T细胞疾病的治疗 【技术领域】
本发明涉及一种用于治疗患者T细胞疾病的方法，它包括破坏性类固醇至胸腺的信号途径并将骨髓或造血干细胞(HSC)引入该患者。
背景技术
胸腺很大程度上受其与神经内分泌系统的双向联系的影响(Kendall，1988)。特别重要的是既包括营养作用(TSH和GH)又包括萎缩作用(LH，FSH和ACTH)的脑垂体、肾上腺和性腺之间的互相作用对胸腺功能的影响(Kendall，1988；Homo-Delarche，1991)。胸腺生理学的特征之一是结构和功能的进行性的衰退，这与青春期左右循环性类固醇的产生升高是相称的(Hirokawa和Makinodan，1975；Tosi等，l982和Hirokawa等，1994)。激素的准确的作用部位和它们诱导胸腺萎缩的机理尚待确定。由于胸腺是外周T细胞库的产生和维持的主要部位，这种萎缩已经被广泛假定为在成年阶段基于免疫的疾病发生率升高地主要原因。特别是表现为T细胞依赖性免疫功能，例如细胞溶解T细胞活性和促有丝分裂反应下降的免疫系统缺陷，可反映为成年后免疫缺陷、自身免疫性和肿瘤疾病的发生率升高(Hirokawa，1998)。
胸腺萎缩的影响反映在外周，伴随向T细胞库减少的胸腺输入，导致较少多样化的T细胞受体(TCR)库。此外尚有细胞因子谱的变化(Hobbs等，1993；Kurashima等，1995)；CD4+和CD8+亚群中的变化以及倾向于形成记忆性T细胞而非纯真T细胞(T cell)(Mackall等，1995)。此外，胸腺细胞生成(thymopoiesis)的效率随年龄削弱，这样以致于免疫系统在T细胞缺失之后再生正常T细胞数量的能力最终丧失了(Mackall等，1995)。然而，近来Douek等(1998)的工作，已经大概显示胸腺输出甚至在老年人中发生。TCR基因重排的切除(excisional)DNA产物用于证实循环的、在年长病人HIV感染之后重新产生的纯真T细胞。这种输出的速率和随后外周T细胞库再生需要被进一步研究，由于在青春期后的病人中，与青春期前的病人相比，经受化疗的病人显示大为减小的T细胞库再生速率，尤其CD4+T细胞(Mackall等，1995)。这在近来Timm和Thoman的工作(1999)中进一步被例证，他们已经表明尽管老龄小鼠中CD4+T细胞在骨髓移植(BMT)后再生，它们似乎显示出倾向于形成记忆细胞，这归因于老化的外周微环境，以及胸腺产生纯真T细胞的能力的贫乏。
胸腺基本上由不同的基质细胞(主要为上皮细胞亚群)内散布的发育的胸腺细胞组成，基质细胞组成微环境并提供T细胞最优发育必需的生长因子和细胞相互作用。胸腺细胞和上皮细胞亚群之间控制它们分化和成熟的共生发育关系(Boyd等，1993)，意味着在两者中任一细胞类型的水平发生性类固醇抑制，它接着会影响另一种细胞的状态。胸腺细胞本身有固有缺陷的可能性很小，这是由于先前使用辐射嵌合体(radiation chimeras)的研究，已经显示骨髓干细胞不受年龄影响(Hirokawa，1998；Mackall和Gress，1997)并具有和年轻的骨髓细胞相同程度的胸腺增殖潜力。此外，老年动物中的胸腺细胞至少一定程度上保留它们的分化能力(Mackall和Gress，1997；George和Ritter，1996；Kirokawa等，1994)。然而，近年Aspinall(1997)的工作，已经显示发生在TCRβ链基因重排阶段的CD3-CD4-CD8-三阴性(TN)前体细胞群内的缺陷。
特别是对AIDS而言，免疫系统内主要的缺陷是CD4+细胞的破坏，其次是髓系细胞中的巨噬细胞和树突状细胞(DC)。没有这些细胞免疫系统是瘫痪的，病人对于机会感染极为敏感，死亡是通常的结果。目前AIDS的治疗基于杀死和排除HIV病毒的许多抗病毒药物。这种治疗现在变得更有效，病毒负荷可大幅度地减少，且可认为病人已达到缓解。但免疫缺陷这一主要问题仍然存在，这是由于功能性T细胞仍然极少，而恢复的那些又恢复得极慢。因此免疫缺陷的时间仍然会持续很久，在某些情形中免疫防卫机制可能无法充分恢复。其中的原因在于，在青春期后，人们的胸腺已经萎缩。
为了产生新的T淋巴细胞，胸腺需要前体细胞；这些前体细胞短时可以来源于该器官本身内部，但是我们已经显示经过3-4周，这些细胞耗尽，必须接受新的HSC(通常情况下HSC经血液来自骨髓)。然而，即使在正常功能的年轻胸腺中，这些细胞的摄取也是极低的(但足以保持T细胞在自稳态调节水平上产生)。实际上细胞进入胸腺极端地限于且有效地被限制于HSC(或者至少是沿T细胞系已经具有优先发育的前胸腺细胞)。在胸腺由于性类固醇抑制丧失而重获活力的情形中，我们已经证明该器官现在对于血液中循环的新前体细胞是极易接收的，这样以致于新的T细胞既由胸腺内又由外部前体产生。通过增加血液中的前体细胞的水平，源自它们的T细胞渐渐会成为T细胞库的主导。这意味着任何引入前体细胞(HSC)的基因将会进入所有子代T细胞上并且最终事实上出现于所有T细胞库内。这些细胞相对于源于内源性宿主HSC的显性水平可通过简单地增加被转移的外源HSC的数量而升高至极高水平。
【发明内容】
本发明者已经证明能够通过抑制性类固醇产生完全逆转胸腺萎缩(老化诱导的或例如由化疗或放疗引起的结果)，同时事实上完全还原胸腺结构和功能。本发明者还发现这种胸腺再生的基础部分上归因于既源自胸腺内又经过血流的前体细胞的开始扩增。该发现表明，注射入患者的外源性造血干细胞(HSC)是能够种植于胸腺的。
通过破坏性类固醇到胸腺的信号途径，遗传修饰或外源HSC能够种植于胸腺，这意味着HSC基因治疗可更有效地用于治疗T细胞(以及在胸腺内发育的髓系细胞)疾病。至今，HSC干细胞治疗很少或从未成功，这是由于胸腺是休眠的且不能够吸收许多HSC，T细胞生成小于正常水平的1％。
因此，本发明的第一方面提供治疗患者T细胞疾病的方法，这种方法包含破坏性类固醇至患者的胸腺的信号途径，并且给患者进行骨髓或HSC移植。
在优选的实施方案中，T细胞疾病选自由病毒感染组成的组，例如人免疫缺陷病毒感染，T细胞增生性疾病或任何直接或间接造成T细胞数量减少或功能下降的疾病。优选地，患者有AIDS并且其病毒负荷通过抗病毒治疗已经减少。
在进一步优选的实施方案中，患者是青春期后的。
优选地，通过阉割或者施用性类固醇类似物以达到对性类固醇产生的抑制。
优选的性类固醇类似物包括氟他胺、戈舍瑞林、亮丙瑞林、dioxalan衍生物，例如曲普瑞林、meterelin、布舍瑞林、组胺瑞林、那法瑞林、黄体瑞林、亮丙瑞林、以及促黄体激素释放激素类似物。目前，优选的类固醇类似物是促黄体激素-释放激素类似物。更优选的，促黄体激素-释放激素类似物是deslorelin。
又一优选的实施方案中，性类固醇类似物通过缓释肽制剂给药。WO98/08533提供了缓释肽制剂的例子，其整个内容通过参考并入本文。
优选的实施方案中，这种方法包括移植浓缩的HSC至患者。HSC可以是自体的或异源的，尽管HSC为自体的是优选的。
在患者感染HIV的情形中，HSC优选是遗传修饰的，这样以致于它们和它们的子代，尤其T细胞、巨噬细胞和树突状细胞，对于HIV病毒感染和/或破坏有抵抗力。遗传修饰可包括引入HSC一种或多种阻止病毒复制、装配和/或感染的核酸分子。核酸分子可以是编码抗病毒蛋白、反义构建子、核酶、dsRNA的基因和催化核酸分子。
在患者具有缺陷T细胞的情况中，优选遗传修饰HSC以使缺陷正常化。对于例如T细胞白血病的疾病，修饰包括引入使HSC正常化并抑制或减少其变成癌细胞的可能性的核酸构建子或基因。
本方法在治疗任何具有明确基因基础的T细胞细胞疾病中是有效的，这会是本领域的技术人员可以理解的。优选的方法包括通过抑制性类固醇再活化胸腺功能以增加其对血液运载的造血干细胞(HSC)的摄取。通常，青春期开始后，胸腺在性类固醇的影响下经历严重萎缩，同时其细胞产生量减少至青春期前胸腺的1％。本发明基于这样的发现，即对性类固醇产生的抑制解除了对胸腺的抑制并允许其功能完全再生，包括增加血源HSC的摄取。HSC的来源可直接来自注射或先前注射后的骨髓。可以展望的是源自修饰过的HSC的血细胞会传递这种遗传修饰至它们的子细胞上，包括源自自我更新的HSC，即使通过由性类固醇的抑制再活化胸腺功能不彻底地促进这些HSC沿T细胞和树突状细胞系在胸腺内的发育，但也可使其得到极大的增强。
本发明的方法特别适于对AIDS的治疗，这里治疗优选包括病毒负荷的减少，通过性类固醇的抑制使胸腺功能再活化，和将HSC(自体或源自第二方供体)转移入患者，所述的HSC已经被遗传修饰以致于所有子代(尤其T细胞，DC)可抵抗进一步的HIV感染。这意味着病人不仅会减少HIV感染并且不再对通常的感染易感，这是由于T细胞已经复原至正常水平，而且新的抵抗HIV的T细胞能够清除任何剩余病毒感染的细胞。原则上相似的策略能应用于适于任何T细胞缺损或任何感染T细胞的病毒感染的HSC基因治疗。
【附图说明】
图1：外科阉割老龄(2岁)小鼠并分析(a)胸腺重量与体重的比以及(b)在阉割后2-4周每个胸腺的细胞总数。与年轻的成熟(2月龄)小鼠相比，老龄小鼠中观察到胸腺重量和细胞含量显著减少，但在阉割后可以复原。阉割后3周观察到胸腺肥大，并且阉割4周后复原至年轻的成熟小鼠的水平。结果表示为每组4-8只小鼠的均值±1SD。**＝p≤0.01；***＝p≤0.001(与年轻的成熟小鼠和阉割后小鼠比较)。
图2：外科阉割老龄(2岁)小鼠并在阉割后2和4周分析外周淋巴细胞群。(a)脾内淋巴细胞总数。由于存在外周稳态，在老龄或阉割后的小鼠未观察到总脾细胞数的变化。(b)B细胞与T细胞之比不随年龄或阉割而变化，然而(c)观察到CD4+∶CD8+T细胞比随年龄显著下降，而在阉割4周后该比例可复原。数值表示为每组4-8只小鼠的均值±1SD。***＝p≤0.001(与年轻的成熟小鼠和阉割后小鼠比较)。
图3：阉割老龄(2岁)小鼠并且基于标记物CD4和CD8分析胸腺细胞亚群。所示为CD4-CD8-DN、CD4+CD8+DP、CD4+CD8-和CD4-CD8+SP胸腺细胞的代表性的CD4/CD8的FACS分析的散点图。未观察到伴随年龄或阉割而出现的任何CD4/CD8定义的亚群的比例的差异。
图4.1：阉割老龄(2岁)小鼠并脉冲式注射一剂溴脱氧尿苷(BrdU)以测定增生水平。所显示的为胸腺内BrdU+细胞比例随年龄和阉割后而变化的代表性直方图。未观察到随年龄或阉割后整个胸腺内的增生细胞的比例的差异。
图4.2：阉割老龄(2岁)小鼠并脉冲式注射一剂溴脱氧尿苷(BrdU)以测定增生水平。基于CD4和CD8在胸腺内的表达对不同亚群的胸腺细胞的增生情况的进行分析。(a)每个胸腺细胞亚群在BrdU+群内的比例不随年龄或阉割后变化。(b)然而，观察到DN(CD4-CD8-)胸腺细胞增生随年龄显著减少，在阉割后其可复原，同时CD4-CD8+SP胸腺细胞的增殖明显增加。(c)观察到TN亚群内BrdU+细胞总比例随年龄或阉割后无变化。然而(d)随年龄的变化观察到TN1(CD44+CD25-)亚群的增生显著减少而TN2(CD44+CD25+)亚群的增生显著增加，而上述变化在阉割后复原。结果表示为每组4-8只小鼠的均值±1SD。**＝p≤0.05；***＝p≤0.001(与年轻的成熟小鼠和阉割后小鼠比较)。
图5：阉割老龄(2岁)小鼠并胸腺内注射FITC以测定胸腺细胞输出率。24小时以后计算外周FITC+细胞数量。(a)观察到新近的胸腺迁出(recent thymic emigrant，RTE)细胞数量随年龄显著下降。阉割后至阉割后2周，这些数值显著升高。(b)迁出比(输出/胸腺细胞总量)随年龄保持稳定，但在阉割后2周显著减少。(c)观察到CD4+与CD8+的RTE比值随着年龄显著升高，但在阉割后1周恢复正常。结果表示为每组4-8只小鼠的均值±1SD。**＝p≤0.01；***＝p≤0.001(与年轻的成熟小鼠和阉割后小鼠比较)。^＝p≤0.001(与阉割小鼠相比)。
图6：使用环磷酰胺减少低龄成年(3月龄)小鼠的淋巴细胞。环磷酰胺处理时小鼠在同一天或者假阉割或者阉割。(a)与假阉割小鼠相比，在阉割小鼠中观察到胸腺细胞数量显著增加。(b)阉割小鼠还显示出在环磷酰胺处理后1周脾细胞数量显著增加。(c)阉割小鼠在处理后1周还观察到淋巴结细胞量显著增加。结果表示为每组4-8只小鼠的均值±1SD，***＝p≤0.001(与阉割的小鼠比较)。
图7：使用亚致死(625拉德)辐射减少低龄成熟(3月龄)小鼠的淋巴细胞。在进行辐射的同一天对小鼠进行假阉割或者阉割。与接受假阉割的小鼠相比，阉割小鼠的胸腺再生显著加快(a)。未观察到阉割小鼠的脾(b)或淋巴结(c)的细胞数量中的差异。与对照组小鼠相比，处理后2周淋巴结细胞数量仍然持续低下。结果表示为每组4-8只小鼠的均值±1SD。**＝p≤0.05(与对照组小鼠相比)；***＝p≤0.001(与对照和阉割后的小鼠比较)。
图8：使用亚致死(625拉德)辐射减少低龄成熟(3月龄)小鼠的淋巴细胞。小鼠在辐射之前1周接受假阉割或者阉割。观察到阉割小鼠的胸腺再生显著增加(a)。未观察到阉割小鼠的脾(b)或淋巴结(c)的细胞数量的差异。与对照组小鼠相比，处理后2周淋巴结细胞数量仍然持续低下。结果表示为每组4-8只小鼠的均值±1SD。*＝p≤0.05；**＝p≤0.01(与对照组小鼠相比)；***＝p≤0.001(与对照组和阉割后小鼠比较)。
图9：在同一天进行环磷酰胺(一种化疗剂)和外科或化学阉割处理后胸腺、脾和淋巴结细胞数量的变化。注意到阉割动物与未阉割(单独使用环磷酰胺)组相比时，在处理后1和2周阉割动物的胸腺迅速增大。此外，与单独的环磷酰胺组相比，阉割组的脾和淋巴结的细胞数量增加良好(每个处理组和时间点n＝3-4)。在环磷酰胺处理后的免疫系统的再生方面，化学阉割的作用与外科阉割相当。
图10：阉割老龄小鼠(2岁)并分析对单纯疱疹病毒-1(HSV-1)的反应。(a)与低龄成熟小鼠和阉割后的小鼠相比时，老龄小鼠显示感染后总淋巴结细胞数量的显著减少。(b)HSV-1感染小鼠的LN中活化(CD8+CD25+)细胞的典型FACS图。未发现因年龄或阉割后引起的小鼠活化CTL比例的差异。(c)老龄小鼠淋巴结内下降的细胞数量表现为活化CTL数量的显著下降。对老龄小鼠进行阉割可以使其恢复对HSV-1的免疫反应，其中的活化细胞数量可与低龄成熟小鼠相当。结果表示为8-12只小鼠的均值±1SD。**＝p≤0.01(与低龄成熟(2个月)小鼠和阉割小鼠相比)。
图11：切取经HSV-1免疫的小鼠的腘淋巴结并培养3天。以未免疫的小鼠作为基础水平裂解的对照进行CTL试验(通过51Cr-释放测定)。结果表示为8只小鼠的均值+1SD(n＝3)。在E∶T比为10∶1和3∶1时，老龄小鼠均显示CTL活性显著减少，表明位于淋巴结内的特异性CTL的百分比减少。对老龄小鼠进行阉割可以使CTL反应恢复至低龄成熟小鼠的水平。*＝p≤0.01(与低龄成熟小鼠和阉割的老龄小鼠相比)。
图12：分析CD4+辅助T细胞和VβTCR对HSV-1感染的反应。在HSV-1感染第5天切取腘淋巴结并离体(ex-vivo)分析(a)CD25、CD8和特异性TCRVβ标记物的表达和(b)CD4/CD8 T细胞。(a)表达Vβ10或Vβ8的活化(CD25+)CD8+T细胞的百分比以每组8只小鼠的均值±1SD表示。未观察到随年龄或阉割后引起的差异。(b)静息LN细胞群中CD4/CD8比随年龄下降，但在阉割后复原。结果表示为每组8只小鼠的均值±1SD。***＝p≤0.001(与低龄成熟小鼠和阉割小鼠相比)。
图13：HSV-1接种之后活化LN内CTL上Vβ10的表达。尽管总体上老龄小鼠中存在正常的Vβ10反应性，但观察到一些小鼠中完全缺乏Vβ10表达。图中所示为代表性的直方图。注意到老龄小鼠中克隆反应的减少，而在阉割后恢复了应有的反应。
图14：进行Ly5同类系小鼠骨髓移植之后胸腺、脾、淋巴结和骨髓细胞数量的变化。与未阉割组相比，阉割的动物在处理后所有时点胸腺迅速增大。此外，与单独用环磷酰胺组相比，阉割组的脾和淋巴结细胞数量增加良好。(每个处理组和时点n＝3-4)。与未阉割动物相比，阉割小鼠的同类系(Ly5.2)细胞已经显著增加(数据未显示)。
图15：胎肝重建(reconstitution)后阉割和未阉割小鼠的胸腺细胞数量的变化(每个试验组的n＝3-4)。(a)第二周，小鼠胸腺细胞数量在正常水平并明显高于未阉割小鼠(*p＜0.05)。四周后在阉割小鼠的胸腺内观察到肥大。未阉割的细胞数量保持低于对照组水平。(b)CD45.2+细胞——CD45.2+是来源于供体细胞的标记物。重建两周后供体来源的细胞既出现于阉割的小鼠又出现于未阉割小鼠中。处理之后四周阉割小鼠胸腺内约85％的细胞是供体来源的。在未阉割小鼠胸腺中无供体来源的细胞。
图16：致死性辐射和胎肝重建继而进行外科阉割后供体来源的CD4对CD8胸腺细胞群的FACS图。每图的右边给出每个象限的百分比。年龄匹配对照图是8月龄Ly5.1同类系小鼠胸腺。以CD45.2+细胞那些阉割和未阉割小鼠的细胞进行设门，发现仅仅为供体来源的细胞。重建两周后胸腺细胞的亚种群在阉割和未阉割小鼠之间无差异。
图17：致死性辐射、胎肝重建和阉割之后骨髓和淋巴树突状细胞(DC)数量。(每个试验组n＝3-4只小鼠。)图中的对照(白色)条基于在未处理过年龄匹配小鼠中发现的正常数量的树突状细胞。(a)来自供体的骨髓树突状细胞——重建后两周的未阉割小鼠中DC处于正常水平。同一时点在阉割小鼠中有明显更多的DC(*P＜0.05)。至第四周时阉割小鼠中的DC数量仍保持在对照水平之上。(b)来自供体的淋巴树突状细胞——重建两周后，阉割小鼠中的DC数量是未阉割小鼠的两倍，至处理后四周，DC数量保持在对照水平之上。
图18：胎肝重建后阉割和未阉割小鼠中总骨髓细胞数量和CD45.2+骨髓细胞数量的变化，每个试验组n＝3-4只小鼠。(a)细胞总数——重建后两周骨髓细胞数量已经正常化，阉割和未阉割小鼠之间细胞数量无显著性差异。重建四周后阉割和未阉割小鼠之间细胞数量有显著性差异(*p＜0.05)。(B)CD45.2+细胞数量——重建后两周骨髓中就CD45.2+细胞数量而言，阉割和未阉割小鼠之间无显著性差异。第四周时阉割小鼠中CD45.2+细胞数量保持高的水平，同一时点未阉割小鼠中无来自供体的细胞。
图19：胎肝重建后阉割和未阉割小鼠骨髓中T细胞以及骨髓和淋巴来源的树突状细胞(DC)数的变化。(每个试验组n＝3-4只小鼠。)图中的对照(白色)代表未处理过的年龄匹配的小鼠中存在的正常数量的T细胞和树突状细胞。(a)T细胞数量——阉割和未阉割小鼠在重建后两周和四周T细胞数量均减少。(b)来自供体的骨髓树突状细胞——重建后两周阉割和未阉割小鼠中DC细胞数量正常。同一时点在阉割和未阉割小鼠中的DC细胞数量之间无显著性差异。(c)来自供体的淋巴树突状细胞——重建后两周和四周，数量在正常水平。第二周时阉割和未阉割小鼠的细胞数量之间无显著性差异。
图20：胎肝重建后阉割和未阉割小鼠中总的脾细胞数量和供体(CD45.2+)脾细胞数量的变化。(每个试验组n＝3-4只小鼠。)(a)细胞总数——重建后两周，细胞数量减少，阉割和未阉割小鼠之间的细胞数量无显著性差异。重建四周后阉割小鼠中的细胞数量达到正常水平。(b)CD45.2+细胞数量——重建后两周，脾中就CD45.2+细胞数量而言，阉割和未阉割小鼠之间无显著性差异。第四周时阉割小鼠中CD45.2+细胞数量保持高的水平。同一时点未阉割小鼠中无来自供体的细胞。
图21：胎肝重建后脾T细胞以及骨髓和淋巴来源的树突状细胞(DC)。(每个试验组n＝3-4只小鼠。)图中的对照条(白色)代表未处理过的年龄匹配的小鼠中存在的正常数量的T细胞和树突状细胞。(a)T细胞数量——重建之后两周和四周，阉割和未阉割小鼠中的细胞数量减少。(b)来自供体的(CD45.2+)骨髓树突状细胞——重建后两周和四周，阉割和未阉割小鼠中的DC数量正常。第二周，阉割和未阉割小鼠中的细胞数量之间无显著性差异。(c)来自供体的(CD45.2+)淋巴树突状细胞——重建后两周和四周，数量在正常水平。第二周时，阉割和未阉割的小鼠中的细胞数量之间无显著性差异。
图22：胎肝重建后阉割和未阉割小鼠中总的淋巴结细胞数量和供体(CD45.2+)淋巴结细胞数量的变化。(每个试验组n＝3-4只小鼠。)(a)细胞总数——重建后两周，细胞数量在正常水平，阉割和未阉割小鼠之间无显著性差异。重建四周后，阉割小鼠中细胞数量达到正常水平。(b)CD45.2+细胞数量——重建后两周，淋巴结中就供体CD45.2+细胞数量而言，阉割和未阉割小鼠之间无显著性差异。第四周阉割小鼠中CD45.2+细胞数量保持高的水平，同一时点未阉割小鼠中无来自供体的细胞。
图23：胎肝重建后阉割和未阉割小鼠的肠系膜淋巴结中T细胞以及骨髓和淋巴来源的树突状细胞(DC)的变化。(每个试验组n＝3-4只小鼠。)图中的对照条(白色)是未处理过的年龄匹配的小鼠中存在的T细胞和树突状细胞的数量。(a)重建之后两周和四周，阉割和未阉割小鼠中的T细胞数量均减少。(b)阉割和未阉割小鼠中来自供体的骨髓树突状细胞数量正常，第四周时细胞数量下降。第二周阉割和未阉割小鼠中数量之间无显著性差异。(c)来自供体的淋巴树突状细胞——重建后两周和四周，数量在正常水平，第二周时，阉割和未阉割小鼠中的细胞数量之间无显著性差异。
【具体实施方式】
定义
术语“修饰T细胞群组成(makeup)”指改变以功能或特征分子的表达所定义的T细胞亚群的性质和/或比例。这些特征分子的例子包括但不限于T细胞受体、CD4、CD8、CD3、CD25、CD28、CD44、CD62L和CD69。
术语“增加T细胞数量”指患者T细胞数量在胸腺和/或循环和/或脾和/或骨髓和/或外周组织中的绝对增加，所述的外周组织例如为淋巴结、胃肠道、泌尿生殖和呼吸道。此术语还指T细胞相对增加，例如与B细胞相比。
“具有降低或异常T细胞群或功能的患者”包括人免疫缺陷病毒感染的个体，尤其具有AIDS的人，或者任何其它攻击T细胞的病毒或感染，或者任何已经识别其缺陷基因的T细胞疾病。
此外，此术语包括任何青春期后(post-pubertal)个体，尤其作为青春期后胸腺萎缩的结果具有下降的免疫反应性和升高的疾病发生率的老年人。
遍及本说明书的词“包括(comprise或comprises或comprising)”的变化，应被理解成意味包含规定的要素、整数或步骤，或者一组要素、整数或步骤，但是不排除任何其它的要素、整数或步骤，或者要素、整数或步骤组。
性类固醇信号的破坏
一些方法可破坏性类固醇至胸腺的信号途径，这是易于理解的，例如，通过抑制性类固醇的生成或阻滞胸腺内性类固醇受体。可通过例如阉割、施用性类固醇类似物和其它公知技术以达到对性类固醇生成的抑制。一些临床病例中，性腺经物理阉割永久除去是合适的。在优选的实施方案中，性类固醇至胸腺的信号途径通过施用性类固醇类似物而破坏，优选促黄体激素释放激素类似物。目前优选的该类似物是deslorelin(US专利4218439号描述)。
性类固醇类似物
性类固醇类似物和它们在治疗和“化学阉割”中的用途是公知的。这些类似物的例子包括氟他胺(FR7923545，WO86/01105和PT100899描述)，戈舍瑞林(US4100274、US4128638、GB9112859和GB9112825描述)、亮丙瑞林(US4490291、US3972859、US4008209、US4005063、DE2509783和US4992421描述)，如EP413209描述的dioxalan衍生物，曲普瑞林(US4010125、US4018726、US4024121、EP364819和US5258492描述)，Meterelin(EP23904描述)，布舍瑞林(US4003884、US4118483和US4275001描述)，组胺瑞林(EP217659描述)，那法瑞林(US4234571、WO93/15722和EP52510描述)，黄体瑞林(US40809946描述)，亮丙瑞林(Plosker等描述)，以及例如EP181236、US4608251、US4656247、US4642332、US4010149、US3992365和US4010149描述的LHRH类似物。以上涉及文献的每一篇公开本文通过交叉引用并入本文。
本领域技术人员会理解，破坏性类固醇至胸腺的信号途径的方法中，至少有些方法只有在施用适当化合物时才有效。因此，本发明某些实施方案的优点在于一旦已经达到预期的本发明的免疫学影响，可以停止治疗(2-3个月)，患者生殖系统会恢复正常。
造血干细胞(HSC)的遗传修饰
分离和转导干细胞和祖细胞的方法对本领域技术人员是公知的。例如，WO95/08105，US5559703，US5399493，US5061620，WO9633281，WO9633282，US5681559和US5199942描述了这些类型方法的例子。
反义多核苷酸
本文使用的术语“反义”指和本发明的多核苷酸互补的多核苷酸序列。反义分子可通过任何方法制备，包括在相反方向连接目的基因至允许合成互补链的病毒启动子。一旦被引入细胞，这种转录链结合该细胞产生的天然序列形成双链体(duplex)。这些双链体继而可阻滞进一步的转录或翻译。以此方式，产生突变型表型。
催化核酸(catalytc nucleic acid)
术语催化核酸指特异性识别特定底物并催化该底物化学修饰的DNA分子或含DNA分子(本领域亦称之为“脱氧核酶(deoxyribozyme)”或“DNA酶(DNAzyme)”)或RNA或含RNA分子(亦称之为“核酶(ribozyme)”)。催化核酸中的核酸碱基可以是A、C、G、T和U碱基，以及它们的衍生物。这些碱基的衍生物是本领域公知的。
通常地，催化核酸包含适于靶核酸特异性识别的反义序列以及核酸切割酶活性。催化链切割靶核酸中的特异性位。本发明中特别有用的核酶的类型是锤头核酶(Haseloff和Gerlach 1988，Perriman等，1992)和发夹核酶(Shippy等，1999)。
dsRNA
dsRNA对于特异性抑制特定蛋白的产生特别有效。尽管不希望受理论限制，Dougherty和Parks(1995)已经提供了dsRNA可用于减少蛋白生成的机理的模型。这个模型近来已经由Waterhouse等修正和发展(1998)。这种技术依赖于dsRNA分子的存在，该分子含有基本上和目的基因的mRNA相同的序列，按照本发明第一方面，所述的mRNA是编码多肽的mRNA。方便地，在重组载体或宿主细胞中dsRNA在单一开放阅读框中产生，其中有义和反义序列通过无关序列相接，这使得有义和反义序列杂交形成dsRNA分子，并使无关序列形成环结构。适于本发明的适当的dsRNA分子的设计和产生是本领域技术人员能力范围之内的，尤其考虑到Dougherty和Parks(1995)，Waterhouse等(1998)，WO99/32619，WO99/53050，WO99/49029，和WO01/34815。
抗HIV构建子
本领域的技术人员能够研发适于本发明的适合的抗HIV构建子。的确，US5811275、US5741706、WO94/26877、AU56394/94和US5144019已经发展和描述了大量的抗HIV反义构建子和核酶。
实施例1——老化诱导的胸腺萎缩的逆转
材料和方法
动物
CBA/CAH和C57B16/J雄性小鼠得自Monash大学Central AnimalServices，并在常规条件下圈养。鼠龄范围在4-6周龄至26个月龄，且在有关处指出。
阉割
动物通过腹膜内注射0.3ml盐水中的0.3mg赛拉嗪(Rompun；BayerAustralia Ltd.，Botany NSW，澳大利亚)和1.5mg盐酸氯胺酮(Ketalar；Parke-Davis，Caringbah，NSW，澳大利亚)麻醉。由阴囊切口，暴露睾丸，以缝合线系住睾丸并且接着将其连同周围脂肪组织一起清除，进行外科阉割。
溴脱氧尿苷(BrdU)掺入
小鼠在4小时间隔接受两次BrdU(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)(100mg/kg体重溶于100μl PBS内)腹膜内注射。对照小鼠接受单独的载体注射。第二次注射后一小时，解剖胸腺，接下去或者制备细胞悬浮液以便FACS分析，或者立即包埋于Tissue Tek(O.C.T.化合物，MIles INC，印弟安纳)，液氮迅速冷冻，并在-70℃贮藏备用。
流式细胞术分析
通过CO2窒息杀死小鼠并且取出胸腺、脾和肠系膜淋巴结。器官经200μm筛温和地推入凉PBS/1％FCS/0.02％叠氮化物，离心(650g，5分钟，4℃)，并且在任一PBS/FCS/Az中再悬浮。脾细胞在红细胞裂解缓冲液(8.9g/升氯化铵)中于4℃培养10分钟，在PBS/FCS/Az中洗涤和再悬浮。采用血球计和溴化乙锭/吖啶橙并且在荧光显微镜(Axioskop；Carl Zeiss，Oberkochen，德国)下观察，双份测定细胞浓度和生存力。
对于3色免疫荧光法，胸腺细胞常规以抗-αβ TCR-FITC或抗-γδTCR-FITC，抗-CD4-PE和抗-CD8-APC(均来自Pharmingen，San Diego，CA)标记，继之以流式细胞术分析。脾和淋巴结悬浮液或以αβTCR-FITC/CD4-PE/CD8-APC标记，或以B200-B(Sigma)和CD4-PE和CD8-APC标记。以购自Caltag Laboratories，Inc.，Burlingame，CA的抗生物素链菌素-三色共轭物对B220-B进行显色。
对于BrdU检测，细胞以CD4-PE和CD8-APC表面标记，继之以如先前描述的固定和增加通透性(Carayon和Bord，1989)。简要地，在4℃将染色的细胞O/N固定于1％PFA/0.01％吐温-20。经过洗涤的细胞在500μlDNase(100 Kunitz单位，Boehringer Mannheim，W.德国)中37℃培养30分钟以便DNA变性。最后，细胞以抗BrdU-FIFC(Becton-Dickinson)进行温育。
对于4色免疫荧光法，胸腺细胞由CD3、CD4、CD8、B220和Mac-1标记，通过抗大鼠Ig-Cy5(Amersham，英国)收集检测，并且门控负细胞(TN)以便分析。如先前描述的(Godfrey和Zlotnik，1993)，它们进一步由Cd25-PE(Pharmingen)和CD44-B(Pharmingen)继之以抗生物素链菌素-三色(Caltag，CA)染色。接着如上所述进行BrdU检测。
在FacsCalibur(Becton-Dickinson)上分析样品。根据0°和90°的光散射图对有活力的淋巴细胞进行设门，采用Cell quest软件(Becton-Dickinson)分析数据。
免疫组织学
胸腺切片(4μm)采用低温箱(Leica)冷冻并且立即固定在100％丙酮内。
对于两色免疫荧光法，切片以该试验室生产的一系列单克隆抗体进行双重标记：MTS6、10、12、15、16、20、24、32、33、35和44(Godfrey等，1990；表1)，并且以多价的兔抗细胞角蛋白Ab(Dako，Carpinteria，CA)评价上皮细胞决定子的共表达。以FITC缀合的绵羊抗大鼠Ig(Silenus实验室)显色结合的mAb，以TRITC缀合的山羊抗大鼠Ig(Silenus实验室)显色抗细胞角蛋白。
对于溴脱氧尿苷检测，胸腺切片或者以抗细胞角蛋白继之以抗大鼠-TRITC进行染色，或者以特异性mAb染色接着以抗大鼠Ig-Cy3(Amersham)显色。然后如先前描述的进行BrdU检测(Penit等，1996)。简要地，切片固定在70％乙醇内30分钟。半干切片在4M HCl中温育，通过在硼酸盐缓冲剂(Sigma)中洗涤中和，接着在PBS中两次洗涤。采用抗-BrdU-FITC(Becton-Dickinson)检测BrdU。
对于三色免疫荧光法，切片由于特异性MTS mAb加抗细胞角蛋白标记。接着如上所述进行BrdU检测。
采用Leica荧光和Nikon共焦显微镜分析切片。
迁移(migration)研究
动物通过腹膜内注射0.3ml盐水中的0.3mg赛拉嗪(Rompun；BayerAustralia Ltd.，Botany NSW，澳大利亚)和1.5mg盐酸氯胺酮(Ketalar；Parke-Davis，Caringbah，NSW，澳大利亚)麻醉。
胸腺细胞FITC标记技术的细节类似于其他地方描述的那些(Scollay等，1980；Berzins等，1998)。简要地，暴露胸腺叶(lobe)并且每个叶注射大约10μm的350μg/ml FITC(PBS中)。伤口以外科纤维闭合，对小鼠进行保温直到其从麻醉中完全恢复。注射后约24h通过CO2窒息杀死小鼠，取出淋巴器官以便分析。
细胞计数后，样品以抗-CD4-PE和抗CD8-APC染色，接着通过流式细胞术分析。迁移细胞鉴别为两者择一地表达CD4或CD8的有活力的门内的FITC+细胞(以忽略细胞的自发荧光和双联体(doublet))。将FITC+CD4和CD8细胞百分比相加以分别得到淋巴结和脾的总迁移百分比。如Berzins等描述(1998)进行每天输出速率计算。
应用非配对学生t检验或非参数的Mann-Whitney检验分析数据，用来确定至少三次的对照实验和检测实验结果之间的的统计学意义。实验值明显与对照值不同，显示如下：*p＜＝0.05，**p＜＝0.01和***p＜＝0.001。
结果
年龄对胸腺细胞群的影响
(i)胸腺重量及胸腺细胞数量
随着年龄的增长，胸腺重量(图1A)及胸腺细胞总数量(图1B)均有非常显著的下降(P≤0.0001)。在低龄的成年体中相对胸腺重量(mg胸腺/g体重)从平均值3.34降到18-24月龄时的0.66(脂肪沉积限制了准确计算)。胸腺重量的下降可归因于胸腺细胞总数量的下降：1-2月龄的胸腺含有～6.7×107个胸腺细胞，到24月龄时降至～4.5×106细胞。通过以阉割方式去除性类固醇对胸腺的影响，发生了胸腺再生现象，而且阉割4周后，无论在重量还是细胞数量方面，胸腺都与年轻的成熟体相当(图1A和图1B)。有趣的是，阉割2周后的胸腺细胞数量有显著提高(～1.2×108)，至阉割4周后恢复到正常低龄时的水平(图1B)。
外周免疫器官中并不反映出胸腺产生的T细胞数量降低，脾细胞数目随着年龄保持稳定(图2A)。外周免疫器官中稳态机制很明显，因为脾脏及淋巴结中的B细胞与T细胞的比率不受年龄及继发的到达外周免疫器官中T细胞数目下降的影响(图2B)。然而CD4+与CD8+的比率随着年龄显著降低(P≤0.001)，由2月龄2∶1降至2岁1∶1的比率(图2C)。随着阉割及继发的到达外周免疫器官中T细胞数目的上升，没观察到外周T细胞数目的变化：脾脏T细胞数目及脾脏和淋巴结中的B∶T细胞比率在阉割后没有改变(图2A和2B)。阉割2周后随年龄而降低的外周CD4+∶CD8+比率仍明显存在，但是阉割4周后完全得以逆转(图2C)。
(ii)αβTCR、γδTCR、CD4及CD8的表达
为明确所看到的随着年龄胸腺细胞数目的下降是否因特定的细胞群损耗造成的，用限定性标记物对胸腺细胞进行了标记以分析不同的亚群。另外，这还允许对阉割后的胸腺亚群的再生动力学进行分析。与正常低龄胸腺的主要T细胞亚群的比例进行了比较(图3)，发现其随年龄保持一致。此外，通过αβTCR和γδTCR的表达对胸腺细胞进一步分型表明这些种群的比例没有随着年龄而变化(数据未显示)。阉割2周及4周后，胸腺细胞亚群保持同样的比例，由于阉割后胸腺细胞的数目增加高达100倍，这意味着所有的胸腺细胞亚群是同步扩增的而不是发育性的递进式扩增。
因此老龄动物胸腺中所看到的细胞数目的明显下降是所有细胞型均衡降低的结果，检测不到T细胞群的明显变化。胸腺再生以一种同步的形式发生，因此是同时而不是顺序性地补充所有的T细胞亚群。
胸腺细胞增殖
正如图4.1所示，15-20％的胸腺细胞在4-6周龄时增殖。其中绝大部分(～80％)是DP，而TN亚群占～6％构成了第二大群(图4.2A)。相应的，通过免疫组化分析发现大部分分裂发生在被膜下及皮质中(数据未显示)。通过FACS分析发现部分分裂发生在髓质区，表明部分SP细胞(9％CD4 T细胞、25％CD8 T细胞)分裂(图4.2B)。
尽管老龄胸腺中细胞数目显著下降，胸腺细胞增殖仍保持稳定，2岁降至12-15％(图4.1)，其中增殖种群的细胞型与2月龄相似(图4.2A)。免疫组化分析表明12月龄的分裂反映了年轻的成熟时所看到的情形，然而，在24月龄时，发现增殖主要是在外皮质层和血管结构周围(数据未显示)。阉割2周后，尽管胸腺细胞数目显著增加，但增殖的胸腺细胞组成未变，再次表明了细胞的同步扩增(图4.1)。免疫组化分析揭示阉割后2周胸腺细胞增殖的定位及细胞分裂的程度都与2月龄胸腺的情况相似(数据未显示)。在分析代表增殖细胞群的各亚群的比例时，发现在增殖细胞群中的CD8 T细胞百分比显著(P＜0.001)增加(由2月龄及24月龄时的1％升至阉割2周后的～6％)。
图4.2B显示了低龄、老龄及阉割小鼠各个亚群增殖的程度。DN亚群的增殖有显著(P≤0.001)降低(由2月龄的35％降至2岁时的4％)；CD8+T细胞的增殖也显著(P≤0.001)下降，反映了免疫组化所发现的(数据未显示)老龄胸腺髓质中无明显分裂。DN增殖的下降在阉割4周后没有恢复到正常低龄时的水平。可是，CD8+T细胞亚群的增殖在阉割2周后有显著的(P≤0.001)提高，阉割4周后恢复到了正常低龄时的水平。
用CD44和CD25对DN亚群增殖的下降情况进行了进一步的分析。除了胸腺细胞前体之外，DN亚群还包括被认为是在转变为SP细胞时负调控两个共同受体的αβTCR+CD4-CD8-胸腺细胞(Godfrey & Zlotnik，1993)。通过对这些成熟细胞进行设门，还可以分析真正的TN亚群(CD3-CD4-CD8-)，结果显示随着年龄或阉割其增殖速率无差别(图4.2C)。可是对表达CD44和CD25的亚群的分析表明TN1亚群(CD44+CD25-)的增殖具有显著的(P＜0.001)降低，由正常低龄时的20％降至18月龄时的6％左右(图4.2D)，在阉割4周后恢复正常。TN1亚群增殖的下降，通过TN2亚群增殖(CD44+CD25+)的显著(P≤0.001)上升得到了补偿，其在阉割2周后恢复到正常低龄时的水平(图4.2D)。
年龄对胸腺微环境的影响
通过免疫荧光对胸腺微环境随年龄的变化进行了检测，利用的是来自MTS系列的大量组别的单抗，由多克隆抗细胞角蛋白抗体进行双标记。
这些单抗识别的抗原可以细分为3组：胸腺上皮亚群、血管相关抗原以及那些在基质细胞和胸腺细胞上均递呈的抗原。
(i)上皮细胞抗原
对2年大的小鼠胸腺的抗角蛋白印迹(全上皮)揭示了常规胸腺结构的丢失，伴随着上皮细胞严重的无组织化、以及皮质—髓质清楚的交界部分的消失。用单抗MTS10(髓质)和MTS44(皮质)进一步分析表明皮质的大小随着年龄明显减少、而髓质上皮的下降相对不明显(数据未显示)。无上皮细胞区域，或者说角蛋白阴性区(KNA’s，van Ewijk等，1980；Godfrey等，1990；Burijntjes等，1993)更加明显，且其大小在老龄胸腺中增加，正如用抗细胞角蛋白标记那样明显。在老龄胸腺中也出现了胸腺上皮“小囊状”的结构，在髓质区尤为明显(数据未显示)。用抗细胞角蛋白印迹结论性的显示了脂肪沉积、胸腺大小剧烈下降以及皮质—髓质交界部分的完整性衰减(数据未显示)。胸腺在阉割2周后开始再生，这通过胸腺小叶的大小(a)、MTS44所揭示的皮质表层的增长(b)、以及髓质表层的定位(c)很明显的表现出来。髓质表层是在2周时由MTS10检测的，整个皮质中仍然散布着由MTS10染色的表层亚囊(subpocket)。阉割4周后，出现明显的髓质和皮质及可辨的皮质—髓质交界部分。
标记物MTS20和MTS 24被认为可以检测原始上皮细胞(Godfrey等，1990)，并能进一步阐释老龄胸腺的退化情况。它们大量存在于E14，在4-6周时可检测孤立的髓质上皮细胞簇，可是在老龄胸腺中浓度增大(数据未显示)。阉割后，所有这些抗原的表达与年轻的成熟胸腺中的水平相当(数据未显示)，伴随着的是MTS20和MTS24恢复到位于皮质—髓质交界部分的不连续的上皮亚囊上。
(ii)血管相关抗原
血—胸屏障被认为负责T细胞前体迁移到胸腺中以及成熟T细胞自胸腺迁移到外周。
MTS15单抗是胸腺血管内皮特异性的，表现为一种粒状的、弥散的染色模式(Godfrey等，1990)。在老龄胸腺中，MTS15的表达大为增加，反映了血管和血管周围空间的频率和大小的增加(数据未显示)。
胸腺胞外基质包含重要的结构及细胞粘附分子，例如胶原蛋白、层粘连蛋白及血纤蛋白原，是通过MTS16单抗检测的。MTS16散布于整个正常低龄胸腺中，在老龄胸腺中，其表达性质是分散的更为广泛，而且互相连接。在阉割2周后，MTS16的表达进一步增加，到阉割后4周，其表达代表了2月龄胸腺的情形(数据未显示)。
(iii)共同抗原
正常低龄胸腺中，通过MTS6检测，MHC II的表达在皮质上皮是强阳性的(Godfrey等，1990)，而髓质上皮则染色较弱。老龄胸腺显示出MHC II表达的下降，而阉割2周后大量增加，到阉割后4周，表达再次减少，表现的与2月龄胸腺相似(数据未显示)。
胸腺细胞迁移
低龄小鼠中每天大约有1％T细胞自胸腺迁移(Scollay等，1980)。我们发现14月龄甚至24月龄时，迁移是以一种与正常低龄小鼠相当的、成比例的速率发生的(图5a和5b)，尽管在数量上显著(P≤0.0001)下降。阉割2周后，观察到了与老龄小鼠相比而言的RTE的显著(P≤0.01)增长。尽管迁移的细胞数目有变化，但迁移速率(RTE/总胸腺细胞)随着年龄保持稳定(图5b)。然而，阉割2周后，该速率显著(P≤0.05)下降，反应了这个时期总胸腺细胞数目的增加。有意思的是，RTE的CD4∶CD8比率有所增加，从2月龄时的～3∶1升至26月龄时的～7∶1(图5c)。阉割1周后，该比率正常化(图5c)。
实施例2化疗或者辐射诱导的胸腺萎缩情况的逆转
阉割的小鼠(或者在处理前1周、或者在处理当天进行)在辐射或环磷酰胺处理后表现出胸腺再生速率的明显提高。
在胸腺中，辐射处理的小鼠表现出胸腺结构的解体，同时发生的还有迅速分裂的细胞的耗尽。皮质的瓦解类似老化的/氢化可的松处理的胸腺，提示DN和DP胸腺细胞的丢失。CD4+和CD8+SP胸腺细胞的αβ-TCR的表达出现下调——凋亡细胞的证据。相比之下，环磷酰胺处理的动物的胸腺结构解体的严重程度表现得较轻，DN和DP胸腺细胞再生速率也更快。
阉割小鼠在处理后1周，即使是在这么早的阶段，就表现出显著的胸腺再生(图6、7和8)。相比之下，未阉割动物显示出了DN和DP胸腺细胞的严重丢失(迅速分裂的细胞)及随后的CD4和CD8细胞比例的增加(抗辐射)。这通过胸腺细胞数目的差别得到最好的阐释，阉割动物的胸腺大小即使在处理后1周还表现出至少4倍的增加。处理后2周，未阉割动物DN和DP胸腺细胞都得以再生，表现出相对的胸腺细胞正常化，可是，胸腺细胞的比例依然与年轻的成熟对照胸腺不同。的确，2周时阉割与未阉割小鼠调控速率之间的巨大差别达到了最大化(4周时处理组之间的胸腺细胞数目相当)。
有意思的是，胸腺大小似乎超过了对照胸腺的基线。表明胸腺内部的迅速扩增，而这些新生胸腺细胞的迁移还没有发生(胸腺细胞迁移出并进入外周需要～3-4周)。所以，尽管各亚群内部比例相当，胸腺细胞在释放到外周之前数目是增加的。
图9示意了利用化学阉割和手术阉割促进T细胞再生的比较。化学阉割的动力学要比手术慢得多，也就是说，小鼠需要多用了大约3周的时间才能降低其体内循环的性类固醇水平。可是，正如图9所示，化学阉割仍能有效的使胸腺再生。
实施例3抑制性类固醇后胸腺再生使得外周T细胞功能的缺陷得以恢复
为测定阉割是否能够增强免疫反应，检测了单纯疱疹病毒HerpesSimplex Virus(HSV)免疫的情况，因其允许对疾病进程和CTL(细胞毒性)T细胞的作用进行研究。阉割小鼠对病毒的反应在质量上和数量上都有了改善。小鼠进行足垫免疫，免疫5天后对腘窝(引流)淋巴结进行分析。此外，在整个实验进程中，切取足垫并匀浆以测定特定时间点的病毒效价。
免疫5天后，阉割小鼠比老龄鼠具有明显大的淋巴结结构(图10a)。尽管没有看到活化细胞(CD8+CD25+)的比例因年龄或阉割有差别，与老龄对照相比，阉割后淋巴结内活化细胞的数目显著增加(图10c)。进一步地，活化细胞的数目与年轻的成熟鼠中的数目相关，表明阉割小鼠中的CTL被激活的程度更高，而年轻的成熟鼠具有增大的淋巴结可能是因为B细胞活化。这通过CTL分析检测随着年龄和阉割而发生的特异性裂解的比例得以证实(图11)。与年轻的成熟鼠(2月龄)相比，在效应物：靶比率为10∶1和3∶1时，老龄小鼠表现出显著减少的靶细胞裂解(图11)。
阉割恢复了HSV感染后小鼠产生特异性CTL反应的能力(图11)。
免疫后针对HSV的CTL反应中利用Vβ10的倾向为40％。在分析老龄并阉割的小鼠Vβ的表达情况时，发现其表达占主导地位(图12a)。可是，在一个老龄鼠的样品中，没有观察到这样的倾向(图13)。而且，与年轻的成熟及阉割小鼠相比，观察到切取的淋巴结中的CD4+T细胞随着年龄而下降(图12b)。这说明了在整个生命过程中迫切需要提高胸腺中T细胞的产量，以获得最大限度的免疫反应。
实施例4抑制性类固醇增强了胸腺对新的造血前体细胞的吸收，实现了受体及供体淋巴细胞(T、B细胞及树突状细胞)的嵌合性混合
先前的实验已表明微嵌合体的形成在器官移植接受中起着重要作用，也已表明树突状细胞在移植抗原耐受中扮演着整合的角色。因此研究了阉割对胸腺嵌合体形成及树突状细胞数目的影响。
对于同源(syngeneic)实验，每个处理组用3月龄小鼠4只，所有对照小鼠均年龄匹配且未经处理。对于同类系(congenic)实验，每个处理组用8月龄小鼠3-4只，所有对照小鼠均年龄匹配且未经处理。同源小鼠经致死辐射、胎肝重建及阉割后的胸腺变化
阉割与未阉割的重建小鼠的胸腺细胞总量与未经处理的年龄匹配的对照进行了比较，并总结于图14。在处理后2周和4周，阉割小鼠的淋巴细胞总量均比未阉割小鼠显著增加(p≤0.05)。在第6周，细胞数目仍然低于对照水平，可是，阉割小鼠的细胞数目比未阉割小鼠高3倍(p≤0.05)(图14A)。
同源小鼠经致死辐射、胎肝重建及阉割后的脾脏变化
在辐射及重建后4周和6周，阉割与未阉割小鼠的脾脏细胞总量均大为下降。同样，阉割小鼠的淋巴细胞数目在这些时间点均较未阉割小鼠增加(p≤0.05)，尽管在2周时阉割与未阉割处理组的脾脏细胞总量看不到差别(图14B)。
同源小鼠经致死辐射、胎肝重建及阉割后的肠系膜淋巴结
在辐射及重建后2周，阉割与未阉割小鼠的肠系膜淋巴结细胞数目都下降。可是，到4周的时间点时，细胞数目达到了对照水平。阉割与未阉割处理组的淋巴结细胞数目之间没有统计学上的显著差别(图14C)。同类系小鼠经致死辐射、胎肝重建及阉割后的胸腺变化
未阉割小鼠在为期4周的时间段内，胸腺细胞数目极度下降，几乎没有或完全没有再生(图15A)。然而，到2周时阉割组已经存在大量胸腺生成，其到4周时已经回复到对照水平，比未阉割小鼠的高10倍。流式细胞仪对胸腺CD45.2(来自供体的抗原)的分析显示在4周时未阉割组检测不到来自供体的细胞，但特别显著的，阉割小鼠中几乎所有的胸腺细胞在这个时间点都是来自供体的(图15B)。倘若胸腺生成的大幅增加是来自于供体来源的造血前体细胞，测定T细胞分化是否正常进行就很重要。用流式细胞仪对CD4、CD8和TCR限定的亚群进行了分析。重建后2周胸腺细胞亚群的比例没有区别(图16)。这一现象到4周时已不存在，因为未阉割小鼠没有来自供体的细胞重建，可是，在这个时间点，阉割小鼠中的胸腺细胞比例看起来是正常的。
胎肝重建2周后，阉割小鼠中来自供体的骨髓树突状细胞(定义为CD45.2+Mac1+CD11C+)比未阉割小鼠显著多，差别为4倍(p＜0.05)。处理4周后，阉割小鼠中来自供体的骨髓树突状细胞仍然高于对照(图17A)。胎肝重建2周后，阉割小鼠胸腺中来自供体的淋巴树突状细胞(定义为CD45.2+Mac1-CD11C+)是未阉割小鼠中发现的2倍。处理4周后，阉割小鼠中来自供体的淋巴树突状细胞仍然高于对照(图17B)。
重建和阉割后4周，对CD11C、上皮细胞(抗角蛋白)及CD45.2进行免疫荧光染色，将树突状细胞定位于胸腺皮质髓质连接及髓质区。利用共定位软件，证实了这些细胞是来自于供体的(数据未显示)。这得到了流式细胞仪分析的支持，分析数据表明重建4周后胸腺中大约85％的细胞为来自供体。
致死辐射、胎肝重建及阉割后的骨髓变化
阉割与未阉割的重建小鼠的骨髓细胞数目与未经处理的年龄匹配的对照小鼠进行了比较，并总结于图18A。阉割小鼠在重建后2和4周骨髓细胞数目正常。而未阉割小鼠的在2周时正常，但在4周时令人注目的下降(p＜0.05)。尽管如此，在这个时间点未阉割小鼠不与来自供体的细胞重建。
流式细胞仪对骨髓CD45.2(来自供体的抗原)的分析显示在重建后4周未阉割小鼠的骨髓中检测不到来自供体的细胞，可是，阉割小鼠中几乎所有的细胞在这个时间点都是来自供体的(图18B)。
重建后2周，阉割与未阉割小鼠中来自供体的T细胞数目均显著的低于对照小鼠(p＜0.05)。4周时未阉割小鼠的骨髓中没有来自供体的细胞，而阉割小鼠中T细胞数目仍然低于对照水平(图19A)。
重建后2周，发现阉割与未阉割小鼠骨髓中的来自供体的骨髓及淋巴树突状细胞均处于对照水平。处理后4周，阉割小鼠中细胞数目进一步下降，而未阉割小鼠中看不到来自供体的细胞(图19B)。
致死辐射、胎肝重建及阉割后的脾脏变化
阉割与未阉割的重建小鼠的脾脏细胞数目与未经处理的年龄匹配的对照小鼠进行了比较，并总结于图20A。处理后2周，阉割与未阉割的小鼠的脾脏细胞数目大约均为对照小鼠的50％。4周时，阉割小鼠中的数目达到正常水平，可是，未阉割小鼠的仍然下降。对CD45.2(来自供体的抗原)的流式细胞仪分析数据显示在重建后2周，阉割与未阉割的小鼠中来自供体的细胞数目没有显著差别(图20B)。4周时未阉割小鼠的脾脏中检测不到来自供体的细胞，可是，阉割小鼠中几乎所有的脾脏细胞都是来自供体的。
重建后2和4周，阉割与未阉割小鼠中T细胞数目均明显下降(p＜0.05)(图21A)。在胎肝重建后2周发现阉割与未阉割小鼠中来自供体的骨髓及淋巴树突状细胞(分别对应于图21A和B)处于对照水平。4周时未阉割小鼠的脾脏中检测不到来自供体的细胞，而阉割小鼠中的细胞数目仍然处于下降的水平。
致死辐射、胎肝重建及阉割对肠系膜淋巴结数目的影响
阉割与未阉割的重建小鼠的淋巴结细胞数目与未经处理的年龄匹配的对照进行了比较，并总结于图22A。重建后2周，阉割与未阉割小鼠的细胞数目均处于对照水平。重建后4周，阉割小鼠的细胞数目仍为对照水平，而未阉割小鼠的却显著下降(图22B)。流式细胞仪对CD45.2的分析表明在重建后2周，阉割与未阉割小鼠中来自供体的细胞数目没有显著差别(图22B)。重建后4周未阉割小鼠中检测不到来自供体的细胞，可是，阉割小鼠中几乎所有的淋巴结细胞都是来自供体的。
重建后2和4周，阉割与未阉割的小鼠中来自供体的T细胞数目均低于对照水平。4周时阉割小鼠中的数目仍然很低，而未阉割小鼠中没有来自供体的T细胞(图23)。在胎肝重建后2周发现阉割与未阉割小鼠中来自供体的骨髓及淋巴树突状细胞(分别对应于图23A和B)均处于对照水平。处理后4周来自供体的骨髓树突状细胞下跌至对照水平以下，然而淋巴树突状细胞保持不变。
实施例的综合讨论
我们已经表明老龄胸腺虽然严重萎缩，但是随着年龄仍保持其职能性功用，其中T细胞增殖、分化及迁移发生的水平与年轻的成熟鼠相当。尽管胸腺功能是由神经—内分泌—免疫轴之间的若干复杂的相互作用调控的，但性类固醇产物诱导的萎缩所起的影响作用最为显著和长久，该影响可由阉割后胸腺再生淋巴及上皮细胞亚群的程度加以说明。
正如以前所表明的胸腺重量随着年龄显著减少(Hirokawa和Makinodan，1975，Aspinall，1997)，与之相关的是胸腺细胞的显著下降。由阉割技术所带来的、可能因为皮质激素的作用而导致胸腺进一步萎缩的应激，通过去除性类固醇的作用而被克服，阉割2周的胸腺在结构上比阉割前的胸腺增加了20-30倍。阉割后3周，老龄胸腺在胸腺大小和细胞数目方面均表现出显著增长而超过了年轻的成熟胸腺，这可能是由于在2月龄小鼠中性类固醇可能已经在起作用了。
我们的数据证实了以前的发现，即胸腺细胞具有随着年龄的增长继续分化以及保持稳定的亚群比例的能力(Aspinall，1997)。此外，我们也表明阉割后同步发生的胸腺细胞分化意味着胸腺细胞亚群的同步扩增。由于胸腺细胞数量随着年龄显著下降，因此分析了胸腺细胞的增殖，以测定其是否为导致胸腺萎缩的一个因素。
年龄所致的胸腺萎缩或阉割后性类固醇的去除都不影响胸腺细胞的增殖，约14％的胸腺细胞还在增殖。然而，这种分裂的定位随着年龄有所差别：2月龄小鼠的胸腺在整个被膜下及皮质区表现出旺盛的分裂(TN和DP T细胞)，髓质也发生部分分裂。由于随着年龄胸腺上皮的无组织化，增殖的定位难以分辨，但较之于低龄时在形式上表现出较少的一致性，并移位于外皮质区。阉割后2周，整个皮质区都可检测到分裂的胸腺细胞，髓质区的分裂也很明显，与2月龄胸腺分布情况相似。
如CD4和CD8分析所测，增殖细胞群的表型不随年龄或阉割改变。可是，在胸腺细胞亚群内部的增殖分析揭示TN和CD8+细胞的增殖均随着年龄显著下降。通过CD44和CD25标记对TN亚群内部做进一步分析，表明TN1(CD44+CD25-)亚群的增殖显著下降，其通过TN2(CD44-CD25+)亚群的增加得以补偿。TN细胞群内部的这种反常现象反映了Aspinall的发现(1997)。奇怪的是，阉割后2周TN亚群以正常水平增殖，意味着该群细胞对抑制性类固醇作用的即刻反应。此外，阉割后2和4周，增殖的CD8+T细胞的比例比对照胸腺有显著增加，可能暗示着其在重建外周T细胞库中的作用。
胸腺细胞的迁移随着年龄以稳定的胸腺细胞比例进行，这与以前Scollay等(1980)所显示的胸腺细胞迁移到外周的速率减少10倍的数据是有冲突的。这些结果之间的差别可能是由于胸腺内FITC标记2岁胸腺的难度或脂肪沉积影响了FITC的摄取所致。不管怎样，如Scollay所发现的，T细胞迁移的绝对数量显著下降导致了迁至外周T细胞池的RTE速率的显著减少。这将会导致外周主要是T细胞库的变化(Mackall等，1995)。以前的论文(Mackall等，1995)披露了一个随年龄出现的、T细胞库偏向(skewing)于记忆T细胞而非纯真T细胞表型的现象。可是，当个体遭遇新的致病原时，减少的T细胞库就可能无法对付该新的致病原，可能是老年个体免疫缺陷增加的原因。显然，需要在无免疫应答的个体中重建T细胞库。阉割使得胸腺能够通过显著提高纯真T细胞的产生而重建外周细胞群。
外周T细胞数目保持稳定水平，正如脾脏和淋巴结中B∶T细胞比率所证实的，可能是因为外周的稳态机制(Mackall等，1995；Berzins等，1998)。可是，老龄胸腺外周细胞组分的解体很明显，表现出CD4∶CD8比例的显著下降，从年轻的成熟小鼠的2∶1降至2岁小鼠的1∶1，这可能暗示CD4+T细胞对年龄更为敏感的特性或者胸腺以外衍生的CD8+T细胞产生的增加。阉割后2周，该比例正常化，再次反映了免疫系统对手术阉割的即刻反应。
上述发现首次表明老龄胸腺能够以相当于青春期前胸腺的特性行使功能。从这个角度看，T细胞数目显著下降，但胸腺细胞分化的功能没有受到干扰。其增殖及最后迁移到外周的总能力也不受年龄相关的胸腺萎缩的影响。不过，提及了两个重要发现。第一，联系到Aspinall(1997)的发现，看起来其对TN细胞增殖的能力有相反的影响。这种不足可以归因于胸腺细胞本身内在的不足。可是我们的数据及以前的工作表明胸腺细胞的分化，虽然减少了，依然发生而且骨髓中干细胞的进入不受年龄影响(Hirokawa，1998；Mackall和Gress，1997)。这意味着胸腺基质可作为性类固醇作用的靶，并由此产生对这种T细胞前体亚群的不正常的调控。第二，CD8+T细胞随年龄其增殖能力显著减弱，而阉割后的小鼠较之于2月龄小鼠，其增殖的CD8+T细胞比例有显著增加。成熟T细胞的增殖被认为是迁移前的最终步骤(Suda和Zlotnik，1992)，因此CD8+增殖的显著下降将意味着其迁移能力的下降。该假说得到了我们的发现的支持，即RTE中CD4∶CD8 T细胞比例随着年龄增长，暗示了迁移的CD8 T细胞的下降。或者，如果胸腺上皮提供了维持CD8 T细胞的关键因素，不管是淋巴基质分子还是细胞因子影响，该因素可能会受性类固醇的产生增加的干扰。通过去除性类固醇产物的影响，CD8 T细胞群能够再次优化增殖。因此，有必要详尽地测定阉割前后胸腺上皮细胞的状态。
由于缺乏胸腺细胞充实上皮网络，皮质随着年龄表现出崩解。阉割后胸腺上皮最令人注目的变化是MTS44所检测出的增强的皮质上皮网络，显示了胸腺细胞数目的显著增加。阉割后2周，KNA丰富且似乎容纳(accomodate)增殖的胸腺细胞，表明胸腺细胞发育发生的速率高于上皮能够处理的速度。皮质上皮细胞的增加似乎是由于胸腺结构的伸展而不是该亚群的增殖，因为通过免疫荧光技术用BrdU染色没有发现上皮细胞的增殖。
髓质上皮受年龄的影响不那么敏感，很可能是由于该区域积累了较少数目的T细胞(在DP阶段由于选择事件＞95％的胸腺细胞丢失)。可是，老龄胸腺表现出严重的上皮细胞解体，突出的是缺乏清楚的皮质——髓质交界区，髓质上皮整合入皮质上皮。阉割后2周，髓质上皮在一定程度上重新构建，正如MTS10染色所检测到的，不过，亚囊仍出现在皮质上皮。阉割后4周，皮质及髓质上皮完全重新构建，具有与年轻的成熟胸腺相似的清楚的皮质——髓质交界区。
阉割后也观察到一些微小的变化，最明显的是较之于阉割前的胸腺，MHC II类及血胸屏障抗原的表达下降。MHC II(由MTS6检测)在老龄胸腺中的表达增加，可能与对照小鼠中发育的胸腺细胞数目减少而致的MHC II的下降有关。或者，可能是简单的由于缺乏胸腺细胞的掩蔽(masking)，这在DP胸腺细胞耗损的辐射后胸腺(Randle和Boyd，1992)中也阐释过。阉割后一旦胸腺细胞数目增加，抗原结合位点再次被积累的胸腺细胞封阻，因此降低了免疫荧光的检测。老龄胸腺中识别血胸屏障的抗原(MTS12，15，16)再次增加，且在阉割后也回复到年轻的成熟胸腺中的表达水平。缺乏胸腺细胞的掩蔽以及胸腺萎缩所致的抗原的紧密邻近可以解释这种表达的增加。或者，发育的胸腺细胞可能对这些抗原的表达提供必要的控制机制，因此当其耗损时，表达不再受控。老龄胸腺中由MTS20和MTS24检测到的原上皮抗原的表达增加，但阉割后回复到皮质——髓质交界区的上皮亚囊中。这表明在老龄小鼠中缺乏上皮前体亚群分化的信号。消除性类固醇带来的封阻后，这些抗原能够分化表达皮质上皮抗原。
上述发现表明胸腺上皮细胞的不足使得其不能为发育中的胸腺细胞提供发育必要的刺激。可是，胸腺上皮细胞和胸腺细胞共生性使得确定性类固醇破坏作用的确切路径很困难。髓质上皮细胞的正确发育和维持需要皮质T细胞。因此，如果该细胞群减少，髓质胸腺细胞可能无法接受发育所需的充足信号，这似乎尤其影响CD8+细胞群，IRF-/-小鼠表现出下降的CD8+T细胞数目。所以测定这些细胞的增殖能力将会非常有意义。
所观察到的TN1亚群增殖的不足表明皮质上皮细胞的丢失在TCR基因重排的关键性阶段影响胸腺细胞的发育，其中皮质上皮提供胸腺再生所必需的IL-7和SCF等因子(Godfrey和Zlotnik，1990；Aspinall，1997)。的确，IL-7-/-和IL-7R-/-小鼠表现出与老龄小鼠中所看到的相似的胸腺形态学(Wiles等，1992；Zlotnik和Moore，1995；von Freeden-Jeffry，1995)。还需要进一步的工作检测IL-7和IL-7R随年龄的变化。
总而言之，老龄胸腺仍然保持其发挥功能的能力，不过，由于胸腺微环境结构完整性的缺乏，老龄小鼠中胸腺细胞的发育不像正常低龄小鼠中所看到的处于胸腺上皮细胞的严谨控制之下。因此这些细胞的增殖、分化及迁移不会被最佳的调控，可能会导致外周释放的自主激活的/免疫机能障碍的T细胞增加。TN以及CD8+种群的不足，特别是后者，可能导致了所看到的外周T细胞池随着年龄的变化。此外，我们已详细描述了阉割对胸腺上皮细胞发育和重构建的影响。利用激素受体结合方法分析胸腺萎缩的机制、以及胸腺上皮细胞亚群在阉割后胸腺再生中的作用目前正处于研究之中。通过阉割恢复胸腺功能将为外周T细胞池的再生提供重要的手段，从而在免疫抑制个体中重建免疫力。
在免疫耗竭动物模型中研究了阉割对胸腺结构及T细胞产量的影响。具体的，实施例2研究了亚致死辐射及环磷酰胺处理后阉割对恢复免疫系统的效果。这些形式的免疫耗竭作用是抑制DNA合成，因而以迅速分裂的细胞为靶向。在胸腺中这些细胞主要是未成熟的皮质胸腺细胞，可是所有的亚群都受到影响(Fredrickson和Basch，1990)。在正常健康老龄小鼠中，外周T细胞质量上和数量上的偏差几乎不导致病理状态，可是，T细胞耗竭后出现了较大的问题，因为胸腺再生T细胞的能力减小。如此的损害发生在HIV/AIDS，以及尤其是癌症治疗中化疗及放疗之后(Mackall等，1995)。
在亚致死辐射及环磷酰胺处理的小鼠中，阉割均显著的促进了胸腺的再生。阉割在免疫耗竭同一天或者之前7天进行，以便评估占主导地位的皮质激素诱导的对阉割手术产生应激反应对胸腺再生的影响。虽然胸腺细胞和结构的增加早在免疫耗竭后一周就看到了，但是在阉割后两周才观察到较大的差别。不管阉割是在免疫耗竭同一天还是前一周进行的，情况都是这样。
免疫组化分析表明在所有的例子中，阉割2周后胸腺结构表型正常，而未阉割小鼠的无组织化。泛上皮标记显示免疫耗竭致使未阉割小鼠的胸腺皮质上皮崩解、常规胸腺结构解体。髓质标记物支持该发现。有意思的是，阉割诱导的胸腺再生的第一个特征之一就是胞内基质的上调(由MTS16识别)。
流式细胞仪分析数据显示阉割小鼠中所有的胸腺细胞亚群都显著增加，与免疫荧光分析相一致。在免疫耗竭和阉割后的每一个时间点，所有CD4、CD8和αβ-TCR限定的亚群都同步增加。这是一个不同寻常但相符的结果，因为T细胞发育是程序性的过程，预期前体细胞(包含在CD4-CD8-门内)将会有一个最初的增加，且这可能会发生在第一时间点之前。而且，因为前体细胞代表了总胸腺细胞非常小的一部分，其数量上的改变可能检测不到。还分析了阉割对其它细胞的影响，包括巨噬细胞和粒细胞。一般来说胸腺中巨噬细胞和粒细胞的数目很少变化。
在辐射和环磷酰胺免疫耗竭模型中，胸腺细胞数目每两周达到高峰并于处理后4周下降。辐射和化疗刚结束，胸腺重量及细胞数显著下降，大约5天后胸腺再生的第一个阶段开始。第一次重建高峰(第5-14天)是通过抗辐射胸腺细胞的增殖(主要是双阴性的)实现的，导致了所有胸腺细胞亚群的增加(Penit和Ezine，1989)。在第16-22天之间观察到的第二次下降是因抗辐射细胞有限的增殖能力加上骨髓产生的胸腺前体细胞的下降所致(也受辐射影响)。第二个再生阶段是因为骨髓衍生的前体细胞补充到胸腺中所致(Huiskamp等，1983)。
着重指出的是，成年小鼠中从HSC发育为成熟T细胞需要大约28天(Shortman等，1990)。所以，直到处理后4周很少看到外周T细胞的变化不足为奇。外周会由胸腺运送的一些细胞支持，但是直到处理后4周在外周发现的大多数T细胞将会是在缺乏耗竭细胞的情况下扩增的增殖中的抗环磷酰胺或辐射的克隆。预期阉割后一些长期的变化将会包括，最为重要的，由增加的胸腺运送所致的TCR库的多样化。阉割不影响外周其它白细胞的恢复，包括B细胞、巨噬细胞和粒细胞。
实施例4显示了阉割对同源及同类系骨髓移植的影响。Starzl等(1992)报道淋巴或非淋巴组织中明显的微嵌合体是同种异体移植的一个好的征兆。也就是说，认为它们是诱导移植耐受所必需的(Starzl等，1992)。来自供体的树突状细胞出现在这些嵌合体中，被认为在避免移植排斥的过程中起着整合的作用(Thomson和Lu，1999)。众所周知树突状细胞是胸腺阴性选择过程中的关键参与者，如果来自供体的树突状细胞出现在受体的胸腺中，移植的激活T细胞可能被消除。
为了确定阉割是否能增加嵌合体的形成，用同源胎肝移植进行了研究。结果表明阉割小鼠胸腺再生增强。用同类系小鼠(Ly5)重复该实验时再次看到了这些趋势。由于同类系标志的存在，评估小鼠嵌合体状态成为可能。早在胎肝重建后2周，胸腺中可检测到来自供体的树突状细胞，阉割的小鼠中的数目比未阉割的小鼠高4倍。重建后4周，未阉割的小鼠没有来自供体的细胞重建，表明阉割可能事实上提高了嵌合体形成的可能性。假如阉割不仅能在致死辐射和胎肝重建后增强胸腺再生，而且还能增加胸腺中来自供体的树突状细胞的数目，除了干细胞移植以外，这种途径提高了移植接受的可能性。
上述说明书中提及的所有出版物均在此引为参考。本发明所描述的方法及系统的各种修饰及变化对本领域技术人员来说是显而易见的，且不偏离本发明的范围和宗旨。尽管本发明是结合具体的优选实施例进行描述的，应当理解所要求保护的发明不应不适当的局限于这些具体的实施例。实际上，对分子生物学或相关领域技术人员来说显而易见的、用来实施本发明的所描述的方法的各种修饰都将落入以下权利要求的范围之内。
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