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本发明涉及式(I)的化合物和其药用盐，其中R1至R3，X和Y如说明书和权利要求书中所定义。式(I)的化合物可以用作用于在哺乳动物中治疗和/或预防炎性疾病或病症的药物，并且尤其涉及瞬时受体电位(TRP)通道拮抗剂。

1.  式(I)的化合物

其中：
X是-CH₂-或氧；
Y是-(CH₂)_n-；
R1是任选地被卤素取代的苯基；
R2是低级烷基；
R3是三氟甲基-苯基、三氟甲基-吡啶基、三氟甲基-哒嗪基，三氟甲基-嘧啶基或三氟甲基-吡嗪基；并且
n是0或1，条件是X是氧时n不是0；
或其药用盐。

2.  根据权利要求1所述的化合物，其中X是-CH₂-。

3.  根据权利要求1所述的化合物，其中X是氧。

4.  根据权利要求1至3任一项所述的化合物，其中n是0。

5.  根据权利要求1至3任一项所述的化合物，其中n是1。

6.  根据权利要求1至5任一项所述的化合物，其中R1是卤代苯基。

7.  根据权利要求1至6任一项所述的化合物，其中R1是氟苯基。

8.  根据权利要求1至7任一项所述的化合物，其中R2是甲基、乙基、异丙基或叔丁基。

9.  根据权利要求1至8任一项所述的化合物，其中R2是甲基、乙基或异丙基。

10.  根据权利要求1至9任一项所述的化合物，其中R3是三氟甲基-苯基或三氟甲基-吡啶基。

11.  根据权利要求1至10任一项所述的化合物，其中，其中R3是三 氟甲基-苯基。

12.  根据权利要求1至10任一项所述的化合物，其中R3是三氟甲基-吡啶基。

13.  根据权利要求1至12任一项所述的化合物，所述化合物选自
2-[乙基-(4-氟-苯磺酰基)-氨基]-N-[1-(4-三氟甲基-苯基)-哌啶-3-基甲基]-乙酰胺；
2-[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-N-[1-(4-三氟甲基-苯基)-哌啶-3-基甲基]-乙酰胺；
2-[乙基-(4-氟-苯磺酰基)-氨基]-N-[1-(4-三氟甲基-苯基)-吡咯烷-3-基甲基]-乙酰胺；
2-[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-N-[1-(4-三氟甲基-苯基)-吡咯烷-3-基甲基]-乙酰胺；
2-[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-N-[(S)-1-(4-三氟甲基-苯基)-哌啶-3-基甲基]-乙酰胺；
2-[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-N-[(R)-1-(4-三氟甲基-苯基)-哌啶-3-基甲基]-乙酰胺；
2-[(4-氟-苯磺酰基)-甲基-氨基]-N-[4-(4-三氟甲基-苯基)-吗啉-2-基甲基]-乙酰胺；
2-[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-N-[4-(4-三氟甲基-苯基)-吗啉-2-基甲基]-乙酰胺；
2-[乙基-(4-氟-苯磺酰基)-氨基]-N-[4-(4-三氟甲基-苯基)-吗啉-2-基甲基]-乙酰胺；
2-[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-N-[(R)-4-(4-三氟甲基-苯基)-吗啉-2-基甲基]-乙酰胺；
2-[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-N-[(S)-4-(4-三氟甲基-苯基)-吗啉-2-基甲基]-乙酰胺；和
2-[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-N-[4-(5-三氟甲基-吡啶-2-基)-吗啉-2-基甲基]-乙酰胺。

14.  一种制备式(I)的化合物的方法，所述方法包括在式(B)的化合物

偶联剂和碱的存在下，式(A)的化合物的反应，

其中R1至R3如权利要求1至12任一项所定义。

15.  通过权利要求14所述的方法制备的根据权利要求1至13任一项所述的化合物。

16.  一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的根据权利要求1至13任一项所述的化合物和药用载体。

17.  根据权利要求1至13任一项所述的化合物，所述化合物用作治疗活性物质。

18.  根据权利要求1至13任一项所述的化合物在治疗或预防呼吸系统疾病中的用途。

19.  根据权利要求1至13任一项所述的化合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗或预防呼吸系统疾病。

20.  根据权利要求1至13任一项所述的化合物，所述化合物用于治疗或预防呼吸系统疾病。

21.  一种治疗选自慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、变应性鼻炎和支气管痉挛的呼吸系统疾病的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至13任一项所述的化合物的步骤。

22.  如上文所述的本发明。

作为TRP通道拮抗剂的新乙酰胺衍生物
本发明涉及用于治疗和/或预防哺乳动物中炎性疾病或病症的有机化合物，并且尤其涉及瞬时受体电位(TRP)通道拮抗剂、它们的制备和包含它们的药物组合物。
本发明尤其涉及式(I)的化合物

其中：
X是-CH₂-或氧；
Y是-(CH₂)_n-；
R1是任选地被卤素取代的苯基；
R2是低级烷基；
R3是三氟甲基-苯基、三氟甲基-吡啶基、三氟甲基-哒嗪基、三氟甲基-嘧啶基或三氟甲基-吡嗪基；并且
n是0或1，条件是当X是氧时n不是0；
或其药用盐。
TRP通道是一类在多种人(或其它动物)细胞类型的质膜上发现的离子通道。存在至少28种已知的人TRP通道，基于序列同源性和功能，其分成很多家族或组。TRPA1是非选择性阳离子传导通道，其通过钠、钾和钙流调节膜电位。已经显示TRPA1在人背根神经节神经元和外周感觉神经中高度表达。在人中，TRPA1被很多反应性化合物比如丙烯醛，异硫氰酸烯丙酯，臭氧以及非反应性化合物比如烟碱和薄荷醇激活并且因此被认为充当‘化学传感器’。许多已知TRPA1激动剂是在人和其它动物中引起疼痛，刺激和神经原性感染的刺激物。因此，将预期TRPA1拮抗剂或阻断TRPA1 通道激活剂的生物学效应的试剂在疾病比如哮喘及其恶化，久咳和相关疾病的治疗中会是有用的，以及在急性和慢性疼痛的治疗中是有用的。近来，也已经表明，组织损伤和氧化应激的产物，例如4-羟基壬烯醛和相关化合物激活TRPA1通道。该发现提供了小分子TRPA1拮抗剂在与组织损伤、氧化应激和支气管平滑肌收缩相关的疾病比如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、职业性哮喘和病毒引起的肺部炎症的治疗中的功效的另外的理论基础。
本发明还提供包含所述化合物的药物组合物、使用所述化合物的方法和制备所述化合物的方法。
除非另有说明，用于本说明书和权利要求书的以下具体术语和措辞定义如下：
术语“部分”是指原子或化学键合的原子的基团，其通过一个或多个化学键连接于另一原子或分子，从而形成分子的部分。例如，式(I)的变量R1至R3是指通过共价键连接于式(I)的核心结构的部分。
关于具有一个或多个氢原子的特定部分，术语“取代的”是指该部分的至少一个氢原子被另一个取代基或部分替代的事实。例如，术语“被卤素取代的低级烷基”是指低级烷基(如下文定义)的一个或多个氢原子被一个或多个卤素原子替代的事实(例如三氟甲基、二氟甲基、氟甲基、氯甲基等)。
术语“烷基”是指具有1至20个碳原子的脂肪族直链或支链饱和烃部分。在特定实施方案中烷基具有1至10个碳原子。
术语“低级烷基”是指具有1至7个碳原子的烷基部分。在特定实施方案中，低级烷基具有1至4个碳原子并且在其他特定实施方案中，低级烷基具有1至3个碳原子。低级烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。低级烷基的特别实例是甲基、乙基和异丙基。
术语“卤代”、“卤素”和“卤化物”，其可以交替使用，是指取代基氟、氯、溴、或碘。氟是卤素的特别实例。
除非另有说明，术语“氢(hydrogen)”或“氢(hydro)”是指氢原子(-H)的部分而不是H₂。
除非另有说明，术语“所述式的化合物”或“某式的化合物”或“所述式的多个化合物”或“某式的多个化合物”是指选自由该式限定的一类化合物的任意化合物(如果不另外说明，包括任何此种化合物的任意药用盐或酯)。
术语“药用盐”是指保留游离碱或游离酸的生物学效用和性质的那些盐，其不是生物学上或另外不适宜的。盐可以由无机酸比如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，优选盐酸，和有机酸比如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、水杨酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、N-乙酰基半胱氨酸等形成。此外，盐可以通过将无机碱或有机碱加入至游离酸来制备。源自无机碱的盐包括，但不限于钠、钾、锂、铵、钙和镁盐等。源自有机碱的盐包括，但不限于伯、仲、叔胺，取代的胺包括天然存在的取代的胺、环胺和碱性离子交换树脂，比如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、赖氨酸、精氨酸、N-乙基哌啶、哌啶、聚胺树脂等的盐。
本发明的化合物可以以药用盐的形式存在。本发明的化合物还可以以药用酯(即，要用作前药的式(I)的酸的甲酯和乙酯)的形式存在。本发明的化合物还可以被溶剂化，即水合。溶剂化可以在制备方法的过程中进行或可以例如作为起初无水的式(I)的化合物的吸湿性质的结果而发生(水合)。
具有相同分子式但性质或它们的原子的结合的顺序不同或它们的原子在空间的排列不同的化合物被称为“异构体”，并且落在本发明的范围内。其原子在空间上的排布不同的异构体被称为“立体异构体”。非对映异构体是在一个或多个手性中心处具有相反构型的立体异构体，其不是对映异构体。带有一个或多个不对称中心的、彼此为不能重叠的镜像的立体异构体被称为“对映异构体”。当化合物具有不对称中心时，例如，如果碳原子结合于四个不同基团上，对映异构体对是可能的。对映异构体可以由其一个不对称中心或多个不对称中心的绝对构型表征并且用Cahn，Ingold和Prelog的R-和S排序规则描述，或用其中分子使偏振光平面旋转的方式描述，并且称为右旋或左旋(即，分别为(+)或(-)-异构体)。手性化合物可以作为个体对映异构体或作为其混合物存在。含有等比例对映异构体的混合物被称为“外消旋混合物”。
术语“治疗有效量”的化合物意为有效预防、减轻或改善疾病的症状或延长要治疗的受试者的存活的化合物量。治疗有效量的确定在本领域技术内。根据本发明的化合物的治疗有效量或剂量可以在限度内改变并且可以以本领域已知的方式确定。将在各个特定情况中对个体需求调节该剂量，所述特定情况包括施用的特定化合物，施用途径，治疗的病症，以及治疗的患者。通常，在口服或肠胃外施用于重约70Kg的成人的情况中，约0.1mg至约5,000mg，1mg至约1,000mg，或1mg至100mg的每日剂量可以是适当的，尽管当有迹象表明必要时可以超过下限和上限。可以以单个剂量或分开的剂量施用每日剂量，或对于肠胃外施用，可以以连续注入施用它。
术语“药用载体”意在包括与药物施用相容的任意和所有物质，包括溶剂，分散介质，包衣，抗细菌和抗真菌剂，等渗和吸收延缓剂，和与药物施用相容的其它物质和化合物。除非到了某一常规介质或试剂与活性化合物不相容的程度，否则考虑其在本发明组合物中的用途。补充的活性化合物也可以整合入组合物。
用于制备其组合物的有用的药物载体可以是固体，液体或气体；因此，所述组合物可以采用片剂、丸剂、胶囊、栓剂、粉末剂、肠包衣的或其它保护的制剂(例如结合于离子交换树脂或包装在脂蛋白泡囊中)、缓释制剂、溶液、混悬剂、酏剂、气溶胶等的形式。所述载体可以选自不同油，包括石油、动物油、植物油或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水、盐水、含水葡萄糖和二元醇是优选的液体载体，特别是(当与血液等渗时)用于可注射溶液。例如，用于静脉施用的制剂包括活性成分的无菌水溶液，其通过将固体活性成分溶解于水来产生水溶液，并使得所述溶液无菌来制备。合适的药物赋形剂包括淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、滑石、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅石、硬脂酸镁、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、氯化钠、无水脱脂乳、甘油、丙二醇、水、乙醇等。组合物可以加入常规药物添加剂比如防腐剂、稳定剂、湿润剂或乳化剂、用于调节渗透压的盐、缓冲剂等。合适的药物载体和它们的制剂在E.W.Martin的Remington′s Pharmaceutical Sciences中描述。在任何情况中，这种组合物将含有与合适的载体一起的有效量活性化合物，以制备适当剂型 用于适当施用于接受者。
在本发明方法的实践中，有效量的本发明化合物中任一个或任何本发明化合物的组合或其药用盐或酯，通过本领域已知的任何常用和可接受方法，或者单独或者组合施用。所述化合物或组合物可以因此口服(例如，口腔)，舌下，肠胃外(例如，肌肉内、静脉内、或皮下)，经直肠(例如，通过栓剂或洗剂)，经皮(例如，皮肤电穿孔)或通过吸入(例如，通过气溶胶)，并且以固体、液体或气体剂型，包括片剂和悬浮液施用。所述施用可以以单个单位剂型以连续治疗或以单个剂量随意治疗进行。治疗组合物也可以是连同亲脂性盐比如扑酸的油乳状液或分散液的形式，或是用于皮下或肌肉内施用的可生物降解的缓释组合物的形式。
本发明尤其涉及：
式(I)的化合物，其中X是-CH₂-；
式(I)的化合物，其中X是氧；
式(I)的化合物，其中n是0；
式(I)的化合物，其中n是1；
式(I)的化合物，其中R1是卤代苯基；
式(I)的化合物，其中R1是氟苯基；
式(I)的化合物，其中R2是甲基、乙基、异丙基或叔丁基；
式(I)的化合物，其中R2是甲基、乙基或异丙基；
式(I)的化合物，其中R3是三氟甲基-苯基或三氟甲基-吡啶基；
式(I)的化合物，其中R3是三氟甲基-苯基或三氟甲基-吡啶基；
式(I)的化合物，其中R3是三氟甲基-苯基；以及
式(I)的化合物，其中R3是三氟甲基-吡啶基。
本发明尤其还涉及式(I)的化合物，所述化合物选自：
2-[乙基-(4-氟-苯磺酰基)-氨基]-N-[1-(4-三氟甲基-苯基)-哌啶-3-基甲基]-乙酰胺；
2-[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-N-[1-(4-三氟甲基-苯基)-哌啶-3-基甲基]-乙酰胺；
2-[乙基-(4-氟-苯磺酰基)-氨基]-N-[1-(4-三氟甲基-苯基)-吡咯烷-3-基甲基]-乙酰胺；
2-[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-N-[1-(4-三氟甲基-苯基)-吡咯烷-3-基甲基]-乙酰胺；
2-[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-N-[(S)-1-(4-三氟甲基-苯基)-哌啶-3-基甲基]-乙酰胺；
2-[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-N-[(R)-1-(4-三氟甲基-苯基)-哌啶-3-基甲基]-乙酰胺；
2-[(4-氟-苯磺酰基)-甲基-氨基]-N-[4-(4-三氟甲基-苯基)-吗啉-2-基甲基]-乙酰胺；
2-[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-N-[4-(4-三氟甲基-苯基)-吗啉-2-基甲基]-乙酰胺；
2-[乙基-(4-氟-苯磺酰基)-氨基]-N-[4-(4-三氟甲基-苯基)-吗啉-2-基甲基]-乙酰胺；
2-[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-N-[(R)-4-(4-三氟甲基-苯基)-吗啉-2-基甲基]-乙酰胺；
2-[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-N-[(S)-4-(4-三氟甲基-苯基)-吗啉-2-基甲基]-乙酰胺；和
2-[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-N-[4-(5-三氟甲基-吡啶-2-基)-吗啉-2-基甲基]-乙酰胺。
本发明还涉及：
一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的根据式(I)的化合物和药用载体；
根据式(I)的化合物，所述化合物用作治疗活性物质；
式(I)的化合物用于治疗或预防呼吸系统疾病的用途；
根据式(I)的化合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗或预防呼吸系统疾病；
根据式(I)的化合物，所述化合物用于治疗或预防呼吸系统疾病；和
一种治疗选自慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、变应性鼻炎和支气管痉挛的呼吸系统疾病的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用治疗有效量的根据式(I)的化合物的步骤。
呼吸系统疾病的实例是慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、变应性鼻炎 和支气管痉挛。
用于制备这些化合物的起始材料和试剂通常可以从商业供应商比如Aldrich Chemical Co.获得，或由本领域技术人员已知的方法，按照在参考文献比如Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis；Wiley&Sons：New York，1991，第1-15卷；Rodd’s Chemistry of Carbon Compounds，Elsevier Science Publishers，1989，第1-5卷和增干；和Organic Reactions，Wiley&Sons：New York，1991，第1-40卷中阐述的步骤制备。
以下合成反应方案仅说明一些可以合成本发明的化合物的方法，并且这些合成反应方案的各种改进是可以进行的并且将对参考本申请中含有的公开内容的本领域技术人员是有暗示的。
如果需要，可以使用常规技术，包括但不限于，过滤，蒸馏，结晶，色谱等来分离和纯化合成反应方案的起始材料和中间体。这种物质可以使用常规方法表征，所述常规方法包括物理常数和光谱数据。
除非有相反指示，本文所述反应优选在惰性气氛下在大气压，在约-78℃至约150℃，更优选约0℃至约125℃，并且最优选和方便地在约室温(或环境温度)，例如，约20℃的反应温度进行。
本发明的化合物可以通过任意数量的常规方法制备。例如，它们可以根据在方案1中概述的过程制备。
方案1

如方案1中所述，N-取代的甘氨酸酯(ii)可以在碱比如三乙胺的存在下与磺酰氯(i)反应，形成中间体磺酰胺(iii)，其中R可以是甲基或乙基基团，R1可以是芳基，杂芳基和被卤素取代的芳基，并且R2可以是低级烷基基团，比如甲基、乙基或异丙基基团。在温和条件，比如THF中的氢氧化锂水溶液下，酯(iii)的水解可以提供所需中间体羧酸(iv)。
钯催化条件下环胺(v)和芳基溴(vi)之间的偶联反应可以提供N-芳基中间体(vii)。R4是三氟甲基。一般Buchwald胺化反应条件可以用于完成N-芳基化反应。详细描述可以在相应中间体的制备步骤中找到。对于化合物(v)，n数可以是0或1(五或六元环胺)。当数n是0时，X是(CH₂)。当数n是1时，X可以是(CH₂)或氧。对于化合物(vi)，X、Y和Z可以是(CH)或N。(vii)中丁氧羰基基团的断裂可以产生相应伯胺(viii)，其可以作为游离胺或盐酸盐储存。
最后，在偶联试剂的存在下，羧酸(iv)和胺(viii)的偶联可以提供所需化合物(ix)。可以使用肽化学中用于酰胺形成的偶联试剂。详细条件可以在 实施例中找到。
本发明因此还涉及制备式(I)的化合物的方法，所述方法包括在式(B)化合物

偶联剂和碱的存在下，式(A)化合物的反应，

其中R1至R3如上文定义。
用于本发明方法的偶联剂的实例是已知的酰胺形成偶联剂，比如例如HATU。
二异丙基乙胺是用于上述方法的适当碱的实例。
本发明因此还涉及通过本发明的方法制备的式(I)的化合物。
本发明现在将通过以下实施例来说明，所述实施例不具有限制性。
实施例
尽管在本文描述和叙述了某些示例性实施方案，本发明的化合物可以使用适当的起始材料根据本文中一般性描述的方法和/或通过本领域普通技术人员可获得的方法制备。
中间体和最终化合物通过急骤色谱和/或通过反相制备型HPLC(高效液相色谱)纯化。除非另有说明，使用(1)Biotage SP1^TM系统和Quad 12/25Cartridge模块(来自Biotage AB)，(2)ISCO色谱仪器(来自Teledyne Isco，Inc.)，或(3)IntelliFlash280^TM色谱仪器(来自Analogix Inc.，Varian Inc.的子公司)进行急骤色谱。除非另有说明，使用的硅胶品牌和孔径是：(1)KP-SIL^TM粒径：40-60微米(来自Biotage AB)；(2)硅胶CAS登记号：63231-67-4，粒径：47-60微米；或(3)来自Qingdao Haiyang Chemical Co.，Ltd的ZCX，孔径：200-300目或300-400目。使用来自Waters公司的Delta-Prep^TM 3000 HPLC系统用一个或多个以下柱进行反相制备型HPLC：来自Varian，Inc.的VarianC-18柱(10μm，20x150mm)，来自Waters公司的Xbridge^TM Prep C₁₈柱(5μm，OBD^TM 20×100mm)，或来自Waters公司的SunFire^TM Prep C₁₈柱(5μm，OBD^TM30×100mm)。
使用ZQ^TM 4000(来自Waters公司)，Quattro micro^TMAPI(来自Waters公司)，Platform II(来自Micromass，Waters公司的分公司)，FTICR，具有4.7特斯拉磁铁(来自Bruker公司)，2795-ZQ^TM2000(来自Waters公司)，或MDS Sciex^TM API-2000^TMn API(来自MDS Inc.)进行质谱(MS)或高分辨率质谱(HRMS)。除非另有陈述，质谱数据通常仅表明母离子。对表明的特定中间体或化合物提供MS或HRMS数据。
使用均来自Varian Inc.的Mercury300 NMR谱仪(在300MHz获得的¹H NMR谱)和Inova400 NMR谱仪(在400MHz获得的¹H NMR谱)进行核磁共振谱(NMR)。对表明的特定中间体或化合物提供NMR数据。
所有涉及空气敏感试剂的反应在惰性气氛下进行。除非另有陈述，如从商业供应商收到的使用试剂。
指认的绝对立体化学基于与由已知绝对构型的手性构建单元制备的类似物的生物学效价和/或在硅胶TLC和层析上的相对保留时间的比较。
中间体
[(4-氟-苯磺酰基)-甲基-氨基]-乙酸

将4-氟苯-1-磺酰氯(1.95g，10mmol)和2-(甲基氨基)乙酸乙酯盐酸盐(1.54g，10mmol)悬浮在二氯甲烷(50mL)中。在冰浴下，加入三乙胺(4.2mL)并且将混合物在室温搅拌4h。将溶剂蒸发并将残留物用乙酸乙酯(60mL)处理，用水、碳酸氢钠溶液，并最后用稀盐酸溶液萃取。将有机层用水洗涤并干燥。将溶剂蒸发并将残留物在真空中干燥，产生油性材料(2.27g)，为[(4-氟-苯磺酰基)-甲基-氨基]-乙酸乙酯。
将2-(4-氟-N-甲基丙基磺酰胺基)乙酸乙酯(2.27g)溶解在THF(20mL)中并加入0.5N LiOH溶液(20mL)。将混合物在室温搅拌5h。蒸发溶剂并将残留物溶解在水中，过滤并用盐酸酸化。将白色固体过滤，产生[(4-氟-苯磺酰基)-甲基-氨基]-乙酸(1.68g)。对C₉H₁₀FNO₄S计算的LRMS(m/e)247.0；观察到246.1(ES-)。
[乙基-(4-氟-苯磺酰基)-氨基]-乙酸

使用与对制备[(4-氟-苯磺酰基)-甲基-氨基]-乙酸所述的相同步骤制备该中间体。对C₁₀H₁₂FNO₄S计算的LRMS(m/e)261.0；观察到260.1(ES^-)。
[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-乙酸

使用与对制备[(4-氟-苯磺酰基)-甲基-氨基]-乙酸所述的相同步骤制备该中间体。对C₁₁H₁₄FNO₄S计算的LRMS(m/e)275.0；观察到274.1(ES^-)。
[1-(4-三氟甲基-苯基)-哌啶-3-基甲基]-氨基甲酸叔丁酯

将哌啶-3-基甲基-氨基甲酸叔丁酯(1.00g，4.67mmol)，1-溴-4-三氟甲基-苯(1.15g，5.13mmol)，叔丁醇钠(673mg，7.00mmol)，(R)-(+)-2，2′-双(二苯基膦基)-1，1′-联萘(291mg，0.47mmol)和三(二亚苄基丙酮)-二钯(0)(214mg，0.23mmol)在甲苯(5mL)中的溶液在25℃用氮气吹扫并抽空三次。将溶液密封并加热至120℃达14h。将反应混合物冷却至25℃，解封并倒入水中。将水相用乙酸乙酯萃取三次。将合并的有机层用盐水洗涤并且经硫酸镁干燥。过滤接着在真空中浓缩，提供粗制[1-(4-三氟甲基-苯基)-哌啶-3-基甲基]-氨基甲酸叔丁酯(1.5g，90％粗制)，为轻油。
[1-(4-三氟甲基-苯基)-哌啶-3-基]-甲胺

将25℃的[1-(4-三氟甲基-苯基)-哌啶-3-基甲基]-氨基甲酸叔丁酯(500mg，1.4mmol粗制)在乙酸乙酯(5mL)中的溶液用1M氯化氢水溶液(1mL)处理。将反应混合物加热至50℃达2h。然后将反应混合物冷却至25℃，倒入水中并用乙酸乙酯萃取。用氢氧化铵水溶液将水层调节至pH约为9-10并用乙酸乙酯萃取三次。然后将合并的有机层经硫酸镁干燥，过滤并在真空中浓缩，提供粗制[1-(4-三氟甲基-苯基)-哌啶-3-基]-甲胺(100mg，28％，粗制)，为油状物[MH]⁺＝259.0。
[1-(4-三氟甲基-苯基)-吡咯烷-3-基甲基]-氨基甲酸叔丁酯

将25℃的吡咯烷-3-基甲基-氨基甲酸叔丁酯(0.50g，2.50mmol)，1-溴-4-三氟甲基-苯(0.62g，2.75mmol)，叔丁醇钠(0.36g，3.47mmol)，(R)-(+)-2，2′-双(二苯基膦基)-1，1′-联萘(155mg，0.25mmol)和三(二亚苄基丙 酮)-二钯(0)(114mg，0.13mmol)在甲苯(5mL)中的溶液用氮气吹扫并抽空三次。将溶液密封并加热至120℃达14h。将反应混合物冷却至25℃，解封并倒入水中。将水相用乙酸乙酯萃取三次。将合并的有机层用盐水洗涤并经硫酸镁干燥。蒸发溶剂并将残留物通过急骤柱色谱(80/20己烷/乙酸乙酯)纯化，提供[1-(4-三氟甲基-苯基)-吡咯烷-3-基甲基]-氨基甲酸叔丁酯(500mg，58％)，为轻油。
[1-(4-三氟甲基-苯基)-吡咯烷-3-基]-甲胺

将25℃的[1-(4-三氟甲基-苯基)-吡咯烷-3-基甲基]-氨基甲酸叔丁酯(500mg，1.45mmol)在乙酸乙酯(5mL)中的溶液用1M氯化氢水溶液(1mL)处理。将反应混合物加热至50℃达2h。然后将反应混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取。将水层用1M氢氧化钠溶液调节至pH约9-10。将水相用乙酸乙酯萃取三次。然后将有机层经硫酸镁干燥，过滤并在真空中浓缩，提供粗制[1-(4-三氟甲基-苯基)-吡咯烷-3-基]-甲胺(100mg，28％，粗制)，为油状物。[MH]⁺＝245.0。
[4-(4-三氟甲基-苯基)-吗啉-2-基甲基]-氨基甲酸叔丁酯

在密封管中，将吗啉-2-基甲基氨基甲酸叔丁酯(1.0g，4.62mmol)，1-溴-4-(三氟甲基)苯(1.04g，4.62mmol)，Pd(dba)₂(133mg，0.23mmol)，X-Phos(220mg，0.46mmol)和叔丁醇钠(533mg，5.55mol)在10mL无水甲苯中合并。将混合物用氩脱气并随后在105℃搅拌4h。将混合物经C盐层过滤并用THF冲洗。将溶剂蒸发并将残留物用水和乙酸乙酯萃取。将有机层干燥并浓缩。将残留物通过ISCO急骤柱色谱(50g硅胶，己烷中乙酸乙酯0％至80％)纯化，产生所需化合物(727mg，44％)。
[4-(4-三氟甲基-苯基)-吗啉-2-基]-甲胺盐酸盐

将(4-(4-(三氟甲基)苯基)吗啉-2-基)甲基氨基甲酸叔丁酯(720mg)溶解在二氯甲烷(4mL)中并加入TFA(3mL)。将混合物在室温搅拌1h并将溶剂蒸发。将残留物用二氯甲烷和甲苯处理。蒸发溶剂。将残留物溶解在二氯甲烷(10mL)中并且加入乙醚中的1N氯化氢(10mL)。蒸发溶剂并将残留物用无水乙醚研磨并过滤，产生所需的盐酸盐(485mg，82％)。[MH]⁺＝261。
[4-(5-三氟甲基-吡啶-2-基)-吗啉-2-基甲基]-氨基甲酸叔丁酯

将吗啉-2-基甲基氨基甲酸叔丁酯(1.0g，4.62mmol)，2-氯-5-(三氟甲基)吡啶(839mg，4.62mmol)，Pd(dba)₂(133mg，0.23mmol)，叔丁醇钠(533mg，5.55mmol)和X-Phos(220mg，0.46mmol)在甲苯(10mL)中合并。将混合物用氮脱气5分钟并密封。将产生的混合物在100℃搅拌12h。将混合物过滤并用THF冲洗。蒸发溶剂并将残留物通过ISCO急骤柱色谱(己烷中0％至35％的乙酸乙酯)纯化，产生所需化合物，为浅棕色蜡状材料(350mg，21％)。[MH]⁺＝362.1。
[4-(5-三氟甲基-吡啶-2-基)-吗啉-2-基]-甲胺盐酸盐

将(4-(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)吗啉-2-基)甲基氨基甲酸叔丁酯(350mg)溶解在3mL的二氯甲烷中并且加入1.5mL的TFA。将混合物在室温搅拌1h。蒸发溶剂并将残留物干燥。将残留物再溶解在二氯甲烷中并加入乙醚中的1N盐酸(6mL)。将混合物浓缩并干燥。将残留物悬浮在无水乙醚中并将上层滗出。将固体材料在真空中干燥，产生所需盐酸盐(312mg，97％)。[MH]⁺＝262.1。
实施例1
2-[乙基-(4-氟-苯磺酰基)-氨基]-N-[1-(4-三氟甲基-苯基)-哌啶-3-基甲基]-乙酰胺

将25℃的粗制[1-(4-三氟甲基-苯基)-哌啶-3-基]-甲胺(30.0mg，0.12mmol，粗制)和[乙基-(4-氟-苯磺酰基)-氨基]-乙酸(30.0mg，0.12mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液用HATU(43.7mg，0.12mmol)处理。将N，N-二异丙基乙胺(29.7mg，0.23mmol)加至该溶液中。将反应混合物搅拌2h。然后将反应混合物倒入0.2M KHSO₄水溶液中并用乙酸乙酯萃取三次。将合并的有机层用水洗涤三次并用盐水洗涤一次。然后将有机层经硫酸镁干燥，过滤并在真空中浓缩。急骤柱色谱(50/50己烷/乙酸乙酯)，提供2-[乙基-(4-氟-苯磺酰基)-氨基]-N-[1-(4-三氟甲基-苯基)-哌啶-3-基甲基]-乙酰胺(10.2mg，18％)，为白色固体。[MH]⁺＝502.0。
实施例2
2-[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-N-[1-(4-三氟甲基-苯基)-哌啶-3-基甲基]-乙酰胺

将25℃的粗制[1-(4-三氟甲基-苯基)-哌啶-3-基]-甲胺(47.0mg，0.18mmol，粗制)和[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-乙酸(50.0mg，0.18mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液用HATU(69.1mg，0.18mmol)处理。将N，N-二异丙基乙胺(46.9mg，0.36mmol)加至溶液中。将反应混合物搅拌2h。然后将反应混合物倒入0.2M KHSO₄水溶液中并用乙酸乙酯萃取三次。将合并的有机层用水洗涤三次并用盐水洗涤一次。然后将有机层经硫酸镁干燥，过滤并在真空中浓缩。经急骤柱色谱(50/50己烷/乙酸乙酯)，提供2-[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-N-[1-(4-三氟甲基-苯基)-哌啶-3-基甲基]-乙酰 胺(50.0mg，53％)，为白色固体。[MH]⁺＝516.2。
实施例3
2-[乙基-(4-氟-苯磺酰基)-氨基]-N-[1-(4-三氟甲基-苯基)-吡咯烷-3-基甲基]-乙酰胺

将25℃的粗制[1-(4-三氟甲基-苯基)-吡咯烷-3-基]-甲胺(28.0mg，0.12mmol，粗制)和[乙基-(4-氟-苯磺酰基)-氨基]-乙酸(30.0mg，0.12mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液用HATU(43.7mg，0.12mmol)处理。将N，N-二异丙基乙胺(29.7mg，0.23mmol)加至溶液中。将反应混合物搅拌2h。然后将反应混合物倒入0.2M KHSO₄水溶液中并用乙酸乙酯萃取三次。将合并的有机层用水洗涤三次并用盐水洗涤一次。然后将有机层经硫酸镁干燥，过滤并在真空中浓缩。经急骤柱色谱(50/50己烷/乙酸乙酯)，提供2-[乙基-(4-氟-苯磺酰基)-氨基]-N-[1-(4-三氟甲基-苯基)-吡咯烷-3-基甲基]-乙酰胺(9.0mg，16％)，为白色固体。[MH]⁺＝488.0。
实施例4
2-[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-N-[1-(4-三氟甲基-苯基)-吡咯烷-3-基甲基]-乙酰胺

将25℃的粗制[1-(4-三氟甲基-苯基)-吡咯烷-3-基]-甲胺(26.6mg，0.11mmol，粗制)和[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-乙酸(30.0mg，0.11mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液用HATU(41.4mg，0.11mmol)处理。将N，N-二异丙基乙胺(28.2mg，0.22mmol)加至该溶液中。将反应混合物搅拌2h。然后将反应混合物倒入0.2M KHSO₄水溶液中并用乙酸乙酯萃取三次。合并的有机层用水洗涤三次并用盐水洗涤一次。然后将有机层经硫酸镁干燥，过滤并在真空中浓缩。急骤柱色谱(50/50己烷/乙酸乙酯)，提供2-[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-N-[1-(4-三氟甲基-苯基)-吡咯烷-3-基甲基]-乙酰胺(24.2mg，44％)，为白色固体。[MH]⁺＝502.1。
实施例5
2-[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-N-[(S)-1-(4-三氟甲基-苯基)-哌啶-3-基甲基]-乙酰胺

使用手性柱(来自Chiral Technologies的IA柱，3x25cm，二氧化碳中的甲醇)由相应外消旋物(来自实施例2)的SFC分离获得该化合物。将第二级分浓缩并指认为(S)-异构体。[MH]⁺515.9。
实施例6
2-[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-N-[(R)-1-(4-三氟甲基-苯基)-哌啶-3-基甲基]-乙酰胺

使用实施例5中所述的手性柱由相应外消旋物(来自实施例2)的SFC分离获得该化合物。将第一级分浓缩并指认为(R)-异构体。[MH]⁺515.9。
实施例7
2-[(4-氟-苯磺酰基)-甲基-氨基]-N-[4-(4-三氟甲基-苯基)-吗啉-2-基甲基]-乙酰胺

将(4-(4-(三氟甲基)苯基)吗啉-2-基)甲胺盐酸盐(99mg，0.34mmol)，2-(4-氟-N-甲基丙基磺酰胺基)乙酸(82.5mg，0.34mmol)，BOP试剂(148mg，0.34mmol)和TEA(0.2mL)在5mL二氯甲烷中合并。将混合物搅拌过夜并蒸发溶剂。将残留物用乙酸乙酯和水萃取。将有机层用碳酸氢钠溶液洗涤 并干燥。将溶剂蒸发并将残留物通过ISCO急骤柱色谱(11g硅胶，己烷中乙酸乙酯0％至80％)纯化，产生所需化合物，为白色固体(140mg，86％)。[MH]⁺＝489.9。
实施例8
2-[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-N-[4-(4-三氟甲基-苯基)-吗啉-2-基甲基]-乙酰胺

将(4-(4-(三氟甲基)苯基)吗啉-2-基)甲胺盐酸盐(99mg，0.34mmol)，2-[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-乙酸(96mg，0.35mmol)，BOP试剂(154mg，0.35mmol)和TEA(0.2mL)在5mL二氯甲烷中合并。将混合物搅拌过夜并蒸发溶剂。将残留物用乙酸乙酯和水萃取。将有机层用碳酸氢钠溶液洗涤并干燥。蒸发溶剂并将残留物通过ISCO急骤柱色谱(11g硅胶，己烷中乙酸乙酯0％至50％)纯化，产生所需化合物，为白色固体(133mg，74％)。[MH]⁺＝517.9。
实施例9
2-[乙基-(4-氟-苯磺酰基)-氨基]-N-[4-(4-三氟甲基-苯基)-吗啉-2-基甲基]-乙酰胺

将(4-(4-(三氟甲基)苯基)吗啉-2-基)甲胺盐酸盐(99mg，0.34mmol)，[乙基-(4-氟-苯磺酰基)-氨基]-乙酸(87.2mg，0.34mmol)，BOP试剂(148mg，0.34mmol)和TEA(0.2mL)在5mL二氯甲烷中合并。将混合物搅拌过夜并蒸发溶剂。将残留物用乙酸乙酯和水萃取。将有机层用碳酸氢钠溶液洗涤并干燥。蒸发溶剂并将残留物通过ISCO急骤柱色谱(11g硅胶，己烷中 乙酸乙酯0％至60％)纯化，产生所需化合物，为白色固体(125mg，74％)。[MH]⁺＝504.0。
实施例10
2-[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-N-[(R)-4-(4-三氟甲基-苯基)-吗啉-2-基甲基]-乙酰胺

使用手性柱(Diacel IA 3.0x25cm，CO₂中40％甲醇)，由相应外消旋物(来自实施例8)的SFC分离获得该化合物。浓缩第一级分并指认为(R)-异构体。[MH]⁺517.9。
实施例11
2-[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-N-[(S)-4-(4-三氟甲基-苯基)-吗啉-2-基甲基]-乙酰胺

使用手性柱(Diacel IA 3.0x25cm，CO₂中40％甲醇)由相应外消旋物(来自实施例8)的SFC分离获得该化合物。将第二级分浓缩并指认为(S)-异构体。[MH]⁺517.9。
实施例12
2-[(4-氟-苯磺酰基)-异丙基-氨基]-N-[4-(5-三氟甲基-吡啶-2-基)-吗啉-2-基甲基]-乙酰胺

将2-(4-氟-N-异丙基苯基磺酰胺基)乙酸(108mg，0.39mmol)，(4-(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)吗啉-2-基)甲胺二盐酸盐(131mg，0.39mmol)和TEA(0.22mL)在二氯甲烷(6mL)中合并。向该搅拌的溶液加入BOP试剂(174mg，0.39mmol)。将混合物在室温搅拌6h。蒸发溶剂并将残留物用乙酸乙酯和水萃取，用碳酸氢钠溶液洗涤并干燥。蒸发溶剂。将残留物通过ISCO急骤柱色谱(己烷中0％至100％乙酸乙酯)纯化，产生白色粉末(160mg，79％)。[MH]⁺＝519.0。
实施例13
IC₅₀确定
剂量反应测定：Chan Test h TRPA 1-CHO稳定转染的细胞系
细胞培养和测定试剂：


CHO-K1 Tet-On HOMSA TRPA1克隆20
中国仓鼠卵巢细胞，可诱导表达
克隆#20，在第#26代接收
已经显示该细胞系中的通道表达对于至少80代是稳定的
以MycoAlert试剂盒证明无支原体
扩增细胞系并储存
生长条件：
对于CHO-K1 Tet-On HOMSA TRPA1克隆20的生长培养基
Ham’s F-12，含有10％无四环素FBS
1X青霉素-链霉素
1X glutamax
0.01mg/ml杀稻瘟素
0.40g/ml Zeocin
细胞系加倍速率是～15小时。培养板不超过80％融合状态。
为了诱导表达，以1ug/ml的终浓度将四环素加入无杀稻瘟素/zeocin培养基。在诱导后24小时进行实验。
铺板条件CHOK1/TRPA1细胞：
用0.025％胰蛋白酶/EDTA收获细胞。
在无选择抗生素的生长培养基中重悬细胞。
测量细胞密度并在含有1ug/ml多西环素的培养基中稀释至2.4x10⁵
细胞/ml，铺板25ul/孔入384孔黑色/透明组织培养处理的平板。
在37℃孵育过夜。
钙流测定：
测定日：
试剂：
替代缓冲液：Hank’s平衡盐溶液，20mM HEPES以及0.005％BSA和2x丙磺舒
染料上样缓冲液：通过将一小瓶内容物溶解在500ml含有20mMHEPES的Hank’s平衡盐溶液中制备Cal-3NW钙染料
-CHOK1/TRPA1细胞的对照化合物：
AP-18，储液10mM，在化合物缓冲液(HBSS/20mM HEPES/0.005％BSA)中制备3.5X化合物稀释物-终浓度10uM。
桂皮醛的制备(激动剂添加)：
FW＝132.16
比重＝1.046gm/cc
1.32gm/1.046gm/cc＝1.26ml的储液
加入1.74ml DMSO＝3.3M储液
工作溶液4.5X(最终100uM于化合物缓冲液中：HBSS/20mM HEPES/0.005％BSA)
从5或10mM储液(100％DMSO)制备化合物稀释物：
在滴定时对体积和浓度进行调节，以反映所需最终测定浓度。
以20μM三倍稀释11步测或30μM两倍稀释11步测测试化合物。
以一式两份平行将3μl的稀释化合物转移至Weidmann 384-孔板中。
将化合物板用100ul的HBSS/20mM HEPES/0.005％BSA缓冲液(化合物缓冲液)重悬：
柱1A-H：缓冲液/DMSO(bk)
柱2A-H：AP-18(CHOK1 TRPA1细胞的对照拮抗剂)
柱1I-P：ATP(CHOK1 teton细胞的对照)
柱2I-P：2APB(CHOK1/TRPM8细胞的对照拮抗剂)。
从细胞板去除生长培养基(20ul)并且将20ul的替代缓冲液加入，接着加入25ul的稀释染料。使用Plate Washer BioTek 407进行所有三个步骤。将板随后在RT孵育30’。
孵育后，将细胞和化合物板带到FLIPR并将20ul的稀释化合物/拮抗剂/bk通过FLIPR转移入细胞板。随后将板在室温孵育30’。30’孵育后，将板返回FLIPR并将20ul的4.5X桂皮醛加入细胞板。在化合物添加以及激动剂添加过程中，每1.5秒同时从细胞板的所有384个孔进行荧光读取。取五个读值来建立稳定基线，随后将20ul样品快速(30ul/sec)和同时加入细胞板的各个孔。在样品/激动剂添加之前、过程中和之后连续监测荧光达100秒(化合物添加)和120秒(激动剂添加)的总逝去时间。确定激动剂添加后各孔中的响应(峰荧光的增加)。使用在配体刺激之前各孔的初始荧光读值作为来自该孔的数据的零基线值。响应表示为抑制剂对照的％抑制，如下表1所示：
表1