转基因植物中1,2－二苯乙烯系产品及其生产方法.pdf

一种至少转化了一种1，2－二苯乙烯合酶(STS)基因结构的转基因植物，和由转基因STS酶构成的相应的1，2－二苯乙烯合酶的产品，同时保持正常的生理生长。优选的实施例包含将转基因白藜芦醇合酶(RS)转化到红色的植物中。这种生产方法包括选择含有高含量的转基因RS酶的前体的受体植物。

1、  一种红色转化植物，其中包括一个转化的基因载体，所述的载体包含分离或合成的DNA编码的1，2-二苯乙烯合酶基因。

2、  按照权利要求1所述的红色转化植物，其中所述的1，2-二苯乙烯合酶基因编码白藜芦醇合酶基因。

3、  按照权利要求1所述的红色转化植物，其中所述的基因载体是一种质粒，所述的1，2-二苯乙烯合酶基因是白藜芦醇合酶基因。

4、  按照权利要求1所述的红色转化植物，其中所述的红色转化植物是红叶莴苣。

5、  按照权利要求1所述的红色转化植物，其中所述的转化植物是能够产生可繁育的种子。

6、  一种由1，2-二苯乙烯合酶基因或部分1，2-二苯乙烯合酶基因转化的转化植物，所述的1，2-二苯乙烯合酶基因编码特定的1，2-二苯乙烯合酶，所述的特定的1，2-二苯乙烯合酶在所述的转化植物中合成组成型水平的特定的1，2-二苯乙烯，所述的转化植物在自然未转化状态时含有高水平的所述的1，2-二苯乙烯合酶基因的前体。

7、  按照权利要求6所述的转化植物，其中所述的1，2-二苯乙烯合酶基因是白藜芦醇合酶基因，所述的特定的1，2-二苯乙烯合酶是白藜芦醇合酶，所述的特定的1，2二苯乙烯是白藜芦醇。

8、  按照权利要求6所述的转化植物，其中所述的转化植物是红叶莴苣。

9、  一种生产含有由特定的转基因1，2-二苯乙烯合酶(STS)转化于其中的转基因植物的方法，所述的转基因植物从受体植物获得包括：
a)选择含有高水平的转基因STS酶前体的受体植物；
b)提供一个基因载体含有STS基因或编码所述特定的STS酶的部分STS基因，为STS基因或部分STS基因提供一个适于在受体植物中STS酶组成型表达的启动子；
c)转化基因载体到受体植物中，并
d)选择并培育对含有高浓度和组成型水平的转基因1，2-二苯乙烯的转基因植物。

10、  按照权利要求9所述的方法，其中所述的选择步骤进一步包括培育所述的受体植物在组织培养系统作为愈合组织培养，并分析所述的愈合组织培养的所述STS酶的前体含量。

11、  一种含有转基因白藜芦醇合酶(RS)酶的转基因植物的生产方法，所述的转基因植物从受体植物获得包括：
a)选择含有高水平的4-香豆酰基(coumaroyl)-辅酶A和丙二酰-辅酶A的受体植物；
b)提供一个基因载体其包含有RS基因或编码RS酶的一部分RS基因，为RS基因或部分RS基因提供一个适于在受体植物中RS酶组成型表达的启动子；
c)转化基因载体到受体植物中，并
d)选择并培育含有高浓度和组成型水平的转基因白藜芦醇的转化植物。

12、  一种含有转基因白藜芦醇合酶(RS)酶的转基因植物的生产方法，所说的转基因植物从受体植物获得包括：
a)选择可食用部分含有高浓度和组成型水平花青素的受体植物；
b)提供一个基因载体含有RS基因或编码RS酶的部分RS基因，为RS基因或部分RS基因提供一个适于在受体植物中RS酶组成型表达的启动子；
c)转化基因载体到受体植物，并
d)选择并培育转化植物在可食用部分含有高浓度和组成型水平的白藜芦醇。

13、  按照权利要求12所述的方法，其中所述的受体植物是红叶莴苣。

14、  一种含有植物可食用部分产生的未发酵汁的饮料，所述的汁含有至少1μg/ml的白藜芦醇。

15、  干的水果和蔬菜每克干重中含有至少1μg的白藜芦醇。

16、  粉末植物提取物每克干重中含有至少1μg白藜芦醇。

转基因植物中1，2-二苯乙烯系产品 及其生产方法
技术领域
本发明涉及转基因植物和植物材料。特别是，本发明涉及白藜芦醇和其他1，2-二苯乙烯系(stilbenes)在植物中的生产。
背景技术
癌症是男性和女性最大的单独死亡原因，癌症的化学预防是减少发病率和死亡率最直接的途径之一。预防癌症的药物包括非类固醇抗炎药物，例如，消炎痛，阿司匹林，吡氯噻嗪和舒林酸，所有的这些药物都抑制COX。过去30年来，在寻找新的癌症预防药物过程中，对数千种植物的样品和提取物进行了研究，并评估了数百种提取物潜在的抑制COX的能力。1974年，一种秘鲁肉桂(Cassia quinquangulata)的提取物被确认为有效的抑制剂，其活性成分被确认为白藜芦醇(3，5，4`-三羟基-反-二苯乙烯)。1997年，据科学杂志报道，白藜芦醇，一种在葡萄和其他食物中发现的植物抗毒素被提纯，并在三个主要的癌症发病阶段的试验中表现为具有化学预防癌症的活性。白藜芦醇作为一种抗氧化剂和抗诱变剂作用并导致第II阶段的药-代酶(抗起始活性)；它具有抗发炎的作用和抑制环氧酶和氢过氧化物酶的作用(抗启动活性)，并且它诱导抗癌症发展的活性。另外，在经致癌处理的小鼠乳腺的培养中白藜芦醇能抑制肿瘤发生前(preneoplastic)的损伤的发展，并抑制小鼠皮肤癌模型中肿瘤的发生(Jang M.S.，Science，275：218-220，1997)。根据这些数据，全世界多数其他科学家强烈建议，对白藜芦醇，一种在我们日常食物中的普通成分作为人类一种潜在的癌症抑制剂进行研究。
过去20年，酒精、心血管疾病和法兰西军团病(the French paradox)已经进行过研究并且全世界医学科学团体都进行了深入调查。多年来大量的研究表明酒精的摄入和心脏局部缺血疾病具有反比关系或U型曲线关系，这是指与没有喝酒的人相比，每天喝两次任何酒的人的冠心病的发病率下降，而更高剂量则导致心肌梗塞和发病的危险的增加。大多数酒精饮料的保护心脏的作用或许是由于增加了高密度脂蛋白和酒精防止血小板凝聚以及增加纤维蛋白溶解的能力；然而，红酒增加了这种有益的作用。红酒独特的保护心脏的性能在于其中的类黄酮和stilbenoids的作用，而在白酒中它们的含量非常小(香槟酒除外)。研究得最多的类黄酮是白藜芦醇和槲皮黄酮，它们比α-维生素E具有更好的抗氧化性能。葡萄汁含有红酒一半的类黄酮的含量。然而，白藜芦醇是一种植物抗毒素，在正常情况下葡萄并不会产生白藜芦醇，只有在葡萄受到微生物病原体袭击的时候才会产生。
至少超过12个科31个属的72种植物产生植物抗毒素白藜芦醇。产生白藜芦醇的植物研究得最好的是葡萄和花生。美国和特别是德国的大学已经积极的观察了所描述的两种植物的植物-病原体交互作用。拜尔AG(Bayer AG)是一个大型化学和制药公司，积极的赞助和开展这种植物抗毒素的工作。他们已经分离了涉及白藜芦醇(植物抗毒素)产物的基因(1，2-二苯乙烯合酶)并表明在转基因植物中被表达时能够增加植物抗病原体攻击的能力。拜尔(Bayer)也申报了他们分离的葡萄1，2-二苯乙烯合酶基因方面的专利。费舍尔R.(FischerR.)在植物杂志(Plant J.11(3)：489-498，1997)发表了一篇论文，在转基因烟草中，1，2-二苯乙烯合酶基因过度表达能导致花粉不育(由于查尔酮合酶和1，2-二苯乙烯合酶具有共同的酶底物前体，而存在竞争)。
不久前，也有一个加拿大公司PharmaScience销售粉状的白藜芦醇，并声称是化学合成的产物。商标名称是“Resverin”。他们只能以非常高的价格少量供应。过去的这些年里，还有许多报告表明白藜芦醇是植物雌激素。因此，白藜芦醇也包含模拟的雌激素作用，可能具有作为非固醇类雌激素补充物的潜力，也可能防止骨质疏松症。
试图开发这类1，2-二苯乙烯系的抗氧化剂和抗诱变剂的一个困难是它们通常是植物抗毒素，只有在受感染或受伤的植物中才能发现，在健康的植物中没有发现，即使这种基因在植物中自然存在。例如，虽然葡萄有1，2-二苯乙烯合酶(STS)基因并且是活泼的STS酶，消费者并不能从摄取葡萄得益，因为在健康的新鲜地葡萄中并没有发现白藜芦醇。因此，需要生产所期望的含有高浓度和组成型水平(high and constitutive level)的一种或更多的1，2-二苯乙烯系的植物。
发明内容
据此，本发明的一方面是至少含有一个转化的1，2-二苯乙烯合酶(STS)基因结构的转基因植物，并通过转基因STS酶合成对应的1，2-二苯乙烯构成的产品。另一方面，转基因植物的生育能力和生理发育能够通过在特定的范围内对1，2-二苯乙烯的表达选择性克隆而得到控制。这种植物优选一种普通的蔬菜，它在可食用的部分天然产生高含量的用于转基因STS的前体。更优选的是一种通常可以生吃的多叶蔬菜，但是也能够在需要时煮熟。优选的STS基因是白藜芦醇合酶(RS)。适合接受白藜芦醇合酶转基因的植物的一个例子是红叶莴苣(Lactuca Sativa)。红叶莴苣也称作红色莴苣(red lettuce)。本发明其他的接受性强的植物的例子包括彩色蔬菜和水果，包括但不局限于西瓜、草莓、菠菜，红甘蓝、红甘蔗。
因此，根据另一方面，本发明是一种转基因植物，至少含有一个被转化的白藜芦醇合酶(RS)基因结构并且通过转基因RS酶合成白藜芦醇的构成产品。植物优选红叶莴苣。
根据另一方面，本发明涉及到转基因植物的可食用的组成部分，一种实施方式是用这样的转基因植物的汁开发的饮料。因此，优选的这样的产品的植物产生足够大量的含有转基因白藜芦醇的汁可通过加工制成饮料。更进一步，本发明也能提供含有转基因白藜芦醇的干的蔬菜和水果。在这种实施方式中，植物的可食用部分包括任何数量的流体。再进一步的实施方式中，可以从转基因植物中生产含有白藜芦醇的植物提取物。提取物可以是浓缩形式或不浓缩形式，例如粉末形式。
根据另一方面，本发明是一种生产含有特定的转基因STS酶的健康的转基因植物的方法。优选的实施方式，根据本发明的方法获得的转基因植物含有高的和组成型水平的转基因白藜芦醇同时维持正常的生理生长。这种方法包括(1)选择含有高含量转基因STS酶前体的受体植物；(2)提供一种含有STS基因或编码STS酶的部分STS基因的基因载体，为STS基因或部分STS基因提供适合于在受体植物中STS酶组成型表达的启动子；(3)将基因载体转入受体植物，并(4)选择和培育含有高浓度和组成型水平的1，2-二苯乙烯的转化的植物。
为了检查内生的1，2-二苯乙烯合酶，按照已知的STS基因的保留区域构成的寡核苷酸可以作为探针，然后通过Southern印迹分析候选受体植物的基因组。
生物化学检测，例如HPLC，可以用于分析前体的水平。4-香豆酰基-辅酶A(4-Coumaroyl-CoA)和丙二酰-辅酶A是RS和其他1，2-二苯乙烯合酶共同的两个前体。作为选择，从具有相同的生物化学途径的其它中间体的水平可推断其高前体水平，例如自然状态下植物的“红色”的外表。“红色”是由于花青素的累积，它是RS的已知前体的中间体。
基因载体中的STS基因可以是从含有适当的STS基因的植物中分离的mRNA或基因组DNA而获得的cDNA。任何能够合成1，2-二苯乙烯系的植物都可以作为候选的原料植物。采用已知STS基因保留区域的同源低聚引物可以获得STS基因或STS基因中重要的cDNA。分离的STS DNA可以克隆到常规的基因载体中，这个载体带有一个常规的可选择标记物(例如抗生素阻抗基因)和一个常规启动子该启动子能引起嵌入的STS DNA的结构表达。
这种方法的特定的优选实施方式是，基因载体载着RS基因或编码RS酶的部分RS基因导致在转基因植物中以高浓度和组成型水平表达转基因白藜芦醇。采用自然产生花青素的非转基因植物适合作为转基因RS酶的前体。受体植物是一种红色的，显示出高含量的自然产生的花青素和它的前体的植物。
在另一优选的实施方式中，受体植物可以是通过组织培养方法再生并分析愈合组织的前体含量。愈合组织和植物幼苗中发现表达有高浓度和组成型水平的转基因白藜芦醇合酶(resveratrol synthase enzyme)的前体，这样的愈合组织和幼苗将被选择。要考虑到转化的植物(开始表达转基因RS酶并开始耗尽用于生物合成转基因1，2-二苯乙烯的前体)在组织培养过程中，甚至成长到成熟植物都能维持良好的健康。
这里所使用的STS基因指的是编码各种STS酶的基因族。STS酶催化1，2-二苯乙烯系的不同成员的合成。白藜芦醇合酶(RS)基因指的是编码白藜芦醇合酶(RS enzyme)的STS基因组的特定的成员。RS酶催化4-香豆酰基-辅酶A和丙二酰-辅酶A转变为3，4`，5-三羟基-反-1，2二苯乙烯(白藜芦醇)
红色用普通的方法就可以确定，可以通过眼睛观察到，并在本领域被广泛接受这是众所共知的。可以作为“红色”植物的例子包括红叶莴苣(Lactucasativa)、red bayam(Amaranthus species)、红甘蓝(Brassica oleracea)、红甜菜(Beta vulgaris)、紫甘蓝、红甜菜根、红苋属(red amaranthus)、红糖甘蔗、红菠菜、红西瓜(Citrullus lanatus)、红草莓(Fragaria species)、黑莓(raspberry)。
这里所使用的“健康”指的是健康的一般状态，包括植物的通常范围，如观察到的相关外观、例如大小和颜色。
这里所使用的“生育能力”指的是植物具有形成能萌芽的种子的能力。
附图说明
图1表示白藜芦醇和柚配基查尔酮的生物合成途径的最后步骤。
图2A-D是基因图：质粒pBI 121含有RS基因的遗传图(图2A)、R65RS基因的遗传图(图2B)，R14RS基因的遗传图(图2C)和R17RS基因的遗传图(图2D)。
图3是亲水曲线：(a)Vitis vinifera cv.Optima RS(pSV21)，(b)Arachishypogaea RS(arqresol)，(c)Pinus sylvestris STS(PSTS1)和(d)Phalenopsissp.BS(pBibsy811)。
图4A-D表示使用ClustraIW排列的4个存在的葡萄RS cDNA，pSV21，pSV25，pSV368和VVLSTS。用于分离全长Vitis vinifera cv的引物。Red FlameRS基因以框内部分标明。
图5是限制性酶切图：(a)葡萄RS(pSV21，pSV25，pSV368和VVLSTS)(b)葡萄RS基因内区(Vst1-1和Vst2-1)(c)Vitis vinifera cv.Red Flame cDNA(R1，R5和R8)(d)Vitis vinifera cv.Red Flame gDNA(G13，G14和G17)。框内区域是基因内区。
图6是在推定的葡萄RS cDNA R6，gDNA G14和葡萄RS VVLSTS之间的DNA排列。
图7是在推定的RS cDNA R12，gDNA G13和葡萄RS pSV21之间的DNA排列。
图8A-E是HPLC洗提图：RV分析对照(图8A)，含有质粒G14的转基因线(the transgenic lines)(图.8B)，G17(图.8C)，R1(图.8D)和R15(图.8E)。箭头表示RV峰。
具体实施方式
下列例子用于举例说明本发明的各方面的情况。
红叶莴苣中白藜芦醇的生产
Vitis vinifera cv.Red Flame的白藜芦醇合酶基因是用于这个例子中的1，2-二苯乙烯合酶基因，作为STS基因组中的一员用于克隆和转化。为了易于描述和理解，由转基因RS酶生成的RV和由转基因STS酶生成的1，2-二苯乙烯，分别称作转基因RV和转基因1，2-二苯乙烯。由于红叶莴苣含有高含量的花青素色素，而4-香豆酰基-辅酶A & 丙二酰-辅酶A是其前体，因而它被选为本例的RS基因受体植物。例如，柚配基查尔酮是花青素生物合成途径的中间体，4-香豆酰基-辅酶A和丙二酰-辅酶A是前体。如图1所示，4-香豆酰基-辅酶A和丙二酰-辅酶A也是已知的白藜芦醇(RV)的前体。因此，在转化莴苣中有大量的从RS转化为RV的前体。而且，将莴苣的各种品种自然存在的基因组与为各种已知的RV基因提供同源区的寡聚核苷酸杂交，检测RV相关基因的存在。Southern印迹分析表明没有杂交发生，说明在莴苣中没有内源的RS基因，按照本发明的优选实施方式它适合于作为受体植物。因此，在转基因红叶莴苣中可以获得高浓度和组成型水平的RV。
开始，从当地市场获得一些红葡萄(培育的Red Flame)。紫外照射这些葡萄10分钟以诱导白藜芦醇合酶的转录并等待12小时后提取紫外辐射的葡萄中的mRNA。我们制备RS基因的5`和3`低聚引物并通过反转录PCR，引出这个基因的cDNA序列。我们也提取red flame葡萄的基因组DNA并再通过PCR分离基因组RS基因(1基因内区)。RS是一种多重基因族。因此，我们对所有的基因绘制基因图，测定序列并表征。
我们选择2个全长的cDNA克隆(称为R1和R65)和2个基因组克隆(称为G14和G17)并通过花椰菜Mosiac病毒(CaMv)35S启动子连接它们到表达载体(pBI 121)中。通过BamH1和Sacl限制性酶切点将克隆R65、G14和G17连接到pBI 121中。通过BamH1和EcoR1限制性酶切点将克隆RI连接到pBI 121中。这些质粒表达载体随后转化到农杆菌(Agrobacterium)中(菌株LBA4404)。采用卡那霉素抗性选择的方法，选出了载有携带RS基因的pBI121的农杆菌。因此，我们获得了如图2A-D所示的包括4个不同结构的4个不同的农杆菌克隆。
同时，我们也筛选了5个不同种类的红莴苣并评定它们子叶外植体组织培养的再生能力。在组培莴苣中，由于Red Salad Bowl红叶莴苣品种具有最高和最快的再生能力，从而选择了它。
试验重复进行，子叶被切成2平方毫米面积的方块并在农杆菌中孵育30分钟。然后清洗，我们为Red Salad Bowl所做的组织培养记录如下。用150mg/L浓度的卡那霉素注射导入介质中来选择可再生殖的幼苗。促使这些幼苗生根并移植到外面生长30到35天，收集叶子用于RNA，DNA，并用HPLC提取白藜芦醇。
Northern和Southern分析表明RS基因(R1，R65，G14和G17)被表达了。按照白藜芦醇分析报告对叶子样品进行了有机溶剂萃取，并采用HPLC进行了分析，从西格玛化学(Sigma chemicals)买的纯白藜芦醇样品作为标准样。
对烟草植物的进行了类似的转化、选择的实验，并用普通绿色植物做阳性对照。
HPLC定量分析数据表明与烟草对照(最佳是大约0.36微克/克鲜叶)，转基因红莴苣能够产生高浓度和构成水平的白藜芦醇(超过4微克/克鲜叶)。转基因红莴苣能够产生10倍于转基因烟草的白藜芦醇，比较时都使用干重。未转基因的植物没有检测到白藜芦醇。从转基因红莴苣的花青素的定量分析获得了关键的观察资料和数据，与没有转化的对照相比，转基因红莴苣的花青素的含量下降一半。这些数据表明一些前体4-香豆酰基-辅酶A和丙二酰-辅酶A通过RS转向产生白藜芦醇，并且如果我们在这蔬菜中进一步地过量表达白藜芦醇合酶基因，红莴苣的白藜芦醇含量还有逐步增加到一个相当高的水平的潜能。过量表达的方法包括使用更强的结构启动子或双倍启动子，更有效的转化可使用滤过性病毒的最后序列，使用象肌动蛋白启动子那样的其他启动子。这个体系用于其他的有颜色的植物和水果中也显示出可获得高含量白藜芦醇产率的能力。设想我们每天吃100克蔬菜将为我们的身体每天提供大于400微克的白藜芦醇。因此，我们预见这种新发明能够为新的具有抗癌症、心血管疾病和其他潜在疾病的新的营养蔬菜的开发开辟新的道路。
下面是详细的获得转基因红叶莴苣的过程
选择和建立受体植物材料
4种不同的红莴苣，Lactuca sativa cv.Canasta，Lollo Rossa，Red Salad Bowl(Novartis种子公司，荷兰)和Red Rapid(Known-you种子公司，台湾)检测它们的红色和在组织培养中的再生能力。
按照克提斯(Curtis)等1995年，《分子生物学方法》(Methods in MolecularBiology)，44卷，美国修玛那出版社(Humana Press Inc.USA)，59-70页的描述进行整个再生过程，有一些修改。每种取10粒种子采用10％次氯酸钠表面灭菌10分钟然后用灭菌R.O.水洗三次。然后，将这些种子播种在装有50ml MS+B5培养基(西格玛索引号(Sigma Catalogue No.)M-5519)的250ml锥形瓶中并在23±2℃生长，16个小时的光周期，用光强为18umol/s/m²(日光荧光管)照射7天。
播种7天后的秧苗子叶被切开，留下叶柄，除掉子叶的顶端。用针沿着子叶的纹理扎进背轴面(abaxial surface)。子叶漂浮在UM液体培养基中(4.71g/LMS盐和维生素，30g/l蔗糖，2g/l酪蛋白水解物，2mg/l 2，4二氯苯氧基乙酸(2，4-D，Sigma)，0.25mg/l激动素，9.9mg/l维生素B1HCL，9.5mg/l维生素B6-HCL，4.5mg/l烟酸，5.5g/l植物凝胶(phytagel)，pH 5.8)10分钟，使它们的伤口表面与培养基接触。取出子叶并浸泡在UM琼脂培养基中。外植体在与发芽种子相同条件下培养两天。
在UM固体培养基中2天后，子叶转移到SI琼脂培养基上(4.71g/L MS盐和维生素，30g/l蔗糖，0.04mg/l NAA(萘乙酸)0.5mg/l苄基氨基嘌呤(BAP)，500mg/l羧苄青霉素，100mg/l氨中噻肟头孢菌素，150mg/l卡那霉素硫酸盐，5.5g/l植物凝胶，pH5.8)用背轴面与SI琼脂培养基接触。如培养发芽的种子一样培养子叶并每21天接种到新鲜的SI琼脂培养基上。
在49天后，产生愈合组织的外植体和幼苗被转移到50ml的SI琼脂培养基0.11％(w/v)2[N-吗啉]乙基磺酸(MES)。
幼苗长到接近1cm高时转移到250ml锥型瓶中，每瓶有50ml的生根琼脂培养基(4.71g/L MS盐和维生素，30g/l蔗糖，0.04mg/l NAA(萘乙酸)，150mg/l卡那霉素硫酸盐，5.5g/l植物凝胶，pH5.8)。这些幼苗在与发芽的种子相同的条件下培养。
葡萄STS基因的分离和基因载体的结构
植物材料
商业上方便的成熟的水果葡萄树Vitis cv.Red Flame用作分离葡萄树RS基因的植物材料。
总RNA和基因组DNA的提取
0.2g的Vitis cv.Red Flame外皮组织用研钵和槌在液氮中研碎。完整RNA和DNA均采用Knapp和Chandlee描述的相同的方法提取(从兰花组织的单一样品中少量制备RNA/DNA生物技术，(RNA/DNA Mini-Prep from a SingleSample of Orchid Tissue.Bio Techniques)21：54-56)，方法有一些修正。2ml提取缓冲液含有3％CTAB；2％PVP；1.42M NaCl；20mM EDTA，pH 8.0；100mM Tris，pH 8.0和5mM维生素C用于提取Vitis cv Red Flame外皮组织的总RNA或gDNA。这些样品在65℃加热15分钟，然后用氯仿萃取除去蛋白质。1/5体积的5％CTAB(5％CTAB和0.7M NaCI)加入样品的液相除去多糖并在65℃加热15分钟。用氯仿再萃取一次。加入2体积的冰冷的100％EtOH到样品的液相中并在-20℃培养15分钟。在室温以11,000rpm使用EppendorfrM5410C冷冻离心分离机离心分离15分钟获得颗粒状总RNA和gDNA。这些颗粒用70％EtOH清洗并在EppendorfrM浓缩器中干燥，然后溶解于50μl TE(10mM Tris-HCl，pH 8.0和1mM EDTA，pH 8.0).中。分离的3μl的总RNA或gDNA和1μl的载入缓冲液(0.025％溴苯酚蓝(bromophenol blue)，0.025％二甲苯苯胺(xylene cyanol)，30％甘油(glycerol)于1X TBE)与0.25μg的lambda DNA/HindIII和0.25μg phiX174 DNA/HaeIII标记物一起被载入到1％琼脂糖上。在100V下进行1/2小时水平凝胶电泳运。使用EtBr染色和Stratagene′sEagle.Eye II Junior系统文件而显现和计算出所提取的总RNA或gDNA的量和质量。
引物的确定
在生物技术信息国家中心(NCBI)网站基因银行(GenBank)获得了所有存在的Vitis cv Optima STS(pSV21，pSV25和pSV368)，Vitis cv.LambruscoaFoglia Frastagliata STS(VVLSTS)，Phalenopsis sp.BS(pBibsy811和pBibsy212)，Arachis hypogaea(peanut)STS(arqresol和a00769)和Pinussylvestris(Scots pine)STS(PSTS1和PSTS2)的基因序列。德克萨斯州休斯顿的Baylor医学院人类基因组中心使用ClustalW BCM多样序列检索装置，进行了所有同源性检索。
通过多种现有序列确定了分离全长葡萄藤RS基因使用的引物，这些序列是如图4A-D所示的pSV21，pSV25，pSV368(Melchior and Kindl，Optima.Arch.Biochem.and Biophy.288：552-557，1991)和VVLSTS(Spavoli F.Plant Mol.Biol.24：743-755，1994)。
在确定了引物的序列和引物的熔解温度后，由Gibco BRL常规寡核苷酸合成部门，美国L.T.I.，进行常规的商业合成。
总RNA的逆转录
1μg紫外诱导Vitis cv.Red Flame表皮总RNA、叶总RNA，作为模板允许3′引物-35GSTS2a在65℃热处理10分钟。在引物热处理后，用200个单位/μl Superscript^TMII逆转录酶(美国Gibco BRL，LTI，)，SuperscriptII^TM1X反应缓冲剂，10mM DTT和200uM dNTP，最终体积为50μl，对总RNA逆转录。在普尔金埃纳基因扩增(Perkin Ehner GeneAmp)PCR系统2400上在42℃进行1小时的逆转录，然后Superscript^TMII逆转录酶在70℃15分钟失活。
采用苯酚Tris-缓冲液和氯仿∶异戊醇(24∶1)萃取提纯cDNA。采用1/10体积3M醋酸钠和2.5体积冰冷100％EtOH沉淀水相。这些颗粒溶解到20μl的灭菌milli-Q水中。
cDNA和gDNA的聚合酶链式反应
通过聚合酶链式反应(PCR)在普尔金埃默基因扩增(Perkin ElmerGeneAmp)PCR系统2400中放大Vitis cv.Red Flame表皮的20μl的cDNA和20ng gDNA。PCR反应在总体积50μl的溶液中进行，包括：所提供的含有5个单位/μl Tlaermus flavus(Tfl)DNA聚合酶1X Tfl反应缓冲剂(美国Promega)、200ng/μl 5′引物35GSTS1和200ng/μl 3′引物35GSTS2a，200aM dNTP，1.5mM硫酸镁并用灭菌millin-Q水加至总体积50μl。
葡萄树RS基因的PCR放大在92℃进行持续5分钟，然后进行40个如下循环92℃变性1分钟，55℃退火2分钟，在72℃扩展2分钟。更进一步在72℃扩展6分钟完成PCR。
在1％的琼脂糖中进行水平凝胶电泳分离和定量分析5μl的PCR反应物。在确定所期望的MW片段存在后，采用1/10体积的10X STE(10mM Tris.Cl，pH8.0；100mM NaCl和1mM EDTA，pH 8.0)，1/10体积的4M NH₄OAc和2.5体积的冰冷的100％EtOH对剩余的45ul的PCR反应物进行选择沉淀。这些颗粒被溶解到TE中用于连接到pGEM-T(+)载体。
克隆到pGEM-T(+)中
采用pGEM-T(+)^TM载体系统试剂盒(美国Promega)将Vitis cv.Red Flame表皮的cDNA和gDNA PCR产物克隆到pGEM-T(+)载体。采用3个单位/ul的T4 DNA连接酶将这些cDNA和gDNA PCR产物以1∶3(载体：插入物)的比率连接到pGEM-T(+)载体，T4 DNA连接酶1X缓冲剂的总体积为10μl，并在16℃培养过夜。
在连接后，10μl的连接反应混合物转化到200μl的XL1-Blue充足的细胞中(美国Stratagene)。它们放进冰中10分钟，接着在37℃保持5分钟，然后在冰中1分钟。加入1ml的普通肉汤，37℃培养1小时。在1小时恢复期后，细胞在11,000rpm 30秒离心分离收集细胞，然后重新悬浮在50μl的普通LB肉汤中。和100μg/ml氨比西林一起50μl的肉汤被涂在1.5％的LB琼脂平皿上。这些平皿在37℃培养过夜。
在质粒小型制备后，遵循制造商推荐的条件采用限制性酶SalI和ClaI(美国NEB Biolabs)进行消化，带有正确嵌入尺寸的阳性克隆被选择。
推定的Vitis cv.Red Flame STS基因的特征
在推定的Vitis cv.Red Flame STS RS基因被分离后，采用限制性酶切图(图5)，序列分析(图6和7)并测绘的亲水曲线(图3)来描述它们的特征。
限制性酶切图
现有的葡萄藤RS基因(pSV21，pSV25，pSV368和WLSTS)的限制酶图采用网站Webcutter 2.0识别。按照所获得的限制性酶图，按照制造商的推荐的条件使用Pstl，Kpnl，和HindlI1(NEB，U.S.A.)消化Vitis cv.Red Flame RS基因的推定的克隆。在消化后，在1％琼脂凝胶上采用100V下水平凝胶电泳45分钟分析反应产物。采用Eagle-Eye II Junior文件系统(美国Stratagene)观察凝胶。
序列分析
采用双脱氧核苷酸链式终止法分析推定的Vitis cv Red Flame RS基因序列。与正向引物(ssDNA序列)和反向引物(dsDNA序列)一起使用Sequenase^TMVersion 2测序试剂盒(瑞典阿默森-法玛西亚(Amersham-Pharmacia))用于测序反应。反应产物用35S-dATP(美国NEN)标记。使用测序仪S2(SequencingApparatus S2)(美国L.T.I.，Inc.)在50W运行6％的聚丙烯酰胺凝胶。将其暴露在Kodax加强拍摄盒内的MR Bio-Max胶卷进行近16小时自动射线照相。用Kodax显影剂和Kodax定影剂冲洗胶卷。人工读序列。克隆R65的5`序列的前300碱基表明它属于葡萄RS基因的PSV21组。
亲水曲线
亲水曲线是由宾夕法尼亚州大学的生物化学和分子生物学支持的亲水作图网站对Vitis cv.Optima RS(pSV21)，Phalenopsis sp.BS(pBibsy811)，Arachishypogaea RS(arqresol)和Pinus sylvestris STS(PSTS1)测画的。按照Kyte和Dolittle方法作出亲水法曲线。
将Vitis cv.Red Flame RS基因克隆到表达载体中
4个克隆Vitis cv.Red Flame RS基因被克隆到表达载体pBI 121中。通过BamH1和Sacl限制性酶切，克隆R65、G14和G17被克隆到pBI 121载体中。通过BamH1和EcoR1限制性酶切，克隆R1被克隆到pBI 121中。由构成的CaMV35S RNA启动子驱动这些基因。克隆载体如图2A-2D所示。
含RS基因结构子的质粒转化到农杆菌LBA4404中
1.备足够的YEP用于转化时的液体培养基、接种和划线(restreak)。每次转化需要5ml的液体培养基、需要1ml用于外部生长、20-40ml用于平板接种。(YEP：10g细菌蛋白胨，10g细菌酵母萃取液，5g NaCl；10g/l固体植物用琼脂)
2.在28℃2ml YEP中培养农杆菌LBA4404菌落O/N。
3.将50ml YEP加入预先准备好的250ml的烧瓶中，在600nm的波长下，以250rpm震荡OD值达到0.5到1。
4.在冰上冷却孵育5分钟，以5,000rpm旋转5分钟。
5.小心倒出上清液并轻柔的重新严格在0℃将离心管中的沉淀用0℃的1ml的20mM的CaCl₂溶液中。
6.按0.1ml等分，并分别放入预先冷却的微型管中。
7.加入1μg DNA到小槽内，柔和的彻底的进行搅拌，然后在无水冰乙醇中浴进行冷冻。
8.将小槽放在37℃浴中5分钟。
9.加入1ml YEP并用柔和方式振动2-4小时培养。
10.离心分离管中以4000rpm离心分离45秒。用移液管尖移走所有的培养基只留下100-200μl，采用吹吸和/或涡流将细胞重新悬浮在留下的介质中并接种到25ug/ml卡那霉素。在28℃培养。菌落应该在2-3天出现。
由农杆菌转化红莴苣
1.用10％W/V次氯酸钠将莴苣种子、VarRed Salad Bowl表面灭菌10分钟，并用清洁的蒸馏水清洗3次。
2.在含有发芽培养基9cm直径的陪氏培养皿中使种子发芽(30个种子/培养皿)。以18umol/s/m²的强度照射下，在24℃培养16小时。
3.含二元载体pBI121结构子(R1，R65，G14和G17)的根癌农杆菌菌株LBA4404在LB培养基中，pH 7和50mg/L浓度的卡那霉素硫酸盐，2mg/L浓度的四环素-盐酸的条件下以210rpm振荡培养1天。
4.将20ml的UM琼脂培养基倒入9cm直径的陪氏培养皿中并固化。
5.将一张无菌的7cm直径的沃特曼(Whatman)滤纸在液体UM中浸泡并放在UM琼脂培养基表面上。
6.切除7天大的幼苗的子叶，留下完整的叶柄，但是去掉子叶的顶端。用一根细针刻离轴边。用解剖刀，在子叶的横向表面制作1mm间隔的浅的切口。在农杆菌液体培养基中漂浮子叶10分钟。除了不用农杆菌外进行相同的条件的对照实验。
7.取出子叶并用灭菌滤纸吸干，转移到预备好的UM培养皿上(每培养皿10个子叶)。在与使种子发芽相同的条件下培养2天。
8.如下制备实验平板：
9.A..没有农杆菌接种的对照移植体：
i.SI培养基
ii.SI培养基+100mg/L卡那霉素硫酸盐
iii.SI培养基+150mg/L卡那霉素硫酸盐
B.用农杆菌接种移植体：
i.SI培养基+100mg/L卡那霉素硫酸盐
ii.SI培养基+150mg/L卡那霉素硫酸盐
10.将外植体转移到SI培养基，将子叶的叶柄的末端插入培养基中大约2mm。象使种子萌芽那样进行培养并每17天更换新鲜的SI琼脂培养基做再培养。
11.40天以后，转移这些已经产生愈合组织和幼芽的外植体到250ml烧瓶中，每个烧瓶含有60ml SI琼脂培养基和0.11％w/V的羧苄青霉素。每个烧瓶4个外植体，在80umol/s/m²的高光强下培养。
12.当外植体的幼芽长到1cm时转移到生根培养基中，在80umol/s/m²的高光强下培养。
13.当生根后，小心的从这些容器中取出植物，清洗掉琼脂并将这些植物移植到10英寸的装满蛭石的罐中。将这些植物装进透明的聚乙烯袋中3天然后除去这些袋。植物在完全日光下生长并用Graviota施肥。在35天后将这些植株进行Northern，Southern化验，再经过有机溶剂提取后，用高压液相色谱分析白藜芦醇的产率。
转基因植物的选择
带有农杆菌的子叶在刺破后携带这些结构。然后子叶浸泡在UM琼脂培养基中(15个子叶/培养皿)并在23±2℃，光周期为16小时，18μmol/s/m²的光强(日光荧光管)的条件下培养2天。
两天后，这些子叶植入SI琼脂培养基，使离轴面与培养基接触。子叶在上述条件下生长。为了颜色选择，子叶每21天在新鲜的SI琼脂培养基中进行再次培养。约1mm的小幼芽并且颜色是红色的需要弃去，而粉红色和绿色的幼芽植入UM培养基2天。在这个阶段粉红或绿色的幼芽变为红色的也去掉，余留的粉红色或绿色的在新鲜的SI琼脂培养基中再培养。这些植物长到1cm高时移植到生根琼脂培养基中。
卡那霉素选择，在植入SI琼脂培养基中1周后，子叶转移到SI+150μg/ml卡那霉素硫酸盐琼脂培养基中。每4周再培养到SI+150μg/ml卡那霉素硫酸盐琼脂培养基中。
采用上述步骤，Red Flame RS基因被成功的克隆到红莴苣中并在转基因植物中产生转基因的白藜芦醇.采用上述方法获得的结果如下所示。
受体植物材料
检验4种变种的Lactuca sativa的花青素含量和在体外的再生能力。白藜芦醇的前体(也就是4-香豆酰基-辅酶A和丙二酰-辅酶A)的含量能够从花青素的含量推导出来，因为4-香豆酰基-辅酶A和丙二酰-辅酶A是这两种生物合成途径的共同前体。4-香豆酰基-辅酶A和丙二酰-辅酶A可以被本领域有经验的人员直接测量出来，也可以考虑本发明的范围。
表1显示子叶在UM培养基中2天后的红色分析，在SI培养基中14天后愈伤组织的颜色和Lactuca sativa cv.Canasta，Lollo Rossa，Red Rapid和RedSalad Bowl在SI培养基中37天后的再生能力。
如下表1所示，在UM培养基中2天后，Lactuca sativa cv.Red Salad Bowl的子叶显示出最浓的红色，Lactuca sativa cv.Lollo Rossa的子叶显示最淡的红色。SI培养基中2星期后形成的愈伤组织表明Lactuca sativa cv.Canasta，Lollo Rossa和Red Rapid有较多浅绿色的愈伤组织，而其它颜色的较少。至于Lactuca sativa cv.Red Salad Bowl的愈伤组织，红色的比其他颜色的比例更高。只有Lactuca sativa cv.Red Rapid和Red Salad Bowl有粉红、深红(dirty-red)和白色的愈伤组织。
表1：