GLP-1和基础胰岛素的预混合物 本发明涉及类胰高血糖素肽(glucagon like peptide)和基础胰岛素(basal insulin)的预混合制剂。这些预混合的制剂可被用于治疗诸如非胰岛素依赖型糖尿病和胰岛素依赖型糖尿病的疾病。
长期以来，糖尿病治疗的一个目标是施用药剂以产生一种胰岛素分泌模式，该模式模拟在正常个体中的内源胰岛素分泌模式。对胰岛素的每日生理需求是变化起伏的，并且可分为两个阶段：(a)吸收期，该阶段需要胰岛素的脉冲(pulse)以处理饮食相关的血糖高涨(surge)，以及(b)后吸收期，该阶段需要胰岛素的持续供给以调控用于维持最佳空腹血糖的肝糖输出(hepatic glucose output)。
口服药剂一旦无法充分地控制II型糖尿病的血糖，那么获得近似正常的血糖控制并且由此而将同糖尿病相关的并发症降至最低则至为重要。当口服药物无效时，唯一的替代方法是以胰岛素治疗患者，该治疗必须针对饮食相关的葡萄糖偏移(excursion)以及在空腹期间的肝糖输出进行定剂量和定时，从而在避免血糖过低的情况下有效地使糖正常化。在不产生诸如血糖过低这样的副作用的情况下，对涉及到处理饮食相关的血糖高涨的第一阶段进行控制通常是最难达到的。这是因为药物治疗的剂量必须受时间控制，以使血液胰岛素水平在进餐后的葡萄糖水平高涨时达到高峰。例如，如果诱导胰岛素的药物治疗在进餐前的太长时间进行，则血糖过低的危险性会很高，这可能导致昏迷甚至死亡。进一步，如果该药物治疗在进餐太长时间后进行，则血糖水平将在进餐后维持很高，长期这样将导致严重的并发症。
已经开发了多种胰岛素制剂，这些制剂具有不同地时间效用。但是，对于II型患者，从涉及口服药物的治疗向涉及胰岛素注射的治疗进行转换通常颇为困难，涉及注射的治疗必须根据进餐而进行精心的时间控制以避免诸如血糖过低这样的并发症。由此，需要一种方便的疗法，该疗法对于II型糖尿病的这种中间阶段进行了充分地治疗并且降低血糖过低的风险。
类胰高血糖素肽-1(GLP-1)很有希望用于治疗II型糖尿病，特别是对于使用口服药物不再能够控制血糖的患者。GLP-1具有多种生理上显著的活性。例如，已经显示GLP-1可促进胰岛素的释放、降低胰高血糖素的分泌、抑制胃排空(gastric emptying)以及增强葡萄糖的利用[Nauck，M.A.等，(1993)Diabetologia 36：741-744；Gutniak，M.等，(1992)New England J.of Med.326：1316-1322；Nauck，M.A.等，(1993)J.Clin.Invest.91：301-307]。此外，一些动物研究表明，GLP-1实际上可以保护beta细胞，抑制beta细胞的凋亡并且诱导beta细胞增殖。一个最令人振奋的发现为，GLP-1的活性受到血糖水平的控制。当血糖水平降至特定的阈值水平时，GLP-1无活性。因此，不存在与GLP-1治疗相关的血糖过低的风险。
但是，与GLP-1肽有关的单一疗法的实用性受到其快速清除以及半寿期短的限制。尽管已经开发了大量的相对于天然GLP-1(7-37)OH具有较长的半寿期的类似物和衍生物，这些分子的活性特征通常不足以充分控制空腹血糖水平，尤其是在两餐之间和就寝时间。
本发明克服了这些同使用相对短地起作用的GLP-1化合物治疗II型糖尿病相关的问题，以及同胰岛素治疗相关的血糖过低风险。本发明包括预先混合的制剂，这些制剂含有GLP-1化合物以及基础胰岛素。该混合物中的GLP-1使与饮食有关的血糖偏移正常化且不具有血糖过低的风险，而基础胰岛素的功能在于控制空腹血糖水平，特别是在就寝时间。除在降低血糖过低风险的情况下提供了最佳的血糖控制外，使用了本发明的预混合制剂的治疗方案同单独使用胰岛素的治疗相比更为方便，这是由于不需要根据就餐而对用药剂量进行精心地时间控制，因为GLP-1化合物并不导致血糖过低。
GLP-1同基础胰岛素作为预混合的制剂而进行的组合尚未受到研究或者甚至未被提出。在本发明之前，对于GLP-1和基础胰岛素是否可以共同配制以使两种药物均为化学和物理稳定并且保持所需的时间效能尚属未知。GLP-1和胰岛素之间的分子作用可能会损害两种药物的时间效能。进一步，获得化学和物理稳定性所必需的条件不同于各药物单独进行配制时的条件。在本发明之前，本领域的技术人员不会认同这两种药物可被共同配制于一种稳定的药物制剂内以获得最佳的血糖控制。
因此，在本发明中令人惊异的是，预混合的制剂可被制备以使存在于制剂之中的GLP-1化合物和基础胰岛素产生一种作用和生理反应特征，该特征类似于使用GLP-1和基础胰岛素分别进行注射情况下的特征。
本发明在其一种形式中提供了预混合的制剂，该制剂含有GLP-1化合物和基础胰岛素。
本发明进一步提供了一种制备预混合制剂的方法，该方法包括，将GLP-1化合物和基础胰岛素混合于水溶液之中，从而使GLP-1保持促胰岛素(insulinotropic)活性，而基础胰岛素保持一种作用特征，该特征与单独使用基础胰岛素进行治疗所产生的特征一致。在优选的情况下，预混合制剂通过将GLP-1化合物的贮存溶液同基础胰岛素在不同的比例下进行混合来制备。在优选的情况下，可向预混合的制剂中加入药学可接受的缓冲液、防腐剂或者等渗剂。
本发明进一步提供了一种方法，该方法以有效量的预混合制剂进行给药，该预混合制剂含有GLP-1化合物和基础胰岛素。
本发明进一步提供了一种方法，该方法使用本文所讨论的制剂治疗非胰岛素依赖型糖尿病、胰岛素依赖型糖尿病、高血糖症、肥胖症、功能性消化不良、肠易激综合征(irritable bowel syndrome)、术后分解代谢改变、心肌梗塞或者中风。
本发明进一步提供了制剂在制备药物中的应用，所述药物用于在哺乳动物体内治疗非胰岛素依赖型糖尿病、胰岛素依赖型糖尿病、高血糖症、肥胖症、人体重治疗性降低、功能性消化不良、肠易激综合征、术后分解代谢改变、心肌梗塞或者中风。
图1为狗体内所测得的葡萄糖输注速率的图示，该测量在以150mg/dl下3小时高血糖注入(hyperglycemic clamp)的起始以及皮下(SC)给药后进行，所述皮下给药使用Val8-GLP-1/NPH混合物制剂(混合物)、分开的Val8-GLP-1溶液和胰岛素-NPH悬浮物SC给药(在不同位点)或者胰岛素-NPH悬浮物SC给药(NPH)。
图2为狗体内的血浆胰岛素浓度(μU/mL)的图示，该图示为在150mg/dl下3小时高血糖注入的起始以及皮下(SC)给药后的结果，所述皮下给药使用Val8-GLP-1/NPH混合物制剂(混合物)、分开的Val8-GLP-1溶液和胰岛素-NPH悬浮物SC给药(在不同位点)或者胰岛素-NPH悬浮物SC给药(NPH)。
图3为狗体内的血浆C-肽浓度(ng/mL)的图示，该图示为在150mg/dl下3小时高血糖注入的起始以及皮下(SC)给药后的结果，所述皮下给药使用Val8-GLP-1/NPH混合物制剂(混合物)、分开的Val8-GLP-1溶液和胰岛素-NPH悬浮物SC给药(在不同位点)或者胰岛素-NPH悬浮物SC给药(NPH)。
图4为狗体内的免疫反应性Val8-GLP-1(pM)的图示，该图示为在150mg/dl下3小时高血糖注入的起始以及皮下(SC)给药后的结果，所述皮下给药使用Val8-GLP-1/NPH混合物制剂(混合物)、分开的Val8-GLP-1溶液和胰岛素-NPH悬浮物SC给药(在不同位点)或者胰岛素-NPH悬浮物SC给药(NPH)。
本说明中用于氨基酸的三字母缩写编码同PCT AdministrativeInstructions的附录2中的附件C中的表3所含的列表以及37 C.F.R.§1.822(d)(1)(2000)相一致。
本发明的术语“预混合制剂”指的是两相的或者可溶的制剂，该制剂含有GLP-1化合物以及基础胰岛素。根据本领域中的惯例，GLP-1化合物的N-末端残基被作为第7位。在本文中用于描述GLP-1类似物的命名法中，用于替换的氨基酸及其位置在原结构之前示出。例如，Val8-GLP-1(7-37)OH所指的为一种GLP-1类似物，该类似物中在正常情况下见于GLP-1(7-37)OH第8位的丙氨酸被缬氨酸所替换。
出于本发明的目的，本文所使用的术语“GLP-1化合物”指的是一些多肽，这些多肽包括天然的截短GLP-1多肽(GLP-1(7-37)OH以及GLP-1(7-36)NH2)、GLP-1片段、GLP-1类似物及它们的衍生物。出于本发明的目的，GLP-1化合物还包括Exendin-3和Exendin-4，及其类似物和衍生物。本发明的GLP-1化合物具有同GLP-1受体结合并且起始一种信号转导通路的能力，所述信号转导通路导致了促胰岛素活性。适用于本发明的GLP-1化合物的例子在下文更广泛地讨论。
术语“促胰岛素活性”指的是对提高的葡萄糖水平作出反应而刺激胰岛素分泌的能力，由此而导致了细胞对葡萄糖的摄取以及与之相关的血浆葡萄糖水平的降低。促胰岛素活性可通过本领域的已知方法进行估测，这些方法包括使用体内实验和体外分析，这些分析测量了GLP-1受体结合活性或者受体激活，例如使用胰岛细胞或者胰岛瘤细胞进行的分析，此二者分别根据Gelfand等人的EP619,322(实施例1中描述)以及美国专利No.5,120,712进行。在常规情况下通过测量胰岛素水平或者C-肽水平在人体内测定促胰岛素活性。如果胰岛细胞在存在GLP-1化合物的情况下所分泌的胰岛素水平高于背景水平,则GLP-1化合物具有促胰岛素活性。
GLP-1化合物可以以至少两种不同的形式存在。第一种形式在生理pH(7.4)下具有生理活性并且易于溶解于水溶液中。与之对比，第二种形式在pH7.4下具有低微的或者无促胰岛素活性并且基本不溶于水中。由此，GLP-1化合物应在减少GLP-1化合物聚集和生成不溶的无活性复合物倾向的条件下进行配制。特定的GLP-1化合物在给定的配制条件组合下的倾向性可根据实施例8的描述通过在350nm下测量浊度而测定。
在优选的情况下，本发明所涵盖的预混合的制剂含有一种具有促胰岛素活性的GLP-1化合物，其活性相当于或者超过了GLP-1(7-37)OH。更为优选的情况下，GLP-1化合物与GLP-1(7-37)OH相比具有较高的促胰岛素活性。
本发明所使用的术语“基础胰岛素”指的是一种具有基础活性的胰岛素类似物或者一种具有基础活性的胰岛素或者胰岛素类似物的制剂。一般地，基础胰岛素可在本领域中被识别，并在标准的糖尿病模型中具有超过8小时的延长的时间效能。在优选的情况下，基础胰岛素具有约24小时的基础活性。优选的情况下，基础胰岛素具有8到14小时的基础活性。优选的情况下，基础胰岛素所具有的基础活性类似于NPH、NPL、PZI、Ultralente或者胰岛素glargine的商业化制剂中所观察到的活性。
本发明中所使用的术语“两相(biphasic)制剂”指的是基本上不溶于预混合制剂的基础胰岛素以及基本上可溶于预混合制剂的GLP-1化合物。如果在对混合物进行离心之后在上清中几乎检测不到或者检测不到胰岛素，则基础胰岛素是基本上不可溶的。在优选的情况下，制剂中的不可溶胰岛素在贮藏条件下长时间内保持不可溶。这些基础胰岛素的延长的时间效能部分原因在于注射后胰岛素六聚体吸收和解聚成为活性胰岛素单体的迟缓速率。
本发明所使用的术语“溶液制剂”指的是基本上可溶于预混合制剂的基础胰岛素以及基本上可溶于预混合制剂的GLP-1化合物。可溶的基础胰岛素的例子包括等电点(pI)移动(shift)的胰岛素以及酰化的胰岛素。胰岛素glargine(Lantus)是pI移动的胰岛素的一个例子。通过向正常的人类胰岛素中添加和/或替换入碱性氨基酸，pI从约5.5变至较为中性的pH。例如，在B链的C-末端加入两个精氨酸导致了pI变成约为7。这种pI移动的胰岛素类似物应在酸性或者碱性pH下可溶。或者，可通过向正常的人类胰岛素中添加和/或替换入酸性氨基酸而使pI变得更酸。这种pI移动的胰岛素类似物应在碱性pH下可溶。由此，通过使用这两种溶液之一进行注射，pH将被调整为充分接近于胰岛素类似物的pI的生理pH，净电荷将为零，结果将导致胰岛素的沉淀。被沉淀的胰岛素将在一段时间内缓慢地溶解并且被吸收入血液，从而获得所需的基础活性。
酰化的胰岛素通常被描述作具有亲脂性取代基的胰岛素或者胰岛素类似物。亲脂取代基同血液中的蛋白质(例如白蛋白)相互作用。其结果为胰岛素在血液循环中的较长的时间内被保护。另外，亲脂取代基可通过保护胰岛素避开降解性酶而提高稳定性。进一步，亲脂性取代基可延缓胰岛素从注射位点处被吸收入血液。
GLP-1化合物与基础胰岛素的比例应使得在以制剂进行给药之后其血浆水平被维持在有效范围内。在优选的情况下，具有的促胰岛素活性在GLP-1(7-37)OH的活性的两倍之内的GLP-1化合物的血清水平被维持在约30皮摩尔/升到约200皮摩尔/升之间。活性低于GLP-1(7-37)OH的GLP-1的最佳血清水平应更高，而活性高于GLP-1(7-37)OH的GLP-1的最佳血清水平应更低。通常情况下，混合物应经过配制以每天使用约0.1到约5mg的GLP-1化合物进行给药。在优选的情况下，GLP-1化合物应在0.1到2mg/天的范围内进行给药。更为优选的情况下，GLP-1化合物应在0.5到2mg/天的范围内进行给药。GLP-1的浓度可根据所选定的GLP-1化合物的活性而进行上下调整。预混合制剂中的GLP-1化合物浓度一般在0.1到20mg/ml的范围内。在优选的情况下，预混合制剂中的GLP-1化合物浓度在0.1到10mg/ml的范围内。更为优选的情况下，预混合制剂中的GLP-1化合物浓度在0.1到5mg/ml的范围内。
总体上，混合物应经过配制从而使每天施用约0.01到约1U/kg的基础胰岛素。在优选的情况下，基础胰岛素应在0.05到0.5U/kg/天的范围内进行给药。更为优选的情况下，基础胰岛素应在0.05到0.3U/kg/天的范围内进行给药。
含有本发明的GLP-1化合物以及基础胰岛素的多种预混合的制剂可任选地包括药学上可接受的缓冲液。但是，缓冲液的选择、浓度以及pH应当使GLP-1化合物保持基本可溶于制剂中并且保持促胰岛素活性，并且使基础胰岛素保持延长的效能特征。药学上可接受的缓冲液的例子如磷酸缓冲液(例如二盐基磷酸钠(dibasic sodiumphosphate))、TRIS、乙酸盐(如乙酸钠)、柠檬酸盐(如柠檬酸钠)、酒石酸钠、碱性氨基酸(例如组氨酸、赖氨酸或者精氨酸)、或者中性氨基酸(例如甘氨酸和甘氨酰基甘氨酸)。其它的药学上可接受的缓冲液在本领域中是已知的。在优选的情况下，缓冲液选自于乙酸盐、磷酸盐和TRIS。技术人员将会认识到，缓冲液的选择依赖于所需的缓冲液pH和pKa。在优选的情况下，当pH处于生理范围内时，缓冲液为磷酸盐和TRIS。当所需的pH处于碱性范围内时，优选的缓冲液为TRIS，当所需的pH处于酸性范围内时，优选的缓冲液为乙酸盐。在优选的情况下，缓冲液的浓度介于约1mM和30mM之间。更为优选的情况下，缓冲液的浓度介于约4mM和14mM之间。
对预混合制剂的pH进行调整以提供可接受的稳定性，维持GLP-1化合物的溶解度以及促胰岛素活性以及基础胰岛素的延长效能特征，并且对于注射给药是可接受的。当胰岛素不可溶时，预混合制剂的pH在优选的情况下被调节而介于约7.0到约8.5，更为优选的情况下pH介于7.4到8.0，更为优选的情况下pH介于约7.4到7.8。最为优选的情况下，pH介于约7.6到7.8，最优选的是7.8。
但是，当胰岛素为一种pI移动的胰岛素类似物时，pH经调整而同时维持GLP-1化合物和基础胰岛素类似物在水性介质中的溶解度。例如，人类胰岛素所具有的pI为约5.5。当由于加入了碱性氨基酸而使pI变至约7时，pH被调节至略为碱性或者略为酸性以维持溶解度。pH可被调节至低于约6、低于约5、低于约4。pH还可被调节至高于约8、高于约9、高于约10。或者，当pI移动的胰岛素类似物为胰岛素glargine时，pH可被调节至约8。
pH还依赖于在预混合制剂中所使用的GLP-1化合物。一般来说，GLP-1化合物的pH介于约4到约10之间。pH根据GLP-1化合物的pI而被调节至微酸或者微碱以维持溶解度。当GLP-1的pI为约7时，则pH可被调节至低于约6、低于约5、低于约4。pH还可被调节至高于约8、高于约9、高于约10。例如，在第22位上为谷氨酸的GLP-1化合物可在酸性pH下进行配制并且仍然保持可溶。在优选的情况下，在第22位上为谷氨酸的GLP-1化合物的pH介于约4到6之间。更为优选的情况下pH约为4。在第22位为中性氨基酸的其它GLP-1化合物可在生理pH或者更高的pH下进行配制并且仍然保持可溶。在优选的情况下，在第22位为中性氨基酸的其它GLP-1化合物的pH介于约7到10之间。更为优选的情况下pH介于约7到8.5之间。Exendin-3和Exendin-4可在酸性pH下进行配制并且仍然保持可溶。在优选的情况下，Exendin-3或Exendin-4的pH介于约4到6之间。更为优选的情况下pH约为4。
本发明的预混合制剂可任选地包括一种防腐剂。但是，防腐剂的选择和浓度应当使GLP-1化合物保持基本可溶于制剂中并且保持促胰岛素活性，并且使基础胰岛素保持延长的效能特征。防腐剂指的是一种化合物，化合物被添加至一种药用制剂中以作为一种抗微生物药物发挥作用。为成为一种可商业化的多用途产品，注射用制剂必须符合防腐效能的准则。本领域所已知的可在注射制剂中有效用并且可被接受的防腐剂有酚类防腐剂、羟苯甲酸烷基酯(alkylparaben)、苄醇、氯丁醇、间苯二酚以及其它类似的防腐剂及它们的混合物。酚类衍生物的例子包括甲酚和苯酚或者甲酚和苯酚的混合物。甲酚的例子包括间甲酚、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚或其混合物。羟苯甲酸烷基酯指的是羟苯甲酸C1到C4烷基酯或其混合物。羟苯甲酸烷基酯的例子包括羟苯甲酸甲酯、羟苯甲酸乙酯、羟苯甲酸丙酯或者羟苯甲酸丁酯。防腐剂的浓度为本领域的技术人员所已知。浓度必须足以通过迟滞微生物生长而维持防腐效能。在优选的情况下防腐剂为苯酚衍生物。更为优选的情况下防腐剂为甲酚、苯酚或者甲酚和苯酚的混合物。更为优选的情况下防腐剂为间甲酚、苯酚或间甲酚和苯酚的混合物。
对于两相制剂，优选的防腐剂为间甲酚和苯酚的混合物。间甲酚的浓度通常介于约0.1到约4.0mg/mL之间。间甲酚的优选浓度约为1.6mg/mL。苯酚的浓度通常介于约0.1到约2.0mg/mL之间。苯酚的优选浓度约为0.65mg/mL。
对于溶液制剂，优选的防腐剂为间甲酚或者苯酚。间甲酚的浓度通常介于约2.0到约8.0mg/mL、约2.5mg/mL到约4.5mg/mL之间以及约2.0mg/mL到约4.0mg/mL之间。防腐剂在最终混合物中的最佳浓度约为2.7mg/mL。在另一个实施方案中，苯酚的浓度介于约2.0mg/mL到约10.0mg/mL之间以及约4.0mg/mL到约8.0mg/mL之间。防腐剂在最终混合物的最为优选的浓度约为5.0mg/mL。
胰岛素通常通过在约为7到8的pH下溶解于一种稀释剂中并且加入锌而被转化成为六聚体复合物，稀释剂含有适量的防腐剂。但是，防腐剂和锌的选择和用量应当使GLP-1化合物保持基本可溶于制剂中并且保持促胰岛素活性，并且使基础胰岛素保持延长的效能特征。锌在优选的情况下以锌盐的形式加入，例如乙酸锌、溴化锌、氯化锌、氟化锌、碘化锌和硫酸锌，但不限于这些。技术人员应认识到，还有其它的锌盐可被用于制备胰岛素类似物复合物，该复合物为本发明的一部分。在优选的情况下，锌盐为乙酸锌、氧化锌或者氯化锌。
六聚物复合体通常由每人类胰岛素类似物六聚体两个锌离子以及至少三分子的苯酚类防腐剂组成，所述苯酚类防腐剂选自氯甲酚、间甲酚、苯酚及其混合物。
本发明的预混合的制剂可任选地包括有一种等渗剂。但是，等渗剂的选择和浓度应当使GLP-1化合物保持基本可溶于制剂中并且保持促胰岛素活性，并且使基础胰岛素保持延长的效能特征。等渗剂指的是一些可被生理容受并且可使试剂具有合适的渗透压的化合物，这样可以防止水跨细胞膜的净流动。这样的化合物的例子包括甘油(丙三醇)、盐(例如NaCl)、还有糖(例如葡萄糖、甘露醇和蔗糖)。这些化合物通常在已知的浓度下用于这样的目的。可加入一种或者多种等渗剂以调节离子强度或者渗透压。
对于两相制剂，优选的等渗剂为甘油。甘油的浓度在优选的情况下介于约12mg/mL到25mg/mL之间，优选的情况下介于12mg/mL到20mg/mL之间，更为优选的情况下约为16mg/mL。
对于可溶制剂，优选的等渗剂为NaCl。NaCl的浓度在优选的情况下介于约10mM到200mM之间，优选的情况下介于50mM到150mM之间，更为优选的情况下约为100mM。在另一个实施方案中，优选的等渗剂为甘露醇。甘露醇的浓度在优选的情况下介于约1％(重量(w)/体积(v))到10％(w/v)之间，更为优选的情况下介于2％(w/v)到8％(w/v)之间。在另一个实施方案中，优选的等渗剂为甘油。甘油的浓度在优选的情况下介于约12mg/mL到25mg/mL之间，优选的情况下介于12mg/mL到20mg/mL之间，更为优选的情况下约为17mg/mL。
本发明的可溶制剂可任选地含有一种增溶剂。但是，增溶剂的选择和浓度应当使GLP-1化合物保持基本可溶于制剂中并且保持促胰岛素活性，并且使基础胰岛素保持基本可溶于制剂中并且保持延长的效能特征。增溶剂为基础胰岛素和GLP-1化合物提供稳定性，由此使基础胰岛素和GLP-1化合物在贮存条件下保持较长时间可溶。在优选的情况下增溶剂为烟酰胺。烟酰胺的浓度通常介于0.01到2M。烟酰胺的其它优选范围为：介于0.05M到1.5M；介于0.1M到1.0M；介于0.1M到0.5M；介于0.5M到1.0M；以及介于0.15M到0.25M。
其它的添加剂，例如像Tween20(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)、Tween40(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单棕榈酸酯)、Tween80(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单油酸酯)、Pluronic F68(聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物)以及PEG(聚乙二醇)这样的增溶剂均可任选地加入制剂中。尽管这些添加剂并非必需，但它们在制剂接触塑性材料时可能会有用。
在优选的情况下，当被注射时，本发明的预混合制剂所产生的葡萄糖特征(glucose profile)等同于或者好于当GLP-1化合物和基础胰岛素被分别进行给药时所获得的葡萄糖特征。
本发明的预混合制剂适用于治疗一些疾病或者症状，在这些疾病或者症状中使用GLP-1或者胰岛素进行的给药将使其有所改善。
所包括的有，患有非胰岛素依赖型糖尿症、胰岛素依赖型糖尿症、中风(见Efendic的WO 00/16797)的患者、心肌梗塞(见Efendic的WO 98/08531)、肥胖症(见Efendic的WO 98/16698)、术后分解代谢改变(见Efendic的美国专利No.6,006,753)、功能性消化不良以及肠易激综合征(见Efendic的WO 99/64060)的患者。还包括有需要以GLP-1化合物进行预防治疗的对象，例如，具有发展成为非胰岛素依赖型糖尿症的危险的对象(见WO 00/07617)。其它的对象包括，具有受损的葡萄糖耐受或者受损的空腹葡萄糖的患者、体重超过相对于其身高和体形的正常体重约25％的对象、具有部分胰切除的患者、具有一名或者多名患有非胰岛素依赖型糖尿病的亲代的对象、患有妊娠期糖尿症的患者以及患有急性或者慢性胰腺炎的患者。
本发明的预混合制剂可被用于使血糖水平正常化、防止胰β-细胞损害、诱导β-细胞增殖、刺激胰岛素基因转录、上调IDX-1/PDX-1或者其它生长因子、改善β-细胞功能、激活休眠的β-细胞、使细胞分化成为β-细胞、促进β-细胞复制、抑制β-细胞凋亡、调节体重和诱导减重。
本文所描述的预混合的制剂可被用于对患有多种疾病和症状的患者进行治疗。在本发明的预混合制剂中所包括的GLP-1化合物通过作用于一种被称作为“GLP-1受体”的受体(见Thorens，PNAS 89，8641-8645(1992))而发挥其生物学效能。因此，患有疾病和/或症状的患者在对GLP-1受体刺激或者GLP-1化合物的给药产生有利反应的情况下可以使用本发明的GLP-1化合物进行治疗。这些患者被描述为“需要以GLP-1化合物进行治疗”或者“需要GLP-1受体刺激”。
下文提供了可用于本发明的预混合制剂的GLP-1化合物和基础胰岛素的更为详尽的讨论。
可被用于本发明的预混合制剂的GLP-1化合物的代表性例子包括本领域所已知的GLP-1化合物，例如，在美国专利No.5,118,666；5,120,712；5,512,549；6,191,102；5,977,071；5,545,618；5,705,483；6,133,235以及Adelhorst等，(1994)J.Biol.Chem.269：6725中所披露的类似物。
式I(SEQ ID NO：1)所示为两种天然的截短GLP-1多肽：
SEQ ID NO：1
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-
18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-
29 30 31 32 33 34 35 36 37
Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Xaa
其中：
位于第37位的Xaa为甘氨酸或者-NH2。
术语“二肽基肽酶IV(DPP IV)抗性”指的是由于对内源性的酶DPP IV有抗性而具有延长的代谢稳定性和提高的生物活性的GLP-1分子。例如，DPP IV抗性可以使用实施例2中所描述的方法进行测定。如果GLP-1分子在存在DPP IV的情况下相对于天然GLP-1而具有延长的代谢稳定性，则GLP-1分子具有DPP IV抗性。具有DPPIV抗性的GLP-1分子可在DPP IV识别位点(第8位)具有一个氨基酸变换。或者DPP IV多肽可具有附加基团限制了DPP IV对识别位点的接近，或者两种情况兼而有之。
“GLP-1片段”为一种多肽，多肽通过将一个或者多个氨基酸从GLP-1(7-37)OH或其类似物或衍生物中截除而获得。用于描述GLP-1(7-37)OH的命名法也适用于GLP-1片段。例如，GLP-1(9-36)OH所表示的GLP-1片段通过从N-末端截除两个氨基酸以及从C-末端截除一个氨基酸而获得。在该片段中的氨基酸通过与GLP-1(7-37)OH中所对应的氨基酸的编号进行表示。例如，与GLP-1(7-37)OH相同，GLP-1(9-36)OH中的N-末端谷氨酸为第9位；第12位为苯丙氨酸所占据；第22位为甘氨酸所占据。对于GLP-1(7-36)OH，位于GLP-1(7-37)OH的第37位的甘氨酸被去除。
“GLP-1类似物”同GLP-1(7-37)OH或者GLP-1(7-37)OH的片段之间具有足以使该类似物具有促胰岛素活性的同源性。在优选的情况下，GLP-1类似物具有GLP-1(7-37)OH或其片段的氨基酸序列，其序列经修饰而使其在一个、两个、三个、四个或者五个氨基酸上同GLP-1(7-37)OH或者GLP-1(7-37)OH的片段中的对应位置上有所差异。在本文表示GLP-1化合物的命名法中，所替换的氨基酸及其位置显示于其源结构之前。例如，Glu22-GLP-1(7-37)OH所表示的GLP-1化合物中，GLP-1(7-37)OH的第22位上正常情况下出现的甘氨酸被谷氨酸替代；Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH所表示的GLP-1化合物中，GLP-1(7-37)OH的第8位上正常情况下出现的丙氨酸以及第22位上正常情况下出现的甘氨酸分别被缬氨酸和谷氨酸替代。
本发明的其它GLP-1化合物包括在N-末端和/或C-末端上添加了一个或者多个氨基酸的GLP-1。在优选的情况下，一到六个氨基酸被添加于GLP-1的N-末端并且/或者一到八个氨基酸被添加于GLP-1的C-末端。这种延长的GLP-1类似物的氨基酸通过与在GLP-1(7-37)OH中对应的氨基酸相同的编号进行表示。例如，通过添加两个氨基酸于GLP-1(7-37)OH的N-末端所获得的GLP-1类似物的N-末端氨基酸处于第5位；通过添加一个氨基酸于GLP-1(7-37)OH的C-末端所获得的GLP-1化合物的C-末端氨基酸处于第38位。延长的GLP-1类似物的氨基酸1-6在优选的情况下与位于GLP-1(7-37)OH的对应位置的氨基酸相同或是其保守替换。延长的GLP-1化合物的氨基酸38-45在优选的情况下与位于Exendin-4的对应位置的氨基酸相同或是其保守替换。
保守替换是将一个氨基酸替换以另一个具有相同的净电荷以及在体积和形状上近似的氨基酸。具有脂肪族或者取代的脂肪族氨基酸侧链的氨基酸当它们的侧链的总碳数和杂环原子数上的差异低于4时具有近似相同的体积。当它们的侧链的分支数上的差异低于1时具有近似相同的形状。侧链上具有苯基或者取代的苯基基团的氨基酸被认为具有大致相同的大小和形状。在优选的情况下，GLP-1化合物具有SEQID NO：1的氨基酸序列或者具有经修饰的序列以使其与SEQ ID NO：1在一个、两个、三个、四个或者五个氨基酸上有所差异。
式II(SEQ ID NO：2)所示为Exendin-3和Exendin-4的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
His-Xaa-Xaa-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-
18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-
29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39
Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-
40 41 42 43 44 45
Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
其中：
第8位的Xaa为丝氨酸或者甘氨酸；
第9位的Xaa为天冬氨酸或者谷氨酸；并且
第45位的Ser为丝氨酸或者丝氨酸-NH2。
Exendin-3在第8位为丝氨酸并且在第9位为天冬氨酸。Exendin-3在第8位为甘氨酸并且在第9位为谷氨酸。本发明的其他GLP-1化合物包括Exendin-3和Exendin-4激动剂，这些激动剂见WO99/07404、WO99/25727、WO99/25728、WO99/43708、WO00/66629以及US2001/0047084A1中的描述，并且在此引为参考。
式III(SEQ ID NO：3)所示为GLP-1类似物的一个优选的群体：
SEQ ID NO：3
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Xaa-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Thr-Xaa-Asp-Xaa-Xaa-
18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Phe-
29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39
Ile-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-
40 41 42 43 44 45
Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa
其中：
第7位的Xaa为：L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸(homohistidine)、α-氟甲基-组氨酸或者α-甲基-组氨酸。
第8位的Xaa为丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或者赖氨酸；
第9位的Xaa为谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丝氨酸、精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或者组氨酸；
第11位的Xaa为苏氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸或者赖氨酸；
第12位的Xaa为组氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或者酪氨酸；
第14位的Xaa为丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或者赖氨酸；
第16位的Xaa为缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、色氨酸、组氨酸、苯丙氨酸或者赖氨酸；
第17位的Xaa为丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或者赖氨酸；
第18位的Xaa为丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸、脯氨酸、精氨酸或者赖氨酸；
第19位的Xaa为酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、半胱氨酸或者赖氨酸；
第20位的Xaa为亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸或者赖氨酸；
第21位的Xaa为谷氨酸、天冬氨酸或者赖氨酸；
第22位的Xaa为甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或者赖氨酸；
第23位的Xaa为谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸或者赖氨酸；
第24位的Xaa为丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或者赖氨酸；
第25位的Xaa为丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或者赖氨酸；
第26位的Xaa为赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸或者组氨酸；
第27位的Xaa为谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、精氨酸、亮氨酸或者赖氨酸；
第30位的Xaa为丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸或者赖氨酸；
第31位的Xaa为色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸或者赖氨酸；
第32位的Xaa为亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或者赖氨酸；
第33位的Xaa为缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸或者赖氨酸；
第34位的Xaa为赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺或者组氨酸；
第35位的Xaa为甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、组氨酸或者赖氨酸；
第36位的Xaa为精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸或者组氨酸；
第37位的Xaa为甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、脯氨酸-NH2或者该位置被去除；
第38位的Xaa为精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、组氨酸或者该位置被去除；
第39位的Xaa为精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、组氨酸或者该位置被去除；
第40位的Xaa为天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸或者该位置被去除；
第41位的Xaa为苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、赖氨酸或者该位置被去除；
第42位的Xaa为丝氨酸、脯氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或者该位置被去除；
第43位的Xaa为丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、赖氨酸或者该位置被去除；
第44位的Xaa为甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、赖氨酸或者该位置被去除；
第45位的Xaa为丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸或者赖氨酸，或者丙氨酸-NH2、缬氨酸-NH2、谷氨酸-NH2、天冬氨酸-NH2、丝氨酸-NH2、赖氨酸-NH2或者该位置被去除，或为一种C-1-6酯，或为酰胺，或为一种C-1-6-烷基酰胺，或为C-1-6-二烷基酰胺；如果第37、38、39、40、41、42、43或者44位被去除，则在该氨基酸下游的各氨基酸也被去除。
GLP-1的一个优选的群体为：
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGRG或G-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIDGGPSSGRPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGRGSSGDPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGRPSSGDPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGDPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGDPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGDPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYIEEQAAKEFIAWLVKGRPSSGAPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGRPSSGDPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGAPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAVKEFIAWLIKGGPSSGAPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAVKEFIAWLVKGGPSSGAPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAVKEFIAWLIKGGPSSGDPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGGSSGDPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGPGSSGDPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGSPSGDPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGDPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGDPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGDAPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGDPAPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGDPPAS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGDAAAS或S-NH2
HVEGTFTSDWSSYLEGQAAKEFIAWLIKGGPSSGAPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDWSSYLEGQAAKEFIAWLIKGGPSSGAPPPH或H-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLIKGGPSSGAPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLIKGGPSSGDPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDWSSYLEGQAAKEFIAWLIKGGPSSGAPPPSH或H-NH2
HVEGTFTSDWSSYLEGQAAKEFIAWLIKGGPHSSGAPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGSSGAPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGGPSSGAPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPSSGAPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGRGSSGAPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAVKEFIAWLIKGRGSSGAPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDWSSYLEEQAAKEFIAWLIKGRGSSGAPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGRGHSSGAPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGRGHSSGAPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDWSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPHSSGAPPPSH或H-NH2
HVEGTFTSDWSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGAPPPSH或H-NH2
HVEGTFTSDVSWYLEGQAVKEFIAWLIKGGPHSSGAPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAVKEFIAWLIKGGPSSGAPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAVKEFIAWLIKGGPSSGAPPPSH或H-NH2
HVEGTFTSDWSSYLEEQAVKEFIAWLIKGGPSSGAPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDWSSYLEEQAVKEFIAWLIKGGPSSGAPPPSH或H-NH2
HVEGTFTSDWSSYLEEQAVKEFIAWLIKGGPHSSGAPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDWSKYLEEQAVKEFIAWLIKGGPSSGAPPPSH或H-NH2
HVEGTFTSDVSSYLESQAVKEFIAWLIKGGPSSGAPPPRG或G-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAVKEFIAWLIKGQPSSGAPPPRG或G-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPSSGAPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVDGGPSSGRPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVDGGPSSGRPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVDGGPSSGKPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVDGGPSSGRG或G-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGAPPPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPSWGAPPPS或S-NH2
HVSGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGAPPPGPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLIKGGPSSGAPPPGPSGPS或S-NH2
HVEGTFTSDVSSYLEEQAVKEFIAWLVKGGPSSGAPPPS或S-NH2
式IV(SEQ ID NO：4)所示为GLP-1类似物的另一个优选的群体：
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
His-Xaa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-
18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Ala-Ala-Lys-Xaa-Phe-
29 30 31 32 33 34 35 36 37
Ile-Xaa-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R
其中：
位于第8位的Xaa为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸或者苏氨酸；
位于第22位的Xaa为天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸或者磺基丙氨酸；
位于第23位的Xaa为组氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、谷氨酸或者谷氨酰胺；
位于第27位的Xaa为丙氨酸、谷氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、精氨酸或者赖氨酸；
位于第30位的Xaa为谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸或者组氨酸；
R为：赖氨酸、精氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、-NH2。
具有替换氨基酸的其它组合的本发明的GLP-1化合物也是优选的。本发明包括了一种GLP-1化合物，该化合物含有式V(SEQ IDNO：5)的氨基酸序列
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Xaa25-Lys-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Lys-Gly-Arg-Xaa37
式V(SEQ ID NO：5)
其中：
Xaa7为：L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、α-氟甲基-组氨酸或者α-甲基-组氨酸。
Xaa8为：丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸或者苏氨酸；
Xaa12为：苯丙氨酸、色氨酸或者酪氨酸；
Xaa16为：缬氨酸、色氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或者酪氨酸；
Xaa18为：丝氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸；
Xaa19为：酪氨酸、色氨酸或者苯丙氨酸；
Xaa20为：亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或者色氨酸；
Xaa22为：甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸；
Xaa25为：丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或者亮氨酸；
Xaa27为：谷氨酸、异亮氨酸或者丙氨酸；
Xaa30为：丙氨酸或者谷氨酸；
Xaa33为：缬氨酸或者异亮氨酸；并且
Xaa37为：甘氨酸、组氨酸、NH2或者不存在。
本发明包括了一种GLP-1化合物，该化合物含有式VI(SEQ IDNO：6)的氨基酸序列
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Xaa25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Xaa33-Lys-Gly-Arg-Xaa37
式VI(SEQ ID NO：6)
其中：
Xaa7为：L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、α-氟甲基-组氨酸或者α-甲基-组氨酸。
Xaa8为：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸或者苏氨酸；
Xaa16为：缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或者色氨酸；
Xaa18为：丝氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸；
Xaa22为：甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或者赖氨酸；
Xaa25为：丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或者亮氨酸；
Xaa33为：缬氨酸或者异亮氨酸；并且
Xaa37为：甘氨酸、NH2或者不存在。
在优选的情况下式I、II、III、IV、V和VI的GLP-1类似物的主链在第8位上含有一个除丙氨酸之外的氨基酸(第8位类似物)。第8位上的优选氨基酸为甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或者甲硫氨酸，更为优选的情况下为缬氨酸或者甘氨酸。该主链还可在第7位上包括L-组氨酸、D-组氨酸或者修饰形式的组氨酸，例如脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、α-氟甲基-组氨酸或者α-甲基-组氨酸。在优选的情况下这些第8位类似物在第12、16、18、19、20、22、25、27、30、33和37位含有同天然GLP-1(7-37)OH的对应氨基酸相比的其它氨基酸。更为优选的情况下这些第8位类似物在第16、18、22、25和33含有同天然GLP-1(7-37)OH的对应氨基酸相比的其它氨基酸。
更为优选的是一些式I、II、III、IV、V和VI的GLP-1类似物，这些类似物中最多有6个氨基酸不同于天然GLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-36)NH2或者Exendin-4的对应氨基酸。最为优选是一些式I、II、II和IV GLP-1类似物，这些类似物中有1到5个氨基酸不同于天然GLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-36)NH2或者Exendin-4的对应氨基酸。
其它的优选的GLP-1类似物具有GLP-1(7-37)OH的序列，其不同之处在于第8位的氨基酸在优选的情况下为甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或者甲硫氨酸并且在更为优选的情况下为缬氨酸或者甘氨酸，同时在优选的情况下第22位为谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸或者精氨酸，更为优选的情况下为谷氨酸或者赖氨酸。
其它的优选的GLP-1类似物具有GLP-1(7-37)OH的序列，其不同之处在于第8位的氨基酸在优选的情况下为甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或者甲硫氨酸并且在更为优选的情况下为缬氨酸或者甘氨酸，同时在优选的情况下第30位为谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸或者组氨酸，更为优选的情况下为谷氨酸。
其它的优选的GLP-1类似物具有GLP-1(7-37)OH的序列，其不同之处在于第8位的氨基酸在优选的情况下为甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或者甲硫氨酸并且在更为优选的情况下为缬氨酸或者甘氨酸，同时在优选的情况下第37位为组氨酸、赖氨酸、精氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸，更为优选的情况下为组氨酸。
在一个优选的实施方案中，GLP-1类似物为GLP-1(7-37)OH，其中第12位的氨基酸选自色氨酸或者酪氨酸。更为优选的情况下，除第12位的替换之外，第8位的氨基酸被替换以甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或者甲硫氨酸，更为优选的情况下为缬氨酸或者甘氨酸。愈加优选的情况下，除第12位和第8位的替换之外，第22位的氨基酸被替换以谷氨酸。
在另一个优选的实施方案中，GLP-1类似物为GLP-1(7-37)OH，其中第16位的氨基酸选自色氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或者酪氨酸。更为优选的情况下，除第16位的替换之外，第8位的氨基酸被替换以甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或者甲硫氨酸，更为优选的情况下为缬氨酸或者甘氨酸。愈加优选的情况下，除第16位和第8位的替换之外，第22位的氨基酸被替换以谷氨酸。同样优选的情况还有，除第16位和第8位的替换之外，第30位的氨基酸被替换以谷氨酸。同样优选的情况还有，除第16位和第8位的替换之外，第37位的氨基酸被替换以组氨酸。
在另一个优选的实施方案中，GLP-1类似物为GLP-1(7-37)OH，其中第18位的氨基酸选自色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸或者异亮氨酸，优选的情况下选自色氨酸、酪氨酸和异亮氨酸。更为优选的情况下，除第18位的替换之外，第8位的氨基酸被替换以甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或者甲硫氨酸，更为优选的情况下为缬氨酸或者甘氨酸。愈加优选的情况下，除第18位和第8位的替换之外，第22位的氨基酸被替换以谷氨酸。同样优选的情况还有，除第18位和第8位的替换之外，第30位的氨基酸被替换以谷氨酸。同样优选的情况还有，除第18位和第8位的替换之外，第37位的氨基酸被替换以组氨酸。
在另一个优选的实施方案中，GLP-1类似物为GLP-1(7-37)OH，其中第19位的氨基酸选自色氨酸或者苯丙氨酸，优选的情况下选自色氨酸。更为优选的情况下，除第19位的替换之外，第8位的氨基酸被替换以甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或者甲硫氨酸，更为优选的情况下为缬氨酸或者甘氨酸。愈加优选的情况下，除第19位和第8位的替换之外，第22位的氨基酸被替换以谷氨酸。同样优选的情况还有，除第19位和第8位的替换之外，第30位的氨基酸被替换以谷氨酸。同样优选的情况还有，除第19位和第8位的替换之外，第37位的氨基酸被替换以组氨酸。
在另一个优选的实施方案中，GLP-1类似物为GLP-1(7-37)OH，其中第20位的氨基酸选自苯丙氨酸、酪氨酸或者色氨酸。更为优选的情况下，除第20位的替换之外，第8位的氨基酸被替换以甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或者甲硫氨酸，更为优选的情况下为缬氨酸或者甘氨酸。愈加优选的情况下，除第20位和第8位的替换之外，第22位的氨基酸被替换以谷氨酸。同样优选的情况还有，除第20位和第8位的替换之外，第30位的氨基酸被替换以谷氨酸。同样优选的情况还有，除第20位和第8位的替换之外，第37位的氨基酸被替换以组氨酸。
在另一个优选的实施方案中，GLP-1类似物为GLP-1(7-37)OH，其中第25位的氨基酸选自缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸，优选的情况下选自缬氨酸。更为优选的情况下，除第25位的替换之外，第8位的氨基酸被替换以甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或者甲硫氨酸，更为优选的情况下为缬氨酸或者甘氨酸。愈加优选的情况下，除第25位和第8位的替换之外，第22位的氨基酸被替换以谷氨酸。同样优选的情况还有，除第25位和第8位的替换之外，第30位的氨基酸被替换以谷氨酸。同样优选的情况还有，除第25位和第8位的替换之外，第37位的氨基酸被替换以组氨酸。
在另一个优选的实施方案中，GLP-1类似物为GLP-1(7-37)OH，其中第27位的氨基酸选自异亮氨酸或者丙氨酸。更为优选的情况下，除第27位的替换之外，第8位的氨基酸被替换以甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或者甲硫氨酸，更为优选的情况下为缬氨酸或者甘氨酸。愈加优选的情况下，除第27位和第8位的替换之外，第22位的氨基酸被替换以谷氨酸。同样优选的情况还有，除第27位和第8位的替换之外，第30位的氨基酸被替换以谷氨酸。同样优选的情况还有，除第27位和第8位的替换之外，第37位的氨基酸被替换以组氨酸。
在另一个优选的实施方案中，GLP-1类似物为GLP-1(7-37)OH，其中第33位的氨基酸为异亮氨酸。更为优选的情况下，除第33位的替换之外，第8位的氨基酸被替换以甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或者甲硫氨酸，更为优选的情况下为缬氨酸或者甘氨酸。愈加优选的情况下，除第33位和第8位的替换之外，第22位的氨基酸被替换以谷氨酸。同样优选的情况还有，除第33位和第8位的替换之外，第30位的氨基酸被替换以谷氨酸。同样优选的情况还有，除第33位和第8位的替换之外，第37位的氨基酸被替换以组氨酸。
在优选的情况下，式I、II、III、IV、V和VI的GLP-1类似物同天然GLP-1(7-37)OH中的对应氨基酸相比较具有6个或者更少的变化。更为优选的类似物同天然GLP-1(7-37)OH中的对应氨基酸相比较具有5个或者更少的变化，或者同天然GLP-1(7-37)OH中的对应氨基酸相比较具有4个或者更少的变化，或者同天然GLP-1(7-37)OH中的对应氨基酸相比较具有3个或者更少的变化。
具有多个替换的优选的式I、II、III、IV、V和VI的GLP-1化合物包括一些GLP-1(7-37)OH，其中第8位为缬氨酸或者甘氨酸，第22位为谷氨酸，第16位为酪氨酸、亮氨酸或者色氨酸，第18位为酪氨酸、色氨酸或者异亮氨酸，第25位为缬氨酸并且第33位为异亮氨酸。其它的优选的GLP-1化合物包括以下：Val8-Tyr16-GLP-1(7-37)OH、Val8-Tyr12-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Tyr16-Phe19-GLP-1(7-37)OH、Val8-Tyr16-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Trp16-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Leu16-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Ile16-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Phe16-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Trp18-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Tyr18-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Phe18-Glu22-GLP-1(7-37)OH、以及Val8-Ile18-Glu22-GLP-1(7-37)OH。
本文所披露的位置上的替换产生的GLP-1化合物同Val8-GLP-1(7-37)OH相比较具有提高的性能。本发明的GLP-1化合物比Val8-GLP-1(7-37)OH的效能一般高出3到6倍。例如，表8和表9提供了GLP-1化合物的列表，附以同GLP-1(7-37)OH或者Val8-GLP-1(7-37)OH相比较的这些化合物的体外效能。表8和9中所披露的体外效能一般代表了相对于GLP-1(7-37)OH或者Val8-GLP-1(7-37)OH的体内效能。
进一步，这些更为高效的类似物中的许多种都具有较低的聚集倾向性，并且由此而具有提高的稳定性。GLP-1可以至少两种不同的形式存在。第一种形式有生理活性并且在生理pH(7.4)下易溶于水溶液中。当水溶液被搅拌、暴露于疏水表面或者具有很大的气水界面时容易产生第二种形式。转化成为不溶形式的倾向性相当程度上使活性GLP-1化合物的商业规模的生产复杂化。由此，在溶液中具有较低的聚集倾向性并且比GLP-1(7-37)OH或者Val8-GLP-1(7-37)OH更为高效的GLP-1化合物较为优选。例如，GLP-1化合物Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu30-GLP-1(7-37)OH以及Val8-His37-GLP-1(7-37)OH同GLP-1(7-37)OH或者Val8-GLP-1(7-37)OH(见表8和9)在溶液中表现出了显著降低的聚集倾向性。由此，除在诸如12、16、18、19、20、25、27和33这样的位置上的替换之外，本发明的优选的GLP-1化合物或者在第22位上具有谷氨酸，或者在第30位上具有谷氨酸，或者在第37位上具有组氨酸或具有这些替换的组合。
式I、II、III、IV、V和VI的优选的实施方案包括一些GLP-1化合物，这些GLP-1化合物同GLP-1(7-37)OH或者GLP-1(7-36)NH2的差异不超过6个氨基酸、不超过5个氨基酸、不超过4个氨基酸或者不超过3个氨基酸。同样优选的情况还有，式I、II、III、IV、V和VI的GLP-1化合物在第8位为缬氨酸或者甘氨酸并且在第22位为谷氨酸。同样优选的情况还有，式I、II、III、IV、V和VI的GLP-1化合物在第8位为缬氨酸或者甘氨酸并且在第30位为谷氨酸。同样优选的情况还有，式I、II、III、IV、V和VI的GLP-1化合物在第8位为缬氨酸或者甘氨酸并且在第37位为组氨酸。
同GLP-1(7-37)OH相比较已经表现出显著降低的聚集倾向的GLP-1类似物的例子在实施例8和表9中有所描述。同GLP-1(7-37)OH相比较已经表现出显著提高的GLP-1受体激活的GLP-1类似物的例子在实施例8和表8和9中有所描述。本发明的GLP-1类似物在优选的情况下在表8和9中描述。
本发明的GLP-1化合物还包括GLP-1衍生物。“GLP-1衍生物”指的是在天然的情况下被截短的GLP-1化合物、GLP-1片段或者GLP-1类似物的一种氨基酸序列，但该序列额外地在一个或者多个氨基酸侧链基团、α碳原子、末端氨基基团或者末端羧基基团上具有的化学修饰。化学修饰包括，添加化学结构团、产生新键和除去化学结构团，但不限于这些。氨基侧链上的化学修饰包括，赖氨酸ε-氨基基团的酰化，精氨酸、组氨酸或者赖氨酸的N-烷基化，天冬氨酸羧基侧链的烷基化以及谷氨酰胺或者天冬酰胺的去氨基化，但不限于这些。末端氨基基团的修饰包括，脱氨基、N-低级烷基、N-二-低级烷基以及N-酰化修饰，但不限于这些。末端羧基基团的的修饰包括，酰胺、低级烷基酰胺、二烷基胺以及低级烷基酯修饰，但不限于这些。进一步，一个或者多个侧链基团或者末端基团可通过保护性基团进行保护，这些保护性基团为普通的蛋白质化学家所知。氨基酸的α-碳可以被单甲基化或者双甲基化。优选的GLP-1衍生物在美国专利No.6,268,343B1中有所描述。更为优选的GLP-1衍生物为Arg34Lys26-(N-εp28-13-(γ-Glu(N-α-hexadecanoyl)))-GLP-1(7-37)。
可被衍生的优选的GLP-1化合物包括一些GLP-1类似物，这些类似物在以下位置中的一个或者多个中具有修饰：8、12、16、18、19、20、22、25、27、30、33和37，并且这些类似物表现出同Val8-GLP-1(7-37)相比较提高的效能。
可被衍生的其它优选的GLP-1化合物为Exendin-3或者Exendin-4。这些GLP-1化合物在WO99/07404、WO99/25727、WO99/25728、WO99/43708、WO00/66629以及US2001/0047084A1中有所描述，并且在此引为参考。
可用于本发明的基础胰岛素的代表性例子在本领域中是已知的并且已经商业化。基础胰岛素的一个例子为胰岛素-NPH。胰岛素-NPH通过本领域中所广泛接受的技术进行制备，并且在美国专利No.5,547,929以及Hagedorn，H.C.等，(1936)J.Am.Med.Assn.106，177-180中有所描述，并且在此引为参考。
基础胰岛素的一个例子为单体胰岛素类似物的一种类胰岛素-NPH制备物，该制备物被称之为单体胰岛素类似物-NPD，在本领域中更常见被称为“NPL”。NPL为LysB28-ProB29的一种中性鱼精蛋白制剂，其中该制剂含有一种胰岛素复合物以及处于水介质中的锌，该复合物含有同鱼精蛋白相复合的LysB28-ProB29。NPL在美国专利No.5,461,031、5,650,486和5,747,642中有所描述。
用于本发明的胰岛素类似物可通过多种被认可的肽合成工艺进行制备，这些工艺包括经典的溶液法、固相法、半合成法以及重组DNA方法。1996年5月7日公开的Chance等人的美国专利No.5,514,646披露了多种胰岛素类似物的制备，该专利具有充分的细节以使本领域的技术人员可对本发明所使用的任何胰岛素类似物进行制备。
AspB28鱼精蛋白胰岛素晶体为另一种基础胰岛素。根据Balschmidt的AspB28鱼精蛋白胰岛素晶体制剂在美国专利No.5,840,680中有所描述。该制剂含有一些晶体，这些晶体中含有Asp28、鱼精蛋白胰岛素以及以下成分之一：苯酚、间甲酚或者它们的组合，任选地还可进一步含有处于水介质中的锌。
另外，还可能有一种基础胰岛素制剂，该制剂含有可用于本发明的不同的胰岛素。在WO99/32116中Brader描述了一些共晶体，这些晶体含有衍生化的胰岛素、未衍生化的胰岛素、锌、鱼精蛋白以及苯酚防腐剂，这些共晶体在糖动力学反应特征的持续时间和形态上提供了控制上的弹性。
可用于本发明的还有多种其它的胰岛素制剂。这些制剂包括，胰岛素锌悬浮物(Ultralente(UL)和Semilente胰岛素)和鱼精蛋白锌胰岛素(PZI)，但不限于这些。这些基础胰岛素的制备物在本领域中为人所熟知并且由Brange在Galenics of Insulin：The Physico-chemicaland Pharmaceutical Aspect of Insulin and Insulin Preparation，Springer-Verlag Berlin Heidelbert(1987)中进行了描述。
可用于本发明的其它的胰岛素制剂一般情况下被描述为可溶的酰化基础胰岛素。这些制剂包括了在LysB29的ε氨基基团上被脂肪酸酰化的胰岛素，但不限于此。这些基础胰岛素的制备物在本领域中为人所熟知并且由Meyers等，(1997)Diabates 46，637-642，Markussen等，(1996)Diabetology 39，281-288以及Havelund等，WO95/07931进行了描述。酰化的胰岛素或者胰岛素类似物在美国专利No.6,011,007中被进一步描述。这些可溶的基础胰岛素含有一种在B链的第29位赖氨酸的ε-氨基基团上具有亲脂取代基。在一个实施方案中，酰化的胰岛素类似物可在A链第21位具有除Lys、Arg和Cys之外的任何氨基酸，可在B链第3位具有除Lys、Arg和Cys之外的任何氨基酸，并且在B链第1位的苯丙氨酸可被去除或者保存。B链第30位可以为(a)一种具有10到24个碳原子的非编码亲脂氨基酸，在该情况下最多具有5个碳原子的某种羧酸的酰基基团可结合于B链的第29位赖氨酸的ε-氨基基团上，(b)除Lys、Arg和Cys之外的任何氨基酸，在该情况下B链的第29位赖氨酸的ε-氨基基团上具有一种亲脂取代基，或者(c)被去除，该情况下B链的第29位赖氨酸的ε-氨基基团上具有一种亲脂取代基；同时为该胰岛素的任何一种同Zn++形成的复合物，倘若在B链的第30位为Thr或者Ala、A链的第21位和B链的第3位均为Asn，并且B链的第1位为苯丙氨酸的情况下，则该酰化的胰岛素类似物为一种Zn++复合物。酰化的胰岛素类似物的例子在表1中描述。
表1.
NεB29-三癸酰基脱(B30)人类胰岛素，
NεB29-四癸酰基脱(B30)人类胰岛素，
NεB29-癸酰基脱(B30)人类胰岛素，
NεB29-十二酰基脱(B30)人类胰岛素，
NεB29-三癸酰基GlyA21脱(B30)人类胰岛素，
NεB29-四癸酰基GlyA21脱(B30)人类胰岛素，
NεB29-癸酰基GlyA21脱(B30)人类胰岛素，
NεB29-十二酰基GlyA21脱(B30)人类胰岛素，
NεB29-三癸酰基GlyA21 GlnB3脱(B30)人类胰岛素，
NεB29-四癸酰基GlyA21 GlnB3脱(B30)人类胰岛素，
NεB29-癸酰基GlyA21 GlnB3脱(B30)人类胰岛素，
NεB29-十二酰基GlyA21 GlnB3脱(B30)人类胰岛素，
NεB29-三癸酰基AlaA21脱(B30)人类胰岛素，
NεB29-四癸酰基AlaA21脱(B30)人类胰岛素，
NεB29-癸酰基AlaA21脱(B30)人类胰岛素，
NεB29-十二酰基AlaA21脱(B30)人类胰岛素，
NεB29-三癸酰基AlaA21 GlnB3脱(B30)人类胰岛素，
NεB29-四癸酰基AlaA21 GlnB3脱(B30)人类胰岛素，
NεB29-癸酰基AlaA21 GlnB3脱(B30)人类胰岛素，
NεB29-十二酰基AlaA21 GlnB3脱(B30)人类胰岛素，
NεB29-三癸酰基GlnB3脱(B30)人类胰岛素，
NεB29-四癸酰基GlnB3脱(B30)人类胰岛素，
NεB29-癸酰基GlnB3脱(B30)人类胰岛素，
NεB29-十二酰基GlnB3脱(B30)人类胰岛素，
NεB29-三癸酰基GlyA21人类胰岛素，
NεB29-四癸酰基GlyA21人类胰岛素，
NεB29-癸酰基GlyA21人类胰岛素，
NεB29-十二酰基GlyA21人类胰岛素，
NεB29-三癸酰基GlyA21 GlnB3人类胰岛素，
NεB29-四癸酰基GlyA21 GlnB3人类胰岛素，
NεB29-癸酰基GlyA21 GlnB3人类胰岛素，
NεB29-十二酰基GlyA21 GlnB3人类胰岛素，
NεB29-三癸酰基AlaA21人类胰岛素，
NεB29-四癸酰基AlaA21人类胰岛素，
NεB29-癸酰基AlaA21人类胰岛素，
NεB29-十二酰基AlaA21人类胰岛素，
NεB29-三癸酰基AlaA21 GlnB3人类胰岛素，
NεB29-四癸酰基AlaA21 GlnB3人类胰岛素，
NεB29-癸酰基AlaA21 GlnB3人类胰岛素，
NεB29-十二酰基AlaA21 GlnB3人类胰岛素，
NεB29-三癸酰基GlnB3人类胰岛素，
NεB29-四癸酰基GlnB3人类胰岛素，
NεB29-癸酰基GlnB3人类胰岛素，
NεB29-十二酰基GlnB3人类胰岛素，
NεB29-三癸酰基GluB30人类胰岛素，
NεB29-四癸酰基GluB30人类胰岛素，
NεB29-癸酰基GluB30人类胰岛素，
NεB29-十二酰基GluB30人类胰岛素，
NεB29-三癸酰基GlyA21 GluB30人类胰岛素，
NεB29-四癸酰基GlyA21 GluB30人类胰岛素，
NεB29-癸酰基GlyA21 GluB30人类胰岛素，
NεB29-十二酰基GlyA21 GluB30人类胰岛素，
NεB29-三癸酰基GlyA21 GlnB3 GluB30人类胰岛素，
NεB29-四癸酰基GlyA21 GlnB3 GluB30人类胰岛素，
NεB29-癸酰基GlyA21 GlnB3 GluB30人类胰岛素，
NεB29-十二酰基GlyA21 GlnB3 GluB30人类胰岛素，
NεB29-三癸酰基AlaA21 GluB30人类胰岛素，
NεB29-四癸酰基AlaA21 GluB30人类胰岛素，
NεB29-癸酰基AlaA21 GluB30人类胰岛素，
NεB29-十二酰基AlaA21 GluB30人类胰岛素，
NεB29-三癸酰基AlaA21 GlnB3 GluB30人类胰岛素，
NεB29-四癸酰基AlaA21 GlnB3 GluB30人类胰岛素，
NεB29-癸酰基AlaA21 GlnB3 GluB30人类胰岛素，
NεB29-十二酰基AlaA21 GlnB3 GluB30人类胰岛素，
NεB29-三癸酰基GlnB3 GluB30人类胰岛素，
NεB29-四癸酰基GlnB3 GluB30人类胰岛素，
NεB29-癸酰基GlnB3 GluB30人类胰岛素，
NεB29-十二酰基GlnB3 GluB30人类胰岛素，
可用于本发明的其它胰岛素制剂一般被描述为可溶的pI移动的胰岛素类似物。pI移动的类似物在美国专利No.5,656,722中有所描述。这些类似物具有的pI介于约5到约8.5之间，这是由于对氨基酸序列的碱性修饰所导致的。它们在适当制剂的弱酸pH值下可稳定较长时间。人类胰岛素的pI移动的类似物在B链的C-末端具有碱性修饰、在A链的第21位有一个精氨酸替换，并且在适当的情况下，在B链的第10位有一个组氨酸替换。优选的情况下，该pI移动的胰岛素类似物在A链的第21位上为Gly并且在B链的第31位上为Arg-Arg-OH。pI移动的胰岛素类似物在表2中描述。
表2
AspA21-人类胰岛素-ArgB31-OH
GluA21-人类胰岛素-ArgB31-OH
GlyA21-人类胰岛素-ArgB31-OH
SerA21-人类胰岛素-ArgB31-OH
ThrA21-人类胰岛素-ArgB31-OH
AlaA21-人类胰岛素-ArgB31-OH
AspA21-人类胰岛素-ArgB31-ArgB32-OH
GluA21-人类胰岛素-ArgB31-ArgB32-OH
GlyA21-人类胰岛素-ArgB31-ArgB32-OH
SerA21-人类胰岛素-ArgB31-ArgB32-OH
ThrA21-人类胰岛素-ArgB31-ArgB32-OH
AlaA21-人类胰岛素-ArgB31-ArgB32-OH
AspA21-AsnB10-人类胰岛素-ArgB31-OH
GluA21-AsnB10-人类胰岛素-ArgB31-OH
GlyA21-AsnB10-人类胰岛素-ArgB31-OH
SerA21-AsnB10-人类胰岛素-ArgB31-OH
ThrA21-AsnB10-人类胰岛素-ArgB31-OH
AlaA21-AsnB10-人类胰岛素-ArgB31-OH
AspA21-AsnB10-人类胰岛素-ArgB31-ArgB32-OH
GluA21-AsnB10-人类胰岛素-ArgB31-ArgB32-OH
GlyA21-AsnB10-人类胰岛素-ArgB31-ArgB32-OH
SerA21-AsnB10-人类胰岛素-ArgB31-ArgB32-OH
ThrA21-AsnB10-人类胰岛素-ArgB31-ArgB32-OH
AlaA21-AsnB10-人类胰岛素-ArgB31-ArgB32-OH
可用于本发明的其它可溶pI移动基础胰岛素类似物在Markussen等，(1988)2：157中描述。Markussen等人所描述的一种优选的类似物为GlyA21ArgB27ThrB30-NH2。这种类似物通常称为NovoSol Basal。
在另一个实施方案中，该pI移动的胰岛素类似物为人类胰岛素，该胰岛素在A链的第0位为Arg，并且在B链的第29位赖氨酸的ε-氨基基团上连着Arg(A0Arg-B29Lys-Nε-Arg)。在另一个实施方案中，该pI移动的胰岛素类似物为人类胰岛素，该胰岛素在A链的第0位为Arg，在A链的第21位以任何一种氨基酸替换了Asn并且在B链的第29位赖氨酸的ε-氨基基团上连着Arg(A0Arg-A21Xaa-B29Lys-Nε-Arg)。在另一个实施方案中，该pI移动的胰岛素类似物为人类胰岛素，该胰岛素在A链的第0位为Arg，在B链的第0位为Arg，并且在B链的第29位赖氨酸的ε-氨基基团上连着Arg(A0Arg-B0Arg-B29Lys-Nε- Arg)。在另一个实施方案中，该pI移动的胰岛素类似物为人类胰岛素，该胰岛素在A链的第0位为Arg，在A链的第21位以任何一种氨基酸替换了Asn，在B链的第0位为Arg，并且在B链的第29位赖氨酸的ε-氨基基团上连着Arg(A0Arg-A21Xaa-B0Arg-B29Lys-Nε-Arg)。在另一个实施方案中，该pI移动的胰岛素类似物为人类胰岛素，该胰岛素在A链的第0位为Lys，该Lys的ε-氨基基团上连着Arg，并且在B链的第29位赖氨酸的ε-氨基基团上连着Arg(A0Lys-Nε-Arg-B29Lys-Nε-Arg)。在另一个实施方案中，该pI移动的胰岛素类似物为人类胰岛素，该胰岛素在A链的第0位为Lys，该Lys的ε-氨基基团上连着Arg，在A链的第21位以任何一种氨基酸替换了Asn，并且在B链的第29位赖氨酸的ε-氨基基团上连着Arg(A0Lys-Nε-Arg-A21Xaa-B29Lys-Nε-Arg)。
其它的pI移动的基础胰岛素类似物在Beal等人的美国临时申请中描述，该申请名称为Insulin Molecule Having Protracted TimeAction，于2002年8月2日在美国专利商标局提交。这些pI移动的基础胰岛素类似物的例子在表3中描述。
表3
A0ArgB0Arg-胰岛素；
A0ArgB0ArgA21Xaa-胰岛素；
A0ArgB0ArgA21Gly-胰岛素；
A0ArgB0ArgA21ser-胰岛素；
A0LysB0Lys-胰岛素；
A0LysB0LysA21Xaa-胰岛素；
A0LysB0LysA21Gly-胰岛素；
A0LysB0LysA21ser-胰岛素；
A0ArgB0Lys-胰岛素；
A0ArgB0LysA21Xaa-胰岛素；
A0ArgB0LysA21Gly-胰岛素；
A0ArgB0LysA21ser-胰岛素；
A0LysB0Arg-胰岛素；
A0LysB0ArgA21Xaa-胰岛素；
A0LysB0ArgA21Gly-胰岛素；
A0LysB0ArgA21ser-胰岛素；
A0ArgB0ArgB28Lys-Nε-ArgB29Pro-胰岛素；
A0ArgA21XaaB28Lys-Nε-ArgB29Pro-胰岛素；
A0ArgA21GlyB28Lys-Nε-ArgB29Pro-胰岛素；
A0ArgA21GlyB28Lys-Nε-ArgB29Pro-胰岛素；
A0ArgB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
A0ArgA21XaaB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
A0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
A0ArgA21SerB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
A0ArgB29Lys-Nε-Lys-胰岛素；
A0ArgA21XaaB29Lys-Nε-Lys-胰岛素；
A0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Lys-胰岛素；
A0ArgA21SerB29Lys-Nε-Lys-胰岛素；
A-1ArgA0LysA21XaaB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
A-1ArgA0LysA21GlyB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
A-1ArgA0LysA21SerB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
A-1ArgA0LysA21XaaB29Lys-Nε-Lys-胰岛素；
A-1ArgA0LysA21GlyB29Lys-Nε-Lys-胰岛素；
A-1ArgA0LysA21SerB29Lys-Nε-Lys-胰岛素；
A-1LysA0LysA21XaaB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
A-1LysA0LysA21GlyB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
A-1LysA0LysA21SerB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
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A-1LysA0LysA21GlyB29Lys-Nε-Lys-胰岛素；
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A-1ArgA0ArgA21XaaB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
A-1ArgA0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
A-1ArgA0ArgA21SerB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
A-1ArgA0ArgA21XaaB29Lys-Nε-Lys-胰岛素；
A-1ArgA0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Lys-胰岛素；
A-1ArgA0ArgA21SerB29Lys-Nε-Lys-胰岛素；
A0Lys-Nε-ArgA21XaaB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
A0Lys-Nε-ArgA21SerB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
A0Lys-Nε-ArgA21XaaB29Lys-Nε-Lys-胰岛素；
A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Lys-胰岛素；
A0Lys-Nε-ArgA21SerB29Lys-Nε-Lys-胰岛素；
A0Lys-Nε-LysA21XaaB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
A0Lys-Nε-LysA21GlyB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
A0Lys-Nε-LysA21SerB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
A0Lys-Nε-LysA21XaaB29Lys-Nε-Lys-胰岛素；
A0Lys-Nε-LysA21GlyB29Lys-Nε-Lys-胰岛素；
A0Lys-Nε-LysA21SerB29Lys-Nε-Lys-胰岛素；
A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
A0ArgA21XaaB0ArgB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
A0ArgA21GlyB0ArgB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
A0ArgA21SerB0ArgB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Lys-胰岛素；
A0ArgA21XaaB0ArgB29Lys-Nε-Lys-胰岛素；
A0ArgA21GlyB0ArgB29Lys-Nε-Lys-胰岛素；
A0ArgA21SerB0ArgB29Lys-Nε-Lys-胰岛素；
A0LysB0LysB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
A0LysA21XaaB0LysB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
A0LysA21GlyB0LysB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
A0LysA21SerB0LysB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
A0LysB0LysB29Lys-Nε-Lys-胰岛素；
A0LysA21XaaB0LysB29Lys-Nε-Lys-胰岛素；
A0LysA21GlyB0LysB29Lys-Nε-Lys-胰岛素；
A0LysA21SerB0LysB29Lys-Nε-Lys-胰岛素；
A0gHRB0gHRB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
A0gHRA21XaaB0gHRB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
A0gHRA21GlyB0gHRB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；以及
A0gHRA21SerB0gHRB29Lys-Nε-Arg-胰岛素；
GLP-1化合物和胰岛素均可在C-末端具有酸或者酰胺。天然的GLP-1为一种酰胺，因此在优选的情况下本发明的GLP-1化合物也为一种酰胺。但是，天然的人类胰岛素为一种酸，因此在优选的情况下本发明的胰岛素也是酸。
本发明进一步提供了一种制备预混合的制剂的方法，该制剂的制备通过将GLP-1化合物同基础胰岛素进行混合而进行。基础胰岛素可作为一种固体加入至含有GLP-1化合物的溶液之中，或者固体GLP-1化合物可被溶解于一种含有基础胰岛素的悬浮物或者溶液之中。在替代的情况下基础胰岛素和GLP-1化合物可以以任何顺序加入至某种缓冲液中。在一个实施方案中，GLP-1化合物以及基础胰岛素的储存液被分别制备而成并且根据所需的比例加至一起。在优选的情况下，用GLP-1储存溶液对100单位/ml的基础胰岛素悬浮物或者溶液进行稀释，从而使最终的预混合制剂具有介于30单位/ml到70单位/ml的基础胰岛素。在另一个实施方案中，固体GLP-1化合物被溶解于一种含有基础胰岛素的悬浮物或者溶液之中。在优选的情况下，该固体GLP-1被溶解于100单位/ml的基础胰岛素悬浮物或者溶液中，从而在混合物制剂中维持100单位/ml的基础胰岛素浓度。在优选的情况下，该预混合制剂被缓冲处理并且含有一种防腐剂和等渗剂。该GLP-1化合物和基础胰岛素的混合方式必须保护它们的生物活性和时间效能。
例如，含有NPH或者NPL的预混合制剂可通过将一种GLP-1化合物溶解于NPH或者NPL稀释液中而进行制备。可对赋形剂和该稀释液的pH进行调整从而将该GLP-1维持在溶液中。但是，缓冲液的pH或者浓度或者其它的赋形剂在GLP-1加入至NPH或者NPL之时不应使该胰岛素的其中部分或者全部溶解。由此，在优选的情况下，含有NPH或者NPL的预混合制剂的最终pH应介于约7到约8，优选的情况下介于7.2到7.8。不同体积的GLP-1化合物溶液可随后被加入至NPH或者NPL，由此而获得GLP-1化合物同胰岛素的所需比例。
以下的实施例仅仅为了进一步阐明本发明的预混合制剂的制备而提供。本发明的范围不应被解释为仅仅由以下的实施例组成。
实施例1
促胰岛素活性的测定：
在Ficoll梯度(于Hank’s平衡盐溶液中，27％，23％，20.5％和11％，pH7.4)上对胰腺组织的胶原酶消化物进行分离。在20.5％/11％的介面上收集胰岛，洗涤并且在立体显微镜下手工除去外分泌物和其它组织。将这些胰岛在RPMI 1640培养基中于37℃和95％空气/5％CO2下保温过夜，该培养基中补充以10％胎牛血清并且含有11mM葡萄糖。在补充以10％胎牛血清并且含有16.7mM葡萄糖的RPMI1640培养基中制备用于研究的GLP-1化合物，其浓度在优选的情况下介于3纳摩到30纳摩。通过微量移液器将约8到10个被分离的胰岛转移至96孔微滴度板中的总体积为250μl的含GLP-1化合物的培养基内。随后在存在GLP-1化合物的情况下，于37℃、95％空气和5％CO2中将这些胰岛保温90分钟。随后收集等份的无胰岛培养基并且对其100μl分析存在的胰岛素的量，该分析通过放射性免疫分析使用Equate Insulin RIA试剂盒进行(Binax，Inc.，Portland，ME)。
实施例2
Val8-GLP-1溶液的制备
制备了几种Val8-GLP-1溶液以在防腐剂系统存在的情况下测定维持Val8-GLP-1溶解度的条件，该防腐剂系统用于典型的基础胰岛素制剂。这些样品通过反相HPLC层析进行分析以测定总蛋白浓度以及可溶蛋白质浓度。表4对来自于各种Val8-GLP-1溶液的数据进行了概述。
表4 缓冲液物理外观pH理论Val8-GLP-1浓度 (mg/ml)总蛋白 浓度(mg/ml)可溶蛋白 浓度(mg/ml)纯度(％) 20mM TRIS 澄清 7.4 0.5 0.5 0.49 92.0 无缓冲液 澄清 7.7 0.5 0.42 - 92.1 14mM磷 酸盐 澄清 7.8 1.0 0.99 - 93.0 无缓冲液 澄清 7.8 0.5 0.43 - 91.9 无缓冲液 澄清 7.8 1.25 0.92 - N/A 无缓冲液 澄清 7.8 1.60 平均 1.3 - 平均 94.06 无缓冲液 澄清 7.8 1.60 1.5 - N/A 14mM磷 酸盐 澄清 8.0 0.5 0.51 - 92.9 14mM磷 酸盐 澄清 8.1 1.0 0.94 - 91.9 无缓冲液 混浊 7.8 2.50 2.19 - N/A 无缓冲液 混浊 7.8 5.0 4.01 - N/A 14mM磷 酸盐 混浊 7.4 1.0 0.96 - 96.8 7mM磷酸 盐 混浊 7.4 1.0 0.87 0.91 93.4 20mM TRIS 混浊 7.4 1.0 0.81 0.91 93.4 20mM TRIS 混浊 7.4 1.0 1.37 0.81 93.4
实施例3
胰岛素复合物
根据Krayenbühl和Rosenberg Crystalline Protamine Insulin 60-73，(1951)所提供的为人所接受的实践而制备了人类胰岛素-NPH。或者，Eli Lilly and Company，Indianapolis，IN所制造的名为Humulin-NTM的悬浮制剂可被购买作为人类胰岛素-NPH。在这些实验中用作为储存供应物的NPH的单位剂量和浓度为3.5mg/ml下U100。使用HCl或者NaOH将NPH的商业化药瓶pH调整至7.2-8.5。这些样品通过反相HPLC层析进行分析以测定可溶蛋白质浓度。表5对来自于各种NPH悬浮液的数据进行了概述。
表5 样品 No. pH 可溶蛋白浓度 (mg/ml) 1 7.2 0.33 2 7.2 0.004 3 7.8 0.01 4 8.0 0.06 5 8.0 0.14 6 8.5 0.39 7 8.5 0.87
实施例4
Val8-GLP-1/NPH混合物：
通过将160mg的Val8-GLP-1溶解于50mL水中而制备Val8-GLP-1溶液，此时保持pH范围为10到10.5。加入等份的Val8-GLP-1并且检测pH并用碱进行调节。在Val8-GLP-1溶解之后，使用HCl将该pH调节至8。随后将该溶液稀释成为缺磷酸盐缓冲液的100mL2×NPH稀释液(3.2mg/mL间甲酚、1.30mg/mL苯酚以及32mg/mL甘油，pH7.4)，Val8-GLP-1终浓度为1.6mg/mL。使用HCl或者NaOH将pH调节至7.8。将该Val8-GLP-1溶液同商业化的胰岛素-NPH悬浮液(U100，3.5mg/mL)以Val8-GLP-1∶NPH为30∶70、50∶50和70∶30的比例(体积∶体积)进行混合。该Val8-GLP-1∶NPH混合物含有最终浓度为1.6mg/mL的间甲酚、0.65mg/mL的苯酚，并且对于30∶70、50∶50和70∶30的比例分别含有10mM、7mM和4mM的磷酸盐缓冲液，并且含有16mg/mL的甘油。使用HCl或者NaOH将pH调节至7.8。这些样品通过反相HPLC层析进行分析以测定总蛋白浓度以及可溶蛋白质浓度。表4对来自于各种Val8-GLP-1/NPH混合物的数据进行了概述。
表6 Val8-GLP- 1/NPH 理论浓度 (mg/mL) 总蛋白浓度 (mg/mL) 可溶蛋白浓度 (mg/mL) 比例 Val8- GLP-1 胰岛素 Val8- GLP-1 胰岛素 Val8- GLP-1 胰岛素 30∶70 0.48 2.45 0.45 2.44 0.02 0.11 30∶70 0.48 2.45 0.29 2.30 0.01 0.07 30∶70 0.48 2.45 0.30 2.26 0.01 0.14 50∶50 0.8 1.75 0.53 1.71 0.06 0.41 50∶50 0.8 1.75 0.51 1.67 0.03 0.18 50∶50 0.8 1.75 0.50 1.68 0.03 0.41 70∶30 1.12 1.05 0.92 1.09 0.15 0.68 70∶30 1.12 1.05 0.92 1.04 0.09 0.86 70∶30 1.12 1.05 0.71 1.06 0.13 0.73
Val8-GLP-1的低可溶蛋白浓度意味着Val8-GLP-1同NPH相互作用。但是，尽管该GLP-1同NPH晶体进行附着，Val8-GLP-1的促胰岛素活性未受影响。见图4。
实施例5
Exendin-4/NPH混合物：
通过将20mg的Exendin-4溶解于5mL水中而制备了Exendin-4的溶液。使用HCl或者NaOH将pH调节至7.4或者7.6。随后将该溶液稀释成为缺磷酸盐缓冲液的10mL 2×NPH稀释液(3.2mg/mL间甲酚、1.30mg/mL苯酚以及32mg/mL甘油，pH7.4)，Exendin-4终浓度为2.0mg/mL。使用HCl或者NaOH将pH调节至7.8。将该Exendin-4溶液同商业化的胰岛素-NPH悬浮液(U100，3.5mg/mL)以Exendin-4∶NPH为30∶70、50∶50和70∶30的比例(体积∶体积)进行混合。该Exendin-4∶NPH混合物含有最终浓度为1.6mg/mL的间甲酚、0.65mg/mL的苯酚，并且对于30∶70、50∶50和70∶30的比例分别含有10mM、7mM和4mM的磷酸盐缓冲液，并且含有16mg/mL的甘油。使用HCl或者NaOH将pH调节至7.8。这些样品通过反相HPLC层析进行分析以测定总蛋白浓度以及可溶蛋白质浓度。表7对来自于各种Exendin-4/NPH混合物的数据进行了概述。
表7 Exendin- 4/NPH 测定 的pH 理论浓度 (mg/mL) 总蛋白浓度 (mg/mL) 可溶蛋白浓度 (mg/mL) 比例 Exendin -4 胰岛 素 Exendin -4 胰岛 素 Exendin -4 胰岛 素 30∶70 7.53 0.61 2.45 0.76 2.38 0.68 0.02 50∶50 7.59 1.02 1.75 1.28 1.74 1.14 0.03 70∶30 7.56 1.42 1.05 1.77 1.04 1.54 0.04
实施例6
Exendin-4/Lantus混合物：
通过将10mg的Exendin-4溶解于5mL水中而制备了Exendin-4的溶液。使用HCl将pH调节至4。随后使用5mL 2×稀释液(5.4mg/mL间甲酚、2.5mg/mL乙酸钠以及32mg/mL甘露醇)稀释该溶液，Exendin-4终浓度为1.0mg/mL。使用HCl将pH调节至4。将该Exendin-4溶液同商业化的Lantus胰岛素(U100，3.6378mg/mL)以Exendin-4∶Lantus为30∶70、50∶50和70∶30的比例(体积∶体积)进行混合。Exendin-4∶Lantus的30∶70混合物含有终浓度0.3mg/mL的Exendin-4、70IU的Lantus、2.7mg/mL的间甲酚、0.75mg/mL的乙酸钠、9.6mg/mL的甘露醇、21μg/ml的锌以及11.9mg/mL的甘油。使用HCl或者NaOH将最终pH调节至4。Exendin-4∶Lantus的50∶50混合物含有终浓度0.5mg/mL的Exendin-4、50IU的Lantus、2.7mg/mL的间甲酚、1.25mg/mL的乙酸钠、16mg/mL的甘露醇、15μg/ml的锌以及8.5mg/mL的甘油。使用HCl或者NaOH将最终pH调节至4。Exendin-4∶Lantus的70∶30混合物含有终浓度0.7mg/mL的Exendin-4、30IU的Lantus、2.7mg/mL的间甲酚、1.75mg/mL的乙酸钠、22.4mg/mL的甘露醇、9μg/ml的锌以及5.1mg/mL的甘油。使用HCl或者NaOH将最终pH调节至4。
实施例7
Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH/Lantus混合物：
通过将10mg的Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH溶解于5mL水中而制备了Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH的溶液。使用HCl将pH调节至4。随后使用5mL 2×稀释液(5.4mg/mL间甲酚、2.5mg/mL乙酸钠以及32mg/mL甘露醇)稀释该溶液，Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH终浓度为0.5mg/mL。使用HCl将pH调节至4。将该Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH溶液同商业化的Lantus胰岛素(U100，3.6378mg/mL)以Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH∶Lantus为30∶70、50∶50和70∶30的比例(体积∶体积)进行混合。Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH∶Lantus的30∶70混合物含有终浓度0.15mg/mL的Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、70IU的Lantus、2.7mg/mL的间甲酚、0.75mg/mL的乙酸钠、9.6mg/mL的甘露醇、21μg/ml的锌以及11.9mg/mL的甘油。使用HCl或者NaOH将最终pH调节至4。Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH∶Lantus的50∶50混合物含有终浓度0.25mg/mL的Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、50IU的Lantus、2.7mg/mL的间甲酚、1.25mg/mL的乙酸钠、16mg/mL的甘露醇、15μg/ml的锌以及8.5mg/mL的甘油。使用HCl或者NaOH将最终pH调节至4。Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH∶Lantus的70∶30混合物含有终浓度0.35mg/mL的Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、30IU的Lantus、2.7mg/mL的间甲酚、1.75mg/mL的乙酸钠、22.4mg/mL的甘露醇、9μg/ml的锌以及5.1mg/mL的甘油。使用HCl或者NaOH将最终pH调节至4。
实施例8
GLP聚集分析
可就GLP肽在溶液中的能力进行分析。溶液中的肽通常在合适的缓冲液中在略有提高的温度下进行搅拌，同时记录在350nm下的浊度作为时间的函数。对直至聚集开始的时间进行了测量以对给定的GLP分子在这些条件之下聚集的能力进行定量。
GLP-1化合物首先在碱性条件(pH10.5)下溶解30分钟以将任何聚集的物质溶解。随后将该溶液调节至pH7.4并且进行过滤。具体来说，将4mg的冻干GLP-1化合物溶解于3ml的10mM磷酸盐/10mM柠檬酸盐之中。将该pH调节至10.0-10.5并且保持30分钟。使用HCl将该溶液调节至pH7.4并且通过适当的滤器进行过滤，如Millex GV针头滤器(Millpore Corporation，Bedford，MA)。将该溶液稀释成为最终样品，该样品在10mM的柠檬酸盐、10mM磷酸盐、150mM NaCl之中含有0.3mg/mL蛋白质，并且被调节至pH7.4到7.5。在石英比色皿中保温该样品于37℃下。每5分钟测量350nm下该溶液的浊度，该测量在AVIV Model 14DS UV-VIS分光光度计(Lakewood，NJ)下进行。使测量之前30秒内以及测量过程中使用磁力搅拌棒搅拌该溶液，该磁力搅拌棒来自于Starna Cells，Inc.(Atascadero，CA)。350nm下OD值的提高显示了该GLP-肽的聚集。到聚集发生的时间通过对生长前期和生长期进行的线性拟合的截距进行估计，该拟合根据Drake的方法进行(Arvinte T，Cudd A，andDrake AF.(1993)J.Bio.Chem.268，6415-6422)。
在实验之间使用苛性皂溶液(例如，Contrad-70)清洗比色皿。
多种GLP-1化合物所对应的结果在表8中以化合物聚集所需的小时时间进行报道。可以发现，这些化合物相对其它GLP-1化合物表现出显著提高的聚集时间。
实施例9
GLP-1受体激活：
使用体外分析对本发明的GLP-1化合物激活GLP-1受体的能力进行了估测，该体外分析的例子如Gelfand等人的EP 619,322以及美国专利No.5,120,712。这些参考文献的全部内容被引为参考。
体外效能是一种肽在基于细胞的分析中激活GLP-1受体的能力的测量值。体外效能以“EC50”进行表达，该值是化合物在单药剂反应实验中产生50％活性的有效浓度。出于本发明的目的，体外效能通过使用一种荧光分析进行测定，该荧光分析使用稳定表达人类GLP-1受体的HEK-293 Aurora CRE-BLAM细胞。这些HEK-293细胞被稳定地整合入了一种DNA载体，该DNA载体具有受到cAmp反应元件(CRE)驱动的β-内酰胺酶(BLAM)基因表达。GLP-1激动剂同该受体的相互作用起始了一种信号，该信号导致了该cAmp反应元件的激活以及β-内酰胺酶的随后表达。可将β-内酰胺酶CCF2/AM底物加入暴露于特定量的GLP-1激动剂的细胞以提供GLP-1激动剂效能的测量，该底物在被β-内酰胺酶切割后发射荧光(Aurora BiosciencesCorp.)。该分析在Zlokarnik等，(1998)Science 279：84-88中有进一步的描述(亦见于实施例1)。使用上述的BLAM分析，利用从0.00003纳摩到30纳摩的稀释度而产生剂量反应曲线，从而对该EC50值进行测定。通过以GLP-1(7-37)OH或者Val8-GLP-1(7-37)OH作为参照并且将该参照设定为1而产生了相对体外效能值。
这些多肽相对于GLP-1(7-37)OH或者Val8-GLP-1(7-37)OH的活性在表8和9中进行报道。
表8
GLP-1多肽 GIP-1受体激活(相对
于GLP-1(7-37)OH)
GLP-1(7-37)OH 1.0
Val8-GLP-1(7-37)OH 0.47
Gly8-His11-GLP-1(7-37)OH 0.282
Val8-Ala11-GLP-1(7-37)OH 0.021
Val8-Lys11-GLP-1(7-37)OH 0.001
Val8-Tyr12-GLP-1(7-37)OH 0.81
Val8-Glu16-GLP-1(7-37)OH 0.047
Val8-Ala16-GLP-1(7-37)OH 0.112
Val8-Tyr16-GLP-1(7-37)OH 1.175
Val-Lys20-GLP-1(7-37)OH 0.33
Gln22-GLP-1(7-37)OH 0.42
Val8-Ala22-GLP-1(7-37)OH 0.56
Val8-Ser22-GLP-1(7-37)OH 0.50
Val8-Asp22-GLP-1(7-37)OH 0.40
Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH 1.29
Val8-Lys22-GLP-1(7-37)OH 0.58
Val8-Pro22-GLP-1(7-37)OH 0.01
Val8-His22-GLP-1(7-37)OH 0.14
Val8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2 0.53
Val8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2 1.0
Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)OH 1.07
Val8-Lys23-GLP-1(7-37)OH 0.18
Val8-His24-GLP-1(7-37)OH 0.007
Val8-Lys24-GLP-1(7-37)OH 0.02
Val8-His26-GLP-1(7-37)OH 1.6
Val8-Glu26-GLP-1(7-37)OH 1.5
Val8-His27-GLP-1(7-37)OH 0.37
Val8-Ala27-GLP-1(7-37)OH 0.47
Gly8-Glu30-GLP-1(7-37)OH 0.29
Val8-Glu30-GLP-1(7-37)OH 0.29
Val8-Asp30-GLP-1(7-37)OH 0.15
Val8-Ser30-GLP-1(7-37)OH 0.19
Val8-His30-GLP-1(7-37)OH 0.19
Val8-Glu33-GLP-1(7-37)OH 0.039
Val8-Ala33-GLP-1(7-37)OH 0.1
Val8-Gly33-GLP-1(7-37)OH 0.01
Val8-Glu34-GLP-1(7-37)OH 0.17
Val8-Pro35-GLP-1(7-37)OH 0.094
Val8-His35-GLP-1(7-37)OH 0.41
Val8-Glu35-GLP-1(7-37)OH 0.15
Val8-Glu36-GLP-1(7-37)OH 0.11
Val8-His36-GLP-1(7-37)OH 0.22
Val8-His37-GLP-1(7-37)OH 0.33
Val8-Leu16-Glu26-GLP-1(7-37)OH 0.23
Val8-Lys22-Glu30-GLP-1(7-37)OH 0.37
Val8-Lys22-Glu23-GLP-1(7-37)OH 0.35
Val8-Glu22-Ala27-GLP-1(7-37)OH 1.02
Val8-Glu22-Lys23-GLP-1(7-37)OH 1.43
Val8-Lys33-Val34-GLP-1(7-37)OH 0.08
Val8-Lys33-Asn34-GLP-1(7-37)OH 0.09
Val8-Gly34-Lys35-GLP-1(7-37)OH 0.34
Val8-Gly36-Pro37-GLP-1(7-37)NH2 0.53
表9 多肽 相对于Val8-GLP-1(7- 37)OH的GLP-1受体激活 GLP-1(7-37)OH 2.1 Val8-GLP-1(7-37)OH 1.0 Gly8-GLP-1(7-37)OH 1.7 Val8-Tyr12-GLP-1(7-37)OH 1.7 Val8-Tyr12-GLP-1(7-37)NH2 1.1 Val8-Trp12-GLP-1(7-37)OH 1.1 Val8-Leu16-GLP-1(7-37)OH 1.1 Val8-Val16-GLP-1(7-37)OH 1.1 Val8-Tyr16-GLP-1(7-37)OH 2.5 Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH 2.2 Val8-Leu25-GLP-1(7-37)OH 0.5 Val8-Tyr12-Tyr16-GLP-1(7-37)OH 1.5 Val8-Trp12-Glu22-GLP-1(7-37)OH 1.7 Val8-Tyr12-Glu22-GLP-1(7-37)OH 2.7 Val8-Tyr16-Phe19-GLP-1(7-37)OH 2.8 Val8-Tyr16-Glu22-GLP-1(7-37)OH 3.6，3.8 Val8-Trp16-Glu22-GLP-1(7-37)OH 4.9，4.6 Val8-Leu16-Glu22-GLP-1(7-37)OH 4.3 Val8-Ile16-Glu22-GLP-1(7-37)OH 3.3 Val8-Phe16-Glu22-GLP-1(7-37)OH 2.3 Val8-Trp18-Glu22-GLP-1(7-37)OH 3.2，6.6 Val8-Tyr18-Glu22-GLP-1(7-37)OH 5.1，5.9 Val8-Phe18-Glu22-GLP-1(7-37)OH 2.0 Val8-Ile18-Glu22-GLP-1(7-37)OH 4.0 Val8-Lys18-Glu22-GLP-1(7-37)OH 2.5 Val8-Trp19-Glu22-GLP-1(7-37)OH 3.2 Val8-Phe19-Glu22-GLP-1(7-37)OH 1.5 Val8-Phe20-Glu22-GLP-1(7-37)OH 2.7 Val8-Glu22-Leu25-GLP-1(7-37)OH 2.8 Val8-Glu22-Ile25-GLP-1(7-37)OH 3.1 Val8-Glu22-Val25-GLP-1(7-37)OH 4.7，2.9 Val8-Glu22-Ile27-GLP-1(7-37)OH 2.0 Val8-Glu22-Ala27-GLP-1(7-37)OH 2.2 Val8-Glu22-Ile33-GLP-1(7-37)OH 4.7，3.8，3.4 Val8-Asp9-Ile11-Tyr16-Glu22-GLP- 1(7-37)OH 4.3 Val8-Tyr16-Trp19-Glu22-GLP-1(7- 37)OH 3.5 Val8-Trp16-Glu22-Val25-Ile33-GLP- 1(7-37)OH 5.0 Val8-Trp16-Glu22-Ile33-GLP-1(7- 37)OH 4.1 Val8-Glu22-Val25-Ile33-GLP-1(7- 37)OH 4.9，5.8，6.7 Val8-Trp16-Glu22-Val25-GLP-1(7- 37)OH 4.4 Val8-Cys16-Val26-GLP-1(7-37)OH 4.2 Val8-Cys16-Val26-Arg34-GLP-1(7- 37)OH 2.4，1.9
实施例10
狗体研究体内比较
样品1：根据实施例4的描述制备了30∶70的Val8-GLP-1∶NPH混合物。该混合物含有终浓度为0.48mg/ml的Val8-GLP-1、2.45mg/ml的胰岛素-NPH、1.6mg/mL的间甲酚、0.65mg/mL的苯酚、10mM磷酸盐缓冲液以及16mg/ml的甘油。该pH经调节为终pH7.8。
样品2：通过以1×NPH稀释液溶解U100商业化胰岛素-NPH而制备了U70的商业化的胰岛素-NPH悬浮液。该U70的商业化的胰岛素-NPH悬浮液含有终浓度为2.45mg/ml的胰岛素-NPH、1.6mg/mL的间甲酚、0.65mg/mL的苯酚、10mM磷酸盐缓冲液以及16mg/ml的甘油。该pH经调节为终pH7.4。
样品3：根据实施例4的描述制备了Val8-GLP-1的溶液，但是没有进行同商业化的胰岛素-NPH悬浮液的混合，取而代之的是使用1×NPH稀释液以30∶70(体积∶体积)的Val8-GLP-1∶稀释液的比例对该Val8-GLP-1溶液进行了稀释。该30％的Val8-GLP-1溶液含有终浓度为0.48mg/ml的Val8-GLP-1、1.6mg/mL的间甲酚、0.65mg/mL的苯酚、10mM磷酸盐缓冲液以及16mg/ml的甘油。该pH经调节为终pH7.8。
在狗体内比较上述样品而进行了一种三方面(three arm)初步研究。在该初步研究的第一个方面中，在四只不同的狗的颈部上的单一位点上以0.74U/kg NPH(1.5nmol/kg Val8-GLP-1)的剂量使用样品1进行注射。对一个3小时的高血糖注入(150mg/dl)进行起始并且对葡萄糖输注速度进行连续记录。定期收取血样以进行血糖、胰岛素、C-肽以及免疫反应性GLP-1浓度的测定。在研究当天测定血糖浓度。随后将剩余样品冻存(-80℃)并且在稍后的时间对激素浓度进行定量分析。
在该初步研究的第二个方面中，在同样四只的狗的颈部上的一个位点上以0.74U/kg NPH的剂量使用样品2进行注射。与此同时，在同样四只的狗的颈部上的第二个位点上以1.5nmol/kg Val8-GLP-1的剂量使用样品3进行注射。同样，对一个3小时的高血糖注入(150mg/dl)进行起始并且对葡萄糖输注速度进行连续记录。定期收取血样以进行血糖、胰岛素、C-肽以及免疫反应性GLP-1浓度的测定。在研究当天测定血糖浓度。随后将剩余样品冻存(-80℃)并且在稍后的时间对激素浓度进行定量分析。
在该初步研究的第三个方面中，在同样四只的狗的颈部上的一个位点上以0.74U/kg NPH的剂量仅仅使用样品2进行注射。同样，对一个3小时的高血糖注入(150mg/dl)进行起始并且对葡萄糖输注速度进行连续记录。定期收取血样以进行血糖、胰岛素、C-肽以及免疫原性GLP-1浓度的测定。在研究当天测定血糖浓度。随后将剩余样品冻存(-80℃)并且在稍后的时间对激素浓度进行定量分析。
在图1-4中出示的狗体内研究的结果显示，当Val8-GLP-1被注射时，糖动力学活性上相对于仅仅注射胰岛素-NPH的情况具有明显的提高(见图1)。出人意料的是，对于该研究的第一方面，糖动力学活性的提高同该研究的第二方面相比更为强劲和一致(见图1和2)。但是，第一方面的C-肽和免疫反应性GLP-1浓度同第二方面相去不远(分别见图3和4)。同样还观察到Val8-GLP-1在研究的第一方面中的吸收同Val8-GLP-1在研究的第二方面中的吸收相比有所延长(见图4)。
实施例11
Exendin-4/Lantus混合物：
在100μL的商业化Lantus胰岛素(U100，3.6378mg/mL)中溶解Exendin-4(160μg)。用手轻轻振荡混合物直至固体溶解并且获得澄清的溶液。在5℃下保存该溶液。18小时后该溶液亦然澄清未见沉淀。pH为4.0。经反相HPLC测定的Exendin-4和Lantus终浓度为0.9mg/mL Exendin-4以及3.5mg/mL Lantus。根据Lantus商业化制剂中的已知赋形剂浓度，混合物中的赋形剂最终浓度如下：2.7mg/mL间甲酚、30μg/ml锌以及17mg/ml甘油。
实施例12
Exendin-4/Lantus混合物：
在100μL的商业化Lantus胰岛素(U100，3.6378mg/mL)中溶解Exendin-4(290μg)。用手轻轻振荡该混合物直至固体溶解并且获得澄清的溶液。使用NaOH调节pH为4.0。经反相HPLC测定的Exendin-4和Lantus终浓度为1.6mg/mL Exendin-4以及3.5mg/mLLantus。根据Lantus商业化制剂中的已知赋形剂浓度，混合物中的赋形剂最终浓度如下：2.7mg/mL间甲酚、30μg/ml锌以及17mg/ml甘油。
实施例13
Exendin-4/Lantus混合物：
在500μL的商业化Lantus胰岛素(U100，3.6378mg/mL)中溶解Exendin-4(529μg)。用手轻轻振荡该混合物直至固体溶解并且获得澄清的溶液。使用NaOH调节pH为4.0。经反相HPLC测定的Exendin-4和Lantus终浓度为1mg/mL Exendin-4以及3.5mg/mLLantus。根据Lantus商业化制剂中的已知赋形剂浓度，混合物中的赋形剂最终浓度如下：2.7mg/mL间甲酚、30μg/ml锌以及17mg/ml甘油。
实施例14
Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH/Lantus混合物：
通过将2.1mg的Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH溶解于1ml的0.01NNaOH中而制备了Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH的储存溶液。使用NaOH将pH调节至11.3从而获得澄清的溶液。随后使用HCl将pH调节至4.0并且保持澄清。将Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH(300μL储存液)加入至700μL商业化的Lantus胰岛素(U100，3.6378mg/mL)中。使用HCl将pH调节至3.3从而获得澄清的溶液，并且使用NaOH调节至4.2，该溶液保持澄清。经反相HPLC测定的Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH和Lantus终浓度为0.5mg/mL Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH以及2.4mg/mL Lantus。根据Lantus商业化制剂中的已知赋形剂浓度，该混合物中的赋形剂最终浓度如下：1.9mg/mL间甲酚、21μg/ml锌以及11.9mg/ml甘油。
实施例15
Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH/Lantus混合物：
通过将2.0g的合成甘油、0.3g的间甲酚以及120μL的25mg/mL氧化锌溶液溶解于100mL无菌水中而获得储存液A。该溶液使用Millipore Sterivex-GV 0.22μm滤器进行过滤。
通过将4.8mg的Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH溶解于1.5ml的储存液A中而制备了Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH的储存溶液。使用NaOH将pH调节至11。随后使用HCl将pH调节至4.0并且保持澄清。将Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH(300μL储存液)加入至700μL商业化的Lantus胰岛素(U100，3.6378mg/mL)中。使用HCl将pH调节至2.7从而获得澄清的溶液，并且随后使用NaOH调节至3.5。Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH和Lantus终浓度据计算为0.96mg/mL Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH以及2.5mg/mL Lantus。根据Lantus商业化制剂中的已知赋形剂浓度，该混合物中的赋形剂最终浓度如下：1.9mg/mL间甲酚、21μg/ml锌以及11.9mg/ml甘油。
实施例16
Exendin-4/A0Arg-B0Arg-B29Lys-Nε-Arg混合物：
过将2.0g的合成甘油、0.3g的间-甲酚以及120μL的25mg/mL氧化锌溶液溶解于100mL无菌水中而获得储存液A。该溶液使用MilliporeSterivex-GV 0.22μm滤器进行过滤。
将A0Arg-B0Arg-B29Lys-Nε-Arg(人类胰岛素，在A链第0位为Arg，在A链第21位为Gly，在B链第0位为Arg并且在B链第29位的Lys的ε氨基基团之上连有Arg)(384μg)溶解于100μL储存溶液A。使用NaOH将pH调节至4.0。
将Exendin-4(197μg)溶解于A0Arg-B0Arg-B29Lys-Nε-Arg溶液。使用NaOH将该溶液的pH调节至4.1。经反相HPLC测定的Exendin-4和A0Arg-B0Arg-B29Lys-Nε-Arg终浓度为1.1mg/mL Exendin-4以及2.4mg/mLA0Arg-B0Arg-B29Lys-Nε-Arg。
实施例17
Exendin-4/A0Arg-B0Arg-B29Lys-Nε-Arg混合物：
过将2.0g的合成甘油、0.3g的间-甲酚以及120μL的25mg/mL氧化锌溶液溶解于100mL无菌水中而获得储存液A。该溶液使用MilliporeSterivex-GV 0.22μm滤器进行过滤。
将A0Arg-B0Arg-B29Lys-Nε-Arg(人类胰岛素，在A链第0位为Arg，在A链第21位为Gly，在B链第0位为Arg并且在B链第29位的Lys的ε氨基基团之上连有Arg)(1.84mg)溶解于500μL储存溶液A。使用NaOH将pH调节至4.1。
将Exendin-4(568μg)溶解于A0Arg-B0Arg-B29Lys-Nε-Arg溶液。使用NaOH将该溶液的pH调节至4.2。终浓度经计算为1.1mg/mL Exendin-4以及3.68mg/mL A0Arg-B0Arg-B29Lys-Nε-Arg。
序列表
<110>依莱利利公司
<120>GLP-1和基础胰岛素的预混合物
<130>X-14314
<150>60/315460
<151>2001-08-28
<150>60/385266
<151>2002-05-31
<150>60/386061
<151>2002-06-04
<160>6
<170>PatentIn Version 3.1
<210>1
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_特征
<222>(31)..(31)
<223>第31位的Xaa是Gly或-NH2
<400>1
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa
20 25 30
<210>2
<211>39
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>MISC_特征
<222>(2)..(2)
<223>第2位的Xaa是Ser或Gly；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(39)..(39)
<223>第39位的Ser是Ser或Ser-NH2；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(3)..(3)
<223>第3位的Xaa是Asp或Glu；
<400>2
His Xaa Xaa Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210>3
<211>39
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>MISC_特征
<222>(1)..(1)
<223>第1位的Xaa是L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、beta-羟基-组氨酸、高组氨酸、alpha-氟甲基-组氨酸或alpha-甲基-组氨酸；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(2)..(2)
<223>第2位的Xaa是Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp或Lys；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(3)..(3)
<223>第3位的Xaa是Glu、Asp、Lys、Thr、Ser、Arg、Trp、Phe、Tyr或His；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(5)..(5)
<223>第5位的Xaa是Thr、Ala、Gly、Ser、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Arg、His或Lys；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(6)..(6)
<223>第6位的Xaa是His、Trp、Phe或Tyr；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(8)..(8)
<223>第8位的Xaa是Ser、Ala、Gly、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp或Lys；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(10)..(10)
<223>第10位的Xaa是Val、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Tyr、Glu、Asp、Trp、His、Phe或Lys；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(11)..(11)
<223>第11位的Xaa是Ser、Ala、Gly、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp或Lys；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(12)..(12)
<223>第12位的Xaa是Ser、Ala、Gly、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、His、Pro、Arg或Lys；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(13)..(13)
<223>第13位的Xaa是Tyr、Phe、Trp、Glu、Asp、Gly、Gln、Asn、Arg、Cys或Lys；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(14)..(14)
<223>第14位的Xaa是Leu、Ala、Gly、Ser、Thr、Ile、Val、Glu、Asp、Met或Lys；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(15)..(15)
<223>第15位的Xaa是Glu、Asp或Lys；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(16)..(16)
<223>第16位的Xaa是Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp或Lys；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(17)..(17)
<223>第17位的Xaa是Gln、Asn、Arg、Glu、Asp、His或Lys；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(18)..(18)
<223>第18位的Xaa是Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Arg、Glu、Asp或Lys；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(19)..(19)
<223>第19位的Xaa是Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp或Lys；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(20)..(20)
<223>第20位的Xaa是Lys、Arg、Gln、Glu、Asp、Trp、Tyr、Phe或His；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(21)..(21)
<223>第21位的Xaa是Glu、Asp、Ala、His、Phe、Tyr、Trp、Arg、Leu或Lys；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(24)..(24)
<223>第24位的Xaa是Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、His或Lys；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(25)..(25)
<223>第25位的Xaa是Trp、Phe、Tyr、Glu、Asp、Ser、Thr、Arg或Lys；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(26)..(26)
<223>第26位的Xaa是Leu、Gly、Ala、Ser、Thr、Ile、Val、Glu、Asp或Lys；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(27)..(27)
<223>第27位的Xaa是Val、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Glu、Asp、Arg或Lys；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(28)..(28)
<223>第28位的Xaa是Lys、Arg、Glu、Asp、Asn或His；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(29)..(29)
<223>第29位的Xaa是Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Arg、Trp、Tyr、Phe、Pro、His或Lys；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(30)..(30)
<223>第30位的Xaa是Arg、Lys、Glu、Asp、Thr、Ser、Trp、Tyr、Phe、Gly或His；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(31)..(31)
<223>第31位的Xaa是Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、His、Lys、Arg、Trp、Tyr、Phe、Pro、Pro-NH2或被去除；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(32)..(32)
<223>第32位的Xaa是Arg、Lys、Glu、Asp、Ser或His或被去除；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(33)..(33)
<223>第33位的Xaa是Arg、Lys、Glu、Asp、Ser或His或被去除；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(34)..(34)
<223>第34位的Xaa是Asp、Glu、Gly或Lys或被去除；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(35)..(35)
<223>第35位的Xaa是Phe、Trp、Tyr、Glu、Asp、Ala或Lys或被去除；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(36)..(36)
<223>第36位的Xaa是Ser、Pro、Lys、Glu或Asp或被去除；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(37)..(37)
<223>第37位的Xaa是Ser、Glu、Asp、Pro或Lys或被去除；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(38)..(38)
<223>第38位的Xaa是Gly、Glu、Asp、Pro或Lys或被去除；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(39)..(39)
<223>第39位的Xaa是Ala、Val、Glu、Asp、Ser、Lys、Ala-NH2、Val-NH2、Glu-NH2、Asp-NH2、Ser-NH2、Lys-NH2或被去除、或C-1-6酯、或酰胺、或C-1-6烷基酰胺、或C-1-6二烷基酰胺；
<400>3
Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Thr Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35
<210>4
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>MISC_特征
<222>(2)..(2)
<223>第2位的Xaa是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser或Thr；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(16)..(16)
<223>第16位的Xaa是Asp、Glu、Gln、Asn、Lys、Arg、Cys或磺基丙氨酸；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(17)..(17)
<223>第17位的Xaa是His、Asp、Lys、Glu或Gln；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(21)..(21)
<223>第21位的Xaa是Ala、Glu、His、Phe、Tyr、Trp、Arg或Lys；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(24)..(24)
<223>第24位的Xaa是Glu、Asp、Ser或His；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(31)..(31)
<223>第31位的R是Lys、Arg、Thr、Ser、Glu、Asp、Trp、Tyr、Phe、His、-NH2；
<400>4
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa
1 5 10 15
Xaa Ala Ala Lys Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Val Lys Gly Arg Arg
20 25 30
<210>5
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>MISC_特征
<222>(1)..(1)
<223>第1位的Xaa是L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、beta-羟基-组氨酸、高组氨酸、alpha-氟甲基-组氨酸或alpha-甲基-组氨酸；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(2)..(2)
<223>第2位的Xaa是Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Ser或Thr；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(6)..(6)
<223>第6位的Xaa是Phe、Trp或Tyr；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(10)..(10)
<223>第10位的Xaa是Val、Trp、Ile、Leu、Phe或Tyr；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(12)..(12)
<223>第12位的Xaa是Ser、Trp、Tyr、Phe、Lys、Ile、Leu或Val；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(13)..(13)
<223>第13位的Xaa是Tyr、Trp或Phe；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(14)..(14.)
<223>第14位的Xaa是Leu、Phe、Tyr或Trp；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(16)..(16)
<223>第16位的Xaa是Gly、Glu、Asp或Lys；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(19)..(19)
<223>第19位的Xaa是Ala、Val、Ile或Leu；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(21)..(21)
<223>第21位的Xaa是Glu、Ile或Ala；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(24)..(24)
<223>第24位的Xaa是Ala或Glu；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(27)..(27)
<223>第27位的Xaa是Val或Ile；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(31)..(31)
<223>第31位的Xaa是Gly、His、NH2或不存在
<400>5
Xaa Xaa Glu Gly Thr Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa
1 5 10 15
Gln Ala Xaa Lys Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Lys Gly Arg Xaa
20 25 30
<210>6
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>MISC_特征
<222>(1)..(1)
<223>第1位的Xaa是L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、beta-羟基-组氨酸、高组氨酸、alpha-氟甲基-组氨酸或alpha-甲基-组氨酸；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(2)..(2)
<223>第2位的Xaa是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser或Thr；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(10)..(10)
<223>第10位的Xaa是Val、Phe、Tyr或Trp；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(12)..(12)
<223>第12位的Xaa是Ser、Tyr、Trp、Phe、Lys、Ile、Leu或Val；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(16)..(16)
<223>第16位的Xaa是Gly、Glu、Asp或Lys；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(19)..(19)
<223>第19位的Xaa是Ala、Val、Ile或Leu；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(27)..(27)
<223>第27位的Xaa是Val或Ile；
<220>
<221>MISC_特征
<222>(31)..(31)
<223>第31位的Xaa是Gly、NH2或不存在
<400>6
Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Tyr Leu Glu Xaa
1 5 10 15
Gln Ala Xaa Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Xaa Lys Gly Arg Xaa
20 25 30