用于对IAP抑制卡斯蛋白酶进行去阻遏的方法及组合物.pdf

本发明提供了具有一核心肽的分离试剂，该核心肽选自由核心肽5至39及42至55组成的组群，其中该试剂可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶(caspase)的阻遏。本发明亦提供一种具有一选自任何图5、9、10、14B及21至24中所示结构的核心结构的分离试剂，其中该试剂可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏。本发明进一步提供一种除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的方阿法。本发明的方法亦可用于促进一细胞中的细胞凋亡并用于减轻一以细胞凋亡速度降低为特征的病状的严重程度。本发明亦提供若干用于鉴别一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂的方法。

1、  一种分离试剂，其包含一选自由核心肽5至39及42至55组成的组群中的核心肽，其中所述试剂可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏。

2、  一种分离试剂，其包含一选自图5中所示任一结构、图9中所示任一结构、图10中所示任一结构及图14B中所示任一结构的核心结构，其中该试剂可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏。

3、  如权利要求1或2所述的试剂，其中所述试剂可除去一XIAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏。

4、  如权利要求1或2所述的试剂，其中所述试剂可除去一XIAP抑制卡斯蛋白酶-3的阻遏。

5、  一种医药组合物，其包含权利要求1或2的试剂及一医药上可接受的载剂。

6、  一种复合体，其包含一IAP，所述IAP结合至选自由核心肽4至39及42至55中任一具有所示序列的核心肽组成的组群的一试剂，并结合至其核心结构选自由TPI759、TPI882、TPI914或TPI927组成的组群的一试剂。

7、  如权利要求6所述的试剂，其中所述IAP选自由XIAP、c-IAP-1、c-IAP-2及survivin组成的组群。

8、  一种除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的方法，其包含使一IAP抑制卡斯蛋白酶与一有效量的试剂接触，以除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏，所述试剂具有一核心基元及一核心结构，其中所述核心基元选自由核心肽4至39及42至55中任一具有一所示序列的核心肽组成的组群，所述核心结构选自由TPI759、TPI882、TPI914或TPI927组成的组群。

9、  如权利要求8所述的方法，其中所述IAP选自由XIAP、c-IAP-1、c-IAP-2及survivin组成的组群。

10、  如权利要求8所述的方法，其中所述卡斯蛋白酶选自由卡斯蛋白酶-3、卡斯蛋白酶-7及卡斯蛋白酶-9组成的组群。

11、  如权利要求8所述的方法，其中所述接触在活体外实施。

12、  如权利要求8所述的方法，其中所述接触发生在一细胞中。

13、  一种促进一细胞中细胞凋亡的方法，其包含使一细胞与一有效量的试剂接触，以除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏，所述试剂具有一核心基元及一核心结构，其中所述核心基元选自由核心肽4至39及42至55中任一具有一所示序列的核心肽组成的组群，所述核心结构选自由TPI759、TPI882、TPI914或TPI927组成的组群。

14、  如权利要求13所述的方法，其中所述细胞为一真核细胞。

15、  如权利要求13所述的方法，其中所述IAP选自由XIAP、c-IAP-1、c-IAP-2及survivin组成的组群。

16、  如权利要求13所述的方法，其中所述卡斯蛋白酶选自由卡斯蛋白酶-3、卡斯蛋白酶-7及卡斯蛋白酶-9组成的组群。

16、  如权利要求13所述的方法，其中所述卡斯蛋白酶选自由卡斯蛋白酶-3、卡斯蛋白酶-7及卡斯蛋白酶-9组成的组群。

17、  一种减轻一个体中一疾病严重程度的方法，其包含向一患有以细胞凋亡量呈病理降低为特征的疾病的个体投予一有效量的可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂，所述试剂具有一核心基元及一核心结构，其中所述核心基元选自由核心肽4至39及42至55中任一具有一所示序列的核心肽组成的组群，所述核心结构选自由TPI759、TPI882、TPI914或TPI927组成的组群。

18、  如权利要求17所述的方法，其中所述疾病为癌症。

19、  如权利要求17所述的方法，其中所述疾病选自由干癣、增生、一自身免疫病及再狹窄症组成的组群。

20、  如权利要求17所述的方法，其中所述IAP选自由XIAP、c-IAP-1、c-IAP-2及survivin组成的组群。

21、  如权利要求17所述的方法，其中所述卡斯蛋白酶选自由卡斯蛋白酶-3、卡斯蛋白酶-7及卡斯蛋白酶-9组成的组群。

22、  一种鉴别一可除去IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂的方法，其包含：
(a)检测与一IAP或卡斯蛋白酶结合的经标记的一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂，所述经标记的一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂可包含一核心基元或核心结构，其中所述核心基元选自核心肽4至39及42至55中任一核心肽中所示的核心序列，所述核心结构选自由TPI759、TPI882、TPI914及TPI927组成的组群；
(b)使所结合的IAP或卡斯蛋白酶与一候选试剂相接触，所述候选试剂被怀疑能够除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏；及
(c)检测所述经标记的一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂与所述IAP或卡斯蛋白酶之间发生的离解，藉此可将所述候选试剂鉴别为可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂。

23、  如权利要求22所述的方法，其中所述IAP选自由XIAP、c-IAP-1、c-IAP-2及survivin组成的组群。

24、  如权利要求22所述的方法，其中所述IAP抑制卡斯蛋白酶选自由卡斯蛋白酶-3、卡斯蛋白酶-7及卡斯蛋白酶-9组成的组群。

25、  如权利要求22所述的方法，其中所述接触在活体外实施。

26、  如权利要求22所述的方法，其中所述接触发生在一细胞中。

用于对IAP抑制卡斯蛋白酶进行去阻遏的方法及组合物
技术领域
本发明是在国家健康研究院(National Institute of Health)/国家癌症研究院(National Cancer Institute)授予的许可号CA78040下由政府支持进行的。美国政府对本发明拥有一定权利。
背景技术
本发明总体上涉及分子医学，更具体而言涉及用于改变与调节细胞程序性死亡有关的分子相互作用的组合物及方法。
身体内的正常组织或是由已达到一最终分化状态并不再进行分裂的细胞形成或是由经一段时间后死亡并由许多正在分裂的细胞所取代的细胞形成。举例而言，神经组织在发育早期形成且神经组织的细胞在产生后不久即达到最终分化状态。相反，身体具有许多可自我更新的组织，例如皮肤、肠、骨髓及性器官，这些组织的细胞经历着一产生与死亡的平衡变化过程。该变化过程导致一般成年人体内每天产生500至700亿个细胞，且在一若干年的时间内，所产生的细胞总量等于整个体重，其通过以调节方式清除等量的细胞来保持平衡。在自我更新组织中，此种清除部分通过称为细胞凋亡的细胞程序性死亡过程来维持，其中细胞在基因上被编程为在一定时间后死亡。
细胞凋亡在有机体发育过程期间特别突出，其间执行过渡性功能的细胞被编程为在不再需要其功能后死亡。另外，经受了重大基因改变的细胞亦可发生凋亡，由此为有机体提供了一种清除自身有缺陷并有可能形成癌症的细胞的途径。将一有机体暴露于各种外界刺激(包括，例如，细菌毒素、酒精及紫外线辐射)下亦可诱导细胞凋亡。用于治疗癌症的化学治疗试剂亦是强效的细胞凋亡诱导剂。
程序性细胞死亡调节是一个涉及若干途径的复杂过程，其偶尔会出现缺陷。已知该过程对维持一组织中的稳态细胞数量及在一有机体发育期间维持适当的细胞具有重要作用，所以程序性细胞死亡中的缺陷通常会伴随有病理状况。据估计，超过一半的目前尚无满意疗法的疾病与细胞死亡过少或过多有关。
有机体中程序性细胞死亡的调节异常可引起多种疾病状态。举例而言，有的缺陷导致一组织中细胞凋亡速度低于维护组织稳定状态所需的正常水平，从而导致该组织中细胞的数量增加。已在多种癌症中发现了此一可增加细胞数量的机制，其中肿瘤并非由癌细胞的分裂速度比正常细胞快所致，而是因为这些细胞不以正常速度死亡。
由此，人们需要可对程序性细胞死亡途径进行调节的试剂及用于对患有与细胞程序性死亡调节异常相关的疾病的个体进行治疗的方法。
发明内容
本发明提供若干具有一核心肽的分离试剂，该核心肽选自由核心肽4至39及42至55组成的组群，其中该试剂可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏。本发明亦提供一种具有一选自任何图5、9、10、14B及21至24中所示结构的核心结构的分离制剂，其中该试剂可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏。本发明进一步提供一种除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的方法。该方法包括使一IAP抑制卡斯蛋白酶与有效量的一试剂接触，以除去该IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏，该试剂具有一核心基元及一核心结构，其中该核心基元选自由具有任何核心肽4至39及42至55中所示的一序列的核心肽组成的组群，该核心结构选自由TPI759、TPI882、TPI914或TPI927组成的组群。本发明的方法亦可用于促进一细胞中的细胞凋亡并用于减轻一特征为细胞凋亡速度降低的病状的严重程度。本发明亦提供若干用于鉴别IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏试剂的方法。
附图说明
图1所示为一标绘图，其显示在含与不含由若干六肽的混合物组成的TPI1328库中各肽的情况下所获得的乙酰基-DEVD-7-胺基-4-三氟甲基香豆素(Ac-DEVD-AFC)水解的Vmax比值(其中Vmax等于RFU/min)。
图2所示图表列出了TPI1313库的各个四肽及在含与不含各肽的情况下Ac-DEVD-AFC水解的Vmax比值。该比值＝(含肽、卡斯蛋白酶3及XIAP时的Vmax)/(含卡斯蛋白酶3及XIAP时的Vmax)。
图3显示了TPI1313库中各四肽的结构。
图4显示了TPI914 N-酰基三胺位置扫描组合库中发现可作为XIAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂的混合物中所定义地官能团的结构。各方框下所列的第一个化学名称为可从中获得R基团的试剂的名称，而各方框下所列的第二个化学名称为各R位置处的官能团的名称。各官能团的立体化学结构与得出该官能团的试剂的立体化学结构相同。
图5显示了TPI914 N-酰基三胺库中发现可作为一XIAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂的各种化合物的结构。图表各条目处所列第一个化学名称为从中获得R基团的试剂的名称，所列第二个化学名称为各R位置处的官能团的名称。各官能团的立体化学结构与得出该官能团的试剂的立体化学结构相同。
图6显示了TPI927多苯基脲位置扫描组合库中发现可作为一XIAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂的混合物中所定义的官能团的结构。各方框中的化学名称为从中获得R基团的试剂的名称，而各方框下的化学名称为各R位置处的官能团的名称。各官能团的立体化学结构与得出该官能团的试剂的立体化学结构相同。对于其中分子的核心结构经过修饰的结构25、73、86及88而言，图中所示为所生成的经修饰核心结构及R基团。
图7所示为TPI882 C-6-酰胺基双环胍库中发现可作为XIAP-抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂的混合物中所定义的官能团的结构。各方框中的化学名称为从中获得R基团的试剂的名称，而各方框下的化学名称为各R位置处的官能团的名称。各官能团的立体化学结构与得出该官能团的试剂的立体化学结构相同。
图8显示了TPI759 N-苄基-1，4，5-三取代-2，3-二酮基呱嗪位置扫描组合库中发现可作为一XIAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂的混合物中所定义的官能团的结构。各方框下所列的第一个化学名称为从中获得R基团的试剂的名称，而各方框下所列的第二个化学名称为各R位置处的官能团的名称。各官能团的立体化学结构与得出该官能团的试剂的立体化学结构相同。
图9显示了TPI927多苯基脲库中发现可作为一XIAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂的各化合物的结构。各方框中的化学名称为从中获得R基团的试剂的名称，而各方框下的化学名称为各R位置处的官能团的名称。各官能团的立体化学结构与得出该官能团的试剂的立体化学结构相同。
图10显示了TPI882 C-6-醯胺基双环胍库中发现可作为一XIAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂的各化合物的结构。各方框中的化学名称为从中获得R基团的试剂的名称，而各方框下的化学名称为各R位置处的官能团的名称。各官能团的立体化学结构与得出该官能团的试剂的立体化学结构相同。
图11显示了TPI1239库中被视为XIAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂的混合物的剂量反应。所示值为含与不含各混合物的情况下Ac-DEVD-AFC的水解Vmax比值。所含卡斯蛋白酶或XIAP的剂量列于各栏的顶部。
图12显示了L-3-(2-噻吩基)-丙氨酰基-L-(2-萘基)-丙氨酰基-L-对氯代-苯基丙氨酰基-L-(e-笏基甲氧基羰基)-赖氨酸(TPI792-33；核心肽16)及L-3-(2-噻吩基)-丙氨酰基-L-(2-萘基)-丙氨酰基-D-(e-笏基甲氧基羰基)-赖氨酰-L-(e-笏基甲氧基羰基)-赖氨酸(TPI792-35；核心肽17)的结构。
图13显示了VP-16(吡喃葡糖苷(etoposide))、TPI792-35、TPI792-33及SMAC AVPI四肽(SEQ ID NO：4)对前列腺癌细胞存活率的影响。
图14显示了TPI1396库中苯基脲化合物及TPI1391库中二酮基呱嗪化合物(A组)的一般化结构以及化合物TPI1391-28、TPI1391-21、TPI1396-34、TPI1396-22、TPI1396-11、TPI1396-12(B组)的结构。
图15显示了TPI1391-28及TPI1396-34对居卡(Jurkat)白血病细胞的浓度依赖性杀伤力。
图16显示了TPI1391-28及TPI1396-34与分别具有类似核心药效基团但不同R基团的对照化合物对居卡白血病细胞所具杀伤力的比较。
图17显示了TPI1396-34及TPI1391-28对正常骨髓细胞与居卡白血病细胞所具影响的对比。
图18显示了野生型XIAP的超表达对TPI1396-34的促细胞凋亡活性的影响。
图19显示了野生型XIAP的超表达对TPI1396-34的促细胞凋亡活性的影响。
图20显示了TPI792-3、TPI792-9、TPI792-15、TPI792-17、TPI792-19、TPI792-22、TPI792-27、TPI792-33及TPI792-35的结构。
图21显示了试剂TPI1349-1至TPI1349-34的结构及各试剂在SMAC竞争分析中具有1.8或更高比值时所具有的分子量、质量以及最低浓度。
图22显示了试剂TPI1396-1至TPI1396-65的结构及各试剂在SMAC竞争分析中具有1.8或更高比值时所具有的分子量、质量以及最低浓度。
图23显示了试剂TPI1391-1至TPI1391-36的结构及各试剂在SMAC竞争分析中具有1.8或更高比值时所具有的分子量、质量以及最低浓度。
图21显示了试剂TPI1400-1至TPI1400-58的结构及各试剂在SMAC竞争分析中具有1.8或更高比值时所具有的分子量、质量以及最低浓度。
具体实施方式
本发明提供了若干可阻止一细胞凋亡蛋白抑制剂(IAP)抑制一卡斯蛋白酶的蛋白酶活性或阻止其与一卡斯蛋白酶结合的试剂。本发明试剂的一优点在于其可用于使其中细胞凋亡被一IAP的调节活性阻止的细胞中发生细胞凋亡。因此，本发明提供了若干通过向细胞中投予一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂来降低一细胞群在活体内或活体外存活能力的方法。在此一方法中使用一对一特定IAP抑制卡斯蛋白酶具有特异性的试剂可选择性地靶向并杀死一较大的混杂细胞群中的一子细胞群。本发明亦提供一种通过向一患病特征为细胞凋亡速度呈病理降低(例如癌症或增生)的个体投予一本发明试剂来治疗该个体所患病症的方法，其中该试剂可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏，由此可提高细胞凋亡速度。
本发明亦提供若干用于鉴别细胞凋亡抑制剂调节试剂的方法。用本发明的方法可检测一候选试剂在阻止一细胞凋亡蛋白抑制剂(IAP)抑制一卡斯蛋白酶的蛋白酶活性或阻止IAP结合至一卡斯蛋白酶方面的能力。卡斯蛋白酶在未受到抑制时可介导细胞凋亡。因此，通过本发明方法测定为可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂可视为一使细胞凋亡能够在存在负调节成分的情况下发生的试剂。本发明方法的一优点在于，其能够以一高处理量形式实施，由此可有效地筛选大规模的候选试剂库，从而鉴别出多种IAP抑制卡斯蛋白酶的去阻遏剂。
本文所用术语“卡斯蛋白酶”意指半胱氨酸天冬氨酰基特异性蛋白酶家族的一成员，该蛋白酶家族可将一多肽中的C端解离为一天冬氨酸残基并与导致细胞凋亡的细胞死亡途径有关。该术语意欲与其在本技术中的使用一致，如(例如)Martin及Green在Cell(82：349-352(1995))中所阐述。卡斯蛋白酶以前称为“Ice”蛋白酶，这是基于其与该家族中第一个被发现的成员介白素(IL-1β)转化酶(Ice)的同源性，介白素转化酶可将IL-1β的灭活33千道尔顿(kDa)形式转化为活性17.5kDa形式。人们发现该Ice蛋白酶与秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)ced-3基因同源，其与秀丽新小杆线虫发育期间的细胞凋亡有关，且转染试验显示：Ice在纤维母细胞中的表达在细胞中诱导了细胞凋亡(参见Martin及Green，见上述文献，1995)。因此，该术语包括Ice及ced-3。
人们已鉴别出其它与Ice及ced-3同源的多肽并将其称为卡斯蛋白酶，各卡斯蛋白酶均通过一编号加以识别。举例而言，最早鉴别出的Ice蛋白酶现称为卡斯蛋白酶-1，称为卡斯蛋白酶-3的蛋白酶以前曾分别被称为CPP32、YAMA及凋亡素(apopain)，以前称为Mch6或ICE-LAP6的蛋白酶现命名为卡斯蛋白酶-9。蛋白酶的卡斯蛋白酶家族的特征在于，每一卡斯蛋白酶均是一可将C端解离为一天冬氨酸残基的半胱氨酸蛋白酶且各具有一通常包含氨基酸序列QACXG(SEQ ID NO：1)的保守活性位点半胱氨酸，其中X可为任一氨基酸且通常为精氨酸。卡斯蛋白酶可进一步细分为具有DEVD(SEQ ID NO：2)解离活性的卡斯蛋白酶(包括卡斯蛋白酶-3及卡斯蛋白酶-7)以及具有YVAD(SEQ ID NO：3)解离活性的卡斯蛋白酶(包括卡斯蛋白酶-1(Martin及Green，见上述文献，1995))。
本文所用术语“IAP”或“细胞凋亡抑制剂”意指一可抑制卡斯蛋白酶的蛋白酶解活性的蛋白质。该术语可包括这样一种蛋白质，当其与一卡斯蛋白酶结合时会抑制该卡斯蛋白酶的蛋白酶解活性。该术语亦可包括这样一种蛋白质，其通过抑制一上游卡斯蛋白酶的活性而将卡斯蛋白酶前体加工成一成熟形式来抑制一下游卡斯蛋白酶的活性。该术语亦包括一可诱导一卡斯蛋白酶的泛素化及降解的蛋白质。
抗细胞凋亡蛋白的细胞凋亡蛋白抑制剂(IAP)家族成员在进化过程中得到保留，在脊椎动物及非脊椎动物中均存在同源基因。杆状病毒IAP、Cp-IAP及Op-IAP是该家族中的第一批被鉴别出来的成员，其鉴别的依据是其在功能上补充细胞死亡抑制剂p35(一可结合至并抑制卡斯蛋白酶的杆状病毒蛋白)的缺陷的能力。后来，人们已鉴别出了至少7种另外的人类同源基因并证明其可抑制细胞死亡，其包括：X染色体连接的IAP(XIAP，基因库编号U32974)；细胞IAP蛋白c-IAP-1/HIAP-2hMIHB及c-IAP-2/HIAP-1/hMIHC(Liston等人，Nature379：349-353(1996)；Rothe等人，Cell 83：1243-1252(1995))；神经细胞凋亡抑制蛋白NAIP(Roy等人，Cell 80：167-178(1995))：亦称为LIVIN的ML-IAP(Vucic等人，Cur.Biol.10：1359-1366(2000)及Kasof等人，J.Biol.Chem.276：3238-3246(2001))；Apollon(Chen等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.264：847-854(1999))；及survivin(Ambrosini等人，Nature Med.3：917-921(1997))。人们亦已鉴别出两种果蝇同源基因(DIAP1与DIAP2)并证明其可抑制细胞死亡(Deveraux等人，Genes and Development 13：239-252(1999))。以下发现表明了果蝇中IAP家族蛋白在程序性细胞死亡调节中的重要作用：苍蝇中的数种细胞凋亡诱导蛋白(包括reaper、hid及grim)作为其细胞毒性机制的一部分均可结合至IAP。其它IAP蛋白包括病毒IAP，例如CiIAP、PoIAP、CpIAP及ASFIAP(Deveraux等人，见上述文献(1999))。
本发明的IAP蛋白包括那些可抑制一效应卡斯蛋白酶(例如卡斯蛋白酶-3或卡斯蛋白酶-7)活性的蛋白质及那些可抑制一启动卡斯蛋白酶(例如卡斯蛋白酶-9)的蛋白质。据报导，人类IAP(XIAP、cIAP1及cIAP2)可结合至并有效地抑制卡斯蛋白酶-3及卡斯蛋白酶-7，其中Kis介于0.2至10nM之间。这些卡斯蛋白酶在细胞凋亡级联的远程活动，起细胞凋亡效应物而不是启动物的作用。
所有IAP家族成员的共同结构特征为一称为杆状病毒IAP重复序列(BIR)的约70氨基酸的基元，其如(例如)Deveraux等人在Genes and Development(13：239-252(1999))中所述，以1至3个拷贝形式存在。在BIR结构域中观察到的半胱氨酸与组氨酸的保守存在及间隔表明该结构代表一锌结合域。BIR结构域已表现出若干截然不同的功能。举例而言，XIAP的第二BIR结构域(BIR2)为卡斯蛋白酶-3的强效抑制剂，而XIAP的第三BIR结构域(BIR3)以卡斯蛋白酶-9为目标(参见Wu等人，Nature 408：1008-1012(2000))。除位于IAP的N端及中央部分的BIR基元外，IAP蛋白家族各成员的C端部分还有一环指结构域(Birnbaum等人，J.Virol.68：2521-2528(1994))。
本文所用术语“IAP抑制卡斯蛋白酶”意指一半胱氨酸天冬氨酰基特异性蛋白酶，其蛋白酶解活性因存在一细胞凋亡蛋白抑制剂而受到抑制或阻抑。该术语可包括一半胱氨酸天冬氨酰基特异性蛋白酶，其活性因结合有一细胞凋亡蛋白抑制剂而降低。该术语亦可包括一半胱氨酸天冬氨酰基特异性蛋白酶，由于存在一细胞凋亡蛋白抑制剂，其受到阻止或阻抑而不能被加工成一具有蛋白酶水解活性的成熟形式。一用于本发明的未经加工的半胱氨酸天冬氨酰基特异性蛋白酶实例为一结合有一原结构域的原卡斯蛋白酶。或者，本发明的组合物及方法可针对一不含一原结构域或不是原卡斯蛋白酶的IAP抑制卡斯蛋白酶。
当本文所用术语“去阻遏”与一IAP抑制卡斯蛋白酶有关时，其意指降低、抑制或阻止IAP对卡斯蛋白酶的蛋白酶解活性的抑制能力。因此，一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂为一分子，其可抑制或阻止IAP对卡斯蛋白酶的蛋白酶解活性的抑制能力。该术语可包括抑制或阻止一IAP对卡斯蛋白酶泛素化及降解的诱导能力。
本文所用术语“试剂”意指一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的合成或纯生物分子，例如一简单或复杂的有机分子、一肽、一拟肽、一蛋白质或一寡核苷酸。
本文所用术语“医药上可接受的载剂”意指一其纯度及质量高至足以适用于人的介质。此一介质可为一人用药物级无菌介质，例如水、磷酸纳缓冲液、磷酸缓冲盐溶液、生理盐水或林格溶液(Ringer’s solution)或其它生理缓冲盐水，或其它溶剂或媒剂，例如乙二醇、甘油、一油(例如橄榄油)或一可注射有机酯。医药上可接受的介质基本上不含污染粒子及生物体。
当本文所用术语“抑制”与一蛋白质活性有关时，其意指通过降低该蛋白质对一底物的亲和力或降低该蛋白质将一底物转变成产物的催化速度来降低活性。举例而言，该术语包括：降低一IAP对一卡斯蛋白酶底物的亲和力，降低一卡斯蛋白酶对一多肽底物的亲和力，降低一卡斯蛋白酶将一多肽C端解离为一天冬氨酸残基的速度，或降低一卡斯蛋白酶泛素化或蛋白酶解的速度。
当本文所用术语“分离的”与一试剂有关时，其意指该试剂与1或多种反应试剂、前体或其它反应物相分离。因此，一分离试剂为一种不含生成该试剂的合成反应或反应途径中常见的一或多种化合物的试剂。该术语亦包括一种不含自然界中与其一起存在的一或多种化合物的试剂。一分离试剂亦包括一基本上纯净的试剂。该术语可包括一分子，其已通过一组合化学方法生成并通过化学提纯法或通过结合至一第二分子以足够的稳定性与该第二分子一起纯化的方式与前体及其它产物相分离。该术语可包括天然试剂(例如生物合成反应的产物)或非天然试剂。
本文所用术语“肽”指一含有两个或更多个氨基酸的分子，其中该些氨基酸通过一氨基酸的羧基与另一氨基酸的胺基之间的共价键连接。本发明的肽可包含于大分子或试剂中，例如较大的肽、蛋白质、蛋白质片段、类肽、拟肽及其诸如此类。一肽可为一非天然分子，其在自然界中不存在，但可用活体外方法生成，或其可为天然分子，例如一在一cDNA库中表达的蛋白质或其片段。肽可为线型、环状或呈多价等，该些构象可用本技术中的熟知方法获得。该术语包括具有能生成蛋白质的天然氨基酸以及非天然氨基酸(例如D-氨基酸及氨基酸类似物，其均可使用本技术中熟知的方法纳入一肽中)的分子。根据该定义，除非另有说明，所属领域的技术人员应了解，本文所提及的氨基酸包括(例如)能生成蛋白质的天然L-氨基酸、D-氨基酸、经化学修饰的氨基酸(例如氨基酸类似物)、不能生成蛋白质的天然氨基酸(例如正亮氨酸)及化学合成试剂。下文进一步阐述了可用于本发明的例示性氨基酸。
当本文所用术语“能生成蛋白质的”与一氨基酸有关时，其表明该氨基酸可通过习知的代谢途径纳入细胞中的一蛋白质中。可根据α碳处的构形将该些氨基酸命名为D或L氨基酸。若未指明具体构形，则本文所指氨基酸应理解为在α碳处具有L构形。能生成蛋白质的氨基酸在本文中用1个或3个字母代码表示且意欲与本技术中所用命名法一致，例如，如“Introduction to Protein Structure”(Branden及Tooze，Garland Publishing，New York，pp6-7(1991))中所述。其它氨基酸用本技术中习知的命名法表示，其中，举例而言，pClPhe指对氯代苯丙氨酸，ThiAla指2-噻吩基-丙氨酸，Nal指3-(2-萘基)-丙氨酸，3I-Tyr指3-碘代酪氨酸，Cha指环己基丙氨酸，Lys-ε-Fmoc指赖氨酸(ε-笏基甲氧基羰基)，OEt-Tyr指酪氨酸(O-乙基)。
本文所用术语“核心”意指一分子的化学结构或基元或其一部分。举例而言，该化学结构或基元可为一肽或含肽分子的一氨基酸序列，或为一代表一分子中各原子的共价结合的化学式。可根据对掌性进一步界定该术语中所包括的化学结构或基元。一核心肽或其它化学实体不需要位于一分子的中心。
本发明提供可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的分离试剂。一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂可具有一与下列对应的核心肽或氨基酸序列基元：
(L-Ala)-X₁-(L-Trp)-X₂(核心肽4)
其中X₁为L-Trp或D-Trp，X₂为L-ThiAla或L-pClPhe。核心肽4所包含的例示性核心肽包括，例如：
(L-Ala)-(L-Trp)-(L-Trp)-(L-ThiAla)(核心肽5)，
(L-Ala)-(L-Trp)-(L-Trp)-(L-pClPhe)(核心肽6)及
(L-Ala)-(D-Trp)-(L-Trp)-(L-ThiAla)(核心肽7)。
一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂可具有一与下列对应的核心肽或氨基酸序列基元：
X₁-X₂-X₃-X₄(核心肽23)
其中X₁为L-Ala、L-Cha、L-Nal、D-Trp或D-Trp(CHO)；X₂为D-Nal、D-Trp、D-Trp(CHO)、L-Trp、L-Trp(CHO)、D-Cha或D-ThiAla；X₃为L-Trp、L-Trp(CHO)或D-Phe；及X₄为L-Nal、D-Nal、D-Trp、D-Trp(CHO)、L-ThiAla、L-3I-Tyr或L-pClPhe。核心肽23所包含的例示性核心肽包括，例如：
(L-Ala)-(D-Nal)-(L-Trp)-(L-Nal)(核心肽24)
(D-Trp)-(D-Trp)-(L-Trp)-(D-Nal)(核心肽25)
(L-Cha)-(D-Nal)-(L-Trp)-(L-ThiAla)(核心肽26)
(L-Ala)-(L-Trp)-(L-Trp)-(L-3I-Tyr)(核心肽27)
(L-Ala)-(D-Trp)-(L-Trp)-(L-ThiAla)(核心肽28)
(L-Cha)-(L-Trp)-(L-Trp)-(L-pClPhe)(核心肽29)
(L-Ala)-(D-Trp)-(L-Trp)-(D-Trp)(核心肽30)
(L-Ala)-(D-Trp)-(D-Phe)-(D-Trp)(核心肽31)
(L-Nal)-(D-Trp)-(D-Phe)-(D-Trp)(核心肽32)
(L-Nal)-(D-Cha)-(L-Trp)-(D-Trp)(核心肽33)
(L-Nal)-(D-ThiAla)-(D-Phe)-(D-Trp)(核心肽34)。
一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂可具有一与下列对应的核心肽或氨基酸序列基元：
X₁-X₂-X₃-X₄(核心肽8)
其中X₁为D-Nal或L-ThiAla；X₂为Lys-εFmoc、D-pClPhe或L-Nal；X₃为D-Nal、L-pClPhe或D-Lys(Fm)；且X₄为Lys-εFmoc或D-pFPhe。核心肽8所包含的例示性核心肽包括，例如：
(D-Nal)-(Lys-εFmoc)-(L-pClPhe)-(Lys-εFmoc)(核心肽9)
(D-Nal)-(D-pClPhe)-(L-pClPhe)-(Lys-εFmoc)(核心肽10)
(D-Nal)-(L-Nal)-(L-pClPhe)-(Lys-εFmoc)(核心肽11)
(D-Nal)-(L-Nal)-(D-Lys-εFmoc)-(Lys-εFmoc)(核心肽12)
(L-ThiAla)-(Lys-εFmoc)-(D-Nal)-(Lys-εFmoc)(核心肽13)
(L-ThiAla)-(Lys-εFmoc)-(L-pClPhe)-(pF-D-F)(核心肽14)
(L-ThiAla)-(D-pClPhe)-(L-pClPhe)-(Lys-εFmoc)(核心肽15)
(L-ThiAla)-(L-Nal)-(L-pClPhe)-(Lys-εFmoc)(核心肽16)
(L-ThiAla)-(L-Nal)-(D-Lys-εFmoc)-(Lys-εFmoc)(核心肽17)
一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂可具有一与下列对应的核心肽或氨基酸序列基元：
X₁-X₂-X₃-X₄(核心肽35)
其中X₁为L-ThiAla或Phe；X₂为D-pClPhe或D-OEt-Tyr；X₃为D-Nal或D-OEt-Tyr；及X₄为D-pClPhe或D-pNO2Phe。核心肽35所包含的例示性核心肽包括，例如：
(L-ThiAla)-(D-pClPhe)-(D-Nal)-(D-pClPhe)(核心肽36)
(L-ThiAla)-(D-pClPhe)-(D-Nal)-(D-pNO2Phe)(核心肽37)
(L-ThiAla)-(D-OEt-Tyr)-(D-OEt-Tyr)-(D-pClPhe)(核心肽38)
(Phe)-(D-pClPhe)-(D-Nal)-(D-pClPhe)(核心肽39)
一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂可具有一与下列对应的核心肽或氨基酸序列基元：
A-X₁-X₂-X₃(核心肽18)
其中X₁为Met、Ser、Thr、Trp或ThiAla，且X₂及X₃选自Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、D-Ala、D-Asp、D-Glu、D-Phe、D-His、D-Ile、D-Lys、D-Leu、D-Met、D-Asn、D-Pro、D-Gln、D-Arg、D-Ser、D-Thr、D-Val、D-Trp、D-Tyr、L-Nle、D-Nle、L-Cha、D-Cha、L-PyrAla、D-PyrAla、L-ThiAla、D-ThiAla、L-Tic、D-Tic，L-pClPhe、D-pClPhe、L-pIPhe、D-pIPhe、L-pNO2Phe、D-pNO2Phe、L-Nal、D-Nal、β-Ala、e-氨基己酸、L-Met[O₂]、L-dehydPro或L-3I-Tyr。
一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂可具有一与下列对应的核心肽或氨基酸序列基元：
X₁-X₂-(L-Trp)-(D-Trp)(核心肽19)
其中X₁及X₂选自A1a、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、D-Ala、D-Asp、D-Glu、D-Phe、D-His、D-Ile、D-Lys、D-Leu、D-Met、D-Asn、D-Pro、D-Gln、D-Arg、D-Ser、D-Thr、D-Val、D-Trp、D-Tyr、L-Nle、D-Nle、L-Cha、D-Cha、L-PyrAla、D-PyrAla、L-ThiAla、D-ThiAla、L-Tic、D-Tic、L-pClPhe、D-pClPhe、L-pIPhe、D-pIPhe、L-pNO2Phe、D-pNO2Phe、L-Nal、D-Nal、β-Ala、e-氨基己酸、L-Met[O₂]、L-dehydPro或L-3I-Tyr。
一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂可具有一与下列对应的核心肽或氨基酸序列基元：
X₁-X₂-X₃-X₄-W-W(核心肽55)，
其中X₁、X₂及X₃选自Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Cys或Tyr且X₄选自Ala、His、Lys、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val。
一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂可具有一与下列任一结构对应的核心肽或氨基酸序列基元：
X₁-X₂-A-A-W-W(核心肽43)序列识别号7，
X₁-X₂-G-A-W-W(核心肽44)序列识别号8，
X₁-X₂-R-A-W-W(核心肽45)序列识别号9，
X₁-X₂-X₄-A-W-W(核心肽46)，
X₁-X₂-C-K-W-W(核心肽47)序列识别号10，
X₁-X₂-L-X₃-W-W(核心肽20)，
X₁-X₂-R-X₃-W-W(核心肽21)，
X₁-X₂-G-X₃-W-W(核心肽22)，
X₁-X₂-T-X₃-W-W(核心肽42)，
X₁-X₂-V-X₃-W-W(核心肽48)，
X₁-T-X₂-X₃-W-W(核心肽49)，
X₁-Y-X₂-X₃-W-W(核心肽50)，
A-X₁-X₂-X₃-W-W(核心肽51)，
C-X₁-X₂-X₃-W-W(核心肽52)，
F-X₁-X₂-X₃-W-W(核心肽53)或
K-X₁-X₂-X₃-W-W(核心肽54)，
其中X₁、X₂及X₄选自Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Cys或Tyr且X₃选自Ala、Lys、Ser或Thr。
本发明的核心肽序列可为一分子或一分子的一部分的核心肽序列。举例而言，上述具有4个位置的序列可为四肽分子且上述具有4个或六个位置的序列可为六肽分子。本发明的一核心肽亦可包含于大分子中，该些大分子包括，例如，一具有至少5个氨基酸、至少6个氨基酸、至少7个氨基酸、至少8个氨基酸、至少9个氨基酸、至少10个氨基酸、至少20个氨基酸或至少25个氨基酸的分子。在某些实施例中，将包含本发明肽的分子的氨基酸长度界定为最大长度为(例如)至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多20个、至多25个、至多50个、至多100个、至多150个、至多200个或更多氨基酸，只要该肽可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏。亦可将一具有本发明一核心肽的分子界定在由上述最小与最大长度的任一组合所限定的大小范围内。
本发明进一步提供一种具有一非肽基核心结构的有效的IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂。因此，本发明提供一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂，其具有一对应于一N-苄基-1，4，5-三取代-2，3-二酮基呱嗪的核心结构(例如图8中所示的TPI759)。举例而言，一具有TPI759核心结构的试剂可在位置R1、R2及R3处受到取代，其中R1衍生自正亮氨酸、NapAla、环己基丙氨酸、Lys、norvaleucine或缬氨酸的一氨基酸侧链基团；R2衍生自Leu、NapAla、Phe、Ile或Val的一氨基酸侧链基团；而R3的官能团衍生自：4-异丁基-α-甲基苯乙酸、3，5-双(三氟甲基)-苯乙酸、庚酸、(α-α-α-三氟间甲苯基)乙酸、4-特丁基环己烷羧甲酸、间甲苯基乙酸、3，4-二氯代苯乙酸、3，3-二苯基丙酸、二环己基乙酸、环庚烷羧甲酸、对甲苯基乙酸或环己烷丁酸，如图8中所示。
可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂可具有一对应于C-6-酰胺基双环胍的核心结构，例如图7中所示TPI882。举例而言，一具有TPI882核心结构的试剂可在位置R1、R2及R3处受到取代，其中R1衍生自下列各物的一氨基酸侧链基团：L-环己基丙氨酸、D-环己基丙氨酸、D-2-氯代Phe、O-乙基-D-Tyr、对碘代-L-Phe、对碘代-D-Phe、D-homo-Phe、L-homo-Phe、L-萘基Ala、D-萘基Ala或L-4，4-联苯基丙氨酸；R2的官能团衍生自：2-苯丁酸、3-苯丁酸、间甲苯基乙酸、3-氟代苯乙酸、对甲苯基乙酸、4-氟代苯乙酸、3-甲氧基苯乙酸、4-甲氧基苯乙酸、4-乙氧基苯乙酸、4-联苯基乙酸、苯乙酸、4-苯丁酸、庚酸、4-甲基戊酸、特丁酸、环己基羧酸、环己基乙酸、环己基丁酸、环庚烷羧酸、环丁烷羧酸、环戊基羧酸、3-环戊基丙酸、环己基丙酸、4-甲基-1-环己基羧酸、4-特丁基环己基羧酸、2-降冰片烷乙酸、1-金钢烷乙酸、2-乙基丁酸、3，3-二苯基丙酸或环戊基乙酸；而R3的官能团衍生自：3-氟代苯乙酸、4-乙氧基苯乙酸、4-联苯基乙酸或3，5-双(三氟甲基)苯乙酸的，如图7中所示。一具有TPI882核心结构的试剂可在其官能团衍生自苯乙酸的R2及R3处受到取代；在衍生自下列各物的一氨基酸侧链基团的R1处受到取代：L-环己基丙氨酸、D-环己基丙氨酸、D-对氯代-Phe、D-对氟代-Phe、L-对氟代-Phe、D-2-氯代-Phe、O-乙基-T-Tyr、O-乙基-D-Tyr、O-甲基-D-Tyr、3，5-二碘-Tyr或L-萘基Ala；在具有Phe的一氨基酸侧链基团的R1处受到取代；在其官能团衍生自苯乙酸的R3处受到取代，及在其官能团衍生自下列各物的R2处受到取代：对甲苯基乙酸、4-甲氧基苯乙酸、4-乙氧基苯乙酸、4-联苯基乙酸、苯乙酸、4-苯丁酸、庚酸、3-甲基戊酸或4-甲基戊酸；或在具有Phe的一氨基酸侧链基团的R1处受到取代；在其官能团衍生自苯乙酸的R2处受到取代；及在其官能团衍生自下列各物的R3处受到取代：4-联苯基乙酸、环己烷羧酸、环己基乙酸、环乙基丁酸、环庚烷羧酸、3-环戊基丙酸或3，5-双(三氟甲基)苯乙酸，如图10中所示。
一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂可具有一对应于多苯基脲的核心结构，例如图6中所示TPI927。举例而言，一具有TPI927核心结构的试剂可在位置R1、R2及R3处受到取代，其中R1衍生自D-Lys(Me)、L-3-(2Nap)Ala、D-Chala、L-Phe、Pro、Leu或Ser的一氨基酸侧链基团；R2衍生自ε-Lys、L-Nle、D-Phe、Pro、D-Orn(Me)、Gln、L-3-(2-Nap)Ala或D-Thr的一氨基酸侧链基团；而R3的官能团衍生自：4-甲氧基苯乙酸、1-金钢烷乙酸、环己烷丁酸、4-特丁基环己烷羧酸、环庚烷羧酸、3-氟代苯乙酸、3，3-二苯基丙酸、4-乙氧基苯乙酸、1-苯基-1-环丙烷羧酸、1-萘基乙酸或环丁烷羧酸，如图6中所示。一具有TPI927核心结构的试剂可在具有Phe的一氨基酸侧链基团的R1及R2处受到取代且在其官能团衍生自下列各物的R3处受到取代：三甲基乙酸、氢化肉桂酸、4-特丁基环己烷羧酸、4-甲基-1-环己烷羧酸、环戊基乙酸、1-苯基-1-环丙烷羧酸、环己烷羧酸、苯乙酸、环庚烷羧酸、环丁烷羧酸、环己烷丁酸、1-金钢烷乙酸、环戊烷羧酸、异丁酸、环己基乙酸、3-甲氧基苯乙酸、丁酸、3-(3，4，5)-三甲氧基苯丙酸、庚酸、2-降冰片烷乙酸、环己烷丙酸、特丁酸、4-乙氧基苯乙酸、3，3-二苯基丙酸、4-甲氧基苯乙酸、乙酸、甲基戊酸、对甲苯基乙酸或4-异丁基-α-甲基苯乙酸，如图9中所示。
一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂可具有一对应于一N-酰基三胺的核心结构，例如图4中所示TPI914。举例而言，一具有TPI914核心结构的试剂可在位置R1、R2及R3处受到取代，其中R1衍生自Nap-Ala或4-氟代苯丙氨酸的一氨基酸侧链基团；R2衍生自L-Trp、Nap-Ala、D-Trp、4-氯代苯丙氨酸、D-环己基丙氨酸或Tyr的一氨基酸侧链基团；而R3的官能团衍生自下列各物：4-乙烯基苯甲酸、4-乙基-4-联苯羧酸、3，5-双(三氟甲基)-苯乙酸、4-联苯羧酸、4-联苯乙酸或3，5-双-(三氟甲基)-苯甲酸，如图4中所示。一具有TPI核心结构的试剂可在R1、R2及R3处受到取代，其中R1的一官能团衍生自Leu的一氨基酸侧链基团，R2的一官能团衍生自D-Trp的一氨基酸侧链基团，而R3具有甲基；或者R1的一官能团衍生自Leu的一氨基酸侧链基团，R2的一官能团衍生自Phe的一氨基酸侧链基团，而R3的一官能团衍生自3，5-双(三氟甲基)-苯乙酸；或者R1的一官能团衍生自Leu的一氨基酸侧链基团，R2的一官能团衍生自Phe的一氨基酸侧链基团，而R3的一官能团衍生自4-乙烯基苯甲酸；或者R1的一官能团衍生自Leu的一氨基酸侧链基团，R2的一官能团衍生自Phe的一氨基酸侧链，而R3的一官能团衍生自4-乙基-4-联苯羧酸，每一均如图5中所示。
所属领域的技术人员将了解，具有核心结构TPI914、TPI927、TPI759或TPI882的各库可在一或多个位置处进行组合。一组合位置指一可以不同方式受到不同部分取代的位置，以致在该位置上组合的一分子库成为在该位置上化学结构互不相同的分子的一混合物。该些库可用于鉴别IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂，例如在如实例VI中所述的利用位置扫描的筛选中。因此，位置R1、R2或R3中的任一位置均可保持固定在一分立部分上，而剩余的两个位置进行组合，以产生若干据以固定位置的子库。并且，核心结构上可增加额外位置，该些位置在一或多个其它位置被组合时可进行组合或保持不变。因此，根据一特定核心结构或自该库中鉴别为可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的一结构可创建若干不同的或更为多样的库。
所属领域的技术人员将了解，具有一对应于TPI914、TPI927、TPI759或TPI882的核心结构的本发明试剂可进一步结合有一或多个部分，例如一肽部分。本发明的试剂可为多价态，如上所述，在这种情况下所结合部分可为：一或多个对应于TPI914、TPI927、TPI759或TPI882的核心结构；一具有上述序列的核心肽；或一或多个该些核心结构与核心肽的组合。
不管是基于一肽还是非肽核心结构，一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂均可包括一已知在生物蛋白中天然存在的部分。当为一蛋白质的一部分时，该些部分通常称为氨基酸R基团。该些R基团可具有多种物理或化学特性。以基本氨基酸为例，Gly、Ala、Val、Leu或Ile上的R基团的特征为非极性；极性R基团包括Cys的巯基部分、Met的硫醚部分、Ser及Thr的羟基部分及Asn和Gln的酰胺部分；Asp及Glu因包含羧酸部分而为极性酸性基团；极性碱性R基团包括具有一胺基部分的Lys、具有一胍基部分的Arg及具有一带仲胺的咪唑的His；Phe、Trp、Tyr及His因包含苯基或杂环而为芳香族氨基酸。本发明的试剂可包括一或多个该些部分或特征，该些部分或特征使得该试剂可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏。
本发明的一试剂亦可根据其它当含有时可使该试剂除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的其它部分或该些部分的组合来进行阐述或表征。下文阐述了本发明试剂中可含有的各种部分的定义。
本文所用术语“烷基”在单独或组合使用时均指一饱和的直链或支链烃部分，该部分含有1至10个碳原子，较佳含有1至6个碳原子，更佳含有1至4个碳原子。该些部分的实例包括(但不限于)甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、特丁基、戊基、异戊基、己基、癸基及诸如此类。
术语“烯烃”在单独或组合使用时均指一具有至少一个碳-碳双的直链或支链烃部分，该部分所含碳原子总数为2至10个，较佳为2至6个，更佳为2至4个。该些部分的实例包括(但不限于)乙烯基、E-和Z-丙烯基、异丙烯基、E-和Z-丁烯基、E-和Z-异丁烯基、E-和Z-戊烯基、癸烯基、亚甲基(＝CH2)、亚乙基(-CH＝CH-)、亚丙基(-CH2-CH＝CH-)及诸如此类。
术语“炔烃”在单独或组合使用时均指一具有至少一个碳-碳三的直链或支链烃部分，该部分所含碳原子总数为2至10个，较佳为2至6个，更佳为2至4个。该些部分的实例包括(但不限于)乙炔基、丙炔基、丁炔基、己炔基、癸炔基及诸如此类。
术语“环烷基”在单独或组合使用时均指碳原子的一饱和的环形排列结构，其中碳原子数为3至8，较佳为3至6。该些环烷基部分的实例包括(但不限于)环丙基、环丁基、环戊基、环己基及诸如此类。
术语“芳基”指一选自由下列组成的组群的碳环(完全由碳与氢构成)芳香族基团：苯基、萘基、茚基、二氢茚基、甘菊环基、笏基及蒽基；或一选自由下列组成的组群的杂环芳香族基团：呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、2-吡唑啉基、吡唑烷基、异噁  唑基、异噻唑基、1，2，3-噁二唑基、1，2，3-三唑基、1，3，4-噻二唑基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、1，3，5-三嗪基、1，3，5-三噻烷基、中氮茚基、二氢茚酮基、异二氢茚酮基、3H-二氢茚酮基、二氢吲哚基、苯并[b]呋喃基、2，3-二氢苯并呋喃基、苯并[b]噻吩基、1H-吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹噁啉基、1，8-二氮杂萘基、蝶啶基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基及吩噁嗪基。
本申请案中所定义的“芳基”可独立含有1至4个独立选自由下列组成的组群的取代基：氢、卤素、羟基、胺基、硝基、三氟甲基、三氟甲氧基、烷基、烯基、炔基、氰基、羧基、烷氧羰基、1，2-乙撑二氧基、烷氧基、烯氧基或炔氧基、烷胺基、烯胺基、炔胺基、脂肪族或芳香族酰基、烷氧基-羰基胺基、烷基磺酰胺基、吗啉基羰基胺基、硫吗啉基羰基胺基、N-烷基胍基、烷基胺基磺酰基、芳烷氧基烷基、N-芳烷氧基脲、N-羟基脲、N-烯基脲、N，N-(烷基，羟基)脲、杂环基、硫芳氧基取代的芳基、N，N-(芳基，烷基)肼基、Ar’-取代的磺酰基杂环基、芳烷基取代的杂环基、环烷基及环烯基取代的杂环基、环烷基稠合芳基、芳氧基取代的烷基、杂环胺基、脂肪族或芳香族酰胺基羰基、脂肪族或芳香族酰基取代的烯基、Ar’取代的胺基羰氧基、Ar’，Ar’双取代的芳基、脂肪族或芳香族酰基取代的酰基、环烷基羰基烷基、环烷基取代的胺基、芳氧基羰基烷基、二胺基磷酸或酯。
“Ar’”为一如上所定义的碳环或杂环芳基，其具有1至3个选自由下列组成的组群的取代基：氢、卤素、羟基、胺基、硝基、三氟甲基、三氟甲氧基、烷基、烯基、炔基、1，2-甲撑二氧基、1，2-乙撑二氧基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、烷胺基、烯胺基或炔胺基、烷基羰氧基、脂肪族或芳香族酰基、烷基羰基胺基、烷氧基羰基胺基、烷基磺酰胺基、N-烷基或N，N-二烷基脲。
术语“烷氧基”在单独或组合使用时均指一烷基醚部分，其中术语“烷基”为如上所定义。适当烷基醚部分的实例包括(但不限于)甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、特丁氧基及诸如此类。
术语“烯氧基”在单独或组合使用时均指一结构式为烯基-O的部分，其中术语“烯基”如上文所定义。适当烯氧基部分的实例包括(但不限于)烯丙氧基、E-和Z-3-甲基-2-丙烯氧基及诸如此类。
术语“硫代烷氧基”指一结构式为烷基-S-的硫醚部分，其中烷基如上文所定义。
术语“烷胺基”在单独或组合使用时均指一经单烷基或二烷基取代的胺基(即一结构式为烷基-NH-或(烷基)2-N-的基团)，其中术语“烷基”如上文所定义。适当烷胺基部分的实例包括(但不限于)甲胺基、乙胺基、丙胺基、异丙胺基、特丁胺基、N，N-二乙胺基及诸如此类。
术语“酰胺”指-N(R¹)-C(＝O)-或-C(＝O)-N(R¹)-，其中(R¹)在本文中定义为包括氢及其它基团。术语“经取代的酰胺”指其中(R¹)不为氢的情况，而术语“未经取代的酰胺”指其中(R¹)为氢的情况。
术语“芳氧基”在单独或组合使用时均指一结构式为芳基-O-的部分，其中芳基如上文中所定义。芳氧基部分的实例包括(但不限于)苯氧基、萘氧基、吡啶氧基及诸如此类。
术语“芳胺基”在单独或组合使用时均指一结构式为芳基-NH-的部分，其中芳基如上文所定义。芳胺基部分的实例包括(但不限于)苯胺基、萘胺基、2-、3-及4-吡啶胺基及诸如此类。
术语“芳基稠合的环烷基”在单独或组合使用时均指一与一芳基部分共有2个相邻原子的环烷基部分，其中术语“环烷基”及“芳基”如上文所定义。一芳基稠合的环烷基部分的实例为苯并环丁基。
术语“烷基羰基胺基”在单独或组合使用时均指一结构式为烷基-CONH的部分，其中术语“烷基”如上文所定义。
术语“烷氧基羰基胺基”在单独或组合使用时均指一结构式为烷基-OCONH-的部分，其中术语“烷基”如上文所定义。
术语“烷基磺酰胺基”在单独或组合使用时均指一结构式为烷基-SO₂NH-的部分，其中术语“烷基”如上文所定义。
术语“芳基磺酰胺基”在单独或组合使用时均指一结构式为芳基-SO₂NH-的部分，其中术语“芳基”如上文所定义。
术语“N-烷基脲”在单独或组合使用时均指一结构式为烷基-NH-CO-NH-的部分，其中术语“烷基”如上文所定义。
术语“N-芳基脲”在单独或组合使用时均指一结构式为芳基-NH-CO-NH-的部分，其中术语“芳基”如上文所定义。
术语“卤素”指氟、氯、溴及碘。
所属领域的技术人员根据上述定义可不难了解整个本申请案中所用的其它化学术语。各术语可单独使用或根据公认的化学命名法组合在一起来阐述各部分的组合。
本发明的试剂可使用习知试剂及条件进行合成，以生成具有预定部分或特征的产物。举例而言，能够以相对较低的成本对肽进行大量合成，且不难将其修饰至呈现多种不同的特性(参见，例如，Rees等人，Protein Engineering：A Practical Approach(IRL Press 1992))。IAP抑制卡斯蛋白酶的肽去阻遏剂既可使用一经过改良的固相肽合成法合成(MerrifieldJ.Am.Chem.Soc.，85；2149(1964)；于1986年12月23日颁予Houghten的美国专利第4,631,211号)也可使用此项技术中熟知的标准溶液法合成(参见，例如，Bodanszky，M.，Principlesof Peptide Synthesis，2nd ed.(Springer-Verlag，1988和1993，suppl.))。通过Merrifield方法制备的肽可使用一自动肽合成器(例如Applied Biosystems 431A-01肽合成器(MountainView，CA))或使用一手动肽合成方法(Houghten，见上述文献，1986)进行合成。
此外，可使用下文所述的组合方法来制备一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏抑的试剂。可将一库合成为具有含有特定部分(例如上文所定义或下文实例中所阐述的部分)的候选试剂。另外，可将合成条件选择为可生成一具有一或多个本文所述部分所固有的特定特征(例如氨基酸R基团的上述特征)的候选化合物库。举例而言，可将一库合成为具有一种天然IAP抑制剂SMAC的特征。已表明SMAC的N端区域可介导与IAP的结合及对IAP的抑制作用(参见Srinivasula等人，Nature 410：112-116(2001)，Wu等人，Nature 1008：1012(2000)，Liu等人，Nature 408：1004-1008(2000))。因此，该N端结构域可用于指导库合成，以便选择反应剂及条件来选择性地将类似部分及特征纳入该库的候选试剂中。可采用类似的方法，该些方法使用本文所述试剂或通过本发明方法鉴别出的试剂，其中使一库选择性地含有一特定试剂所具有的或多种试剂所共有的特征或部分。此一设计方法可增加鉴别一IAP抑制卡斯蛋白酶的有效去阻遏的机率。
可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的本发明试剂可在一筛选中鉴别或者根据本文所述多种功能特性中的任何一种来表征。在一实施例中，一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂根据其在存在一IAP的情况下使卡斯蛋白酶具有活性的能力来鉴别。举例而言，本发明一化合物的效力可根据一IAP抑制卡斯蛋白酶在存在及不存在本发明试剂两种情况下的活性比来测定。
实例I中提供了一用于鉴别可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的化合物的例示性分析法，实例I至VI阐述了使用该分析法来鉴别该些去阻遏剂化合物的应用。如下文实例中所述，视分析条件而定，一IAP抑制卡斯蛋白酶在存在及不存在该试剂两种情况下V_max的比率至少约为1.7，这表明该试剂为一IAP抑制卡斯蛋白酶的有效去阻遏剂。所属领域的技术人员将了解，表明效力的该比率的值将取决于所用试剂的浓度及该试剂的IC₅₀。因此，当所用试剂的浓度较高时，在存在及不存在试剂两种情况下V_max的比率的阈值可至少约为2、至少约为2.5、至少约为3或至少约为4或更大。当所用试剂的浓度较低时，该比率可低至至少约为1.5、至少约为1.3、至少约为1或更小。因此，结合分析中所含试剂对IAP的相对量来表达该比率较合适，例如，1摩尔当量试剂/IAP、2摩尔当量试剂/IAP、5摩尔当量试剂/IAP、10摩尔当量试剂/IAP或50摩尔当量试剂/IAP或更高。
一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂亦可在(例如)一结合分析中通过其对一IAP或IAP的一卡斯蛋白酶结合片段的亲和力来鉴别。应了解，在一结合分析中可使用一IAP的功能片段、卡斯蛋白酶或两者来鉴别一IAP抑制卡斯蛋白酶的去阻遏剂。若需要，使用一结合分析法测得的一试剂对一IAP的亲和力可通过一平衡离解常数(K_d)或平衡缔合常数(K_a)来定量。可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂可被视作一种其K_d处于包括(例如)小于约1×10^-6M、1×10^-7M或1×10^-8M微摩尔范围内的试剂。亦可鉴别具有更高亲和力的试剂，包括其亲和力处于毫微摩尔范围内的试剂，例如Kd小于约1×10^-9M、1×10^-10M或1×10^-11M。本发明的一试剂亦可具有微微摩尔的亲和力，包括，例如，一小于1×10^-12M的K_d。
或者，在(例如)一抑制结合分析中，可根据对一IAP与卡斯蛋白酶之间的缔合的抑制程度来测定一试剂在除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏方面的效力。应了解，一抑制结合分析可使用IAP的功能片段、卡斯蛋白酶或两者。或者，可根据抑制IAP与另一抑制剂(例如SMAC)之间的结合的能力来鉴别一IAP抑制卡斯蛋白酶的去阻遏剂。实例VII中提供了一种用于测定对IAP-SMAG结合的抑制作用的例示性分析法。若需要，可通过一平衡抑制常数(例如K_i)将抑制作用量化。K_i值可通过实施去阻遏分析(例如本文中所述的分析)来测定，其中试剂的浓度逐渐增加，而各结合配偶体的浓度固定不变。可使用已知的动力学分析法(例如Segel在Enzyme Kinetics(John Wiley and Sons，New York(1975))中阐述的分析法)来分析结合或抑制作用，以便测定上述平衡常数。一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂可被视作其Ki处于微摩尔、毫微摩尔或微微摩尔范围(例如上述的K_d的范围及值)内的试剂。
因此，本发明提供一种复合体，其具有一与一试剂结合的IAP，其中该试剂具有本发明的一核心肽或核心结构(包括，例如，上述核心结构)。该复合体可自至少一种自然界中通常与IAP共生的其它细胞成分中分离。举例而言，该复合体可处于纯化状态，基本上不含自然界中通常与IAP共生的其它细胞成分。该复合体亦可存在于一通常不表达IAP的重组细胞中。
本发明进一步提供若干偶联物，该些偶联物包括一连接至一可除去IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的部分。本发明的一偶联物可包括一部分，该部分用于将试剂靶向一特定细胞或用于增强一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏试剂的稳定性或生物半衰期。举例而言，一部分可为一其对一欲在其中促进细胞凋亡的特定细胞(例如肿瘤细胞)具有特异性的特定抗体、其功能片段或其它结合多肽。任何可将试剂靶向一欲在其中除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的细胞的部分均可用作一偶联物。
一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂的偶联物亦可为一能将该试剂引入一细胞的胞质溶胶或者有助于该试剂通过细胞膜的部分。可通过(例如)一异源靶向结构域或使用一基于脂质的载体将一试剂引入细胞。因此，本发明可提供IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏试剂的胞质输送。
一部分亦可以是一药物输送媒剂，例如一分室微型装置、一细胞、一脂质体或一病毒，其可为投予IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂提供稳定性及其它有利特性。该些微型装置通常应无毒且(若需要)可生物降解。各种包括微型胶囊的部分(其可含有一试剂)及用于将一部分(包括一分室微型装置)连接至一治疗试剂的方法在此项技术中已为人们所熟知且市场上有售(参见，例如，“Remington’s Pharmaceutical Sciences”18th ed.(Mach Publishing公司1990)，Chapters 89-91；Harlow and Lane，Antibodies：A laboratory manual(ColdSpring Harbor Laboratory Press 1988)；亦参见Hermanson，见上述文献，1996)。
另外，可将一IAP抑制卡斯蛋白酶调配物的去阻遏剂纳入可容许该化合物持续释放的生物可降解聚合物中，该等聚合物可在欲输送药物位置(例如肿瘤位点)的附近植入或以可使试剂随时间在全身释放的方式植入。亦可使用微型渗透泵，以可控方式将特定浓度的IAP抑制卡斯蛋白酶类去阻遏剂调配物通过套管输送到指定位点，例如直接介入肿瘤生长或肿瘤的脉管供应。举例而言，Brem等人在J.Neurosurg.(74：441-446(1991))中详细阐述了该些生物可降解聚合物及其应用。
本发明的一偶联物可包括一是一标记物的部分。一可结合至IAP及/或卡斯蛋白酶的经标记试剂可用于鉴别IAP及/或卡斯蛋白酶的亚细胞定位或用于鉴别一以前未被认识的IAP或卡斯蛋白酶。一可结合至一IAP及/或卡斯蛋白酶的经标记试剂亦可用于鉴别其它可与一IAP及/或卡斯蛋白酶相互作用的分子。如下文所述，此一结合竞争分析可用于鉴别一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂。一可作为一部分纳入的标记物包括(例如)一荧光团、发色团、顺磁自旋标记物、放射性核苷酸或对另一可被检测出的分子具有特异性的结合基团。
本发明的一经标记试剂可用于鉴别一组织内因受到一IAP抑制卡斯蛋白酶的抑制而不能发生凋亡的细胞。因此，该经标记试剂可用于一诊断方法中，以鉴别投予一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂即可发生凋亡的细胞。该方法可包括以下步骤：向一组织投予本发明的一经标记试剂，鉴别一或更多已结合有该经标记试剂的细胞。该经标记试剂可使用上述活体内输送方法投予。可以不同的分辨率使用该些诊断方法。举例而言，该方法可用于鉴别一含有若干被该试剂标记的细胞的组织。或者，可使用更高分辨率的方法鉴别一组织内在存在一IAP抑制卡斯蛋白酶情况下被标记的一特定细胞或细胞型。由于该些诊断方法可用于将一投予一IAP抑制卡斯蛋白酶抑制剂后即可发生凋亡的细胞与其它未经标记的细胞区分开来，所以，该些方法对于指导选择靶向或输送偶联物在本发明一治疗方法中的用途甚为有用。
可在活体外应用该诊断方法，在此种情况下可通过注射或将组织浸泡在一含经标记试剂的溶液中投予经标记试剂。另外，亦可以高分辨率使用该等方法，以对一组织内一具有IAP抑制卡斯蛋白酶的细胞与那些其凋亡不受该方式限制的细胞进行区分。此种分辨率可通过(例如)使用基于显微镜的技术实现。更高的分辨率可提供一IAP抑制卡斯蛋白酶的亚细胞定位。亚细胞定位可用于测定一适当胞质溶胶输送偶联物或用于进一步鉴别细胞凋亡在所研究的特定组织或细胞中的作用。
本发明亦提供一含有一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂及一医药载剂的医药组合物。该些组合物可用于本发明的细胞凋亡促进法中，以达到抑制、治疗或降低一以细胞凋亡量病理性降低为特征的疾病的严重程度。举例而言，一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂可与一医药上可接受的介质一起作为溶液或悬浮液投予。
IAP抑制卡斯蛋白酶抑制剂调配物包括适于以非经肠方式投予的调配物，例如以皮下、腹膜腔内、肌内、静脉内、皮内、颅内、气管内及硬膜外方式投予。亦包括适于经口、直肠、眼(包括玻璃体内或眼房内)、鼻、局部(包括口腔及舌下)、子宫内或阴道投予的调配物。IAP抑制卡斯蛋白酶抑制剂调配物可呈单位剂型且可通过所属领域的技术人员熟知的医药技术制备。该些技术包括使活性成分与一医药载剂或赋形剂结合的步骤。
适于以非经肠方式投予的调配物包括无菌注射水溶液及非水溶液，例如上述医药上可接受的介质。该些溶液可进一步含有(例如)抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂及可使该调配物与预期接受者的血液等渗的溶质。其它调配物包括(例如)无菌水悬浮液及非水悬浮液，其可包含悬浮剂及增稠剂。该些调配物可装入单位剂量或多次剂量容器(例如，密封的安瓿及小玻璃瓶)中，并可在冻干条件下贮存，其要求(例如)在即将使用前加入无菌液体载剂。临时配制的注射溶液及悬浮液可由上述类型的无菌粉剂、颗粒及片剂制备。
一医药上可接受的介质可另外含有起(例如)稳定该IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂作用的生理上可接受的化合物。该些生理上可接受的化合物包括，举例而言，碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；抗氧化剂，例如抗坏血酸或谷胱甘肽；鳌合剂，例如EDTA，其可破坏微生物膜；二价金属离子，例如钙或镁；低分子量蛋白质；脂质或脂质体；或其它稳定剂或赋形剂。如上所述，IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂亦可用一医药上可接受的介质(例如一可生物降解的聚合物)调配。所有上述医药载剂及介质均可为此项技术中所定义的医药级，这表明其纯度及质量高至足以用于人类并有别于研究级调配物中的相当试剂。
本发明亦提供一组合物，该组合物包括一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂及一具有治疗活性的分子。本发明去阻遏剂中所含分子可为一化合物，该化合物具有活性，该活性可对抗以细胞凋亡呈病理降低为特征的疾病。举例而言，该化合物可具有抗癌活性。一具有抗前列腺癌活性且可与本发明的去阻遏剂化合物一起使用的例示性化合物为VP-16(吡喃葡糖苷)。如实例X的结果所示，将VP-16与TPI792-33或TPI792-35一起投予对癌细胞的杀伤效力比单独使用任一上述两种化合物更有效。
其它抗癌药物亦可在一组合物中与一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂一起使用，该些药物包括(但不限于)：一烷基化试剂，例如氮芥(mechlorethamine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、环磷酰胺、美法仑(melphalan)、异环磷酰胺(ifosfamide)；一抗代谢物，例如胺甲蝶呤(methotrexate)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)或阿糖胞苷(cytarabine)；一抗体，例如利妥西单抗(Rituxan)、曲司佐单抗(Herceptin)或利妥希玛(MabThera)；一植物生物碱，例如长春花碱(vinblastine)或长春新碱(vincristine)或吡喃葡糖苷；一抗生素，例如阿霉素(doxorubicin)、柔红霉素(daunomycin)、博来霉素(bleomycin)或丝裂霉素(mitomycin)；一亚硝基脲，例如亚硝基脲氮芥(carmustine)或罗氮芥(lomustine)；一无机离子，例如顺铂；一生物响应修饰剂，例如干扰素；一酶，你如天冬酰胺酶；或一激素，例如他莫昔芬(tamoxifen)或氟利坦(flutamide)。该些及其它抗癌化合物在此项技术中已为人们所熟知且适于医药应用的调配物如(例如)The MerckManual(16^th Ed.，Merck Res.Labs.，Rahway N.J.(1992))中所述亦已为人们知晓。
本发明进一步提供一套组，该套组包括至少一种具有IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂活性的本发明化合物及一具有治疗活性的第二化合物。可包含于一套组中的本发明化合物包括，例如，一具有一选自由核心肽4至39及42至55组成的组群的核心肽的化合物，或一具有任一选自图5、9、10、14B、及21至24中所示核心结构的化合物，其中该化合物可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏。该些套组可用于(例如)治疗一以细胞凋亡呈病理降低为特征的疾病。举例而言，一包括VP-16以及TPI792-33和TPI792-35两者中任一种化合物的套组可用于治疗前列腺癌。
一适当套组中所包含的化合物既可为单独封装的调配物形式亦可为一混合调配物形式，只要所提供的每一化合物的量在投予至少一次后足以产生疗效即可。该些调配物可为任一上述调配物，或者为已知适用于特定化合物及投予方式的调配物。
本发明一套组的容纳物置于封装材料或其它适宜的物理结构中，较佳以提供一无菌且无污染物的环境。另外，该封装材料含有说明书，其说明如何投予该套组内的材料来治疗一特征为细胞凋亡呈病理降低的疾病。典型地，该使用说明包括关于投予途径的具体说明或(若需要)投予用调配物的制备方法。该说明书亦可包括对由使用该套组的容纳物所产生的潜在效果的识别方法或关于不正确使用套组容纳物的警告。
本发明提供一种鉴别一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂的方法。该方法包括以下步骤：(a)使一IAP及一卡斯蛋白酶与一被认为能除去IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂接触，其中该卡斯蛋白酶为一受IAP抑制的IAP抑制卡斯蛋白酶，其中接触是在容许卡斯蛋白酶在不存在IAP的情况下具有活性的条件下进行的；及(b)检测该IAP抑制卡斯蛋白酶的去阻遏。
IAP抑制卡斯蛋白酶的去阻遏可检测为一IAP抑制卡斯蛋白酶活性(包括，例如蛋白酶解活性)的增加。可使用一特定底物在一活体外分析中测量蛋白酶解活性。举例而言，可使用一连续萤光分析法通过下列测量水解速度：跟踪7-胺基-4-三氟甲氧-香豆素(AFC)自DEVD(SEQ ID NO：2，用一C端胺基甲基香豆素衍生)、YVAD(SEQ ID NO：3，用一C端胺基甲基香豆素衍生(Tyr-Val-Ala-Asp-胺基甲基香豆素))的释放或苄氧羰基-Glu-Val-Asp-胺基甲基香豆素的释放；或跟踪对硝基苯胺(pNA)自用pNA标记的类似肽的释放，如美国专利第6,228,603 B1中所述。
可使用免疫印迹分析法或其它基于色谱的分析法根据产物相对于底物改变的分子量来检测一底物被卡斯蛋白酶的蛋白酶解程度。举例而言，在一如美国专利第6,228,603 B1号中所述免疫印迹分析中，一上游启动卡斯蛋白酶(例如卡斯蛋白酶-9)的蛋白酶解活性可根据将一下游效应原卡斯蛋白酶(例如原卡斯蛋白酶-3)加工至成熟形式来测定。根据在存在本发明试剂时卡斯蛋白酶的活性会相对增强，此一分析对一IAP抑制卡斯蛋白酶在存在及不存在本发明试剂两种情况下的结果的比较可用于鉴别IAP抑制卡斯蛋白酶抑制剂。
亦可通过鉴别一细胞或细胞核中标志细胞凋亡的形态变化来测定一卡斯蛋白酶的蛋白酶解活性。标志细胞凋亡的变化包括，例如，染色质聚集、核断裂、细胞邹缩、或细胞起泡导致最终分裂成称为凋亡小体的围绕有细胞膜的片段。因此，可根据以下鉴别一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂：当将其加至受IAP抑制卡斯蛋白酶的抑制而不能发生凋亡的细胞中时其具有可引起一标志细胞凋亡的变化的能力。可对自此一细胞获得的不含细胞的提取物进行类似分析，只要在存在及不存在所添加试剂两种情况下可辨别出一细胞凋亡变化，例如染色质聚集或核断裂。
IAP抑制卡斯蛋白酶的去阻遏亦可检测为一IAP-卡斯蛋白酶类型的离解。使用此项技术中熟知的结合分析法，可将一IAP抑制卡斯蛋白酶鉴别为一缔合有一IAP的卡斯蛋白酶。可使用(例如)未变性聚丙烯酰胺凝胶、大小排除色谱法或离心分析法根据分子量或大小来鉴别此一复合体。亦可用一共沉淀技术来鉴别一IAP卡斯蛋白酶复合体。举例而言，因抗体具有可与两个配偶体一起共沉淀但不能单独与一个或另一个配偶体共沈淀的能力，据此可鉴别一IAP卡斯蛋白酶。类似地，当IAP或卡斯蛋白酶已藉由一重组DNA方法进行修饰后，可使用多种方法纳入一亲和标签，该亲和标签可为(例如)谷胱甘肽-S-转移酶(AmershamPharmacia；Piscataway，NJ)，其可用谷胱甘肽珠沉淀；聚组氨酸标签(Qiagen；Chatsworth，CA)，其可用镍NTA琼脂糖凝胶沉淀；抗体抗原决定部位例如标签肽(Sigma，St Louis，MO)，可将其免疫沉淀；或其它熟知亲和标签。在此一分析中可将一可阻止IAP卡斯蛋白酶复合体形成或者可使该复合体离解的试剂被鉴别为一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂。
卡斯蛋白酶以称为原卡斯蛋白酶的多肽前体形式存在于细胞中。对原卡斯蛋白酶进行蛋白酶解处理可激活卡斯蛋白酶。举例而言，卡斯蛋白酶-3为一由约17至20kDa多肽与11kDa多肽组成的异四聚体，该些多肽通过蛋白酶解一32kDa多肽前体(即原卡斯蛋白酶-3)而形成。原卡斯蛋白酶-3的解离分两步进行。第一个解离步骤导致生成一仍含有原结构域的部分加工的大亚单位(22至24kDa)及一较小的完全加工的亚单位(约11kDa)。在第二个步骤中，原结构域从部分加工的大亚单位中解离出来(或许通过一自动催化方法)，生成酶卡斯蛋白酶-3的17至20kDa成熟且完全加工的大亚单位。然而，激活蛋白酶并非必须除去原结构域，因为部分加工的卡斯蛋白酶还具有卡斯蛋白酶活性。
用于鉴别一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂的本发明方法可用于鉴别一因存在IAP而不能被加工成一成熟的完全蛋白酶解活性形式的卡斯蛋白酶。举例而言，该些方法可用于鉴别一可防止或阻止原卡斯蛋白酶因受到IAP抑制而不能加工成卡斯蛋白酶的试剂。因为在一原卡斯蛋白酶加工成一卡斯蛋白酶的同时，卡斯蛋白酶的蛋白酶解活性会增强，所以用于测定蛋白酶解活性的上述方法可用于鉴别一可防止或阻止原卡斯蛋白酶因受到IAP抑制而不能加工成卡斯蛋白酶的试剂。同样，一结合分析(例如上文所述的结合分析)可用于根据各配偶体结合后的分子量鉴别一卡斯蛋白酶-IAP复合体。在此一分析中，可将一防止形成复合体或使复合体离解的试剂鉴别为一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂。还可根据成熟的原卡斯蛋白酶形式在分子量或大小上的差异来鉴别一因存在IAP而不能加工成一成熟的完全蛋白酶解活性形式的卡斯蛋白酶。因此，当一试剂在存在抑制性IAP的情况下与一原卡斯蛋白酶接触时，其会导致分子量或大小的变化，此表明该成熟形式可被鉴别为一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂。
本发明的方法可用于鉴别一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂，其对一特定IAP或卡斯蛋白酶或二者的组合具有特异性。举例而言，本发明提供若干用于鉴别一可改变一真核IAP(例如XIAP、c-IAP-1或c-IAP-2)与一卡斯蛋白酶(例如卡斯蛋白酶-3、卡斯蛋白酶-7或卡斯蛋白酶-9)的特异性结合的筛选分析法。在本发明的方法中，任何IAP(包括任何真核IAP)均可与适当的卡斯蛋白酶组合使用。使用本文所揭示方法可鉴别出其它与调节特定卡斯蛋白酶相关的IAP蛋白，然后可在一筛选分析中使用卡斯蛋白酶与IAP的特定组合来鉴别一具有以下特征的试剂：其可调节IAP对卡斯蛋白酶激活的控制作用或可改变IAP与卡斯蛋白酶的特异性缔合。
如本文所揭示，本发明的核心肽是通过筛选具有核心四肽及六肽结构的组合库来鉴别的。根据所揭示方法，所属领域的技术人员可了解，还可对具有多于六个或少于4个氨基酸的组合库进行筛选，以鉴别出其它可除去IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的核心肽。此外，虽然所揭示方法可用于初步鉴别可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的核心肽，但所属领域的技术人员将了解，如下文所述，该些方法可叠合使用，以最优化或鉴别其它可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的核心肽。
据预期，所属领域的技术人员结合使用组合合成法及快速筛选法可最优化及鉴别其它具有更强IAP结合亲和力或在除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏方面具有更强活性(由此其治疗潜能增强)的去阻遏剂。
该叠代法在此项技术中已为人熟知，概言之，Houghten等人在Nature(354，84-86(1991))且Dooley等人在Science(266，2019-2022(1994))中阐述了该方法，上述两份文献均以引用方式并入本文中。在叠代法中，举例而言，形成一具有3个可变基团的分子的若干子库，其中第一种可变基团已定义。每一具有已定义可变基团的化合物均可与所有的其它可能化合物在另两个可变基团处发生反应。对该些子库逐一进行检测，以便在筛选中在具有最高活性的子库中界定第二个可变基团的特性。一具有前两个已定义可变位置的新子库再次与所有其它可能的化合物在剩余的未定义可变位置处进行反应。如上所述，在具有最高活性的子库中测定第三个可变位置的特性。若存在更多可变基团，对于每一基团均重复该步骤，生成其各可变基团在筛选步骤中均有助于形成最高预期活性的化合物。然后，使用传统的单一化合物合成法大规模合成由该步骤得出的活性较高的化合物，以用于进一步的生物研究。
目前已有关于各种不同有机库及肽库用位置扫描方法的阐述(参见，例如，R.Houghten等人的PCT/US91/08694及美国专利第5,556,762号，其均以引用方式并入本文中)。在位置扫描方法中，使每一组子库仅界定一个可变位置，生成并检测所有可能的具有所定义各单个可变位置的子库(及在所有其它可变位置处的所有其它可能的子库)。通过本发明书，所属领域的技术人员可合成其中一次界定2个固定位置的库。通过检测每一单个可变位置所定义的库，可确定该位置处的最佳取代基，由此得出最佳或至少一系列具有最大预期生物活性的化合物。因此，具有一单个所定义位置的化合物子库的数量将为该位置处所需不同取代基的数量，且每一子库中所有化合物的数量将为其它可变位置处的取代基数量的乘积。
噬菌体展示法提供了一种用于表达多种无规或以选择性方式无规化的肽群的途径。各种噬菌体展示法及生产多种肽群的方法在此项技术中已为人们所熟知。举例而言，Ladner等人(美国专利第5,223,409号，颁布于1993年6月29日)阐述了在一噬菌体表面上制备多种结合结构域群的若干方法。具体而言，Ladner等了阐述了可用于生成一噬菌体展示库的噬菌体载体以及用于选择潜在结合结构域和生成以无规方式或选择性方式突变的结合结构域。
可使用氨基酸合成本发明含有肽部分的一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂，其活性基团视需要用(例如)一二碳酸特丁酯(t-BOC)基团或一笏甲氧羰基(FMOC)予以保护。氨基酸及氨基酸类似物可从市场上采购(Sigma Chemical公司，St.Louis MO；Advanced Chemtec，Louisville KY)或用此项技术中熟知的方法进行合成。使用固相方法合成的肽可附着在多种树脂上，包括(例如)：4-甲基二苯甲基胺(MBHA)、4-(氧甲基)-苯乙酰胺基甲基及4-(羟甲基)苯氧基甲基共聚(苯乙烯-1％二乙烯基苯)(王氏树脂(Wang resin))，其均可从市场上购得；或附着在对硝基苯基苯甲酮肟聚合物(肟树脂)上，其可用Grado及Kaiser(J.Org.Chem.47：3258(1982))所述方法合成。
可纳入一本发明肽中的氨基酸或氨基酸类似物将部分根据一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻抑剂的具体物理、化学或生理特征来选择。该些特性根据(举例而言)该肽是用于活体内还是活体外来确定，当用于活体内时，根据本发明肽的投予途径或该肽在一接受者中所欲到达的位置来确定。举例而言，本文所阐述的IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏剂核心肽可仅用L-氨基酸合成。然而，所属领域的技术人员将了解，本发明的一肽中的任一或所有氨基酸可为天然L-氨基酸、非天然的D-氨基酸或氨基酸类似物，只要该肽可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏。
在本发明肽中包括一L-氨基酸还是一D-氨基酸将部分视该肽的预期特性而定。举例而言，纳入一或多种D-氨基酸可使该肽在活体外或活体内具有增强的稳定性。纳入一或多种D-氨基酸也可增强或降低该肽的活性，例如，IAP结合活性，该活性通过(例如)本文实例VII中所述分析法或其它用于测定一特定肽对一特定蛋白质的结合活性的熟知方法测定。
如上所述，本发明肽可为线型、环状或多价态及诸如此类，该些构象可使用此项技术中为人们熟知的方法获得。本文所用一“环状肽”指合成线型肽的类似物，其可通过以化学方法将该些结构转变成环状形式而获得。线型肽的环化形式可通过增强或减弱与靶蛋白结合的效价来达到调节生物活性的目的(Pelton，J.T.等人，Proc.Natl.Acad.Sci..U.S.A.，82：236-239)。线型肽的柔性极大，其在溶液中往往呈现多种不同构象。进行环化可限制在溶液中可获得的构象的数量，由此可有利于形成一具有更高IAP亲和力或具有更高IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂活性的构象。
线型肽的环化可通过在游离N端与C端间形成一肽键(homodetic环肽)或通过在氨基酸主链与/或靠近N端或C端的侧链基团间形成一新的共价键(heterodetic环肽)来实现(Bodanszky，N.，1984，见上述文献)。环化使用另外的化学方法来形成共价键，例如二硫化物、内酯、醚或硫醚。如本文所述，对具有5个或更多氨基酸残基的线型肽进行环化相对比较容易。肽往往会在中央四个残基中形成一β-转角构象，这有助于形成homodetic及heterodetic环肽两者。在N端或C端存在脯氨酸或甘氨酸也有助于形成环肽，特别是从长度上短于6个残基的线型肽形成环肽。
相对于每个分子中所含IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏序列或部分的数目，本发明的一试剂可为多价态。一多价态试剂中所含的序列或部分可相同也可不同。例示性多价肽可用熟知的多抗原肽系统生成(MAPS；参见，例如Briand等人，1992，J.Immunol Meth.，156(2)：255-265；Schott等人，1996，Cell Immun.，174(2)：199-209，等)。一相对于所含IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏序列或部分呈多价态的试剂可用于与一具有多于1个BIR结构域的IAP发生相互作用。举例而言，可将一单一试剂制备成含有两个或更多可与同一IAP上的单独BIR结构域发生相互作用的序列或部分。多价态试剂和IAP中存在多个相互作用的配偶体能够增强亲和力或相互作用的特异性。
在某些情况下，最好是使一IAP抑制卡斯蛋白酶仅在短时间内保持活性。在该些情况下，举例而言，在试剂中纳入一或更多L-氨基酸可允许一接受者中的内源性肽酶在活体内消化该试剂，从而限制该受试者暴露于该去阻遏剂。在一实施例中，无论该试剂是基于一肽主链还是其它结构，其均可包括一通过一L-天冬氨酸根部分或残基形成的肽键。已由其除去阻遏的卡斯蛋白酶对含L-天冬氨酸根的试剂的降解可提供一反馈控制机制，该机制将该试剂所允许的细胞凋亡程度降至最低。所属领域的技术人员在考虑(例如)接受者的年龄及一般健康状况等因素后可确定本发明一试剂所需具有的预期特征。举例而言，可使用医药领域中为人熟知的方法测定一其中用一或更多D-氨基酸取代了对应L-氨基酸的肽在一接受者体中的半衰期。
对一肽中的反应基团进行选择性修饰也可使一IAP抑制卡斯蛋白酶的去阻遏剂具有预期特性。可对一仍附着于树脂的本发明肽进行处理，以获得(例如)一N端经修饰的肽，例如一N端乙酰基化了的肽。或者，可使用氢氟酸或一等效解离剂将该肽自树脂移除，然后对其进行修饰。可在含有C端羧基的合成试剂(王氏树脂)从树脂上解离下来后对其进行修饰，或在某些情况下，在进行液相合成前对其进行修饰。用于修饰一肽的N端或C端的方法在此项技术中已为人们所熟知，其包括，例如，用于乙酰基N端的方法及用于酰胺化C端的方法。
本发明肽的范围还涵盖肽类似物。本文所用术语“肽类似物”包括任何具有一与本文中明确列出的序列大致相同的氨基酸序列的肽，例如核心肽1至55，其中一或更多残基已保守地由一功能上类似的残基所取代，该功能上类似的残基在功能上与本文所述的一本发明凝集素结合肽极其相似。保守取代的实例包括：用一非极性(疏水性)残基(例如用异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸)取代另一残基；用一极性(亲水性)残基取代另一残基，例如精氨酸与赖氨酸之间、谷氨酰胺与天冬酰胺之间、甘氨酸与丝氨酸之间；用一碱性残基(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)取代另一残基；或者用一酸性残基(例如天冬氨酸或谷氨酸)取代另一残基。
本文所用短语“保守取代”还包括使用一化学衍生的残基来代替一未经衍生的残基，只要该肽展现出所需的IAP结合或抑制活性。一化学衍生物可包括，例如，那些其中游离氨基已衍生形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基、特丁氧羰基、氯乙酰基或甲酰基的分子。游离羧基可衍生形成盐、甲基及乙基酯或其它类型的酯或酰肼。游离羟基可衍生形成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可经衍生形成N-im-苄基组氨酸。本发明的化学衍生物还包括那些含有20种基本氨基酸的一或多种天然氨基酸衍生物的肽。例如：4-羟基脯氨酸可取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸或取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可取代组氨酸；高丝氨酸可取代丝氨酸；及鸟氨酸或取代赖氨酸。本发明的肽还可包括任何具有下列特征的肽，即相对于本文所示的肽的序列，该肽增加了一或多个残基或缺失了一或多个残基，或两种情况组合存在，只要其仍保留了所需的IAP结合或抑制活性。
所属领域的技术人员根据本文所提供的指导可了解到，本发明的一试剂可包括一核心肽或核心结构，其可由类似物或衍生物修饰、衍生或取代，只要该试剂可除去一IAP抑制卡期蛋白酶的阻遏。一核心肽或核心结构中的该些改变可通过例如本文所述的习知合成方法来实现。可使用本文所述方法(例如实例I中所述去阻遏分析法或实例VII中所述偏光结合分析法)检测发生了上述改变的试剂的活性。
可使用一分析法检测一鉴别为一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂的试剂，该方析法用于在存在或不存在该试剂的情况下测定卡斯蛋白酶的蛋白酶解活性或IAP与卡斯蛋白酶的结合情况，其中包括(例如)上述分析法。可使用上述叠代法在一或多个位置处对一通过上述分析法鉴别为可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂进一步进行组合。另外，可以使用一或多种已识别的去阻遏剂作为基础来合理地设计第二代试剂。举例而言，可使用多种已证明有效的试剂之间的共同结构特征来指导合成一种纳入该些共有特征的一般性结构。当结合至一IAP或卡斯蛋白酶时，与试剂有关的结构信息可用于设计一第二代试剂，该第二代试剂可保留或改进鉴别为可提供有利相互作用的部分，同时除去了可导致与卡斯蛋白酶或IAP发生不利相互作用的部分。
本发明提供一种鉴别一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂的方法。该方法包括以下步骤：(a)检测与一IAP或卡斯蛋白酶结合的经标记的IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂；(b)使所结合的IAP或卡斯蛋白酶与一候选试剂相接触，该候选试剂被怀疑能够除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏；及(c)检测经标记的一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂与IAP或卡斯蛋白酶之间发生的离解，藉此可将候选试剂鉴别为一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂。该方法中所用的经标记的IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂可具有一核心基元或核心结构，其中该核心基元选自本发明的一核心肽，例如核心肽4至39及42至55，该核心结构选自TPI759、TPI882、TPI914或TPI927。该些方法可用于在上述筛选格式及该些实例中鉴别一更佳的IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂。
本发明一方法中使用的一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂可标有多种标记物的任一种标记，该等标记物包括(例如)上文所述的标记物。可根据标记物的一习知可测量特性检测一结合至一IAP或卡斯蛋白酶的经标记去阻遏剂。举例而言，可根据下列检测一荧光团：荧光团的激发或发射波长、荧光团的荧光偏光度或荧光团发出的荧光密度。或者，可根据标记物处于结合状态与未结合状态之间的差异来进行检测。举例而言，如实例VII中所示，与一未经结合的底物相比，结合至一IAP的底物的旋转速度要慢，由此可使用由此造成的荧光偏光度差异来检测缔合作用。可用于测定一荧光标记试剂与一IAP或卡斯蛋白酶之间缔合作用的其它可测量差异包括(例如)：由存在或不存在一猝灭剂而造成的发射密度差异、由存在或不存在一荧光共振能量传递(FRET)给体或受体而造成的发射波长差异、或由荧光团构象或环境而造成的发射波长差异。
IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏剂与IAP或卡斯蛋白酶发生离解现象可检测为下述两种情况：在存在一竞争性结合候选试剂的情况下，来自IAP或卡斯蛋白酶的标记物缺如或数量降低，或在存在一竞争性结合候选试剂的情况下，一旦经标记试剂与一卡斯蛋白酶或IAP进行缔合即刻发生相反的变化。因此，在存在一未经标记的候选试剂时，离解现象可检测为：在存在一用放射性核苷酸标记的去阻遏剂的情况下，IAP或卡斯蛋白酶的放射性减弱或消失；在存在一用发色团标记的去阻遏剂的情况下，IAP或卡斯蛋白酶在一规定波长下的电磁吸收减弱或消失；在存在一顺磁自旋标记抑制剂的情况下，IAP或卡斯蛋白酶在一规定场强度或射频下的磁信号减弱或消失，或在存在一标记有一次级标记用结合基团的去阻遏剂的情况下，该与IAP或卡斯蛋白酶相关的次级标记物减少或消失。实例VII中提供一根据缔合时发生的相反变化来量测离解的实例，其中利用因一经离解底物比IAP结合底物旋转更快而造成的偏光度差异来检测离解。
一标记物特性中的其它可进行检测来测定一经适当标记的去阻遏剂与IAP或卡斯蛋白酶之间的缔合或离解的变化包括(例如)吸热与放热、电磁辐射的吸收与发射、对一受体的亲和力、分子量、密度、质量、电荷、导电性、核的磁矩、电子的自旋状态、极性、分子形状或分子大小。可改变一经适当标记的去阻遏剂与IAP或卡斯蛋白酶之间的缔合或离解的周围环境因素包括：(例如)周围溶剂的折射率及温度。可使用习知方法根据一经标记去阻遏剂或一去阻遏剂与IAP或卡斯蛋白酶的复合体的多种特性中的任一特性测量一去阻遏剂与一IAP或卡斯蛋白酶之间的缔合或离解，该些习知方法包括(例如)平衡结合分析法、竞争分析法及动力学分析法，如Segel在Enzyme Kinetics(John Wiley and Sons，New York(1975))及Kyte在Mechanism in Protein Chemistry(Garland Pub.(1995))中所述。
本发明进一步提供一种用于在一数据库中鉴别一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂的方法。可用一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂的结构来查询一分子(例如肽或小分子)数据库，以鉴别具有一与查询结构完全相同或类似的部分的候选试剂。可使用习知方法合成、分离或者以其它方式获得在数据库搜寻中所鉴别的一候选试剂，然后使用上述及实例中所述分析法检测其作为IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂的活性。
若为基于肽的去阻遏剂，则可依据氨基酸序列(一级结构)或三维结构(三级结构)或两者的组合进行查询，以鉴别具有完全相同或大致类似的结构的肽或蛋白质。用来比较主要序列结构来确定两个序列是否大致与数据库相同的的方法在此项技术中已为人们所熟知，其包括(例如)SwissProt及GenPept。举例而言，一用于测定两个序列是否大致相同的方法为BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)，其可根据Tatiana等人(FEMS Microbial Lett.174：247-250(1999))或国家生物技术信息中心(the National Center for BiotechnologyInformation)网页上所述的缺省参数加以使用。BLAST是一组设计用于检查所有可用序列数据库的相似性搜索程序，其可用于搜索氨基酸或核酸序列中的相似性。BLAST搜索可提供具有明确统计学解释的得分。此外，BLAST使用一可寻找局部序列对比的启发式算法，因此可检测仅共享分离的类似性区域(包括，例如蛋白质结构域)的各序列之间的关系(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))。
除最初阐述的BLAST(Altschul等人，见上述文献，1990)外，人们已对该算法进行修改(Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997))。一种修改形式为GappedBLAST，其可容许缺口(插入或删除)参与序列对比。容许缺口参与序列对比往往会更密切地反映生物关系。举例而言，Gapped BLAST可用于鉴别两种或更多种多肽的类似结构域内完全相同的序列。第二种修改形式为PSI-BLAST，其为一敏感的同源序列搜索方法。PSI-BLAST首先进行一Gapped BLAST搜索并使用来自任何显著的序列对比的信息来构建一位置特异性得分矩阵，该矩阵代替该查询序列进行下一轮数据库搜索。PSI-BLAST搜索通常对弱的但在生物上相关的序列类似性更为敏感。
另一可用于测定两种序列是否大致相同的办法为PROSITE，其可在ExPASy环球网上获得。PROSITE为一种测定由基因组序列或cDNA序列转译而来且未经表征的多肽(Bairoch等人，Nucleic Acids Res.25：217-221(1997))的方法。PROSITE由一在生物上显著的位置和模式数据库组成，其可用于鉴别新序列属于哪一已知的多肽家族(若有)。使用该算法或一类似算法，可根据下列情况鉴别一多肽与另一多肽大致相同：在其序列中出现一特定的可称作一模式、基元、特征或指纹的氨基酸残基簇，该氨基基酸残基簇与一参考多肽的一特定氨基酸残基簇大致相同，其包括(例如)那些存在于类似结构域中的氨基酸残基簇。PROSITE使用一计算机算法来搜寻可将多肽鉴别为家族成员的基元。PROSITE亦可对先前已鉴别出的基元进行汇编，其可用于测定一新鉴别出的多肽是否为一已知家族的一员。
可使用此项技术中熟知的算法通过一理论性方法(例如从头蛋白质折叠)或通过一实验性方法(例如基于X射线晶体解析或核磁共振的结构测定法)测定一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂的三级结构。一去阻遏剂的结构模型可用于一对多肽结构进行比较的算法中，该些多肽结构包括(例如)SCOP、CATH或FSSP(其阐述于Hadley及Jones，Structure 7：1099-1112(1999))及具有一特定折叠或构象的区域，该折叠或构象可作为一区域用于与另一多肽的序列进行比较以鉴别大致相同的区域。
类似数据库搜索方法可用于非肽基去阻遏剂或用于基于结构查询一非肽基候选试剂的数据库。举例而言，可通过基于化学特性信息或结构信息进行查询的方式来搜索一数据库。在后一种方法中，可使用一基于寻找一模板匹配者的算法，例如，如“Database Searching inDrug Design”(Martin，J.Med.Chem.35：2145-2154(1992))中所述。
也可在一数据库中将一位置扫描合成组合库的结果作为一查询条件来鉴别一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂。可将该类结果视为一基元，该基元可用于搜索一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂的数据库。基元搜索源自位置扫描合成组合库的筛选结果，每一位置中所包含的是与若干其活性阈值大于一规定值的混合物相对应的氨基酸。一活性阈值实例为实例I中所述的在存在及不存在一候选试剂两种情况下卡斯蛋白酶活性的V_max的比率。基于基元的数据库搜索在此项技术中已为人们所熟知，例如，如Hemmer等人在Nat.Med.(5：1375-1382(1999))、J.Exp.Med.(185：1651-1659(1997))及Immunol Today(19：163-168(1998))中所述。
或者，可将由一位置扫描合成组合库获得的结果视为一得分矩阵，该得分矩阵可用于在一序列数据库中查询其它IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂。Zhao等人在J.Immunol.(167：2130-2141(2001))中阐述了若干用于鉴别候选肽或蛋白质的方法，该些方法以对一数据库进行基于得分矩阵的搜索为基础。简言之，构建一矩阵，其中列代表位置，行代表20种氨基酸，且每一均与一得分相关。一特定位置和氨基酸的得分基于对与该位置处所界定的氨基酸相对应的一位置扫描合成组合库混合物的分析结果。举例而言，每一得分均可相当于在存在及不存在与该特定位置处所界定的氨基酸相对应的混合物的情况下卡斯蛋白酶活性的Vmax比率。然后，通过将得分矩阵以1个氨基酸的增量沿数据库条目移动，用该得分矩阵来搜索一IAP抑制卡斯蛋白酶的候选去阻遏剂。计算所搜索数据库条目的得分并对每一条目进行归类。那些得分高于一预定截止值的被鉴别为一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂。
本发明提供一种除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的方法，其通过使一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂与一有效量的试剂相接触来除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏，该试剂具有一选自本发明的一核心肽(例如核心肽4至39及42至55)的核心基元或本发明的一核心结构(例如TPI759、TPI882、TPI914或TPI927)。
为了抑制一细胞凋亡蛋白抑制剂(IAP)的卡斯蛋白酶抑制活性，使IAP抑制卡斯蛋白酶与一定量的可除去该IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的去阻遏剂相接触。因此，该试剂的一有效量即为一足以使经去阻遏的IAP抑制卡斯蛋白酶的蛋白酶解活性比一IAP抑制卡斯蛋白酶的蛋白酶解活性增强的量。可使用任一上述方法并参照一用于鉴定IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂的方法来测定一经去阻遏的IAP抑制卡斯蛋白酶的蛋白酶解活性的增强程度。
可在一旦IAP受到抑制不能对卡斯蛋白酶产生抑制即出现卡斯蛋白酶活性的合适条件下，使本发明的一试剂与一IAP抑制卡斯蛋白酶相接触。该些条件包括实例I中阐述的条件。与该IAP抑制卡斯蛋白酶相接触的试剂可以分离形式或大致纯净的形式存在于一化合物混合物中。如上所述，在一利用位置扫描或叠代筛选方法中可将一化合物混合物与一IAP抑制卡斯蛋白酶相接触。此一混合物可被鉴别为具有除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的能力。该混合物可在本发明的方法中用来除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏。或者，可通过下列进一步界定该混合物中具有该活性的一特定物种：分离该混合物中的各单独物种并重复该去阻遏分析或实施第二次IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏分析。可将一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂与IAP抑制卡斯蛋白酶相接触，该试剂可呈一大致纯净的形式、作为一偶联物或呈一上述调配物形式。
在本发明的另一实施例中，可使一IAP抑制卡斯蛋白酶与本发明的试剂在一细胞中相接触。因此，本发明提供一种通过使一细胞与一有效量的试剂接触以除去IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏来促进一细胞凋亡的方法，该试剂具有一选自本发明的一核心肽(例如核心肽4至39及42至55)的核心基元或本发明的一核心结构(例如TPI759、TPI882、TPI914或TPI927)。
本文所述的用胞质溶胶输送一IAP抑制卡斯蛋白酶的方法(例如附着偶联物的一部分)可在一促进一细胞凋亡的方法中使用。该试剂的一有效量可视为一足以容许细胞发生凋亡的量。用于测定一细胞或细胞核中表征细胞凋亡的形态变化的方法(例如上述那些有关鉴别一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂的方法)可用于在实施一促进细胞凋亡的方法时监测细胞凋亡情况。
本发明还提供一种用于降低一细胞群在体外存活能力的方法。该方法可包括使细胞与本发明试剂接触的步骤，其中本发明试剂除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏。可用上述用于促进一细胞凋亡的方法使该些细胞与该试剂接触。该些方法可用于利用上述寻靶方法(例如将一寻靶部分附着至该试剂上)除去一试样中的一特定细胞子群。
可在任何其中当除去一IAP抑制卡斯蛋白酶的阻遏时可发生细胞凋亡的生物体细胞中实施本发明的方法，该些细胞包括，举例而言，真核细胞，例如哺乳动作细胞、人类细胞、非人类灵长类动物细胞、小鼠细胞、仓鼠细胞或其它动物的细胞；无脊椎动物细胞，例如苍蝇或线虫细胞，或酵母细胞。本发明的方法中可使用多种细胞型，例如，肿瘤细胞、干细胞、神经细胞、脂肪细胞、造血细胞、肝细胞或肌细胞。具体而言，该些方法可用于在调节异常的细胞中引发细胞凋亡，该些细胞包括，例如，细胞增生不受控制的细胞以及细胞循环的特定阶段出现紊乱的细胞，从而导致增生特性或形态表现型改变。调节异常的细胞型的具体实例包括赘瘤细胞(例如癌)及特征为组织增生的增生细胞。另一具体实例包括启动态变得异常或不能向下调节后续刺激的免疫细胞。调节异常的细胞还包括在生物化学上或生理上功能异常的细胞。其它类型的细胞功能调节异常及增生已为所属领域的技术人员所熟知，且同样是适于使用本发明方法破坏细胞凋亡的本发明靶细胞。
因为许多与细胞凋亡相关的特性变化是由卡斯蛋白酶的蛋白酶解活性造成的，所以可使用该些方法诱导细胞发生特性改变。举例而言，由卡斯蛋白酶引发的核纤层蛋白B的蛋白酶解(其涉及将染色质附着至核膜上)可导致与细胞凋亡相关的染色质发生崩解(Martin及Green，见上述文献，1995)。卡斯蛋白酶引发的45 kDa DNA断裂因子亚单位(DFF-45)的蛋白酶解可激活一导致基因组DNA断裂成核小体片段的途径(Liu等人，Cell 89：175-184(1997))。另外，卡斯蛋白酶引发的PARP的蛋白酶解可阻碍PARP修复DNA损伤的能力，由此进一步促使发生与细胞凋亡相关的形态变化。因此，本发明的方法可用于引发与细胞凋亡相关的染色质的崩解及基因组DNA的断裂。其它卡斯蛋白酶靶蛋白包括甾醇调节因子结合蛋白；成视网膜细胞瘤(RB)蛋白；DNA依赖性激酶；U1 70-K激酶；及DNA复制复合体的大亚单位(Wang等人，EMBO J.15：1012-1020(1996)；Takahashi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA93：8395-8400(1996)；Casciola-Rosen等人，J.Exp.Med.183：1957-1964(1996)；Ubeda及Habener，J.Biol.Chem.272：19562-19568(1997))，本发明的方法可致使此等蛋白均发生蛋白酶解。
在哺乳运输细胞中，卡斯蛋白酶的激活至少通过两种独立机制实现，该两种机制通过不同的卡斯蛋白酶引发，却激活共同的“执行”卡斯蛋白酶。由结合至Fas受体的配体启动的细胞凋亡为一已明确论述的细胞死亡途径。在该途径中，一配体与Fas的结合容许Fas的细胞内结构域与细胞内MORT1(FADD)蛋白结合，而细胞内MORT1蛋白反过来又会与卡斯蛋白酶-8(MACH；FLICE；Mch5；参见Boldin等人，Cell 85：803-815(1996)；Muzio等人，Cell85：817-827(1996))结合。这些结果将卡斯蛋白酶-8界定为一与Fas细胞死亡途径有关的上游卡斯蛋白酶。另外，卡斯蛋白酶-3在Fas细胞死亡途径中被激活，这表明一上游蛋白酶(例如卡斯蛋白酶-8)或一由卡斯蛋白酶激活的蛋白酶与卡斯蛋白酶-3激活与关。因此，本发明的方法可用于直接除去IAP抑制卡斯蛋白酶-8的阻遏，藉此可有效除去下游卡斯蛋白酶-3蛋白酶的阻遏。
卡斯蛋白酶激活还可涉及细胞色素c，在哺乳动物中细胞色素c通常在细胞凋亡期间自线粒体释放入胞质溶胶中(Liu等人，Cell 86：147-157(1996)；Kharbanda等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 94：6939-6942(1997)；Kluck等人，Science 275：1132-1136(1997)；及Yang等人，Science 275：1129-1132(1997))。进入胞质溶胶后，细胞色素c可使蛋白质以依赖于ATP-或dATP的方式形成一复合体，从而激活原卡斯蛋白酶-3的蛋白酶解活性并使细胞核发生凋亡性破坏(Liu等人，见上述文献，1996)。CED-4同源物Apaf-1及卡斯蛋白酶-9(Apaf-3；Liu等人，见上述文献，1996；Li等人，Cell 91：479-489(1997)；Zou等人，Cell 90：405-413(1997))均为该复合体的一员。XIAP、c-IAP-1及c-IAP-2可遏制由已知可使线粒体释放细胞色素c的刺激引发的细胞凋亡，且其可在活体外抑制由细胞色素引发的卡斯蛋白酶激活。因此，本发明的试剂及方法可用于通过使用XIAP、c-IAP-1或c-IAP-2抑制一卡斯蛋白酶的方式使细胞凋亡随细胞色素从线粒体中的释放而发生。
本发明进一步提供一种方法，该方法通过向一患有以细胞凋亡量呈病理性降低为特征的疾病的个体投予一有效量的可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂来减轻一个体的疾病严重程度。以细胞凋亡量呈病理性降低为特征且可用本发明的一方法治疗的疾病包括(但不限于)再狭窄症；自身免疫病，例如狼疮或类风湿性关节炎；同种异体移植排斥、皮肤的增生性损伤(例如湿疹)；或良性前列腺肥大。该试剂可具有一选自本发明一核心肽(例如核心肽4至39及42至55)的核心基元或一本发明的一核心结构(例如TPI759、TPI882、TPI914或TPI927)。
当一可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂用于治疗一疾病时，其一有效量是指一当投予至一个体时可促进细胞凋亡所需的量。本发明一试剂达到在治疗上有效所需的剂量将取决于(例如)待治疗的疾病、给药途径及形式、个体的体重和健康状况以及先前或并行的治疗情况。所属领域的技术人员使用本文所提供的指导说明可确定对于该方法的一特定应用而言认为是有效剂量的适宜用量。举例而言，可由上述的活体外或活体内分析法推知该剂量。所属领域的技术人员将了解，可在整个治疗期间对患者的状况进行监测，所投予试剂可据此做出相应调整。
对于治疗或降低一疾病的严重程度而言，一有效量指该试剂能够对呈病理降低的细胞凋亡产生增进作用的有效量。一有效量视治疗方案而定可，举例而言，介于约10μg/kg至500mg/kg体重之间，例如介于约0.1mg/kg至100mg/kg之间，或更佳介于约1mg/kg至50mg/kg之间。举例而言，若一天一次至数次投予一试剂或含有该试剂的调配物，则所需剂量将比一周或一月或更长时间投予一次调配物所用剂量要低。类似地，可容许试剂缓慢释放的调配物(例如上述那些调配物)持续释放的细胞凋亡去阻遏剂的量比作为单次大剂量投予的量要小。举例而言，本发明的一试剂可以约1至5mg/kg/周的剂量投予。
一IAP抑制卡斯蛋白酶的调配物、其变体或组合还可交互投予方式输送，以便随时间组合它们的细胞凋亡增强效果。举例而言，可将本发明的一具有一核心肽或结构的试剂以一单次大剂量形式投予，随后多次单独投予一或更多该类试剂或变体，或与此一试剂的一不同调配物或一不同试剂的调配物组合投予。不论该试剂调配物、其变体或组合是同时还是交互输送，投予方式均可为上述投予类型的任何一种且其将视所选用IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂的特定治疗需要及功效而定。确定在一临时投予与案中组合哪种试剂、调配物、类型或变体将取决于待治疗的疾病及患有该疾病的个体的具体身体状况。根据本文所提供的教示和指导说明以及特定疾病技术领域内习知的诊断及临床标准，所属领域的技术人员将了解或可确定一特定应用的具体给药方案。
治疗一以细胞凋亡量呈病理降低为特征的疾病的方法还可联合其它疗法实施。举例而言，对治疗癌症而言，本发明的方法可在传统癌症治疗例如手术、化学治疗(包括投予细胞因子及生长因子)、放射或此项技术中熟知的其它方法之前、期间或之后实施。如上所述以及如实例X的结果所显示，TPI792-33或TPI792-35可与VP-16联合投予来治疗癌症。
类似地，对于治疗包括传染病在内的疾病而言，本发明的方法可在传统治疗例如投予抗生素、抗感染试剂或此项技术中熟知的其它方法之前、期间或之后实施。也可通过接合使用旨在除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的本发明方法与特定自身免疫病的传统治疗法来治疗自身免疫病。传统治疗包括(例如)化学治疗、类固醇治疗、胰岛素及其它生长因子及细胞因子结合以及T细胞受体接种。本发明的方法可联合这些方法或此项技术中熟知的其它方法在传统治疗开始之前、期间或之后实施。关于治疗以细胞生长异常为特征的疾病的阐述参见，例如，The Merck Manual(Sixteenth Ed，(Berkow，R.，Editor)Rahway，N.J.，1992)。此外，在一治疗方法中，包括(例如)上述联合性组合物中任一种药物的抗癌药物可在投予一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂之前、期间或之后投予。
如上所述，可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂调配物的投予可与传统疗法同时进行或以交互形式进行，包括多次投予。同时投予可为，举例而言，在同一调配物中一起投予或在约在同一时间或迅速依次给药的不同调配物中投予。交替投予可为，举例而言，输送本发明的一试剂与一传统治疗在时间上分开。如上所述，本发明一试剂的投予与传统治疗在时间上分开同样可使用不同的输送模式及途径。
可用本发明的试剂及方法治疗的一以细胞凋亡量呈病理降低为特征的疾病包括(例如)癌症、增生、自身免疫病及再狭窄症。越来越多的人类疾病被归类为自身免疫病，其包括(例如)类风湿性关节炎、重症肌无力、多发性硬化、干癣、全身性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、葛雷夫斯氏病(Grave’s disease)、炎症性肠病、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、多肌炎及糖尿病。人们已开发出用于多种以细胞凋亡量呈病理降低为特征的疾病的动物模型，该些模型可用于以预测形式评价使用一可除去IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂的治疗效果。并且，从该些动物模型能够可靠地推知含有一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂的医药组合物可治疗这些疾病。
所属领域的技术人员知道如何根据在一相关动物模型中的常规测试结果来测定本发明一试剂的功效或数量。可根据一受治疗个体的反应在一临床环境中测定一试剂的待投予量。功效的调控将取决于疾病以及治疗或降低疾病严重程度所预期的细胞凋亡进展程度。可通过调节用于除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的特定试剂、调配物或计量方案来实现调控。基于本文所提供的指导说明，所属领域的技术人员将可根据所治疗特定疾病严重程度的习知指征来调控功效。关于本文所述的或者已知以细胞凋亡量呈病理降低为特征的各种疾病指征的阐述，参见(例如)The Merck Manual(Sixteenth Ed，(Berkow，R.，Editor)Rahway，N.J.，1992)。
下列实例意欲举例说明本发明而非对其加以限制。
                   实例1
从六肽库中鉴别一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂
该实例阐述了一IAP去阻遏分析法。该实例进一步阐述了一种鉴别各种可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂的位置扫描法。
由六肽的120种混合物组成的DCR390库是使用诸如颁予R.Houghten等人的PCT/US91/08694和美国专利第5,556,762号中所述的此项技术中已知的方法合成的。每一混合物均由一群六肽组成，其中所有六肽在一规定位置上均具有相同的氨基酸且在剩余的5个位置上具有20种基本氨基酸的任一组合。每一混合物均以该规定氨基酸所在的位置编号(自该六肽的胺基端至羧基端依次为1至6)及该规定氨基酸的标识符进行标记。因此，如表I的第一列所示，位置I处具有一色氨酸且在位置2至5具有20种基本氨基酸的任一组合的混合物标记为“位置1，W”。
用下述分析法筛选DCR390库。根据从DCR390库中鉴别出的可除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的混合物，将另外的规定位置纳入TPI1239及TPI1328子库中，使用相同的分析法筛选该些子库。
使用一Molecular Devices Spectromax 340并通过释放Ac-DEVD-AFC合成肽的7-胺基-4-三氟甲基-香豆素(AFC)来分析卡斯蛋白酶活性(参见Zhou等人，J.Biol.Chem.272：7797-7800(1997))。通过在存在及不存在候选试剂的情况下测量含有经纯化的重组卡斯蛋白酶-3、Ac-DEVD-AFC及GST-XIAP的混合物的AFC水解速率来鉴别候选混合物除去一IAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的能力。计算出在存在及不存在候选混合物情况下Ac-DEVD-AFC的水解Vmax比率，并将该比率用于鉴别那些含有一IAP抑制卡斯蛋白酶去阻遏剂的混合物。该比率＝(存在候选混合物、卡斯蛋白酶3及XIAP时的Vmax)/(存在卡斯蛋白酶3及XIAP时的Vmax)。
如下所述，使用上述分析法将每一混合物从DCR390、TPI1239或TPI1328中筛选出来。将每一混合物都均分为25μl的量并一式两份加至一96孔微量滴定板的加样孔中。在第一组加样孔中添加25μl卡斯蛋白酶分析缓冲液(50mM HEPES，pH7.4，100mM NaCl，10％蔗糖、10mM DTT、1mM EDTA及0.1％CHAPS)，在第二组加样孔中加入25μl 40nM XIAP溶于卡斯蛋白酶分析缓冲液中的母液。每一微量滴定板还具有下列对照组：(1)一缓冲液空白加样孔，其中添加有25μl卡斯蛋白酶分析缓冲液及25μl肽载体溶剂，(2)一XIAP对照加样孔，其中添加有25μl肽载体溶剂及25微米40nM XIAP溶于卡斯蛋白酶分析缓冲液中的母液，及(3)一SMAC对照加样孔，其中添加有25μl 40nM XIAP溶于卡斯蛋白酶分析缓冲液中的母液以及2.5μl 4mM SMAC肽(H-Ala-Val-Pro-Ile-Ala-Gln-Lys-NH2，SEQ ID NO：5)。向各试样的加样孔及对照加样孔中添加25μl 0.64nM卡斯蛋白酶-3溶液，随后添加25μl 0.4mMAc-DEVD-AFC底物。以30秒的间隔迅速检测各加样孔所释放的AFC的荧光，该检测持续30分钟。使用softmax软件包测量各加样孔中Ac-DEVD-AFC水解的Vmax。
DCR390库的筛选结果列于表I中。若干在同一位置上分别固着有不同氨基酸的混合物组排列在以位置编号标识的6个部分中。该6个部分的每一个均分为3列，其显示(1)固定氨基酸的标识符，(2)存在候选混合物、卡斯蛋白酶3及XIAP时的反应表观速度，及(3)当存在候选混合物及卡斯蛋白酶3时的反应表观速度。各部分中还显示有XIAP对照反应的结果。每一部分中的各混合物根据第二列中的表观速度按降序排列。与XIAP对照反应相比，那些具有明显较更的表观速度的混合物列于横线以上，藉此标记为含有一可除去一XIAP抑制卡斯蛋白酶阻遏的试剂。
表I：DCR 390