和制备 【发明领域】
本发明涉及过敏反应的诊断和治疗。更具体而言，本发明提供了获得突变过敏原分子的方法，所述分子可用于过敏反应的诊断和治疗。本发明还涉及新型重组过敏原及其应用，所述过敏原是天然存在的过敏原的突变体。另外，本发明还涉及含有重组过敏原混合物的药用组合物。本发明还涉及这种重组突变过敏原的制备方法以及含有该重组突变过敏原的药物组合物和疫苗。在一些实施方案中，本发明涉及在受试者中产生免疫应答，接种或治疗受试者的方法以及制备本发明组合物的方法。
【发明背景】
遗传上易感的个体可被个体所接触的各种环境来源产生的抗原或过敏原致敏(过敏)。当以前致敏的个体再接触相同或同源的过敏原时会发生过敏反应。过敏反应的范围包括枯草热、鼻传导疾病(rhinoconductivitis)、鼻炎、哮喘和全身性过敏病以及例如由于蜜蜂或大黄蜂螫伤或昆虫咬伤所引起的死亡。该反应是即时的且可由各种特异反应性过敏原引起，例如，来自草类，树木，杂草，昆虫，食物，药品，化学物质和香料等的化合物。
然而，当个体首次接触过敏原时不出现这类反应。开始的适应性应答需要时间且通常不引起任何症状。但当已产生能与过敏原反应的抗体和T细胞时，任何随后的接触都可能激发症状。因此，过敏反应表明免疫应答本身可引起威胁生命的重大病理状态。
特异反应性过敏反应涉及的抗体主要属于IgE型免疫球蛋白。IgE与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面上的特异性受体结合。特定的过敏原与结合于肥大细胞上的IgE形成复合物后，受体在细胞表面交联，导致通过该受体产生信号传导和形成靶细胞地生理反应。肥大细胞的脱粒导致释放组胺，肝素，嗜酸性白细胞趋化因子，白三烯C4、D4和E4，它们会引起支气管平滑肌细胞持续收缩。在自然情况下产生的效应可以是全身性的或是局部的。
抗体介导的过敏性反应可分成4类，即I型，II型，III型和IV型。I型过敏反应是典型的即时过敏反应，在接触抗原后几秒或几分钟内发生。其症状由过敏原特异性IgE介导。
通常，观察到的过敏反应是对存在于诸如花粉，室内粉尘螨，动物毛发和头皮屑，毒液和食品中的蛋白质过敏原发生的反应。
为了减小或消除过敏反应，通常使用仔细控制和重复地施用过敏反应疫苗。传统上经过肠胃外、鼻内或舌下用药进行过敏反应疫苗接种，在相当长的时间期间内不断增加剂量，导致病人脱敏。尚未知道精确的免疫学机制，但有人认为在过敏原特异性T细胞表型方面诱导的差异特别重要。
过敏反应的疫苗接种
疫苗接种的概念以免疫系统的两个基础特征，即特异性和记忆性为基础。疫苗接种会引发受体的免疫系统，当重复接触相似蛋白时，免疫系统会对诸如微生物感染之类的攻击发生更强烈的应答。疫苗是用于接种以在受体中产生这种保护性免疫反应的蛋白混合物。保护仅包括存在于疫苗中的成份和同源抗原。
与其它类型的疫苗接种相比，过敏反应接种由于在过敏反应病人中存在正进行的免疫反应从而更加复杂化。这种免疫反应的特征在于存在过敏原特异性IgE，当接触过敏原时介导过敏反应症状出现。因此，使用来自天然来源的过敏原进行过敏反应接种具有固有的危险，其副作用的最坏后果可能会威胁患者的生命。
围绕该问题的研究方法可分成3类。在实际中常结合使用多类方法。第一类方法包括在较长的时间内施用一些小剂量以达到较大的累积剂量。第二类方法包括将过敏原掺入诸如氢氧化铝的凝胶物质中对过敏原进行物理修饰。氢氧化铝制剂具有佐剂效应和延缓过敏原释放以降低活性过敏原成份组织浓度的贮藏效应。第三类方法包括化学修饰过敏原以降低过敏原性，即IgE的结合性。
成功的过敏反应接种的详细机制还存在争议。然而，已认可T细胞在免疫反应的总体调节中起关键作用。根据目前的共识，T细胞的两种极端表型，Th1和Th2之间的关系决定了个体的过敏反应状态。当用过敏原刺激时，Th1细胞分泌白细胞介素，主要是干扰素-γ，导致保护性免疫，而该个体是健康的。另一方面，Th2细胞主要分泌白细胞介素4和5，导致IgE合成和嗜曙红细胞增多，而该个体是过敏性的。体外研究表明，用含相关T细胞表位的肽衍生的过敏原攻击则有可能改变过敏原特异性T细胞的反应。因此目前对新的过敏反应疫苗的研究主要以针对T细胞为基础，目的在于使T细胞(过敏反应诱导)沉默或使反应从Th2表型转换为Th1表型。
结合抗体的表位(B-细胞表位)
Fab抗原复合物的X-射线晶体学分析增进了对结合抗体的表位的了解。根据这类分析，结合抗体的表位可定义为含有15-25个氨基酸残基的原子的抗原表面部分，它们与能直接相互作用的抗体原子保持在一定的距离内。抗原-抗体相互作用的亲和性不能单独从范德华相互作用、氢键或离子键所产生的焓来推测。其能量贡献的大小相似于水分子从界面几乎完全脱离所需的焓。这意味着相互作用的分子外形之间的高度匹配是进行抗原-抗体高亲和性相互作用的主要因素。
在WO 97/30150(参考文献1)中要求保护一组蛋白质分子，该蛋白质分子与亲本蛋白质相比在氨基酸序列中分布着特定的突变。根据其说明书，似乎该发明涉及产生与亲本蛋白质相比修饰过的类似物，但它们与亲本蛋白质(天然存在的过敏原)以相同的方式被吸收、消化并呈递给T细胞。因此，获得有所改变的T细胞反应。修饰蛋白质的文库使用称为PM(简约原则的诱变)的技术制备。
在WO 92/02621(参考文献2)中描述了重组的DNA分子，该分子包含编码具有山毛榉目中树的过敏原至少一个表位的多肽的DNA，该过敏原选自Alng1，Cora1和Betv1。文中描述的重组分子确实都具有相应于天然存在的过敏原序列的氨基酸序列或部分氨基酸序列。
WO 90/11293(参考文献3)涉及分离的豚草花粉过敏原多肽和修饰的豚草花粉肽。其中公开的多肽具有相应于天然存在的过敏原或其天然存在的同种型序列的氨基酸序列。
过敏原的化学修饰
对过敏原的化学修饰已进行了一些研究。七十年代早期的科学研究包括将过敏原化学偶联到多聚体上和使用甲醛等化学交联过敏原产生所谓的“过敏原类似物(allergoids)”。这些研究的基本原理是经过附着化学配体随机破坏IgE结合表位从而降低IgE结合，同时因增加复合物的分子量而保持其免疫原性。与“过敏原类似物”生产的内在缺陷相关联的是难以控制化学交联过程和难以分析及标准化所得的高分子量复合物。“过敏原类似物”目前用于临床，且由于随机破坏了IgE结合表位，故与常规疫苗相比可施用更高的剂量，但相对于常规疫苗的使用并没有提高安全性和效力参数。
化学修饰过敏原的更近期的研究集中于总体破坏过敏原的三级结构，从而消除IgE结合，其中假定基本治疗靶是过敏原特异性T细胞。该疫苗含有来自过敏原序列的代表最小T细胞表位的合成肽，代表相连T细胞表位的较长肽，来自较长过敏原序列、代表免疫显性T细胞表位区域的合成肽，或以重组技术切成两半的过敏原分子。根据这一基本原理的另一方案是建议使用“低IgE结合”的重组同种型。在最近几年中，已清楚天然的过敏原是异源性的，其中含有同种过敏原(isoallergen)和具有多达大约25％氨基酸被取代的变体。已发现一些重组的同种过敏原在IgE结合中效率较低，这很可能是由于不可逆的变性且因此总体上破坏了三级结构。
体外诱变和过敏反应接种
使用一些过敏原经过体外定点诱变进行了降低过敏反应性的尝试。这些过敏原包括Derf2(Takai等，文献4)，Derp2(Smith等，文献5)，39KDa美洲家刺皮螨过敏原(Aki等，文献6)，蜜蜂毒液磷脂酶A2(Frster等，文献7)，Arah1(Burks等，文献8)，Arah2(Stanley等，文献9)，Betv1(Ferreira等，文献10和11)，桦木抑制蛋白(Wiedemann等，文献12)，和Orys1(Alvarez等，文献13)。
同样，这些方案的基本原理也是针对过敏原特异性T细胞，同时经过破坏重组突变体过敏原的三级结构以减少或消除IgE结合来降低IgE介导的副作用风险。
Ferreira等(文献11)的文章描述了使用定点诱变以减少IgE结合。尽管在该文章中提到了Betv1的三维结构，但作者没有使用该结构预测暴露于表面、可用于突变的氨基酸残基，其中一半具有较低的溶剂暴露程度。相反他们使用用于预测蛋白质中功能性残基的方法。尽管作者确实讨论了α-碳原子骨架三级结构的保守性，但该概念不是治疗策略的一部分，而仅仅用于体外评价IgE结合。而且，提供的证据也不充分，因为CD-谱的标准化会防碍对样品变性部分的评价，这是一个共同的问题。所述的治疗策略旨在在过敏原特异性T细胞中诱导耐受性，且末提及起动新的免疫应答。
Wiedemann等(文献12)的文章描述了使用定点诱变和肽合成来进行单克隆抗体表位的鉴定。该研究表明取代表面暴露的氨基酸具有修饰单克隆抗体结合特征的能力，但这并不令人惊奇，据认为是一种常识。所描述的实验没有设计成评价对诸如过敏反应患者血清IgE之类多克隆抗体的结合调节。其中所包含的一个实验确实应用了血清IgE，尽管该实验不适合于定量评价，但IgE结合似乎不受所进行的突变的影响。
Smith等(文献5)的文章描述了使用定点诱变以实现单克隆抗体表位绘图和减少IgE结合。作者不了解三级结构且没有尝试评价α-碳原子骨架三级结构的保守性。所用的算法不能保证选择用于突变的氨基酸确实暴露于分子表面。所述的突变体只有一个导致IgE结合明显减小。该突变体不能结合所试验的全部抗体，表明其三级结构被破坏。作者没有限定治疗策略、也没有提及起动新的免疫应答。
Colombo等(文献14)的文章描述了使用定点诱变和肽合成研究IgE结合表位。作者根据同源蛋白质的晶体结构使用了一个三维计算机模型结构以阐明分子表面的表位存在。使用代表表位的合成肽证实了显示一级结构同源性的不同过敏原上也存在一个表位。治疗策略以使用代表单价IgE结合表位的合成肽进行治疗为基础。
Spangfort等(文献15)的文章描述了主要桦木过敏原的三维结构和保守的表面暴露部分。该文章没有提及定点诱变，也没有阐述治疗应用。
在上述研究中没有一个是经过取代表面暴露的氨基酸而保持α-碳骨架的三级结构来减小IgE结合。上述研究均未提及起动一个新的保护性免疫应答的治疗理念。
WO01/83559公开了一种筛选具有改进的免疫原性蛋白变体的方法，利用抗体结合肽序列确定亲本蛋白三维结构中的表位序列。随后定义了一个表位区域，然后将定义该表位区域的一个或多个氨基酸突变。该发明利用可作为过敏原的工业酶进行举例说明。
WO99/47680提出向指定的关键位置中引入人工氨基酸取代，同时保持过敏原α-碳骨架三级结构的保守性。WO 99/47680还特别公开了一种重组过敏原，它是一种来自天然过敏原的非天然突变体，其中B细胞表位中至少一个暴露于表面的保守氨基酸残基被在所述天然过敏原起源的分类学目内任何已知同源性蛋白质的氨基酸序列中相同位置上都不出现的另一残基取代，所述的突变过敏原具有与所述天然过敏原基本上相同的α-碳骨架三级结构，且特异性IgE与突变过敏原的结合比与所述天然过敏原的结合更小。
WO99/47680所公开的重组过敏原可经过如下方法获得：a)鉴定天然过敏原中，在该天然过敏原起源的分类学目内所有已知同源蛋白质中具有超过70％相同性的保守氨基酸残基；b)以具有至少20％的溶剂可接近性，确定在过敏原分子三维结构表面至少400A2的范围内连贯连接的至少一块保守氨基酸残基区域，所述至少一块区域包含至少一个B细胞表位；c)所述至少一块区域中的至少一个氨基酸残基被在该特定位置不保守的另一氨基酸取代，而基本上保留过敏原分子的总体α-碳骨架三级结构。
专利申请PCT/DK01/00764涉及天然过敏原的突变体。其中公开了下述特定Betv1突变体：
突变A：Asn28Thr，Lys32Gln，Asn78Lys，Lys103Val，Arg145Glu，Asp156His，+160Asn。
突变B：Tyr5Val，Glu42Ser，Glu45Ser，Asn78Lys，Lys103Val，Lys123Ile，Lys134Glu，Asp156His。
突变2628：Tyr5Val，Glu45Ser，Lys65Asn，Lys97Ser，Lys134Glu。
突变2637：Ala16Pro，Asn28Thr，Lys32Gln，Lys103Thr，Pro108Gly，Leu152Lys，Ala153Gly，Ser155Pro。
突变2724：N28T，K32Q，N78K，K103V，P108G，R145E，D156H，+160N。
突变2733：Tyr5Val，Lys134Glu，Asn28Thr，Lys32Gln，Glu45Ser，Lys65Asn，Asn78Lys，Lys103Val，Lys97Ser，Pro108Gly，Arg145Glu，Asp156His，+160Asn。
突变2744：Tyr5Val，Lys134Glu，Glu42Ser，Glu45Ser，Asn78Lys，Lys103Val，Lys123Ile，Asp156His，+160Asn。
突变2753：Asn28Thr，Lys32Gln，Lys65Asn，Glu96Leu，Lys97Ser，Pro108Gly，Asp109Asn，Asp125Tyr，Glu127Ser，Arg145Glu。
突变2744+2595：Y5V，N28T，K32Q，E42S，E45S，N78K，K103V，P108G，K123I，K134E，D156H，+160N。
突变2744+2628：Y5V，E42S，E45S，K65N，N78K，K97S，K103V，K123I，K134E，D156H，+160N。
突变2744+2595+2628：Y5V，N28T，K32Q，E42S，E45S，K65N，N78K，K97S，K103V，P108G，K123I，K134E，D156H，+160N。
附图的简要描述
图1显示了过敏原和肥大细胞之间通过IgE交联反应的理论模型。
图2(左)用黑色和灰色区域显示的Betv1分子表面第1-10组的定位。(右)构成第1-10组的氨基酸残基视图。各组被标记为1-10。
图3显示了用于Betv1突变的突变体特异性寡聚核苷酸引物。突变的核苷酸下划线。
图4显示了为所有突变体而合成和使用的2个普遍适用的引物(称为“全有义”(all-sense)和“全无义”(all non-sense))。
图5显示了天然及一些突变Betv1过敏原的DNA和氨基酸序列。
图6显示用非生物素标记的Betv1和用Betv1 Glu45Ser突变体抑制生物素标记的重组Betv1与过敏反应患者群的血清IgE的结合。
图7显示用非生物素标记的Betv1和用Betv1突变体Asn28Thr+Lys32Gln抑制生物素标记的重组Betv1与过敏反应患者群的血清IgE的结合。
图8显示了用非生物素标记的Betv1和用Betv1 Pro108Gly突变体抑制生物素标记的重组Betv1与过敏反应患者群的血清IgE的结合。
图9显示了用非生物素标记的Betv1和用Betv1 Glu60Ser突变体抑制生物素标记的重组Betv1与过敏反应患者群的血清IgE的结合。
图10显示了重组及(Asn28Thr，Lys32Gln，Glu45Ser，Pro108Gly)突变体的CD谱，接近等浓度下记录。
图11显示了用非生物素标记的Betv1和用(Asn28Thr，Lys32Gln，Glu45Ser，Pro108Gly)突变体抑制生物素标记的重组Betv1与过敏反应患者群的血清IgE的结合。
图12显示用于形成突变Betv1过敏原的2步法PCR突变技术图解。
图13显示形成克隆Betv1(3004)，(3005)，(3007)和(3009)的PCR突变步骤图解。列出了用于导入点突变的引物。
图14显示形成克隆Betv1(3031)-(3045)的PCR突变步骤图解。列出了用于在10，20，36，73，87，129和149位导入随机突变的简并引物。在顶部显示了各位点可能形成的突变结果。
图15是用于产生突变的各引物的示意图。(I)显示正义和反义引物。(II)显示在指定位点带有突变的重组蛋白终产物。
图16显示Betv1突变体的构建说明及所用引物列单。该突变体含有5-9个氨基酸。
图17显示在Betv1(2628)和Betv1(2637)表面引入的点突变。在Betv1(2628)突变体中，在Betv1的一半区域引入了5个一级突变，另一半区域维持不变。而在Betv1(2637)突变体中，在另一半区域引入了5个一级突变和3个二级突变，第一半区域维持不变。
图18显示了Betv1.2801(野生型)和Betv1(2637)突变体的圆二色性(CD)光谱，接近等浓度下记录。
图19显示了用非生物素标记的Betv1.2801(野生型)，和用Betv1(2628)，Betv1(2637)以及用1∶1混合的Betv1(2628)和Betv1(2637)抑制生物素标记的重组Betv1与过敏反应患者群的血清IgE的结合。
图20显示Betv1.2801(野生型)，Betv1(2628)，Betv1(2637)在人嗜碱性粒细胞中的组胺释放。
图21显示Betv1.2801(野生型)，Betv1(2628)，Betv1(2637)在人嗜碱性粒细胞中的组胺释放。
图22显示Betv1(2744)表面的点突变。
图23显示Betv1(2753)表面的点突变。
图24显示Betv1(2744)和Betv1(2753)表面的点突变。
图25显示了Betv1.2801(野生型)和Betv1(2744)的圆二色性(CD)谱，接近等浓度下记录。
图26显示Betv1.2801(野生型)和Betv1(2744)在人嗜碱性粒细胞中的组胺释放。
图27显示Betv1.2801(野生型)和Betv1(2744)在人嗜碱性粒细胞中的组胺释放。
图28显示Betv1(2733)表面的点突变。
图29显示不同Betv1制剂的表示为刺激指数(SI)的外周血淋巴细胞的增殖情况。
图30-32显示用不同Betv1制剂刺激的T细胞的细胞因子特征。图30显示具有Th0特征的患者，特征31为Th1特征，图32为Th2特征。
图33显示rBetv1.2801(·)(野生型)和带有12个突变的rBetv1 3007突变体[Δ]的圆二色性(CD)谱，接近等浓度下记录。显示了15℃下获得的圆二色性(CD)谱的覆盖图
图34显示用rBetv1.2801(·)(野生型)和带有12个突变的rBetv1(3007)突变体[Δ]抑制生物素标记的rBetv1.2801与桦木过敏反应患者血清IgE集合的结合。
发明目的
本发明的目的是提供改进的重组突变过敏原蛋白。
本发明的基本原理
本发明以独特的原理为基础。根据该基本原理，成功的过敏反应接种的机制不改变正在进行的Th2型免疫应答，而同时起动涉及由B细胞识别的三级结构表位以及形成抗体的一种新的免疫应答。可以相信该新型免疫反应部分属于Th1型免疫应答。当疫苗(或药用组合物)通过非呼吸道的其它途径用药时，假定新的免疫应答在身体上不同于正在进行Th2应答的部位发生，从而使得两种应答同时存在。
另外，本发明还基于发现了过敏症状是由具有至少两个特异性IgE的过敏原通过高亲合性IgE受体，FcεRI而交联所引发的，所述IgE与效应细胞，即肥大细胞和嗜碱性粒细胞的表面结合。为进行说明，我们参见图1，其描绘了一种过敏原具有3种IgE结合表位的理论模型。诱导介体从肥大细胞释放，从而通过过敏原介导的肥大细胞表面的IgE交联引发过敏症状，比较图1A。在图1B所示的情况中，表位的2个位点已被突变以减少其IgE结合能力，从而避免了过敏原介导的交联。在这种连接情况下应该注意到过敏原通常含的B细胞表位都多于3个。
为了使突变过敏原能够产生包括IgG反应在内的一种新型免疫应答，该突变过敏原必须包含至少一个完整的表位或仅被轻微改变的表位。轻微改变表位的表面构形优选类似原始表位，可以形成更多IgG抗体。这些新的IgG抗体具有特异性，能够竞争并若干程度地取代IgE结合天然过敏原。另外，可以假设：已被突变以消除或减少其IgE结合能力的表位越多，则过敏疫苗给药后过敏原介导的交联和所引起过敏症状的风险就越小。
根据这一基本原理，过敏原具有α-碳骨架三级结构必需基本上相似于天然过敏原。
以前已假定适于突变的位点仅位于被认为含有主要的IgE结合表位的保守氨基酸残基的区域。但是，根据本发明，似乎适于突变的表面暴露氨基酸残基同时包含高度保守残基和不保守残基或者轻微保守的残基。这种氨基酸残基似乎分布于整个分子表面，倾向于形成小基团，覆盖着分子表面的特定区域。
因此，根据本发明，适于突变的表面暴露氨基酸可以分成若干组，如图2所示。分组是根据这些氨基酸残基形成分离区域的倾向性进行，分组还不依赖于氨基酸残基的保守程度。每组代表许多表面暴露的氨基酸残基，所述氨基酸是在过敏原表面的有限区域内发现。每个单独的组很可能含有至少一个表位的一部分或至少一个完整表位。每个单独的组还可能含有通过突变导致温和改变的表位的氨基酸位点以及通过突变形成更剧烈改变的表位的氨基酸位点。如果原始氨基酸残基被化学性质类似的氨基酸取代(如用疏水氨基酸取代另一个疏水氨基酸)，那么一个单独的氨基酸通常会形成温和改变的表位。总之，通过从指定各组的至少四组氨基酸残基中选择突变可以提供一种工具，从而可以获得本发明的突变过敏原，该过敏原是在几种B细胞表位进行突变并且具有与天然过敏原类似的α-碳骨架结构。
本发明的另一重要方面是突变过敏原维持着连续表面区域，该区域面积大约为400-8002，其中不含突变或仅含温和突变。据信过敏原含有大量潜在的针对特定IgE的结合区域，其中每个区域的面积大约为8002。
本发明的发明理念基于对突变过敏原的下述认识：过敏原含有能够将IgE结合力减少的突变(该突变选自至少4个规定的组，每一组都含有表面暴露的适于突变的氨基酸)，但是保留至少一个完整的或温和改变的表位，这种过敏原一方面能够减少过敏原介导的交联，另一方面可以产生有与IgE竞争的结合能力的IgG反应。因此，所述突变过敏原构成了非常有利的过敏原，因为过敏反应的风险被大大减少。该突变过敏原能够以相当高剂量用药以提高其在产生保护性免疫应答中的效力而不损失其安全性。
而且，本发明基于认识到含有不同的这种突变过敏原的疫苗在诱导对过敏症状的保护能力上与其天然过敏原等效，其中许多或全部表位理想地不发生变化或仅在不同突变过敏原发生温和改变。
发明简述
本发明涉及向过敏原中导入氨基酸取代。该氨基酸取代选自至少4组适于进行氨基酸取代的氨基酸组。其目的是减少每个突变表位的特异性IgE结合能力但同时还在该突变过敏原上维持至少一个完整或仅温和改变的表位。
本发明具体涉及一种重组Betv1过敏原，其特征在于它是天然Betv1过敏原的突变体，其中：
突变维持了与所述天然过敏原基本上相同的α-碳骨架三级结构，
突变含有至少4个一级突变，与天然Betv1过敏原的IgE结合能力相比，每种突变都能够将突变过敏原的特异性IgE结合能力降低，
每种一级突变都是一种表面暴露的氨基酸残基被另一种残基所取代，
该突变位点的放置方式应符合下述：在至少一块400-8002的面积内不含有突变或仅含有一个或多个温和突变，
该一级突变选自下述10组中的至少4组，每组均含有适于氨基酸取代的表面暴露的氨基酸位点：
组1：A130，E131，K134，A135，K137，E138，E141，T142，R145；
组2：V2，F3，N4，Y5，E6，T7，K119；
组3：D27，S39，S40，Y41，E42，N43，I44，E45，G46，N47，P50，G51，K55，D72，E73；
组4：E8，T10，V12，P14，V105，A106，T107，P108，D109，G110，I113，K115；
组5：A16，K20，S149，Y150，L152，A153，H154，S155，D156，Y158，N159，+160，其中+160代表N-末端氨基酸的增加；
组6：L24，D25，N28，K32；
组7；H76，T77，N78，F79，K80，E101，K103；
组8：K68，R70，I86，E87，E96，K97；
组9：G1，G92，D93，T94，K123，G124，D125，H126，E127，K129；
组10：P35，Q36，E60，G61，P63，F64，K65，Y66；
其前提条件是：重组Betv1过敏原不是下述特定突变体：(Asn28Thr，Lys32Gln，Asn78Lys，Lys103Val，Arg145Glu，Asp156His，+160Asn)；(Tyr5Val，Glu42Ser，Glu45Ser，Asn78Lys，Lys103Val，Lys123Ile，Lys134Glu，Asp156His)；(Tyr5Val，Glu45Ser，Lys65Asn，Lys97Ser，Lys134Glu)；(Ala16Pro，Asn28Thr，Lys32Gin，Lys103Thr，Pro108Gly，Leu152Lys，Ala153Gly，Ser55Pro)；(N28T，K32Q，N78K，K103V，P108G，R145E，D156H，+160N)；(Tyr5Val，Lys134Glu，Asn28Thr，Lys32Gln，Glu45Ser，Lys65Asn，Asn78Lys，Lys103Val，Lys97Ser，Pro108Gly，Arg145Glu，Asp156His，+160Asn)；(Tyr5Val，Lys134Glu，Glu42Ser，Glu45Ser，Asn78Lys，Lys103Val，Lys123Ile，Asp156His，+160Asn)；(Asn28Thr，Lys32Gln，Lys65Asn，Glu96Leu，Lys97Ser，Pro108Gly，Asp109Asn，Asp125Tyr，Glu127Ser，Arg145Glu)；(Y5V，N28T，K32Q，E42S，E45S，N78K，K103V，P108G，K123I，K134E，D156H，+160N)；(Y5V，E42S，E45S，K65N，N78K，K97S，K103V，K123I，K134E，D156H，+160N)；和(Y5V，N28T，K32Q，E42S，E45S，K65N，N78K，K97S，K103V，P108G，K123I，K134E，D156H，+160N)。
更具体地，本发明涉及一种重组Betv1过敏原，其中一级突变选自下述10组中的至少4组，每组均含有适于下述氨基酸取代的表面暴露的氨基酸位点：
组1：A130：A130V，A130G，A1301，A130L，A130S，A130H，A130T；E131：E131D，E131H，E131K，E131R，E131S；K134：K134R，K134H，K134S，K134Q，K1341，K134E；A135：A135V，A135G，A1351，A135L，A135S，A135H，A135T；K137：K137R，K137H，K137S，K137Q，K1371，K137E；E138：E138D，E138H，E138K，E138R，E138S，E138N；E141：E141D，E141H，E141K，E141R，E141S；T142：T142A，T142S，T142L，T142V，T142D，T142K，T142N；R145：R145K，R145H，R145T，R145D，R145E；
组2：V2：V2A，V21，V2K，V2L，V2R，V2T；F3：F3H，F3W，F3S，F3D；N4：N4H，N4K，N4M，N4Q，N4R；Y5：Y5D，Y5G，Y5H，Y51，Y5K，Y5V；E6：E6D，E6H，E6K，E6R，E6S；T7：T7P，T7S，T7L，T7V，T7D，T7K，T7N；K119：K119R，K119H，K119S，K119Q，K119I，K119E，K119N；
组3：D27：D27E，D27H，D27K，D27R，D27S；S39：S39T，S39L，S39V，S39D，S39K；S40：S40T，S40L，S40V，S40D，S40K；Y41：Y41D，Y41G，Y41H，Y41I，Y41K，Y41V；E42：E42S，E42D，E42H，E42K，E42R；N43：N43H，N43K，N43M，N43Q，N43R；I44：I44L，I44K，I44R，I44D；E45：E45S，E45D，E45H，E45K，E45R；G46：G46N，G46H，G46K，G46M，G46Q，G46R；N47：N47H，N47K，N47M，N47Q，N47R；P50：P50G；G51：G51N，G51H，G51K，G51M，G51Q，G51R；K55：K55R，K55H，K55S，K55Q，K551，K55E，K55N；D72：D72E，D72S，D72H，D72R，D72K；E73：E73D，E73S，E73H，E73R，E73K；
组4：E8：E8D，E8H，E8K，E8R，E8S；T10：T10P，T10S，T10L，T10V，T10D，T10K，T10N；V12：V12A，V121，V12K，V12L，V12R，V12T；P14：P14G；V105：V105A，V1051，V105K，V105L，V105R，V105T；A106：A106V，A106G，A1061，A106L，A106S，A106H，A106T；T107：T107A，T107S，T107L，T107V，T107D，T107K，T107N；P108：P108G；D109：D109N D109E，D109S，D109H，D109R，D109K；G110：G110N，G110H，G110K，G110M，G110Q，G110R；I113：I113L，I113K，I113R，I113D，K115：K115R，K115H，K115S，K115Q，K151，K115E，K115N；
组5：A16：A16V，A16G，A16I，A16L，A16S，A16H，A16T；K20：K20R，K20H，K20S，K20Q，K20I，K20E，K20N；S149：S149T，S149L，S149V，S149D，S149K；Y150：Y150T，Y150L，Y150V，Y150D，Y150K；L152：L152A，L152V，L152G，L1521，L152S，L152H，L152T；A153：A153V，A153G，A153I，A153L，A153S，A153H，A153T；H154：H154W，H154F，H154S，H154D；S155：S155T，S155L，S155V，S155D，S155K；D156：D156H，D156E，D156S，D156R，D156K；Y158：Y158D，Y158G，Y158H，Y158I，Y158K，Y158V；N159：N159H，N159K，N159M，N159Q，N159R，N159G，+160N；
组6：L24：L24A，L24V，L24G，L24I，L24S，L24H，L24T；D25：D25E，D25H，D25K，D25R，D25S；N28：N28H，N28K，N28M，N28Q，N28R，N28T；K32：K32Q，K32R，K32N，K32H，K32S，K321，K32E；
组7：H76：H76W，H76F，H76S，H76D；T77：T77A，T77S，T77L，T77V，T77D，T77K，T77N；N78：N78H，N78K，N78M，N78Q，N78R；F79：F79H，F79W，F79S，F79D；K80：K80R，K80H，K80S，K80Q，K801，K80E，K80N；E101：E101D，E101H，E101K，E101R，E101S；K103：K103R，K103H，K103S，K103Q，K103I，K103E，K103V；
组8：K68：K68R，K68H，K68S，K68Q，K681，K68E，K68N；R70：R70K，R70H，R70T，R70D，R70E，R70N；I86：I86L，I86K，I86R，I86D；E87：E87D，E87H，E87K，E87R，E87S，E87A；E96：E96D，E96H，E96K，E96R，E96S，E96L；K97：K97R，K97H，K97S，K97Q，K971，K97E；
组9：G1：G1N，G1H，G1K，G1M，G1Q，G1R；G92：G92N，G92H，G92K，G92M，G92Q，G92R；D93：D93N，D93E，D93S，D93H，D93R，D93K；T94：T94A，T94S，T94L，T94V，T94D，T94K，T94N；K123：K123R，K123H，K123S，K123Q，K123I，K123E；G124：G124N，G124H，G124K，G124M，G124Q，G124R；D125：D125E，D125H，D125K，D125R，D125S，D125Y；H126：H126W，H126F，H126S，H126D；E127：E127D，E127H，E127K，E127R，E127S；K129：K129R，K129H，K129S，K129Q，K129I，K129E，K129N；
组10：P35：P35G；Q36：Q36K，Q36R，Q36N，Q36H，Q36S，Q36I，Q36E；E60：E60H，E60K，E60M，E60Q，E60R；G61：G61N，G61H，G61K，G61M，G61Q，G61R；P63：P63G；F64：F64H，F64W，F64S，F64D；K65：K65R，K65H，K65S，K65Q，K651，K65E，K65N；Y66：Y66D，Y66G，Y66H，Y661，Y66K，Y66V。
本发明还涉及一种重组Betv1突变过敏原，其含有选自下述10组中的至少4组的取代：
组1：A130V，K134E，E141N，
组2：V2L，Y5V，E6S，K119N，
组3：E42S，E45S，N47K，K55N，E73S，E73T，E73S，
组4：E8S，T10P，P14G，P108G，D19N，K115N，
组5：A16G，K20S，S149T L152A A153V，S155T，N159G，+160N，
组6：L24A，D25E，N28T，K32Q，
组7：T77A，T77N，N78K，K103V，
组8：R70N，E87A，E96S，K97S，
组9：D93S，K123I，D125Y，K129N，
组10：Q36N，E60S，G61S，P63G。
本发明还涉及一种重组Betv1突变过敏原，其含有选自下述10组中的至少4组的取代：
组1：K134E，
组2：Y5V，K119N，V2L，
组3：E45S，E42S，K55N，N47K，E73S，
组4：E96S，K97S，P108G，D109N，T10N，K115N，P14G，
组5：N159G，+160N，S149T，A153V，L152A，A16G，K20S，
组6：N28T，K32Q，L24A，
组7：K103V，T77N，N78K，
组8：E96S，K97S，E87A，
组9：K129N，D125Y，K123I，D93S，
组10：E60S，Q36N，G61S，P63G。
本发明还涉及下述：
可以用作药物以及用于预防和/或治疗桦木花粉过敏反应的药物的重组Betv1过敏原变体
含有两种或多种不同的本发明重组突变Betv1过敏原变体的组合物，其中每种变体均具有至少一种一级突变，该突变在至少另一变体中不存在。该组合物含有2-12，优选3-10，更优选4-9，最优选5-8种变体。本发明的组合物可用作药物并可用于制备预防和/或治疗桦木花粉过敏反应的药物。该药物组合物优选含有药学上可接受的载体，和/或赋形剂，以及任选的佐剂。
疫苗形式的药物组合物，其针对桦木花粉过敏患者中由天然Betv1过敏原引起的过敏反应。
在个体体内产生免疫反应的方法，包括对个体施用重组过敏原，组合物或药物组合物。
个体的免疫接种或治疗，包括对个体施用重组过敏原，组合物或药物组合物。
制备药物组合物的方法，包括将重组过敏原或组合物与药学上可接受物质和/或赋形剂混合。
治疗，预防或减轻个体过敏反应的方法，包括对个体施用重组Betv1过敏原，组合物或药物组合物。
制备重组Betv1过敏原的方法，特征在于氨基酸取代是通过定点突变，或DNA改组(shuffling)(分子育种)(Punnonen等，参考文献25)进行。
编码重组Betv1过敏原的DNA序列，其衍生物，其部分序列，其简并序列或在严谨条件下能够与其杂交的序列，其中所述衍生物，部分序列，简并序列或杂交序列编码具有至少一种B细胞表位的肽。
由编码天然过敏原的DNA序列所衍生的DNA序列。编码该衍生物的DNA序列是通过对天然Betv1过敏原的DNA编码序列进行定点突变获得。
含有重组Betv1变体的DNA编码序列的表达载体，含有该表达载体的宿主细胞，以及生产重组Betv1突变体的方法，其包括培养该宿主细胞。
重组Betv1过敏原或由下述DNA序列所编码的Betv1过敏原：含有至少一个T细胞表位的DNA序列，所述表位能够刺激对天然Betv1过敏原特异的T细胞克隆或T细胞系。
评价使用重组Betv1过敏原或组合物治疗患者的疗法的相关性，安全度或效果的诊断试验，其中将患者的含IgE样品与所述突变或组合物混合，评价所述样品中IgE和所述突变体之间的反应性水平。
本发明的详细描述
在本发明中，“与天然过敏原的IgE结合能力相比，特异性IgE结合能力有所降低”是指这种减少在至少一种免疫试验中以统计学显著水平(p＜0.05)被测量到，所述试验中使用对天然过敏原过敏的个体的血清。优选地，该IgE结合能力被降低至少10％，更优选至少30％，更优选至少50％，最优选至少70％。
“表面暴露的氨基酸”指氨基酸残基位于3维结构的表面，其方式是当过敏原在溶液中时，该氨基酸残基的至少一个原子的至少一部分可以被周围的溶剂接触到。优选该氨基酸残基在3维结构中具有至少20％的溶剂(水)可接近性，优选至少30％，更优选至少40％，最优选至少50％。
“溶剂可接近性”定义为与半径同溶剂分子(水，r＝1.4)相当的球体可接近的分子区域。“表面暴露”和“溶剂暴露”可互换使用。
“氨基酸的组”应理解为表面暴露的适于突变的氨基酸的集合。每组代表许多表面暴露的氨基酸残基，所述氨基酸是在过敏原表面的有限区域内发现。每个单独的组含有许多氨基酸，这些氨基酸是至少一个表位的一部分。每个单独的组还可能含盖一个包含一个完整表位的区域。在一个组内的一个或多个突变被定义为一种一级突变。带有至少4个一级突变的突变过敏原能够确保几种表位对IgE结合亲合力有所降低。来自至少4组氨基酸的突变还可进一步确保突变在分子表面大约呈均匀分布，并确保几个表位产生突变从而导致几个表位与IgE结合亲合力有所降低(与所带有突变少于4个突变的突变体相比)。
“天然过敏原来源的分类学种”是指在所述天然过敏原起源的分类学属，优选亚科，更优选科，更优选超家族，更优选团(legion)，更优选亚目，最优选目中的种。
“温和改变的表位”指维持着与相应未突变表位基本相同的三级结构和表面拓扑学的表位。温和改变通常是用与原始氨基酸化学特性类似的氨基酸取代该原始氨基酸而获得。一种获得方法是用天然过敏原所在的分类学目内可能发现的氨基酸取代一个或多个表面暴露的氨基酸。温和改变的表位还可能含有这样的氨基酸取代：其中一个或多个取代的氨基酸并未在天然过敏原所在的分类学目内发现，只要该取代可以轻微地影响表位的三级结构和/或IgE结合亲合性。该突变过敏原可以从结构和随后的IgE结合亲合性角度进行评价。与温和改变表位相反的是被剧烈改变的表位，如能够显著降低IgE结合亲合力的突变。通常，表位的剧烈改变包括用不同化学性质的氨基酸替换一个或多个氨基酸的取代。
另外，“具有与天然过敏原基本相同的α-碳骨架三级结构的突变过敏原”指当比较突变和天然过敏原的结构时，原子坐标的平均均方根差优选小于2。通过在突变前和突变后进行x射线晶体照相术或NMR获得同一结构来精确地测定α-碳骨架三级结构的保守性。如果与分析结构被测定分子所获的数据相比，在没有描述突变的结构数据时，无差别的CD光谱或免疫化学数据(如抗体反应性)可以认为α-碳骨架三级结构的是保守的。
本发明中“突变”指与天然过敏原的氨基酸序列相比，存在氨基酸的缺失，取代或增加。该术语“突变”和“取代”可互换使用。本发明的重组突变Betv1还可进一步含有氨基酸插入或氨基酸缺失，特别是在该分子的表面暴露区域，如“环区域”。环区域联系着二级结构元件，如β折叠，α螺旋和随机缠绕结构。Betv1中的环区域为Val12到ala16，val33到ser40，glu45到Thr52，pro54到tyr66，his76到asn78，gly89到glu96，val105到gly111，thr122到glu131。突变体在环区域可含有1-5，优选1-3，最优选1-2个取代。
一级突变定义为在表面暴露、适于突变的氨基酸的单个组内的一个或多个突变。至少一个突变氨基酸的各组会减少IgE结合亲合力(与不带突变的相同组相比)。优选本发明的重组过敏原含有5-10，优选6-10，更优选7-10，最优选8-10个一级突变。
二级突变定义为单个组内额外的突变。该重组过敏原优选含有多个二级突变，与天然过敏原的结合能力相比，每个二级突变均会降低该突变过敏原与IgE的结合能力。因此，含有几个二级突变的一级突变在许多情况下其IgE结合亲合力可能比仅具有一种突变的一级突变更低。本发明的重组过敏原的每个一级突变含有1-15，优选1-10，最优选1-5个二级突变。
保守残基：天然过敏原中的保守残基与该过敏原起源物种内所有已知同源蛋白具有高于70％，优选80％，最优选90％的同源性。高度溶剂暴露并保守的氨基酸残基构成了取代的靶位。
突变所致的IgE结合力减少和介导交联能力减少的另一评价方法是突变抑制组胺释放(HR)的能力。可通过几种组胺释放试验测定组胺的释放。突变体的组胺释放减少量来自于与细胞表面结合的IgE的特异亲合力的减少，以及其对交联促进作用能力的降低。与天然过敏原相比，优选本发明突变体的组胺被降低5-100％，更优选25-100％，更优选50-100％，最优选75-100％。
在本发明的优选实施例中，不含突变或仅含温和突变的表面区域面积为8002，优选6002，更优选5002，最优选4002。通常一个不含突变或仅含温和突变的8002面积表面区域内含有15-25个氨基酸残基的原子。
另一实施例中，至少一个要结合入过敏原突变体的氨基酸残基在该天然存在的过敏原所属分类学属，优选亚科，更优选科，更优选超家族，更优选团(legion)，更优选亚目且最优选目中任何已如同源蛋白质氨基酸序列的相同位置上不出现。
根据本发明，将表面暴露的氨基酸残基按照溶剂可接近性排序，且溶剂可接近性较大的氨基酸中的至少4个氨基酸被取代。
另一实施例中，重组过敏原的特征在于将表面暴露的氨基酸残基按其在该天然存在的过敏原的分类学种中的所有已知同源蛋白质中的保守程度而排序，且将处于较高保守程度的氨基酸中的一个或多个替换。
本发明所公开的原则包括将选自至少4组氨基酸的表面暴露氨基酸残基突变，其中每组代表该分子表面的分离区域。该原则还适用于Betv1之外的过敏原。本发明的重组过敏原可适当地为吸入性过敏原突变体，理论上来源于树、草、草本植物、真菌、屋尘螨、蟑螂和动物毛发和皮屑。来自树、草和草本植物的重要花粉过敏原是源自山毛榉(Fagales)、木犀目(Oleales)和松目(Pinales)分类目的这些，理论上包括桦木(桦木属(Betula))、桤木(桤木属(Alnus))、榛树(榛属(Corylus))、角树(鹅耳枥属(Carpinus))和橄榄树(齐墩果属(OIe))，禾目(Poales)目理论上包括黑麦草属(Lolium)、猫尾草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、狗牙根属(Cynodon)、鸭茅属(Dactylis)和黑麦属(Secale)等属的草，菊目(Asterales)和荨麻目(Urticales)理论上包括豚草属(Ambrosia)和蒿属(Artemisia)的草本植物。来自真菌的重要吸入性过敏原理论上为源自链格孢属(Alternaria)和芽枝霉属(Cladosporium)的这些。其他重要吸入性过敏原来自嗜皮螨属的屋尘螨、来自蟑螂和来自哺乳动物如猫、狗和马。更进一步地，本发明的重组过敏原可为毒液过敏原的突变体，包括来自刺人的或咬人的昆虫，例如来自膜翅目，包括蜜蜂(蜜蜂总科(Apidae))，黄蜂(胡蜂总科(Vespidae))和蚂蚁(蚁总科(Formicoidae))。
特异的过敏原成分包括如山毛榉(Fagales)目的Betv1(白桦(B.verrucosa)，桦木)，Alng1(胶桤木(Alnus glutinosa)桤木)，Cora1(Corylus avelana，榛子)和Carb1(桦叶鹅耳枥(Carpinus betulus)角树)。其他的为Cryj1(松目)，Amba1和2，Artv1(菊目)，Parj1(荨麻目)，Olee1(木犀目)，Avee1，Cynd1，Dacg1，Fesp1，Hol11，Lolp1和5，Pasn1，Phlp1和5，Poap1，2和5，Secc1和5，及Sorh1(各种草的花粉)，Alta1和Clah1(真菌)，Derf1和2，Derp1和2(屋尘螨，分别为粉尘螨(D.farinae)和屋尘螨(D.pteronyssinus))，Eurm1(螨，Euroglyphus maynei)，(Lepd1和2(Lepidoglyphus destructor；贮藏螨(storage mite)，Blag1和2，Pera1(蟑螂，分别为德国小蠊(Blatella germanica)和美洲大蠊(Periplaneta americana))，Feld1(猫)，Canf1(狗)，Equc1，2和3(马)，Apism1和2(蜜蜂)，Vesv1，2和5，Pola1，2和5(均为黄蜂)和Soli1，2，3和4(火蚁)。
向指定突变体中导入额外取代的一些实例
在本发明的一个实例中突变过敏原被进一步导入了取代，该取代方式能够确保最终突变过敏原的取代可以均匀地分布在分子表面，并且各组含有的导入突变的数目基本相同。这可用下述实施例说明，其中含有特定取代的突变体优选被进一步导入了选自列表的取代，该表中氨基酸的顺序反应出导入更多取代的优选顺序。这些实施例代表如何设计突变的一种应用，而并非限制本发明，本领域技术人员显而易见地可以对其进行改变以确保突变呈均匀分布。突变可以被设计成含有下述指定列表的一个或多个取代。
含有下述取代的Betv1突变体(“3004A”)过敏原：Y5V，E45S，N78K，K97S，K103V，K134E，+160N。还可进一步含有一个或多个下述取代：E8或K115，D125或H126，E138或K137或E141，D25或N28，E87或K55，S155或H154或N159，N47或P50或H76或N43或I44或R70，E73或P50或D72，A130，N28或D25，P108，V2或K119或N4或E6或E96。
含有下述取代的Betv1突变体(″3004B″)过敏原：Y5V，E45S，L62F，N78K，K97S，K103V，K134E，+160N。还可进一步含有一个或多个下述取代：T10P，K65N，N28或D25或K32Q或E141X或K137X或E138X，D125X或K123I或H126，P108X或D109N，E42S或K55X或I44X或N43X，E73X或D72X，E87X，E96X或K119，A130X，V2X或E6X，E8X或K115，N47X或P50X或R70X或H76X或T77A，S155X或D156H或N159X，E6X或V2X。
含有下述取代的Betv1突变体(″3005A″)过敏原：Y5V，N28T，K32Q，E45S，L62F，N78K，K97S，K103V，K134E，+160N。还可进一步含有一个或多个下述取代：E8X或K115X，D125或H126，E138X或K137X或E141X，E87X或K55X，S155X或H154X或N159X，N47X或P50X或H76X或N43X或I44X或R70X，E73X或P50X或D72X，A130X，D25X，P108X，V2X或K119X或N4X或E6X或E96X。
含有下述取代的Betv1突变体(″3005B″)过敏原：Y5V，N28T，K32Q，E45S，L62F，N78K，K97S，K103V，K134E，+160N。还可进一步含有一个或多个下述取代：T10P，K65N，E141X或K137X或E138X，D125X或K123I或H126X，P108X或D109N，E42S或K55X或I44X或N43X，E73X或D72X，E87X，E96X或K119X，A130X，V2X或E6X，E8X或K115X，N47X或P50X或R70X或H76X或T77A，S155X或D156H或N159X，E6X或V2X。
含有下述取代的Betv1突变体(“3006A”)过敏原：Y5V，N28T，K32Q，E45S，N78K，E87S，K97S，K103V，K134E，N159G，+160N。还可进一步含有一个或多个下述取代：K55，A138或K137或E141，D125或H126，P108，V2或N4或K119或E6，S155或H154，N47或P50或H76，E73，R70，A130，E8或K115，E96。
含有下述取代的Betv1突变体(″3006B″)过敏原：Y5V，N28T，K32Q，E45S，N78K，E87S，K97S，K103V，K134E，N159G，+160N。还可进一步含有一个或多个下述取代：K65N，T10P，D125，K123I，P108，D109N，N47或P50或H76，E138或K137或E141，E42S或K55或I44或N43，S155或D156H，E73或D72，E6或V2，E96。
含有下述取代的Betv1突变体(″3007A″)过敏原：Y5V，N28T，K32Q，E45S，L62F，N78K，K97S，K103V，P108G，D125Y，K134E，+160N。还可进一步含有一个或多个下述取代：E87，E141，E138，K55，N47或N43X或I44或H76，S155或H154，A130，E8，E73，V2或K119，D25。
含有下述取代的Betv1突变体(″3007B″)过敏原：Y5V，N28T，K32Q，E45S，L62F，N78K，K97S，K103V，P108G，D125Y，K134E，+160N。还可进一步含有一个或多个下述取代：K65N，T10P或E8，E87，S155或D156H，E138，E141，E42S，A130，E8或T10P，N47，H76，R70，E96。
含有下述取代的Betv1突变体(″3008A″)过敏原：Y5V，N28T，K32Q，E45S，L62F，E73S，E96S，P108G，D125Y，N159G，+160N。还可进一步含有一个或多个下述取代：E134，N78，E87，K119，E8，K55，E138，E141，S155，N47，E6，K103，D25，A130，V2，R70。
含有下述取代的Betv1突变体(″3008B″)过敏原：Y5V，N28T，K32Q，E45S，L62F，E73S，E96S，P108G，D125Y，N159G，+160N。还可进一步含有一个或多个下述取代：K65N或K55，T10P或E8或E141，E138或K134，E87，E42S或K55或I44，S155或D156H，N78，K119或V2或N4，N47或P50，H76或T77A，A130，D25，E6或K115或K103。
含有下述取代的Betv1突变体(″3009A″)过敏原：Y5V，N28T，K32Q，E45S，L62F，E96S，P108G，+160N。还可进一步含有一个或多个下述取代：E134，N78，E87，K119，E8，K55，E138，E141，S155，N47，E6，K103，D25，A130，V2，R70。
含有下述取代的Betv1突变体(″3009B″)过敏原：Y5V，N28T，K32Q，E45S，L62F，E96S，P108G，+160N。还可进一步含有一个或多个下述取代：N78或T77A，K103，E134或E138，K65N或K55，T10P，D125或H126，S155或D156H或HIS154，K119或V2，E87，N47或P50或H76，E42S或K55，I44或N43，A130。
环突变
在本发明突变过敏原的另一实施方案中还进一步含有氨基酸插入或氨基酸缺失，特别是在分子的表面暴露区域，如环区域。环区域联系着二级结构元件，如β折叠，α螺旋和随机缠绕结构。Betv1中的环区域为：Val12到ala16，val33到ser40，glu45到Thr52，pro54到tyr66，his76到asn78，gly89到g1u96，Val105到gly111，thr122到glu131。本发明突变体在环区域可含有1-5，优选1-3，最优选1-2个取代。在一个优选实施方案中，突变过敏原含有选自10组的至少4个突变，以及一些额外的“环突变”。这种“环突变”(其中x代表加入的氨基酸残基)的实例为：
在残基B60和残基G61之间带有氨基酸插入的Betv1(3007-L1)：
GVFNVETETTSVIPAARLFKAFILDGDTLFPQVAPQAISSVENISGNGGPGTI
KKISFPExGFPFKYVKDRVDEVDHTKFKYNYSVIEGGPIGDTLESISNEIVIVA
TGDGGSILKISNKYHTKGYHEVKAEQVEASKEMGETLLRAVESYLLAHSDA
YNN
在残基D93和残基T94之间带有氨基酸插入的Betv1(3007-L2)：
GVFNVETETTSVIPAARLFKAFILDGDTLFPQVAPQAISSVENISGNGGPGTI
KKISFPEGFPFKYVKDRVDEVDHTKFKYNYSVIEGGPIGDxTLESISNEIVIVA
TGDGGSILKISNKYHTKGYHEVKAEQVEASKEMGETLLRAVESYLLAHSDA
YNN
在残基V12和残基113之间带有氨基酸插入的Betv1(3007-L3)：
GVFNVETETTSVxIPAARLFKAFILDGDTLFPQVAPQAISSVENISGNGGPGT
IKKISFPEGFPFKYVKDRVDEVDHTKFKYNYSVIEGGPIGDTLESISNEIVIVA
TGDGGSILKISNKYHTKGYHEVKAEQVEASKEMGETLLRAVESYLLAHSDA
YNN
在残基156和残基S57以及残基K65和残基T66之间带有氨基酸插入的Betv1(3007-L4)：
GVFNVETETTSVIPAARLFKAFILDGDTLFPQVAPQAISSVENISGNGGPGTI
KKIxSFPExGFPFKYVKDRVDEVDHTkFKYNYSVIEGGPIGDTLESISNEIVIV
ATGDGGSILKISNKYHTKGYHEVKAEQVEASKEMGETLLRAVESYLLAHSD
AYNN
残基G111位点缺失的Betv1(3007-L5)：
GVFNVETETTSVIPAARLFKAFILDGDTLFPQVAPQAISSVENISGNGGPGTI
KKISFPEGFPFKYVKDRVDEVDHTKFKYNYSVIEGGPIGDTLESISNEIVIVAT
GDGSILKISNKYHTKGYHEVKAEQVEASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYN
N
根据本发明制备重组过敏原的方法
依照本发明适合于替换的表面暴露的氨基酸可以其溶剂(水)可接近性的信息为基础进行确定，该信息表达了其表面暴露的程度。本发明方法的一个优选实施方案特征在于以溶剂可接近性对其中确定的氨基酸残基进行排序，且在具有较大溶剂可接近性的氨基酸中替换一个或多个。
此外，本发明方法的特别优选的一个实施方案特征在于关于以在该天然存在的过敏原所属物种中所有已知同源蛋白质中的保守程度来对其中确定的氨基酸残基进行排序，并在具有较大保守性的氨基酸中替换一个或多个。
本发明方法更进一步优选的实施方案包含选择确定的氨基酸以形成突变体过敏原，它具有与天然存在的过敏原基本上相同的α碳主链三级结构。
本发明方法的另一个优选实施方案特征在于对氨基酸残基的替换通过定点突变来实现。
本发明方法的另一个优选实施方案特征在于对氨基酸残基的替换通过DNA改组来实现，或通过建立含有适当位点及其优选取代的文库来实现。
取代的标准
对于三级结构已经确定的分子(例如通过X-射线晶体学或NMR电子显微镜方法)带有取代氨基酸的突变体优选应满足下列标准：
1.分子的总体α-碳骨架三级结构优选保守。保守定义为当比较突变和天然过敏原的结构时，原子坐标的平均均方根差小于2。其重要性有2个原因：可预期该天然过敏原的整个表面组成潜在抗体结合表位的重叠连续体。该分子表面的大部分不受取代的影响，从而保留了其抗体结合特性，这对于产生针对也存在于天然过敏原上的表位的新保护性抗体特异性是重要的。b)稳定性，涉及保存期和注射进体液两方面的稳定性。
通过在突变前和突变后进行x射线晶体照相术或NMR获得同一结构来精确地测定α-碳骨架三级结构的保守性。如果与分析结构被测定分子所获的数据相比，在没有描述突变的结构数据的情况下，无差别CD光谱或免疫化学数据(如抗体反应性)可以认为α-碳骨架三级结构的是保守的。
2.待取代的氨基酸优选位于表面，并因此对于抗体结合是可接近的。位于表面的氨基酸通常具有至少20％的溶剂(水)可接近性，合适的是20-80％，更合适的是30-80％的溶剂可接近性。溶剂可接近性定义为同半径与溶剂分子(水，r＝1.4)相当的球体可接近的分子区域。
3.取代的氨基酸选自至少4组。每组代表许多表面暴露的氨基酸残基，所述氨基酸是在过敏原表面的有限区域内发现。在一个组内的一个或多个突变被定义为一个一级突变。每个单独的组含有许多氨基酸，这些氨基酸是至少一个表位的一部分。每个单独的组还可能包含一个完整表位。带有至少4个一级突变的突变过敏原能够确保几种表位对IgE结合亲合力有所降低。来自至少4组氨基酸的突变还可进一步确保突变在分子表面大约呈均匀分布，并确保几个表位产生突变从而导致几个表位与IgE结合亲合力有所降低。
为基本维持过敏原的3维结构，可在与该过敏原同源结构蛋白进行比较的基础上选择导入的氨基酸，如与过敏原属于相同分类学目的蛋白，并且该蛋白与该过敏原不存在任何交联反应。
疫苗
疫苗的制备为本领域众所周知。疫苗一般以可注射的液体溶液或悬浮液的形式制备。这样的疫苗也可以乳化或配制成能够经鼻及经口给药的形式，包括口腔和舌下给药。正被讨论的免疫原性成分(如在此处所限定的重组过敏原)可适当地与药物学上可接受且进一步与活性成分相容的赋形剂混合。适当的赋形剂的实例为水、盐、右旋糖、甘油、乙醇等以及它们的组合。疫苗另外可含有其他的物质，如润湿剂、乳化剂、缓冲剂或增强疫苗效力的佐剂。
疫苗最通常通过皮下或肌内注射以肠胃外方式给药。适合于通过其他途径给药的制剂包括口服制剂和栓剂。经口给药的疫苗可适当地用通常用于这种制剂的赋形剂来调配，如药物等级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠(sodium saccharine)、纤维素、碳酸镁等。组合物可被制备成溶液、悬浮掖、乳剂、片剂、药丸、胶囊、缓释制剂、气溶胶、粉末或颗粒。
疫苗的给药途径应与剂量配方相容，并且其量有治疗有效性且具免疫原性。在疫苗中包含的活性成分的量依赖于治疗对象、理论上被试者响应于治疗的免疫系统对治疗的应答能力、给药途径及被试者的年龄和体重。适当的剂量范围在0.0001μg～1000μg。
如上所述，通过向制备物中添加佐剂可获得增加的作用。这样的佐剂的实例为在磷酸缓冲盐溶液中以0.05％～0.1％溶液存在的氢氧化铝和磷酸盐(明矾)，以0.25％的溶液使用的合成糖类聚合物或聚交酯已交酯(polylactid glycolid)(PLG)。也可采用与细菌细胞诸如小棒杆菌(C.parvum)、革兰氏阴性细菌的内毒素或脂多糖成份的混合物，在诸如缩甘露醇(mannide monoaleate)(AracelA)的生理学上可接受的油类载体中的乳剂，或含有20％全氯化碳(例如，Fluosol-DA)的溶液的乳剂用作封闭取代物。油乳剂，诸如MF-59也可用。也可使用其它佐剂，如弗氏完全和不完全佐剂以及QuilA，Qs-21和ISCOM，RIBI。
最经常地，疫苗的多重给药对确保其作用是必需的。疫苗经常以初次给药后伴随后续接种或其他给药的方式来给药。疫苗接种的数量一般为1～50次，通常不超过35次疫苗接种。疫苗接种通常双周到月地进行3个月到5年的时间。预期这将达到预防或治疗效果的期望水平。
重组过敏原可被用作药物制备物，在症状出现所在年的期间适合于提供某些对抗过敏反应的保护(预防)。通常，必须每年重复治疗以维持保护作用。配制为鼻、口和舌下应用的制备物特别适合于这个目的。
本发明的DNA
本发明的DNA序列是天然Betv1过敏原编码DNA的突变体。天然Betv1分子的实例为SEQ ID NO 1(数据库登录号Z80104)和SEQID NO 2(数据库登录号P15494)。其他的Betv1变体包含具有下述数据库登录号的Betv1序列：P15494＝X15877＝Z80106，Z80101，AJ002107，Z72429，AJ002108，Z80105，Z80100，Z80103，AJ001555，Z80102，AJ002110，Z72436，P43183＝X77271，Z72430，AJ002106，P43178＝X77267，P43179＝X77268，P43177＝X77266，Z72438，P43180＝X77269，AJ001551，P43185＝X77273，AJ001557，Z72434，AJ001556，Z72433＝P43186，AJ001554，X81972，Z72431，P45431＝X77200，P43184＝X77272，P43176＝X77265，S47250，S47251，Z72435，Z72439，Z72437，和S47249。
优选地，该DNA衍生物是通过对天然过敏原编码DNA进行定点或随机或半随机突变产生。
“突变文库”是过敏原突变体的文库。该文库是通过用简并的DNA寡核苷酸引物构建而成，该引物可以在每个位点导入0个、1个或几个不同的氨基酸残基。这样的文库方法可以使氨基酸残基被保守或非保守取代。因为保守取代可以在特定位置导入这种“轻微”或温和突变，不会过多地影响结构的整体性，因此可以增加形成稳定突变体的机会。构建这种突变体文库可以克服由单一或特定结合的突变所引起的突变过敏原蛋白质稳定性缺陷。“半随机文库”指待突变的位点被限制在表面暴露的那些氨基酸残基之中。该方法还可提高获得稳定突变过敏原的可能性。“半随机”还意味着设计的引物可以允许在选定位置用选定数目的氨基酸进行取代。这两种半随机方法可独立应用，或组合应用。理论上，本发明的文库含有许多rBetv1突变过敏原，与未突变的Betv1相比，每个突变过敏原都具有至少4个氨基酸取代。
在一个实施例中，构建了一个基于rBetv1(2744)(突变位点Y5，E42，E45，N78，K103，K123，K134，D156，+160)和rBetv1(2628)(位点位点Y5，E45，K65，K97，K134)的半随机文库，并在过敏原表面靶定额外7个位点：T10，K20，Q36，E73，E87，K129和S149。这7个位点选自位于Fagales过敏原中共有的外部连贯表面区域的表面区域。该文库是基于简并DNA寡核苷酸引物的应用，该引物能够在各位点导入不同氨基酸残基。另外，在rBetv1(2744)和rBetv1(2628)中的几个突变氨基酸残基位点可以继续维持，或突变回WT rBet v1.2801中发现的残基。
另一实施例中构建了基于rBetv1(2744)和rBetv1(2628)及rBetv1(2595)即N28，K32，E45，P108的半随机文库，其中在过敏原表面靶定了额外7个靶位点：T10，K20，Q36，E73，E87，K129和S149。
突变体
以下列出了本发明特定Betv1过敏原突变体的实例。突变的氨基酸位点用黑体小写字体显示：
Betv1(“3004”)(SEQ ID NO 3)：
GVFNvETETTSVIPAARLFKAFILDGDNLFPKVAPQAISSVsNIEGNGGPGTIK
KISFPEGfPFKYVKDRVDEVDHTkFKYNYSVIEGGPIGDTLEsISNEIvIVATPD
GGSILKISNKYHTKGDHEVKAEQVeASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYNn
Betv1(“3005”)(SEQ ID NO 4)：
GVFNvETETTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVENIsGNGGPGTIKK
ISFPEGfPFKYVKDRVDEVDHTkFKYNYSVIEGGPIGDTLEsISNEIvIVATPDG
GSILKISNKYHTKGDHEVKAEQVeASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYNn
Betv1(“3007”)(SEQ ID NO 5)：
GVFNvETETTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVENIsGNGGPGTIKK
ISFPEGfPFKYVKDRVDEVDHTkFKYNYSVIEGGPIGDTLEsISNEIvIVATgDG
GSILKISNKYHTKGyHEVKAEQVeASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYNn
Betv1(“3009”)(SEQ ID NO 6)：
GVFNvETETTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVENIsGNGGPGTIKK
ISFPEGfPFKYVKDRVDEVDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLsKISNEIKIVATgD
GGSILKISNKYHTKGDHEVKAEQVKASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYNn
Betv1(“3006”)(SEQ ID NO 7)：
GVFNvETETTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVENIsGNGGPGTIKK
ISFPEGfPFKYVKDRVDEVDHTkFKYNYSVIEGGPIGDTLEsISNEIvIVATPDG
GSILKISNKYHTKGDHEVKAEQVeASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYgn
Betv1(“3008”)(SEQ ID NO 8)：
GVFNvETETTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPkVAPQAISSVENIsGNGGPGTIKK
ISFPEGfPFKYVKDRVDsVDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLsKISNEIKIVATgDG
GSILKISNKYHTKGyHEVKAEQVKASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYgn
本发明还包括下述特定突变体：
Betv1(“3005-7”)(SEQ ID NO 9)：
Y5V，N28T，K32Q，E45S，N78K，K97S，K103V，K134E，+160N，E8S，D125Y，E141S，D25T，E87A，S155T，N47K，K55N.
GVFNvETsTTSVIPAARLFKAFILtGDtLFPqVAPQAISSVENIsGkGGPGTIKnIS
FPEGLPFKYVKDRVDEVDHTkFKYNYSVIaGGPIGDTLEsISNEIvIVATPDGG
SILKISNKYHTKGyHEVKAEQVeASKEMGsTLLRAVESYLLAHtDAYNn
Betv1(“3005-12”)(SEQ ID NO 10)：
Y5V，N28T，K32Q，E45S，N78K，K97S，K103V，K134E，+160N，E8S，D125Y，E141S，D25T，E87A，S155T，N47K，K55N，E73T，A130V，P108G，V2L，
GIFNvETsTTSVIPAARLFKAFILtGDtLFPqVAPQAISSVENIsGkGGPGTIKnIS
FPEGLPFKYVKDRVDtVDHTkFKYNYSVIaGGPIGDTLEsISNEIvIVATgDGGS
ILKISNKYHTKGyHEVKvEQVeASKEMGsTLLRAVESYLLAHtDAYNn
Betv1(“3005-22”)(SEQ ID NO 11)：
Y5V，N28T，K32Q，E45S，N78K，K97S，K103V，K134E，+160N，T10K，K65N，E141N，K123I，D109N，E42S，E73T，E87A，V2L，N47K.
GIFNvETETpSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVsNIsGkGGPGTIKKI
SFPEGLPFnYVKDRVDtVDHTtFKYNYSVIaGGPIGDTLEsISNEIvIVATPnGG
SILKISNKYHTiGDHEVKAEQVeASKEMGnTLLRAVESYLLAHSDAYNn
Betv1(“3005-27”)(SEQ ID NO 12)：
Y5V，N28T，K32Q，E45S，N78K，K97S，K103V，K134E，+160N，T10K，K65N，E141N，K123I，D109N，E42S，E73T，E87A，K119N，A130V，V2L，E8S，N47K，D156H，E6S.
GIFNvsTsTpSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVsNIsGkGGPGTIKKIS
FPEGLPFnYVKDRVDtVDHTtFKYNYSVIaGGPIGDTLEsISNEIvIVATPnGGSI
LKISNKYHTiGDHEVKAEQVeASKEMGnTLLRAVESYLLAHShAYNn
Betv1(“3007-6”)(SEQ ID NO 13)：
Y5V，N28T，K32S，E45S，N78K，K97S K103V，P108G，D125Y，K134E，+160N，E87A，E141N，K55N，N47K，S155T，
GVFNvETETTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVENIsGkGGPGTIKnI
SFPEGLPFKYVKDRVDEVDHTkFKYNYSVIaGGPIGDTLEsISNEIvIVATgDG
GSILKISNKYHTKGyHEVKAEQVeASKEMGnTLLRAVESYLLAHtDAYNn
Betv1(“3007-10”)(SEQ ID NO 14)：
Y5V，N28T，K32S，E45S，N78K，K97S K103V，P108G，D125Y，K134E，+160N，E87A，E141N，K55N，N47K，S155T，A130V，E8S，E73T，V2L.
GIFNvETsTTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVENIsGkGGPGTIKnIS
FPEGLPFKYVKDRVDtVDHTkFKYNYSVIaGGPIGDTLEsISNEIvIVATgDGGS
ILKISNKYHTKGyHEVKvEQVeASKEMGnTLLRAVESYLLAHtDAYNn
Betv1(“3007-17”)(SEQ ID NO 15)：
Y5V，N28T，K32Q，E45S，N78K，K97S，K103V，P108G，D125Y，K134E，+160N，K65N，T10P E87A，D156H，E141N，E42S.
GVFNvETETpSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVsNIsGNGGPGTIKK
ISFPEGLPFnYVKDRVDEVDHTkFKYNYSVIaGGPIGDTLEsISNEIvIVATgDG
GSILKISNKYHTKGyHEVKAEQVeASKEMGnTLLRAVESYLLAHShAYNn
Betv1(“3007-22”)(SEQ ID NO 16)：
Y5V，N28T，K32Q，E45S，N78K，K97S，K103V，P108G，D125Y，K134E，+160N，K65N，T10P E87A，D156H，E141N，E42S，A130V，E8S，N47K，H76T，V2L.
GIFNvETsTpSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVsNIsGkGGPGTIKKIS
FPEGLPFnYVKDRVDEVDtTkFKYNYSVIaGGPIGDTLEsISNEIvIVATgDGGS
ILKISNKYHTKGyHEVKvEQVeASKEMGnTLLRAVESYLLAHShAYNn
Betv1(“3008-8”)(SEQ ID NO 17)：
Y5V，N28T，K32Q，E45S，E73S，E96S，P108G，D125Y，N159G，+160N，K134E，N78K，E87A，K119N，E8S，K55N，E141N，N47K.
GVFNvETsTTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVENIsGkGGPGTIKnI
SFPEGLPFKYVKDRVDsVDHTkFKYNYSVIaGGPIGDTLsKISNEIKIVATgDG
GSILKISNnYHTKGyHEVKAEQVeASKEMGnTLLRAVESYLLAHSDAYgn
Betv1(“3008-13”)(SEQ ID NO 18)：
Y5V，N28T，K32Q，E45S，E73S，E96S，P108G，D125Y，N159G，+160N，K134E，N78K，E87A，K119N，E8S，K55N，E141N，N47K，S155T，E6S，K103V，A130V，V2L.
GIFNvsTsTTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVENIsGkGGPGTIKnIS
FPEGLPFKYVKDRVDsVDHTkFKYNYSVIaGGPIGDTLsKISNEIvIVATgDGG
SILKISNnYHTKGyHEVKvEQVeASKEMGnTLLRAVESYLLAHtDAYgn
Betv1(“3008-20”)(SEQ ID NO 19)：
Y5V，N28T，K32Q，E45S，E73S，E96S，P108G，D125Y，N159G，+160N，K65N，T10P，E138N，E87A，E42S，D156H，N78K.
GVFNvETETpSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVsNIsGNGGPGTIKK
ISFPEGLPFnYVKDRVDsVDHTkFKYNYSVIaGGPIGDTLsKISNEIKIVATgDG
GSILKISNKYHTKGyHEVKAEQVKASKnMGETLLRAVESYLLAHShAYgn
Betv1“3008-25”)(SEQ ID NO 20)：
Y5V，N28T，K32Q，E45S，E73S，E96S，P108G，D125Y，N159G，+160N，K65N，T10P，E138N，E87A，E42S，D156H，N78K，K119N，N47K，T77A，E130V，K115N.
GIFNvsTETpSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVsNIsGNGGPGTIKKI
SFPEGLPFnYVKDRVDsVDHTkFKYNYSVIaGGPIGDTLsKISNEIvIVATgDG
GSILKISNKYHTKGyHEVKvEQVKASKnMGETLLRAVESYLLAHthAYgn
Betv1(“3009-9”)(SEQ ID NO 21)：
Y5V，N28T，K32Q，E45S，E96S，P108G，+160N，K134E，N78K，E87A，K119N，E8S，K55N，E138N，E141N，S155T，N47K，E6S，K103V，A130V，V2L，R70N，D125Y.
GVFNvETsTTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVENIsGkGGPGTIKnI
SFPEGLPFKYVKDRVDEVDHTkFKYNYSVIaGGPIGDTLsKISNEIKIVATgDG
GSILKISNnYHTKGDHEVKAEQVeASKnMGnTLLRAVESYLLAHtDAYNn
Betv1(“3009-15”)(SEQ ID NO 22)：
Y5V，N28T，K32Q，E45S，E96S，P108G，+160N，K134E，N78K，E87A，K119N，E8S，K55N，E138N，E141N，S155T，N47K，E6S，K103V，A130V，V2L，R70N，D125Y.
GIFNvsTsTTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVENIsGkGGPGTIKnIS
FPEGLPFKYVKDnVDEVDHTkFKYNYSVIaGGPIGDTLsKISNEIvIVATgDGG
SILKISNnYHTKGyHEVKvEQVeASKnMGnTLLRAVESYLLAHtDAYNn
Betv1(“3009-22”)(SEQ ID NO 23)：
Y5V，N28T，K32Q，E45S，E96S，P108G，+160N，T77A，K103V，E138N，K65N，T10P，D125Y，E42S.
GVFNvETETpSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVsNIsGNGGPGTIKK
ISFPEGLPFnYVKDRVDEVDHaNFKYNYSVIEGGPIGDTLsKISNEIvIVATgD
GGSILKISNKYHTKGyHEVKAEQVKASKnMGETLLRAVESYLLAHSDAYNn
Betv1(“3009-28”)(SEQ ID NO 24)：
Y5V，N28T，K32Q，E45S，E96S，P108G，+160N，T77A，K103V，E138N，K65N，T10P，D125Y，D156H，K119N E87A，E42S，A130V.
GVFNvETETpSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVsNIsGNGGPGTIKK
ISFPEGLPFnYVKDRVDEVDHaNFKYNYSVIaGGPIGDTLsKISNEIvIVATgDG
GSILKISNnYHTKGyHEVKvEQVKASKnMGETLLRAVESYLLAHShAYNn
Betv1克隆(“3031″)(SEQ ID NO 25)：
GVFNVETETASVIPAARLFNAFILDGDTLFPQVAPQAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDSVDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLESISNEIVIVAT
PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVEPYLLAHSHAYN
N
Betv1克隆(“3032”)(SEQ ID NO 26)：
GVFNVETETASVIPAARLFLAFILDGDTLFPQVAPPAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDPVDHTKFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT
PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVEGYLLAHSHAYN
N
Betv1克隆(“3033”)(SEQ ID NO 27)：
GVFNVETETPSVIPAARLFHAFILDGDTLFPQVAPKAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDRVDHTKFKYNYSVIEGGPIGDTLESISNEIVIVAT
PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVEGYLLAHSHAYN
N
Betv1克I隆(“3034”)(SEQ ID NO 28)：
GVFNVETETTSVIPAARLFHAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDSVDHTKFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT
PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVERYLLAHSHAYN
N
Betv1克隆(“3035”)(SEQ ID NO 29)：
GVFNVETETPSVIPAARLFMAFILDGDTLFPQVAPPAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDSVDHTNFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT
PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVEAYLLAHSHAYN
N
Betv1克隆(“3036”)(SEQ ID NO 30)：
GVFNVETETPSVIPAARLFLAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDTVDHTKFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT
PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVERYLLAHSHAYN
N
Betv1克隆(“3037”)(SEQ ID NO 31)：
GVFNVETETPSVIPAARLFQAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDSVDHTNFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT
PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVEPYLLAHSHAYN
N
Betv1克隆(“3038”)(SEQ ID NO 32)：
GVFNVETETASVIPAARLFLAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDGVDHTKFKYNYSVIDGGPIGDTLESISNEIVIVAT
PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVERYLLAHSHAYN
N
Betv1克隆(“3039”)(SEQ ID NO 33)：
GVFNVETETASVIPAARLFLAFILDGDTLFPQVAPEAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDGVDHTNFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVA
TPDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVEAYLLAHSHAY
NN
Betv1克隆(“3040”)(SEQ ID NO 34)：
GVFNVETETPSVIPAARLFKAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDSVDHTKFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT
PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVETYLLAHSHAYN
N
Betv1克隆“3041”)(SEQ ID NO 35)：
GVFNVETETPSVIPAARLFKAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDRVDHTKFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT
PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVERYLLAHSHAYN
N
Betv1克隆(“3042”)(SEQ ID NO 36)：
GVFNVETETPSVIPAARLFKAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDRVDHTKFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT
PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVERYLLAHSHAYN
N
Betv1克隆(“3043”)(SEQ ID NO 37)：
GVFNVETETPSVIPAARLFLAFILDGDTLFPQVAPKAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDRVDHTKFKYNYSVIDGGPIGDTLESISNEIVIVAT
PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVEPYLLAHSHAYN
N
Betv1克隆(“3044”)(SEQ ID NO 38)：
GVFNVETETPSVIPAARLFLAFILDGDTLFPQVAPKAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDGVDHTKFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVA
TPDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVETYLLAHSHAY
NN
Betv1克隆(“3045”)(SEQ ID NO 39)：
GVFNVETETPSVIPAARLFMAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDGVDHTKFKYNYSVIDGGPIGDTLESISNEIVIVAT
PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVEGYLLAHSHAYN
N
Betv1(3010)(SEQ ID NO 40)
Y5V，N28T，K32Q，E45S，K97S，P108G，+160N，E60S，T10N，K103V，K65N，
K129N，D125Y，E42S，S149T.
GVFNvETETnSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVsNIsGNGGPGTIKK
ISFPsGLPFnYVKDRVDEVDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLEsISNEIvIVATgDG
GSILKISNKYHTKGyHEVnAEQVKASKEMGETLLRAVEtYLLAHSDAYNn
Betv1(3011)(SEQ ID NO 41)
Y5V，N28T，K32Q，E45S，K97S，P108G，+160N，E60S，T10N，K103V，K65N，
K129N，D125Y，E42S，S149T，K134E，N47K，T77N，V2L.
GIFNvETETnSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVsNIsGkGGPGTIKKI
SFPsGLPFnYVKDRVDEVDHnNFKYNYSVIEGGPIGDTLEsISNEIvIVATgDG
GSILKISNKYHTKGyHEVnAEQVeASKEMGETLLRAVEtYLLAHSDAYNn
Betv1(3012)(SEQ ID NO 42)
Y5V，N28T，K32Q，E45S，K97S，P108G，+160N，E60S，T10N，K103V，K65N，
K129N，D125Y，E42S，S149T，K134E，N47K，T77N，V2L，E87A，A16G，
Q36N，E73S，D93S.
GIFNvETETnSVIPAgRLFKAFILDGDtLFPqVAPnAISSVsNIsGkGGPGTIIKKIS
FPsGLPFnYVKDRVDsVDHnNFKYNYSVIaGGPIGsTLEsISNEIvIVATgDGGS
ILKISNKYHTKGyHEVnAEQVeASKEMGETLLRAVEtYLLAHSDAYNn
诊断试验
此外，根据本发明的重组过敏原突变体具有诊断可能性和优点。当前领域中的过敏反应疫苗基于天然存在的过敏原来源的提取物，因而代表了多种同种型。过敏反应个体最初针对一种或多种存在的同种型过敏并产生IgE。由于同源性及随后与使个体发生过敏反应的同种型的交叉反应性，一些同种型关于过敏反应个体的过敏反应是相关的，然而其他同种型由于不具有任何过敏反应个体对其具有特异性IgE的IgE结合抗原决定表位而不相关。由于IgE群体特征性的异质性，一些同种型因而可安全地给药，即它们不导致经由IgE的过敏反应，然而其他的同种型可能有害地导致不良的副作用。
因而，打算治疗性给药的本发明突变体和本发明组合物也可被用作体内或体外诊断测定以监控使用这种突变体或组合物进行治疗的适当性、安全性或结果。应用的诊断样品包括人体样品，如血液或血清。
因而，本发明也涉及用本发明的重组过敏原突变体或本发明的组合物来估计对个体的治疗的适当性、安全性或结果的诊断测定，其中将个体的含IgE样品与该突变体或该组合物混合并评估该样品中或该突变体中IgE之间的反应性的水平。对该样品中或该突变体中IgE之间的反应性的水平的评估可用任何已知的免疫测定来实施。
本发明通过以下非限制性实施例进一步地进行阐明。
实施例
实施例1
该实施例描述了IgE结合亲合力降低的重组Betv1过敏原突变体的特征。PCT/DK 01/00764也公开了该特定突变过敏原。以下代表如何制备本发明突变体的说明性实施例。
山毛榉(Fagales)花粉过敏原中共同表位的鉴定
主要桦木花粉过敏原Betv1与来自分类学相关的树木花粉的主要过敏原具有约90％的氨基酸序列相同性，即，Fagales(例如榛子和角树)和桦木花粉过敏患者对这些Betv1同源蛋白质常显示出过敏交叉反应的临床症状。
Betv1也显示与某些水果(例如苹果和樱桃)和蔬菜(如芹菜和胡萝卜)中存在的过敏反应蛋白质显示出大约50-60％的序列相同性，且有临床证据显示Betv1和这些食物相关蛋白之间存在过敏反应交叉反应性。
另外，Betv1与一组被称为病理相关蛋白质(PR-10)的植物蛋白具有明显的序列相同性(20-40％)，然而对这些PR-10蛋白还没有过敏交叉反应性的报道。
分子模型表明山毛榉目(Fagales)和食品过敏原及PR-10蛋白质的结构与Betv1的结构近似相同。
过敏反应性Betv1交叉反应性的结构基础在(Gajhede等，1996，文献17)中报道，因此，识别Betv1上这些区段的任何IgE可与其它山毛榉目主要花粉过敏原发生交叉反应并与其结合，产生过敏反应症状。
选择氨基酸残基用于定点诱变
用于定点突变的氨基酸残基选自Betv1上的表面暴露残基。根据它们的原子坐标计算各氨基酸残基的相对定位和溶剂暴露百分数。具有较低溶剂暴露程度(＜20％)的残基由于可能会破坏结构或缺乏抗体相互作用而被视为与诱变无关。剩下的残基根据其溶剂暴露程度进行排序。
序列对比
与所述序列(Betv1 No.2801，WHO IUIS过敏原命名小组委员会)同源的序列通过BLAST检索得自GenBank和EMBL序列数据库(Altschul等，文献18)。考虑BLAST报道概率小于0.1的所有序列，将含无冗余序列的同源序列制成列表。通过CLUSTAL W(Higgins等，文献19)进行序列对比，针对全部序列或仅分类学上有亲缘关系的种类计算序列中各位置的相同百分数。总共有122个序列与Betv1No.2801同源，其中57个序列来自分类学相关的种类。
克隆编码Betv1的基因
通过酚提取和LiCl沉淀从白桦(Betula verrucosa)花粉(Allergon，Sweden)制备RNA。在微量离心管中分批进行寡聚(dT)-纤维素亲合层析，使用市售试剂盒(Amersham)合成双链cDNA。编码Betv1的DNA经PCR扩增和克隆。简单地说，使用cDNA作模板，和设计成与分别相应于Betv1氨基端和3’-非翻译区位置的cDNA序列匹配的引物进行PCR。引物在5’端延伸以提供限制性位点(Ncol和HindIII)用于定向克隆进pKK233-2。
亚克隆进pMAL-c
编码Betv1的基因随后被亚克隆进麦芽糖结合蛋白融合载体pMAL-c(New England Biolabs)中。PCR扩增基因并与malE符合读框地亚克隆以产生麦芽糖结合蛋白(MBP)-Betv1蛋白融合操纵子，其中MBP和Betv1由因子Xa蛋白酶裂解位点分开，该裂解位点所处位置使得在裂解后可恢复Betv1真正的氨基端序列，如文献15所述。简单地说，使用插入了Betv1的pKK233-3作模板，分别相应于该蛋白质氨基和羧基端的引物进行PCR。启动子近端引物在5’端延伸以包含编码符合读框的因子Xa蛋白酶裂解位点的4个密码子。两个引物均在5’端进一步延伸以包含限制性位点(KPn1)用于克隆。使用20个循环的PCR亚克隆编码Betv1的基因以降低PCR假象的频率。
体外诱变
使用带有Betv1插入片段的重组pMAL-c作模板经PCR进行体外诱变。各突变的Betv1基因使用4个引物经3个PCR反应产生。下述突变实例是根据现有技术PCT/DK 01/00764。本发明的突变体可以类似方式制备并测试。
合成2个包含每个突变的突变特异性寡核苷酸引物，每条引物针对一条DNA链，见图3和4。以突变的核苷酸作起点，两条引物均在5’-端延伸7个核苷酸，在3’-端延伸15个核苷酸。延伸的核苷酸在序列上与Betv1基因实际区域相同。
还合成了两个通用引物(在图4中称为“全有义”和“全无义”)并用于所有突变体。这些引物长15个核苷酸，在序列上与pMAL-c载体中Betv1上游和下游大约1千碱基对处区域的序列相应。上游引物的序列来自有义链，下游引物的序列来自无义链，见图4。
除了只进行20个温度循环以减少PCR假象的频率以外，基本上按照标准方法(Saiki等，1988，文献20)进行2个独立的PCR反应。各PCR反应使用插入了Betv1的pMAL-c作模板，以及一个突变特异引物和一个通用引物所形成的有意义组合。
按照上面所述的逐步方法在突变体中导入4个氨基酸取代(Asn28Thr，Lys32Gln，Glu45Ser，Pro108Gly)。分别使用插入了Betv1第2801，Betv1(Glu45Ser)，Betv1(Glu45Ser，Pro108Gly)的pMAL-c作模板，首先导入Glu45Ser突变，然后导入Pro108Gly突变，最后导入Asn28Thr，Lys32Gln突变。
经过琼脂糖凝胶电泳并电洗脱，随后乙醇沉淀纯化PCR产物。使用来自前两次PCR反应的混合PCR产物作模板和2个通用引物进行第3次PCR反应。同样，使用20个循环的标准PCR。经琼脂糖凝胶电泳和电洗脱，随后进行乙醇沉淀纯化PCR产物，用限制性酶(Bs/WI/EcoRI)切割并定向连接进用相同限制性酶消化的插入了Betv1的pMAL-C中。
图5显示了所有9个Betv1突变的概述，这9个突变如下：Thr10Pro，Asp25Gly，Asn28Thr+Lys32Gln，Glu45Ser，Asn47Ser，Lys55Asn，Glu60Ser，Thr77Ala和Pro108Gly。还制备了具有4处突变的另外一个突变体(Asn28Thr，Lys32Gln，Glu45Ser，Pro108my)。其中，选择5个突变体用于进一步的试验：Asn28Thr+Lys32Gln，Glu45Ser，Glu60Ser，Pro108Gly和Asn28Thr，Lys32Gln，Glu45Ser，Pro108Gly突变体。
核苷酸测序
亚克隆之前、之后和体外诱变之后分别对Betv1编码基因的核苷酸序列进行了测定。
将10ml来自在补充了0.1g/l氨卞青霉素的LB培养基中过夜培养至饱和的细菌培养物的质粒DNA用Qiagen-tip 20柱纯化，并按照厂商的建议使用Sequenase version 2.0 DNA测序试剂盒(USB)测序。
重组Betv1和突变体的表达与纯化
融合到麦芽糖结合蛋白上的重组Betv1(Betv1第2801和突变体)在大肠杆菌DH5a中过表达并按文献15所述纯化。简单地说，重组大肠杆菌细胞在37℃下生长至436nm下光密度为1.0，此时加入IPTG诱导Betv1融合蛋白表达。诱导后3小时离心收获细胞，重悬于裂解缓冲液中并经超声处理破碎。超声处理和再次离心后，经淀粉亲和色谱分离重组融合蛋白并随后经过与因子Xa温育裂解(文献15)。因子Xa裂解后，经凝胶过滤分离重组Betv1，如果有必要，进行另一轮淀粉亲和色谱以去掉痕量的麦芽糖结合蛋白。
重组Betv1经超滤浓缩纯化至大约5mg/ml并贮存于4℃。纯化的重组Betv1制品的最终产率为每升大肠杆菌细胞培养物2-5mg。
纯化的重组Betv1制品在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳银染后出现具有17.5kDa表观分子量的单一带，N-端测序显示出来自cDNA核苷酸序列的预期序列，定量氨基酸分析显示出预期的氨基酸组成。
我们以前已表明(文献15)重组Betv1第2801与天然存在的Betv1在免疫化学上不可区别。
使用兔多克隆抗体的免疫电泳
以重组Betv1蛋白的形式产生了7种突变体Betv1并按上文所述纯化，试验其与针对从桦木花粉分离的Betv1产生的多克隆兔抗体的反应性。当在非变性条件下免疫电泳(火箭免疫电泳)分析时，兔抗体能沉淀所有的突变体，表明这些突变体具有保守的α-碳原子三级结构。
为了分析对人多克隆IgE-反应的影响，选择突变体Glu45Ser，Pro108Gly，Asn28Thr+Lys32Gln和Glu60Ser进行进一步的分析。
Betv1 Glu45Ser突变体
在45位的谷氨酸显示高度溶剂暴露性(40％)。在一些Betv1同源的PR-10蛋白质中发现丝氨酸残基占据位置45，表明谷氨酸可被丝氨酸取代而不会破坏α-碳骨架的三级结构。另外，由于没有一个已知的山毛榉目过敏原序列在位置45具有丝氨酸，因此用丝氨酸取代谷氨酸产生非天然存在的Betv1分子。
使用重组Glu45Ser Betv1突变体进行T细胞增殖试验
按Spangfort等，1996a所述进行分析。发现重组Betv1Glu45Ser突变体能诱导来自3种不同桦木花粉过敏患者的T细胞系增殖，其刺激指数相似于重组的和天然存在的过敏原。
重组Glu45Ser Betv1的结晶和结构测定
基本上按(Spangfort等1996b，文献21)所述在25℃经蒸气扩散形成重组Glu45Ser Betv1晶体。5mg/ml浓度的Glu45Ser Betv1与等体积的2.0M硫酸铵，0.1M柠檬酸钠，1％(V/V)的二氧杂环己烷，pH6.0，混合，并用100倍体积的2.0M硫酸铵，0.1M柠檬酸钠，1％(V/V)的二氧杂环己烷，pH6.0平衡。平衡24小时后，使用重组野生型Betv1晶体作晶种来源，应用文献21所述的加晶种技术诱导晶体生长。
大约2个月后，收获晶体并按文献21所述使用Rigaku旋转正极产生的X-射线进行分析，使用分子取代解析结构。
Betv1 Gln45Ser突变体的结构
通过3维生长Betv1 Glu45Ser蛋白晶体来解析突变对结构的影响，该晶体当用旋转正极产生的X-射线分析时分衍射出辨率为3.0，以Bet vIGlu45Ser结构电子密度图证实在45位的谷氨酸取代成丝氨酸，该电子密度图也显示总体α碳骨架三级结构是保守的。
Betv1 Gln45Ser突变体的IgE结合特性
使用来自桦木过敏反应患者血清IgE库进行液相IgE-抑制试验，比较Betv1 Glu45Ser突变体与重组Betv1的IgE结合特性。
以1∶5的摩尔比(Betv1第2801：生物素)用生物素标记重组Betv1第2801。抑制试验按下述方法进行：血清样品(25μl)与固相抗IgE7保温，洗涤，重悬并进一步与生物素标记的Betv1第2801(3.4nM)和给定突变体(0-2.6nM)的混合物保温。根据与吖啶酯标记的链霉抗生素蛋白保温后测定的RLU评价结合到固相上的生物素标记的Betv1第2801的量。以使用缓冲液和突变体作抑制剂获得的RLU之间的比率计算抑制的程度。
图6显示了由无生物素标记的Betv1和由Betv1 Glu45Ser突变体对生物素标记的重组Betv1与过敏反应患者血清IgE的结合的抑制。
对血清库中存在的血清IgE的结合达到50％抑制所需的各重组蛋白的量有明显的区别。重组Betv1在大约6.5ng达到50％的抑制，而Betv1 Glu45Ser突变体的相应浓度是大约12ng。这说明在Betv1Glu45Ser突变体中导入的点突变将对特异性血清IgE的亲和性大约降低了2倍。
用Betv1 Glu45Ser突变体所达到的最大抑制水平比重组Betv1明显更低。这表明Glu45Ser取代后，存在于血清库中的一些特异性IgE不能识别Betv1 Glu45Ser突变体。
Betv1突变体Asn28Thr+Lvs32Gln
28位和32位的天冬氨酸和赖氨酸分别显示出高度的溶剂暴露性(分别为35％和50％)。在结构上，天冬氨酸28和赖氨酸32在分子表面上互相靠近，且最有可能通过氢键相互作用。在一些Betv1同源性PR-10蛋白质中发现苏氨酸和谷氨酸残基分别占据位置28和32，表明天冬氨酸和赖氨酸可分别被苏氨酸和谷氨酸所取代而不破坏α-碳骨架三级结构。另外，由于没有一个天然存在的同种过敏原序列分别在28和32位具有苏氨酸和谷氨酸，因此这种取代产生了天然不存在的Betv1分子。
Betv1突变体Asn28Thr+Lvs32Gln的IgE结合特性
使用上文所述来自桦木过敏反应患者血清IgE库在液相IgE抑制试验中比较突变体Asn28Thr+Lys32Gln与重组Betv1的IgE结合特性。
图7显示了由非生物素标记的Betv1和由Betv1突变体Asn28Thr+Lys32Gln对生物素标记的重组Betv1与过敏反应患者血清IgE的结合的抑制作用。
对血清库中存在的血清IgE的结合达到50％抑制作用所需的各重组蛋白质的量有明显的区别。重组Betv1在大约6.5ng时达到50％的抑制，而Betv1突变体Asn28Thr+Lys32Gln的相应浓度是大约12ng。这表明Betv1突变体Asn28Thr+Lys32Gln中导入的点突变将对特异性血清IgE的亲和力降低了大约2倍。
用Betv1突变体Ash28Thr+Lys32Gln突变体达到的最大抑制水平与重组Betv1相比明显更低。这可能表明Asn28Thr+Lyr32Gln取代后，一些存在于血清库中的特异性IgE不能识别Betv1突变体Asn28Thr+Lys32Gln。
Betv1突变体Pro108Gly
位置108的脯氨酸显示出高度的溶剂暴露姓(60％)。在一些Betv1同源的PR-10蛋白中发现甘氨酸残基占据108位，这表明脯氨酸可被甘氨酸取代而不破坏α-碳原子三级结构。另外，由于没有一个天然存在的同种过敏原序列在108位具有甘氨酸，因此用甘氨酸取代脯氨酸产生了非天然存在的Betv1分子。
Betv1突变体Pro108Gly的IgE结合特性
使用上述来自桦木过敏反应患者的血清IgE库在液相IgE-抑制试验中比较Betv1 Pro108GIy突变体与重组Betv1的IgE-结合特性。
图8示了由非生物素标记的Betv1和由Betv1 Pro108Gly突变体对生物素标记的重组Betv1与过敏反应患者血清IgE的结合的抑制作用。
对血清库中存在的血清IgE的结合达到50％抑制所需的各重组蛋白的量有明显的区别。重组Betv1在大约6.5ng时达到50％的抑制，而Betv1 Pro108Gly的相应浓度为15ng。这表明在Betv1 Pro108Gly中导入的单个点突变降低了对特异性血清IgE的亲和性大约2倍。
与重组Betv1相比，Betv1 Pro108GIy突变体达到的最大抑制水平有一定程度的降低。这可能表明，Pro108Gly取代后，血清库中存在的一些特异性IgE不能识别B6t VI Pro108Gly突变体。
Betv1突变体Glu60Ser
位置60的谷氨酸显示出高度的溶剂暴露性(60％)。在一些Betv1同源的PR-10蛋白中发现丝氨酸残基占据60位，这表明谷氨酸可被丝氨酸取代而不破坏α-碳原子三级结构。另外，由于没有一个天然存在的同种过敏原序列在60位具有丝氨酸，因此用丝氨酸取代谷氨酸可产生非天然存在的Betv1分子。
Betv1突变体Glu60Ser的IgE结合特性
使用上述来自桦木过敏反应患者的血清IgE库在液相IgE-抑制试验中比较Betv1 Glu60Ser突变体与重组Betv1的IgE-结合特性。
图9显示了由非生物素标记的Betv1和由Betv1 Glu60Ser突变体对生物素标记的重组Betv1与过敏反应患者血清IgE的结合的抑制作用。与Glu45Ser，Pro108Gly和Asn28Thr+Lys32Gln突变体相反，谷氨酸60取代成丝氨酸对其IgE-结合特性没有显示任何明显的影响。
Betv1 Glu45Ser，Asn28Thr+Lvs32Gln和Pro108Glv突变体的结构分析
以圆二色性(CD)谱学分析纯化蛋白的结构完整性。图10显示了在接近等浓度时记录的重组突变体和重组天然蛋白的CD光谱。两个重组蛋白CD光谱的峰振幅和位置重叠，表明两制品含有等量的二级结构，这有力地表明α-碳原子三级结构不受导入的氨基酸取代的影响。
Betv1 Glu45Ser，Asn28Thr+Lvs32Gln和Pro108Gly突变体的IgE结合特性
使用上文所述来自桦木过敏反应患者的血清IgE库在液相IgE抑制试验中比较突变体与重组Betv1的IgB结合特性。
图11显示了由非生物素标记的Betv1和由Betv1突变体对生物素标记的重组Betv1与过敏反应患者血清IgE的结合的抑制作用。与本文所述的单一突变体相反，突变体的抑制曲线不再与重组体相似。这表明，与重组体相比，突变体中导入的取代改变了IgE结合特性和表位情况。缺乏相似性使得难以定量评估突变体与特异性血清IgE亲和性的降低。
重组Betv1在大约6ng达到50％抑制，而Betv1突变体(Asn28Thr，Lys32Gln，Glu45Ser，Pro108Gly)的相应浓度是30ng，即亲和性降低5倍。然而，为了达到80％抑制，相应的值分别是20ng和400ng，即降低20倍。
使用重组Betv1 Glu45Ser，Asn28Thr+Lys32Gln和Pro108Gly突变体的T细胞增殖试验
按文献15所述进行分析。发现重组Betv1突变体能以与重组和天然存在Betv1相似的刺激指数诱导来自三种不同桦木花粉过敏反应患者的T细胞系增殖。这表明突变体可起动抗体产生所必需的细胞免疫应答。
实施例2
本发明突变体的体外诱变
使用插入了Betv1的重组pMAL-c作为模板进行PCR，实现体外诱变。重组突变过敏原的制备包括两个PCR步骤：步骤I和II。首先，使用包含各突变的正义和反义突变特异性寡核苷酸引物，和包含上游或下游邻近突变或Betv1 N末端/C末端的正义和反义寡核苷酸引物，将每个单独突变(如果在DNA序列中定位很紧密，也可为几个突变)导入Betv1.2801衍生物的连续DNA序列内，即Betv1(2595)或Betv1(2628)或Betv1(2733)，分别如图12(I)所示。其次，纯化PCR反应I的PCR产物，混合，作为模板，与含有Betv1 N末端/C末端的寡核苷酸引物一起进行另一PCR反应(II)，如图13(II)所示。琼脂糖凝胶电泳，PCR凝胶纯化(Life Techhnologies)，然后乙醇沉淀纯化该PCR产物，用限制性酶(Sacl/EcoRI)或(Sacl/Xbal)切割并定向连接进用相同限制性酶消化的pMAL-c中。
图13显示了合成的寡核苷酸引物以及Betv1突变体的构建示意图。下述Betv1突变体被克隆并测序(核酸分子的测序在实施例1中描述)：
Betv1(3004)
GVFNvETETTSVIPAARLFKAFILDGDNLFPKVAPQAISSVsNIEGNGGPGTIK
KISFPEGfPFKYVKDRVDEVDHTkFKYNYSVIEGGPIGDTLEsISNEIvIVATPD
GGSILKISNKYHTKGDHEVKAEQVeASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYNn
Betv1(3005)
GVFNvETETTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVENIsGNGGPGTIKK
ISFPEGfPFKYVKDRVDEVDHTkFKYNYSVIEGGPIGDTLEsISNEIvIVATPDG
GSILKISNKYHTKGDHEVKAEQVeASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYNn
Betv1(3007)
GVFNvETETTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVENIsGNGGPGTIKK
ISFPEGfPFKYVKDRVDEVDHTkFKYNYSVIEGGPIGDTLEsISNEIvIVATgDG
GSILKISNKYHTKGyHEVKAEQVeASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYNn
Betv1(3009)
GVFNvETETTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVENIsGNGGPGTIKK
ISFPEGfPFKYVKDRVDEVDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLsKISNEIKIVATgD
GGSILKISNKYHTKGDHEVKAEQVKASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYNn
Betv1(3006)
GVFNvETETTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPqVAPQAISSVENIsGNGGPGTIKK
ISFPEGfPFKYVKDRVDEVDHTkFKYNYSVIEGGPIGDTLEsISNEIvIVATPDG
GSILKISNKYHTKGDHEVKAEQVeASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYgn
Betv1(3008)
GVFNvETETTSVIPAARLFKAFILDGDtLFPkVAPQAISSVENIsGNGGPGTIKK
ISFPEGfPFKYVKDRVDsVDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLsKISNEIKIVATgDG
GSILKISNKYHTKGyHEVKAEQVKASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYgn
根据本发明制备的其他突变体
向Betv1突变体中导入多个点突变可以潜在地破坏分子的α碳骨架折叠模式。导入随机氨基酸取代会提高形成稳定Betv1突变体分子的机会。因此我们构建了含有Betv1突变体的Betv1突变体文库，所述突变体带有17-20个点突变，其中有7个位点是随机的氨基酸取代。该文库含有上百个不同的克隆。被称为Betv1(3031)-(3045)的15个Betv1突变体获自这个使用简并寡核苷酸引物生成的Betv1突变体文库。这些引物在Betv1的T10，K20，Q36，E73，E87，K129和S149位点含有随机氨基酸残基取代(图14和15)。这些位点并不会覆盖已经导入Betv1(3002)和Betv1(2595)中的点突变，所述Betv1(3002)和Betv1(2595)用作DNA模板用于进行定点突变PCR反应，如图15所示。
克隆过程与图12所示相同，只是在第一轮PCR中所用的引物在特定位点被简并，这些位点在图15中用G，C，T或A之外的字母表示。G，C，T或A之外的字母表示该引物在这些位点含有几种不同的核苷酸。制备了8种覆盖Betv1基因的PCR产物，并在第一轮PCR中纯化，然后使用末端引物(3076s和3067a)在第二轮PCR中进行组装，其中使用来自第一轮PCR的8种产物作为模板。
如同对Betv1 3004，3005，3007和3007突变体所述，对Betv1突变体3031-3045进行DNA测序，以鉴定导入点突变的数目和性质：
Betv1克隆(“3031”)(SEQ ID NO 25)：
GVFNVETETASVIPAARLFNAFILDGDTLFPQVAPQAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDSVDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLESISNEIVIVAT
PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVEPYLLAHSHAYN
N
Betv1克隆(“3032”)(SEQ ID NO 26)：
GVFNVETETASVIPAARLFLAFILDGDTLFPQVAPPAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDPVDHTKFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT
PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVEGYLLAHSHAYN
N
Betv1克隆(“3033”)(SEQ ID NO 27)：
GVFNVETETPSVIPAARLFHAFILDGDTLFPQVAPKAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDRVDHTKFKYNYSVIEGGPIGDTLESISNEIVIVAT
PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVEGYLLAHSHAYN
N
Betv1克隆(“3034”)(SEQ ID NO 28)：
GVFNVETETTSVIPAARLFHAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDSVDHTKFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT
PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVERYLLAHSHAYN
N
Betv1克隆(“3035”)(SEQ ID NO 29)：
GVFNVETETPSVIPAARLFMAFILDGDTLFPQVAPPAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDSVDHTNFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT
PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVEAYLLAHSHAYN
N
Betv1克隆(“3036”)(SEQ ID NO 30)：
GVFNVETETPSVIPAARLFLAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDTVDHTKFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT
PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVERYLLAHSHAYN
N
Betv1克隆(“3037”)(SEQ ID NO 31)：
GVFNVETETPSVIPAARLFQAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDSVDHTNFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT
PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVEPYLLAHSHAYN
N
Betv1克隆(“3038”)(SEQ ID NO 32)：
GVFNVETETASVIPAARLFLAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDGVDHTKFKYNYSVIDGGPIGDTLESISNEIVIVAT
PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVERYLLAHSHAYN
N
Betv1克隆(“3039”)(SEQ ID NO 33)：
GVFNVETETASVIPAARLFLAFILDGDTLFPQVAPEAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDGVDHTNFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVA
TPDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVEAYLLAHSHAY
NN
Betv1克隆(“3040”)(SEQ ID NO 34)：
GVFNVETETPSVIPAARLFKAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDSVDHTKFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT
PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVETYLLAHSHAYN
N
Betv1克隆“3041”)(SEQ ID NO 35)：
GVFNVETETPSVIPAARLFKAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDRVDHTKFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT
PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVERYLLAHSHAYN
N
Betv1克隆(“3042”)(SEQ ID NO 36)：
GVFNVETETPSVIPAARLFKAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDRVDHTKFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVAT
PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVERYLLAHSHAYN
N
Betv1克隆(“3043”)(SEQ ID NO 37)：
GVFNVETETPSVIPAARLFLAFILDGDTLFPQVAPKAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDRVDHTKFKYNYSVIDGGPIGDTLESISNEIVIVAT
PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVEPYLLAHSHAYN
N
Betv1克隆(“3044”)(SEQ ID NO 38)：
GVFNVETETPSVIPAARLFLAFILDGDTLFPQVAPKAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDGVDHTKFKYNYSVIGGGPIGDTLESISNEIVIVA
TPDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVETYLLAHSHAY
NN
Betv1克隆(“3045”)(SEQ ID NO 39)：
GVFNVETETPSVIPAARLFMAFILDGDNLFPKVAPPAISSVSNISGNGGPGTI
KKISFPEGLPFNYVKDRVDGVDHTKFKYNYSVIDGGPIGDTLESISNEIVIVAT
PDGGSILKISNKYHTIGDHEVEAEQVEASKEMGETLLRAVEGYLLAHSHAYN
N
实施例3
鉴定和筛选用于取代的氨基酸
用溶剂可接近性和保守程度参数来确定和选择适合于对过敏原Betv1、DerP2和Vesv5进行替换的表面暴露的氨基酸。
溶剂可接近性
溶剂可接近性用软件InsightII版本97.0(MSI)和1.4的探测半径(Connolly Surface)来计算。
通过使用软件PASS(推定的球体活性位点)以探针充满而从分析中排除内部腔。随后手动去除表面的探针。
保守性
Betv1
3-D结构基于登录号Z80104(1bv1.pdb)。
包括在保守残基分析中的38个其他的Betv1序列包含登录号：
P15494＝X15877＝Z80106，Z80101，AJ002107，Z72429，AJ002108，Z80105，Z80100，Z801O3，AJ001555，Z80102，AJ002110，Z72436，P43183＝X77271，Z72430，AJ002106，P43178＝X77267，P43179＝X77268，P43177＝X77266，Z72438，P43180＝X77269，AJ001551，P43185＝X77273，AJ001557，Z72434，AJ001556，Z72433＝P43186，AJ001554，X81972，Z72431，P45431＝X77200，P43184＝X77272，P43176＝X77265，S47250，S47251，Z72435，Z72439，Z72437，S47249.
Betv1
59个高度溶剂暴露的氨基酸：
K-129，E-60，N-47，K-65，P-108，N-159，D-93，K-123，K-32，D-125，R-145，D-109，T-77，E-127，Q-36，E-131，L-152，E-6，E-96，D-156，P-63，H-76，E-8，K-134，E-45，T-10，V-12，K-20，L-62，S-155，H-126，P-50，N-78，K-119，V-2，L-24，E-42，N-4，A-153，I-44，E-138，G-61，A-130，R-70，N-28，P-35，S-149，K-103，Y-150，H-154，N-43，A-106，K-115，P-14，Y-5，K-137，E-141，E-87，E-73.
57个高度溶剂暴露并保守(＞70％)的氨基酸：
K-129，E-60，N-47，K-65，P-108，N-159，D-93，K-123，K-32，D-125，R-145，D-109，E-127，Q-36，E-131，L-152，E-6，E-96，D-156，P-63，H-76，E-8，K-134，E-45，T-10，V-12，K-20，S-155，H-126，P-50，N-78，K-119，V-2，L-24，E-42，N-4，A-153，1-44，E-138，G-61，A-130，R-70，N-28，P-35，S-149，K-103，Y-150，H-154，N-43，A-106，K-115，P-14，Y-5，K-137，E-141，E-87，E-73.
表1是以降序显示Betv1氨基酸溶剂暴露程度的列表。第1列列出了起始于氨基末端的氨基酸号码，第2列以单字母缩写列出了氨基酸，第3列列出标准化的溶剂暴露指数，第4列列出已知序列在该位置具有保守氨基酸的百分比数。
表1：Betv1
NO AA Solv_ex Cons％
p
129 K 1,000 90
60 E 0,986 97
47 N 0,979 100
65 K 0,978 100.
108 P 0,929 100
159 N 0,869 100
93 D 0,866 100
123 K 0,855 100
32 K 0,855 100
125 D 0,821 74
145 R 0,801 90
109 D 0,778 82
77 T 0,775 56
127 E 0,760 100
36 Q 0,749 95
131 E 0,725 100
152 L 0,718 97
6 E 0,712 100
96 E 0,696 100
156 D 0,693 97
63 P 0,692 97
76 H 0,683 90
8 E 0,638 97
134 K 0,630 100
45 E 0,623 100
10 T 0,613 97
12 V 0,592 100
20 K 0,584 100
62 L 0,575 5
155 S 0,568 97
126 H 0,551 95
50 P 0,541 100
78 N 0,538 100
119 K 0,529 100
2 V 0,528 100
24 L 0,528 100
42 E 0,519 100
4 N 0,517 95
153 A 0,513 100
44 1 0,508 97
138 E 0,496 100
61 G 0,488 100
130 A 0,479 97
70 R 0,474 100
28 N 0,469 90
35 P 0,467 100
149 S 0,455 92
103 K 0,447 100
150 Y 0,438 100
154 H 0,436 100
43 N 0,412 100
106 A 0,411 95
115 K 0,411 100
14 P 0,410 97
5 Y 0,410 100
137 K 0,396 100
141 E 0,387 95
87 E 0,385 100
73 E 0,384 100
16 A 0,367 100
79 F 0,362 100
3 F 0,355 100
158 Y 0,346 100
105 V 0,336 100
101 E 0,326 100
64 F 0,325 100
86 I 0,322 100
39 S 0,314 100
124 G 0,310 100
72 D 0,308 97
142 T 0,293 67
66 Y 0,289 100
55 K 0,288 100
7 T 0,279 67
40 S 0,274 95
25 D 0,271 87
135 A 0,267 92
68 K 0,262 100
97 K 0,247 100
46 G 0,235 100
27 D 0,232 97
1 G 0,227 100
113 I 0,225 77
51 G 0,220 100
92 G 0,218 100
80 K 0,212 100
110 G 0,211 100
107 T 0,203 85
94 T 0,202 92
41 V 0,201 97
48 G 0,198 100
91 I 0,192 18
31 P 0,188 100
75 D 0,188 97
33 V 0,183 100
49 G 0,176 100
17 R 0,172 100
99 S 0,158 64
89 G 0,154 100
53 I 0,154 100
121 H 0,153 100
9 T 0,150 72
74 V 0,148 97
132 Q 0,146 72
57 S 0,137 49
148 E 0,135 100
82 N 0,133 41
128 V 0,125 64
117 S 0,124 87
90 P 0,117 67
116 I 0,112 100
122 T 0,107 100
139 M 0,104 62
95 L 0,104 97
54 K 0,096 100
146 A 0,095 100
59 P 0,088 97
157 A 0,088 100
133 V 0,077 44
88 G 0,068 100
140 G 0,053 85
37 A 0,042 95
81 Y 0,041 100
23 I 0,036 95
104 I 0,036 92
15 A 0,036 97
58 F 0,029 100
29 L 0,028 100
19 F 0,027 100
100 N 0,022 97
22 F 0,021 97
71 V 0,014 100
111 G 0,014 100
13 I 0,014 100
18 L 0,014 97
114 L 0,014 100
11 S 0,007 100
151 L 0,007 97
144 L 0,007 90
52 T 0,007 100
84 S 0,007 97
118 N 0,007 97
102 I 0,007 100
21 A 0,000 97
26 G 0,000 97
30 F 0,000 44
34 A 0,000 100
38 I 0,000 87
56 I 0,000 100
67 V 0,000 97
69 D 0,000 62
83 Y 0,000 95
85 V 0,000 72
98 I 0,000 95
112 S 0,000 77
120 Y 0,000 95
136 S 0,000 67
143 L 0,000 100
147 V 0,000 100
实施例4
该实施例描述重组Betv1过敏原突变体的制备和特征，这些突变体带有多于4个突变，并且具有与现有技术PCT/DK 01/00764相比降低的IgE结合亲合力。本发明的突变体被相应制备和测试。
用于Betv1定点突变的氨基酸残基的选择
按实施例1所述选择氨基酸残基。
体外诱变
体外诱变用插入了Betv1的重组pMAL-c作为模板通过PCR来进行。包含5～9个一级突变的重组过敏原突变体的制备包括两个PCR步骤：步骤I和II。首先，使用包含各突变的正义和反义突变特异性寡核苷酸引物，和包含上游或下游邻近突变或Betv1 N末端/C末端的正义和反义寡核苷酸引物，将每个单独突变(如果在DNA序列中定位很紧密，也可为几个突变)导入Betv1.2801或Betv1.2801衍生物的连续DNA序列内，分别如图15(I)所示。其次，纯化PCR反应I的PCR产物，混合，作为模板，用含有Betv1的N末端/C末端的寡核苷酸引物一起进行另一PCR反应(II)，如图15(II)所示。琼脂糖凝胶电泳，PCR凝胶纯化(Life Techhnologies)，然后乙醇沉淀纯化该PCR产物，用限制性酶(Sac1/EcoRI)或(Sac1/Xba1)切割并定向连接进用相同限制性酶消化的pMAL-c中。
图16表示合成的寡核苷酸引物和具有大于4个一级突变的Betv1突变体的构建示意图。突变的氨基酸优选地选自特征在于如实施例3所述具有高度溶剂暴露和保守性的氨基酸。Betv1突变体如下：
突变体Betv1(2628)：Tyr5Val，Glu45Ser，Lys65Asn，Lys97Ser，Lys1 34GIu。
突变体Betv1(2637)：Ala16Pro，Asn28Thr，Lys32Gln，Lys103Thr，Pro108Gly，Leu152Lys，Ala153Gly，Ser155Pro。
突变体Betv1(2733)：Tyr5Val，Lys134Glu，Asn28Thr。Lys32Gln，Glu45Ser，Lys65Asn，Asn78Lys，Lys103Val，Lys97Ser，Pro108Gly，Arg145Glu，Asp156His，+160Asn。
突变体Betv1(2744)：Tyr5Val，Lys134Glu，Glu42Ser，G1u45Ser，Asn78Lys，Lys103Val，Lys123Ile，Asp156His，+160Asn。
突变体Betv1(2753)：Asn28Thr，Lys32Gln，Lys65Asn，Glu96Leu，Lys97Ser，Pro108Gly，Asp109Asn，Asp125Tyr，Glu127Ser，Arg145Glu。
重组Betv1和突变体的核苷酸测序及表达和纯化
重组蛋白的测序和表达如实施例1所述进行。
Betv1(2628)和Betv1(2637)突变体
图17显示了在Betv1(2628)和Betv1(2637)分子表面导入的点突变。
重组Betv1(2628)突变蛋白的结晶和结构确定。
结构确定如实施例1所述进行。
Betv1(2628)突变体的结构
突变的结构作用通过生长三维Betv1(2628)蛋白质晶体而解析，当用旋转阳极生成的X-射线进行分析时该晶体衍射为2.0的分辨率。Tyr5Val、GIn45Ser、Lys65Asn、Lys97Ser、Lys134Glu取代通过Betv1(2628)的结构电子密度图证实，该图也显示总的α-碳骨架三级结构是保守的。
Betv1(2637)突变体的结构分析
纯化的Betv1(2637)突变体的结构完整性用圆二色(CD)谱分析。图18显示以近乎相同的浓度记录的重组Betv1.2801(野生型)和Betv1(2637)突变体的CD谱。来自2个重组蛋白质的CD谱中峰幅和位置的交迭显示这2种制备物含有相同量的二级结构，这强有力地暗示α-碳骨架三级结构没有受到氨基酸替换引入的影响。
Betv1(2628)和Betv1(2637)突变体的IgE结合特性
在液相IgE抑制测定中比较Betv1(2628)和Betv1(2637)以及Betv1(2628)与Betv1(2637)的1∶1混合物同重组野生型Betv1.2801的IgE结合性质，该测定使用衍生自桦木过敏反应患者的血清IgE库。
如在实施例1中所述，重组Betv1.2801以摩尔比为1∶5进行生物素化(Betv1第2801：生物素)。抑制测定如下进行：将血清样品(25μl)与固相抗IgE温育，洗涤，重悬并进一步同生物素化的Betv1.2801和给定的突变体或两种突变体的1∶1混合物温育。根据与吖啶酯标记的链霉抗生素蛋白保温后测定的RLU评价结合到固相上的生物素标记的Betv1.2801的量。以使用缓冲液和突变体作抑制剂获得的RLU之间的比率计算抑制的程度。
图19表示由非生物素化的Betv1.2801和由Betv1(2628)、Betv1(2637)以及Betv1(2628)与Betv1(2637)的1∶1混合物对生物素化的重组Betv1.2801与来自过敏反应患者库的血清IgE的结合的抑制作用。
对血清库中存在的血清IgE的结合达到50％抑制所需的各重组蛋白的量有明显的区别。重组Betv1.2801在大约5ng达到50％的抑制，而Betv1(2628)突变体的相应浓度是大约15-20ng。这说明在Betv1(2628)突变体中导入的点突变将对特异性血清IgE的亲和性大约降低了3-4倍。
用Betv1(2628)突变体所达到的最大抑制水平比重组Betv1.2801明显更低。这表明导入点突变后，存在于血清库中的一些特异性IgE不能识别Betv1(2628)突变体。
Betv1(2637)在约400-500ng达到50％的抑制，显示在Betv1(2637)突变体中引入的点突变使其与Betv1.2801相比将对特异血清IgE的亲和力降低了80-100倍。在IgB结合中的巨大差异进一步由Betv1.2801抑制曲线与Betv1(2637)突变体蛋白质抑制曲线相比后所得的显著倾角差别所支持。不同的倾角提供证据表明IgE结合的减少归因于该突变体(与Betv1.2801相比)截然不同的表位模式。
除用单独修饰的过敏原进行抑制测定之外，对分别与Betv1(2628)或Betv1(2637)的样品具有等摩尔浓度的Betv1的Betv1(2628)和Bet11(2637)的1∶1混合物进行检验，它们显示能彻底抑制rBetv1.2801对IgE的结合(100％)。彻底抑制IgE结合的能力清楚表明所有存在于Betv1.2801上的活性表位也存在于1∶1的过敏原混合物中。进一步的证明来自Betv1.2801和过敏原混合物两种抑制曲线的相当的倾角。混合的过敏原样品减少的IgE反应性通过为得到50％的IgE结合抑制需要比Betv1.2801时高4倍浓度的过敏原混合物来证明。
用突变的重组Betv1过敏原进行T细胞增殖测定
该分析如参考文献15所述方法进行。Betv1(2628)和Betv1(2637)两者均能够诱导来自桦木花粉过敏患者中的T细胞系的增殖，其刺激指数与重组体和天然存在的情况相似。这表明Betv1(2628)和Betv1(2637)突变体蛋白质均能起始对抗体生产所必需的细胞免疫反应。
人嗜碱性粒细胞的组胺释放测定
嗜碱性白细胞组胺释放如下进行。从每个桦木花粉过敏患者取肝素化的血液(20ml)，贮存于室温，并在24小时内使用。将25微升肝素化的全血置于玻璃纤维覆盖的微量滴定孔中(ReferenceLaboratory，Copenhagen，丹麦)并与25微升的过敏原或抗IgE于37℃温育1小时。然后漂洗平板并去除干扰物质。最后，结合到微纤维上的组胺进行荧光分光光度测量。
Betv1(2628)和Betv1(2637)突变体蛋白质的组胺释放性质
组胺释放的数据在图20和图21中显示。测定了Betv1(2628)和Betv1(2637)突变体蛋白质在来自两个桦木花粉过敏患者的人嗜碱性粒细胞中诱导组胺释放的潜能。与Betv1.2801的释放曲线相比，两种突变过敏原的释放曲线都明显地右移。该移动表明Betv1(2628)和Betv1(2637)的潜能减少了3～10倍。
突变体Betv1(2744)和突变体Betv1(2753)
同样构建了Betv1(2744)和Betv1(2753)突变体用作混合过敏原疫苗。如图22和23所示，在这些突变过敏原中，点突变被调整分布于整个表面，并还分别在两个分子中被设计为影响不同的表面，如图24所示。然而，这些修饰的过敏原也可单独用作单一过敏原疫苗。
Betv1(2744)突变体蛋白的结构分析
纯化的Betv1(2744)突变体的结构完整性用圆二色(CD)谱分析。图25显示以近乎相同的浓度记录的重组Betv1.2801(野生型)和Betv1(2744)突变体的CD谱。来自2个重组蛋白质的CD谱中峰幅和位置的交迭显示2种制备物含有相同量的二级结构，这强有力地表明α-碳骨架三级结构没有受到导入的氨基酸取代的影响。
Betv1(2744)的组胺释放性质
从来自5种不同花粉过敏患者的嗜碱性白细胞的5个实验中得来的组胺释放数据在图26和图27A-D中显示。测定了Betv1(2744)突变体蛋白质在人嗜碱性粒细胞中诱导组胺释放的潜能。与Betv1.2801的释放曲线相比，突变过敏原的释放曲线明显地右移。该移动表明Betv1(2744)的潜能减少了3～5倍。
突变体Betv1(2733)
构建并重组表达了突变体Betv1(2733)。Betv1(2733)突变体中点突变的分布保留了几个＞4002的表面区域未被改变。图28表示在Betv1(2733)分子表面引入的点突变。
实施例5
该实施例描述重组Betv1过敏原突变体的特征，这些突变体带有多于4个突变，并且具有与现有技术PCT/DK 01/00764相比降低的IgE结合亲合力。本发明的突变体被相应制备和测试。
重组和突变Betv1的T细胞反应性
目的
通过增殖和细胞因子产量研究突变过敏原的体外T细胞反应。
方法：
在下述研究中使用来自过敏患者的PBL(外周血淋巴细胞)。
为了维持T-细胞所呈递的betv1同种型的种类，用天然纯化的betv1从PBL建立了8个betv1特异性T细胞系，如以前公开的方法所述(26)。
用桦木提取物(Betv)、天然纯化的betv1(nBetv1)、重组Betv1(rBetv1或wt；27)和rBetv1的4种不同突变体(在别处所述)：2595、2628、2637、2744、2773刺激10个PBL和8个T-细胞系。随后发现2637突变体部分解折叠，将不予讨论。
简单说：在一个96孔圆底平板上每孔加入2×105的PBL。以3种不同浓度一式四份加入不同的桦木样品并使其生长6天。在第6天，收获具有最高浓度桦木的各孔的半数体积(100μl)细胞，以用于细胞因子的生产。将放射性标记的胸苷加入到孔中。第二天(第7天)在滤器中收获细胞。将闪烁液加入到滤器中，其放射性用闪烁计数器进行测量。
同样地，在一个96孔圆底平板上，每孔加入3×104的T-细胞，并用自身辐射的PBL(1×105细胞/孔)和3种不同浓度的不同桦木样品进行刺激。1天后，收获来自具有最高浓度桦木的各孔细胞以用于细胞因子的生产。将放射性标记的胸苷加入到孔中。在第2天在滤器中收获细胞并如对PBL所述进行计数。
收集来自四份的上清夜，并用来自Becton Dickinson的CBA(细胞因子珠阵列(cytokine bead array))试剂盒来测量细胞因子。
结果：
10个PBL培养物显示出对桦木的特异性刺激。通常，对不同桦木样品的PBL增殖比较相似，尽管可看到变化。在3个PBL中，nBetv1能比rBetv1和突变体更好刺激增殖。突变桦木样品与rBetv1几乎一样地刺激PBL(图29)。图29表示上述Betv1制备物的刺激指数。刺激指数(SI)是被刺激样品的增殖(cpm：每分钟的读数)除以培养基(medium)对照的增殖(cpm)来计算的。PPD指来自结核分枝杆菌(mucobacterium tuberculosis)的纯化蛋白质衍生物，它充当阳性对照。
细胞因子的产量受IFN-γ的控制且随PBL的增殖按比例增加。Th1/Th2替换的信号不明显(图30-32)。图30表示具有Th0特征的患者，图31表示Th1特征而图32表示Th2特征。细胞因子产量用pg/ml测量(如条形图所示)，IL-5/IFN-γ之间的比率是靠下方的虚线(右侧的Y轴)。用cpm测量增殖，如右侧Y轴上所示，表示为实线。以培养基(medium)和MBP(麦芽糖结合蛋白质)作为背景对照。
在nBetv1上建立8个T-细胞系，除一个之外，其余的全部对所有桦木样品具有同等优良程度的增殖。4个T细胞系基于IL-5和IFN-γ的比率(Th2＞5，5＞Th0＞0.2，0.2＞Th1)而分泌Th0样细胞因子。3个T细胞系分泌Th1细胞因子，1个T细胞系分泌Th2细胞因子。IL-5/IFN-γ的比率不受不同桦木样品的影响。
结论：
对nBetv1显示特异性刺激的所有PBL培养物和7/8个T细胞系也对rBetv1和突变体起反应。这些数据表示对于T细胞的刺激，单一的Betv1的同种型或这4个突变体可替换在天然过敏原制备物中发现的单独同种型的混合物。因而，基于重组过敏原或这4个突变体的疫苗将针对现存的Betv1特异性T细胞群体。
实施例6
该实施例描述重组Betv1过敏原突变体的特征，这些突变体带有多于4个突变，并且具有与现有技术PCT/DK 01/00764相比降低的IgE结合亲合力。本发明的突变体被相应制备和测试。
在用重组和突变体Betv1蛋白质免疫接种后诱导Betv1特异性IgG抗体和阻断抗体
在本部分中，术语“阻断抗体”定义为与人IgE抗体不同的抗体，它能够结合抗原并阻止人IgE抗体对该抗原的结合。
在小鼠免疫接种实验中检验重组Betv1 2227野生型蛋白质(rBetv1)和Betv1 2595，2628，2744及2773突变体蛋白质诱导Betv1特异性IgG抗体和阻断抗体的能力。
用重组Betv1 2227野生型蛋白质或4个突变体蛋白质对BALB/cA小鼠(每组8个)腹膜内注射进行免疫接种。该小鼠以14天的剂量间隔免疫接种4次。将不同的蛋白质连接到1.25mg/ml的Alhydrogel上(氢氧化铝凝胶，1，3％pH 8.0-8.4，SuperfosBiosector)。该小鼠用1μg蛋白/剂量或10μg蛋白/剂量免疫接种。血液样品在第0，14，35，21，49和63天从眼眶采血获取。
用rBetv1包被的微量滴定板和生物素化兔抗小鼠lgG抗体(Jackson)作为探测抗体，通过直接ELISA分析特异性IgG抗体水平。重组Betv1 2227野生型蛋白质或4种突变体蛋白质的免疫接种诱导了很强的rBetv1特异性IgG反应。该发现证明4种突变的蛋白质能够诱导与Betv1 2227野生型蛋白质高度交叉反应的抗体。
为了评价阻断抗体的诱导，将来自桦木过敏患者的血清样品与包被了单克隆小鼠抗人IgE抗体的顺磁珠温育。温育后，将珠子洗涤并重悬于缓冲液或来自未免疫接种小鼠(对照)或上述免疫接种小鼠的小鼠血清的稀释样品(1∶100)中。然后将生物素化的rBetv1加入到该珠和小鼠血清抗体的混合物中。温育之后，洗涤珠子，用吖啶(acridinium)标记的链霉抗生素探测其结合的生物素化rBetv1。珠子和来自未免疫接种小鼠血清的温育并没有改变rBetv1与珠子的结合。相反的，珠子与来自用重组Betv1 1227野生型蛋白质或4种突变体蛋白质免疫接种的小鼠血清的温育显著地减少了Betv1与珠子的结合，这证明了在血清样品中存在Betv1特异性阻断抗体。结果，在第63天，来自所有高剂量(10μg/剂量)免疫接种组的一种或多种血清样品能够将Betv1与珠子的结合减少80％以上。这些发现证明4种突变的蛋白质能够诱导可充当Betv1特异性阻断抗体的抗体。
实施例7
该实施例描述重具有12个突变的本发明突变体的结构特征和IgE结合特性。在突变体3007中导入的突变在实施例2中描述。
Betv1(3007)突变体蛋白的结构分析
如实施例1所述，纯化的Betv1(3007)突变体的结构完整性用圆二色(CD)谱分析。图33显示以近乎相同的浓度记录的重组Betv1.2801(野生型)和Betv1(3007)突变体的CD光谱。来自2个重组蛋白质的CD光谱中峰幅和位置的交迭显示这2种制备物含有相同量的二级结构，这强有力地表明α-碳骨架三级结构没有受到氨基酸替换引入的影响。
Betv1(3007)突变蛋白的IgE结合特性
图34表示由非生物素化的Betv1.2801(野生型)和Betv1(3007)根据实施例4所述方法对生物素化重组Betv1.2801与来自过敏反应患者库的血清IgE的结合的抑制作用。对血清库中存在的血清IgE的结合达到50％抑制所需的各重组蛋白的量有明显的区别。重组Betv1.2801在大约5ng达到50％的抑制，而Betv1(3007)突变体的相应浓度是大约200ng。Betv1(3007)突变体达到的抑制水平明显低于重组Betv1.2801。这说明在Betv1(3007)突变体中导入的12个点突变降低了对特异性血清IgE的亲和性。
参考文献
1.WO 97/30150(Pangenetics B.V.，Molecules for the induction ofimmunological tolerance)
2.WO 92/02621(Biomay Biotechnik Produktions-und HandelsgesellschaftmbH，Allergens of Alder pollen and applications thereof)
3.WO 90/11293(Immunologic Pharmaceutical Corporation，The Universityof North Carolina at Chapel Hill，Aliergenic proteins from ragweed and usesthereof)
4.Takai T，Yokota T，Yasue M，Nishiyama C，Yuuki T，Mori A，Okudaira H，Okumura Y：″Engineering of the major house dust mite allergen Der f 2 forallergen-specific immunotherapy″.Nat Biotechnol 15，754-758(1997).
5.Smith AM，Chapman MD：″Localization of antigenic sites on Der p 2 usingoligonucleotide-directed mutagenesis targeted to predicted surface residues″.Clin Exp Allergy 27，593-599(1997).
6.Aki T，Ono K，Hidaka Y，Shimonishi Y，Jyo T，Wada T，Yamashita M，Shigeta S，Murooka Y，Oka S：″Structure of IgE epitopes on a new 39-kDallergen molecule from the house dust mite，Dermatophagoides farinae″.IntArch Allergy Immunol 103，357-364(1994).
7.Frster E，Dudler T，Gmachl M，Aberer W，Urbanek R，Suter M：″Naturaland recombinant enzymatically active or inactive bee venom phospholipaseA2 has the same potency to release histamine from basophils in patients withHymenoptera allergy″.J Allergy Clin Immunol 95，1229-1235(1995).
8.Burks AW，Shin D，Cockrell G，Stanley JS，Helm RM，Bannon GA：″Mapping and mutational analysis of the IgE-binding epitopes on Ara h 1，aIegume vicilin protein and a major allergen in peanut hypersensitivity″.Eur JBiochem 245，334-339(1997).
9.Stanley JS，King N，Burks AW，Huang SK，Sampson H，Cockrell G，HelmRM，West CM，Bannon GA：″Identification and mutational analysis of theimmunodominant IgE binding epitopes of the major peanut allergen Ara h 2″.Arch Biochem Biophys 342，244-253(1997).
10.Ferreira F，Rohlfs A，Hoffmann-Sommergruber K，Schenk S，Ebner C，Briza P，Jilek A，Kraft D，Breitenbach M，Scheiner O：″Modulation of IgE-binding properties of tree pollen allergens by site-directed mutagenesis″.AdvExp Med Biol 409，127-135(1996).
11.Ferreira F，Ebner C，Kramer B，Casari G，Briza P，Kungl AJ，Grimm R，Jah-Schmid B，Breiteneder H，Kraft D，Breitenbach M，Rheinberger H-J，Scheiner O，″Modulation of IgE reactivity of allergens by site-directedmutagenesis：Potential use of hypeallergenic variants for immunotherapy″，FASEB Journal for Experimental Biology Vol.12，No.2，February 1998，231-242(1998).
12.Wiedemann P，Giehl K，Almo SC，Fedorov AA，Girvin M，Steinberger P，Rüdiger M，Ortner M，Sippl M，Dolecek C，Kraft D，Jockusch B，Valenta R：″Molecular and structural analysis of a continuous birch profilin epitopedefined by a monoclonal antibody″，J Biol Chem 271，29915-29921(1996)，
13.Alvarez AM，Fukuhara E，Nakase M，Adachi T，Aoki N，Nakamura R，Matsuda T：″Four rice seed cDNA clones belonging to the alpha-amylase/trypsin inhibitor gene family encode potential rice allergens″.BiosciBiotechnol Biochem 59，1304-1308(1995).
14.Colombo P，Kennedy D，Ramsdale T，Costa MA，Djro G，Izzo V，Salvadori S，Guerrini R，Cocchiara R，Mirisola MG，Wood S，Geraci D，Journal of Immunology Vol.160，No.6，15 March 1998，2780-2875.
15.Spangfort MD，Ipsen H，Sparholt SH，Aasmul-Olsen S，Larsen MR，MrtzE，Roepstorff P，Larsen JN：″Characterization of Purified Recombinant Bet v1 with Authentic N-terminus，Cloned in Fusion with Maltose-Binding Protein″.Prot Exp Purification 8，365-373(1996a).
16.Ipsen H，Wihl J-，Petersen BN，Lwenstein H：″Specificity mapping ofpatients IgE response towards the tree pollen major allergens Alng1，Betv1and Cora1.″Clin.Exp.Allergy 22，391-9，(1992)
17.Gajhede M，Osmark P，Poulsen FM，Ipsen H，Larsen JN，Joost vanNeerven RJ，Schou C，Lwnstein H，and Spangfort MD：″X-ray and NMRstructure of Betv1，the origin of birch pollen allergy″.Nature structuralbiology 3，1040-1045(1996).
18.Altschul SF，Gish W，Miller W，Myers EW，and Lipman DJ：″Basic Iocalalignment search tool″J.Mol.Biol.215，403-410(1990).
19.Higgins D，Thompson J，Gibson T，Thompson JD，Higgins DG，andGibson TJ：″CLUSTAL W：improving the sensitivity of progressive multiplesequence alignment through sequence weighting，position-specific gappenalties and weight matrix choice″.Nucleic Acids Res.22，4673-4680(1994).
20.Saiki RK，Gelfand DH，Stoffel S，Scharf SJ，Higuchi R，Horn GT，MullisKB，Erlich HA：″Primer-directed enzymatic amplification of DNA with athermostable DNA polymerase″.Science 239，487-491(1988).
21.Spangfort MD，Larsen JN，Gajhede M：″Crystallization and Preliminary X-ray Investigation at 2.0 Resolution of Betv1，a Birch Pollen ProteinCausing IgE-Mediated Allergy″.PROTEINS，Struc Func Genet 26，358-360(1996b).
22.Monsalve Rl，Lu G，and King TP：″Recombinant venom allergen，antigen5 of yellowjacket(Vespula vulgaris)and paper wasp(Polistes annularis)byexpression in bacteria or yeast”(1999)Submitted.
23.Fang KSF，Vitale M，Fehlner P and King TP：″cDNA cloning and primarystructure of a white-face hornet venom allergen，antigen 5”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，895(1988).
24.Lu G，Villalba M，Coscia MR，Hoffman DR and King TP：″SequenceAnalysis and Antigenic Cross-reactivity of a Venom Allergen，Antigen 5，fromHornets，Wasps，and Yellow Jackets”.Journal of lmmunology 150，2823-2830(1993).
25.Punnonen J：″Molecular Breeding of Allergy Vaccines and AntiallergicCytokines″.Int Arch Allergy Immunol 2000；121：173-182.
26.P.A.Würtzen，M.Wissenbach，H.Ipsen，A.Bufe，J.Arnved，and R.J.J.van Neerven.J Allergy Clin Immunol，1999；104：115-23.
27.Sparholt SH，Larsen JN，Ipsen H，Schou C，van Neerven RJ.Clin ExpAllergy 1997 Aug；27(8)：932-41.