脱细胞真皮基质材料的制备方法 一、技术领域
本发明涉及一种脱细胞真皮基质材料的制造方法，属于生物医用材料的加工领域。
二、背景技术
无论是战争还是和平时期，总会有因烧伤、创伤或战伤遗留的创面，因此创面修复就成为医疗救治的永恒主题。随着科学技术的不断发展和进步，可用于创面修复的材料日渐增多，如自体皮、异体皮、人工皮和生物敷料等。现有的创面修复材料虽有一定的康复效果，但仍不能满足临床的需要。
脱细胞真皮基质材料(acellular dermal matrix，ADM)是近几年来在烧伤和整形外科领域中得到临床应用的一种真皮替代品，其原料是异体皮和异种皮。
美国Lifecell公司生产的AlloDerm是最早见诸报道的脱细胞异体真皮。Krejci等将尸体皮经三次冻融循环后，用500rad的γ射线照射12min，然后在37℃的PBS(磷酸式盐缓冲溶液)中浸泡7-14天，再采用机械方法除去表皮，然后，置于温度为37℃的PBS中浸泡3周，直到光镜下观察组织切片无细胞为止。Matoskiva等用胰蛋白酶在温度为37℃处理猪皮2h，去表皮后，将真皮在PBS中彻底清洗，再用胰蛋白酶在37℃下处理1h，然后在培养液中漂洗，再浸入水中浸泡至少3天以除去细胞和抗生素的残余成分。Wainwright等将尸体皮在RPMI1640培养液中孵育过夜，张力条件下诱导锚状纤维从基底细胞半桥粒上分离，在不改变胶原或破坏基底膜的情况下，除去真皮基质中的成纤维细胞。Livesey等先将猪皮在RPMI1640培养液中过夜，然后在1mol/LNaCl中于温度为37℃下孵育，再在0.5％SDS(Sodium dodecyl suphate，SDS)中孵育1h，直到光镜下辨认不出细胞为止。Medalie等将尸体皮快速冻融后，再在PBS中孵育以制备脱细胞真皮基质材料(ADM)。国内孙永华等用20％福尔马林对大鼠皮肤的细胞外基质进行交联，使用胰蛋白酶及EDTA螯合剂去表皮，保留基底膜，再用DNA酶、RNA酶及其它化学试剂和低渗化合物缓冲液以及EDTA螯合剂等，对真皮内可引发宿主细胞识别反应的细胞成分进行处理。1998年，孙永华还报道了利用脱细胞异体真皮与自体薄皮片复合移植成功。此外，还有Custafson等用Dispase和TritonX-100处理尸体皮各12h的方法来制备ADM的报道。
由于异体脱细胞真皮基质来源有限，价格昂贵，且存在传染疾病的危险，科学家们开始将目光投向异种脱细胞真皮基质材料地研制。国内由江苏启东医用材料研究所率先推出异种(猪)脱细胞真皮基质材料，做工精良，厚薄均匀，经临床使用后获得圆满成功，其移植效果几乎不亚于脱细胞异体真皮。基制备方法是：将50Kg左右无皮肤疾患的健康白色小猪活杀后，剃毛洗净皮肤，剥下大张皮，在电动劈皮机上制成厚度为0.3-0.5mm的断层皮片，裁剪成4cm×5cm大小的皮片，用洗必泰溶液消毒后，浸入高渗盐水24h，轻轻撕去表皮，戊二醛交联后，用含胰蛋白酶为主要成分的脱细胞液去细胞，生理盐水冲洗，用特制的制网机制成网孔后备用。
概括地说，已有的脱细胞真皮基质材料制备方法，主要包括去表皮、脱真皮细胞及冷冻干燥处理等三个基本步骤，有两种情况。(1)尸体皮经高渗盐水和十二烷基硫酸钠(SDS)处理，形成NaCl-SDS ADM；(2)经DispaseII处理后，再经TritonX-100处理，形成Dispase-Triton ADM。
已有的脱细胞真皮基质材料，一般处于实验研究阶段，尚未见大规模工业化生产的报道，且存在以下不足：
1.操作复杂，周期长，费工费时；
2.多为手工操作，劳动强度大；
3.基质材料中存在大量毛根及其它杂质；
4.无规范制备工艺和专用设备、材料，无法确保目标材料的质量与性能。
三、发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供的一种脱细胞真皮基质材料的制备方法，其特点是采用健康的动物皮为原料，应用复合酶皮胶原处理剂和碱等化学物质，制备具有良好生物相容性和适当的生物降解速率的脱细胞真皮基质材料。
本发明的目的由以下技术措施实现，其中所述原辅材料的份数除特殊说明外，均为重量份数。
脱细胞真皮基质材料的制备方法：
1.清洗：选取健康的动物，经屠宰，剥下其皮，取新鲜动物皮100份，放入转鼓中，加入常温水200-500份，盖上转鼓门，转动30-150min，控干废液。加入常温水200-500份，盖上转鼓门，转动30-150min，控干废液，如此反复操作2-6次，然后充分水洗。
2.预脱脂：用温度40-50℃的热水预热调温，使转鼓中液体的温度达到36-42℃。控干。加入温度34-42℃的热水200-500份，加入平平加0.5-10.0份、纯碱0.5-12.0份和渗透剂JFC 0.2-1.0份，转动30-120min。控干废液。加入温度30-36℃热水200-600份，转动20-120min，控干废液。再加入30-36℃，热水200-600份，转动20-120min。控干废液，如此反复操作2-6次。
3.二次脱脂：用温度为40-46℃的热水预热调温，使转鼓中液体的温度达到36-42℃。控干。加入36-42℃的热水200-500份，加入脱脂剂PT-101 1.0-10.0份，平平加0.2-8.0份，洗衣粉0.2-10.0份，转动30-240min，控干废液。再加入30-36℃热水200-600份，转动20-120min。控干废液，如此反复操作2-6次。然后，控干废液。
4.预热：用温度为40-46℃的热水预热调温，使转鼓中液体的温度达到24-30℃。控干废液。取出动物皮，立即放入专用恒温柜中，静置沥水2-8h。要求室温与专用恒温柜中的温度相同，可控制温度为24-32℃。
5.涂酶堆置：沥水达到动物皮的含水量约为60-65％，将事先配制好的酶糊均匀涂于动物皮的肉面。酶糊的配方为：复合酶皮胶原处理剂E-894 20-100份，水10-50份。涂好后，肉面对肉面平铺整齐，用塑料薄膜盖严。全部操作均在恒温下进行，堆置时间18-50h。
6.手工去毛：涂酶达到要求后，手工拔去皮板上的针毛和绒毛。
7.清洗：将手工去毛的动物皮放入转鼓中，加入常温水200-600份，盖上转鼓门，转动30-180min。控干废液。加入常温水200-600份，盖上转鼓门，转动30-180min，控干废液，如此反复操作2-6次。加入NaCl5-30份，加入常温水100-400份，转动30-240min。控干废液。加入常温水200-600份，盖上转鼓门，转动30-180min。控干废液。再按上述方法重复操作2-6次。然后，充分水洗。控干废液。
8.拔毛：清洗、水洗后，加入温度为20-30℃水100-400份，加入氢氧化钠0.5-10.0份，转动30-240min。用镊子除去残留在每块动物皮上的针毛及绒毛。
9.剖层：动物皮上的残留针毛及绒毛完全除去干净后，在精密剖层机上剖层，剖层厚度：带粒面的头层皮剖层厚度为0.4-1.0mm；不带粒面的二层皮剖层厚度为0.4-1.2mm。剩余部分回收用作提取皮胶原的原料。
10.脱碱：取带粒面的头层皮或个带粒面的二层皮100份，加入乳酸0.2-3.0份，氯化铵1.0-6.0份，或硫酸铵0.6-6.0份，转动30-180min。控去废液。
11.清洗：加入常温水200-600份，NaCl 5-30份，转动30-240min。控干废液。加入常温水200-600份，转动30-150min，控干废液。按上述方法重复操作2-6次。然后，充分水洗，控干废液。将皮从转鼓中取出，用离心机脱水。再将皮放入转鼓中，加入去离子水200-600份，转动30-180min。控干废液。按此方法重复操作2-6次。然后，将皮从转鼓中取出，用离心机脱水。
12.将经脱水的动物皮，放入冷冻干燥机的冷冻室内冻干后，再经剂量为6.0-30.0KGy/h的60Co所产生的γ射线幅照消毒灭菌、成型包装，即为成品。
本发明脱细胞真皮基质材料的制备方法中所用动物皮为新鲜的无病毒感染的、无皮肤病及无病史的动物皮，若为猪、牛、羊家畜皮，则应选取未用饲料喂养的猪、牛、羊家畜。
本发明脱细胞真皮基质材料的制备方法中所用转鼓为悬挂式木转鼓和不锈钢转鼓。
采用本方法所制备的脱细胞真皮基质材料，能够满足以下医学应用的要求：
1.作为真皮的替代品，用于烧伤创面的修复。对于浅II度烧伤和深III度烧伤有显著疗效，对于III烧伤有明显疗效。
2.用于溃疡皮肤的修复，尤其适用于因糖尿病引起的皮肤溃疡的医治。
3.隆胸、隆唇和隆鼻。将目标材料进行适当的本体改性的处理后，可用于隆胸、隆唇及隆鼻等医疗手术。
4.可以用于眼科整形、面部软组织缺损的修复等。
本发明具有以下优点：
1.在维持动物皮三维组织构造不变的前提下，彻底清除了动物皮中的非胶原成分如细胞、细胞碎片和其它细胞外基质成分，得到具有完整的三维组织构造的真皮。
2.方法极为简便、易行，经济、合理、安全、可靠。
3.整个工艺过程属于清洁化生产，对环境无污染。
四、具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容作出一些非本质的改进和调整。
实施例1
(1)清洗：选取健康的猪，经屠宰，剥下皮，取新鲜猪皮100kg，放入转鼓中，加入常温水200kg，盖上转鼓门，转动60min。控干废液。加入常温水200kg，盖上转鼓门，转动60min，控干废液，如此反复操作3次。然后充分水洗。
(2)预脱脂：用温度为40℃的热水预热调温，使转鼓中液体的温度达到36C。控干。加入温度为36℃的热水200kg，加入平平加3.0kg、纯碱2.5kg和渗透剂JFC0.4kg，转动40min。控干废液。加入温度为30℃的热水200kg，转动40min，控干废液。再加入30℃的热水300kg，转动40min。控干废液，如此反复操作3次。
(3)二次脱脂：用温度为40℃的热水预热调温，使转鼓中液体的温度达到36℃，控干废液。加入36℃的热水200kg，加入脱脂剂PT-101 3.0kg，平平加2.0kg，洗衣粉2.5kg，转动90min，控干废液。加入温度为30℃的热水300kg，转动70min，控干废液。再加入温度为30℃热水300kg，转动70min，控干废液。如此反复操作2次。然后，控干废液。
(4)预热：用温度为40℃的热水预热调温，使转鼓中液体的温度达到24℃，控干废液。取出猪皮，立即放入专用恒温柜中，静置沥水2h。要求室温与专用恒温柜中的温度相同，可控制在24℃。
(5)涂酶堆置：沥水达到猪皮的含水量约为60-65％后，将事先配制好的酶糊均匀地涂于动物皮的肉面。酶糊的配方为，复合酶皮胶原处理剂E-894 20kg，水10kg。涂好后，肉面对肉面平铺整齐，用塑料薄膜盖严。全部操作均在恒温下进行，堆置时间18h。
(6)手工去毛：涂酶达到要求后，手工拔去皮板上的针毛和绒毛。
(7)清洗：将手工去毛的皮放入转鼓中，加入常温水300kg，盖上转鼓门，转动60min，控干废液。加入常温水300kg，盖上转鼓门，转动60min。控干废液。如此反复操作3次。加入NaCl 15kg，加入常温水200kg，转动60min。控干废液。再按上述方法重复操作3次。然后，充分水洗，控干废液。
(8)拔毛：清洗、水洗完毕后，加入20℃水200kg，加入氢氧化钠3.0kg，转动90min。用镊子拔去残留在每块动物皮上的针毛和绒毛。
(9)剖层：残留在动物皮上的针毛或绒毛完全除去干净后，在精密剖层机上剖层，剖层厚度：带粒面的头层皮剖层厚度为0.50mm；不带粒面的二层皮剖层厚度为0.60mm，剩余部分回收用作提取皮胶原的原料。
(10)脱碱：取带粒面的头层皮或不带粒面的二层皮100kg，加入乳酸1.0kg，氯化铵或硫酸铵2.0kg，转动120min。控去废液。
(11)清洗：加入常温水300kg，NaCl 10kg，转动120min，控干废液。加入常温水300kg，转动90min，控干废液。按上述方法重复操作3次。然后，充分水洗，控干废液。将猪皮从转鼓中取出，用离心机脱水。再将猪皮放入转鼓中，加入去离子水300kg，转动120min，控干废液。按此方法重复操作3次。然后，将猪皮从转鼓中取出，用离心机脱水。
(12)将经脱水的猪皮，放入冷冻干燥机的冷冻室内冻干后，再经剂量为10.0KGy/h的60Co所产生的γ射线幅照消毒灭菌、成型包装，即为成品。
实施例2
(1)清洗：选取健康的山羊，经屠宰，剥下皮，取新鲜山羊皮100kg，放入转鼓中，加入常温水350kg，盖上转鼓门，转动90min。控干废液。加入常温水350kg，盖上转鼓门，转动90min，控干废液，如此反复操作4次。然后充分水洗。
(2)预脱脂：用温度为45℃的热水预热调温，使转鼓中液体的温度达到3g℃。控干。加入温度为38℃的热水350kg，加入平平加7.0kg、纯碱6.5kg和渗透剂JFC 0.7kg，转动75min。控干废液。加入温度为34℃的热水400kg，转动75min，控干废液。再加入34℃的热水400kg，转动75min。控干废液，如此反复操作4次。
(3)二次脱脂：用温度为44℃的热水预热调温，使转鼓中液体的温度达到38℃，控干废液。加入38℃的热水350kg，加入脱脂剂PT-101 7.0kg，平平加5.0kg，洗衣粉6.5kg，转动120min，控干废液。加入温度为33℃的热水400kg，转动90min，控干废液。再加入温度为33℃热水400kg，转动90min，控干废液。如此反复操作4次。然后，控干废液。
(4)预热：用温度为43℃的热水预热调温，使转鼓中液体的温度达到27℃，控干废液。取出山羊皮，立即放入专用恒温柜中，静置沥水5h。要求室温与专用恒温柜中的温度相同，可控制在27℃。
(5)涂酶堆置：沥水达到山羊皮的含水量约为60-65％后，将事先配制好的酶糊均匀地涂于动物皮的肉面。酶糊的配方为，复合酶皮胶原处理剂E-894 60kg，水30kg。涂好后，肉面对肉面平铺整齐，用塑料薄膜盖严。全部操作均在恒温下进行，堆置时间36h。
(6)手工去毛：涂酶达到要求后，手工拔去皮板上的针毛和绒毛。
(7)清洗：将手工去毛的山羊皮放入转鼓中，加入常温水450kg，盖上转鼓门，转动120min，控干废液。加入常温水450kg，盖上转鼓门，转动120min。控干废液。如此反复操作4次。加入NaCl 20kg，加入常温水300kg，转动180min。控干废液。再按上述方法重复操作4次。然后，充分水洗，控干废液。
(8)拔毛：清洗、水洗完毕后，加入25℃水300kg，加入氢氧化钠6.5kg，转动180min。用镊子拔去残留在每块动物皮上的针毛和绒毛。
(9)剖层：残留在动物皮上的针毛或绒毛完全除去干净后，在精密剖层机上剖层，剖层厚度：带粒面的头层皮剖层厚度为0.50mm；不带粒面的二层皮剖层厚度为0.60mm，剩余部分回收用作提取皮胶原的原料。
(10)脱碱：取带粒面的头层皮或不带粒面的二层皮100kg，加入乳酸2.5kg，氯化铵或硫酸铵4.0kg，转动150min。控去废液。
(11)清洗：加入常温水450kg，NaCl 15kg，转动180min，控干废液。加入常温水450kg，转动120mm，控干废液。按上述方法重复操作4次。然后，充分水洗，控干废液。将山羊皮从转鼓中取出，用离心机脱水。再将山羊皮放入转鼓中，加入去离子水450kg，转动150mm，控干废液。按此方法重复操作4次。然后，将山羊皮从转鼓中取出，用离心机脱水。
(12)将经脱水的山羊皮，放入冷冻干燥机的冷冻室内冻干后，再经剂量为14.8KGy/h的60Co所产生的γ射线幅照消毒灭菌、成型包装，即为成品。
实施例3
(1)清洗：选取健康的黄牛，经屠宰，剥下皮，取新鲜黄牛皮100kg，放入转鼓中，加入常温水500kg，盖上转鼓门，转动150min。控干废液。加入常温水500kg，盖上转鼓门，转动150min，控干废液，如此反复操作5次。然后充分水洗。
(2)预脱脂：用温度为48℃的热水预热调温，使转鼓中液体的温度达到42℃。控干。加入温度为42℃的热水500kg，加入平平加10.0kg、纯碱12.0kg和渗透剂JFC1.0kg，转动120min。控干废液。加入温度为36℃的热水600kg，转动120min，控干废液。再加入36℃的热水600kg，转动120min。控干废液，如此反复操作5次。
(3)二次脱脂：用温度为46℃的热水预热调温，使转鼓中液体的温度达到42℃，控干废液。加入42℃的热水500kg，加入脱脂剂PT-101 10.0kg，平平加8.0kg，洗衣粉10.0kg，转动180min，控干废液。加入温度为36℃的热水600kg，转动120min，控干废液。再加入温度为36℃热水600kg，转动120min，控干废液。如此反复操作5次。然后，控干废液。
(4)预热：用温度为46℃的热水预热调温，使转鼓中液体的温度达到30℃，控干废液。取出黄牛皮，立即放入专用恒温柜中，静置沥水8h。要求室温与专用恒温柜中的温度相同，可控制在30℃。
(5)涂酶堆置：沥水达到山羊皮的含水量约为60-65％后，将事先配制好的酶糊均匀地涂于黄牛皮的肉面。酶糊的配方为，复合酶皮胶原处理剂E-894 80kg，水40kg。涂好后，肉面对肉面平铺整齐，用塑料薄膜盖严。全部操作均在恒温下进行，堆置时间50h。
(6)手工去毛：涂酶达到要求后，手工拔去皮板上的针毛和绒毛。
(7)清洗：将手工去毛的黄牛皮放入转鼓中，加入常温水600kg，盖上转鼓门，转动180min，控干废液。加入常温水600kg，盖上转鼓门，转动180min。控干废液。如此反复操作6次。加入NaCl 30kg，加入常温水400kg，转动240min。控干废液。再按上述方法重复操作5次。然后，充分水洗，控干废液。
(8)拔毛：清洗、水洗完毕后，加入30℃水400kg，加入氢氧化钠10.0kg，转动240min。用镊子拔去残留在每块黄牛皮上的针毛和绒毛。
(9)剖层：残留在动物皮上的针毛或绒毛完全除去干净后，在精密剖层机上剖层，剖层厚度：带粒面的头层皮剖层厚度为0.50mm；不带粒面的二层皮剖层厚度为0.60mm，剩余部分回收用作提取皮胶原的原料。
(10)脱碱：取带粒面的头层皮或不带粒面的二层皮100kg，加入乳酸3.0kg，氯化铵或硫酸铵5.0kg，转动150min。控去废液。
(11)清洗：加入常温水600kg，NaCl 25kg，转动180min，控干废液。加入常温水600kg，转动150min，控干废液。按上述方法重复操作5次。然后，充分水洗，控干废液。将黄牛皮从转鼓中取出，用离心机脱水。再将黄牛皮放入转鼓中，加入去离子水600kg，转动180min，控干废液。按此方法重复操作5次。然后，将黄牛皮从转鼓中取出，用离心机脱水。
(12)将经脱水的黄牛皮，放入冷冻干燥机的冷冻室内冻干后，再经剂量为20.0KGy/h的60Co所产生的γ射线幅照消毒灭菌、成型包装，即为成品。
本发明中所用复合酶皮胶原处理剂为成都迪澳胶原高技术有限公司生产、加酶浸灰助剂EA为广东新会皮革化工厂生产、平平加、洗衣粉和渗透剂JFC为上海助剂厂生产，脱脂剂PT-101为桂林洗涤剂厂生产。其余化学试剂，均为市售的分析纯制剂。