一种猪繁殖与呼吸综合征的“自杀性”DNA疫苗及应用.pdf

本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合征的“自杀性”DNA疫苗以及该疫苗在防制猪繁殖与呼吸综合征中的应用。特征是，将猪繁殖与呼吸综合征病毒主要免疫原性基因ORF5插入“自杀性”DNA疫苗表达载体pSCA的BamHI位点构建而成；同时还构建了一种新的适合于制备该“自杀性”DNA疫苗的表达载体pSCA，该载体是在西门利克森林病毒复制子质粒型表达载体pSFVl的非结构蛋白基因上游引入人巨细胞病毒的立即早期启动子序列，在其多克隆位点下游引入SV40 poly(A)序列。本发明的“自杀性”DNA疫苗结合了常规DNA疫苗与自主复制型RNA疫苗的优点，具有制备工艺简单、运输保存方便、安全和免疫效果好等特点。可用于猪繁殖与呼吸综合征的防制。

1、  一种猪繁殖与呼吸综合征的“自杀性”DNA疫苗，其特征是将猪繁殖与呼吸综合征病毒主要免疫原性基因ORF5插入“自杀性”DNA疫苗表达载体pSCA的BamHI位点构建而成，含有该质粒的大肠杆菌Escherichia coli DH5α/pSCA-ORF5，保藏在CCTCC，保藏号为M203073。

2、  实现权利要求1所述的“自杀性”DNA疫苗的表达载体pSCA，其特征是在西门利克森林病毒复制子质粒型表达载体pSFV1的非结构蛋白基因上游引入人巨细胞病毒的立即早期启动子序列，在其多克隆位点下游引入SV40 poly(A)序列。

3、  权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征的“自杀性”DNA疫苗在防制猪繁殖与呼吸综合征中的应用。

一种猪繁殖与呼吸综合征的“自杀性”DNA疫苗及应用
                                    技术领域
本发明涉及动物病毒学与动物传染病学技术领域。具体地说涉及一种猪繁殖与呼吸综合征的“自杀性”DNA疫苗，还涉及该疫苗在防制猪繁殖与呼吸综合征中的应用。
                                    背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，简称PRRS，下文简称PRRS)是近年发现的一种新的病毒性传染病，以母猪发热、厌食、早产、流产、死胎、弱仔等繁殖障碍及各种年龄猪的呼吸系统疾病和高死亡率为特征。该病最早于1987年报道于美国南部，不久即传播到了中西部，并在全美迅速蔓延。随后加拿大、德国、荷兰等一些国家也先后暴发了该病(Bilodeau R等，Porcine reproductive and respiratory syndrome in Quebec.Vet Rec，1991，129：102-103；Dea S，Bilodeau R，Athanassious R et al.Swine reproductive and respiratory syndrome virus in Quebec：isolation of an enveloped virus serologically-related to lelystad virus.Can Vet J.1992，33：801-808)；亚洲地区报道此病的时间相对较晚，中国台湾地区1991年出现此病(张志成等，台湾地区猪繁殖与呼吸道征候群I病毒鉴定，中华兽医杂志，1993，19(4)：268-276)；日本1994年暴发PRRS(Hiroyoshi Kuwaahara.An outbreak of PRRS in Japan.J Vet Med Sci，1994，56(50)：901-909)；中国大陆1996年报道此病开始流行，并分离到病毒(郭宝清等，从疑似PRRS流产胎儿分离猪生殖与呼吸综合征病毒的研究，中国畜禽传染病，1996，87(2)：1-5)。上述文献显示猪繁殖与呼吸综合征给全球养猪业造成了巨大的经济损失，仅1991年欧洲PRRS的暴发就造成了100万头猪的死亡。
同其它许多猪的病毒病的防制一样，PRRS的防制也主要是免疫预防。目前用于预防PRRS的主要是弱毒苗和灭活苗。尽管弱毒疫苗能提供较好的免疫保护，但存在毒力返强的危险，并且返强的机率相当高，这一点也在几年前丹麦等国因广泛使用弱毒苗而导致该病大暴发中得以证实。与弱毒苗相比，灭活疫苗虽然安全，但往往需要反复多次的免疫接种，而且效果不稳定，还经常导致免疫失败。可以说，目前对该病的防制一直不尽人意，迫切需要更加安全、有效的疫苗来预防和控制该病的发生与流行。
“自杀性”DNA疫苗(Suicidal DNA vaccine)是近几年提出的一种新的疫苗设计，是在常规DNA疫苗和“自主复制型”RNA疫苗(Self-replicating RNAvaccine)基础上发展起来的，不仅具有“自主复制型”RNA疫苗的安全性与有效性，而且结合了常规DNA疫苗易制备、运输、保存等方面的优点，堪称近年来基因疫苗发展的重大突破。目前，这种新型疫苗的研究尚处于研究早期，但已有报道用这种方法构建的流感病毒、人单纯疱疹病毒的“自杀性”DNA疫苗免疫实验动物小白鼠后可诱导高于常规DNA疫苗的体液免疫与细胞免疫，并且较常规DNA疫苗地免疫剂量低100~1000倍，展示了“自杀性”DNA疫苗巨大的开发潜力与良好的应用前景。
猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV，下文简称PRRSV)ORF5基因编码的糖蛋白GP5是PRRSV中最主要的保护性抗原，可诱导体液免疫和细胞免疫，而且目前确定的最主要的中和表位也位于其N端胞外区，因此是设计PRRS新型疫苗的首选目标基因(Dea S，Gagnon CA，Mardassi H.Current knowledge on the structural proteins of porcinereproductive and respiratory syndrome(PRRS)virus：compari son of the North American andEuropean isolates.Arch Virol，2000a，145：659-688)。
                                    发明内容
本发明的一个目的是得到一种能够防制猪繁殖与呼吸综合征的“自杀性”DNA疫苗。
本发明的另一个目的是提供一种“自杀性”DNA疫苗表达载体pSCA，该载体不仅适合制备猪繁殖与呼吸综合征的“自杀性”DNA疫苗的应用，而且有可能应用于其他类似疫苗上。
本发明的另一个目的是提供一种猪繁殖与呼吸综合征的“自杀性”DNA疫苗在防制猪繁殖与呼吸综合征中的应用。
本发明通过以下技术方案实施：
一种猪繁殖与呼吸综合征的“自杀性”DNA疫苗，是将猪繁殖与呼吸综合征病毒主要免疫原性基因ORF5插入“自杀性”DNA疫苗表达载体pSCA的BamHI位点构建而成，含有该质粒的大肠杆菌Escherichiacoli DH5 α/pSCA-ORF5，保藏在CCTCC，保藏号为M203073。
所述的“自杀性”DNA疫苗的表达载体pSCA，其特征是在西门利克森林病毒复制子质粒型表达载体pSFV1的非结构蛋白基因上游引入人巨细胞病毒的立即早期启动子序列，在其多克隆位点下游引入SV40poly(A)序列。
本发明还包括上述一种猪繁殖与呼吸综合征的“自杀性”DNA疫苗在防制猪繁殖与呼吸综合征中的应用。
本发明的具体技术方案如下列技术步骤所述：
一、pSFV1载体的改造
1、引物的设计：
根据pCI-neo(Promega)的全序列(见Promega公司pCI-neo《真核表达载体操作手册》)合成能扩增SV40晚期poly(A)转录终止信号序列的引物P1和P2，上下游引物分别设计SpeI和XbaI位点，扩增大小为250bp；同时设计一对扩增HCMV IE Enhancer/Promoter元件的引物P3和P4，上下游引物两端均设计SphI位点，扩增大小为823bp。引物序列为：
P1：5’-CAAACTAGTCAAACATGATAAGATAC-3’；
P2：5’-GGCTCTAGATACCACATTTGTAGAGGT-3’
P3：5’-ACATGCATGCTCAATATTGGCCATTAGC-3’
P4：5’-ACATGCATGCCTGACTGCGTTAGCAATT-3’
2、PCR扩增
以pCI-neo为模板，P1、P2为引物扩增SV40 poly(A)序列。扩增条件为95℃变性5min后进入循环，循环参数为95℃ 1min、55℃ 1min、72℃ 1.5min，35个循环后72℃延伸10min。反应结束后于1.0％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测。
以P3、P4为引物，pCI-neo为模板扩增HCMV IE Enhancer/Promoter片段。扩增条件为95℃变性5min后进入循环，循环参数为95℃ 1min、55℃ 1min、72℃ 1.5min，35个循环后72℃延伸10min。反应结束后于1.0％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测。
3、pSFV1载体的改造
将扩增的SV40 poly(A)片段纯化后用SpeI和XbaI酶切，回收目的片段，插入经SpeI酶切并去磷酸化的载体pSFV1中，重组质粒经酶切和PCR鉴定，命名为pSFVA。然后将HCMV IE Enhancer/Promoter片段的扩增产物纯化后用SphI酶切，插入pSFVA的SphI位点，重组质粒也经酶切和PCR鉴定，命名为pSCA，该载体是用于猪繁殖与呼吸综合征的“自杀性”DNA疫苗的构建上，依照本发明的思路，申请人认为该载体有可能应用于类似的疫苗的构建上。
二、PRRSV ORF5基因“自杀性”DNA疫苗表达质粒的构建
设计一对可扩增ORF5完整编码区的引物P52S和P52R(同P51R)，上下游引物两端分别设计了BamHI和XbaI位点。引物序列如下：
P52S 5’-GAAGGATCCTCAGTATGTTGGGGAAATGCTTGACC-3’
P52R 5’-TTTTCTAGAGACGACCCCATTGTTCCGC-3’
以pMD-ORF5为模板，进行PCR扩增，扩增大小为607bp。PCR反应条件为：94℃ 5min；进入PCR循环，94℃ 1min，55℃ 1min，72℃1 min，35个循环后，72℃延伸10min。反应结束后，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。纯化回收目的片段，克隆到载体pMD18-T中，选择两端均含BamHI位点的质粒，命名为pMD-ORF5-1，测序分析，证实无碱基误配。
BamHI酶切质粒pMD-ORF5-1，回收目的片段，插入pSCA的相应位点，获得的阳性重组质粒命名为pSCA-ORF5。
三、质粒pSCA-ORF5的大量制备
(1)挑取含有质粒pSCA-ORF5的菌落接种于75mL LB培养液，37℃ 300r/min培养过夜，6000r/min5min，收集细胞沉淀，用3mL溶液I(50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-Cl(pH8.0)，高压灭菌后置4℃保存备用)悬浮(吹散或涡旋)。
(2)加6mL溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS，现配现用)，冰浴7-10min。
(3)加4.5mL溶液III(3mol/L乙酸钾，冰醋酸调pH值至4.8)，冰浴7-10min。4℃ 10000r/min10-15min。
(4)取上清，加0.6倍体积的异丙醇，混匀，-20℃ 30min或室温5min。室温，10000r/min 6-15min。
(5)弃上清，用75％乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加1.5mL TE(10.0mmol/L Tris-HCl，1.0mmol/L EDTA)悬浮(洗壁20min左右)。
(6)加1.5ml即1倍体积冰预冷的5mol/L NH₄Ac，混匀。4℃ 10000r/min 10min。
(7)将上清转移至7mL的离心管，加1倍体积(3mL)的异丙醇混匀，-20℃作用30min。12000r/m 15min。
(8)弃上清，用75％乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加500μL TE悬浮(洗壁20 min左右)，并转移至1.5mL的离心管。
(9)加入适量的RNase，37℃ 1h，去RNA。
(10)加1倍体积的13％的PEG8000(含1.6mol/L NaCl)，混匀，-20℃ 30min(可以过夜)。离心，弃上清，用400μL TE重溶。
(11)加等体积酚∶仿∶异戊醇抽提2次，氯仿∶异戊醇抽提1次。
(12)加100μl 10mol/L NH₄Ac，充分混匀后，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min。4℃12000r/min离心5-10min。
(13)弃上清，用75％乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加50μL TE或H₂O重溶，置-20℃备用。
四、用于对比试验的常规DNA疫苗表达质粒pCI-ORF5的构建
设计一对可扩增ORF5完整编码区的引物P51S和P51R，上下游引物两端分别设计了XhoI和XbaI位点。引物序列如下：
P51S 5’-GAACTCGAGAGTATGTTGGGGAAATGCTTGACC-3’
P51R 5’-TTTTCTAGAGACGACCCCATTGTTCCGC-3’
以pMD-ORF5为模板(方六荣等，猪繁殖与呼吸综合症病毒YA株ORF5基因的克隆与序列分析，华中农业大学学报，2002，21(6)：501-505)，进行PCR扩增，扩增大小为619bp。PCR反应条件为：94℃ 5min；进入PCR循环，94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，35个循环后，72℃延伸10min。反应结束后，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。纯化回收目的片段，纯化的扩增产物经XhoI、XbaI酶切后，直接克隆到真核表达载体pCI-neo(Promega)的相应位点，获得的重组质粒pCI-ORF5经XhoI、XbaI和XhoI+XbaI酶切与PCR鉴定证实构建正确，测序证实无碱基误配。
五、“自杀性”DNA疫苗与用于比较的常规DNA疫苗的生产工艺
疫苗生产工艺的主要流程：质粒的转化、质粒的大量提取、质粒浓度的测定与稀释。
1、质粒的转化
将“自杀性”DNA疫苗表达质粒pSCA-ORF5(氨苄抗性)和常规DNA疫苗表达质粒pCI-ORF5(氨苄抗性)分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。具体操作是：1)取100μl感受态细胞悬液转移到无菌的1.5ml EP管中，加入10μl连接产物，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min。2)将离心管放到预先加温到42℃的循环水浴中热冲击90秒。3)快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2min。4)每管加400μl LB培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将离心管转移到37℃摇床上，温育45min，使细菌复苏。为达到有效转化，复苏时转速不宜超过225转/分。5)取100μl转化的感受态细胞转移到含相应抗生素的LB琼脂平皿上，用一无菌弯头玻棒将转化的细胞均匀地涂布到琼脂平板表面。6)将平皿置37℃培养，直至液体被吸收，然后倒置平皿培养，12~16h可出现菌落。
2、质粒的大量提取同上述“三、质粒pSCA-ORF5的大量制备”的方法(本处省略该详细制备步骤)。
3、质粒浓度的测定、稀释
利用分光光度计测定大提质粒的浓度，用磷酸盐缓冲液(PBS pH7.4)将其稀释到1μg/μl或0.2μg/μl，即可用于动物注射。
六、疫苗的免疫效力检验
1、对Balb/c小白鼠的免疫效力试验
将“自杀性”DNA疫苗pSCA-ORF5和常规DNA疫苗pCI-ORF5经后腿肌肉注射6周龄的Balb/c小鼠，每组6只，每只小鼠100μl(含100μg质粒)，共免疫两次，间隔4周；同时用空白质粒载体pCI-neo、pSCA作为核酸免疫的阴性对照。每次免疫后4周经尾静脉负压采血，分离血清，检测ELISA抗体。二免后4周眼球放血，分离血清，检测ELISA抗体和中和抗体。结果“自杀性”DNA疫苗pSCA-ORF5诱导的ELISA抗体和中和抗体均明显高于常规DNA疫苗pCI-ORF5。
2、疫苗对断奶仔猪的免疫效力试验
将“自杀性”DNA疫苗pSCA-ORF5、常规DNA疫苗pCI-ORF5经颈部肌肉注射断奶仔猪，每组4头，每头猪500μl(含100μg质粒)，共免疫两次，间隔4周；同时用空白质粒载体pCI-neo、pSCA作为核酸免疫的阴性对照。每次免疫后4周经前腔静脉采血，分离血清，检测ELISA抗体和中和抗体水平，同时采集抗凝血，分离淋巴细胞检测细胞免疫应答水平。结果“自杀性”DNA疫苗pSCA-ORF5诱导的体液免疫与细胞免疫反应均明显高于常规DNA疫苗pCI-ORF5。
                                    附图说明
本发明的生物材料样品即菌株DH5α/pSCA-ORF5于2003年10月22日保藏，保藏编号是：CCTCCNO：M203073，分类命名为大肠杆菌(Escherichia coli)，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，位于湖北省武汉市武汉大学内。
图1显示了PRRSV YA株ORF5基因常规DNA疫苗pCI-ORF5的构建流程图
图2显示了“自杀性”DNA疫苗表达载体pSCA的构建流程图
图3显示了PRRSV YA株ORF5基因“自杀性”DNA疫苗pSCA-ORF5的构建流程图
图4显示了“自杀性”DNA疫苗pSCA-ORF5和常规DNA疫苗pCI-ORF5免疫Balb/c小鼠后的ELISA抗体水平
图5显示了“自杀性”DNA疫苗pSCA-ORF5和常规DNA疫苗pCI-ORF5免疫断奶仔猪后的ELISA抗体水平
图6显示了“自杀性”DNA疫苗pSCA-ORF5和常规DNA疫苗pCI-ORF5免疫断奶仔猪后诱导的细胞免疫反应水平
                                具体实施方式
以下结合说明书附图对本发明作进一步的说明：
1、常规DNA疫苗表达质粒pCI-ORF5的构建
以pMD-ORF5为模板，P52S和P52R为引物扩增ORF5基因，纯化的扩增产物经XhoI、XbaI酶切后，直接克隆到真核表达载体pCI-neo的相应位点，获得重组质粒pCI-ORF5。其构建流程见图1。
2、“自杀性”DNA疫苗表达载体pSCA的构建
以pCI-neo为模板，P1、P2为引物扩增SV40 poly(A)序列，纯化后用SpeI和XbaI酶切，回收大小约250bp的片段，将其插入载体pSFV1的SpeI位点，获得重组质粒pSFVA。然后再以pCI-neo为模板，P3、P4为引物扩增HCMV IE Enhancer/Promoter片段，扩增产物纯化后用SphI酶切，回收大小约823bp的片段，将其插入pSFVA的SphI位点，获得重组质粒pSCA。其构建流程见图2。
3、“自杀性”DNA疫苗pSCA-ORF5的构建
BamHI酶切质粒pMD-ORF51，回收目的片段，插入pSCA的BamHI位点，获得的阳性重组质粒命名为pSCA-ORF5。其构建流程见图3。
4、“自杀性”DNA疫苗pSCA-ORF5对Balb/c小白鼠免疫效力的测定
(1)Balb/c小鼠的免疫程序
Balb/c小鼠分为4组，每组6只，采用后腿肌肉注射，每只小鼠100μl(含100μg质粒)，共免疫两次，间隔4周，同时用空白质粒载体pCI-neo、pSCA作为核酸免疫的阴性对照。每次免疫后4周经尾静脉负压采血，分离血清，检测ELISA抗体。二免后4周眼球放血，分离血清，检测ELISA抗体和中和抗体。
(2)ELISA抗体检测
利用建立的GP5-ELISA方法检测血清针对PRRSV的ELISA抗体，结果如图4。
(3)中和抗体检测
根据国际兽医局(OIE)推荐的标准，检测抗血清的PRRSV中和抗体水平，试验结果如表1：
                   表1  Balb/c小鼠二免后第4周的中和抗体水平
组别                                  首免后8周(二免后4周)
               免疫前
(6只/组)                      ＜1∶4          ≥1∶4           ≥1∶8          ≥1∶16
pCI-neo        ND             6/6             0/6              0/6             0/6
pSCA           ND             6/6             0/6              0/6             0/6
pCI-ORF5       ND             2/6             4/6              1/6             0/6
pSCA-ORF5      ND             0/6             6/6              3/6             1/6
注：ND表示未做
5、“自杀性”DNA疫苗pSCA-ORF5对断奶仔猪免疫效力的测定
(1)猪的免疫程序
断奶仔猪随机分成5组，每组4头，采用颈部肌肉注射，每头猪500μL(含100μg质粒)，共免疫两次，间隔4周，同时用空白质粒载体pCI-neo、pSCA作为核酸免疫的阴性对照。每次免疫后4周经前腔静脉采血，分离血清，检测中和抗体水平，同时采集抗凝血，分离淋巴细胞检测细胞免疫应答水平。
(2)中和抗体检测
根据国际兽医局(OIE)推荐的标准，检测抗血清的猪繁殖与呼吸综合征病毒中和抗体水平，试验结果如表2：
       表2  断奶仔猪免疫后的第4周、第8周的中和抗体水平
组别(4头                   首免后4周              首免后8周
              免疫前
猪/组)                     ≥1∶4       ≥1∶8       ≥1∶4          ≥1∶8       ≥1∶16
pCI-neo       -            0/4          0/4          0/4             0/4          0/4
pSCA          -            0/4          0/4          0/4             0/4          0/4
pCI-ORF5      -            0/4          0/4          1/4             0/4          0/4
pSCA-ORF5     -            1/4          0/4          4/4             2/4          0/4
注：—表示中和抗体阴性
(3)ELISA抗体检测
利用建立的GP5-ELISA方法检测抗血清的PRRSV ELISA抗体，结果如图5。
(4)细胞免疫水平检测
抗原特异性细胞毒性T细胞活性(CTL)的诱导及测定。试验结果如图6。