二环CB2大麻碱受体配体 【发明领域】
本发明涉及作为外周大麻碱(cannabinoid)受体CB2配体的(+)α-蒎烯衍生物及其药物组合物，可用于预防和治疗自身免疫性疾病以及相关的紊乱、炎症、疼痛、肌肉痉挛、心血管紊乱、神经系统紊乱、神经退行性疾病、CNS中毒以及某些种类的癌症。
【发明背景】
长期以来大麻制剂已经被认为是治疗多种疾病的治疗剂(Mechoulam，R.“作为治疗剂的大麻碱(Cannabinoids as TherapeuticAgents)”CRC Press，Boca Raton，Fla.，1-19，1986)。现今，天然的活性组分Δ9-四氢大麻碱(Δ9-THC)以通用名Dronabinol由医生开处方作为抗催吐剂并增强食欲，主要用于爱滋病人。然而，直到最近才实现临床上不希望的影响精神的效果和治疗上所希望的效果，诸如血管血压过低和免疫调节之间的区别。两种大麻碱受体CB1和CB2的发现已经帮助阐明了大麻碱不同的效果。
受体显示出具有七个偶联的跨膜结构G-蛋白，它们共有44％的氨基酸序列同源性，但是在组织特异性方面不同(Munro，S.，Thomas，K.L.& Abu-Shaar，M.，Nature 365：61-5，1993)。这两种受体都通过对百日咳毒素-敏感的GTP-结合蛋白负调节腺苷酰基环化酶地活性来发挥它们的作用。在某些细胞类型中它们还表现出激活有丝分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)(Parolaro，D.，Life Sci.65：637-44，1999)。
CB1受体主要表达在CNS中，并且在其它组织中表达水平较低。主要在与大麻碱对行为的作用相关的大脑区域，诸如海马、扁桃体、脑皮层、基底神经节以及小脑中发现CB1受体的存在。此外，发现高浓度的CB1受体存在于调节伤害感受过程的区域中。CB2受体大多数表达在与免疫功能相关的外周组织中，包括巨噬细胞、B和T细胞以及外周神经末梢中以及肥大细胞上(Pertwee，R.G.，Prog.Neurobiol.63：569-611，2001)。虽然已经充分地研究了由主要存在于CNS中的CB1介导的作用，但是由CB2介导的作用目前仍然在解释中。
利用放射性标记的THC类似物，诸如[3H]CP-55940确定受体的神经解剖学分布(Elphick，M.R.& Egertova，M.，Phil.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.356：381-408，2001)。人们发现最高浓度的大麻碱结合位点，特异性CB1受体存在于在参与运动的脑区域：基底神经节和小脑中。受体的一个亚群表达在脊神经后根神经节的外周末梢。有人认为大麻碱的止痛作用在解剖学上比它们的运动作用更明显的位置处介导。其它技术包含免疫组织化学、利用特异性转录本的原位杂交分析(Galiegue，S.等人，Eur.J.Biochem.232：54-61，1995)以及基因敲除小鼠(Buckley，N.E.等，Eur.J.Pharmacol.396：141-9，2000)已被用来帮助对受体表达图谱与功能的理解。CB2受体不在大脑中表达，但是在免疫组织中尤为丰富，比CB1的表达水平高10-100倍。在脾脏和扁桃体中，CB2 mRNA的含量相当于中枢神经系统中CB1 mRNA的含量。在主要的人类血细胞亚群中，CB2 mRNA的分布图显示重要的变化，即在B细胞中比在自然杀伤细胞或者单核细胞中水平更高以及在多形核嗜中性细胞、T8细胞和T4细胞中水平较低。
CB1基因敲除小鼠在行为分析中已经显示对大麻碱无反应，从而提供了通过活化主要存在于CNS中的CB1受体来清楚解释包含镇静、幻觉以及精神错乱和抗伤害感受的影响精神作用的分子证据。对CB2基因敲除小鼠的分析证实了CB2受体在调节免疫系统中发挥功能的事实。对来自CB2基因敲除小鼠的脾、淋巴结和胸腺的细胞的FACS分析确定了CB2不影响免疫细胞的发育和分化，但是介导Δ9-THC的抑制作用。
由于CB2受体在免疫细胞和神经元的亚群中的限制性表达，所以选择性CB2配体具有治疗学价值(Pertwee，R.G.Curr.Med.Chem.6：635-64，1999)。特别重要的是那些对CB2受体具有高亲合性和高特异性的化合物。这些化合物可以赋予CB2激动剂(agonism)的优点同时避免了在对CB1受体具有亲合性的化合物中发现的不良副作用。这种化合物可以有效治疗自身免疫疾病，包括但不限于多发性硬化、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、重症肌无力、I型糖尿病、肝炎、炎性肠病或者过敏性肠综合征、牛皮癣的自身免疫性疾病及其他免疫相关的紊乱，包括但不限于器官移植中的组织排斥、吸收不良综合征诸如脂泻病、肺疾病诸如哮喘和Sjgren氏综合症。
大麻碱受体的发现以及最近对能够激活CB受体的内源性配体内源性大麻碱(endocannabinoid)的鉴定已经使我们理解了由大麻碱和相关化合物赋予的许多作用。除某些大麻碱激动剂有总的神经保护作用外，还可以发现更具体的应用。因此，除了通过对由免疫细胞表达的CB2受体的作用进行免疫调节而可能缓和疾病以外，例如由内源性大麻碱系统提供的对痉挛紧张性控制的证据暗示大麻碱激动剂可以辅助对肌肉痉挛以及多发性硬化中震颤的治疗(Baker D.等人，FASEB J.15：300-2，2001)。大麻碱激动剂也被证明有助于治疗癌症以及HIV/AIDS患者的肌肉痉挛(Hall W.D.，Degenhardt L.J.& Currow D.Med.J.Aust.175：39-40，2001)以及神经性肌肉失调。
CB1受体的活化除了镇静以及不希望的影响精神的作用以外，在治疗疼痛以及炎症的治疗中具有治疗效果。大麻碱不仅通过对伤害应答的神经元的作用抑制急性疼痛而且还调节持续的疼痛以及炎症诱导的行为超敏反应。除了大麻碱的主要作用外，它们也抑制损伤部位的疼痛，并且有趣的是大麻碱在周围神经中的抗炎以及抗痛觉过敏作用也可以涉及CB2受体介导的活性。选择性激活CB2受体的化合物有可能作为免疫调节剂并且为自身免疫性疾病以及相关紊乱提供治疗方法。另外，已经证明选择性CB2受体激动剂可用于治疗炎症和疼痛，心肌缺血以及某些类型的癌症。THC，以及迄今为止鉴定的两种主要的内源配体，花生四烯酰乙醇酰胺(arachidonoylethanolamide)(anandamide或者AEA)(Devane，W.A.等人，Science 258：1946-9，1992)以及2-花生四烯酰甘油(arachidonylglycerol)(2-AG)(Sugiura，T.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.215：89-97，1995)通过结合到这两种大麻碱受体发挥它们大部分的作用。
几个合成的化合物已经显示出对CB2受体的结合比对CB1受体具有更高的亲合性(Pertwee，R.G.，Expert Opin.Investig.Drugs 9：1553-71，2000)。大麻碱受体激动剂包括四个主要的化合物组。典型的大麻碱保持了THC的二苯并吡喃环系，而非典型的大麻碱包括缺乏吡喃环的二环或者三环类似物。氨基烷基吲哚以及类似物组成第三族，而包含anandamide及其它脂肪酸衍生物的内源性大麻碱组成第四族。例如，L-759656是典型的大麻碱类似物，而HU-308是二环类似物。两者都具有300-400的CB2/CB1结合亲合性比值，并且两者都已经在功能分析中表现出有效和特异的CB2激动剂(Hanus，L.等，Proc Natl.Acad.Sci.USA 96：14228-33，1999；Ross，R.A.等，Br.J.Pharmacol.126：665-72，1999)。
将CB2受体的活化与治疗学特性联系起来的证据是多方面的。大麻碱特异性地通过活化CB2参与心脏保护，抗缺血以及包含心律不齐的再灌注作用最近在PCT专利申请WO 01/28588中以及被Krylatov等人(Krylatov A.V.等，Bull.Exp.Biol.Med.131：523-5，2001)描述，其公开内容在此处引入作为参考。大麻碱由于能够诱导各种类型的肿瘤，包含动物模型的肺腺癌，神经胶质瘤，甲状腺上皮瘤以及皮肤非黑色素瘤的退化，可能是潜在的抗肿瘤剂。某些肿瘤，特别是神经胶质瘤表达CB2受体。Guzman等人(Galve-Roperh，I.等人，Nat.Med.6：313-9，2000；Guzman，M.，Sanchez，C.，Galve-Roperh，I.，J.Mol.Med.78：613-25，2001)已经证实THC以及WIN55212-2诱导动物体内恶性脑肿瘤的退化或者根除，前者THC是天然的配体，而后者WIN55212-2为合成的大麻碱。大鼠神经胶质瘤C6细胞系表达CB2并且根据用选择性CB拮抗剂的研究，已经有人认为任何一种受体的活化都可以引起细胞程序性死亡。
内源性大麻碱系统在免疫抑制中的作用是许多研究的焦点(Berdyshev，E.V.Chem.Phys.Lipids 108：169-90，2000)。Anandamide(AEA)，棕榈酰乙醇酰胺(PEA)以及2-AG显示出下调多种实验系统中的免疫应答并且用作抗炎药和免疫抑制剂。
THC因其止痛特性而众所周知。两种主要的内源性配体，AEA和2-AG已经显示出起止痛剂的作用，并且可以通过结合到两种大麻碱受体而发挥它们的作用(Calignano，A.等，Nature 394：277-81，1998)。因此CB2受体或者假定的CB2样受体的激动剂可用作外周、内脏、神经性、炎症以及关联痛的抑制剂。此外，CB2受体配体可以是防止CNS中毒。
美国专利4,208,351公开了在制备典型的三环大麻碱立体结构选择性过程中作为中间体的任选的旋光活性二环化合物。然而，没有将治疗活性归因于中间体，也没有提到这种化合物结合大麻碱受体的能力，因此就没有预想到包括这种化合物的药物组合物。
美国专利4,282,248公开了蒎烯衍生物的两种同分异构体的混合物以及单独的异构体。包含止痛、中枢神经系统抑制、镇静以及镇定活性的治疗活性归因于所述化合物，但是该公开内容没有教导所述化合物会结合任何大麻碱受体。
美国专利5,434,295公开了一族新的4-苯基蒎烯衍生物，并且教导如何将所述化合物利用在用于治疗与中枢神经系统损害相关的各种病理学症状的药物组合物中。这个公开内容既没有教导也没有暗示任何这些衍生物对于外周大麻碱受体是选择性的。国际专利申请WO01/32169公开了一族二环化合物，包含作为CB2特异性激动剂的HU-308，并且举例说明了它们在治疗疼痛和炎症、自身免疫性疾病、胃肠机能紊乱以及作为降血压剂中的应用。
美国专利6,013,648公开了作为CB2特异性激动剂并且可能用于制备免疫调节药物的吲哚衍生物。国际性专利申请WO 01/28497公开了对CB2受体显示出高亲合性的新的二环大麻碱类似物。对专业技术人员而言，显而易见的是当参考在本申请中采用的命名法时，上述专利中的化合物为立体化学取向，其中C-1、C-4和C-5为R。然而，还没有合成相应的(+)α-蒎烯衍生物，并且它们的治疗活性是未知的。
很清楚本发明明确地排除了已知的化合物，包括那些公开在美国专利4,208,351，4,282,248和5,434,295和国际专利申请WO 01/32169中的化合物；虽然这些化合物的某些新特性同样要求了保护的权利。
发明概述
本发明的一个目的是提供新的α-蒎烯衍生物及其组合物。尤其是，优选的化合物显示对外周大麻碱受体CB2的特异性结合亲合性，因此本发明提供了包括特异性治疗用CB2结合配体的治疗方法。这个方法涉及适当配制的药物组合物的应用。本发明的另一目的是提供能够体内发挥它们的CB2受体-特异性作用的CB2结合配体。本发明进一步提供了通过给需要的个体施用包含作为活性成分的治疗有效量的CB2特异性配体的药物组合物以预防和治疗疾病的方法。
根据本发明的第一个实施方案，我们公开了下列通式(I)的化合物及其药用盐、酯或者溶剂化物：
式I
式I具有特异性立体化学结构，其中C-5为S，在C-1和C-5位置的质子彼此之间为顺式，而在C-4和C-5位置的质子为反式；并且其中：
R1选自
(a)O或者S，
(b)(R′)2，其中每次出现的R′独立地选自氢、氰基、-OR″、-N(R″)2，饱和或者不饱和、直链、支链或者环状的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″或者C1-C6烷基-N(R″)2，其中每次出现的R″独立地选自氢、C(O)R、C(O)N(R)2、C(S)R、饱和或者不饱和、直链、支链或者环状的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR以及C1-C6烷基-N(R)2，其中每次出现的R独立地选自氢或者饱和或者不饱和、直链、支链或者环状的C1-C12烷基，并且
(c)NR″或者N-OR″，其中R″如前所定义；
R2和R3各自独立地选自：
(a)卤素，
(b)-R″、-OR″、-N(R″)2、-SR″、-S(O)(O)NR″，其中每次出现的R″如前所定义，
(c)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb选自氢、饱和或者不饱和、直链、支链或者环状C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″以及C1-C6烷基-N(R″)2，R″如前所定义，以及
(d)由-C(O)OH、-S(O)(O)ORe或者-P(O)(ORe)2作为末端的-OC(O)OH、-OS(O)(O)ORe、-OP(O)(ORe)2、-ORd或-OC(O)-Rd链，其中Rd为饱和或者不饱和、直链、支链或者环状的C1-C6烷基，以及每次出现的Re选自氢和如前所定义的Rd；和
R4选自：
(a)R，其中R选自氢、卤素、OR、OC(O)R、C(O)OR、C(O)R、OC(O)OR、CN、NO2、N(R)2、NC(O)R、NC(O)OR、C(O)N(R)2、NC(O)N(R)2、SR、以及C(S)R，其中每次出现的R如前所定义，
(b)饱和或者不饱、直链、支链或者环状的C1-C12烷基-R，其中R如前所定义，
(c)芳香环，其可在任一位置由R进一步取代，其中R如前所定义，以及
(d)饱和或者不饱和、直链、支链或者环状的C1-C12烷基，任选地以芳香环作为末端，所述芳香环可以如(c)所定义被进一步取代；附带条件是当R1为O并且R2和R3为OH时，那么R4不是直链或者支链的C5-C10烷基、C5-C10烯基、C5-C8环烷基以及C5-C8环烯基。
根据目前优选的实施方案，我们现在公开通式(I)的化合物，其中R1为O、CH2或者N-OH，R2和R3各自独立地为H、OH、OCH3、琥珀酸酯、延胡索酸酯或者二乙基磷酸酯，并且R4为1，1-二甲基-戊基、1，1-二甲基庚基、1，1-二甲基-戊-4-烯基、1，1-二甲基-庚-6-炔基，1，1-二甲基-3-苯基-丙基，1，1-二甲基-5-溴代-戊基，1，1-二甲基-5-氰基-戊基，1，1，3-三甲基-丁基，1-甲基-1-对氯苯基-乙基或者1-乙基-1-甲基-丙基，附带条件如对式(I)的定义。
据本发明的另一实施方案，我们公开下列通式(II)的化合物及其药用盐、酯或溶剂化物：
式II
式II具有特异性立体化学结构，其中C-5为S，在C-1和C-5位置的质子彼此之间为顺式，而在C-4和C-5位置的质子为反式，并且C-2------C-3为任选的双键；并且其中：
R5选自：
(a)卤素或者氢，
(b)-OR″、-N(R″)2、-SR″、-S(O)(O)NR″，其中每次出现的R″独立地选自氢、C(O)R、C(O)N(R)2、C(S)R、饱和或者不饱和、直链、支链或者环状的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR以及C1-C6烷基-N(R)2，其中每次出现的R独立地选自氢或饱和或者不饱和、直链、支链或者环状的C1-C12烷基，
(c)饱和或者不饱和、直链、支链或者环状的C1-C6烷基-SR″或者C1-C6烷基-S(O)(O)NR″，其中R″如前所述，
(d)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb选自氢、饱和或者不饱和、直链、支链或者环状的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″以及C1-C6烷基-N(R″)2，其中每次出现的R″如前所定义，
(e)饱和或者不饱和、直链、支链或者环状的C1-C6烷基-S(O)Rb，C1-C6烷基-S(O)(O)Rb，C1-C6烷基-S(O)(O)ORb，其中Rb如前所定义，以及
(f)Rc，其中Rc选自饱和或者不饱和、直链、支链或者环状C1-C6烷基，C1-C6烷基-OR″，C1-C6烷基-N(R″)2，C1-C6烷基-C(O)OR″，以及C1-C6烷基-C(O)N(R″)2，其中每次出现的R″如前所定义；
R2和R3各自独立地选自
(a)卤素，
(b)-R″，-OR″，-N(R″)2，-SR″，-S(O)(O)NR″，其中每次出现的R″如前所述，
(c)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb选自氢、饱和或者不饱和、直链、支链或者环状的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″以及C1-C6烷基-N(R″)2，其中R″如前所定义，以及
(d)以-C(O)OH、-S(O)(O)ORe或者-P(O)(ORe)2作为末端的-OC(O)OH、-OS(O)(O)ORe、-OP(O)(ORe)2、-ORd或者-OC(ORd)-链，其中Rd为饱和或者不饱和、直链、支链或者环状C1-C6烷基，而且每次出现的Re选自氢和如前所定义的Rd；并且
R4选自：
(a)R，其中R选自氢、卤素、OR、OC(O)R、C(O)OR、C(O)R、OC(O)OR、CN、NO2、N(R)2、NC(O)R、NC(O)OR、C(O)N(R)2、NC(O)N(R)2，SR，和C(S)R，其中每次出现的R如前所定义；
(b)饱和或者不饱和、直链、支链或者环状C1-C12烷基-R，其中R如前所定义，
(c)芳香环，其可在任一位置由R进一步取代，其中R如前所定义，以及
(d)饱和或者不饱和、直链、支链或者环状的C1-C12烷基，任选地以芳香环作为末端，所述芳香环可以如(c)所定义进一步取代；附带条件是当R5为Rc时，那么R4不是直链或者支链的C1-C12烷基链，直链或者支链饱和的-O-C2-C9烷氧链，其任选末端碳由苯基取代，以及直链或者支链饱和的C1-C7烷基链，其以羟基或者直链或者支链饱和的O-C1-C5烷氧链作为末端。
根据目前优选的实施方案，我们现在公开通式(II)的化合物，其中R5为CH2OC(O)C(CH3)3、OH或者CH3，R2和R3各自独立地为OH、H或者二乙基磷酸酯，R4为CH2OC(O)(CH2)3CH3、1，1-二甲基-庚基、1，1-二甲基-乙基-苯基或者1，1-二甲基-庚-6-炔基，并且在C-2和C-3之间有一个任选的双键，附带条件如对式(II)的限定。
根据本发明的另一优选的实施方案，我们公开通式(I)的CB2结合化合物：
式I
式I具有特异性立体化学结构，其中C-5为S，在C-1和C-5位置的质子彼此之间为顺式，而在C-4和C-5位置的质子为反式；并且其中R1-R4取代基如上所定义。
根据本发明一可选择的优选实施方案，我们公开通式(II)的CB2结合化合物：
式II
式II具有特异性立体化学结构，其中C-5为S，在C-1和C-5位置的质子彼此之间为顺式，而在C-4和C-5位置的质子为反式，以及C-2------C-3为任选的双键；并且其中取代基R2-R5如对式(II)的限定以及其中所限定的附带条件。
本发明还包括含有作为活性成分的式(III)的化合物或其药用盐、酯或溶剂化物的药物组合物：
式(III)
式III具有特异性立体化学结构，其中C-5为S，在C-1和C-5位置的质子彼此之间为顺式，而在C-4和C-5位置的质子为反式；并且其中：
R1选自
(a)O或者S，
(b)C(R′)2，其中每次出现的R′独立地选自氢、氰基、-OR″、-N(R″)2，饱和或者不饱和、直链、支链或者环状的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″或者C1-C6烷基-N(R″)2，其中每次出现的R″独立地选自氢、C(O)R、C(O)N(R)2、C(S)R、饱和或者不饱和、直链、支链或者环状的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR以及C1-C6烷基-N(R)2，其中每次出现的R独立地选自氢，或者饱和或者不饱和、直链、支链或者环状的C1-C12烷基，并且
(c)NR″或者N-OR″，其中R″如前所定义；
R2和R3各自独立地选自：
(a)卤素，
(b)-R″、-OR″、-N(R″)2、-SR″、-S(O)(O)NR″，其中每次出现的R″如前所定义，
(c)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb选自氢、饱和或者不饱和、直链、支链或者环状C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″以及C1-C6烷基-N(R″)2，R″如前所定义，以及
(d)以-C(O)OH、-S(O)(O)ORe或者-P(O)(ORe)2作为末端的-OC(O)OH、-OS(O)(O)ORe、-OP(O)(ORe)2、-ORd或者-OC(O)-Rd链，其中Rd为饱和或者不饱和、直链、支链的或者环状的C1-C6烷基，以及每次出现的Re选自氢和如前所定义的Rd；和
R4选自：
(a)R，其中R选自氢、卤素、OR、OC(O)R、C(O)OR、C(O)R、OC(O)OR、CN、NO2、N(R)2、NC(O)R、NC(O)OR、C(O)N(R)2、NC(O)N(R)2、SR、以及C(S)R，其中每次出现的R如前所定义，
(b)饱和或者不饱和、直链、支链或者环状的C1-C12烷基-R，其中R如前所定义，
(c)芳香环，其可在任一位置由R进一步取代，其中R如前所定义，以及
(d)饱和或者不饱和、直链、支链或者环状的C1-C12烷基，其任选地以芳香环作为末端，所述芳香环可以如(c)所定义进一步取代。
根据目前优选的实施方案，我们现在公开包含作为活性成分的通式(III)的化合物的药物组合物，其中R1为O、CH2或者N-OH，R2和R3各自独立地为H、OH、OCH3、琥珀酸酯、延胡索酸酯或者二乙基磷酸酯，并且R4为1，1-二甲基-戊基、1，1-二甲基庚基、1，1-二甲基-戊-4-烯基、1，1-二甲基-庚-6-炔基，1，1-二甲基-3-苯基-丙基，1，1-二甲基-5-溴-戊基，1，1-二甲基-5-氰基-戊基，1，1，3-三甲基-丁基，1-甲基-1-对氯苯基-乙基或者1-乙基-1-甲基-丙基。
本发明还包括含有作为活性成分的式(II)化合物或其药用盐、酯或溶剂化物的药物组合物：
式II
式II具有特异性立体化学结构其中C-5为S，在C-1和C-5位置的质子彼此之间为顺式，而在C-4和C-5位置的质子为反式，并且C-2------C-3为任选的双键；以及其中：
R5选自：
(a)卤素或者氢，
(b)-OR″、-N(R″)2、-SR″、-S(O)(O)NR″，其中每次出现的R″独立地选自氢、C(O)R、C(O)N(R)2、C(S)R、饱和或者不饱和、直链、支链或者环状的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR以及C1-C6烷基-N(R)2，其中每次出现的R独立地选自氢，或者饱和或者不饱和、直链、支链或者环状的C1-C12烷基，
(c)饱和或者不饱和、直链、支链或者环状C1-C6烷基-SR″或者C1-C6烷基-S(O)(O)NR″，其中R″如前所述，
(d)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb选自氢、饱和或者不饱和、直链、支链或者环状的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR”以及C1-C6烷基-N(R”)2，其中每次出现的R”如前所定义，
(e)饱和或者不饱和、直链、支链或者环状的C1-C6烷基-S(O)Rb，C1-C6烷基-S(O)(O)Rb，C1-C6烷基-S(O)(O)ORb，其中Rb如前所定义，以及
(f)-Rc，其中Rc选自饱和或者不饱和、直链、支链或者环状的C1-C6烷基，C1-C6烷基-OR″，C1-C6烷基-N(R″)2，C1-C6烷基-C(O)OR″，以及C1-C6烷基-C(O)N(R″)2，其中每次出现的R″如前所定义；
R2和R3各自独立地选自
(a)卤素，
(b)-R″，-OR″，-N(R″)2，-SR″，-S(O)(O)NR″，其中每次出现的R″如前所述，
(c)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb选自氢、饱和或者不饱和、直链、支链或者环状的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″以及C1-C6烷基-N(R″)2，其中R″如前所定义，以及
(d)以-C(O)OH、-S(O)(O)ORe或者-P(O)(ORe)2作为末端的-OC(O)OH、-OS(O)(O)ORe、-OP(O)(ORe)2、-ORd或者-OC(ORd)-链，
其中Rd为饱和或者不饱和、直链、支链或者环状C1-C6烷基，而且每次出现的Re选自氢和如前所定义的Rd；以及
R4选自
(a)R，其中R选自氢、卤素、OR、OC(O)R、C(O)OR、C(O)R、OC(O)OR、CN、NO2、N(R)2、NC(O)R、NC(O)OR、C(O)N(R)2、NC(O)N(R)2、SR，和C(S)R，其中每次出现的R如前所定义；
(b)饱和或者不饱和、直链、支链或者环状的C1-C12烷基-R，其中R如前所定义，
(c)芳香环，其可在任一位置由R进一步取代，其中R如前所定义，以及
(d)饱和或者不饱和、直链、支链或者环状的C1-C12烷基，其任选地以芳香环作为末端，所述芳香环可以如(c)所定义进一步取代；
附带条件是当R5为Rc时，那么R4不是直链或者支链的C1-C12烷基链，直链或者支链饱和的-O-C2-C9烷氧链，其任选末端碳由苯基取代，并且直链或者支链饱和的C1-C7烷基链，其以羟基或者直链或者支链饱和的O-C1-C5烷氧链作为末端。
根据目前优选的实施方案，我们现在公开包含作为活性成分的通式(II)的化合物的药物组合物，其中R5为CH2OC(O)C(CH3)3、OH或者CH3，R2和R3各自独立地为OH、H或者二乙基磷酸酯，R4为CH2OC(O)(CH2)3CH3，1，1-二甲基-庚基，1，1-二甲基-乙基-苯基或者1，1-二甲基-庚-6-炔基，并且在C-2和C-3之间具有任选的双键，附带条件如式(II)所定义。
除了传统活性成分以外，新的组合物可以包含生产生理学可接受和稳定制剂所必需的药用载体、稀释剂以及赋形剂。
药物组合物可以通过任一传统并且合适的路径进行给药，包括口服、胃肠外、静脉内、肌内、损伤内、皮下、透过皮肤、鞘内、直肠或者鼻内给药。
本发明的另一方面提供了通过刺激CB2受体治疗病人的方法，所述方法包括给所述病人施用包含治疗有效量的本发明通式(II)和(III)化合物的药物组合物。
因此，本发明提供了给需要治疗的个体施用治疗有效量的通式(II)和(III)化合物的方法，用于免疫调节和对CB2受体调节敏感的症状。所述症状包括但不限于：自身免疫疾病，包括类风湿性关节炎、多发性硬化、全身性红斑狼疮、重症肌无力、I型糖尿病、肝炎和牛皮癣；以及免疫相关疾病，包括但不限于器官移植中的组织排斥、吸收不良综合征诸如脂泻病、肺疾病诸如哮喘以及Sjgren氏综合症，包含炎性肠病的炎症，包含外周、内脏、神经性、炎性以及关联痛的疼痛，肌肉痉挛，、包含心律不齐、高血压和心肌缺血的心血管紊乱，包含中风、偏头痛和丛发性头痛的神经系统紊乱，包含帕金森氏症、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿氏舞蹈症、朊病毒相关神经退行性病变的神经退行性疾病，CNS中毒以及某些类型的癌症。
本发明包括通式(II)和III的化合物在制备用于治疗和预防自身免疫性疾病的药物中的应用，所述自身免疫性疾病包括但不限于如说明书中所示的风湿性关节炎、多发性硬化、全身性红斑狼疮、重症肌无力、I型糖尿病、肝炎、牛皮癣和免疫相关的紊乱，包括但不限于器官移植中的组织排斥、吸收不良综合征诸如脂泻病、肺疾病诸如哮喘以及Sjgren氏综合症，包含炎性肠病的炎症，包含外周、内脏、神经性、炎性以及关联痛的疼痛，肌肉痉挛，包含心律不齐、高血压和心肌缺血的心血管紊乱，包含中风、偏头痛和丛发性头痛的神经系统紊乱，包含帕金森氏症、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿氏舞蹈症、朊病毒相关神经退行性病变的神经退行性疾病，CNS中毒以及某些类型的癌症。
虽然本发明的化合物和组合物具体目的是用作外周大麻碱受体CB2的配体，但是不管是否通过CB2受体介导它们可能同时具有被称作“非典型大麻碱”类别的化合物的其它所希望的治疗特征。因此通式(I)到(III)的化合物和组合物除了它们的免疫调节活性以外还具有神经保护特性。
如下举例所示，现在我们已经发现已知的CB2特异性激动剂HU-308，其化学名全称为(+){4-[4-(1，1-二甲基庚基)-2，6-二甲氧基-苯基]-6，6-二甲基-二环[3.1.1]庚-2-烯-2-基}-甲醇，也以(+)4-[2，6-二甲氧基-4-(1，1-二甲基庚基)苯基]-6，6-二甲基-二环[3.1.1]庚-2-烯-2-甲醇公开在WO 01/32169中，其不仅在治疗外周疼痛而且在治疗神经性疼痛中有效。而且，现在我们已经发现HU-308在治疗和预防帕金森氏症中尤其有效。
【附图说明】
为了帮助理解本发明尤其是在实施例中给出的数据，给出下列附图：
图1显示选定的二环化合物结合到CB1和CB2人类大麻碱受体。
图2显示选定的二环化合物对活化的巨噬细胞分泌作用的影响。试验组A显示单剂量对IL-1β分泌作用的影响。试验组B显示各种剂量对PGE2分泌作用的影响。
图3显示了各种剂量的本发明化合物对激活的T细胞的IL-2分泌作用的影响。
图4显示了各种剂量的本发明化合物在多发性硬化的EAE模型中的作用。
图5显示了各种剂量的已知CB2激动剂HU-308以及本发明的化合物在过敏或者其它免疫反应的DTH模型中的作用。
图6显示了已知的CB2激动剂HU-308在帕金森氏症的MPTP模型中的作用。
图7显示了两种剂量的本发明化合物在慢性神经性疼痛的收缩神经损伤模型中的作用。
图8显示了各种剂量的本发明化合物在急性外周疼痛的Tail Flick模型中的作用。试验组A给出处理后30分钟获得的结果，试验组B是处理后90分钟获得的结果。
图9显示了与介质和吗啡相比，单剂量的本发明化合物在5.5小时的时间内在急性外周疼痛的Tail Flick模型中的作用。试验组A给出的结果是潜伏时间，而试验组B给出的结果是显示潜伏时间比介质处理的动物高两倍的处理组中动物的百分比。
图10显示本发明的化合物与吗啡相比对Tail Flick模型中测定的耐受性发展的影响。试验组A显示的结果是潜伏时间，而试验组B显示的结果以疼痛消失的动物的百分比表示。
发明详述
本发明提供了属于非典型大麻碱的新化合物，含有这些化合物的药物组合物以及使用这种化合物和组合物的方法。这种类型的化合物显示了对大麻碱受体的亲合性。本发明优选的新化合物显示了对外周人类大麻碱受体CB2的亲合性。本发明的组合物已经显示出具有免疫调节、抗炎、止痛、神经保护以及某些抗肿瘤的特性。一些化合物的作用可以引起参与免疫调节和炎症的基因的转录调节或者参与这种过程的信号转导组分的调节。
大麻碱被认为是主要通过受体介导的机制发挥它们的生理学作用，但是已经报道了非受体介导的活性(Felder C.C.等，Mol.Pharmacol.42：838-45，1992)。而且，发展的药理学证据显示除了迄今为止发现的CB1和CB2以外还存在其它种类的大麻碱受体(Howlett A.C.等人，Pharmacol.Review 54：161-202，2002)。因此，虽然本发明化合物最可能的作用机制是通过它们选择性结合到CB2受体并且与特异性信号转导途径功能性偶联得以实现，但是我们不能排除其它的机理，例如通过结合到其它尚未鉴定的大麻碱受体或者通过非受体介导的途径或者这些机制的组合。
在本发明的说明书中，术语“前体药物”表示在体内例如通过在血液中的水解迅速转化成式(I)到(III)的母体化合物的化合物。一些式(I)到(III)的化合物能够进一步形式药用盐和酯。“药用盐和酯”是指可以药用并且具有期望的药理学特性的任一盐和酯。这种盐包含可能来源于包含氨基酸的无机或者有机酸或者无机或者有机碱的盐，所述酸或碱在任何情况下都没有毒性或者符合要求。本发明同样在其范围内包含式(I)到(III)的化合物的溶剂化物及其盐，例如水合物。所有这些药物形式都将包含在本发明的范围内。
在本发明的说明书和权利要求中使用的“预防有效的”是用来限定化合物的量以实现预防、降低或者根除紊乱发生的风险同时避免不良副作用。术语“治疗有效”是用来限定所需的化合物的量，从而一旦紊乱不能进一步延缓以及病人不再无征状，将实现减轻、减少紊乱的发展或者治疗紊乱而同时没有副作用的目的。本发明的组合物为预防性的和治疗性的。
为了治疗目的的“个体”或者“病人”包含受到对所述治疗具有有效治疗效果的任一疾病感染的所有人类或者哺乳动物受试对象。
基于它们的抗炎和免疫调节特性，应该认识到本发明的组合物可用于治疗具有涉及它们的病源学或者发病机理的炎性或者自身免疫机制的症状，所述症状的例子为包含类风湿性关节炎、关节炎的关节炎，多发性硬化，全身性红斑狼疮(SLE)，重症肌无力，I型糖尿病，肝炎和牛皮癣，免疫相关的紊乱包含但不限于器官移植中的组织排斥，吸收不良综合征诸如脂泻病，肺疾病诸如哮喘和Sjgren氏综合症，炎性肠病以及风湿性疾病。
虽然本发明的化合物和组合物是指CB2配体，但是它们共有这类非典型大麻碱的其它特性，包含神经保护的特性(美国专利5,434,295)。由于它们的神经保护特性，应该认识到根据本发明的组合物将用于治疗包含但不限于中风、偏头痛和丛发性头痛的神经系统紊乱。本发明的组合物也可有效治疗某些慢性退行性疾病，所述退行性疾病的特征在于逐渐的选择性神经元丧失。在这一点上，预计本发明的组合物预计在治疗帕金森氏症、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿氏舞蹈病和朊病毒相关的神经退行性变中是治疗有效的。由CB2激动剂赋予的神经保护还可以有效预防和/或治疗神经毒剂，诸如神经毒气，以及其它由化学或者生物制剂引起的大脑或者神经组织的损害。
由于它们的止痛的特性，应该认识到本发明的组合物将用于治疗包含外周、内脏、神经性、炎性和关联痛的疼痛。本发明的组合物也可有效保护心脏预防心律不齐、高血压和心肌缺血。本发明的组合物也可有效治疗肌肉痉挛和颤动。
本发明的另一特征是公开的化合物能够预防或者治疗某些癌症，包含恶性脑肿瘤、皮肤肿瘤、肺腺癌、神经胶质瘤、甲状腺上皮瘤，其中CB2结合配体可以引发肿瘤细胞的细胞程序性死亡以及抑制肿瘤的血管生成。
而且，我们已经发现一些优选的CB2结合化合物也可通过调节参与免疫调节和炎症的基因的转录发挥作用。
此外，我们现在公开被发现有效治疗外周疼痛的已知的CB2特异性激动剂HU-308出乎意料地也可以有效治疗神经性疼痛，正如通过啮齿动物模型中坐骨神经的慢性收缩所评定的。
另外，同样发现HU-308显著降低了用神经毒素MPTP处理的小鼠黑质中产生的细胞死亡的程度。这就提示这种化合物在治疗帕金森氏症中可以证实特别有效。
显示出对CB2受体具有高亲合性和特异性的二环化合物已经由Makriyannis及合作者公开在国际专利申请WO 01/28497中。本领域技术人员会辨别出在此公开内容中公开的化合物与本发明的化合物具有相反的立体化学结构，因为如此公开物内容式I和II所示，四元环的二甲基位于萜烯环平面的下方而芳基位于这个平面的上方。根据本发明中采用的命名法，Makriyannis的化合物为立体化学取向，其中C-1、C-4和C-5为R。
通常，已经可以在功能上区分大麻碱和大麻碱相关化合物的R和S对映异构体。化合物HU-210和HU-211举例说明了这种情况。HU-210为合成的大麻碱7-羟基-Δ6-四氢大麻碱-1，1-二甲基-庚基的(-)(3R，4R)对映异构体。HU-211为此化合物的(+)(3S，4S)对映异构体。与HU-210相反，HU-211显示出对大麻碱受体较低的亲合性，因此不能治疗精神性疾病。另外，HU-211作为非竞争性的NMDA-受体激动剂和神经保护剂发挥作用，HU-210缺乏这两种特性(美国专利5,284,867)。
本发明的发明者意想不到地发现与公开在WO 01/28497中的化合物相反的立体化学对映异构体是有效的CB2受体配体。本发明的公开内容教导(+)α-蒎烯的新衍生物，如式(I)到(III)所示，其中C-5为S，在C-1和C-5位置的质子彼此之间为顺式，而在C-4和C-5位置的质子为反式。本发明的优选化合物与它们已知对映异构体相比不仅对CB2具有更高的亲合性和更好的选择性而且通过试验结果证实在体内更有效。关于这一点，应该注意到对公开在WO 01/28497中的对映异构体而言，发明者只测试了它们的结合活性而没有在体外和体内测试其它生物活性。
而且，本发明涉及这些新CB2配体在制备预防或者治疗自身免疫性疾病和相关紊乱、炎症、疼痛、肌肉痉挛、心血管紊乱、神经系统紊乱、神经退行性疾病、CNS中毒和某些类型的癌症的化合物中的应用。
在本发明中，我们将参考环状结构中下列位置的编码，其中位置1，4和5为手性中心。本发明公开的化合物的立体化学如式(IV)所示，其中C-5为S、C-1和C-5位置的质子彼此间为顺式，而在C-4和C-5位置的质子为反式：
式IV
本发明中，结合亲合性由IC50值表示，也就是测试化合物置换来自CB受体的50％放射性标记的激动剂的浓度。优选的化合物显示出对CB2结合的IC50值为50nM或者更低，优选地30nM或者更低，更优选地10nM或者更低，最优选地1nM或者更低。“CB2特异性或者选择性的”表示化合物具有的CB2/CB1结合亲合性比值至少10，优选地20，更优选地50并且最优选地100或者更高。优选地，可以获得人类CB1和CB2受体的这些比值。对CB2的选择性表示为CB2/CB1亲合性，通过如下方式进行计算：用测试化合物置换CB1特异性放射性配体获得的IC50值除以测试化合物置换CB2特异性放射性配体获得的IC50值，即IC50 CB1/IC50 CB2。一些本发明优选的化合物不必共有这两种特性，换句话说，一些化合物对CB2的IC50具有1nM或者更低但是比例仅仅为约30。
贯穿本说明书，本发明的某些化合物可能通过大写字母而不是通过它们完整的化学名称给出。烷基取代基可以为饱和或者不饱和、直链、支链或者环状，只有当烷基链中碳原子的数目大于或等于3时才是后者的情况。OC(O)R代表酯，OC(O)NR为氨基甲酸酯，OC(S)R为硫酯，NR2为胺，NRC(O)R为酰胺，NRC(O)NR为尿素，NRC(S)R为硫代酰胺，SR为硫醇或者硫化物，S(O)R为亚砜，SC(O)R为硫酯，SC(O)NR为硫代氨基甲酸酯，SC(S)R为二硫酯，S(O)(O)R为砜，S(O)(O)OR为磺酸酯，S(O)(O)NR为磺酰胺，S(O)(O)NC(O)R为酰基磺酰胺，S(O)(O)NC(O)NR为硫脲，当R为氢或者烷基链时S(O)(O)NC(S)R为硫代酰基磺酰胺。
本发明涉及通式(I)的化合物：
式I
式I具有特异性立体化学结构，其中C-5为S，在C-1和C-5位置的质子彼此之间为顺式，而在C-4和C-5位置的质子为反式；并且其中取代基R1-R4为式(I)所限定以及其中限定的附带条件。
根据目前优选的实施方案，我们现在公开通式(I)的化合物，其中R1为O、CH2或者N-OH，R2以及R3各自独立地为H、OH、OCH3、琥珀酸酯、延胡索酸酯或者二乙基磷酸酯，并且R4为1，1-二甲基-戊基、1，1-二甲基-庚基、1，1-二甲基-戊-4-烯基、1，1-二甲基-庚-6-炔基，1，1-二甲基-3-苯基-丙基，1，1-二甲基-5-溴代-戊基，1，1-二甲基-5-氰基-戊基，1，1，3-三甲基-丁基，1-甲基-1-对氯苯基-乙基或者1-乙基-1-甲基-丙基，附带条件如对式(I)的限定。
根据其它目前优选的实施方案，我们现在公开通式(I)的化合物，其中：R1是O，R2和R3为OCH3，而R4为1，1二甲基-庚基；R1为N-OH，R2和R3为OH，而R4为1，1-二甲基-庚基；R1为O，R2和R3为OH，而R4为1，1-二甲基-庚-6-炔基；R1为O，R2和R3为OH，R4为1，1-二甲基-3-苯基-丙基；R1为O，R2和R3为OH，而R4为1-甲基-1-对氯苯基-乙基；R1为O，R2和R3为OH，而R4为1，1-二甲基-5-溴-戊基；R1为O，R2和R3为OH，而R4为1，1-二甲基-5-氰基-戊基；R1为O，R2为琥珀酸酯，R3为OH，而R4为1，1-二甲基-庚基；R1为O，R2和R3为琥珀酸酯，而R4为1，1-二甲基-庚基；R1为O，R2为琥珀酸酯，R3为OH，而R4为1，1-二甲基-戊基；R1为O，R2为OH，R3为OCH3，而R4为1，1-二甲基-庚基；R1为O，R2和R3为H，而R4为1，1-二甲基-庚基；R1为CH2，R2和R3为OCH3，而R4为1，1-二甲基-庚基；R1为O，R2和R3为二乙基磷酸酯，而R4为1，1-二甲基-庚基；R1为O，R2为二乙基磷酸酯，以及R3为OH，而R4为1，1-二甲基-庚基；R1为CH2，R2和R3为二乙基磷酸酯，而R4为1，1-二甲基-庚基；以及R1为O，R2为延胡索酸酯，R3为OH，而R4为1，1-二甲基-庚基。
本发明也涉及通式(II)的化合物：
式II
式II具有特异性立体化学结构，其中C-5为S，在C-1和C-5位置的质子彼此之间为顺式，而在C-4和C-5位置的质子为反式，以及C-2------C-3为任选的双键；并且其中取代基R2-R5如对式(II)的限定以及其中所限定的附带条件。
根据目前优选的实施方案，我们现在公开通式(II)的化合物，其中R5是CH2OC(O)C(CH3)3、OH或者CH3，R2和R3各自独立地为OH、H或者二乙基磷酸酯，R4为CH2OC(O)(CH2)3CH3，1，1-二甲基-庚基，1，1-二甲基-乙基-苯基或者1，1-二甲基-庚-6-炔基，并且在C-2和C-3之间具有任选的双键，附带条件如式(II)所定义。
根据其它目前优选的实施方案，我们现在公开通式(II)的化合物，其中R5是OH，R2和R3为OH，R4为1，1二甲基-庚基，并且在C-2和C-3之间具有一单键；R5为CH3，R2和R3为OH，R4为1，1-二甲基-庚-6-炔基，并且在C-2和C-3之间具有一个双键；R5为CH3，R2和R3为OH，R4为1，1-二甲基-乙基-苯基，并且在C-2和C-3之间具有一双键；R5为OH，R2和R3为H，R4为1，1-二甲基-庚基，并且在C-2和C-3之间具有一单键；R5为CH3，R2和R3为OH，R4为CH2OC(O)(CH2)3CH3，并且在C-2和C-3之间具有一双键；R5为OH，R2和R3为二乙基磷酸酯，R4为1，1-二甲基-庚基并且在C-2和C-3之间具有一单键。
本发明进一步涉及通式(I)的CB2结合化合物：
式I
式I具有特异性立体化学结构，其中C-5为S，在C-1和C-5位置的质子彼此之间为顺式，而在C-4和C-5位置的质子为反式；并且其中取代基R1-R4为对式(I)的定义。
本发明进一步涉及通式(II)的CB2结合化合物：
式II
式II具有特异性立体化学结构，其中C-5为S，在C-1和C-5位置的质子彼此之间为顺式，而在C-4和C-5位置的质子为反式，并且C-2------C-3为任选的双键；以及其中取代基R2-R5为对式(II)的限定以及其中所限定的附带条件。
本发明涉及为了上述目的的药物组合物，包括作为活性成分的通式(III)的化合物：
式III
式III具有特异性立体化学结构，其中C-5为S，在C-1和C-5位置的质子彼此之间为顺式，而在C-4和C-5位置的质子为反式；并且其中取代基R1-R4为对式(III)的定义。
根据目前优选的实施方案，我们现在公开包括作为活性成分的通式(III)化合物的药物组合物，其中R1为O、CH2或者N-OH，R2和R3各自独立地为H、OH、OCH3、琥珀酸酯、延胡索酸酯或者二乙基磷酸酯，并且R4为1，1-二甲基-戊基、1，1-二甲基-庚基、1，1-二甲基-戊-4-烯基、1，1-二甲基-庚-6-炔基，1，1-二甲基-3-苯基-丙基，1，1-二甲基-5-溴代-戊基，1，1-二甲基-5-氰基-戊基，1，1，3-三甲基-丁基，1-甲基-1-对氯苯基-乙基或者1-乙基-1-甲基-丙基。
根据目前其它优选的实施方案，我们现在公开包括作为活性成分的通式(III)化合物的药物组合物，其中：R1是O，R2和R3为OH，而R4为1，1-二甲基-庚基；R1为O，R2和R3为OCH3，而R4为1，1-二甲基-庚基；R1为N-OH，R2和R3为OH，而R4为1，1-二甲基-庚基；R1为O，R2和R3为OH，而R4为1，1-二甲基-庚-6-炔基；R1为O，R2和R3为OH，而R4为1，1-二甲基-3-苯基-丙基；R1为O，R2和R3为OH，而R4为1，1，3-三甲基-丁基；R1为O，R2和R3为OH，而R4为1-甲基-1-对氯苯基-乙基；R1为O，R2和R3为OH，而R4为1，1-二甲基-戊基；R1为O，R2和R3为OH，而R4为1-乙基-1-甲基-丙基；R1为O，R2和R3为OH，以及R4为1，1-二甲基-5-溴-戊基；R1为O，R2和R3为OH，而R4为1，1-二甲基-5-氰基-戊基；R1为O，R2为琥珀酸酯，R3为OH，而R4为1，1-二甲基-庚基；R1为O，R2和R3为琥珀酸酯，而R4为1，1-二甲基-庚基；R1为O，R2为琥珀酸酯，R3为OH，而R4为1，1-二甲基-戊基；R1为O，R2为OH，R3为OCH3，而R4为1，1-二甲基-庚基；R1为O，R2和R3为H，而R4为1，1-二甲基-庚基；R1为CH2，R2和R3为OCH3，而R4为1，1-二甲基-庚基；R1为O，R2和R3为二乙基磷酸酯，而R4为1，1-二甲基-庚基；R1为O，R2为二乙基磷酸酯以及R3为OH，而R4为1，1-二甲基-庚基；R1为O，R2和R3为OH，而R4为1，1-二甲基-戊-4-烯基；R1为CH2，R2和R3为二乙基磷酸酯，而R4为1，1-二甲基-庚基；以及R1为O，R2为延胡索酸酯，R3为OH，而R4为1，1-二甲基-庚基。
本发明进一步涉及用于上述目的的药物组合物，包括作为活性成分的通式(II)的化合物：
式II
式II具有特异性立体化学结构，其中C-5为S，在C-1和C-5位置的质子彼此之间为顺式，而在C-4和C-5位置的质子为反式，并且C-2------C-3为任选的双键；以及其中取代基R2-R5为式(II)的限定以及其中限定的附带条件。
根据目前优选的实施方案，我们现在公开包括作为活性成分的通式(II)化合物的药物组合物，其中：R5是CH2OC(O)C(CH3)3、OH或者CH3，R2和R3各自独立地为OH、H或者二乙基磷酸酯，R4为CH2OC(O)(CH2)3CH3，1，1-二甲基-庚基，1，1-二甲基-乙基-苯基，或者1，1-二甲基-庚-6-炔基，并且在C-2和C-3之间具有任选的双键，附带条件如式(II)所定义。
根据其它目前优选的实施方案，我们现在公开包括作为活性成分的通式(II)化合物的药物组合物，其中：R5是OH，R2和R3为OH，R4为1，1二甲基-庚基，并且在C-2和C-3之间具有一单键；R5为CH3，R2和R3为OH，R4为1，1-二甲基-庚-6-炔基并且在C-2和C-3之间具有一个双键；R5为CH3，R2和R3为OH，R4为1，1-二甲基-乙基-苯基，并且在C-2和C-3之间具有一双键；R5为OH，R2和R3为H，R4为1，1-二甲基-庚基，并且在C-2和C-3之间具有一单键；R5为CH3，R2和R3为OH，R4为CH2OC(O)(CH2)3CH3，并且在C-2和C-3之间具有一双键；以及R5为OH，R2和R3为二乙基磷酸酯，R4为1，1-二甲基-庚基并且在C-2和C-3之间具有一单键。
本发明的新的非典型大麻碱最优选地有效结合CB2受体，但是较弱地结合CB1受体，后者除了有效的治疗作用外已知具有介导CNS中精神调理活性。
本发明进一步涉及利用本发明组合物在预防和治疗如下疾病中的新的治疗方法：自身免疫疾病，包括类风湿性关节炎、多发性硬化、全身性红斑狼疮、重症肌无力、I型糖尿病、肝炎和牛皮癣，以及免疫相关的紊乱，包括但不限于器官移植中的组织排斥、吸收不良综合症诸如脂泻病、肺疾病诸如哮喘以及Sjgren氏综合症，包含炎性肠病的炎症、包含外周、内脏、神经性、炎性以及关联痛的疼痛，肌肉痉挛，包含心律不齐、高血压和心肌缺血的心血管紊乱，包含中风、偏头痛和丛发性头痛的神经系统紊乱，包含帕金森氏症、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿氏舞蹈症、朊病毒相关神经退行性病变的神经退行性疾病，CNS中毒以及某些类型的癌。
新的组合物除了活性成分以外可以包含传统上对制备生理学上可接受和稳定制剂所必需的药用载体、稀释剂以及赋形剂。对于具有溶解性问题的化合物而言，本发明的一些化合物在特征上是疏水的，并且具有较强的亲油性，事实上不溶于水，具有表示为它们较高的辛醇/水分配系数和logP值，所以应该采用制备可接受剂型的制剂策略。能够使本发明的化合物治疗有效并且方便给药是本发明不可分割的一部分。
对于水溶性化合物，将采用标准制剂。可以通过将活性成分与作为药用稀释剂的传统药用成分，诸如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、环糊精、葡聚糖、甘油、polyglycolized甘油酯、tocopheryl聚乙二醇琥珀酸酯、十二烷基硫酸钠、聚乙氧基化蓖麻油、非离子表面活性剂、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙和树胶混合，制备用于口服给药的固体组合物，诸如药片、药丸、胶囊、软胶囊等。药片或者药丸可以包被或与本领域已知的药用材料混合，诸如微晶纤维素和纤维素衍生物，诸如羟丙基甲基纤维素(HPMC)，以提供能够延长作用或者持续释放的剂型。其它固体组合物可以制备成用于直肠给药的栓剂。可以制备用于口服或者注射的液体形式，所述给药方式包含但不限于皮下、透皮、静脉内、鞘内、损伤内、接近或者进入肿瘤及其它肠胃外给药途径。液体组合物包含水溶液，存在或者不存在有机助溶剂，水或者油悬浮液，包含但不限于作为悬浮剂的环糊精，带有食用油的加香乳剂，甘油三酸脂和磷脂以及酏剂和类似的药用介质。另外，本发明的组合物可以制成用于鼻内等给药的气雾剂形式。本发明的局部药物组合物可以与包含但不限于丙二醇、磷脂、甘油单酸酯、甘油二酯、甘油三酯、聚山梨酸酯、表面活性剂、水凝胶、矿脂或者其它本领域已知的赋形剂的药用赋形剂配制成溶液、洗液、凝胶、乳油、油膏、乳剂或者粘着膜。
在它们用作药剂之前，药物组合物通常配制成单位剂量。用于人类的活性剂量一般在每公斤体重0.05mg到约50mg的范围内，给药方案为每天1-4次。优选的的剂量范围是每kg体重从0.1mg到约20mg。然而，对本领域技术人员而言，显而易见的是剂量将由主治医师根据待治疗的疾病、给药方法、病人的年龄、体重、禁忌症等进行确定。
参考下列的实施例将更全面的理解本发明的原理，所述实施例应以非限制性的方式解释。
实施例
合成实施例
合成化合物A：(-)-4-[4-(1，1-二甲基-庚基)-2，6-二羟基-苯基]-6，6-二甲基-二环[3.1.1]庚-2-酮。
流程图1中描述了化合物A的合成，其中苯二酚化合物的R部分为1，1-二甲基-庚基。
流程图1
化合物A：R＝1，1-二甲基-庚基
化合物L：R＝1，1-二甲基-戊基
在-78℃的氮气气氛下，向含有正丁基锂(196ml，2M)和44g叔丁醇钾的3-颈瓶中逐滴添加50ml的(+)-α-蒎烯(1)。将反应物温热到室温并连续搅拌48小时。然后将反应物冷却到-78℃。添加硼酸三甲酯(113ml)的80ml醚溶液，然后将反应物温热到室温并且再搅拌1小时。分离有机层，并用正己烷(3×80ml)萃取水层。用盐水洗涤混合的有机相，并经无水硫酸钠干燥，过滤并蒸干获得化合物(2)％(+)-β-蒎烯。该流程根据Brown等人的方法进行(Brown H.C.等人，J.Org.Chem.54：1764-6，1989)。向(+)-β-蒎烯(2)(30.8g)中添加RuCl3(0.470g)，以及溶于250ml乙酸乙酯的苄基三丁基氯化铵(2.12g)。向这种混合物中逐滴添加高碘酸钠(145.5g)的1.3L水溶液，在室温下搅拌3小时并保存过夜。向反应混合物中添加250ml的乙酸乙酯。分离有机相，用500ml的盐水、500ml的10％亚硫酸钠洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤、减压蒸发后获得化合物(3)(-)-诺蒎酮。该流程根据Yuasa等人的方法进行(Yuasa Y.等人，J.Essent.Oil.Res.10：39-42，1998)。将(-)-诺蒎酮(3)(14.86g)和对甲苯磺酸(1.48g)溶于异戊烯基乙酸酯(148ml)中。利用Dean-Stark装置回流加热反应混合物5小时以除去丙酮。减压除去溶剂，将残余物转移到400ml醚中，用水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发以获得化合物(4)(+)诺蒎酮烯醇乙酸酯。这个流程基于由Archer等人对相反对映异构体所开发的方法进行(Archer R.A.等人，J.Org.Chem.42：2277-84，1977)。向16.17g(+)-诺蒎酮烯醇乙酸酯(4)的202ml无水甲苯溶液中添加62.2g的Pb(OAc)4(之前在真空中经P2O5/KOH干燥过夜)。反应混合物在80℃受热3.5小时，冷却，过滤，用饱和碳酸氢钠洗涤。分离有机层，经无水硫酸钠干燥并在减压下蒸发以产生(+)-6，6-二甲基-2，4-二乙酸基-2-norpinene(5)和(-)-6，6-二甲基-2，2-二乙酸基-3-norpinene(6)。5和6(1.18g，5mmol)，R为1，1-二甲基庚基(7)(1.18g，5mmol)的间苯二酚和对甲苯磺酸(0.95g，5mmol)的氯仿(50ml)的混合物在室温下反应4小时。然后添加乙醚(30ml)，用饱和碳酸氢钠、水洗涤有机相，然后经无水硫酸钠干燥、过滤并蒸发。残余物在乙腈中结晶后提供0.5g的晶体。母液经硅胶进行层析分离，另获得0.7g的纯化合物A。
合成化合物L：(-)-4-[4-(1，1-二甲基-戊基)-2，6-二羟基-苯基]-6，6-二甲基-二环[3.1.1]庚-2-酮。
流程图1中描述了化合物L的合成，其中间苯二酚化合物的R部分为1，1-二甲基-戊基。如合成化合物A所述制备化合物1到6。
合成化合物B：(-)-4-[4-(1，1-二甲基-庚基)-2，6-二甲氧基-苯基]-6，6-二甲基-二环[3.1.1]庚-2-酮。
化合物B的合成描述在流程图2中。
向化合物A(115mg，0.3mmol)的DMF(5ml)的溶液中添加碳酸钾(0.5g，3.6mmol)并搅拌混合物10分钟。然后添加碘代甲烷(0.15ml，24mmol)并在室温下搅拌混合物过夜。向反应混合物中添加水并用EtOAc萃取。有机相用水洗涤两次，经无水硫酸钠干燥并蒸发。残余物经反相C-18柱利用10％水的乙腈溶液作为洗脱液进行层析分离以获得98mg的化合物B。
流程图2.
合成化合物C：(-)-5-(1，1-二甲基-庚基)-2-(4-羟基-6，6-二甲基二环[3.1.1]庚-2-基)-苯-1，3-二醇。
化合物C的合成描述在流程图3中。
将溶于10ml甲醇的100mg的化合物A冷却到0℃。逐步添加硼氢化钠(200mg)并搅拌反应混合物4小时。将混合物倒入50ml的5％HCl中，用乙酸乙酯(2×30ml)萃取，经Na2SO4干燥，过滤并蒸发以产生白色粉末形式的90mg的化合物C。
流程图3
合成化合物D：4-[4-(1，1-二甲基-庚基)-2，6-二羟基-苯基]-6，6-二甲基-二环[3.1.1]庚-2-酮肟。
化合物D的合成描述在流程图4中。
将盐酸羟胺(37.3mg)溶于5ml水中并将溶液冷却到0℃。缓慢添加氢氧化钾(30mg)的1ml水溶液中。添加化合物A(372.5mg)继之以添加甲醇以溶解所有的组分。搅拌3小时后，观察不到起始物质。然后添加水并用乙酸乙酯萃取溶液，经Na2SO4干燥、过滤并蒸发以提供380mg的化合物D。
流程图4
合成化合物E：(+)-5-(1，1-二甲基-庚-6-炔基)-2-(4，6，6-三甲基-二环[3.1.1]庚-3-烯-2-基)-苯-1，3-二醇。
化合物E的合成描述在流程图5中，其中间苯二酚化合物的R部分为1，1-二甲基-庚-6-炔基。
流程图5
(+)马鞭草烯醇 3-间苯二酚 化合物E：R＝1，1-二甲基-庚-6-炔基
化合物K：R＝1，1-二甲基-戊基
化合物Q：R＝1，1-二甲基-乙基-苯基
反应在无水条件下进行。(+)马鞭草烯醇(0.505，3.3mmol)，3-(1，1-二甲基庚-6-炔基)间苯二酚(0.77g，3.3mmol)和催化量的无水对甲苯磺酸钠的无水氯仿(10ml)的混合物在0℃搅拌1小时。将混合物倒入碳酸氢钠(50ml)的水溶液上并用氯仿(3×30ml)萃取水相。然后用水(3×30ml)和盐水(3×100ml)洗涤混合的有机层。有机层经Na2SO4干燥、过滤并蒸发。这样获得的粗物质通过硅胶上的快速层析利用5％乙醚/石油醚作为洗脱液进行纯化以获得1.034g的化合物E。
化合物Q的合成：5-(1，1-二甲基-乙基-苯基)-2-(4，6，6-三甲基-二环[3.1.1]庚-3-烯-2-基)-苯-1，3-二醇。
流程图5中描述了化合物Q的合成，其中间苯二酚化合物的R部分为1，1-二甲基-乙基-苯基。
如对化合物14所述利用苯基锂制备1，1-二甲基-乙基-苯基间苯二酚。如对化合物E所述利用(+)-马鞭草烯醇进行浓缩。
合成化合物F：(-)-4-[4-(1，1-二甲基-庚-6-炔基)-2，6-二羟基-苯基]-6，6-二甲基-二环[3.1.1]庚-2-酮。
化合物F的合成描述在流程图6中。
如Harrington等人的描述制备(3，5-二甲氧基苯基)-N-甲氧基-N-甲基甲酰胺(carboxamide)(8)(Harrington P.E.等，J.Org.Chem.65：6576-82，2000)。根据Negishi等人的描述制备1-(三甲基甲硅烷基)-6-溴-1-己炔(9)(Negishi E-I等，J.Amer.Chem.Soc.110：5383-96，1988)。根据下列流程制备[7-(3，5-二甲氧基苯基)-7-氧代-1-庚炔基]三甲硅烷(10)。
流程图6
向金属镁(300mg)的5ml无水THF中添加催化量的二溴甲烷，并将反应混合物加热到回流几分钟。终止加热并利用注射器以保持回流的添加速率注射0.9ml的化合物9(大约20分钟)。完成添加后，继续回流1小时。将反应混合物冷却到室温。在0℃通过套管将如此获得的Grignard转移到化合物8(0.9g)的2ml THF溶液中。30分钟后，用1M HCl溶液猝灭反应混合物并用乙醚进行稀释。分离有机相，经Na2SO4干燥、过滤并蒸发以提供1.5g的粗物质。通过硅胶快速层析法，利用10％乙酸乙酯的石油醚溶液作为洗脱液进行纯化获得680mg的纯化合物10。如国际专利申请WO 01/28497所述，从化合物10获得3-(1，1-二甲基-6-炔基)间苯二酚(11)。5和6(1.18g，5mmol)，3-(1，1-二甲基-6-炔基)间苯二酚(11)(1.18g，5mmol)以及对甲苯磺酸(0.95g，5mmol)的氯仿(50ml)的混合物在室温下反应4小时。然后添加乙醚(30ml)，用饱和碳酸氢钠、水洗涤有机相，然后经无水硫酸钠干燥、过滤并蒸发。残余物在乙腈中结晶以提供0.5g的晶体。母液经硅胶进行层析分离以另提供0.7g的纯化合物F。
合成化合物G：4-[4-(1，1-二甲基-苯基-丙基)-2，6-二羟基-苯基]-6，6-二甲基-二环[3.1.1]庚-2-酮。
化合物G的合成描述在流程图7中，其中R为2-乙基-苯。
如Harrington等所述制备化合物8，12以及13(Harrington P.E.等人，J.Org.Chem.65：6576-82，2000)。如国际专利申请WO 01/28497所述制备化合物14。如前合成化合物A所述制备化合物5以及6。如合成化合物A所述进行化合物5，6和14的缩合。
流程图7
化合物G：R＝2-乙苯
化合物H：R＝仲丁基
化合物J：R＝对氯苯
合成化合物H：(-)-4-[2，6-二羟基-4-(1，1，3-三甲基-丁基)-苯基]-6，6-二甲基-二环[3.1.1]庚-2-酮。
化合物H的合成描述在流程图7中，其中R为仲丁基。如化合物A和F的合成所述制备化合物5，6，8，12-14。如合成化合物A所述进行化合物5，6和14的缩合。
合成化合物J：(-)-4-{4-[1-(4-氯-苯基)-1-甲基-乙基]-2，6-二羟基-苯基]-6，6-二甲基-二环[3.1.1]庚-2-酮。
化合物J的合成描述在流程图7中，其中R为对氯苯。
如化合物A和F的合成所述制备化合物5，6，8，12-14。如合成化合物A所述进行化合物5，6和14的缩合。
合成化合物M：(-)-4-[4-(1-乙基-1-甲基-丙基)-2，6-二羟基-苯基]-6，6-二甲基-二环[3.1.1]庚-2-酮。
化合物M的合成描述在流程图8中。
流程图8
(留18行插入原文第34页的图)
化合物M
如下合成化合物16：1-(1-羟基-1-乙基-丙基)-3，5-二甲氧基-苯。在无水条件下进行反应。在0℃，向甲基-3，5-二甲氧基基苯甲酸酯(5g，25.5mmole)的无水THF(100ml)溶液中添加乙基溴化镁的THF(1M，76.5ml)。在室温下搅拌反应混合物72小时。添加乙酸乙酯和水，并用乙酸乙酯萃取水相。然后用水和盐水洗涤混合的有机层、干燥(Na2SO4)，并过滤以提供6.3g的化合物16。
下列流程描述在国际专利申请WO 01/28497中。
如下合成化合物17：1-(1-氯-1-乙基-丙基)-3，5-二甲氧基-苯。化合物16(6.3g，25mmole)溶于无水CCl4(30ml)中，HCl(g)起泡1小时。然后用水和10％碳酸氢钠溶液洗涤有机层、干燥(Na2SO4)并蒸发以产生6.3g的化合物17。
如下合成化合物18：1-(1-乙基-1-甲基-丙基)-3，5-二甲氧基-苯。在N2下将化合物17(6g，25mmole)的无水甲苯溶液冷却到-30℃，并添加三甲基铝的庚烷(2M溶液)(25ml)。反应混合物温热到室温并搅拌过夜。添加HCl(1N)，然后分离有机层，用水洗涤、干燥并蒸发。在硅胶上利用1％乙酸乙酯/石油醚作为洗脱液层析分离粗物质以提供5.3g的化合物18。
如下合成化合物19：5-(1-乙基-1-甲基-丙基)-间苯二酚。在N2气氛下向冷却的(-50℃)化合物18的无水二氯甲烷中添加硼-三-溴化物(10.15ml，107.3mmole)。反应混合物温热到室温并搅拌过夜。添加饱和碳酸氢钠，分离有机层、干燥(Na2SO4)并蒸发以产生4.2g的期望的间苯二酚19。如化合物A的合成所述制备化合物5和6以及与间苯二酚19的缩合。
合成化合物N：(-)-4-[4-(5-溴-1，1-二甲基-戊基)-2，6-二羟基-苯基]-6，6-二甲基-二环[3.1.1]庚-2-酮。
化合物N的合成描述在流程图9中，其中R为溴原子。
如合成化合物A所述制备化合物5以及6。化合物20的制备如Singer等人所述(Singer等，J.Med.Chem.41：4400-7，1998)。如合成化合物A所述进行化合物5，6和20的缩合。
合成化合物P：(-)-4-[4-(1，1-二甲基-戊基-5-腈)-2，6-二羟基-苯基]-6，6-二甲基-二环[3.1.1]庚-2-酮。
化合物P的合成描述在流程图9中，其中R为氰基。
流程图9
化合物20：R＝Br 化合物N：R＝Br
化合物21：R＝CN 化合物P：R＝CN
化合物5和6如化合物A的合成所述进行制备。化合物21从化合物20以类似于Singer等人描述的方法进行制备(Singer等，同上)。如合成化合物A所述进行化合物5，6和21的缩合。
合成化合物R：(-)-4-{4-[1，1-二甲基-庚基]-2-琥珀酸酯-6-羟基-苯基}-6，6-二甲基-二环[3.1.1]庚-2-酮。
化合物R的合成描述在流程图10中。
合成化合物S：4-{4-[1，1-二甲基-庚基]-2，6-二琥珀酸酯-苯基}-6，6-二甲基-二环[3.1.1]庚-2-酮。
化合物S的合成描述在流程图10中。
在N2气氛下将化合物A(227mg，0.61mmole)和琥珀酸酐(731mg，7.31mmole)的无水吡啶(10ml)的混合物加热到50℃。添加叔丁醇钾，并将获得的混合物搅拌过夜(50℃)。将混合物倒入1N HCl中，并用乙酸乙酯萃取。混合的有机相用1N HCl和盐水进行洗涤，干燥(Na2SO4)并蒸发。通过柱层析(20％乙酸乙酯/石油醚+0.1％乙酸)分离两种产物以产生220mg的化合物R(油)和150mg的化合物S(固体)。
流程图10
合成化合物T：4-{4-[1，1-二甲基-庚基]-2，6-双-二乙基磷酸酯-苯基]-6，6-二甲基-二环[3.1.1]庚-2-酮。
化合物T的合成描述在流程图11中。
流程图11
反应在N2气氛下进行。向充分搅拌的化合物A(1.97g，5.29mmole)的新蒸馏的THF溶液中添加叔丁醇钾(1.54g，13.75mmole)，并搅拌混合物10分钟。然后添加二乙基氯磷酸酯，并搅拌反应混合物过夜。添加水并用乙酸乙酯萃取水相。用盐水洗涤混合的有机层，干燥(Na2SO4)并蒸发。在硅胶上利用25％-70％乙酸乙酯-石油醚作为洗脱液进行色谱纯化产生2.2g的纯化合物T。
合成化合物U：4-{4-[1，1-二甲基-庚基]-2-二乙基磷酸酯-6-羟基-苯基]-6，6-二甲基-二环[3.1.1]庚-2-酮。
化合物U的合成描述在流程图11中。
合成化合物W：(-)-4-{4-[1，1-二甲基-庚基]-2，6-双-二乙基磷酸酯-苯基}-6，6-二甲基-二环[3.1.1]庚烷-2-亚甲基。
化合物W的合成描述在流程图12中。
在N2气氛下进行合成。向甲基-三苯基-碘化膦(5.92g，14.65mmole)的无水THF(100ml)的悬浮液中添加双(三甲基甲硅烷基)酰胺钾(PBTSA)的甲苯(0.5M，28.7ml)，并在室温下搅拌混合物0.5小时。添加化合物T(1.89g，2.93mmole)的THF(10ml)溶液，并将混合物搅拌过夜。添加氯化铵的水溶液，分离有机层并用EtOAc萃取水相。混合的有机相用盐水进行洗涤，干燥(Na2SO4)、过滤并蒸发。利用15％到30％EtOAc/石油醚作为洗脱液通过硅胶柱层析纯化产物。
流程图12
合成化合物Y：(-)-4-{4-[1，1-二甲基-戊基]-2-琥珀酸酯-6-羟基-苯基}-6，6-二甲基-二环[3.1.1]庚-2-酮。
化合物Y的合成类似于描述在流程图10中化合物R的合成。唯一的差异是起始物质，利用相同的合成流程，化合物A产生化合物R，化合物L产生化合物Y。
合成化合物Z：(-)-4-{4-[1，1-二甲基-庚基]-2-延胡索酸酯-6-羟基-苯基}-6，6-二甲基-二环[3.1.1]庚-2-酮。
化合物Z的合成描述在流程图13中。
流程图13
化合物A(600mg，1.6mmol)溶于100ml的无水二乙醚中。然后添加0.21ml的三乙胺(1.6mmol)和0.18ml的富马酰氯(1.7mmol)。搅拌约15分钟后，过滤氯化三甲铵盐并蒸发滤液。然后向残余物中添加乙酸乙酯，并用水洗涤3次直到pH高于4。然后用饱和氯化钠洗涤有机相，经硫酸钠干燥、过滤并蒸发。然后利用20％乙酸乙酯和石油醚作为洗脱液在硅胶上通过柱层析纯化化合物Z。
合成化合物AA：(-)-4-[4-(1，1-二甲基-庚基)-2-羟基-6-甲氧基-苯基]-6，6-二甲基-二环[3.1.1]庚-2-酮。
化合物AA的合成描述在流程图14中。
流程图14
向化合物A(150mg，0.4mmol)的DMF(16ml)溶液中添加碳酸钾(400mg，2.9mmol)，并在室温下搅拌混合物10分钟。然后添加碘代甲烷(85.2mg，0.6mmol)，并在室温下搅拌混合物过夜。向反应混合物中添加水并用EtOAc萃取。用水洗涤有机相两次，经无水硫酸钠干燥、过滤并蒸发。残余物经反相柱利用50％水的乙腈溶液作为洗脱液进行层析分离以提供30mg的化合物AA。
合成化合物AB：4-{4-[1，1-二甲基-庚基]-2，6-双-二乙基磷酸酯-苯基}-6，6-二甲基-二环[3.1.1]庚-2-醇。
化合物AB的合成描述在流程图15中。
流程图15
向充分冷却的化合物T(0.12g，0.18mmol)的无水乙醇(6ml)溶液中添加硼氢化钠(51mg，1.34mmol)。在-40℃搅拌反应混合物1小时，然后温热到室温。3小时后，TLC分析显示初始物质的完全消失。然后添加水，并用乙酸乙酯萃取反应混合物。用水、饱和氯化钠洗涤有机层，并经硫酸钠干燥。通过蒸发除去剩余溶剂以提供0.17g的化合物AB(92％的产率)。
合成化合物AC：4-[4-(1，1-二甲基-庚基)-苯基]-6，6-二甲基-二环[3.1.1]庚-2-醇。
化合物AC的合成描述在流程图16中。
流程图16
在无水条件下进行反应。向充分冷却的(-78℃)化合物AB(0.107g，0.165mmol)的无水THF(6ml)和液氨(约50ml)溶液中添加锂(约50mg，7.2mmol)。保持反应容器完全封闭直到蓝色消失(约30分钟)，然后打开过夜使氨气蒸发。残余物溶于乙酸乙酯(30ml)和氯化铵的饱和溶液中。用乙酸乙酯萃取水相。经硫酸钠干燥混合的有机相、过滤并蒸发以提供77.6mg的化合物AC，HPLC测得的纯度为100％。
合成化合物AD：(-)-4-[4-(1，1-二甲基-庚基)-苯基]-6，6-二甲基-二环[3.1.1]庚-2-酮。
化合物AD的合成描述在流程图17中。
流程图17
向充分搅拌的化合物AC(0.204g，0.6mmol)的无水二氯甲烷溶液中以一部分添加吡啶重铬酸盐(0.448g，1.2mmol)。在室温下搅拌反应混合物过夜。通过硅藻土过滤固形物并用DCM洗涤。通过蒸发除去溶剂以提供0.27g的残余物。利用10％乙酸乙酯/石油醚作为洗脱液通过快速层析法纯化粗物质以提供0.15g的纯化合物AD(产率74％)。
合成化合物AE：(+)5-(戊酸甲酯)-2-(4，6，6-三甲基-二环[3.1.1]庚-3-烯-2-基)-苯-1，3-二醇。
化合物AE的合成描述在流程图18中。
在室温下搅拌甲基3，5-二甲氧基苯甲酸酯(20g，0.12mole)，咪唑(100g，1.47mole)和叔-丁基二甲基甲硅烷基氯化物(100g，0.66mole)的DMF(无水，400ml)溶液2小时。用水(300ml)稀释反应混合物并用乙醚(3×300ml)萃取水相。用水洗涤混合的有机相，干燥(Na2SO4)并蒸发。获得的粗物质溶于THF(300ml)中，冷却到-20℃并逐滴添加LiAlH4的THF(1N，140ml，0.14mole)。在室温下搅拌反应混合物2小时。反应混合物冷却到-30℃并添加乙酸乙酯(300ml)，然后添加MgSO4的饱和溶液。通过硅藻土过滤获得的溶液。
流程图18
分离有机层并用乙酸乙酯萃取水相3次。用饱和氯化钠洗涤混合的有机相，干燥(硫酸钠)并蒸发以提供44.2g的粗产物(23)(0.12mole)。不用任何纯化步骤，将三乙胺(25ml，0.18mole)和戊酰氯(30ml，0.25mole)添加到溶于无水二氯甲烷(1升)的粗产物(23)中。在室温下搅拌产生的混合物过夜。然后添加水，分离有机层并用DCM(3×300ml)萃取水相。用饱和氯化钠洗涤混合的有机相，干燥(Na2SO4)并蒸发。残余物在硅胶上用4％乙酸乙酯/石油醚作为洗脱液进行层析。获得45g的黄色油(24)。向黄色油(45g，0.1mole)的THF(1升)溶液中添加氟化四丁铵(87g，0.33mole)，然后在室温下搅拌混合物过夜。将反应混合物倒入用乙酸酸性化直到pH约为4.5的水(11)中，并用乙酸乙酯萃取若干次。用饱和氯化钠洗涤混合的有机相，干燥(Na2SO4)并蒸发。用30％乙酸乙酯和石油醚作为洗脱液在硅胶柱上层析分离残余物以提供20g的白色固体(25)。将白色固体(0.75g，3.3mmol)用马鞭草烯醇(0.5g，3.3mmol)溶解在CHCl3(40ml)中，并将产生的溶液冷却到0℃。添加无水对甲苯磺酸(催化量)并将产生的混合物在0℃搅拌15分钟。将反应混合物倒入碳酸钠的饱和溶液中。用CHCl3萃取水相并用碳酸钠的水溶液洗涤混合的有机相。干燥(Na2SO4)有机相、过滤并蒸发。分离化合物AE并用20％水与乙腈作为洗脱液通过预备性HPLC进行纯化。
合成化合物AF：4-{4-[1，1-二甲基-庚基]-2，6-二甲氧基-苯基}-6，6-二甲基-二环[3.1.1]庚-2-亚甲基。
化合物AF的合成描述在流程图19中。
流程图19
在N2气氛和无水条件下进行反应。向甲基三苯基碘化膦(1.083g，2.68mmol)的无水THF(20ml)的悬浮液中添加双(三甲基甲硅烷)酰胺钾的甲苯(5.26ml，2.63mmol，0.5M)。在室温下搅拌反应混合物半小时。然后添加化合物B(0.214g，0.537mmol)的无水THF(2ml)溶液，并将产生的混合物搅拌过夜。向反应混合物中添加氯化铵的饱和溶液，并用乙酸乙酯萃取水相(3次)，用饱和氯化钠清洗混合的有机相，干燥(硫酸钠)过滤并蒸发。用己烷研磨获得的粗褐色固体以除去三苯基氧化膦。
然后用100％的己烷作为洗脱液在硅胶上进行层析以获得淡黄色油的化合物AF。
合成化合物AG：(-)-4-[4-(1，1-二甲基-戊-4-烯基)-2，6-二羟基-苯基]-6，6-二甲基-二环[3.1.1]庚-2-酮。
化合物AG的合成描述在流程图20中。
1g的金属钠(43mmol)溶于无水甲醇(25ml)中，然后添加溶于甲醇(3.5g，12mmol)的4-(7-溴-1，1-二甲基-庚基)-2，6-二羟基-苯基(20)。搅拌反应混合物约半小时。然后将反应混合物倒入100ml的1N HCl中。用乙酸乙酯萃取水相(3×100毫升)，用饱和氯化钠清洗混合的有机相，干燥(硫酸钠)、过滤并蒸发。获得800mg的粗间苯二酚产物(26)，并用20％的乙酸乙酯的石油醚溶液经硅胶柱层析进行纯化。让产物间苯二酚(170mg，0.82mmol)与诺蒎酮二-乙酸酯的两种异构体(5)和(6)(540mg，2.2mmol)的CHCl3溶液和催化量的对甲苯磺酸反应。在室温下搅拌4小时后，完成反应。用碳酸氢钠洗涤反应混合物并用乙酸乙酯萃取(3次)，用饱和氯化钠清洗混合的有机相，干燥(硫酸钠)、过滤并蒸发。获得的粗物质用石油醚研磨以产生150mg的粗化合物AG。然后用50％的水∶乙腈作为洗脱液经反相层析纯化产物。
流程图20
(留10行插入原文第45页的图)
化合物AG
合成化合物AH：2，2-二甲基丙酸-4-{4-[1，1-二甲基-戊基]-2，6-二羟基-苯基}-6，6-二甲基-二环[3.1.1]庚-2-烯-2基甲酯。
化合物AH的合成描述在流程图21中。
流程图21
(留10行插入原文第43页的上图)
4-羟基桃金娘烯基-7-特戊酸酯5-(1，1-二甲基-戊基)-间苯二酚化合物AH
4-羟基桃金娘烯基-特戊酸酯的制备如美国专利4,876,276所述，而5-(1，1-二甲基戊基)-间苯二酚的制备如下。在250ml的圆底烧瓶中添加100ml的甲醇和100ml的THF。然后添加5.5g的3，5-二甲氧基-苯甲酸(0.03mole)和1.27g的氢氧化锂一水合物(0.03mole)。然后添加10ml的水，并搅拌反应混合物1小时。过滤获得的浆液并蒸发。残余物用乙醚研磨，并再一次蒸发获得浅黄色固体。在60℃、减压条件下用P2O5干燥固体。向100ml THF的250ml圆底烧瓶中添加3，5-二甲氧基锂苯甲酸的干燥盐。添加正丁基锂(20ml，1.7M，0.032mole)。反应物温热到50℃并搅拌2小时。反应混合物冷却到室温，并逐滴添加到250ml的1N HCl。然后添加Na2CO3直到pH为约11。然后用乙醚萃取反应混合物3次。经硫酸钠干燥混合的有机相，过滤并蒸发以产生从正戊烷结晶而来的橙色油。获得2.6g的化合物12，其中R为丁基，总产率为39％。如流程图7所述制备化合物13和14，其中R为丁基。如化合物E所述进行4-羟基桃金娘烯基-特戊酸酯和5-(1，1-二甲基戊基)-间苯二酚的缩合，并且产率为65％。
生理学实施例
在一系列实验系统中进行新的二环CB2配体治疗作用的评估以支持这些药物作为免疫调节、抗炎、止痛、神经保护和抗肿瘤剂的实用性。这些作用都在体外和体内进行评价，并利用如下所述的系统进行证实。除非另有所示，测试化合物的制备如下：为了体外分析，首先将化合物溶于DMSO中，并逐步稀释在分析缓冲液，通常为组织培养基中，直到终浓度为0.1％DMSO。为了体内分析，测试化合物首先稀释在CREMOPHOR EL∶乙醇中(分别为70％和30％w/w)并且进一步以1∶20的比例稀释在生理缓冲液，通常为生理盐水中，以到达合适的剂量。因此介质为稀释在合适缓冲液中的初始“溶剂”。
实施例1
CB1和CB2受体的结合亲合性。
在膜上通过检测新化合物从CB1受体置换[3H]CP55940的能力进行CB1的结合分析，所述膜来源于hCB1稳定转染的HEK-293细胞(Perkin Elmer/NEN)。将膜稀释在分析缓冲液(50mM Tris-HCl，2.5mMEDTA，5mM MgCl2，1mg/ml BSA，pH＝7.4)中得到500μg蛋白/ml。在存在或者不存在二环测试化合物的条件下将50μl的稀释膜(25μg)与[3H]CP55940一起温育在总体积0.5ml中。测试化合物溶于DMSO中，并稀释在分析缓冲液中得到0.1％溶剂的终浓度。添加与介质等量的对照样品。通过添加10μM的WIN 55212-2测量非特异性结合。在30℃培养1.5小时后，通过Whatman 934A/H过滤器(用0.1％的聚乙烯亚胺(PEI)预浸透)过滤反应物。
通过检测新二环类似物从膜中的受体置换[3H]WIN 55212-2的能力确定新二环类似物与CB2受体的亲合性，所述膜来源于hCB2稳定转染的CHO细胞(Perkin Elmer/NEN)。将膜稀释在分析缓冲液(10mMHEPES，1mM MgCl2，1mM EDTA，0.3mg/ml BSA，pH＝7.4)中得到500μg蛋白/ml。在存在或者不存在几个浓度的二环测试化合物的条件下将50μl的稀释膜(25μg)与0.8nM的[3H]WIN 55212-2一起温育在总体积1ml中。如前对hCB1的分析所述溶解并稀释测试化合物。通过添加10μM的CP 55940测定非特异性结合。在30℃培养40分钟后如先前所述过滤反应物。所有结合分析的过滤器用β-计数器计数并将类似物浓度的log对结合％作图。从这个图外推出IC50的值。
结合分析的结果显示在表1中，其根据它们分别从CB2或者CB1结合位点置换[3H]WIN 55212-2或者[3H]CP55940的能力描述了优选化合物的构效关系(SAR)。
表1用于定义R2、R3和R4的缩写参考下列取代基：
DMBP＝1，1-二甲基-5-溴代-戊基
DMCP＝1，1-二甲基-5-氰基-戊基
DMEP＝1，1-二甲基-乙基-苯基
DMH＝1，1-二甲基-庚基
DMH6＝1，1-二甲基-庚-6炔基
DMP＝1，1-二甲基戊基
DMPP＝1，1-二甲基-3-苯基-丙基
EMP＝1-乙基-1-甲基-丙基
MCPE＝1-甲基-1-(对-氯代-苯基)-乙基
表1中报告的IC50的值从诸如描述在图1的图表计算而来，其显示了所选择的二环化合物与大麻碱受体的结合。通过竞争性抑制稳定转染有人类CB1受体基因的HEK-293细胞中的[3H]CP55940来测定与CB1的结合。通过竞争性抑制转染有人类CB2受体基因的CHO细胞中的[3H]WIN55212-2来测定与CB2的结合。以抑制％作为化合物浓度函数的两个曲线(hCB1■和hCB2◆)在这个图中重叠。A-显示由化合物A得到的结果。B-显示由化合物B得到的结果。C-显示由化合物J得到的结果。D-显示由化合物L得到的结果。
表1.式(I)到(III)的二环化合物的SAR和IC50(nM) 化合物 R1 R2 R3 R4 R5 CB2 IC50 CB1 IC50 CB2/CB 1亲合 性比率 HU-210* 0.35 0.39 1.11 HU-308* OCH3 OCH3 DMH CH2OH 13.3 3600 271 A O OH OH DMH 1 27.6 28 B O OCH3 OCH3 DMH 45 2800 62 C OH OH DMH OH 3.5 31 9 D N-OH OH OH DMH 3.4 93 27 E OH OH DMH6 CH3 0.783 26 33 F O OH OH DMH6 0.344 13 38 G O OH OH DMPP 6.6 563 85 J O OH OH MCPE 11 659 60 L O OH OH DMP 3.8 446 117 M O OH OH EMP 40.8 3900 96 N O OH OH DMBP 0.36 50 139 P O OH OH DMCP 1.55 227 146 Q OH OH DMEP CH3 12 640 53 R O 琥珀酸酯 OH DMH 1.2 41 34 S O 琥珀酸酯 琥珀酸酯 DMH 1.52 117 77 Y O 琥珀酸酯 OH DMP 7.4 315 42 Z O 延胡索酸 酯 OH DMH 1.2 816 656 AH OH OH DMP CH2OC(O) C(CH3)3 42 398 9.5
带有星号的化合物不在式(I)和(II)定义的范围内，包含在内仅仅用于比较。HU-210公开在美国专利5,284,867中，而HU-308公开在国际专利申请WO 01/32169中。
实施例2
体外二环CB2配体的抗炎特性。
炎性应答级联的特异方面通过诸如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，IFN-γ，IL-2和IL-1β的细胞因子以及诸如COX-2和PGE2的炎性介质介导。调节这些前炎性剂的水平对于最终炎症结果的严重性是非常重要的。这些前炎性剂也由免疫系统的激活细胞产生，而这个研究的目的是测试新二环CB2配体对从活化的巨噬细胞和T细胞分泌这些炎性剂的影响。各种测试组中的分泌水平通过ELISA分析进行测定，并且对比介质治疗组计算抑制水平。
利用ELISA进行蛋白定量。
用于液体样品，组织培养上清液或者体液中的给定蛋白的定量技术是基于酶联免疫吸附测定(ELISA)的方法。不管是市售或者自产的，分析是基于由结合到ELISA板微孔底部的特异性抗体捕获目的蛋白来进行的。冲洗掉未结合的物质，然后将捕获的蛋白暴露于通常用辣根过氧化酶(HRP)或者碱性磷酸酶(ALP)标记的二级抗体。再一次冲洗掉未结合的物质，然后将样品用产生比色反应的合适底物温育。终止反应并在合适的波长处对分光光度计进行读数。至少一式两份测试样品，并且在每个板上合编出由重组体靶蛋白的系列稀释构成的合适标准曲线。从标准曲线计算样品中蛋白的浓度。
巨噬细胞的活化
RAW 264.7巨噬细胞为一种小鼠细胞系(ATCC #TIB-71)，将其生长在Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(DMEM)上，该培养基用4mM的L-谷氨酰胺调节以包含1.5g/L的碳酸氢钠、4.5g/L的葡萄糖以及10％热灭活的胎牛血清。细胞生长在组织培养瓶中并以合适的密度接种在24微孔组织培养板中。一毫升中的0.5×106的Raw细胞用2μg/ml的脂多糖E.coli 055：B5(DIFCO实验室)进行刺激。小鼠巨噬细胞用对照或者10μM的二环CB2配体预处理1小时，其后用LPS激活。50nM的地塞米松用作阳性对照。活化后4小时(对于PGE2)以及24小时(对于IL-1β和TNF-α)收集上清液，通过先前所述的ELISA测定研究中炎性剂的水平。相对介质处理的细胞，计算抑制率。
抑制活化巨噬细胞中的IL-1β。
IL-β获得的结果描述在图2A中，其中对每一处理组绘制分泌的水平。由此图可见，二环CB2配体在10μM时是IL-1β的有效抑制剂，化合物A抑制76％的分泌，化合物D抑制67％，化合物B抑制34％，而化合物C抑制26％的分泌。在相同的实验中地塞米松抑制IL-1β97％的分泌。
抑制活化巨噬细胞中的TNF-α。
如先前所述进行巨噬细胞的活化。如先前所述用ELISA分析测定TNF-α的水平。对比介质处理的细胞计算抑制率。用10μM的化合物A处理降低了53％的TNF-α分泌并且计算的IC50为10μM。用从1μM到20μM范围内各种剂量的测试化合物进行处理以确定本发明其它化合物的IC50值，诸如化合物L、N、P、R和Y，并且当剂量高达20μM时它们中没有一个显著影响TNF-α的分泌。
抑制活化巨噬细胞中的PGE2。
如先前所述进行巨噬细胞的活化。如先前所述用ELISA分析测定PGE2的水平。对比介质处理的细胞计算抑制率。用从1μM到20μM的范围内的各种剂量的测试化合物进行处理以确定IC50值。结果描述在图2B中。由化合物A、L、N、P、R和Y抑制PGE2分泌的IC50值分别为9μM、7μM、7μM、18μM、9μM和7μM。
T细胞的活化。
Jurkat细胞(人类急性淋巴瘤T-细胞系；ATCC #TIB-152)生长在RPMI 1640培养基中，该培养基用2mM的L-谷氨酰胺调节以包含1.5g/L的碳酸氢钠、4.5g/L的葡萄糖，10mM的HEPES，1.0mM的丙酮酸钠以及10％热灭活的胎牛血清。细胞生长在组织培养瓶中并以合适的密度接种在24微孔组织培养板中。用10ng/ml的PMA(Sigma)和1μM的A23187钙离子载体(Sigma)刺激一毫升中的2×106个细胞。环孢菌素A(Sandoz)为一种已知的免疫抑制药物，用作阳性对照。刺激之前1小时以所示浓度加入对照和测试化合物。刺激后24小时收集上清液，并且如先前所述用ELISA分析测定研究中的炎性剂。对比载体处理的细胞计算抑制率。
抑制激活T细胞中的IL-2。
如先前所述进行T细胞的活化。如先前所述用ELISA分析测定IL-2的水平。对比介质处理的细胞计算抑制作用。在图3中显示的这个实验的结果为由介质或者化合物处理的细胞获得的IL-2的分泌水平，在每个浓度进行绘图。由此图可见，二环CB2配体可以为IL-2的有效抑制剂，化合物A具有3μM的计算IC50，而化合物L、R和Y分别具有8μM、9μM和9μM的计算IC50。在高达10μM的剂量下，在这种实验设置中，从中衍生二环合成大麻碱族的HU-308本身具有最小的作用。相同实验中浓度为10nM的环孢菌素A抑制98％的IL-2分泌。应该注意到在0.5-5μM的CB1拮抗剂SR141716A或者CB2拮抗剂SR144528存在的条件下在这种实验设置中同样测试了化合物A和L，而且它们的IL-2分泌抑制活性没有被任何这些拮抗剂所逆转。这种观察可能通过拮抗剂不完全足以阻断这种潜在的特异性受体-介导的活性的事实，或者通过一些化合物的活性不能由CB2结合介导但是通过选择性的机制介导的假设进行解释，例如通过结合到未经鉴定的大麻碱受体或者通过非受体介导的机制进行。
总而言之，这些试验结果支持了下列结论：本发明的二环CB2结合化合物是从免疫系统活化的细胞分泌前炎性剂的有效抑制剂，而不管是通过CB2结合还是通过选择性机制进行的。
肥大细胞的活化。
肥大细胞为活化后释放有效炎性剂的多功能骨髓来源的细胞。从预先形成的颗粒通过脱颗粒的过程或者在刺激诱导的从头合成后完成释放。由肥大细胞释放的分子包含诸如组胺的生物胺、趋化因子、细胞因子、酶、生长因子、肽、花生四烯酸产物和蛋白多糖。应该注意到肥大细胞也已知在产生疼痛信号中具有关键作用。RBL-2H3细胞(大鼠嗜碱性白血病细胞系；ATCC #CRL-2256)表达了CB2样受体并且最适合于研究支撑CB2选择性配体的抗炎活性的机制。RBL-2H3可以由IgE依赖的机制或者通过添加PMA和钙离子载体进行刺激。
RBL-2H3细胞生长在EMEM培养基中，用Earle氏BSS，2mM L-谷氨酰胺调节到包含1.5g/L的碳酸氢钠、0.1mM的非必需氨基酸、1.0mM的丙酮酸钠和15％的热灭活胎牛血清。细胞生长在组织培养瓶中并以合适的密度接种在24微孔组织培养板中。一毫升中的2×105细胞通过下列之一的方式进行刺激。首先，在IgE依赖的方法中，过夜涂板后，用包含0.5μg/ml的共轭连接IgE的抗-DNP(二硝基苯基)(Sigma，Cat.No.D-8406)的培养基更换培养基并对细胞致敏1小时。然后用PBS洗涤细胞两次并暴露于包含0.1μg/ml DNP-HAS(二硝基苯基白蛋白，人类血清，Sigma，Cat.No.A-6661)的新预热的培养基。在最终刺激之前添加稀释在DMSO中的测试化合物和对照，终浓度不超过0.1％DMSO。根据待评估的介质，在37℃下让脱颗粒过程进行不同时间段，然后收集200μl的上清液。例如，在组胺取样之前刺激细胞1小时以及刺激3小时用于监控血清素、TNF-α和IL-4的分泌水平。使用这种模型的第二种可能性是当利用10ng/ml的PMA(Sigma)以及1μM的A23187钙离子载体(Sigma)实现刺激的时候。Src家族抑制剂PP1或者PKC抑制剂GF109203X(都获得自Calbiochem)用作阳性对照。刺激之前以所示浓度加入对照和测试化合物。依据在研究中的介质，刺激后收集上清液长达24小时，并且如先前所述用ELISA分析测定这种炎性剂的水平。对比介质处理的细胞计算抑制率。
实施例3
化合物对基因表达的作用。
通过一些二环CB2结合化合物对体外或者体内免疫系统活化的细胞中炎性剂分泌的影响显示的抑制活性可能与基因表达的调节相关。
RNA制备和实时RT-PCR。
利用SV总RNA分离系统(Promega)制备总RNA。细胞或者组织在溶解缓冲液中匀浆化。根据试剂盒的说明书，将裂解物转移到RNA分离柱，用DNAse处理，洗涤并洗脱。利用GeneQuant II(Pharmacia-Amersham)确定RNA的浓度。利用SUPERSCRIPT II逆转录酶(LifeTechnologies)从总RNA合成互补DNA(cDNA)。根据试剂盒说明书，将2μg的总RNA与寡核苷酸(dT)15引物、0.5mM dNTP混合物、8单位的逆转录酶及其他反应组分组合达到20μl的终容积。反应混合物在42℃保温45分钟并在70℃灭活15分钟。定量的实时RT-PCR包含1μl的cDNA，300nM的合适正反向引物(根据监控的基因)以及7.5μl的反应混合物，所述反应混合物包含缓冲液、核苷酸、Taq聚合酶和SYBER绿(SYBER Green master混合物，Applied Biosystems)，总反应体积为15μl。利用GeneAmp 5700序列检测系统(AppliedBiosystems)获得基因扩增。扩增过程包含在95℃10分钟的一个步骤，继之以两步的40个循环：95℃20秒，以及在60℃1分钟。每个退火步骤期间，扩增产物的量通过双链DNA结合染料SYBER Green的荧光强度进行测定。对每种产物测定循环阈值(CT)，表示可以首先检测到荧光高于基线信号的增加的PCR循环。CT中一个PCR循环的延迟被转化为起始模板分子降低两倍，反之亦然。将特异基因产物CT的改变规格化到参考基因亲环素或者GAPDH CT的变化。结果表示为试验系统中基因表达高于合适对照，诸如灭活细胞系或者介质“处理”的动物的成倍增加。在所有的情况下，结果同样规格化到诸如亲环素或者GAPDH的参考管家基因。
实施例4
化合物对ConA诱导的肝脏损伤的作用。
在刀豆素A诱导的肝脏损伤鼠模型中评价二环CB2结合化合物的护肝活性。
T细胞介导的损伤的ConA模型。
人类危急生命的T细胞介导肝脏损害最普遍的原因是感染乙型肝炎或者丙型肝炎病毒以及自身免疫肝炎。已经发展了自身免疫肝脏损伤的不同动物模型，包含由静脉内注射T细胞刺激性植物凝集素刀豆素A(ConA)诱导的小鼠急性肝功能衰竭。ConA对肝窦具有较高的亲合性。用ConA处理小鼠激活了在肝脏中聚集并释放调节肝脏损伤的细胞因子(诸如IL-6、IL-10、TNF-α、INF-γ、IL-2)的T细胞。用免疫抑制剂药物诸如环孢菌素或者FK506预处理完全预防了由ConA注射引起的肝脏损伤，从而证实了T细胞激活在这种模型中的主要作用。
每个实验组包含至少5只BALB/c纯系雌性小鼠(平均体重25g，Harlan，以色列)。阴性对照组由注射盐水而非ConA的小鼠组成。以10mg/kg盐水溶液的剂量在尾的基部通过i.v.进行ConA(Sigma)注射。注射ConA前30分钟以1mg/kg的剂量i.v.注射进行处理。化合物溶于CREMOPHOR EL∶乙醇中，并且仅以内部对照包含介质。
在三个水平监控处理的效果。首先，在注射ConA后预定的时间点利用后眼眶穿刺收集血样(200-400μl)。短暂离心后(5000rpm，2分钟)，收集血清并保藏在-80℃，直到进一步用于经ELISA确定细胞因子的水平以及确定肝脏转氨酶的渗漏作为肝脏损伤的标志。同时，也在目的器官中确定细胞因子或者其它炎性介质的水平。为了这个目的，注射ConA后在预定时间点通过颈椎脱臼法处死小鼠。取出脾和肝脏。部分肝脏固定在4％的甲醛中，而其他部分保藏在-80℃用于蛋白或者RNA的提取。将脾称重，并且将小部分脾固定在4％的甲醛中，而大部分根据下列方法进行培养。用5ml注射器的粗糙末端插入4ml的RPMI培养基中，将每个脾挤压通过一细胞滤器。通过重力沉积除去大组织片段并且收集上清液。用5ml的红细胞裂解缓冲液(Boehringer)洗涤细胞3次，重悬在4ml的RPMI培养基中，所述培养基补充有2mM的L-谷氨酰胺，调节到包含1.5g/L的碳酸氢钠、4.5g/L的葡萄糖，10mM HEPES，1.0mM的丙酮酸钠以及10％热灭活的胎牛血清，并在6微孔培养皿中铺板。细胞保温24小时并且通过如前所述的ELISA确定上清液中细胞因子的水平。
通过ConA处理8小时后测量血浆中ALT的水平评价化合物A对肝脏损伤的作用。暴露于ConA引起ALT血浆浓度从30急剧升高到2800IU/l以上。用介质处理的动物仅仅显示ALT非显著性减少29％，而用1mg/kg的化合物A处理的动物显示显著性减少65％。ALT为肝脏损伤的明确标志，这些试验结果支持了肝脏炎症中二环CB2配体可能的治疗效果。
实施例5
注射LPS后化合物在脑组织中的作用。
在CNS炎症的情况下，通过模型在体内的试验，确定二环CB2结合化合物的神经保护活性，在所述模型中，将LPS注射到小鼠脑室中产生炎性损伤。PBS用作对照。LPS溶于PBS中浓度为50ng/μl，以1μl/分钟的速度在注射泵和脑注入套管的帮助下将5μl注入每个脑室中。每次注射后，套管继续遗留在原位一分钟以避免回流。i.c.v(脑室内)注射LPS后紧接着i.p.(0.1毫升/10g体重)注射各种处理组和对照。每个处理组由五只C57/BL雄性小鼠(6-8周龄，平均体重25g，Harlan，Israel)组成。注射LPS后6小时，通过i.p.注射100mg/kg的戊巴比妥钠处死动物，取出它们的大脑并保藏在-80℃直到下一步骤。从每个完整的大脑提取RNA并通过如前所述的实时RT-PCR分析炎性剂的基因表达水平。这个实验的结果表示成LPS对PBS注射的大脑中所研究基因的成倍激活。
这个实验模型同样能够通过测量神经胶质增生的程度来监控二环CB2结合化合物对脑炎的作用。为了这个目的，LPS和处理注射后3天处死动物并取出大脑。在海马区的水平面切割20μm的冷冻切片并利用抗F4/80标记的抗体，通过标准的免疫组织化学方法进行染色。通过对F4/80免疫活性细胞的计数进行定量分析。处理组之间的差异利用方差ANOVA分析继之以事后(post-hoc)t检验进行比较。p＜0.05的值被认为是统计学上显著的。
实施例6
化合物在中脑动脉阻塞中的作用。
小鼠瞬时MCAo
本发明化合物的神经保护活性在模拟脑缺血的中脑动脉阻塞(MCAo)鼠模型中进行评价。这个模型相当于中风中观察到的脑缺血。用30％氧和70％氮中的氟烷(在麻醉室中4％用于诱导，并且在面罩中1-2％为了维持)麻醉小鼠(C57B1，雄性，平均体重25g，Harlan，Israel)。在颈部皮肤进行中线切割，笔直地切开下面的组织。通过钝器解剖研究右颈总动脉(CCA)及其与颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)的连接。然后灼烧ECA、枕骨和甲状腺上动脉的分支。接着通过将其围绕5-0丝缝线材料(Assut，瑞士)进行CCA的瞬间封闭。切割2厘米段的尼龙缝合材料并放进1％聚L-赖氨酸的溶液中，然后在烘箱(60℃)中干燥60分钟。每段的顶端围绕在火焰的下方。用相同类型的缝合材料将ECA永久地阻塞。此时，在ICA中用5-0丝缝线材料进行第三次瞬时闭合。在ECA中切开小孔并向ICA中插入尼龙线，同时避免进入翼突腭动脉。线插入11mm直到感觉到轻微的抗性。然后打一5-0丝缝线结使线固定。然后切断留在外面的1厘米线。通过5-0丝缝线材料封闭皮肤伤口。
操作后，使动物在笼中醒来。损伤开始后1小时对动物进行临床试验以验证MCA阻塞是否成功。评估系统基于Belayev等人的工作(Stroke 27：1616-23，1996；Brain Res.833：181-90，1999)。它包括两个测试：姿势反射测试和前肢放置测试。动物尾部悬吊评价姿势反射，而通过胃部固定动物进行前肢放置测试。表1总结了这两个试验及它们的得分系统。
表1：用MCAo进行小鼠的神经学估价。项目 标准分 不足姿势反射测试(悬吊测试)* 0 2放置测试(在每侧进行)#目测放置向前 0 2向侧面 0 2触觉放置爪的背面 0 2爪的侧面 0 2本体感受放置 0 2
*记分如下：0代表没有观察到不足，1代表悬吊测试期间四肢弯曲，2代表侧面推力不足。
#记分如下：0代表完全直接放置，1代表不完全或者延迟放置(＞2秒)，2代表没有放置。
只有总分在8到12之间的动物才被归入研究中。起始损伤后90分钟，利用相同的方法给选择的动物再次给服镇静剂，然后重新打开颈部伤口并用尼龙线拉出ICA。接着用5-0丝缝线材料封闭皮肤伤口。损伤结束之前1分钟施用对照和测试化合物。经静脉内递送5ml/kg的所有处理物。介质的施用为5ml/kg。每个测试组包括至少6只动物。然后追踪动物的三个主要参数：临床功能评估，包含损伤程度的组织病理学评估以及免疫/炎性标记的评估。研究的最后，通过i.p.注射戊巴比妥钠100mg/kg处死动物。然后取出大脑并准备用于检查。从大脑同侧的一半，制备总RNA用于监控测试化合物对局部缺血标记的作用。通过如前所述的实时RT-PCR分析基因表达水平。结果可以表示成高于假装操作动物的成倍激活。基因表达规格化到管家基因亲环素。
实施例7
处理炎症：小鼠的耳浮肿模型。
新二环CB2配体的抗炎活性利用小鼠的耳浮肿模型进行体内筛选。这个测试系统利用各种炎症诱导物，包含巴豆油(CO)以及花生四烯酸(AA)，并且通过测定耳组织肿胀确定结果。非甾醇类抗炎药物已经显示出减轻这种模型的肿胀(Young，J.M.等人，J.Invest.Dermatol.82：367-71，1984)。测试化合物预防或者减低对这些兴奋剂的炎性应答的能力是它们全身性抗炎能力的指示。
化合物A溶于CREMOPHOR EL∶乙醇中，并根据需要的剂量在用无菌0.9％氯化钠稀释到期望的终浓度后i.p.注射成熟雄性ICR小鼠(平均体重30g，Harlan，以色列)。检查化合物从0到30mg/kg范围的各种剂量。每个处理组由8-10只动物组成而介质处理组由16只动物组成。通过施用20μl 50％CO的丙酮溶液到一只耳的外表面可立即诱导炎症，对侧耳只暴露于丙酮并作为对照。利用表盘式测厚仪(Mitutoyo，Japan)在施用CO后3小时测定耳的厚度(0.01mm单位)。最后，修剪耳朵，取出一6mm直径的耳孔并测量其重量。耳的浮肿可以表示为CO处理耳的耳孔重量与对侧丙酮处理耳的耳孔重量的比值。结果计算为与CREMOPHOR EL∶乙醇介质处理的动物相比的抑制％。从这个研究中进行的剂量反应的分析，我们发现当腹腔内注射化合物A时，化合物A具有30mg/kg或者81μmole/kg的ED50。这些结果显示二环CB2配体可以起到全身性抗炎化合物的作用。
实施例8
处理炎症：小鼠的爪浮肿模型。
这个研究的目的是体内测试化合物对动物后爪注射1％角叉菜胶诱导的爪浮肿的抗炎活性。分别以15和6mg/kg i.p.注射稀释在无菌盐水中的甲苯噻嗪和戊巴比妥组合麻醉雌性Balb/c小鼠(平均体重20g，Harlan，以色列)。在一只(右)爪趾面下区用0.05ml的1％w/v角叉菜胶的无菌水溶液皮下注射麻醉的小鼠。没有注射对侧的(左)爪，因为来自文献的数据被我们自己的经验所证实，显示注射0.05ml的生理盐水不影响以后的厚度或者容积计量。包含已知的抗炎对照的所述测试化合物，在i.p.注射之前溶于CREMOPHOR EL∶乙醇中并进一步以1∶20或者1∶50稀释在无菌盐水中，所述i.p.注射紧跟在角叉菜胶注射之前发生。注射后3小时，如先前所述方法将动物重新服用镇静剂。利用表盘式测厚仪(Spring-dial，恒定低压压力表，Mitutoyo，TG/L-1，0.01mm)测量爪厚度，利用器官充满度测量器(型号#7150，UgoBasile，Italy)测量爪体积。爪浮肿可以表示成同一动物右侧处理和左侧未经处理的爪之间的差异，或者以立方毫米表示的Δ爪体积(ΔPV)或者以毫米表示的Δ爪厚度(ΔPT)。每个组包括至少10只动物。结果可以进一步规格化到每个处理组0mg/kg(只有介质)的ΔPV和ΔPT值。在研究最后，i.p.注射100mg/kg的戊巴比妥使动物安乐死。
结果首先计算为ΔPV或者ΔPT，然后通过比较处理和介质对爪体积或者厚度的作用更进一步被分析成抑制％。各种处理组中的差异利用方差分析(ANOVA)继之以事后t Fisher试验进行分析。p＜0.05的值被认为是统计学上显著的。
当结果表示为规格化到介质的爪厚度抑制％，并根据测试化合物的剂量作图时，产生的图型为给定剂量时起始斜率直至最大的观察结果(MOE)，继之以更高剂量的平稳状态。针对下列两个参数进行测试化合物的抗炎活性分析：爪厚度的最大抑制％以及观察到最大结果的剂量。第一个总的观察是：与在最多2mg/kg范围内的已知抗炎化合物，诸如地塞米松和Celecoxib相比，二环CB2配体在较低的剂量下是有效的。二环CB2配体的原型HU-308在0.6mg/kg剂量时产生爪厚度约28％的最大减少。在2.5mg/kg剂量时化合物A对爪厚度有类似28％的减少，而化合物L和R在0.25和0.5mg/kg剂量时分别显示34％和31％的MOE。由于比较的缘故，已知的抗炎药物诸如Celecoxib和地塞米松分别在相应的剂量范围内，在0.1mg/kg时引起爪厚度减少7％和26％，在0.25mg/kg时减少16％和31％，而在0.5mg/kg时减少24％和33％。因此，大多数测试的化合物至少优于Celecoxib。应该记住这些市售药物显示严重的副作用，如果不经补充性保护药物处理的话会阻止它们长期应用。本发明的化合物与这些药物相比具有抗炎活性的事实是非常令人鼓舞的，因为这个家族的化合物具有避免副作用的优点，从而使它们成为代替现存抗炎药物的重要候选药物。这些结果支持了本发明的二环CB2配体具有可能与含有炎性组分的较宽范围的人类状态相关的抗炎效果。
实施例9
试验性自身免疫疾病：CIA，EAE和DTH。
自身免疫疾病与升高水平的炎性细胞因子相关。最常研究的啮齿动物模型为实验性变应性脑脊髓炎(EAE)(一种人类多发性硬化的模型)，试验性自身免疫关节炎(一种人类类风湿性关节炎的模型)，以及迟发型超敏反应(DTH)(一种人类过敏性反应的模型)。EAE为由动物对中枢神经系统的髓鞘碱性蛋白致敏化作用引发的自身免疫神经系统疾病，所述髓鞘碱性蛋白又称碱性致脑炎蛋白。试验性的自身免疫关节炎由完全弗氏佐剂中的胶原蛋白免疫动物所引发：因此所述模型称为胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)。迟发型超敏反应是根据严格时间表通过施用二硝基氟苯诱导的，因此产生的模型相当于人类变应性接触性皮炎。本研究的目的是测试我们的化合物预防或者减弱这三种自身免疫病模型的临床征象的能力。
胶原蛋白诱导的关节炎。
在这个研究中，每处理组使用至少8只成年DBA/1雄性小鼠(平均体重20g，Harlan，以色列)。在4℃通过搅拌ON将2型牛胶原蛋白溶于0.05M乙酸中，浓度为2mg/ml。胶原蛋白溶液在等体积的完全弗氏佐剂(CFA)中进一步乳化。每只动物施用100μg的2型胶原蛋白的0.1ml CFA乳化液。在尾的基部s.c.施用胶原蛋白。启动后21天，小鼠皮内加强注射100μg胶原蛋白的弗氏不完全佐剂溶液。
利用器官充满度测量器(Hugo Basill，Italy)测量每个后爪的体积，利用转盘恒压计量器(Mitutoyo，日本)测量厚度。胶原蛋白给药之前以及在指定的随访期间每隔一天进行测量。所有的处理为腹膜内给药。处理周期的最后，i.p.100mg/kg的戊巴比妥处死动物。
各种不同的处理组之间爪肿胀严重性的差异利用方差分析ANOVA继之以事后t检验进行比较。p＜0.05的值被认为是统计学上显著的。
试验性自身免疫脑脊髓炎。
自身免疫脑脊髓炎的各种动物模型是本领域已知的，这取决于诱导方法，动物的伤情以及用于诱导疾病的抗原。利用Lewis大鼠测试二环CB2配体对EAE的影响，其中诱导后约10天通过临床症状的表现观察疾病的开始。疾病的进展以及临床记分增加，并且大约15天达到顶点，诱导疾病后约18天观察到自然恢复。动物(起始研究时每测试组至少9只，除了未经处理的对照组，只包括5只大鼠)保持12小时照明/12小时黑暗的作息时间，22℃恒温，不限量给食和水。通过用s.c.注射后爪25μg纯化的豚鼠髓鞘碱性蛋白(MBP，Sigma)的0.1ml完全弗氏佐剂(Difco)的乳化液免疫这些动物而诱导EAE。
临床上记分在0.5和1之间，显示出疾病症状的动物用测试化合物或者介质对照进行处理，给药方式为从发病(诱导疾病后约第10天)开始连续3天静脉内注射，体积为5ml/kg。甲基强的松龙用作阳性对照，其从注射MBP诱导疾病开始每天i.v.施用30mg/kg，连续5天。结果记录为临床记分；0分表示没有临床征象的正常动物，0.5显示尾远部肌肉弹性的丧失，1显示整个尾部瘫痪，2显示截瘫，3显示四肢麻痹，4显示整个身体瘫痪和濒临死亡以及5显示死亡。发病后对动物临床记分共11天，计算这段时间曲线下面积(AUC)。各种不同处理组之间临床结果的差异利用方差分析(ANOVA)继之以Fisher氏LSD检验进行分析。p＜0.05的值被认为是统计学上显著的。
图4中显示的结果为每个处理组平均AUC的减少％。以剂量相关的方式，化合物A产生临床记分AUC的降低，在1mg/kg剂量时明显减少35％。结果显示为图4中的#，其在统计学上好(p＜0.05)于未经处理和CREMOPHOR EL∶乙醇介质处理获得的结果。在这个试验设置中，当以30mg/kg的剂量在发病前给药5次时，阳性对照甲基强的松龙(MPred)减少34％。苯甲醇作为Mpred的介质，并且自然而然提高AUC 18％，数据未显示在图中。实验以盲法方式独立地重复，并获得类似的结果，例如采用1mg/kg的化合物A，临床记分减少30％。
此外，在单独研究中，诱导疾病后15天i.p.注射100mg/kg的戊巴比妥对动物实施安乐死。取出大脑和脊髓并用4％低聚甲醛温育固定过夜。利用提高浓度的乙醇溶液对脊髓的颈部脱水，然后包埋入paraplast中。接着对脊髓进行切片(10μm)，并利用苏木精和曙红进行染色。用光学显微镜对浸润淋巴细胞的病灶检查染色的玻片。对病灶的数目进行计数，并对每个动物的6张切片加以平均。在这个系统中测试3组，每组至少4只动物：未经处理的，介质处理的，和用0.5mg/kg的化合物A处理的动物。结果表示为病灶数目的平均值±SD。各种不同的处理组中浸润病灶数目之间的差异利用方差分析(ANOVA)继之以学生氏t检验进行分析。p＜0.05的值被认为是统计学上显著的。
未经处理的动物在它们的脊髓中显示最高的浸润病灶数，每个切片平均23±16个病灶。只用介质处理对这个结果没有影响，病灶数为21±6，而0.5mg kg的化合物A使浸润显著降低超过50％，每个切片病灶数为10±5。当已经确诊(自从发病约5天)疾病时进行这些观察，并且支持了二环CB2配体通过阻止细胞浸润产生损伤的炎性/免疫级联作为有效的神经保护剂的事实。
总而言之，这些试验结果不仅在神经系统的组织水平而且在功能性临床结果的水平，暗示二环CB2配体为与人类多发性硬化相关的模型的有效处理剂。
小鼠的迟发型超敏反应
第0天和第1天在腹部剃毛皮肤上涂敷稀释在丙酮中的30μl0.15％二硝基氟苯(DNFB)，对成年雌性BALB/c小鼠(平均体重20g，Harlan，以色列)致敏。在第6天，通过在一只耳上涂敷10μl的DNFB丙酮溶液攻击动物。对侧耳不受攻击但是涂敷10μl丙酮。以从0到15mg/kg提高的剂量i.p.施用测试化合物两次，第一次注射紧接在DNFB攻击后(第6天)，而第二次注射在攻击后16小时(第7天)。每个处理组包括至少7只动物。地塞米松(DXM)用作阳性对照。攻击后24小时(第7天第二次处理后6小时)利用表盘式测厚仪(Mitutoyo，Japan)确定耳的厚度。
结果分析为DNFB处理的耳厚度高于未用DNFB处理的对侧耳的厚度。通过比较其对处理组动物的平均影响与只对合适的介质产生的应答，进一步评价这种测试化合物的效果。结果显示在图5中，其中耳厚度减少的％相对处理剂量作图。一般而言，获得的图型为到达活性平稳状态的曲线。对于阳性对照而言，我们可以发现最大抑制为约80％，而HU-308的最大抑制在60％的范围内。对于地塞米松计算的IC50为3.2mg/kg，而对于HU-308而言IC50为4.8mg/kg。在测试的剂量下，化合物A和L没有到达50％的抑制，它们的最大减少是在35-43％的范围内。这些试验结果显示二环CB2配体可以有效处理与人类变应性和免疫应答相关的模型。
实施例10
处理神经退行性紊乱：MPTP模型。
帕金森氏症(PD)是一种神经退行性紊乱，其特征在于震颤、运动减慢、僵硬以及平衡性差。如果不是所有的，大多数的这些行动障碍应归于由黑质致密层部分(SNpc)中多巴胺能神经元以及纹状体中它们的突出神经纤维的丧失所引起的纹状体多巴胺含量的显著降低。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)是一种众所周知的神经毒素，可以引起多巴胺含量在纹状体中的损耗以及黑质纹状体多巴胺能神经元的数目在几个物种中的减少，所述物种包含人类(Turski L.等，Nature349：573，1991)。本研究的目的是检验二环CB2配体对MPTP-诱导的多巴胺能毒性进展的影响。
动物处理和方法。
在第1天以2小时的间隔，用4次注射MPTP(Sigma USA)(20mg/kg，5ml/kg)的盐水(Teva Medical Israel)溶液对小鼠(C57/BL雄性小鼠，平均体重30g，Harlan，Israel)i.p.给药。包含：(a)盐水，未处理的，(b)MPTP，未处理的，(c)介质(1∶20的CREMOPHOR EL∶乙醇)，5ml/kg i.p.，以及(d)测试化合物的处理组仅在第一次MPTP给药前经一次i.p.给药。MPTP处理动物后七天处死动物(通过i.p.施用戊巴比妥钠CTS，以色列100mg/kg)，取出大脑利用免疫组织化学技术检测酪氨酸羟化酶(TH)。
免疫组织化学。
通过心脏灌注4％低聚甲醛继之以大脑浸入相同的固定剂至少72小时固定大脑。然后用PBS洗大脑并转入30％蔗糖的PBS溶液中直到它们下沉。大脑沉入蔗糖后，利用专用制冷器速冻(-60℃)进行冷冻。然后在黑质(SN)的平面对大脑进行低温切片(20μm)。利用兔抗酪氨酸羟化酶(1∶100，Calbiochem)进行免疫组织化学染色。利用自动免疫染色系统(Ventana)的二氨基联苯胺(DAB)检测试剂盒对玻片染色。通过在SNpc侧面到第三脑神经根部的最宽尺寸处对免疫活性(IR)细胞计数进行定量分析，所述第三脑神经在interpreduncular核的平面将中间和侧面SN分离开来。纹状体平面的标记量利用计算机化图象分析系统进行评估。
所有的数据表示为平均值±SD。利用方差分析(ANOVA)继之以事后Fisher检验分析数据。p＜0.05的值被认为是统计学上显著的。在SNpc平面上的TH免疫反应性。
图6显示了i.p.20mg/kg的HU-308在帕金森氏症MPTP模型中的作用。对每个处理组在MPTP注射和处理后SNpc平面TH-IR细胞/mm2的数目作图。黑色柱-盐水注射的未处理组。黑色带点柱-MPTP注射的未处理组。阴影柱-MPTP注射的用化合物介质处理的组。白色柱-MPTP注射的用HU-308处理组。柱上的符号是指统计分析：#与盐水处理组相比p＜0.05；*与介质相比p＜0.05。注射MPTP后，TH-IR细胞的数目与盐水处理的动物相比减少65％(58±10盐水组对20±3MPTP组)。计算处理组相对于MPTP处理组的TH-IR结果显示HU-308从MPTP毒性拯救约43％的SN多巴胺能细胞。介质本身对TH-IR细胞没有拯救作用。这些结果显示二环CB2配体对慢性神经退行性疾病诸如帕金森氏症的模型是有效的。
实施例11
内脏疼痛的处理：减弱机械痛觉过敏(allodynia)。
这个研究的目的是评价新二环CB2结合化合物在内脏疼痛动物模型中可能的止痛效果。内脏疼痛由诸如胃、肾、胆囊、膀胱、肠等内脏器官紊乱引起。这些紊乱包含来自碰撞或者肿瘤的膨胀、局部缺血、肠系膜上的炎症和粘连，其可以引起相关征状，诸如发烧、不适和疼痛(Al-Haer E.D.等，Pain 96：221-5，2002)。内脏疼痛由i.p.注射乙酸诱导小鼠产生。
通过i.v.注射5ml/kg体积剂量的介质、不同剂量的对照和测试化合物对雄性ICR小鼠(平均体重25g，Harlan，Israel)进行预处理。每个处理组由至少4只动物组成。十五分钟以后，给小鼠i.p.注射10ml/kg的0.6％乙酸，并在乙酸给药后5分钟开始记下5分钟时间段内萎靡小鼠的数目。结果表示为萎靡平均数±SD。利用方差分析(ANOVA)继之以事后Fisher试验分析数据。p＜0.05的值被认为是统计学上显著的。
未处理的动物显示为平均30.5±4.3萎靡，而介质处理的只有轻微的非显著的结果，降低萎靡数目到21.8±3.4。然而，剂量范围在从0.5到2mk/kg的化合物A在这个模型中效率很高，甚至在最低剂量时仍然具有统计显著性(p＝0.015)。在0.5mg/kg剂量时，与介质相比化合物A已经降低了64％的萎靡数至7.9±4.8，在1mg/kg剂量时抑制高达95％，只有1.2±0.6的萎靡数，而在2mg/kg的剂量时化合物A显示完全保护，抑制率达100％，并且根本没有萎靡的动物。这些试验结果支持了二环CB2结合化合物是有效止痛的并且防止内脏疼痛。
实施例12
处理慢性神经性疼痛：减弱机械痛觉过敏。
这个研究的目的是评定新二环CB2结合化合物在神经性疼痛动物模型中的可能止痛效果。坐骨神经慢性收缩后在大鼠右后肢诱导外周monopathy(Bennet，G.J.& Xie，Y-K.，Pain 33：87-107，1988)。利用建立的行为测试监控机械allodyna的发展(Von Frey纤维)。
确定手术前的基准值作为两个术前值的平均数。一旦建立了基准值，通过用4根松的铬羊肠线收紧右侧坐骨神经准备动物外科手术。手术后第11天，将基于预手术值已经发展了机械allodyna的动物随机分配给各种不同的处理组。
根据是否正在施用药物或者介质，以掩蔽方式进行随机设计。在测试前，使雄性Sprague-Dawley大鼠适应行为测试设备。在测试这天，每处理组至少6只动物以2.5ml/kg的体积i.p.施用单剂量的一种测试化合物。15分钟以后，一系列Von Frey纤维(在测试前预先标定)自下而上施用于后爪的趾面。从最弱力开始以逐渐递增的顺序施加纤维并且评价同侧和对侧后爪的退缩阈值。每一纤维在脚的中趾面到它刚刚开始弯曲的点压痕；每一纤维以大约1Hz的频率重复大约8-10次。缩回阈值被定义为两种或多种连续Von Frey氏纤维引发一种反射缩回应答(即，一种短暂的爪翘起)的最小压力，并以克进行测定。
图7显示化合物A在神经性疼痛的慢性压缩神经损伤模型中的作用。结果被表示为在测试化合物处理组中相对介质处理的动物中对VonFrey氏纤维的应答阈值增加的百分比，且根据定义，介质处理组产生无效的基准值。黑色柱表示吗啡处理的动物(4mg/kg)，灰色和带点的柱条表示两种剂量的化合物A(分别为0.5和1mg/kg)。从这个研究中可以看出处理15分钟后，用4mg/kg剂量的吗啡处理的动物在其同侧的后爪比介质处理组的动物具有91％的更高疼痛阈值。用0.5mg/kg和1mg/kg的化合物A处理的组分别显示出疼痛阈值增加71％和64％，而在单独实验中，用5mg/kg的HU-308处理的动物显示出117％的改善(数据未显示)。这些结果表明本发明的二环CB2配体和已知的CB2激动剂HU-308一样可减轻或治疗慢性神经性疼痛。迄今为止，已知HU-308减轻在福尔马林测定中评价的外周疼痛(WO 01/32169)。
此外，如实施例10所述，应该注意到化合物A在试验性自身免疫脑脊髓炎系统模拟的人多发性硬化中是有效的。患有MS的病人不但经受神经缺陷而且发展为严重的神经性疼痛。本发明的化合物可同时治疗这两个方面疾病的事实赋于它们显著的治疗优点。
实施例13
急性外周疼痛的处理：尾部翘起模型。
本研究的目的是用来评价新二环CB2结合化合物在急性疼痛动物模型中潜在的止痛作用。在此模型中，伤害性刺激是热，并监控直到动物尾部翘起的时间(Le Bars D.，Gozariu M.& Cadden S.W.，Pharmacol.Rev.53：597-652，2001)。
ICR雄性小鼠(平均体重为20-30g，Harlan，Israel)以5ml/kg的体积剂量进行i.p.注射。每一处理组包含至少6只动物。吗啡HCl以5mg/kg的终剂量用作阳性对照。其介质，盐也被包括在对照中。将测试的化合物溶于CREMOPHOR EL∶乙醇中，并在注射之前以1∶20稀释在盐水中，第二种介质也被包括在阴性对照中。注射的终剂量从0.1到10mg/kg。在注射处理物后的预定时间点，动物被放入在尾部翘起系统中(Socrel，model DS 20)。动物轻轻地固定，而它们的尾部被置于光电池上。然后在距离末梢2cm处照射(21V)尾部且记录按秒计量的潜伏时间，一式两份。在研究的最后，通过i.p注射100mg/kg的戊巴比妥钠对动物实施安乐死。
下列两个参数被用于分析结果：潜伏时间和显示痛觉丧失动物的％。通过后者我们测定处理组中有多少动物已经增加了对疼痛的抗性，通过潜伏时间测定，所述潜伏时间高于或等于介质处理动物中所观测的潜伏时间的两倍。两种情况下的结果表示为平均数±SE。不同处理组之间的显示痛觉丧失的动物的潜伏时间或百分率之间的差异通过方差分析(ANOVA)继之以事后Tukey氏检验(用于潜伏时间)或Fisher氏精确试验(用于动物百分率)进行分析。p＜0.05的值被认为是统计学上显著的。
图8显示了在用于急性疼痛的尾部翘起模型中，不同剂量化合物A(带点柱)和化合物R(阴影柱)的作用。注射后30分钟进行测定时(图A)，两个对照组的潜伏时间是类似的，对于盐水为2.65秒，而对于测试化合物的介质为2.89秒。阳性对照吗啡为5mg/kg时增加潜伏时间到7.5秒(与盐水相比p＜0.05，用星号标记在图表中)。测试化合物A在所有从2到10mg kg的测试剂量时都显著地(与介质相比p＜0.05，用星号标记在图表上)增加了潜伏时间，在最大测试剂量处具有7.1秒的最长潜伏时间。当注射90分钟后(图B)进行测定时，吗啡的作用显著地减少且其潜伏时间现在仅仅为3.9秒，几乎倒回到基线，而化合物A和R的作用保持相对稳定。在最佳的测试剂量10mg/kg时，化合物A在注射后90分钟，仍然产生7.3秒的潜伏时间，而化合物R的最大潜伏时间保持高达8.5秒。当基于显示痛觉丧失的动物百分率分析时，结果看上去更为显著。然后我们观察到在注射后90分钟，仅仅大约40％的用5mg/kg吗啡处理的动物仍然显示痛觉丧失，而超过80％的用10mg/kg化合物A处理的动物和100％的用10mg/kg化合物R处理的动物具有超过两倍于介质处理的动物的潜伏时间。甚至注射后330分钟，8和10mg/kg剂量的化合物A痛觉丧失仍然是明显的。化合物R更为显著，100％的用10mg/kg化合物R处理的动物在注射后330分钟仍然显示增加的痛觉丧失，在此时间点绝对的潜伏时间仍然高达6.8秒。4和8mg/kg较低剂量的化合物R仍然两倍于5mg/kg吗啡所产生的痛觉丧失。
有趣的是注意到，化合物A相反的对映异构体，其中其它所有参数与C-5是R的相同，在此实验设置中进行测试，且被证明是无效的。化合物A的(+)对映异构体，即(4R)-4-[4-(1’，1’-二甲基庚基)-2，6-二羟苯基]-6，6-二甲基-2-norpinanone根据Makriyannis及其合作者的方案利用(-)-β-蒎烯作为初始材料进行合成(Drake D.J.等，J.Med.Chem.41：3596-3608，1998)。经i.p.注射4mg/kg的化合物A，(-)对映异构体处理的动物在给药30分钟后显示出潜伏时间增加，为4.9秒，用介质处理的动物为2.8秒，而用4mg/kg的(+)对映异构体处理的动物具有仅仅2.4秒的平均潜伏时间。由(+)和(-)对映异构体得到的结果之间的差异在统计学上是显著的(双尾不成对的t检验，p＝0.04)。此外，化合物A也比其(+)对映异构体对CB2具有更高的选择性，对CB2的IC50低10倍，CB2/CB1比例为约30，而对映异构体仅为10。
对Sprague Dawley雄性大鼠进行类似的研究，其中药物在小鼠模型中通过i.v.注射代替i.p.注射。获得可比较的结果，仅在引发显著增加的潜伏时间所需的剂量(与i.p相比在i.v中更低)，作用的开始(与i.p相比在i.v中更迅速)以及作用的持续时间(与i.p相比在i.v中更短)方面有细微的差别。这些观察与给药途径相一致。在i.p研究中注射后的第一个时间点是30分钟，而i.v注射后其为10分钟，因此在这些实验中，作用的开始时间没有全面地测定。i.v注射后90分钟，100％的用3或4mg/kg的化合物A处理的动物仍然具有超过介质处理的动物两倍的潜伏时间。在最后的测试时间点(注射后330分钟)，几乎70％的用4mg/kg化合物A处理的动物保持增加的对疼痛的抗性。
一旦确定了最佳的剂量，在此单剂量重复实验较长的一段时间以确定止痛作用的持续时间。图9A显示了在5mg/kg的吗啡剂量时，潜伏时间更加快速地回到介质的基准值，且注射后两个半小时吗啡处理的动物的潜伏时间为3.1秒，而用介质处理组为2.6秒，上述显示类似于盐水。这些观察与已知的吗啡短期止痛作用相一致。然而，10mg/kg剂量的化合物A，N，R和Z产生持续的止痛作用直到实验的最后测试时间点。注射5个半小时后，化合物A，N，R和Z处理的动物分别显示出4.9，5.4，6.8和5.2秒的潜伏时间。在此时间点，介质处理的动物具有2.5秒的潜伏时间直到尾部翘起，而吗啡处理的动物被轻微保护，具有3.6秒的潜伏时间。当用显示增加痛觉丧失的动物的数目进行分析时，图9B描述了相同实验的结果。结果显示了相似的模式，其中显示吗啡处理动物中增加的痛觉丧失的动物数目从注射后半小时的88％快速降至处理后5个半小时的17％。在用10mg/kg化合物A处理的组中，以更缓和的速度降低显示痛觉丧失提高的动物的百分比，从研究开始的100％降至5个半小时后的80％，以及对于化合物N和Z而言，从70-90％降至研究结束时的大约60％。在用10mg/kg的化合物R处理的组中获得了最显著的结果，其中100％的动物显示增加对疼痛的抗性，在整个研究期间，用潜伏时间表示是介质的两倍。
从这些结果可知，二环CB2配体具有比吗啡时间延长的止痛作用，且它们可减轻或治疗急性外周疼痛。虽然可与处理的早期相比较，但是在注射后至多90分钟，二环CB2配体在获得的潜伏时间和实现增加潜伏时间的动物的百分比方面都开始开始优于吗啡。应当记住本发明的化合物是CB2选择性的，但其中的一些也的确保留对CB1受体的生理学显著的结合能力。我们不能排除一些观察到的活性是只取决于CB1的激活或与更强的CB2的激活的结合。尽管本发明的一些化合物的残余CB1结合活性，二环CB2配体仍然在副作用，诸如耐受性方面具有显著优于吗啡的优点，这将在下面讨论。
实施例14
炎性疼痛的处理：大鼠的爪浮肿模型。
此研究的目的是测定化合物对在动物后爪注射2％的λ角叉菜胶诱导的爪浮肿的抗炎性疼痛活性。雄性Sprague Dawley大鼠(平均体重200g，Harlan，以色列)在注射期间被放置在干冰上进行短暂镇静。在大鼠的一个(右)爪的足底区皮下注射0.1ml的2％w/vλ角叉菜胶的无菌盐水溶液。因为文献的数据通过我们自己的经验已证实，表明注射0.1ml的生理盐水不影响随后的止痛测定，因此对侧的(左)爪不用注射。测试化合物，包括已知的抗炎性对照，溶于CREMOPHOR EL∶乙醇中，并在角叉菜胶注射后立即进行的i.p注射之前以1∶20或1∶50进一步稀释在无菌盐水中。诱导炎性疼痛前和注射后3小时，在两个系统中测定动物对痛觉刺激的反应。第一刺激是热，并根据Hargreaves的足底实验利用Ugo Basile模型7370进行评价。刻度设定到50个任意单位的强度。对红肿和非红肿后爪记录直到动物举起爪作为对热刺激的反应的潜伏时间。第二刺激是机械的(触觉)，并利用DynamicPlantar Sesthesiomether(Ugo Basile Model 73400-002)进行评价。系统被设置在50克的最大力，且施加的力以10g/秒的速率逐步增加。在研究的结束，用100mg/kg的戊巴比妥对动物实施安乐死。
结果测定成在0小时和3小时的两个后爪之间的差，对研究的热部分中的潜伏时间为ΔLT，而对研究的机械部分的力为Δ力。每一处理组的结果被表示为平均值±SE，且组之间的差别通过方差分析(ANOVA)继之以事后Tukey氏实验进行分析。p＜0.5的值被认为是统计学上显著的。
给药2％λ角叉菜胶诱导爪炎症，通过爪的肿胀和红色表征。炎症诱导后3个小时，未经处理的或仅用介质处理的动物在热刺激后后爪之间显示出大约5到7秒的ΔLT。当该动物用8mg/kg的化合物A(ΔLT＝1.5秒)或10mg/kg的化合物N(ΔLT＝2秒)处理时，这些结果减少了大约3倍，且当动物用10mg/kg化合物R处理时降至ALT＝0秒。在此模型中，5mg/kg吗啡也是有效的且减少ALT到0秒。当施加的刺激是触觉型时，人们观察到引起大鼠举起它们的爪所需的力减少了17(从注射角叉菜胶之前的47g降至3个小时后的30g)。同样该结果在未经处理的和用介质处理的动物中是非常相似的，而8mg/kg的化合物A显著地减少该结果，降至仅仅2g的Δ力，化合物N产生6g的Δ力，化合物R产生4g的Δ力，且化合物Z产生仅仅2g的Δ力，后面的化合物以10mg/kg进行测试。在2mg/kg剂量时，化合物L在未经处理的或介质处理的动物引起Δ力的减少从大约20g降至11g。这些值类似于由1mg/kg的化合物R得到的结果，其被证明在较高的浓度是有效的，然而这种正趋势没有统计学显著性。在此模型中，5mg/kg吗啡也是同样有效的，且减少Δ力到2.7克。
二环CB2配体的抗炎止痛活性不仅与麻醉剂而且与非类固醇抗炎药物(NSAID)进行比较。在此模型中下列三种药物被测试：Celecoxib(COX-2抑制剂)，Ketoprofen(COX-1抑制因子)和DiClofenac(混合的COX-1和COX-2抑制剂)。下列3种剂量的NSAIDS被测试：5，10和20mg/kg，且选择10mg/kg剂量的中间体用于其余的研究。在以10mg/kg剂量腹腔注射时，所有3种药物是非常有效的，且减少ΔLT到0秒，然而这些结果是不显著的，与10mg/kg化合物R的作用相反。当表示为Δ力时，仅仅Diclofenac和Ketoprofen显示的活性分别为2和7g。这些值与A，N，R和Z相比在相同的范围中。
应注意的是，在5mg/kg i.p.注射CB1拮抗剂SR141716A或CB2拮抗剂SR144528的情况下，化合物R也在此实验设置中被测试，在角叉菜胶和化合物前15分钟给药。拮抗剂独自给药没有止痛活性。化合物R抗热和机械刺激的止痛活性不被任何拮抗剂逆转。这些观察可通过拮抗剂没有充分地阻断此特异活性的事实，或一些化合物的活性不通过CB2结合介导而是通过可选择的机制，例如通过结合其它的尚未鉴定的大麻碱受体或通过非受体介导的机制的假说来解释。
总之，这些结果证明了本发明的二环CB2配体是有效的镇痛药，具有类似于或优于吗啡或NSAIDS的活性。这些活性是通过CB2结合还是通过可选择的机制介导的仍有待于确定。市售的上述治疗剂的副作用是众所周知的，因此本发明的化合物可有利地代替它们。
实施例15
外周有害疼痛的处理：福尔马林实验。
通过外周神经系统介导的疼痛，在用于皮肤(外周的)疼痛的“福尔马林试验”中(Tiolson A.等，Pain 51：5-17，1992)进行测试。首先，测试的化合物经i.p.注射。然后在注射该测试化合物后90分钟在小鼠的后爪的趾面s.c注射福尔马林。福尔马林给药后立即通过动物舔注射福尔马林的爪的次数来评价疼痛(每5分钟评价一次，持续1小时)。
实施例16
腺苷酰基环化酶分析。
大麻碱及衍生物结合G蛋白偶联的CB1以及CB2受体，并且通过抑制腺苷酰基环化酶的活性行使它们的活性。通过确定它们抑制或者促进毛喉素-活化的cAMP的产生能力，对腺苷酰基环化酶的分析形成了化合物功能分析的基础。根据Chin等人(Chin，C.N.等，J.Neurochem.70：366-73，1998)进行分析。简要地，用人类CB1或者CB2受体(cDNA)稳定转染的HEK-293人类肾细胞(ATCC#CRL-1573)生长在补充有10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素和2mM L-谷氨酰胺的DMEM中。细胞以5×104细胞/微孔接种在24微孔板中，并培养48小时。然后除去培养基并用PBS清洗粘附细胞。向每个微孔添加补充有0.2mM Ro 20-1724，0.25％BSA以及20mM HEPES的200μl不含血清的培养基。然后在浓度范围从10pM直至1μM的二环测试化合物的存在下用1μM毛喉素活化细胞。然后将活化的细胞培养在37℃20分钟，并加入1.2M HC1到终浓度0.1M以终止反应。通过冻融裂解细胞，并用pH7.5的2M HEPES中和裂解物。利用[3H]-cAMP分析系统(Amersham)测量每份50μl的cAMP。
在这个系统中评价两个参数，观察达到cAMP最大抑制水平50％的剂量(IC50)以及用1μM的测试化合物所达到的抑制水平。必须指出，因为毛喉素通过多种方式活化cAMP的产生，所以只作用于一种受体或者有限量激活途径的化合物一定难以预料100％的总抑制。这个实验首先在CB2受体转染的细胞上进行。在1μM时，确定下列化合物的IC50和％抑制：HU-210作为参考(1.43nM和50％)，化合物A(0.24nM和63％)，L(未确定和33％)，R(0.47nM和64％)，S(0.16nM和58％)以及Y(1.13nM和60％)。对于对照而言，测试化合物也在非转染的HEK-293细胞中进行测试，并在cAMP的水平上没有观察到抑制，这支持了先前描述的结果实际上特异于CB2受体的事实。对CB1结合的IC50为0.328nM的参比化合物HU-210，在CB1转染的细胞中显示对cAMP的IC50为0.35nM，在1μM最大的抑制为73％。同样，化合物A在CB1转染的细胞中显示对抑制毛喉素诱导的cAMP产生的IC50为10.3nM，在1μM时最大抑制为69％。CB1结合化合物A的IC50与28nM的值范围相同。IC50介于结合活性和功能抑制cAMP产生之间的类似性，进一步支持了这个实验设置的相关性。这些结果显示二环CB2配体不仅与受体结合而且引起源于足够受体激活的适当的功能性引发。从这些观察可以推导出本发明的二环CB2配体起对受体激动剂的作用。
另外，稳定表达外源人类CB1或者CB2受体和连接到环-AMP反应元件(CRE)的荧光素酶报告基因的哺乳动物细胞用诸如毛喉素或者钙离子载体的不同刺激物活化。激活后，提取细胞并通过荧光素酶分析按照发光单位测量报告基因的活性。环状-AMP的水平通过荧光素酶活性的增加得以反映。
实施例17
化合物模拟精神病的作用。
雄性ICR小鼠(平均体重25g，Harlan，Israel)用于一系列影响精神作用的试验，具体地为运动活性和直肠温度。在适当的时候，测试化合物、已知的和特异性CB1和CB2拮抗剂溶于稀释在盐水中的介质中，并且以直至3mg/kg i.v.的剂量i.p.或者i.v.注射，所述体积不超过0.05ml/10g体重的小鼠。首次用于实验的小鼠作为对照。每个处理组由至少6只动物组成。
i.v.给药处理后5分钟或者i.p.注射后30分钟将动物置于露地(60×50cm)。利用基于计算机系统(ViewPoint，France)的录象记录它们的运动活性。记录下列参数3分钟：总距离，时间和动物移动的速度。在露地检查结束时，利用恒温温度计(Cole Parker型8402-00)和恒温探针(YSI 400型号402)监控另一参数直肠体温。
结果表示为平均值±SE，介质和处理之间的差异通过ANOVA继之以事后Tukey氏试验进行比较。p＜0.05的值被认为是统计学上显著的。
就动物移动的总距离而言，观察处理组之间的波动。i.v.注射介质的动物在3分钟随访期间移动1000cm。施用0.1，0.5和1mg/kg化合物A的动物显示增强的运动活性，总距离在1300和1400cm之间。这个增强统计上是不显著的。施用1，2，3，4，5和6mg/kg化合物R的动物同样显示所行总距离的波动，并且这种现象没有统计显著性。同样，介质处理动物的平均速度是5.9秒/cm，而用0.1，0.5和1mg/kg化合物Ai.v.处理的动物的移动速度稍有增加，达7到7.2秒/cm。用1，2，3，4，5和6mg/kg化合物R处理的动物以从4到8秒/cm的速度以剂量依赖的方式移动。这些速度差异在任一方向都不是统计上显著的。最后，介质处理动物的平均直肠体温是38.4℃。化合物A和R诱导适中约2℃的低温症，这在统计学上是显著的，但是在没有严格生理意义的范围内。利用i.p.给药途径反复进行这些实验，并且产生类似的观察。两种给药途径之间的唯一差异是i.p.注射的试验剂量约为更高的数量级，测试化合物A直至30mg/kg i.p.，而测试化合物R直至40mg/kg。
虽然化合物A和R显示一些适中的副作用，但是这些现象只在剂量远远超过它们的有效剂量至少6-8倍时观察到，并且小鼠全部对化合物耐受性良好。没有观察到死亡，因此最大耐受剂量远远超过40mg/kg i.p。注射后在非常短的周期内监控二环CB2配体的行为作用并且被证明是不仅适中而且是瞬时的，因为注射后24小时所有动物都恢复到基线行为。应该记住本发明的化合物优选地结合CB2受体，但是有些化合物保持对CB1受体的结合能力，所述CB1受体已知介导这种副作用。关于这点，应注意到化合物A和R结合CB1受体，IC50为约30-40nM。因此可以假定以最低亲合性结合CB1受体的化合物，表达为置换高于40nM的IC50值，甚至会更安全。
测试化合物对全部运动能力的作用在第二实验设置中进行评定，其中如Rozas等人所述(Rozas G.等人，J.of Neuroscience Methods 83：165-75，1998)利用rotarod装置进行动物的功能试验。开始实验前4天训练动物雄性ICR小鼠(平均体重40g，Harlan，Israel)。它们的任务是停留在加速竿上不落下12分钟(每个速度3分钟)。试验速度为：15，19，23和27rpm。对竿上的动物表现记分如下：每个动物以每个速度可以获得在竿上完全行走的3个点(每分钟1点)的最大值。因此，动物可以得到12点的满分(每个速度3点)。对动物围着的每3周来说，抓住竿的环绕横梁没有移动减去0.5点。前3周不影响记分。适当训练后，每组至少6只动物i.p.施用各种剂量的测试化合物和对照，体积剂量为5ml/kg。注射化合物前零时间以及施用化合物或者介质后30分钟，3和24小时在rotarod装置中确定记分。
结果表示为平均值±SD，介质和处理之间的差异通过ANOVA继之以事后Tukey氏检验进行比较。p＜0.05的值被认为是统计学上显著的。在所有时间点，介质处理的动物显示最高分12，因为无论如何它们的运动能力不受影响。用10mg/kg化合物A处理的动物显示统计上是显著的，但是注射后三十分钟运动活性瞬时降低，平均分为5.6。以后时点这种效果消失，在3和24小时平均分分别为9.7以及11.9。在第一个半小时观察到的这种瞬时作用可能由于CB1结合化合物A的能力，这暗示与CB1受体以最低亲合性结合的化合物甚至会更安全。基于这些结果，在注射后至少半小时的时间点，测试化合物以保证观察到的作用如果存在的话可以最低限度受到剩余CB1结合能力的影响。
实施例18
化合物对心血管系统的作用。
这个研究的目的是评价测试化合物对雄性Sprague Dawley大鼠(270-350g，Harlan，Israel)的安全性。测试化合物溶于介质中，以1∶20稀释在无菌盐水中，并i.v.或者i.p.注射，i.v.给药的剂量范围从0.1到2mg/kg，或者i.p.给药的剂量范围为10到40mg/kg，体积为每100g体重0.5ml。每个处理组由至少6只动物组成。氟烷麻醉(诱导4％并维持)的条件下将一套管(PE 50，Clay Adams，USA)植入股动脉。将导管插入静脉用于药物给药。动脉插管附着于压力传感器(Ohmeda DT-XX USA)。转换器连接一数据收集系统(Biopac，USA)。在处理之前记录心率(HR)、平均动脉血压(MABP)和心电图(ECG铅2)20分钟用于确立稳定的基线，直至注射测试化合物后60分钟。通过一直肠热敏探示器(YSI模型400，USA)将动物也连接到温度记录器，并在研究期间监控直肠温度。研究结束时，通过i.p.注射100mg/kg的戊巴比妥钠处死动物。
介质和处理之间的差异通过单向ANOVA继之以事后Newman-Keuls检验(Prism软件，获自Graphpad，San Diego)进行比较。p＜0.05的值被认为是统计学上显著的。
介质处理的动物血压值没有表现出变化。在约100mmHg的平均值时，MABP保持稳定。化合物A诱导剂量相关的瞬时压力过低。在最低i.v.试验剂量，0.1mg/kg注射后5分钟只引起4mmHg的降低，在以后的时间点(15，30，45和60分钟)处理动物的MABP恢复到基线。在化合物A的中间剂量0.5mg/kg，在5分钟MABP减少约25mmHg，注射后30分钟逐渐升高回到基线范围，在最高剂量1mg/kg下，5分钟时的MABP减少约30mmHg，注射后45分钟逐渐升高回到基线范围。1mg/kg剂量的化合物R获得类似的结果。当i.p.注射时，在直至30mg/kg的剂量时化合物A引起不超过15mmHg适中的血压过低，而在40mg/kg剂量时化合物R引起至多36mmHg的降低。没有一个试验剂量是血压过低致死的，而且在化合物A和R的最高剂量至多45分钟期间这个现象是瞬时的。如果血压过低表现为MABP减少超过50％或者表现为效应延长，则该测试化合物的安全性可能受到质疑。
介质处理动物的心率显示出与稳定的基准值约每分钟350次具有非常类似的模式，而0.1mg/kg的化合物A引起HR轻微和瞬时的降低，而更高剂量引起HR更清晰并且更延长的降低。HR的最大下降为约每分钟80次并且不持续超过15分钟，注射后最多45分钟内恢复到正常基准值。此外，当i.p.注射化合物时，化合物A高达20mg/kg的剂量和化合物R高达40mg/kg的剂量几乎对HR没有影响。在1小时随访(从基线5％)的时间内，20mg/kg的化合物A只引起每分钟约17次的微小降低，而40mg/kg的化合物R引起10％幅度的微小波动，结果平均只降低每分钟约4次。相比而言，介质处理的动物在HR上也显示约17次/分钟的微小降低，与基线相比降低5％。如果对心率的影响表现为每分钟脉搏的数目减少超过50％或者表现为效应延长，则该测试化合物的安全性可能受到质疑。
在这个研究期间没有达到最大耐受剂量，并且可以假定经i.p.给药途径，这个值比至少40mg/kg更高。根据使用的模型以及试验的症状，本发明的化合物在mg/kg的剂量范围内显示出治疗上显著的活性(从约0.1直至10mg/kg)。因此治疗范围大大低于尚未确认的毒性范围，该毒性范围至少高出4倍。例如在EAE中，1mg/kg i.p.化合物A引起临床记分AUC显著减少35％，在这种情况下治疗指数至少为40，而在爪浮肿的情况下，i.p.0.5mg/kg的化合物R引起爪厚度减少31％，在这种情况下治疗指数至少为80。应该记住在这些模型中，测试化合物的结果可与市售药物的活性相比较。总而言之，这些结果支持本发明的二环CB2配体对治疗很宽范围的疾病和紊乱都是安全的，并且是有效的替代物。
实施例19
反复施用化合物对耐受进展的影响。
当利用吗啡处置严重疼痛状况时，医学团体遇到的主要问题之一是随时间病人形成对药物的耐受的事实。为了保持止痛活性，首先可以逐渐增加吗啡的剂量，但是长期使用将达到饱和点，药物将不再减轻疼痛。也可能形成大麻碱对CB1受体的选择性耐受。上述实施例17和18所述的研究已经证实，一些二环CB2配体的剩余CB1结合力没有引起严重的和延长的副作用，并且全部耐受性良好。对于进一步加强本发明化合物的安全特性，测试了它们诱导耐受的能力。
在上述的尾部翘起模型中评价耐受性。简要地，每日二次给每个10只动物的组i.p.施用测试化合物直至10天。如先前实施例13所述，在第1，4，8和10天第一次给药后30分钟测定有害疼痛阈。结果表示为直到动物翘起其尾部的平均潜伏时间±SE。潜伏时间或者各种处理组中显示痛觉消失的动物的％之间的差异通过方差分析(ANOVA)继之以事后Tukey氏试验(对于潜伏时间)或者Fisher氏精确试验(对于％动物)进行分析。p＜0.05的值被认为是统计学上显著的。
结果描述在图10中，其中图A显示了与吗啡相比化合物A对潜伏时间的影响，而图B显示了对显示痛觉消失增加的动物％的影响。每日施用5mg/kg吗啡两次，共10天，引起处理动物所期望的耐受性发展，表现为在整个研究期间潜伏时间和痛觉消失增加动物的百分比均逐渐降低。在第1天潜伏时间为7.5秒，在第10天潜伏时间仅仅为5.8秒，而在第1天显示痛觉消失增加的动物的％为80％，而在第10天仅仅为30％。另一方面，每日两次注射10mg/kg的化合物A对这些参数没有显著的影响，意思指20次以先前证明治疗有效的剂量施用化合物A不引起耐受性的发展。具体地，用10mg/kg化合物A处理的动物在第1天观察到的潜伏时间为8.1秒，而在第10天潜伏时间仍然高达7秒，而在第1天显示痛觉消失增加的动物为88％，而在第10天仍然为80％。而且，应该注意到在第10天评价直肠体温，并且发现两个处理组都在正常范围内。总而言之，这些研究证实不仅本发明的化合物比吗啡在止痛中更有效，而且它们也更安全，因为它们不诱导耐受性。
实施例20
I型糖尿病：NOD小鼠模型。在非肥胖糖尿病(NOD)小鼠模型中，测试实验设置中与人类胰岛素-依赖的糖尿病有关的二环结合化合物的预防活性。
在第1天称重NOD/lt雌性小鼠(研究开始时，70-80天龄，Harlan，Israel)。利用通过切断尾部的顶端获得的一滴血液和具有合适的glucosticks的糖度计(Elite，Bayer)确定它们的基线葡萄糖水平。然后以300mg/kg剂量i.p.注射小鼠稀释在盐水中的环磷酰胺(Sigma)。每隔一天利用尿multisticks(Bayer)监控动物尿液中葡萄糖的存在。当试验显示动物达到葡萄糖尿时，过夜饥饿后连续两天再评价血液中葡萄糖的水平。如果它们的葡萄糖血液水平高于300mg/dl，动物被确诊为患糖尿病。糖尿病诊断后3天，通过i.p.注射戊巴比妥钠100mg/kg处死动物。取出它们的脾和胰腺进行进一步研究，包括FACS分析脾中的T细胞亚群以及胰腺的组织和免疫病理学评估。
对每个动物在10个Langerhans胰岛上进行组织病理学评估，并根据下列方法记分(Sempe P.等人，Eur.J.Immunol.21：1163，1991)。根据单核细胞浸润的水平对损伤的严重性记分：0-没有浸润，1-小导管周围浸润，2-胰岛周围浸润，3-胰岛内浸润，4-与β细胞破裂相关的胰岛内浸润。每个动物的胰腺平均分数通过总分除以检查的胰岛数进行计算。
实施例21
肾缺血。
在大鼠的急性肾缺血模型中测试二环CB2结合化合物的肾预防活性。
用分别为8和35mg/kg的甲苯噻嗪和戊巴比妥的组合i.p.注射麻醉雄性Sprague Dawley大鼠(平均体重250g，Harlan，以色列)。然后在两个肾上双侧诱导45-分钟的局部缺血。服镇静剂的动物仰卧放置。给腹部皮肤剃毛并用70％乙醇消毒。进行中线皮肤切口(2-3厘米长)，并通过切割腹白线打开腹部。轻轻地将肠移动到反方向后仔细研究肾。当进行这些工作时，用湿(温盐水37℃)无菌海绵覆盖肠。通过从周围脂肪钝器解剖分离肾动脉，并用动脉用微镊子(FST加拿大)在肾门与肾静脉一起封闭。动脉封闭后迅即变苍白的肾被认为是缺血性的。只有两个肾都显示缺血的动物才包括在研究中。在缺血性损伤期间将肠返回腹腔内。用湿海锦(它们通过冲冼温盐水保持潮湿)覆盖伤口。另外，监视直肠温度保持在37℃-38℃之间。利用热敏电阻(YSI USA型号400)和计量装置(Cole Farmer型号8402-00)测量直肠温度。
局部缺血开始后四十五分钟，除去动脉钳。通过肾恢复粉红色验证再灌注。然后用3-0丝缝线材料(Assut，瑞士)封闭伤口两层(腹腔壁和皮肤)。缺血性损伤后第1，3和7天，在麻醉室中用乙醚轻微麻醉动物，并在低眼眶凹处穿刺后收集血样。血液收集在微量离心管中并离心(4000rpm，5分钟)。然后分离血清并在评估肌酐和血液尿素氮(BUN)的血液水平前保藏在-20℃。研究结束时，i.p.注射100mg/kg的戊巴比妥钠使动物安乐死。取出肾，称重并保藏在4％甲醛溶液中用于其它可能的用途。
缺血性损伤的结束后迅即对每组10只动物以5ml/kg剂量i.v.施用处理物到股静脉中。结果与缺血性(介质处理的)和伪品(相同的方法，没有肾动脉封闭)相比。利用方差比较(ANOVA)继之以Duncan氏post-hoc检验比较BUN和肌酐的血液水平。
实施例22
用于测量心脏保护的Langendorff灌注模型。
最近内源性大麻碱被证明参与LPS抗心肌缺血的心脏保护效应(Lagneux，C.& Lamontagne，D.，Br.J.Pharmacol.132：793-6，2001)。在分离灌注的大鼠心脏的Langendorff模型中检验新二环化合物的心脏保护效应。遵照实验动物的管理和使用的NIH指南(NIH公布No.85-23，修订版1996)称重280±20g的雄性Sprague-Dawley大鼠用于灌注实验。给动物腹腔内注射肝素钠(500U)并用戊巴比妥(30mg/动物)麻醉。迅即取出心脏并放入肝素化的冰冷盐溶液中。将主动脉通过导管插入Langendorff灌注器，并切开肺动脉以提供流出物的自由排放。用改性的Krebs-Henseleit(KH)溶液保持逆行主动脉灌注。用95％氧和5％二氧化碳的混合物对KH充气。保持主动脉灌注在37℃，90cmH2O的恒定压力下。
正常体温的短期局部缺血。
心脏经历20min的KH灌注，25分钟的不流动性全身局部缺血(在37℃)，以及45分钟的KH再灌注。这已经显示降低工作指标(LVDPxHR)恢复到约40％，通过药物可能得以改善。在预缺血性灌注、再灌注或者二者期间添加不同浓度的化合物。
血液动力学测量。
将一顶端带胶乳球的导管插入左侧心房的一小切口并穿过二尖瓣推进到左侧心室。该球通过一压力转换器与记录系统(Hewlett Packard7758B，USA)相连。使球充气并平衡到产生0mm Hg的末端舒张压。在收缩(+dP/dt)和松弛(-dP/dt)期间，测量左心室的心脏收缩压和舒张压以及压力延续的时间。由心脏收缩压和舒张压之间的差异计算左心室的展开压力(LVDP)。由LVDP的积和心率(HR)计算心脏的工作指标(LVDPxHR)。在预缺血期间和再灌注过程中通过收集从肺动脉流出的流出物测量冠脉血流量(CF)。如果发生心律不齐，形成血栓，或者前20分钟的灌注后LVDP以及心率分别小于60mm Hg和210次/分钟，从研究中排除所述的心脏。
结果表示为平均值±SEM。心脏组之间统计学上的差异利用ANOVA以及Mann-Whitney秩检验进行计算。p＜0.05被认为是统计学上显著的。
实施例23
化合物对肿瘤细胞系和肿瘤的作用。体外。在存在我们的测试化合物的条件下，测试几个衍生自肿瘤的细胞系的细胞增殖能力。肿瘤细胞系获自ATCC，并根据供应商的说明书培养。细胞接种在24微孔板(105细胞/ml/微孔)并培养过夜。用测试化合物(1-100μM)或者介质(0.1％DMSO终浓度)培养细胞。24小时以后利用标准结晶紫染色确定细胞的存活力。除去微孔的培养基并通过添加1ml/微孔的2％甲醛的PBS溶液固定10分钟。细胞固定后，用PBS洗涤细胞3次，并给每个微孔添加250μl的0.5％(W/V)结晶紫，以及在室温下轻轻搅拌培养板30分钟。然后用重蒸馏水洗涤染色的细胞3次，并通过向每个微孔添加250μl的10％乙酸提取颜色。在室温下搅动板15分钟，一式两份转移100μl到96微孔板中用于读数。在620nm处用ELISA读数器测量细胞的光密度(OD)，结果表示为活细胞％。未经处理的细胞的吸光度记录为100％。确定IC50(剂量抑制细胞生长50％)。
此外，染色细胞的活化半胱氨酸蛋白酶3(caspase 3)以确定它们是否通过细胞程序性死亡机制死亡。弃去微孔的培养基并通过添加1ml的4％甲醛的PBS溶液固定10分钟。细胞用PBS-0.1％Tween20(PBS-T)洗涤两次并用冷甲醇渗透20分钟。细胞用PBS-T洗涤两次，并与1ml封闭溶液(3％BSA，PBS-T)温育30分钟。添加初级抗体(兔抗切割的半胱氨酸蛋白酶3(asp175)细胞信号传导技术，用封闭溶液1∶50稀释)，并在37℃培养细胞60分钟。用PBS-T洗涤细胞两次。向微孔添加二级抗体(HRP共轭的抗兔IgG，用封闭溶液以1∶200稀释)并在室温下培养60分钟。用PBS-T洗涤细胞两次，并与荧光素酪酰胺试剂(NEN，用扩增稀释剂稀释1∶50)培养10分钟。用PBS-T洗涤细胞两次，并通过荧光或者共焦显微镜观察信号。除监控活化的caspase-3之外，将用dexanabinol及其类似物处理的细胞与未经处理的细胞比较细胞程序性死亡相关基因的表达。如前所述进行实时RT-PCR。用于每个基因而言，设计一对特异性PCR引物，并根据ABI方案进行反应。每个基因表达的定量分析水平规格化到管家基因，并与来自未处理细胞的RNA样品相比较。
体内。一旦我们已经选择了其增殖通过二环CB2结合测试化合物体外抑制的肿瘤细胞系，我们就测试其体内的效力。根据供应商的说明书培养细胞。在裸CD-1雄性小鼠(平均体重20-25g，Harlan，Israel)的右股骨关节以上s.c.注射预定量(每动物0.12ml恒定体积的1×106细胞)。每个处理组由至少7只动物组成。每日临床监控每只动物。在每日访问期间也监控肿瘤的生长但是每周一次记录实际的测量。当肿瘤达到合适的大小时，用介质，5ml/kg/天或者用我们的测试化合物在2.5到10mg/kg/天的剂量范围内处理动物。
实施例24
化合物在炎性肠病模型中的作用。
在大鼠乙酸诱导的IBD掩蔽研究中测试二环CB2结合化合物的抗炎活性。
通过i.p.注射克他命∶rompun组合(分别为100∶10mg/kg)，轻微麻醉雄性Sprague Dawley大鼠(10周龄，200-250g，Harlan，Israel)。将聚乙烯导管(外径1.7mm)插入直肠5cm进入结肠内。然后慢慢地将2ml的5％乙酸施用到结肠内。15秒后，用3ml盐水清洗结肠，15秒以后用另外的3ml盐水洗涤。其后迅即，用任一种合适的处理物处理每个动物组。所有的处理物每天施用一次，共7天。临床跟踪动物1周。在这期间，每日监控并记录下列参数：体重、粪便中血液的存在以及粪便的稠度。这些发现根据表1进行记分。
表1：IBD疾病活性指数(DAI#)的记分标准(Murthy S.N.等，Dig.Dis.Sci.38：1722-34，1993)。 记分 重量损失(％) 粪便的稠度* 潜血或者总的出血 0 无 正常 阴性 1 1-5 疏松的粪便 阴性 2 5-10 疏松的粪便 潜血阳性 3 10-15 腹泻 潜血阳性 4 ＞15 腹泻 总的出血
#DAI-(重量损失，粪便稠度以及出血的组合记分)/3。
*正常的粪便-形成良好的小球；稀粪-苍白粪便不粘住肛门；以及腹泻-液体粪便粘住肛门。
诱导动物疾病后7天用戊巴比妥100mg/kg i.p.处死动物。切除全部结肠，纵向切开并在放大镜下检验，记录所有明显的损伤并根据表2记分。
表2：评价IBD严重性的总的病理学记分方法(Wong等，J.Pharm.Exp.Ther.274：475-80，1995)。 记分 病理学 0 没有损伤 1 局部充血和/或浮肿 2 2或者位点的充血和/或浮肿 3 局部糜烂 4 局部溃疡 5 1个以上位点糜烂/或者溃疡，或者沿着结肠 的长度1个糜烂位点或者溃疡延伸＞2cm
利用方差分析(ANOVA)继之以post-hoc试验分析临床结果。非参数检验(Wilcoxon秩和检验)用于评价总的病理学发现。
制剂实施例
用于复溶的冻干粉末。如上所述，一些本发明的化合物高度亲脂，计算的LogP高于5，使它们十分不溶于水。虽然这些化合物可以配制在多种组合物中，使所述组合物具有它们的亲脂性，但是已经使用了基于母体化合物化学修饰的方法以改善水溶性从而扩大制剂的范围以及适合于所述化合物的给药途径。一种这样的例子为化合物R，其是化合物A的半琥珀酸酯衍生物。这个酯化步骤显著提高了pH7时化合物计算的logD。化合物A具有6.21的logD，虽然其半琥珀酸酯衍生物化合物R只有3.76的logD(利用ACD软件计算)。根据水溶性，这指的是在中性pH时，化合物A预计溶于水，浓度为7.6×10-5g/l，而化合物R预计可溶解至0.024g/l。提高的溶解性打开了替代制剂，诸如制备用于复溶的冻干粉末。
30毫克的化合物R溶于0.3ml的叔丁醇中。为了获得最终5mg/ml的药物浓度，添加6ml的磷酸盐缓冲液(NaH2PO4以及Na2HPO4，pH7.8，80mM)。然后添加150mg的乳糖获得最终25mg/ml的乳糖浓度。随着化合物的溶解，溶液的pH趋向降低，并且利用0.2N的NaOH再调整到pH7.8。所得溶液冷冻干燥过夜获得冻干粉末。化合物R的冻干粉末随后用水重新溶解获得约5mg/ml终浓度范围的酯衍生物的透明溶液，所述终浓度与最初的76ng/ml化合物A母体药物相比溶解性意外的显著增加。也制备除了磷酸盐缓冲液以外还包含浓度为9mg/ml的苯甲醇的相同制剂。可以添加5％的蔗糖或者5％的甘露糖醇，或者2％的甘油，或者5％的葡聚糖，或者直至5％，优选地1-2.5％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K-30或者PVP K-10代替乳糖作为稀释剂以及冷冻干燥过程中的防冻剂。用无菌水重新溶解冻干化合物R用于冲洗，并且如HPLC所监控，显示至少稳定长达2小时。在这期间高达14％的化合物R水解成母体化合物A。如上所述，当配制在CREMOPHOREL∶乙醇时，化合物R具有生物学活性。初步研究显示重新溶解的冻干化合物R也实现了化合物的治疗目标。例如，配制在助溶剂中的化合物R在大约1μM/kg时使爪浮肿程度最大减少31％，而重新溶解的冻干化合物R在约0.5μM/kg时相同的模型中使爪浮肿减少29.5％。这个研究结果表明本发明的化合物可以制备成药用盐或者酯衍生物，从而使得各种剂型的制备以及通过各种途径施用这种化合物处理由上述模型所引发的疾病成为可能。
虽然本发明仅仅为了说明目的提出各种不同的具体实施方案而已加以描述，但是这种具体公开的实施方案不应该理解为限制性的。根据申请人在这里的公开内容，本领域技术人员可以得出很多其它这样的实施方案，并且申请人认为本发明的实质和范围仅受所附权利要求书的限制。