一种植物内生真菌布雷正青霉菌F4A及其应用.pdf

本发明涉及微生物技术领域，具体为一种新的植物内生真菌及其制备布雷菲德菌素A（brefeldin A，BFA）的应用。植物内生真菌为布雷正青霉菌F4a（Eupenicillium brefeldianum F4a），于2012年12月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M2012531。本发明提供了布雷正青霉F4a能产生高含量的BFA，最高发酵产量达1.9g/L；还提供了通过HP20固相萃取和快速硅胶柱色谱或纯结晶技术制备获得高纯度的BFA。该方法生产成本低，且大大减少有机物的处理和污染，该发明具有良好的工业化前景。所制备的BFA具有抗真菌和杀虫活性，是理想的兽用或农用候选药物。

1.  一种植物内生真菌布雷正青霉菌F4a，其特征在于：植物内生真菌为布雷正青霉菌F4a（Eupenicillium brefeldianum F4a），于2012年12月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M2012531。

2.  一种权利要求1所述的植物内生真菌布雷正青霉菌F4a的应用，其特征：利用所述植物内生真菌布雷正青霉菌F4a用以制备布雷菲德菌素A。

3.  一种权利要求1所述的利用植物内生真菌布雷正青霉菌F4a制备布雷菲德菌素A的方法，其特征在于：
1)将布雷正青霉菌F4a发酵种子液按照体积比1:10-1:20接种于PSB发酵培养基，28℃培养7-15d；
2)将上述所得发酵液采用4-6层纱布过滤，固液分离得到上清液及菌丝体；过滤上清液采用HP20大孔吸附树脂固相萃取，用70-100%乙醇洗脱获得粗提物；菌丝体经丙酮提取得提取物；合并两部分提取物减压浓缩后进一步经MeOH精制得到BFA含量超过50-65%的粗提取物；
3)将上述粗提取物用减压快速硅胶柱色谱法分离，使用49:1-0:10（v/v）二氯甲烷/甲醇溶剂系统进行梯度洗脱，收集体积百分比为47:3-44:6的二氯甲烷/甲醇洗脱液，即得纯度为90-99%的布雷菲德菌素A；
或，将所述粗提取物通过丙酮溶解，常温下过夜，即得纯度为90-99%的布雷菲德菌素A。

4.  按权利要求3所述的利用植物内生真菌布雷正青霉菌F4a制备布雷菲德菌素A的方法，其特征在于：
所述步骤1）将菌株F4a用划线法接种于PSA培养基上，于28℃恒温培养4-6d；然后采用挖块法接种于装有50mL PSB培养基的250mL三角瓶中，于28℃180rpm恒温摇床培养72h作为发酵种子液。

5.  按权利要求3所述的利用植物内生真菌布雷正青霉菌F4a制备布雷菲德菌素A的方法，其特征在于：所述的化合物可用于制备成医用、兽用或农用非治疗目的的抗真菌剂。

6.  按权利要求3所述的利用植物内生真菌布雷正青霉菌F4a制备布雷菲德菌素A的方法，其特征在于：所述的化合物可用于制备成杀虫剂。

7.  按权利要求5所述的利用植物内生真菌布雷正青霉菌F4a制备布雷菲德菌素A的方法，其特征在于：所述的化合物可作为白色念珠菌、立枯丝核菌、镰刀菌的抑菌剂。

8.  按权利要求6所述的利用植物内生真菌布雷正青霉菌F4a制备布雷菲德菌素A的方法，其特征在于：所述的化合物可制备为杀卤虫剂。

一种植物内生真菌布雷正青霉菌F4a及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体为一种植物内生真菌布雷正青霉菌F4a及其应用。 
背景技术
植物内生菌是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物组织内部，而不使寄主植物表现出明显感染症状（至少暂时没有感染症状）的微生物。在长期的进化过程中与宿主这个其特殊生境形成了特定的互利共生的关系，其生长代谢受宿主、外界环境因子等多方面因素的制约。如今，内生菌所发挥的重要的生理和生态作用及其在农、林业和医药领域中的巨大应用潜力，已逐渐成为国内外研究的热点。因此，丰富多样的植物内生菌已成为在寻找抗肿瘤、抗感染和抗植物病虫害活性物质的重要来源。本发明提供了一株新的植物内生真菌布雷正青霉菌F4a，具有非常强的抗菌和杀虫活性，且其能发酵产生高含量的布雷菲德菌素A（brefeldin A，BFA） 
BFA早在1958年由Singleton等从斜卧青霉菌(Penicillium decumbens)中首次分离得到并被命名为ducumbin.直至1971年Weber等确定了该化合物的绝对构型，并使用brefeldin A作为其名称。从而使这一名称沿用至今。BFA是一种包含13元环的大环内酯类抗生素，它能反竞争性抑制蛋白质从内质网中转运至高尔基体，因此具有抗真菌、抗肿瘤、抗病毒、抗线虫等广泛生物学活性。美国国家癌症研究院研究发现BFA具有选择性抑制和杀死人肿瘤细胞活性。BFA通过不依赖于p53凋亡机制诱导人前列腺癌细胞凋亡，因此，BFA是作为诱导不依赖于p53的细胞凋亡的有效的备选化疗药物。Akira等联合使用低剂量BFA提高吉西他滨（gemcitabine）与对人胰腺癌细胞MIA PaCa-2细胞线的作用效果。可见该化合物作为候选抗肿瘤药物、医药和农药中间体和重要的分子工具试剂具有较大的市场需求。 
BFA结构式如下所示： 
BFA因为其多样性的生物活性和独特的化学结构引起了合成化学家门的兴趣。但由于其含有多个手性中心，因此化学合成比较复杂且收率较低。 同时，由于许多真菌都能发酵产生BFA，包括分枝孢子菌属（Cladosporium）、茎点霉属（Phoma）、拟青霉属（Paecilomyces）、叶点霉属（Phyllosticta）、青霉属（Penicillium）、正青霉属（Eupenicillium）、曲霉属（Aspergillus）等等。因此微生物发酵产生BFA成为一种有效的方式。但是目前报道的微生物发酵产BFA的产量较低。如Howard等发明的美国专利U.S.3896002公开了Phyllosticta medicaginis发酵BFA的产量为300mg/L。刘万云报道青霉菌Penicillium sp.SHZK-15经优化发酵条件后产BFA为151.6mg/L。发明人郑裕国等的中国专利CN101445784A公开了利用低能离子注入技术诱变获得的布雷正青霉变种ZJB082702能发酵产生高达943.8mg/L的BFA。2012年王亚军等进一步对布雷正青霉变种ZJB082702的发酵条件进行优化，最终使BFA的产量达1304.7mg/L。 
发明内容
本发明目的在于提供一种植物内生真菌布雷正青霉菌F4a及其应用。 
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为： 
一种植物内生真菌布雷正青霉菌F4a，植物内生真菌为布雷正青霉菌F4a（Eupenicillium brefeldianum F4a），于2012年12月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M2012531。 
植物内生真菌布雷正青霉菌F4a的应用，其特征：利用所述植物内生真菌布雷正青霉菌F4a用以制备布雷菲德菌素A。 
利用植物内生真菌布雷正青霉菌F4a制备布雷菲德菌素A的方法， 
1)将布雷正青霉菌F4a发酵种子液按照体积比1:10-1:20接种于PSB发酵培养基，28℃培养7-15d； 
2)将上述所得发酵液采用4-6层纱布过滤，固液分离得到上清液及菌丝体；过滤上清液采用HP20大孔吸附树脂固相萃取，用70-100%乙醇洗脱获得粗提物；菌丝体经丙酮提取得提取物；合并两部分提取物减压浓缩后进一步经MeOH精制得到BFA含量超过50-65%的粗提取物； 
3)将上述粗提取物用减压快速硅胶柱色谱法分离，使用49:1-0:10（v/v）二氯甲烷/甲醇溶剂系统进行梯度洗脱，收集体积百分比为47:3-44:6的二氯甲烷/甲醇洗脱液，即得纯度为90-99%的布雷菲德菌素A； 
或，将所述粗提取物通过丙酮溶解，常温下过夜，即得纯度为90-99%的布雷菲德菌素A。 
所述步骤1）将菌株F4a用划线法接种于PSA培养基上，于28℃恒温培养4-6d；然后采用挖块法接种于装有50mL PSB培养基的250mL三角瓶中，于28℃180rpm恒温摇床培养72h作为发酵种子液。 
所述的化合物可用于制备成医用、兽用或农用非治疗目的的抗真菌剂。 
所述的化合物可用于制备成杀虫剂。 
所述的化合物可作为白色念珠菌、立枯丝核菌、镰刀菌的抑菌剂。 
所述的化合物可制备为杀卤虫剂。 
本发明所具有的优点：本发明的植物内生真菌布雷正青霉菌F4a，其具有很强的抗菌和杀虫作用，其能发酵产生含量高达1.9g/L以上的BFA。本发明菌株是产BFA最高的野生菌种。本发明中使用发酵培养基成分简单且产物较单一，可实现简单而高效的提取与分离。即利用树脂采用固相萃取和快速硅胶柱色谱或纯结晶技术可获得高纯度的BFA。该方法生产成本低，且大大减少有机物的处理和污染。该发明具有良好的工业化前景。 
附图说明
图1为本发明实施例提供的布雷正青霉菌F4a的形态学特征。 
图2为本发明实施例提供的布雷正青霉菌F4a基于其ITS基因序列构建的系统进化树。 
图3为本发明实施例提供的化合物brefeldin A的ESIMS图。 
图4为本发明实施例提供的化合物brefeldin A的¹H-NMR(Bruker AV600，CD₃OD)的光谱图。 
图5为本发明实施例提供的化合物brefeldin A的¹³H-NMR(Bruker AV600，CD₃OD)的光谱图 
图6为本发明实施例提供的化合物brefeldin A的X-ray单晶衍射结果。 
图7为本发明实施例提供的布雷正青霉菌F4a发酵产brefeldin A的时间曲线。 
具体实施方式
为了更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明，但本专利的保护内容不仅限于此。 
实施例1植物内生菌布雷正青霉菌F4a的鉴定 
植物内生真菌F4a，于2012年12月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC M2012531，分类学命名为布雷正青霉菌F4a（Eupenicillium brefeldianum F4a）。 
菌株F4a在PDA、马丁氏培养基上生长良好；早期菌落呈纯白色，逐渐菌落中央变成黄绿色；菌落表面呈绒毛状，无渗出液和可溶性色素；成熟后菌落有放射状皱褶，中央稍微隆起，形成色彩明显的圆形菌斑，背面呈黄色。镜下观察，顶端无膨大的顶囊，其分生孢子结构稀少，孢子着生于分生孢子梗，呈扫帚状，小梗顶端分生孢子成串状，分生孢子近球形或梨形，大小2.5-2.0×2.2-1.6μm（图1）。 
将菌株F4a液体培养48h后，提取总DNA，经纯化后采用通用引物进行ITS基因序列的PCR扩增，PCR产物经检测、纯化后进行测序，得到ITS序列提交GenBank数据库，获得基因登陆号：KF682223。BLAST比对分析结果显示，菌株F4a与Eupenicillium brefeldianum A1163同源性最高，达100%。进化树分析结果显示F4a与Eupenicillium brefeldianum A1163和Eupenicillium brefeldianum NRRL710在在同一分支上（图2）。综合形 态学特征，将F4a鉴定为Eupenicillium brefeldianum。 
>F4a ITS 
TTTATCGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGTTCCGGCCGCCGGGGGGCATCCGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACACCATTGAACGCTGTCTGAAGAATGCAGTCTGAGCGATTAGCTAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGCCCCCCGGCTACCGGGGGGCGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCCCGCCGGCGACCCCCCTCAATCTTTCTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA 
实施例2菌株F4a发酵制备BFA 
2.1种子液的准备：首先将菌株F4a用划线法接种于准备好的PSA培养基平板上，28℃恒温培养5d；然后在平板上菌丝生长处用打孔器取直径5mm菌块，接种于250mL三角瓶装有50mL PSB培养基中，28℃180rpm恒温摇床培养72h； 
所述PSB培养基为：20.0g蔗糖糖，200g土豆浸出液，用蒸馏水配平至1L，pH5.0～8.0，115℃灭菌30min。 
PSA则为每升PSB添加18g琼脂的固体培养基。 
2.2大瓶发酵：用容量为3L的三角瓶，每瓶装PSB培养基0.70L，115℃灭菌30min后备用。每瓶接种种子液50mL，28℃180rpm恒温摇床培养7-13d，共发酵10L； 
2.3粗提物的获得：将获得发酵液采用4-6层纱布过滤，完成固液分离。过滤上清液采用HP20大孔吸附树脂固相萃取，15%乙醇洗脱除杂，100%乙醇洗脱获得6.09g粗提物A；菌丝体经丙酮提取3次以上获得13.23g提取物B。合并两部分减压浓缩后的提取物，并加入纯MeOH溶液200-250mL，超声10-20min使其尽量完全溶解，然后静止10min以上，待固液分离后将MeOH精制的上清液吸取至另一圆底烧瓶，减压浓缩得到BFA含量超过50%粗提取物11.5g。 
2.4BFA的纯化和制备： 
首先上述粗提取物与硅胶质量比约为1:2的比例拌样，减压蒸馏至完全干燥。同时准备好500-600目柱层析硅胶柱。完成干法上样后，按照二氯甲烷/甲醇体系进行梯度洗脱纯化（v/v49:1-0:10）。收集体积比为45:5的二氯甲烷-甲醇(v/v)洗脱下的洗脱组分，获得纯度超90%BFA5.729g。或者将2.3所得粗提取物约50mg经丙酮超声溶解，室温静置过夜挥发溶剂即可析出纯度超过95%的BFA晶体28mg。 
实施例3BFA的结构解析 
BFA为无色晶体，ESI-MS给出（图3）m/z303.2[M+Na]⁺（Calcd.for C₁₆H₂₄O₄Na，303.1572）推断其分子式为C₁₆H₂₄O₄。在¹H-NMR（600MHz， CD₃OD）谱中（表1和图4），低场区δ_H7.46（1H，dd，J=15.5，2.2Hz）与5.82（1H，d，J=15.5Hz）组成一反式双键，并且一端连接在季碳上；δ_H5.27（H，dd，J=15.1，9.7Hz）和5.77（1H，ddd，J=15.1，9.7，4.4Hz）组成另一个反式双键，两端分别连接CH和CH₂基团。3个连氧碳上的氢δ_H4.04（1H，brd，J=9.1Hz），4.80（1H，m）和4.21（1H，m）以及1个连接在CH上的甲基质子信号δ_H1.24（3H，d，J=6.2Hz）。¹³C-NMR（150MHz，CD₃OD）中给出16个碳信号（表1和图5），其中1个酯羰基碳信号δ_C166.96；4个不饱和碳信号δ_C153.69，136.70，129.99，116.37；3个连氧sp³杂化的碳δ_C75.21，71.8，71.56；1个甲基碳信号δ_C19.66。结合计算其不饱和度为5，除去1个羰基和2对双键，化合物应该为双环结构。综上可推测该化合物应该为具有2对反式双键、2个羟基、1个甲基、1个甲氧基以及具有α，β不饱和酮的双环大环内酯。结合其ESI-MS可初步确定化合物的平面结构与BFA相同。 
由于该化合物有5个手性中心，因此进一步采用X-Ray单晶衍射测定其相对构型。该化合单晶衍射的晶胞参数分别为：空间群为P212121，推导晶体结构如图6所示。最后测定该化合物的旋光度，通过计算获得其比旋光度＋95.4±2.0（c1.40，MeOH）。因此最终确定其绝对构型为(1R,2E,6S,10E,11aS,13S,14aR)-1,13-dihydroxy-6-methyl-6,7,8,9,12,13,14,14a-octahydro-H-cyclopenta[f][1]oxacyclotridecin-4(11aH)-one。即该化合物为BFA。其NMR信号归属如表1所示。 
表1.Brefeldin A的NMR信号归属及特征（CD₃OD） 


实施例4真菌F4a生产BFA的产量 
HPLC定量分析真菌F4a不同时间发酵上清液经HP20固相萃取物和菌体甲醇提取物中BFA的含量。利用Dionex U3000HPLC系统建立标准曲线，使用C18YMC-Pack ODS-A(5μm,φ4.6×250mm)柱，洗脱程序为：起始溶剂为甲醇：水（7：3），线形梯度洗脱20min时为纯甲醇，流速0.53ml/min，检测波长210nm。 
定量分析结果显示，BFA从发酵2d时开始产生，并逐渐增加。起初阶段发酵液中含量高于菌体中，然而发酵7天以后发酵液中含量逐渐降低并趋于稳定。而菌体中含量随着发酵时间的增长逐渐攀升，并于13d时达到峰值。发酵液在7d时产量最高，达到509.1mg/L，而菌体在13d时最高，相当于1L发酵液中的菌体产量高达1605.5mg。总计其13d时发酵液和菌体中的brefeldin A产量高达1939.6mg/L（图7）。这是目前报道的产brefeldin A最高的菌株。 
实施例5BFA生物活性的测定 
采用纸-琼脂片扩散实验（paper-agar disk diffusion assay）测定了化合物BFA对病原真菌和细菌的抑制活性。 
对于丝状真菌，首先将立枯丝核菌和黄瓜枯萎病菌活化后用打孔器打9mm菌块，接种到PSA平板中央，28℃恒温培养，待菌落生长至直径大于4cm时，将纯化的BFA配制成浓度分别为2mg/mL的甲醇溶液。用滤纸片法测定抗真菌活性，上样量为20μL，滤纸片直径为8mm，等滤纸片上甲醇挥发完全后继续在28℃恒温培养至病原真菌生长至铺满整个平板时记录抑菌圈的直径大小，抑菌圈直径越大则说明该菌株的抗真菌的活性越强。 
实验结果表明，BFA对立枯丝核菌和黄瓜枯萎病菌都表现出良好的抗真菌活性，抑菌圈直径分别为18mm和6.4mm。因此BFA具有作为农用杀菌剂使用的应用前景。 
对于白色念珠菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，则首先将上述靶菌活化，并用灭菌的生理盐水配置成2-5×10⁴cfu/ml的浓度，取50ul均匀涂布于培养基上。然后将预先准备的2mg/mL BFA溶液，用滤纸片法测定抗真菌活性，上样量为20μL，滤纸片直径为8mm，继续28℃恒温培养48h。抑制活性结果显示BFA对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌没有表现出抑制活性，而对白色念珠菌显示出极强的抑制活性，其抑菌圈直径达22mm。 
采用卤虫生物检测法(Brine Shrimp Assay，BSA)评价BFA的杀虫活性。具体操作：首先将上述实施例制备所得化合物用灭菌的人工海水配制成终浓度分别为200、100、50、25、12.5、6.23μg/ml的水溶液，按照每孔100μl分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，每个浓度三个重复。以灭菌的人工海水为空白对照。然后将预先孵化好的卤虫液加入各96孔板中，使每孔中卤虫数为10-20只，体积为200μl。室温放置24h，用双目解剖镜观察， 记录卤虫死亡数。将卤虫全部死亡时的浓度定为该化合物的最小杀灭浓度。结果表明，BFA展现出较强的的杀虫活性，它对卤虫的最小杀灭浓度为100μg/ml。