神经生长因子（NGF）脂质体.pdf

该发明提出了神经生长因子(NGF)脂质体新剂型，属于药学中蛋白多肽类药物新剂型领域。其结构见附图1，磷脂在水中分散得单层或多层微囊，水溶性药物NGF包载在脂质体微囊内水相中。NGF脂质体材料组成主要为磷脂，胆固醇，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇(2000)(DSPE－PEG－2000)和NGF。采用逆相蒸发法经处方优选后能得到34％以上包封率的NGF脂质体。发现了NGF脂质体较NGF有更好的体内稳定性，体内半衰期延长了约4倍；发现NGF脂质体鼻腔给药后较NGF有更高的脑组织药物浓度(附图2)，而且能明显提高老年痴呆大鼠的认知记忆能力。NGF脂质体鼻腔给药最佳制剂剂型为NGF脂质体凝胶喷雾剂。

1.  一种药物组合物，其特征在于该药物组合物含有脂质体微囊和包裹于其中的神经生长因子，神经生长因子与脂质体微囊的重量比为1∶50～1∶200。

2.  如权利要求1所述的药物组合物，其中所述的脂质体微囊含有磷脂，胆固醇以及二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇形成的复合物。

3.  如权利要求3所述的药物组合物，其中所述的磷脂选自大豆卵磷脂，蛋黄卵磷脂，二硬脂酰磷脂酰胆碱，棕榈酰磷脂酰胆碱，磷脂酰丝氨酸，磷脂酸，氢化卵磷脂。

4.  如权利要求2所述的药物组合物，所述的磷脂为大豆卵磷脂，所述的聚乙二醇为聚乙二醇2000。

5.  如权利要求4所述的药物组合物，所述的脂质体微囊中磷脂和胆固醇的重量比为1∶1～1∶5，磷脂与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇所形成的复合物重量比为4∶1～40∶1。

6.  如权利要求1所述的药物组合物，该组合物是凝胶剂、喷雾剂、溶液剂、混悬剂，粉针剂。

7.  如权利要求6所述的药物组合物，该组合物是凝胶喷雾剂。

8.  如权利要求7所述的药物组合物，其中所述的喷雾剂还含有酶抑制剂，增稠剂，防腐剂，支持剂。其中所述的酶抑制剂选自杆菌肽；所述防腐剂选自苯扎溴铵，EDTA；所述增稠剂选自羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，卡波普；所述的支持剂选自甘露醇和人血蛋白。

9.  权利要求8的药物组合物，其中所述的酶抑制剂为杆菌肽；所述防腐剂为苯扎溴铵，；所述增稠剂为羟丙基甲基纤维素。
10制备如权利要求1所述药物组合物的方法，该方法选自逆向蒸发法，复乳法，冻融法，钙诱导融合法。
11如权利要求10所述的方法，其特征在于该方法为逆向蒸发法，该方法的具体步骤如下：将大豆卵磷脂SPC，胆固醇CHol和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇用合适的油相溶解后，加入适量神经生长因子，涡旋振荡后超声1～2min使其形成均匀的W/O型乳液，25～30℃下减压蒸发至形成凝胶态物质后，继续旋转蒸发10～20min。然后补充一定量的生理盐水使其水化，分散成均匀的脂质体混悬液。然后冷冻高速离心即得。
12如权利要求1所述的药物组合物在制备治疗中枢神经系统疾病的药物中的用途。
13如权利要求12所述的用途，其中该药物用于治疗老年性痴呆。

神经生长因子(NGF)脂质体
技术领域  该发明提出了用脂质体包载神经生长因子(NGF)的理念以及NGF脂质体制剂的制备工艺和鼻腔给药治疗中枢神经系统疾病的可行性，属于药学中蛋白多肽类药物技术领域。
背景技术  神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是人体神经系统最重要的生物活性分子之一，兼有促神经突起生长和营养神经的双重作用，是迄今发现的唯一一个能对中枢神经系统和周围神经系统损伤有修复作用的生物活性物质[1]。2001年注射用NGF在我国获得国家医药监督管理局颁发的国家一类生物制品新药证书，这是世界上第一个批准生产上市的NGF制剂。目前使用的NGF为肌肉注射冻干粉制剂，制剂中主要是2.5s NGF，加入5％甘露醇和0.1％人血蛋白作保护剂。它的适应症为正已烷中毒性周围神经病，主要用于治疗由于外伤引起的神经损伤，视神经病变，多发性神经炎、带状疱疹、面神经麻痹等[2]。除此之外，NGF对中枢神经胆碱能神经元也具有良好的保护和修复作用，但由于NGF不易通过血脑屏障，目前治疗中枢神经系统疾病还仅限于脑室直接给药。曾有研究表明，给阿尔茨海默氏病人脑室直接注射NGF，可明显缓解病人的认知记忆障碍[3]，然而这种给药方式易引起损伤和感染，给临床应用带来了诸多不便，限制了其在中枢神经系统的应用。随着我国人口老龄化比率的上升，退行性神经病变的发病几率呈上升趋势，消费人群有可能进一步扩大，市场容量也将增大，因此研制NGF在脑内中枢神经系统应用的合适制剂和给药方式势在必行。
解剖学研究证明在鼻腔和颅腔之间存在着嗅粘膜上皮通路和嗅神经通路，为大分子药物经鼻腔给药直接入脑提供了途径[4]。实验证明那些位于中枢神经系统，且疗效与脑功能有关的药物比如用于帕金森，阿尔茨海默氏病或疼痛的药物，尤其在常规给药途径下脑内浓度极低的药物，经鼻粘膜递送入脑给药途径具有很大的优势。Frey[5]等最早研究了NGF鼻腔给药，结果显示¹²⁵I标记的NGF在鼻腔给药后20min即在嗅球中出现，脑内其他部位也有分布，但量较少。分析其原因，可能由于其易被鼻腔内存在的蛋白水解酶和氨肽酶所降解，以及易被鼻纤毛清除造成了药物浓度降低。为解决此问题，可以采用合适的酶抑制剂，增稠剂和用药物载体(如脂质体，脂质体为磷脂在水中分散而得，其在结构上为单层或多层泡囊。而且脂质体具有生物相容性和生物可降解性，是目前良好的药物载体[6])包载的方法增加NGF的稳定性，进而增加其脑组织药物摄入量，实现较好的疗效。
因此为解决NGF在体内稳定性以及开拓其在中枢神经系统的应用范围，本发明采用脂质体包载NGF，并研制了NGF脂质体制备工艺以及对NGF脂质体鼻腔给药制剂——凝胶喷雾剂进行处方优选；经动物实验研究发现NGF脂质体血管给药后较NGF有更长的体内半衰期，鼻腔给药后在大鼠脑组织的分布以及药效学均好于游离的NGF。说明NGF脂质体在临床上较NGF具有更广阔的应用前景。经文献检索，目前没有NGF脂质体的研究报道。
发明内容
1.该发明的创新点之一是提出用脂质体包载神经生长因子(NGF)。
神经生长因子(NGF)为蛋白多肽类药物，生物活性高，用量少，在体内半衰期短，容易被酶所降解。采用脂质体包载NGF可以避免NGF被体内酶所降解，提高其稳定性，延长其体内半衰期。NGF用脂质体包载的特征为脂质体为磷脂在水中分散而得，其在结构上为单层或多层泡囊。水溶性药物NGF包载在脂质体内水相中(见附图1)。脂质体与由表面活性剂构成的胶团不同，其在体液中被稀释时，不会因浓度降低而破裂，具有较好的保护包载的NGF生物活性的能力。磷脂是生物膜的组成成分，具有生物降解性和生物相容性，因此脂质体是NGF一个良好的药物载体。
2.该发明的创新点之二在于NGF脂质体的制备工艺。
制备脂质体的材料主要是磷脂和胆固醇。磷脂可以采用天然大豆磷脂(主要成分为磷脂酰胆碱)，蛋黄卵磷脂以及二硬脂酰磷脂酰胆碱，棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，磷脂酰丝氨酸，磷脂酸，氢化卵磷脂等。这里优选天然大豆卵磷脂(纯度＞95％)。
制备NGF脂质体的方法有逆向蒸发法，复乳法，冻融法，钙诱导融合法，注入法等。优选逆向蒸发法。大豆卵磷脂SPC，胆固醇CHol和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(2000)(DSPE-PEG-2000)，用合适的油相溶解后，加入适量NGF，涡旋振荡后超声1～2min使其形成均匀的W/O型乳液，25～30℃下减压蒸发至形成凝胶态物质后，继续旋转蒸发10～20min。然后补充一定量的生理盐水使其水化，分散成均匀的脂质体混悬液。制备的NGF脂质体特征为透明液体，具有蓝色乳光，平均粒径小于100nm。
NGF脂质体制备工艺处方中加入DSPE-PEG-2000有利于脂质体在水相中的分散，旋转蒸发一般不高于37℃，超声时间不超过2min，有利于保护NGF生物活性。
利用冷冻高速离心法进一步提高NGF脂质体包封率。将制备的NGF脂质体在-10～4℃下10000～40000rpm离心10～30min，除部分上清，可提高NGF脂质体包封率。
上述NGF脂质体制备工艺未见报道。在脂质体制备工艺中，DSPE-PEG-2000的加入以及用冷冻高速离心提高蛋白多肽类药物包封率属于方法创新。
3.该发明的创新点之三在于发现NGF脂质体较NGF具有更好的体内稳定性。
NGF为蛋白多肽类药物，在体内半衰期短，容易被酶所降解。NGF静脉给药后在体内的半衰期约为9分钟，用长循环脂质体包载NGF经大鼠股静脉给药后，体内半衰期延长至35分钟，约提高了4倍，体现了其在临床应用上的优越性。
4.该发明的创新点之五在于发现NGF脂质体鼻腔给药在治疗中枢神经系统疾病方面较游离的NGF有更好的优势。
由于NGF难以通过血脑屏障，长期以来限制了其在中枢神经系统方面的应用。NGF鼻腔给药后能增加药物在脑组织的分布，但效果并非最佳。用脂质体包载NGF后，鼻腔给药，能明显增加NGF在大鼠脑组织的药物浓度。经给阿尔茨海默氏病大鼠治疗后发现，NGF脂质体鼻腔给药较NGF能明显提高大鼠的认知记忆能力，具有良好的保护和修复受损胆碱能神经元的功能。NGF脂质体鼻腔给药有望治疗中枢神经系统疾病。
5.该发明的创新点之四在于提出NGF脂质体鼻腔给药凝胶喷雾剂处方。
NGF脂质体鼻腔给药制剂最佳为凝胶喷雾剂。处方在NGF脂质体的基础上，添加了酶抑制剂，抗菌剂，增稠剂以及冻干支持剂等。这种鼻腔给药制剂先制作成冻干粉，临用前用蒸馏水分散后，即可使用。由于NGF是高活性蛋白多肽，制成冻干粉有利于保持其生物活性。凝胶喷雾剂制作简单，使用方便，处方中加入凝胶基质能够降低鼻纤毛的清除率，延长药物在鼻腔内的滞留时间，使药物在鼻腔内能够长时间保持药物浓度，制成喷雾剂能尽可能增加药物在鼻腔内的分散吸收面积，使药物吸收效果最好。
具体实施方式
实施例1 NGF脂质体制备工艺
按优化处方取适量大豆卵磷脂SPC，胆固醇CHol和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(2000)(DSPE-PEG-2000)，用合适的油相溶解后，加入适量NGF，涡旋振荡后超声1min使其形成均匀的W/O型乳液，28℃下减压蒸发至形成凝胶态物质后，继续旋转蒸发10min。然后补充一定量的生理盐水使其水化，分散成均匀的脂质体混悬液。将制备的NGF脂质体在-10℃下20000rpm离心20min，除部分上清，得到包封率34％以上NGF脂质体。制备地NGF脂质体为透明液体，具有蓝色乳光，平均粒径为64.03nm。
其优化处方：
磷脂与胆固醇的比例为1∶1～1∶2(摩尔比)，
磷脂与DSPE-PEG-2000比例为100∶8～100∶1(摩尔比)，
NGF与脂材比例为1∶50～1∶100(质量比)
实施例2 NGF脂质体静脉给药体内稳定性
一、实验方法：取SD雄性大鼠36只，分为2组，分别为NGF和NGF脂质体组。用15％乌拉坦麻醉后，股静脉给药，剂量为每100g体重6uCi(20ug)¹²⁵I-NGF(NGF脂质体组给药剂量为所包载的NGF量)。分别于给药5，10，15，30，60，120min后从颈动脉插管处取血1.0ml。血样5000rpm离心5min得到血清，取20ul血清行SDS-PAGE凝胶电泳约4小时，在NGF分子量处切取凝胶条用γ计数仪计数1min，根据计数与¹²⁵I-NGF含量关系的标准曲线，计算血清中药物含量，根据C～t关系，用3P-87软件计算药物动力学参数。
二、实验结果：
表1 NGF及NGF脂质体静脉给药的药动学参数
                    K_e/min-1×103          t/min
NGF                  25.5±3.1               9
NGF-SSL              7.89±2.84              35
三、结论：NGF为蛋白多肽类药物，在体内容易被酶所降解，半衰期短，NGF静脉给药后在体内的半衰期约为9分钟，用长循环脂质体包载NGF经大鼠股静脉给药后，体内半衰期延长至35分钟，约提高了4倍，体现了其在临床应用上的优越性。
实施例3 NGF脂质体鼻腔给药凝胶喷雾剂的优化处方
NGF脂质体鼻腔给药凝胶喷雾剂处方：
选择范围                                                   优选
NGF脂质体                                            按实施例1所述制备工
                                                     艺制备，含NGF 100ug
酶抑制剂  杆菌肽                                     杆菌肽2mg
抗菌剂    苯扎溴铵，EDTA                             0.01％苯扎溴铵
增稠剂    羧甲基纤维素钠，羟丙甲纤维素，聚乙二醇，聚 1％羟丙甲纤维素
          乙烯吡咯烷酮K30，卡波普1974NF
支持剂    甘露醇，山梨醇，蔗糖，牛血清白蛋白，人血蛋 5％甘露醇和0.1％人血蛋
          白                                         白
为了保护NGF生物活性，按上述优化处方制备的NGF脂质体鼻腔凝胶喷雾剂，分装2ml(含100ugNGF)于5ml喷雾剂专用瓶中，在温度为-40℃压力为0.22mbar下冻干30小时。使用前用2ml无菌水分散。
这种凝胶喷雾剂制作简单，使用方便，处方中加入凝胶基质能够降低鼻纤毛的清除率，使药物不易从鼻腔流失，喷出的雾滴较细，在鼻腔内分布均匀，使药物吸收效果最好。
实施例4 NGF脂质体(NGF-SSL)鼻腔给药治疗中枢神经系统方面疾病
1.NGF脂质体鼻腔给药的组织分布
一、实验方法：
取SD雄性大鼠54只，分为3组，依次为NGF，NGF脂质体(NGF-SSL)。用15％乌拉坦麻醉后分离其单侧颈动脉和股静脉，颈动脉近心端结扎，远心端做颈动脉插管。同时做气管插管以维持呼吸，在暴露的食管上切一小口，将一聚乙烯管插入直通鼻腔后部，注入适当浓度的明胶做胶粘剂将鼻腭通道封死，以防给药后药液从鼻腔进入口腔流失。
鼻腔给药部位为鼻孔内0.4cm，给药剂量为每100g体重6uCi(20ug)¹²⁵I-NGF。双侧鼻孔给药，分别于给药30，60，120min后从插管处取血1.0ml，然后用蠕动泵以0.5ml·min^-1的流速通过颈动脉插管灌流生理盐水5min，继而剪断大鼠对侧颈静脉，以1.0ml·min^-1的流速继续灌注10min，最后剪断对侧颈动脉，继续灌流15min.以此消除脑毛细血管中残留的药物对脑组织分布的影响，准确评价药物跨越血脑屏障进入脑组织的能力。
脑组织各部分用0.5％TritonX-100超声匀浆后制成30％脑组织悬液，10000rpm离心10min后取上清[7]。精确取部分上清液，35℃真空干燥，再用适量蒸馏水溶解，浓缩10～20倍。再次10000rpm离心10min后取上清。肝、脾、肺、肾组织用0.5％TritonX-100匀浆后制成10％匀浆液，直接离心取上清。上清液行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，切取NGF分子量处示踪的凝胶条，根据标准曲线计算药物浓度。
二、实验结果：
1.在大鼠脑组织各部分的分布结果：
NGF和NGF脂质体(NGF-SSL)鼻腔给药后30min，60min及120min后在脑组织嗅球，纹状体，海马，小脑，脑干和前额皮质的药物浓度见附图2。从图中可以看出，NGF脂质体(NGF-SSL)组在嗅球以及胆碱能神经元丰富的纹状体和海马区的药物浓度均明显高于NGF给药组，这是因为NGF包载在长循环脂质体的内水相中，脂质体降低了NGF与鼻腔内酶的相互作用，相应增加了NGF在脑组织的摄入量。
2.在大鼠其他组织的分布结果：
NGF和NGF脂质体鼻腔给药后30min，60min及120min后在肝，脾，肺，肾的药物浓度见附图3。比较NGF鼻腔给药在脑组织和其他组织的药物含量分布(附图2和3)可以看出，鼻腔给药后药物主要分布在脑组织，而经鼻粘膜吸收入血后分布在其他组织的量较少，说明鼻腔给药具有脑靶向性，是药物入脑的一种良好途径。
三、结论：
NGF用脂质体包载鼻腔给药在脑组织的分布优于NGF，尤其在与退行性疾病相关的纹状体和海马区的药物浓度约能提高2～3倍，是一个较有潜力的鼻腔给药脑靶向制剂。
2.NGF脂质体(NGF-SSL)鼻腔给药的药效学研究
一、实验方法：
1.NGF及NGF脂质体(NGF-SSL)药效学研究步骤：
1)取SD雄性大鼠50只，饲养两天后，用水迷宫实验筛选均匀分组。
2)将大鼠分为4组，分别为生理盐水静脉注射(NS-iv)，NGF静脉注射(NGF-iv)，NGF鼻腔给药(NGF-na)，NGF-SSL鼻腔给药(NGF-SSL-na)组。给药剂量均为NGF：10ug/100gbw，每日一次给药，连续给药7天。
3)制作阿尔茨海默氏病模型：SD雄性大鼠腹腔注射10％水合氯醛麻醉(0.4ml/100g体重)，头部固定在大鼠脑立体定位仪上，以前囟门为基点，根据大鼠脑立体定位图谱[8]，确定Meynert核位置，坐标为脑正中线旁侧2.0mm，前囟前-1.4mm，硬脑膜下7.0mm。用电钻在坐标处垂直颅骨钻孔后，用10ul微量注射器沿钻孔轻轻插入至靶点，缓慢注射5ug/ml的鹅膏蕈氨酸(IBO)，两侧各2ul，注射后留针1min，用强力胶粘合伤口皮肤。
4)造模后两天，动物基本恢复自由活动，继续给药7天，每日一次。
5)行为学实验测定：采用下述水迷宫实验和跳台实验方法。
6)每组选择两只动物做AchE染色，方法如下。
2.药效学指标：
2.1水迷宫实验：水迷宫泳箱由聚乙烯塑料制成，水温25±1℃。第一天训练：首先将大鼠在安全台上放置10s适应环境，然后分别将大鼠依次放入第二，第三，第四盲端，由近至远，逐渐加长路程。当大鼠游到台处，并爬上台后，进行下一盲端训练。训练结束第二天同一时间进行记忆测验：首先将大鼠在安全台上放置10s，然后将大鼠放置安全台附近处水中，使其自动爬上台1次。实验时将大鼠放置第五盲端，同时启动秒表，记录到达终点的时间和错误次数。设定实验时间为180s，超过180s不能游出者按180s计。第三天重复记忆实验。
2.2跳台实验：该装置为被动回避条件反射箱，用黑色塑料隔板分隔成2间，底部栅板(间距0.5cm)可以通电。第一天训练：将大鼠放入跳台仪中，适应环境60s，然后立即通以36V交流电，大鼠受电击后蹦窜。训练时间为180s。记忆成绩测定：24h后将大鼠放入同前一次的测定箱中适应环境60s，然后将大鼠放在安全台上，通电计时180s，记录大鼠第一次跳下安全台的时间为潜伏期，以及此后跳下台的错误次数。记录时间为180s。48小时重复记忆成绩测量。
2.3乙酰胆碱酯酶的组化化学[9]：
①组织的固定：SD大鼠经左心室灌流后，取脑组织。脑组织在4％多聚甲醛溶液中固定4h，置30％蔗糖溶液(0.1mol/LPBS，pH7.4)4℃饱和至沉底，做冰冻冠状切片，厚度为20um。
②AchE染色：切片用0.1mol/L醋酸钠缓冲液(pH6.0)浸洗两次。室温在反应液(32.5ml0.1mol/L醋酸钠缓冲液(pH6.0)，2ml 0.1mol/L柠檬酸三钠，5ml 0.03mol/LCuSO4，9.5ml H2O，1ml 0.005mol/L K3FeCN6，25mg碘化乙酰硫代胆碱)中反应30min，磁力搅拌器搅拌溶液。然后切片依次加入1％ NH4SO4处理1min，0.1％ AgNO3溶液反应1min。乙醇中梯度脱水，二甲苯中透明处理，中性树胶封片。
③积分光密度测定：用图像分析系统测量单位面积内AchE的积分光密度，定量参数为每5949412.00um²内AchE阳性细胞覆盖的面积与光密度的乘积。测量纹状体尾壳核CPU和海马CA区，每组实验取相同部位3张切片，以AchE阳性细胞积分光密度的平均值做统计分析。所有结果按SPSS 8.0统计软件包做t检验处理。
二、实验结果：
1.大鼠行为学研究结果
SD大鼠鼻腔给药，2周后进行水迷宫和跳台实验，实验结果见表2。
表2 NGF及NGF脂质体经静脉给药和鼻腔给药后对大鼠的学习记忆能力的影响(n＝4～10)
                   生理盐水(iv)     NGF(iv)       NGF(na)      NGF-SSL(na)
      游泳时间     152.17±                                                30.17±              11.05±
                                  121.75±50.89
        (S)        43.06                          14.08^**Δ        1.87^**ΔΔ
水迷宫                                            4.50±                 0.80±
      错误次数     22.00±7.35    16.05±5.72
                                                  3.21^**Δ           0.45^**ΔΔ
                                                  106.17±             156.17±
      潜伏期(S)    33.67±12.93   90.80±64.56
跳台                                              61.11^*      37.15^**Δ
      错误次数     3.50±1.38     2.40±1.34      1.00±0.89^* 0.33±0.75^**Δ
NS(iv)为对照组：^*P＜0.05，^**P＜0.01；
NGF(iv)为对照组：ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01各组大鼠经水迷宫实验和跳台实验结果显示：与生理盐水尾静脉给药(natural saline，NS(iv))组和NGF静脉给药组(NGF(iv))相比，NGF和NGF-SSL经鼻给药(NGF(na)，NGF-SSL(na))大鼠记忆能力明显提高。尤其NGF-SSL(na)组的记忆成绩具有显著性增加。由此可见，NGF-SSL经鼻给药组在提高动物记忆能力方面具有很好的优越性。
2.AchE组织化学研究结果
各组动物脑组织切片并进行AchE组织化学染色后，胆碱能神经元数目较多的，呈现红棕色，阴性为灰色。比较各给要组的染色结果可以看出，NGF-SSL(na)组染色为红棕色，而NGF(na)略浅，NGF(iv)和NS(iv)组呈灰色，说明NGF-SSL(na)组对于大鼠胆碱能神经元具有很好的保护和修复作用。(见附图4)
选择纹状体CPU区进行积分光密度的测量，结果见附图5。结果显示NGF-SSL(na)组均具有最高的积分光密度，依次递减为NGF(na)，NGF(iv)，生理盐水组。
三、结论：
NGF经鼻腔给药对于阿尔茨海默氏病的治疗效果要好于静脉给药，鼻腔给药是治疗中枢神经系统疾病的一个有效途径；用脂质体包载NGF能保护NGF免受鼻腔内酶所降解，进一步提高NGF对阿尔茨海默氏病的治疗效果。NGF脂质体鼻腔给药是一个较理想的治疗中枢神经系统疾病的有效方法。
参考文献：
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