用于发酵含CO的气态底物的方法
与相关申请的交叉引用
本申请要求均于2012年5月22日提交的美国临时申请号 61/650,098、61/650,093、61/650,077和61/650,084的权益，所有上述 临时申请以其整体通过参考并入本文。
技术领域
本发明提供了一种用于发酵含CO的气态底物(substrate)的方法。 更具体来说，使细菌在含CO的气态底物存在下形成芽孢然后萌发，以 提供接种物。得到的接种物有效地为发酵提供了具有1或更高的比STY 的乙醇生产率。
背景技术
产乙酸微生物可以通过气态底物的发酵从一氧化碳(CO)生产乙 醇。使用来自于梭状芽胞杆菌属(Clostridium)的厌氧微生物的发酵产 生乙醇和其他有用产物。例如，美国专利号5,173,429描述了杨氏梭菌 (Clostridium ljungdahlii)ATCC号49587，这种厌氧微生物从合成气体 生产乙醇和乙酸盐。美国专利号5,807,722描述了一种使用杨氏梭菌 (Clostridium ljungdahlii)ATCC号55380将废气转变成有机酸和醇类 的方法和装置。美国专利号6,136,577描述了一种使用杨氏梭菌 (Clostridium ljungdahlii)ATCC号55988和55989将废气转变成乙醇 的方法和装置。
许多产乙酸微生物不太适合工业规模的生物过程，因此没有显示出 用于此目的的商业可行性。这样的微生物具有缓慢的倍增时间和低的总 生产率。此外，许多用于基因操作的技术(敲除、通过整合或游离体质 粒繁殖的转入基因的过表达)低效、耗时、费力或不存在。
可以生长产乙酸微生物以从一氧化碳生产乙醇。所述生长过程可能 包括将产乙酸细菌在随时间增加的量的CO上进行培养。对于更快地开 发微生物以及使用它们利用合成气或其他气态碳源生产所需化学品和 燃料的方法，仍存在需求。
发明概述
一种用于发酵含一氧化碳(CO)的气态底物的方法，包括供应能 够使用所述含CO的气态底物作为唯一碳源和能源生长的细菌细胞的 接种物。所述方法包括供应所述气态底物以维持至少约0.25mmol/g细 胞的比CO摄入率(specific CO uptake)，并供应营养培养基。在一种 情况下，所述细菌细胞的接种物通过包括在含CO的气态底物存在下形 成芽孢然后萌发的过程来生产。所述方法有效地提供了约1g乙醇/ (L·天·克细胞)或更高的比STY。
附图简述
所述方法的几种情况的上述和其他方面、特点和优点，从下面的附 图将变得更加明显。
图1示出了在甲醇上培养并降低pH后，食甲基丁酸杆菌 (Butyribacterium methylotrophicum)通过芽孢形成和萌发在合成气上的 生长。
图2示出了在酵母提取物、甲醇上培养并酸化后，食甲基丁酸杆菌 (Butyribacterium methylotrophicum)通过芽孢形成和萌发在合成气上的 生长。
图3示出了在酵母提取物上培养并酸化后，食甲基丁酸杆菌 (Butyribacterium methylotrophicum)合成气上的生长。
图4示出了在预先将食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)在合成气上生长后，食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)在合成气上的生长。
图5示出了在酵母提取物上培养并降低pH后，产乙醇梭菌 (Clostridium autoethanogenum)在合成气上的生长。
图6示出了在酵母提取物上培养并降低pH后，杨氏梭菌 (Clostridium ljungdahlii)在合成气上的生长。
图7示出了发酵合成气的杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)在果 糖上的生长。
详细描述
下面的描述不应以限制性意义对待，而是仅仅出于描述示例性实施 方式的一般性原理的目的做出。本发明的范围应该参考权利要求书确 定。
本文描述的方法有效地为发酵提供了高水平的乙醇生产率。就此而 言，所述方法有效地提供的比STY(用g乙醇/(L·天·g细胞)表示的比 空间时间产率)为至少约1，在另一种情况下约1至约10，在另一种情 况下约2至约8，在另一种情况下约3至约7并且在另一种情况下约4 至约6。
定义
除非另有定义，否则在本公开的整个本说明书中使用的下列术语被 定义如下，并且可以包括下面规定的定义的单数或复数形式：
修饰任何量的术语“约”是指所述量在真实世界条件下，例如在实 验室、中试工厂或生产设施中遇到的变化性。例如，在混合物中使用的 成分的量或测量值或数量，当用“约”修饰时，包括在生产厂或实验室 中的实验条件下的测量中通常使用的变化性和照管程度。例如，产物的 组分的量，当用“约”修饰时，包括在工厂或实验室中的多次实验中批 次之间的变化性，以及分析方法中固有的变化性。不论是否用“约”修 饰，所述量包括那些量的等同量。本文中陈述的并且用“约”修饰的任 何数量，当所述量没有被“约”修饰时，也可用于本公开。
术语“合成气”或“合成气体”是指为含有不同量的一氧化碳和氢 气的气体混合物命名的合成气体。生产方法的实例包括天然气或烃类的 蒸汽重整以产生氢气，煤的气化，以及在某些类型的废物变能量的气化 设施中。所述名称来自于它们在产生合成天然气(SNG)和用于生产氨 或甲醇中用作中间体。合成气是可燃的，并且通常被用作燃料源或作为 生产其他化学品的中间体。
术语“发酵”、“发酵方法”或“发酵反应”等，打算涵盖所述方 法的生长阶段和产物生物合成阶段两者。在一种情况下，发酵是指CO 向醇类的转化。
术语“细胞密度”是指每单位体积发酵液的微生物细胞的质量，例 如克/升。
术语“细胞回收利用”是指从发酵培养液分离微生物细胞，并将全 部或一部分分离到的微生物细胞返回到发酵罐。一般来说，使用过滤装 置来实现分离。
产乙酸培养物
在一种情况下，所述方法包括在可能包含第一底物的第一培养基中 培养或繁殖细菌。所述第一培养基可以为细菌提供适合的碳源和能源以 及其他营养物，包括生长因子。就此而言，第一培养基包括诸如维生素、 微量元素和氨基酸的组分。第一培养基可以包含碳源，其包括酵母提取 物、糖类、醇、氨基酸、蛋白胨(peptone)、肽、蛋白质、脂肪酸、脂 质及其混合物。例如，由培养物保藏中心例如ATCC提供的细菌，可能 包括推荐的培养基，其包含诸如蛋白胨、葡萄糖、果糖、酵母提取物、 氨基酸、维生素和微量元素的组分。第一培养基可以提供允许细胞密度 快速增加的组分。就此而言，第一培养基可以具有约5.7至约7.0的pH。 可以利用的第一培养基的一些实例包括ATCC培养基1754 (http://www.atcc.org/Attachments/2940.pdf)、ATCC培养基1136(含 有0.1％酵母提取物、50mM乙酸钠和100mM甲醇， http://www.atcc.org/Attachments/2408.pdf)、ATCC培养基1019 (http://www.atcc.org/Attachments/3112.pdf)和ATCC培养基1016 (http://www.atcc.org/Attachments/2299.pdf)。
在另一种情况下，所述第一培养基和底物有效地维持约0.005g/L 或更高、在另一种情况下约0.02g/L或更高、在另一种情况下约0.03g/L 或更高、在另一种情况下约0.04g/L或更高、在另一种情况下约0.05g/L 或更高、在另一种情况下约0.1g/L或更高、在另一种情况下约0.3g/l 或更高、在另一种情况下约0.5g/L或更高、在另一种情况下约0.75g/L 或更高并且在另一种情况下约1.0g/L或更高的细胞密度。
在一种情况下，所利用的微生物包括产乙酸细菌。有用的产乙酸细 菌的实例包括梭状芽胞杆菌属(Clostridium)的细菌，例如杨氏梭菌 (Clostridium ljungdahlii)菌株，包括在WO 2000/68407、EP 117309、 美国专利号5,173,429、5,593,886和6,368,819、WO 1998/00558以及 WO 2002/08438中所描述的；产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum) 菌株(德国DSMZ的DSM 10061和DSM 19630)，包括在WO 2007/117157和WO 2009/151342中所描述的；以及拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)(P11，ATCC BAA-622)和Alkalibaculum bacchi(CP11， ATCC BAA-1772)，包括分别在美国专利号7,704,723和“来自于生物 质产生的合成气体的生物燃料和生物产品”(Biofuels and Bioproducts from Biomass-Generated Synthesis Gas，Hasan Atiyeh，在Oklahoma EPSCoR年度国家会议上的报告，2010年4月29日)中所描述的；以 及在美国专利申请号2007/0276447中描述的食一氧化碳梭菌 (Clostridium carboxidivorans)(ATCC PTA-7827)。其他适合的微生 物包括穆尔氏菌属(Moorella)的微生物和一氧化碳嗜热菌属 (Carboxydothermus)的微生物，所述穆尔氏菌属的微生物包括穆尔氏 菌Moorella sp.HUC22-1。每个这些参考文献通过参考并入本文。可以 使用两种或更多种微生物的混合培养物。
有用的细菌的一些实例包括凯伍产醋菌(Acetogenium kivui)、潮 湿厌氧醋菌(Acetoanaerobium noterae)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、Alkalibaculum bacchi CP11(ATCC BAA-1772)、延长布劳特 氏菌(Blautia producta)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、Caldanaerobacter subterraneous、Caldanaerobacter subterraneous pacificus、生氢一氧化碳嗜热菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、丙酮丁醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)P262(德国DSMZ的DSM 19630)、产乙醇梭菌 (Clostridium autoethanogenum)(德国DSMZ的DSM 19630)、产乙 醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)(德国DSMZ的DSM 10061)、 产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)(德国DSMZ的DSM 23693)、产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)(德国DSMZ的 DSM 24138)、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)P7(ATCC PTA-7827)、Clostridium coskatii(ATCC PTA-10522)、德雷克氏梭菌 (Clostridium drakei)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)PETC(ATCC 49587)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)ERI2(ATCC 55380)、 杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)C-01(ATCC 55988)、杨氏梭菌 (Clostridium ljungdahlii)O-52(ATCC 55889)、大梭菌(Clostridium magnum)、巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)(德国DSMZ的DSM 525)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdali)P11(ATCC BAA-622)、粪味 梭菌(Clostridium scatologenes)、热醋酸梭菌(Clostridium thermoaceticum)、突那梭菌(Clostridium ultunense)、库氏脱硫肠状 菌(Desulfotomaculum kuznetsovii)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、 硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)、食乙酸甲烷八叠球菌 (Methanosarcina acetivorans)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、Morrella thermoacetica、Morrella thermoautotrophica、繁氏 产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)、产生消化链球菌(Peptostreptococcus productus)、产物瘤胃球菌(Ruminococcus productus)、凯伍热厌氧杆 状菌(Thermoanaerobacter kivui)及其混合物。
芽孢形成
在第一培养基和第一底物中建立细菌之后，减少第一底物的量。第 一培养基中的组分浓度也可以随着第一底物一起降低。就此而言，可以 将第一培养基用生产培养基替换。在其他情况下，第一底物和所选底物 可能相同，或者它们可能不同。
在一种情况下，第一培养基和第一底物可以使用高至与用于供应生 产培养基的泵的最大速率相同的最大速率进行替换。在另一种情况下， 可以将细菌从第一培养基浓缩，例如采取细胞团粒的形式，并直接转移 到生产培养基中。
在另一种情况下，在芽孢形成之前，可以添加碳源以维持约0.005 g/L或更高、在另一种情况下约0.02g/L或更高、在另一种情况下约0.03 g/L或更高、在另一种情况下约0.04g/L或更高、在另一种情况下约0.05 g/L或更高、在另一种情况下约0.1g/L或更高、在另一种情况下约0.3g/l 或更高、在另一种情况下约0.5g/L或更高、在另一种情况下约0.75g/L 或更高并且在另一种情况下约1.0g/L或更高的细胞密度。可以添加的 碳源的一些实例包括酵母提取物、醇、糖类、氨基酸、蛋白胨、肽、蛋 白质、脂肪酸、脂质及其混合物。
减少第一底物的输入有效地引起至少一部分细菌形成芽孢。芽孢通 过母细胞细胞质内的细胞内分裂来形成。形成芽孢的细菌对不利环境变 化例如营养物限制作出响应启动芽孢形成。在形成后，成熟的芽孢从母 细胞释放(对于其他的详细情况，参见Brun等主编的《原核生物发育》 (Prokaryotic Development)，“形成内生芽孢的细菌：综述” (Endospore-forming bacteria:an overview)，A.L.Sonenshein.主编，2000, 美国微生物学会:Washington,D.C.133-150；Cutting,S.主编的《芽孢杆 菌的分子生物学方法》(Molecular Biology Methods for Bacillus)，“芽 孢形成、萌发和长出“(Sporulation,germination and outgrowth)，W.L. Nicholson和P.Setlow主编，1990，John Wiley and Sons:Sussex,England. 391-450，所述文献通过参考并入本文)。芽孢的形状通常为卵形或球形， 并且比营养性细菌细胞更宽。其他与众不同的芽孢形式包括纺锤状、球 棒状形式和网球拍状结构。
就此而言，将第一底物以有效地提供至少约0.05的芽孢数比细胞 数比率、在另一种情况下至少约0.1的芽孢数比细胞数比率并且在另一 种情况下至少约0.5的芽孢数比细胞数比率的量减少。芽孢可以使用已 知方法来定量，例如目测检查和使用血细胞计数器计数。
萌发
根据所述方法，向细菌芽孢加入生产培养基中的所选底物。所选底 物的添加有效地引起芽孢萌发。当芽孢通过萌发向细胞分裂发展时，存 在各个不同阶段，包括(1)芽孢活化；(2)萌发阶段I，在此期间水 使芽孢核心部分重新水化；(3)萌发阶段II，在此期间发生皮层水解 并且代谢恢复；以及(4)长出，在此期间发生细胞分裂(对于其他详 细情况，参见Setlow,P.，“芽孢萌发“(Spore germination)，Curr Opin Microbiol,2003.6:p.550-556；Foster,S.J.等，“扣动扳机：细菌芽孢萌 发的机制”(Pulling the trigger:the mechanism of bacterial sporegermination)，Mol Microbiol,1990.4:p.137-141；以及Moir等， “芽孢萌发”(Spore germination)，Cell Mol Life Sci,2002.59:p. 403-409，所述每个文献通过参考并入本文)。
根据所述方法，萌发有效地提供至少约0.04的芽孢比细胞数比率， 在另一种情况下至少约0.01的芽孢比细胞数比率，并且在另一种情况下 至少约0.001的芽孢比细胞数比率。在所选底物是CO的情况下，方法 有效地提供至少约0.25mmole/分钟/g细胞、在另一种情况下至少约0.50 mmole/分钟/g细胞、在另一种情况下至少约0.75mmole/分钟/g细胞并 且在另一种情况下至少约1.0mmole/分钟/g细胞的比CO摄入率。
生产培养基是含有较低浓度的用于生长的营养物的培养基。生产培 养基可以含有用于细菌生长的碳源、各种盐类，所述盐类可以随着细菌 物种和生长条件而变；它们通常提供必需元素例如镁、氮、磷和硫，以 允许细菌合成蛋白质和核酸。生产培养基可以具有约5至约4.1的pH。 在一种情况下，由生产培养基提供的唯一的碳由合成气提供。生产培养 基的一个实例如下：
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在一种情况下，所述培养基包括一种或多种氮源、磷源和钾源。所 述培养基可以包括这三类物质中的任一种、这三类物质的任何组合，并 且在重要的情况下包括所有这三类物质。氮源可以包括选自氯化铵、磷 酸铵、硫酸铵、硝酸铵及其混合物的氮源。磷源可以包括选自磷酸、磷 酸铵、磷酸钾及其混合物的磷源。钾源可以包括选自氯化钾、磷酸钾、 硝酸钾、硫酸钾及其混合物的钾源。
在一种情况下，所述培养基包含铁、钨、镍、钴、镁、硫和硫胺素 中的一种或多种。培养基可以包含这些组分中的任一种、任何组合，并 且在重要的情况下，包括所有这些组分。铁可以包括选自氯化亚铁、硫 酸亚铁及其混合物的铁源。钨源可以包括选自钨酸钠、钨酸钙、钨酸钾 及其混合物的钨源。镍源可以包括选自氯化镍、硫酸镍、硝酸镍及其混 合物的镍源。钴源可以包括选自氯化钴、氟化钴、溴化钴、碘化钴及其 混合物的钴源。镁源可以包括选自氯化镁、硫酸镁、磷酸镁及其混合物 的镁源。硫源可以包括半胱氨酸、硫化钠及其混合物。
在一种情况下，生产培养基包括仅由所选底物例如CO提供的碳源。 就此而言，生产培养基可以具有少于约0.01g/L的由所选底物提供的碳 之外的碳源。其他添加的碳的实例可以包括酵母提取物、醇、肽、蛋白 质、脂肪酸、脂质及其混合物。
合成气
合成气可以从任何已知来源提供。在一种情况下，合成气可以源自 于含碳材料的气化。气化包括生物质在受限的氧供应中的部分燃烧。得 到的气体主要包括CO和H2。就此而言，合成气含有至少约10摩尔％ 的CO，在一种情况下至少约20摩尔％，在一种情况下约10至约100 摩尔％，在另一种情况下约20至约100摩尔％的CO，在另一种情况下 约30至约90摩尔％的CO，在另一种情况下约40至约80摩尔％的CO， 并且在另一种情况下约50至约70摩尔％的CO。合成气将具有至少约 0.75的CO/CO2比率。适合的气化方法和装置的某些实例提供在均于 2011年4月6日提交的美国系列号13/427,144、13/427,193和13/427,247 中，所有所述文献通过参考并入本文。
在另一种情况下，用于繁殖产乙酸细菌的合成气可以基本上是CO。 当在本文中使用时，“基本上是CO”意味着至少约50摩尔％的CO， 在另一种情况下至少约60摩尔％的CO，在另一种情况下至少约70摩 尔％的CO，在另一种情况下至少约80摩尔％的CO，并且在另一种情况 下至少约90摩尔％的CO。
生物反应器运行
根据一个方面，通过向反应器容器添加培养基来启动发酵方法。将 培养基灭菌以除去不想要的微生物，并用所需微生物接种反应器。
在接种后，建立初始进料气体供应速率，以有效地供应初始微生物 群体。分析流出物气体以确定流出物气体的含量。将气体分析的结果用 于控制进料气体速率。在达到所需水平后，从反应器抽出液体相和细胞 物质并用培养基补充。
实施例
实施例1：在甲醇上培养并降低pH后，食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)在合成气上的生长
接种物制备：将食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum) 在血清瓶(13瓶，每瓶25ml)中，在BM培养基中生长。BM培养基 具有下列组成：
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在压热灭菌后：
9)Wolfe的维生素溶液 10
10)半胱氨酸-硫化物还原剂 20
11)甲醇(100％) 10
Wolfe的矿物质溶液可以从ATCC获得(微量矿物质增补剂，目录 号MD-TMS)。
Wolfe的维生素溶液可以从ATCC获得(维生素增补剂，目录号 MD-VS)。
混合流程：
将#1到#8混合，压热灭菌，在N2下冷却
转移到厌氧箱，加入#9到#11(厌氧并灭菌)
调整到pH7.2
生物反应器运行：用如上所述生长的325ml食甲基丁酸杆菌 (Butyribacterium methylotrophicum)接种生物反应器。在开始时向生物 反应器加入甲醇(92.5mL/L)，以增加培养物的初始细胞密度(0.049 g/L)。如下所述将生长培养基逐渐用生产培养基(低pH最低培养基， 使用合成气作为唯一碳源)替换。
培养基更换事件
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培养物的目测评估
359 将培养基瓶改变成不含甲醇的生产培养基
383 培养物的目测评估
360 向反应器加入5ml甲醇
向培养基瓶加入20ml MPFN/L
407 向培养基瓶加入14.7ml ATCC维生素/L
培养物的目测评估
480 培养物的目测评估
通向反应器的生长培养基流速的变化
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生产培养基(其制备描述在通过参考并入本文的美国专利号 7,285,402中)
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如上所述，在15天时间段内将生物反应器中的甲醇两次降低50％， 然后完全除去。在从培养基除去甲醇后2天，加入MPFN(其含有Ni)。
结果：目测观察提供了下列指示：
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监测培养物参数包括细胞质量、比CO摄入率和比H2摄入率。如 图1中所示，比CO和比H2摄入率在约450小时时开始增加。
实施例2：使用预先在合成气上生长的冷冻的食甲基丁酸杆菌 (Butyribacterium methylotrophicum)的反应器启动
将600毫升从实施例1收获的冷冻的食甲基丁酸杆菌 (Butyribacterium methylotrophicum)接种在1400ml生产培养基中。起 始细胞密度为0.39g/L。监测CO消耗率，并且它在前24小时内高于0.4 mmole/分钟/g。
实施例3：在酵母提取物、甲醇上培养并酸化后食甲基丁酸杆菌 (Butyribacterium methylotrophicum)在合成气上的生长
接种物制备：将食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum) 在血清瓶中，在包含酵母提取物并具有7.2-7.4的pH的培养基中生长。 培养基如Heiskanen等，(2007)Enzyme and Microbial Technology,Vol. 41，第3期，第362-367页中所描述，所述文献通过参考并入本文。
生物反应器操作：将含有1升如上所述的培养基的生物反应器用 100ml如上所述生长的食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)接种。起始细胞密度为0.04g/L。
按照下列流程向生物反应器加入酵母提取物，以提高细胞密度：
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酵母提取物的组成：20％，在DI水中
向生物反应器加入乙酸溶液以降低pH。乙酸溶液和添加流程如下：
乙酸溶液
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乙酸溶液添加流程
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在253.8小时时加入甲醇(26.92ml 10％的溶液)以提高细胞密度。 如下所述将生长培养基逐渐用生产培养基(低pH最低培养基，使用合 成气作为唯一碳源)替换。
通向反应器的生长培养基流速的变化
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结果：目测观察提供下列指示：
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监测培养物参数包括细胞质量、比CO摄入率和比H2摄入率。如 图2中所示，比CO和比H2摄入率在约450小时时开始增加。
实施例4：在酵母提取物上培养并酸化后食甲基丁酸杆菌 (Butyribacterium methylotrophicum)在合成气上的生长
接种物制备：将食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum) 在血清瓶中在如实施例3中所述的培养基中生长。
生物反应器操作：将生物反应器用350ml如上所述生长的食甲基 丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)接种。将上述350ml食 甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)接种物转移到1250ml 含有酵母提取物的生长培养基中。反应器中的初始生长培养基的组成如 下：
初始生长培养基
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无机盐溶液：(80g/L NaCl，100g/L NH4Cl，10g/L KCl，10g/L KH2PO4，20g/L MgSO4·7H2O，4g/L CaCl2·H2O)
在接种后，没有可测量的合成气被培养物的消耗。作为提高培养物 的细胞密度的方式，在下面指出的时间点时向反应器加入酵母提取物。 通过按照下面表中的指示向反应器加入乙酸溶液(如上所述)，将反应 器的pH逐渐改变到4.7。也按照下面表中的指示将反应器中的培养基逐 渐更换成所需生产培养基(如上所述)。
添加酵母提取物以提高反应器中的初始细胞质量：
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酵母提取物的组成：20％，在DI水中。
添加乙酸溶液以降低反应器中的pH：
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将反应器中的培养基用低pH、无酵母提取物的生产培养基更换：
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结果：目测观察提供了下列指示：
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监测培养物参数包括细胞质量、比CO摄入率和比H2摄入率。如 图3中所示，比CO和比H2摄入率在约600小时时开始增加。
实施例5：用预先在合成气上生长的食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)接种含有低pH生产培养基的生物反应器
将来自于实施例4的细菌在血清瓶中在MES培养基(不含酵母提 取物或果糖)维持28天。对这些血清瓶进行顶部空间气体组成的定期 检查，并且在需要时用合成气重新填充。
将生物反应器用210ml在上述血清瓶中生长的食甲基丁酸杆菌 (Butyribacterium methylotrophicum)接种。将210ml食甲基丁酸杆菌 (Butyribacterium methylotrophicum)转移到1升不含酵母提取物或任何 有机碳底物的生产培养基(如本文中所述)中。接种后，培养物的初始 细胞密度和pH分别为0.03 g/L和4.7。
通向反应器的生产培养基流速
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结果：目测观察提供了下列指示：
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监测培养物参数包括细胞质量、比CO摄入率和比H2摄入率，并 示出在图4中。
实施例6：通过芽孢形成和萌发改造产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)以适应于在低pH培养基(无酵母提取物)中利用合 成气
接种物制备：产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)的接种 物如下制备：
接种物生长培养基
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无机盐溶液：(80g/L NaCl，100g/L NH4Cl，10g/L KCl，10g/L KH2PO4，20g/L MgSO4·7H2O，4g/L CaCl2·H2O)
生物反应器操作：将生物反应器用在如上所述含有酵母提取物和果 糖的培养基中生长的产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)接种。 反应器中培养物的初始pH为4.7，并且细胞密度为0.03g/L。在接种后 没有可测量的合成气被培养物的消耗。
在接种后前20小时，不存在细胞密度增加。如下面所指示的向反 应器加入果糖和酵母提取物以使条件更加有利，并且也作为提高培养物 的初始细胞密度的方式。此外，如下面所指示的将反应器用细菌进一步 接种三次。进行上述另外的接种是为了进一步提高反应器的初始细胞密 度。在整个实验期间，如下所指示，将反应器中的培养基逐渐更换成生 产培养基(如本文中所述)。在这一过程中，反应器中的细菌形成芽孢， 并萌发成可以在不含酵母提取物和果糖的低pH最低培养基中利用合成 气的培养物。通过添加如下所述的两种还原剂之一，将反应器中培养物 的氧化还原电位维持在低于-140 mv。
添加酵母提取物以提高反应器中的初始细胞质量：
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酵母提取物的组成：20％，在DI水中
添加果糖以提高反应器中的初始细胞质量：
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果糖的组成：25％，在DI水中
将反应器用在丰富培养基中生长的产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)另外接种：
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在实验中使用的还原剂的组成：9g/L NaOH，40g/L L-半胱氨酸， 40g/L Na2S，H2O，TiCl3(Sigma Aldrich 14010)。
反应器中的培养基从初始生长培养基向生产培养基的更换：
过程时间(小时) 通向反应器的最低培养基流速的变 化，每升的添加体积和培养基类型
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结果：目测观察提供了下列指示：
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监测培养物参数包括细胞质量、比CO摄入率和比H2摄入率，并 示出在图5中。
实施例7：通过芽孢形成和萌发改造杨氏梭菌(Clostridium ljungdahli)PETC以适应于在低pH培养基(无酵母提取物)中利用合 成气
接种物制备：杨氏梭菌(Clostridium ljungdahli)PETC接种物首先 生长在如下所述的pH5.7的含有(0.1％)酵母提取物和(1％)果糖的 培养基中。上述接种物培养物中的酵母提取物和果糖，通过将那些培养 物(160ml)转移到不含酵母提取物和果糖的相同生长培养基(1000ml) 中进行稀释。在将这种培养物在37℃下温育5天后，将930ml该培养 物转移到含有1200ml如下所述的最低培养基的种子反应器。在温育16 天后，将200ml该种子培养物转移到含有1200ml相同的上述最低培养 基的另一个反应器。反应器中培养物的初始pH为5.4，初始细胞密度为 0.05g/L。
用于生长接种物细菌的培养基：
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无机盐储用溶液：(80g/L NaCL，100g/L NH4Cl，10g/L KCL，10 g/L KH2PO4，20g/L MgSO4·7H2O，4g/L CaCl2·H2O)
还原剂组成：9g/L NaOH，40g/L L-半胱氨酸，40g/L Na2S，1L H2O。
生产培养基：0.15g/L KCl，0.5g/L MgCl2·6H2O，0.2CaCl2.2H2O， 2g/L NH4Cl，0.6g(NH4)2HPO4，0.2g/L NaCl，0.45g/L半胱氨酸。10ml/L 微量矿物质增补剂：(100ml/L 85％H3PO4，0.3g/L MgSO4·7H2O，0.5g/L MnSO4·H2O，1.g/L NaCl，0.1g/L FeSO4·7H2O，0.1g/L Co(NO3)2·6H2O， 0.1g/L CaCl2，0.1g/L ZnSO4·7H2O，0.01g/L CuSO4·5H2O，0.02g/L AIK(SO4)2·12H2O，0.01g/L H3BO3，0.01g/L Na2MoO4·2H2O，0.001g/L Na2SeO3，0.01g/L Na2WO4·2H2O，0.02g/L NiCl2·6H2O)。10ml/L维 生素(0.002g/L叶酸，0.01g/L盐酸吡哆醇，0.005g/L核黄素，0.026g/L 生物素，0.065g/L硫胺素，0.005g/L烟酸，0.0353g/L泛酸钙，0.0001g/L 维生素B12，0.005g/L对氨基苯甲酸，0.005硫辛酸，0.9g/L磷酸单钾)。
生物反应器操作：作为提高培养物的细胞密度的方式，在下面指出 的时间点向反应器添加果糖。如下所示，逐渐增加通向反应器的(最低) 培养基流速，以向培养物提供营养物，稀释生长培养基中的果糖，并且 也将培养物的pH降低到4.9(从5.4)。
添加果糖以提高反应器中的初始细胞质量：
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果糖的组成：20％，在DI水中
通向反应器的生产培养基流速：
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结果：目测观察提供了下列指示：
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监测培养物参数包括细胞质量、比CO摄入率和比H2摄入率，并 示出在图6中。
实施例8：杨氏梭菌(Clostridium ljungdahli)的反向适应
将杨氏梭菌(Clostridium ljungdahli)生长在含有30ml含有或不含 果糖和含有或不含合成气的下述生长培养基(pH调整到5.7)的血清瓶 中。杨氏梭菌(C.ljungdahli)培养物在37℃振摇(60rpm)温育器中 生长。
将使用合成气作为碳源和能源在上述生长培养基中生长的杨氏梭 菌(C.ljungdahli)转移到含有相同生长培养基但增补有1％果糖的血清 瓶(标为果糖)中。该血清瓶不含合成气。出于比较目的，也将使用合 成气作为碳源和能源的杨氏梭菌(C.ljungdahli)转移到含有合成气和生 长培养基(无果糖)的血清瓶(标为合成气)中。
正如在下面的表和图7中所指出的，转移到果糖中的发酵合成气的 杨氏梭菌(C.ljungdahli)，在使用果糖作为能源和碳源开始生长之前经 历芽孢形成和萌发的周期。
目测观察提供了下列指示：
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用于生长细菌的培养基：10g/L MES，12.5ml/L无机盐储用溶液(80 g/L NaCL，100g/L NH4Cl，10g/L KCL，10g/L KH2PO4，20g/L MgSO4·7H2O，4g/L CaCl2·H2O)，10.0ml/L ATCC微量矿物质增补剂， 10.0ml/L ATCC维生素增补剂，10.0ml/L还原剂，0.001g/L刃天青。
无机盐储用溶液：(80g/L NaCL，100g/L NH4Cl，10g/L KCL，10 g/L KH2PO4，20g/L MgSO4·7H2O，4g/L CaCl2·H2O)
还原剂组成：9g/L NaOH，40g/L L-半胱氨酸，40g/L Na2S，1l H2O。
尽管本文公开的发明已利用其具体实施方式、实施例和应用进行描 述，但是本领域技术人员可以对其做出大量修改和改变，而不背离在权 利要求书中提出的本发明的范围。