对苯甲醛-O-β-D-阿洛吡喃糖苷治疗神经源性疼痛的用途 【发明领域】
本发明涉及药物化学领域，具体而言，本发明涉及对苯甲醛-O-β-D-阿洛吡喃糖苷化合物的新用途。
背景技术
按照疼痛持续时间长短，临床上将疼痛分为急性疼痛和慢性疼痛两种，这两种疼痛在发生机理上有本质区别。急性疼痛称作伤害性疼痛，即由组织创伤引起的疼痛，随着组织创伤的修复，疼痛自然停止，在发作期可使用镇痛剂(如麻醉镇痛剂与非甾体类解热镇痛剂)缓解疼痛；慢性疼痛则以神经源性疼痛为主，其发病机理极其复杂，且很难治疗，是疼痛医学的基础与临床研究和药物研发的新领域。国外兴起约30年，在中国约有10-15年的研究历史。
一.神经源性疼痛基本概念
神经源性疼痛是由外伤、炎症或其他疾病等引起神经损伤或病变所致的慢性疼痛。其典型的例子包括：带状疱疹神经痛、糖尿病的多发神经炎性疼痛、脑中风后疼痛综合征、截肢后的假肢痛、脊柱疾患压迫脊髓或神经根引起的腰背痛、中枢和外周创伤引起的慢性疼痛以及顽固性癌痛等。由于其复杂的发病机制与缺乏有效的治疗药物(阿片类与非甾体类解热镇痛药对这类疼痛效果不佳)，神经源性疼痛已经成为临床治疗上较为棘手的问题。神经源性疼痛被认为是渐进的神经系统疾病，与急性疼痛的区别在于痛觉的持续状态、神经可塑性的适应性改变及继发的生化反应等。
神经源性疼痛病理生理学特点是痛觉高反应性，主要表现为：痛觉过敏(hyperalgesia)，对伤害性刺激反应增加或敏化；痛觉超敏(allodynia)，对非伤害性刺激产生伤害性刺激反应；自发痛(spontaneous pain)，在无刺激条件下出现疼痛。
二.神经源性疼痛发病机制
神经源性疼痛的痛觉高反应性在动物实验模型上表现为痛觉阈值下降，初级感觉神经元电活性增强，出现异位放电等。在近五年来对这些现象的发生机制的研究取得显著进展。值得瞩目的进展有以下几点：
1.痛觉传导神经沉寂纤维活化与痛觉过敏
在正常情况下，C纤维传导尖锐性疼痛，Aδ纤维传导钝痛。这些纤维中的10-20％在正常情况下处于“休眠状态”，称为沉寂(silence)纤维。当神经损伤后，这些神经纤维被活化，出现自发和异位放电，在痛觉过敏中起着重要作用。
2.Aβ纤维参与痛觉传导与痛觉超敏
在正常情况下，Aβ纤维只参与触觉、振动和压力感的传递，其神经胞体处于背角深层(III和IV层)，与处于浅层地(I和II层)纤维的神经胞体没有联系。神经损伤后Aβ纤维不但电活性活跃，而且其胞体向I、II层生长发射出纤维，并与C和Aδ纤维的神经胞体形成突触联系，这样就使原本不引起疼痛感的刺激也活化了痛觉传递通路。目前研究认为Aβ活化C和Aδ纤维神经元的神经递质主要是氨基酸和肽类物质。
3.交感神经篮状结构与自发性疼痛和痛觉超敏
在正常情况下，背根神经节处交感神经主要支配其周围血管，调节血流。外周神经损伤后，交感神经也发射出纤维扩展到背根多层的神经胞体上，与Aβ神经元胞体形成篮状结构，并激活沉寂的Aβ神经元，增强诱发性电活性，导致自发性疼痛和痛觉超敏反应。
4.Na+通道与神经源性疼痛
以往研究主要集中在Ca2+通道及其电流在神经损伤中的作用，并发现电压依赖性N型Ca2+通道及其电流参与神经痛的发病。某些钙通道拮抗剂如维拉帕米(Verapamil)也有一定的镇痛效果。但最近(特别是90年代中期后)发现Na+通道的改变可能更为重要，特别是电压依赖性Na+通道。
电压门控性Na+通道由α与β亚单位组成，通道由α亚单位形成。目前，已克隆出9种电压门控通道的α亚单位和3个β亚单位。在神经元中存在至少有7种α亚单位，药理学上根据其对河豚毒素的敏感性，将其分成河豚毒素敏感型(TTX-s)和不敏感型(TTX-r)两种。
在神经源性疼痛模型上可以观察到受损神经元中TTX-r型α亚单位Nav1.8(SNS/PN3)和Nav1.9(NaN)的转录下调，Na+电流减弱。TTX-s型α亚单位Nav1.3(TypeIII)转录上调，电流增加。也有人证明Nav1.8在背根神经元中表达下调，但在受损神经纤维的轴突部位其表达为上调，认为这是Nav1.8亚单位蛋白由神经元胞体向轴突转位的结果，所以是Na+通道分布的变化。使用胶质细胞神经生长因子(GKNF)可以翻转这些改变，并有镇痛作用。此外，Nav1.8基因敲除小鼠也显示出痛觉过敏和超敏反应低下的行为特点。这些结果证明，Na+通道改变在神经源性疼痛中起着重要作用，寻找Na+通道亚型选择性抑制剂已成为今后治疗药物的重要发展方向。
5.炎症过程、炎症因子与神经源性疼痛
神经受损后的继发性伤害改变通常都伴有炎性反应。因此，在探讨神经源性疼痛的机制中，一些学者将注意力集中到炎性因子的改变及其病理生理学作用。这些炎性因子包括P物质、钙调素基因相关肽、单胺、ATP、一氧化氮、白三烯、前列腺素、神经生长因子等。
值得注意的是最近(90年代中期后)发现缓激肽(brady kinin)系统，在神经痛中也有改变，观察到缓激肽B1和B2受体上调。缓激肽通过激活B1和B2受体，直接兴奋伤害性感受器，B2受体拮抗剂有镇痛作用。B1受体主要介导损伤后的炎症过程和疼痛。全面抑制该系统。对神经源性疼痛可能有良好的效果。
三.神经源性疼痛治疗药物
目前，治疗神经源性疼痛的主要药物都属于老药新用，大部分都是经过临床试用发现可能有效，再进行系统临床研究，然后回到实验室研究，探讨其机制，推动新药的发展研究。这些治疗药物大致分为四种类型：抗癫痫药、抗抑郁剂、局部麻醉药和其他。
1.抗癫痫药
1942年Bergonignan首次限导苯妥英钠能有效治疗三叉神经痛，未受重视。1962年Blom首次报导卡马西平也能有效治疗三叉神经痛。但一直到80年代，才开始进行系统的临床研究。目前临床研究已证明卡马西平和加巴喷丁(gabapetin)治疗神经痛的有效性，美国FDA已批准卡马西平用于三叉神经痛的治疗。苯妥英钠的镇痛效果较弱。拉莫三嗪(Lamotrigine)镇痛效果有矛盾报导，尚须进一步临床研究。苯巴比妥、氯硝安定、丙戊酸、托吡酯(Topiramate)、pregabalin和Tiagabine等在动物模型上有效，还未得到临床系统研究的证实。其中丙戊酸已被美国FDA批准治疗偏头痛。卡马西平阻断Na+通道，抑制Na+跨膜传导，阻止动作电位形成，减弱不良刺激向心传导，抑制异位放电。此外它还可抑制缓激肽引起的兔三叉神经痛。加巴喷丁镇痛机制研究报导较少，有人报道它对Na+通道无影响，可能与阻断Ca++通道有关，因为它可以和N型Ca++通道αδ2亚单位结合。
2.抗抑郁剂
三环抗抑郁剂对带状疱疹神经痛、慢性腰背痛、慢性紧张性头痛、糖尿病性和非糖尿病性多发神经炎痛等神经源性疼痛具有镇痛作用，已得到临床系统研究的证实。
研究最早报导较多的是阿米替林(Amitriptyline)，但是由于该药有明显镇静、抗胆碱能等不良反应，并可引起位置性低血压。后来临床研究证明其他三环类包括去甲替林、去甲丙咪嗪、氯丙咪嗪也同样有效，不良反应低于阿米替林。尽管如此，三环抗抑郁剂属于不良反应较多的药物，临床使用受到限制，为此，国外正在系统研究不良反应较少的第二代、第三代抗抑郁剂的镇痛效果，包括选择性5-HT重吸收抑制剂、去甲肾上腺素和5-HT双重吸收抑制剂等。前者有帕罗西丁(paroxetine)、西地兰(citaloprame)等，后者主要是拉法新(venlafaxine)等。
3.局部麻醉药
局部麻醉药利多卡因是典型的Ca2+通道阻断剂，1961年发现静脉灌注后可缓解术后疼痛，1982年Boas等报告用此法可以缓解中枢和外周神经痛，到90年代初才较多使用。静脉或皮下灌注后，有明显的镇痛效果，静脉灌注的有效血药浓度为0.62-5μg/ml，皮下灌注血药浓度也可达到2-5μg/ml。此外也有椎管内灌注的报导，但使用较少。由于心脏毒性和中枢神经系统的不良反应以及用药途径的不便，限制其临床使用范围。又试用了可以口服的抗心律失常药美西律(mexiletine)，其化学结构与利多卡因近似，也是一个Na+通道阻断剂。到了90年代末期美国FDA批准了利多卡因贴片(lidoderm)，局部贴敷治疗带状疱疹的神经源性疼痛，对其他神经源性疼痛也有效。
化合物对苯甲醛-O-β-D-阿洛吡喃糖苷，其通用名为豆腐果苷(Hilieidum)，曾用名为昆明神衰果素，系从中国云南省野生植物山龙眼科萝卜树(Helicia essatia Hook)的果实豆腐果中提取的有效成分，该化合物的化学结构与天麻素(gastrodin)(对羟甲基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷)有相似的单体糖苷。对苯甲醛-O-β-D-阿洛吡喃糖苷的分子式是C13H16O7，结构式如下：
该化合物为白色针状结晶性粉末，无臭，味微苦。在热水中溶解，在水、乙醇或甲醇中略溶，在乙醚或氯仿中均不溶。现有技术中，人们通过研究已经发现，豆腐果苷具有镇静、催眠和止痛作用，已经在临床上将其用于缓解神经官能症的头痛、头昏及睡眠障碍等，但是，现有技术中没有将豆腐果苷用于治疗神经源性疼痛疾病的报道。本发明人通过研究发现，豆腐果苷化合物可以用于治疗神经源性疼痛疾病。
发明目的
本发明的目的在于发现对苯甲醛-O-β-D-阿洛吡喃糖苷化合物的新的用途，即本发明提供了将对苯甲醛-O-β-D-阿洛吡喃糖苷化合物用于制备治疗神经源性疼痛疾病的药物的用途。
【发明内容】
一.神经源性疼痛动物模型
热板、甩尾、扭体是常用的筛选经典的急性疼痛镇痛药的动物模型，并不适合用来筛选神经源性疼痛治疗药物。近年来神经源性疼痛动物模型的建立发展，对神经源性疼痛的作用机制与药物研究起到极大的推动作用。
根据神经源性疼痛发病机理，实验室常常利用机械损伤外周或中枢神经损伤办法制造动物模型，曾使用坐骨神经部分切断(PSL)[参见：Seltzer Z，et al.Anovelbehavioral model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury.Pain 1990；43：205-218]，脊神经结扎(SNL)[参见：Kim SH，Chung JM.An experimentalmodel for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat.Pain1992；50：355-363]等方法建立相应模型。1988年建立了坐骨神经慢性压迫损伤模型(CCI)[参见：Bennett GJ，Xie YK.A peripheral mononeuropathy in rat that producesdisorders of pain sensation like those seen in man.Pain 1988；33：87-107]，由于该模型操作相对简单，结果可靠，因而很快被广泛接受。临床上有效治疗药物如抗抑郁剂，抗癫痫药和利多卡因(Na+通道阻断剂)均在此模型上有效[参见：Ardid O，et al.Antinociceptive effects of acute and chronic injections of tricyclic antidepressant drugs in anew model of mononeuropathy in rats.Pain，1992；49：279-287；或者Xia WH，et al.Gabapentin has an antinociceptive effect mediated via a spinal side of action in a rat model ofpainful peripheral neuropathy.Analgesia，1996；2：267-273；或者Lesley JS，Andre S et al.Coninnal systemic infusion of lidocaine provides analgesia in an animal model ofneuropathic pain.Pain，2002，97：267-273]。尽管发现了更多的动物模型[参见：LiLi X，etal Animal and cellular models of chronic pain.Advanced Prng Delivery Rev，2003；55：949-965]，但CCI模型仍是药物研发中神经源性疼痛药效评价的主要模型[参见：Luo ZD，et al.Calcutt NA，Higuera ES，et al.Injury type-specific calcium channel alpha 2 delta-1subunit up-regulation in rat neuropathic pain models correlates with antiallodynic effects ofgabapentin.J Pharmacol Exp Ther.2002；303(3)：1199-205；或Yamamoto T，etal.Sakashita，Y.Differential effects of intrathecally administered N-and P-type voltage-sensitive calcium channel blockers upon two models of experimental mononeuropathy in therat.Brain Res，1998；794：329-332；或Veneroni O，et al.Anti-allodynic effect of NW-1029，anovel Na+channel blocker，in experimental animal models of inflammatory and neuropathicpain.Pain，2003；102(1-2)：17-25；或Seko T，et al L-cysteine based N-type calcium channelblockers：structure-activity relationships of the C-terminal lipophilic moiety，and oralanalgesic efficiency in rat pain models.Bioorg Med Chem Lett，2002；12(17)：2267-9]。本发明人前期在研发神经源性疼痛治疗药物中也采用CCI模型，先后观测到抗抑郁剂、河豚毒素(Na+通道阻断剂)和抗癫痫药加巴喷丁均显示良好抗痛效果，并在加巴喷丁类似物筛选中发现了有效化合物。因此，在评价对苯甲醛-O-β-D-阿洛吡喃糖苷的抗神经源性疼痛作用时，也采用了此模型。
二.大鼠坐骨神经慢性压迫性神经源性疼痛实验
(一)实验目的：通过大鼠坐骨神经慢性压迫性神经源性疼痛模型评价豆腐果苷的抗神经源性疼痛作用。
(二)材料与方法：
1.实验动物：SD大鼠，雄性，初体重120-140g，二级，由维通利华实验动物技术有限公司提供。
2.药物配制及给药方法：豆腐果苷(代号WN-7-6)，由昆明贝克诺顿制药有限公司提供，临用前加蒸馏水至最大配制浓度，水浴加温至药物完全溶解，并倍比稀释到所需浓度。以2ml/kg的容积单次腹腔注射。实验设蒸馏水组为空白对照。
3.实验方法：参照文献Bennett GJ，et al.A peripheral mononeuropathy in rat that producesdisorders of pain sansation like those seen in man，Pain，1988(33)：87-107中描述的方法，大鼠用戊巴比妥钠麻醉(40mg/kg)，在右后侧大腿中段分离坐骨神经。在坐骨神经即将分叉的前段，用无菌玻璃钩将坐骨神经与周围组织分离，用无菌铬肠线(4号，直径0.15mm)松结扎4个环，每个环间距1-2mm，局部撒青霉素药粉，分别缝合肌肉组织与皮肤，置于铺有软木屑的笼中。假手术组仅暴露坐骨神经，其他处理同上。实验选择术后14～31天的动物，在给药前测定基础压力痛阈，淘汰基础痛阈大于4g或小于0.6g的动物，其余动物随机分组，每组分别给予不同剂量的药物，于给药后不同时间后分别重测压力痛阈值。
4.机械性痛觉过敏的观测：将大鼠置于金属笼中，用不同克重的纤维丝刺激其足底足心部位，持续刺激5秒，每次刺激间隔5秒，找到10次刺激中引起4次到6次大鼠抬足反应的纤维丝，此纤维丝的克重即为压力痛阈值(单位：克)。最大痛阈值设定为26克。
5.统计方法：阈值统计采用非参数检验Wilcoxon 2-Sample Test与Kruskal-WallisTest。最大痛阈值为26g。
(三)实验结果：
表1.CCI术后不同天数大鼠压力痛阈值
压力痛阈值(克)
组别 术后天数 动物数
非手术侧 手术侧
正常组 0 6 17.83±6.61 17.83±6.61
假手术组 7 6 16.83±4.49 17.20±4.92
CCI组 7 10 15.75±4.34 4.62±1.59**##
10 10 14.50±4.34 3.77±1.85***
14 10 18.67±5.68 3.00±1.55***
28 10 21.60±7.69 3.30±2.24***
31 10 24.17±4.49 3.20±1.33***
注：***P＜0.001，与非手术侧比较；##P＜0.01，与假手术组比较。
CCI组在手术后第7天即出现痛觉超敏，表现为手术侧压力痛阈值明显低于非手术侧(P＜0.01)和假手术组(P＜0.01)。痛觉超敏现象在术后10天加重，压力痛阈值均显著降低(与非手术侧比较P＜0.001)，并至少持续31天(如表1所示)。
表2.单次腹腔注射不同剂量豆腐果苷对CCI大鼠压力痛阈值的影响
豆腐果苷剂量
压力痛阈值(g)
(mg/kg) 动物数
给药前 给药后
25.0 5 2.56±1.34 4.00±1.41
12.5 8 3.10±1.26 5.50±1.77*
6.25 8 2.60±1.19 9.75±3.73***
3.125 8 3.58±1.20 4.83±2.68
注：选择术后14～31天、给药前基础压力痛阈在4g至0.6g之间的大鼠随机分组，每组分别给予不同剂量的豆腐果苷，给药后2小时重测压力痛阈值。结果以 x±s表示，*P＜0.05，***P＜0.001，与给药前压力痛阈值比较。
表3.腹腔注射豆腐果苷(6.25mg/kg)后不同时间对CCI大鼠压力痛阈值的影响豆腐果苷作用
动物数 压力痛阈值(g)
时间(h)
给药前 8 2.60±1.19
给药后： 1 8 4.00±1.85
2 8 9.75±3.73***
3 7 9.57±5.13**
6 4 10.00±5.83*
24 6 8.33±5.82*
48 6 3.90±2.31
注：选择术后14～31天且给药前基础压力痛阈在4g至0.6g之间的大鼠，腹腔注射豆腐果苷6.25mg/kg后不同时间重测压力痛阈值。结果以 x±s表示，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，与给药前压力痛阈值比较。
如表2所示，单次腹腔注射豆腐果苷25、12.5、6.25、3.125mg/kg 2小时后，各剂量组均不同程度地缓解CCI引起的痛觉超敏。与给药前比较，豆腐果苷12.5mg/kg和6.25mg/kg可显著提高机械痛觉过敏压力痛阈值(分别为P＜0.05和P＜0.001)，说明在此模型上豆腐果苷有抗慢性神经源性疼痛活性。
如表3所示，单次腹腔注射豆腐果苷6.25mg/kg后不同时间对CCI引起的痛觉超敏有不同程度地缓解作用，给药后1小时作用尚不明显，2小时可明显提高压力痛阈值(P＜0.001)，镇痛作用可达24小时以上(P＜0.05)，48h后作用消失。该药抗痛效应时间长，剂量低，并且毒性低，适于长期服用，克服了抗抑郁剂、局部麻醉药等不良反应较大的缺点，有较好的新药研发前景。
由此说明，本发明化合物：对苯甲醛-O-β-D-阿洛吡喃糖苷，即豆腐果苷，具有明显的抗痛效应，可以用于治疗神经源性疼痛疾病。
本发明的豆腐果苷化合物可以制备成用于治疗神经源性疼痛疾病的各种剂型的药物。