扁豆原位丛生芽组织培养方法.pdf

一种扁豆原位丛生芽组织培养方法，用于现代农业技术领域。本发明采用扁豆再生腋芽分生组织的方法，扁豆种子经消毒处理，放在萌发培养基上萌发扁豆无菌苗，去除下胚轴、顶尖生长点，保留二片子叶，把外植体放在长芽培养基上，不定芽长大切下再放在生根培养基上，长出根系得到再生苗后移栽到大盆，经培养后得到再生苗。本发明能促使其产生丛生的不定芽，芽生长快，且封顶芽少，植株生长健壮，培养时间缩短，各种间组织培养再生差异小，用本发明方法建立扁豆原位丛生芽高效再生系统适合于各种扁豆品种的组织培养，并能快速得到扁豆组培苗。

1、  一种扁豆原位丛生芽组织培养方法，其特性在于，采用扁豆再生腋芽分生组织的方法，扁豆种子经消毒处理，放在萌发培养基上萌发扁豆无菌苗，去除下胚轴、顶尖生长点，保留二片子叶，把外植体放在长芽培养基上，不定芽长大切下再放在生根培养基上，长出根系得到再生苗后移栽到大盆，经培养后得到再生苗。

2、  根据权利要求1所述的扁豆原位丛生芽组织培养方法，其特征是，通过步骤对其进一步限定如下：
(1)种子用水清洗放在70％的酒精中25～35秒，取出放在10％的次氯酸钠溶液中15～25分钟，用无菌水清洗2～4次，消毒种子放在MSB+6-BA0.1～1mg/L，pH5.8，萌发培养基上23℃～25℃萌发3天～5天；
(2)萌发扁豆去除下胚轴、顶尖生长点，保留二片子叶，放在MSB+6-BA2～4mg/L，pH5.8，长芽培养基上保持23℃～27℃，培养26天～30天至2～4cm高；
(3)切下不定芽放在MSB+IBA0.1～0.5mg/L，pH5.8，生根培养基上23℃诱导生根23天～25天，移栽到大盆，经培养后得到再生苗。

3、  根据权利要求2所述的扁豆原位丛生芽组织培养方法，其特征是，步骤(2)中，所述的萌发扁豆取出顶尖生长点，即将萌发的扁豆在解剖镜下用解剖刀去除下胚轴、两片子叶间顶芽和侧芽的生长点。

扁豆原位丛生芽组织培养方法
技术领域
本发明涉及一种扁豆组织培养的方法，特别是一种扁豆原位丛生芽组织培养方法，用于现代农业技术领域。
背景技术
利用生物技术素改良作物已成为现代农业的一项重要技术途径。而组织培养是生物技术的基础。组织培养的成功取决于是否具有良好的再生系统。扁豆组织培养研究比较少。
经对现有技术文献的检索发现，程林梅等在《中国油料作物学报》，1998年20(2)：6～8，撰文“大豆不同外植体植株再生的研究”该文对不同大豆品种的不同组织诱导率研究表明下胚轴＞上胚轴＞小真叶＞幼胚，再生频率平均为34％，最高达50％。报导提及大豆诱导再生植株频率低，重复性差。大豆组培的不定芽少，繁殖倍数低生长慢，在培养中品种基因型间差异大。扁豆是豆科作物，和豆科作物一样组织培养具有困难，一个高效扁豆再生植株体系，是利用生物技术改良扁豆的技术关键。
发明内容
本发明针对背景技术的不足和缺陷，克服扁豆组织培养中再生能力低的问题，提供一种扁豆原位丛生芽组织培养方法，通过高效的植株再生系统，使其解决在组织培养中扁豆不定芽少，繁殖数量低，生长慢和基因型间差异大的难点，达到扁豆组织培养的再生芽多，并通过培养基的培养使再生植株健壮的目的。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明采用扁豆再生腋芽分生组织的方法，扁豆种子经消毒处理，放在萌发培养基上萌发扁豆无菌苗；将萌发的大豆在解剖镜下用解剖刀去除下胚轴、顶尖生长点，保留二片子叶，并制造一定的伤口，把外植体放在长芽培养基上；不定芽长大切下再放在生根培养基上，长出根系得到再生苗后移栽到大盆，用这种培养基方法可以得到很多丛生的扁豆不定芽，经培养后得到再生苗。
以下对本发明作进一步的描述，方法步骤如下：
(1)种子消毒和萌发培养。种子用水清洗放在70％的酒精中25～35秒，取出放在10％的次氯酸钠溶液中15～25分钟，用无菌水清洗2～4次，消毒种子放在MSB+6-BA(6-苄基腺嘌呤)0.1～1mg/L，pH5.8，萌发培养基上23℃～25℃萌发3天～5天。
(2)原位丛生芽萌发和生长培养。萌发扁豆去除下胚轴，取出顶尖生长点，保留二片子叶，放在MSB+6-BA 2～4mg/L，pH5.8，长芽培养基上保持23℃～27℃，培养26天～30天，至芽长至2～4cm高。
(3)原位丛生芽的培养和生根。切下不定芽放在MSB+IBA(吲哚丁酸)0.1～0.5mg/L，pH5.8，生根培养基上23℃诱导生根23天～25天，移栽到大盆，经培养后得到再生苗。
本发明具有实质性特点和显著进步，与选用子叶、子叶节等外植体培养再生植株相比，本发明能产生丛生的不定芽、芽生长快且封顶芽少、植株生长健壮、培养时间缩短、各品种间组织培养再生差异小，重复性好，用本发明方法建立扁豆原位丛生芽高效再生系统适合于各种扁豆品种的组织培养，并能快速得到扁豆组织苗。
具体实施方式
结合本发明方法的内容提供以下三个实施例：
实施例1
试验品种为交选扁豆1号，50粒；
种子用水清洗放在70％酒精中25秒，取出在10％的次硫酸钠15分钟，用无菌水清洗2次，消毒种子放在MSB+6-BA 0.1mg/L，pH 5.8，萌发培养基上23℃萌发5天；将萌发的扁豆在解剖镜下用解剖刀去除下胚轴、两片子叶间顶芽和侧芽的生长点，保留二片子叶，放在MSB+6-BA 2mg/L，pH 5.8，长芽培养基上保持23℃萌发30天，培养至2cm高；切下不定芽放在MSB+IBA 0.1mg/L，pH5.8，生根培养基23℃诱导生根25天，移栽到大盆得到再生苗；获得交选扁豆1号再生植株356株。产生丛生的不定芽7-10个/棵、试管苗培养60天，芽生长快且封顶芽少、植株生长健壮、品种内组织培养再生差异小，诱导再生植株频率达到712％。
实施例2
试验品种为泥城1号，50粒；
种子用水清洗放在70％酒精中30秒，取出在10％次硫酸钠20分钟，用无菌水清洗3次，消毒种子放在MSB+6-BA 0.5mg/L，pH 5.8，萌发培养基上24℃萌发4天；将萌发地扁豆在解剖镜下用解剖刀去除下胚轴、两片子叶间顶芽和侧芽的生长点，保留二片子叶，放在MSB+6-BA 3mg/L，pH 5.8，长芽培养基上保持25℃萌发28天，培养至3cm高；切下不定芽放在MSB+IBA 0.3mg/L，pH5.8，生根培养基上23℃诱导生根24天，移栽到大盆得到再生苗；获得泥城1号，再生植株389株。产生丛生的不定芽7-10个/棵、试管苗培养56天，芽生长快且封顶芽少、植株生长健壮、品种内组织培养再生差异小，诱导再生植株频率达到778％。
实施例3
试验品种为泥城2号，50粒；
种子用水清洗放在70％酒精中35秒，取出放在10％次硫酸钠25分钟，用无菌水清洗3次，消毒种子放在MSB+6-BA 1mg/L，pH 5.8，萌发培养基上25℃萌发3天；将萌发的扁豆在解剖镜下用解剖刀去除下胚轴、两片子叶间顶芽和侧芽的生长点，保留二片子叶，放在MSB+6-BA 4mg/L，pH 5.8，长芽培养基上保持27℃萌发26天，培养至4cm高；切下不定芽放在MSB+IBA 0.5mg/L，pH 5.8，生根培养基上23℃诱导生根23天，移栽到大盆得到再生苗；获得泥城2号再生植株373株。产生丛生的不定芽7-10个/棵、试管苗培养52天，芽生长快且封顶芽少、植株生长健壮、品种内组织培养再生差异小，诱导再生植株频率达到746％。
本发明具有实质性特点和显著进步，与选用子叶、子叶节等外植体培养再生植株相比，本发明能产生丛生的不定芽7-10个/棵、试管苗培养52-60天，芽生长快且封顶芽少、植株生长健壮、培养时间缩短20-30天、重复性好，各品种间组织培养再生差异小，诱导再生植株频率达到712％-778％。用本发明方法建立扁豆原位从生芽高效再生系统适合于各种扁豆品种的组织培养，并能快速得到扁豆组织苗。