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1、10申请公布号CN104306333A43申请公布日20150128CN104306333A21申请号201410508569922申请日20140928A61K9/127200601A61K47/42200601A61K31/337200601A61P35/0020060171申请人沈阳药科大学地址110016辽宁省沈阳市沈河区文化路103号沈阳药科大学机关楼科研处72发明人唐星张宇张岩蔡翠芳74专利代理机构沈阳晨创科技专利代理有限责任公司21001代理人张晨54发明名称一种卡巴他赛脂质微球注射液及其制备方法57摘要一种卡巴他赛脂质微球注射液及其制备方法属医药技术领域，该注射液各组分按重量百。
2、分比为卡巴他赛胆固醇复合物以卡巴他赛计0011；注射用油530；注射用磷脂16；辅助乳化剂0207；两亲性聚氨基00510；渗透压调节剂2035；其余为注射用水。其制备方法以磷脂为乳化剂，以表面活性剂为辅助乳化剂，高纯度的卡巴他赛作为有效成分，并加入胆固醇、两亲性的聚氨基酸、渗透压调节剂及注射用水，采用超高压微射流纳米分散技术构建而成。本发明借助胆固醇和药物的独特相互作用，不仅提高了卡巴他赛在脂质微球中的化学稳定性，还改善了卡巴他赛脂质微球的热力学稳定性。本发明中所述的两亲性聚氨基酸的加入进一步增加了制剂的稳定性。51INTCL权利要求书2页说明书17页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局。
3、12发明专利申请权利要求书2页说明书17页附图4页10申请公布号CN104306333ACN104306333A1/2页21一种卡巴他赛脂质微球注射液，其特征在于该注射液由卡巴他赛胆固醇复合物、注射用油、乳化剂、辅助乳化剂、两亲性聚氨基酸、渗透压调节剂及注射用水组成；该注射液组成的重量百分比为所述的卡巴他赛胆固醇复合物由卡巴他赛和胆固醇组成；所述卡巴他赛与注射用胆固醇的重量比为1110；所述的两亲性聚氨基酸为PEG聚谷氨酸苄酯嵌段共聚物；所述的注射用油为长链甘油三酯和中链甘油三酯中的一种或几种的混合物；所述乳化剂为注射用磷脂；所述的注射用磷脂为蛋黄卵磷脂、大豆磷脂和合成磷脂中的一种或几种的混合。
4、物；所述的辅助乳化剂为吐温TWEEN和普郎尼克中的一种或几种的混合物；所述的渗透压调节剂为注射用甘油。2根据权利要求1所述卡巴他赛脂质微球注射液，特征在于其中吐温为吐温20、吐温40、吐温60或吐温80中的一种或几种混合，所述的普郎尼克为普郎尼克188。3根据权利要求1所述卡巴他赛脂质微球注射液，其特征在于所述的卡巴他赛胆固醇复合物的制备方法，按照以下步骤进行按照卡巴他赛与注射用胆固醇的重量比为1110称取卡巴他赛和胆固醇，将其加到有机溶剂中，2080加热回流052小时，至溶液澄清透明，取出溶液进行旋转蒸发或真空干燥以除去有机溶剂，即得卡巴他赛胆固醇复合物。4根据权利要求卡巴他赛脂质微球注射液。
5、，其特征在于所述的卡巴他赛胆固醇复合物制备方法中所述反应溶剂为无水乙醇、丙酮、乙醚、氯仿和乙酸乙酯中的一种或几种。5根据权利要求3所述卡巴他赛脂质微球注射液，其特征在于所述的卡巴他赛胆固醇复合物的制备方法进一步优选卡巴他赛与注射用胆固醇的重量比为128；反应溶剂为无水乙醇；反应温度为2060；反应时间0510小时。6一种权利要求1所述的卡巴他赛脂质微球注射液制备方法，其特征在于该方法按照一下步骤进行1将处方量的卡巴他赛胆固醇复合物、注射用磷脂和处方量的注射用油，在6080下加热搅拌分散均匀得澄清的含药油相；2将处方量两亲性聚氨基酸、水溶性乳化剂、渗透压调节剂加入到适量注射用水中，加热至6080。
6、，搅拌分散均匀得水相；3在组织捣碎机搅拌下，将载药油相缓慢加入水相中或将水相加入到载药油相中，待权利要求书CN104306333A2/2页3完全加入后，以800020000转/分搅拌25分钟，即得初乳；4将初乳冷却至室温，用氢氧化钠或盐酸溶液调节PH值至57，用注射用水定容至全量，转移至高压均质机中，在6001200BAR，3060条件下均质510次；5装瓶，充氮气，轧盖密封，121高压蒸汽灭菌10分钟，然后在冷水浴中迅速冷却。7根据权利要求6所述的卡巴他赛脂质微球注射液制备方法，其特征在于所述处方量为按重量百分比为卡巴他赛胆固醇复合物以卡巴他赛计0011；注射用油530；注射用磷脂16；辅助。
7、乳化剂0207；两亲性聚氨基00510；渗透压调节剂2035；其余为注射用水。权利要求书CN104306333A1/17页4一种卡巴他赛脂质微球注射液及其制备方法技术领域0001本发明属医药技术领域，具体涉及一种卡巴他赛脂质微球注射液及其制备方法。背景技术0002癌症严重威胁着人类的生命与健康，随着工业化程度的提高、环境污染的加重与人类寿命的普遍延长，癌症的发病率在逐年上升。据世界卫生组织WHO报道目前全球有2460万癌症患者；到2020年，估计将达到3000万。2005年有760万人死于癌症，占全世界5800万死亡的13，到2020年，癌症每年可造成1000多万人死亡。如果这一趋势继续，每年。
8、新病例的估计数预期将从2002年1090万增加至2020年1600万。2005年中国癌死亡人数近190万，其中120万人寿命低于70岁。专家预计，2020年死亡人数将超过400万。这些数字表明，肿瘤无论是在国外、国内，都仍然还是一种严重威胁人们生命和生活质量的主要病种之一。也正是基于这一认识，各国政府、研究机构和制药公司均对癌症研究和抗肿瘤药物开发高度重视和巨额投资。0003紫杉烷类化合物是从植物中得到的一大类天然产物，是唯一直接作用于肿瘤发生病因的药物。卡巴他赛CABAZITAXEL是新一代的紫杉烷类化合物，其分子式为C45H57NO14，分子量为83593，结构式如下00040005卡巴他。
9、赛通过与微管蛋白结合，促进微管双聚体装配成微管，同时通过防止去多聚化过程抑制微管分解而使微管稳定，阻滞细胞于G2和M期，从而抑制细胞的有丝分裂和增值。卡巴他赛不仅对多西他赛敏感的肿瘤细胞株，包括P388、HL60、KB和CALC18具有抗癌活性，此外，对多西他赛不敏感的肿瘤细胞模型例如P388/DOX、P388/TXT、P388/VCR和HL60/TAX等仍有活性，这显示卡巴他赛不仅抗肿瘤活性强于多西他赛，且具有较强的抗多药耐药性。因此其在抗肿瘤方面显示出巨大的潜力。0006目前上市的卡巴他赛制剂仅有由法国赛诺菲万安特公司生产的卡巴他赛注射剂商品名，于2010年6月17日被美国FDA批准上市。。
10、与泼尼松联合使用治疗既往用含多西他赛治疗方案的激素难治性转移性前列腺癌。其规格为60MG/15ML，即单说明书CN104306333A2/17页5次使用小瓶盛装60MG卡巴他赛无水、无溶剂和156G吐温80。卡巴他赛注射液在静脉滴注之前需要两种稀释剂，首先由提供的稀释剂一种无色透明，无菌，无热原的13乙醇水溶液，约57ML稀释，随后再用生理盐水溶液或5葡萄糖溶液稀释。因此，卡巴他赛注射液需两步稀释为临床的使用带来极大的不便，而聚山梨酯80的应用将引发患者的严重不良反应，包括严重的过敏反应和外周神经病变，另外，卡巴他赛注射液稀释后需尽快使用，在室温最多可放置8小时，造成药物的极大浪费，这些均为卡。
11、巴他赛的临床使用带来局限。因此，急需开发一种质量可控、稳定性强、高效、低毒的卡巴他赛新剂型降低毒副作用，充分发挥其抗肿瘤活性。0007静脉注射脂质微球作为抗肿瘤药物的载体，近来得到广泛的应用。其特殊的理化特性和低毒性决定了其可以作为脂溶性药物，特别是抗癌药物、麻醉药物及抗炎药物的良好载体。与传统注射液相比较，脂质微球可以降低血管刺激性，并起到靶向肿瘤组织的作用。静脉注射脂肪乳剂作为肠外能量的重要补给方式应用于临床已近半个世纪，是根据乳糜微粒的组成、结构与特点而设计，主要是由甘油三酯和磷脂组成的乳剂颗粒溶液。将药物包裹于脂肪乳剂的脂质核心部分，在发挥药效的同时，为无法进食的患者提供能量供给。一般。
12、认为脂质微球是通过将药物溶于脂肪油中，并经磷脂乳化分散于水相后制成，是一种以脂肪油为软基质而被磷脂膜包封的微粒分散体系，是脂溶性药物的良好载体。卡巴他赛水溶性较差，脂质微球是发挥卡巴他赛抗癌效果的最佳载体。考虑到卡巴他赛结构中含有大量的酯键，易水解、不稳定，本专利公开的新型卡巴他赛脂质微球注射液产品，是一种含有卡巴他赛胆固醇复合物和两亲性聚氨基酸的脂质微球注射液，一方面，卡巴他赛胆固醇复合物的制备不仅提高了卡巴他赛在脂质微球中的化学稳定性，还改善了卡巴他赛脂质微球的热力学稳定性；并详细阐明了其机制；另一方面，两亲性聚氨基酸具有更强的乳化能力，不仅将药物牢牢锚定于油相中，而且为乳滴提供一层空间屏。
13、障，阻止了乳滴间的合并，形成了更稳定的乳滴，提高了制剂的稳定性，另外，两亲性聚氨基酸的加入明显延长了药物的半衰期。本专利公开的含有卡巴他赛胆固醇复合物和两亲性聚氨基酸的载药脂质微球注射液在保持卡巴他赛高效抗癌活性的同时，不含有机溶剂、能耐受高压灭菌12110MIN灭菌后含量、粒径、PH和电位等保持不变，且具有较高的耐稀释性5葡萄糖注射液稀释4倍后，在24H内含量、粒径、PH和电位等保持不变。相对于卡巴他赛注射液卡巴他赛聚山梨酯80混合溶液40MGML1，本发明公开的卡巴他赛脂质微球注射液不仅稳定性好、生物利用度高，而且降低了毒性和刺激性，成本低，适用于工业化大生产。0008现有中国专利CN10。
14、3450119A公开号中公开了天津炜捷制药有限公司发明的“一种卡巴他赛晶型W及其制备方法”。其涉及发明了包含卡巴他赛的晶型及其制备方法，并未涉及到制剂方面。0009现有中国专利CN102895183A公开号中公开了江苏红豆杉生物科技股份有限公司发明的“一种注射用卡巴他赛及其制备方法”。其涉及发明了包含注射用卡巴他赛及其制备方法，并未涉及到脂质微球制剂方面。0010现有中国专利CN103054800A公开号中公开了无锡尔云科技有限公司发明的“氟比洛芬对乙酰氨基酚酯脂质微球注射剂、冻干脂质微球注射剂及制备方法”。其涉及发明了包含脂质微球注射液及其制备工艺，所载药物为氟比洛芬对乙酰氨基酚酯，并未涉及。
15、胆固醇的使用和药物胆固醇复合物的制备。说明书CN104306333A3/17页60011TINGCHU等研究的丹参酮2A静脉注射脂肪乳的制备以及体外抗癌活性的评价，详细考察了影响丹参酮2A注射脂肪乳制备的因素，但并未涉及胆固醇、两亲性聚氨基酸的使用和药物胆固醇复合物的制备。0012现有中国专利CN103006558A公开号中公开了苏州雷纳药物研发有限公司发明的“一种CABAZITAXEL脂质微球注射液及其制备方法”。其涉及发明了包含卡巴他赛磷脂复合物的脂质微球注射液及其制备工艺，并未涉及胆固醇、两亲性聚氨基酸的使用和卡巴他赛胆固醇复合物的制备。该专利中考察了CABAZITAXEL脂质微球注射液。
16、在温度62的加速条件下的稳定性，6个月内，其含量、粒径等未发生显著变化。0013现有中国医学科学院药物研究申请的中国专利CN102048725A公开号、CN102048688A公开号中分别公开了所发明的“紫杉醇胆固醇复合物”和“以胆固醇复合物为中间载体的紫杉醇亚微乳”，其涉及发明了紫杉醇胆固醇复合物及以此为中间载体的紫杉醇亚微乳，但并未涉及卡巴他赛和两亲性聚氨基酸的使用。在专利CN102048725A公开号中紫杉醇胆固醇复合物制备的主要目的在于提高药物在油中的溶解度，虽有提到以胆固醇复合物为中间载体制备的亚微乳剂有助于制剂稳定性的提高，但并未对此进行深刻探讨，且不涉及两亲性聚氨基酸的使用。00。
17、14经专利和文献检索，未见报道涉及卡巴他赛胆固醇复合物和两亲性聚氨基酸的脂质微球制剂的研究。发明内容0015本发明的目的在于提供一种含有卡巴他赛胆固醇复合物和两亲性聚氨基酸的脂质微球注射液，本脂质微球注射液可耐高压灭菌，具有高稳定性、高生物利用度、延长半衰期、提高药效、减少毒副作用的特点。0016为了达到上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的0017本发明一种卡巴他赛脂质微球注射液，包含卡巴他赛胆固醇复合物、注射用油、乳化剂注射用磷脂、两亲性聚氨基酸、辅助乳化剂、渗透压调节剂及注射用水；该注射液组成的重量百分比为00180019所述的卡巴他赛胆固醇复合物由卡巴他赛和胆固醇组成；0020所述的。
18、两亲性聚氨基酸为聚乙二醇聚谷氨酸苄酯两亲性嵌段共聚物；0021所述的注射用油为长链甘油三酯和中链甘油三酯中的一种或几种的混合物；说明书CN104306333A4/17页70022所述的注射用磷脂为蛋黄卵磷脂、大豆磷脂和合成磷脂中的一种或几种的混合物；0023所述的辅助乳化剂为吐温TWEEN和普郎尼克中的一种或几种的混合物；0024所述的渗透压调节剂为注射用甘油；0025所述吐温选自吐温20、吐温40、吐温60或吐温80中的一种或几种按任意比混合；所述的的普郎尼克为普郎尼克188。0026所述的卡巴他赛胆固醇复合物，按照以下步骤制备0027按照卡巴他赛与注射用胆固醇的重量比为1110称取卡巴他赛。
19、和胆固醇，将其加到有机溶剂中，2080加热回流052小时，至溶液澄清透明，取出溶液进行旋转蒸发或真空干燥以除去有机溶剂，即得卡巴他赛胆固醇复合物。0028所述的卡巴他赛胆固醇复合物制备方法中所述反应溶剂为无水乙醇、丙酮、乙醚、氯仿和乙酸乙酯中的一种或几种。0029所述的卡巴他赛胆固醇复合物的制备方法进一步优选卡巴他赛与注射用胆固醇的重量比为128；反应溶剂为无水乙醇；反应温度为2060；反应时间0510小时。0030一种卡巴他赛脂质微球注射液的制备方法，其工艺步骤如下00311将处方量的卡巴他赛胆固醇复合物、注射用磷脂和处方量的注射用油，在6080下加热搅拌分散均匀得澄清的含药油相；00322。
20、将两亲性聚氨基酸、水溶性乳化剂、渗透压调节剂加入到适量注射用水中，加热至6080，搅拌分散均匀得水相；00333在组织捣碎机搅拌下，将载药油相缓慢加入水相中或将水相加入到载药油相中，待完全加入后，以800020000转/分搅拌25分钟，即得初乳；00344将初乳冷却至室温，用氢氧化钠或盐酸溶液来调节PH值至57，用注射用水定容至全量，转移至高压均质机中，在6001200BAR，3060条件下均质510次；00355装瓶，充氮气，轧盖密封，121高压蒸汽灭菌10分钟，然后在冷水浴中迅速冷却。0036所述处方量为按重量百分比为卡巴他赛胆固醇复合物以卡巴他赛计0011；注射用油530；注射用磷脂16。
21、；辅助乳化剂0207；两亲性聚氨基00510；渗透压调节剂2035；其余为注射用水。0037本发明所公开的含卡巴他赛胆固醇复合物和两亲性聚氨基酸的新型脂质微球注射液中，不含或含有较少量的聚山梨酯80，耐稀释性好，避开了给药所带来的两次稀释的不便、聚山梨酯80的严重过敏反应等问题，且避免了药物浪费，在降低毒性的同时提高了药效，可耐受高压灭菌、延长了药物的半衰期。0038本发明通过经典恒温法测定降解动力学、冻融稳定性等试验证实采用普通处方工艺制备的卡巴他赛脂质微球注射液在物理化学方面极其不稳定，尤其是化学稳定性；由卡巴他赛化合物的结构式可知，结构中含有大量的酯键，酯键的断裂是造成其稳定性差的原因，。
22、主要有以下两种途径一方面，油中的卡巴他赛泄露到水相，酯键在水相中水解；另一方面，油相中含有游离脂肪酸等提供氢离子的物质，氢离子进攻卡巴他赛的酯键，导致其水解；经高效液相证实了上述降解途径。又经液相飞行时间质谱验证，卡巴他赛结构式中说明书CN104306333A5/17页8C13上的羟基所形成的酯键是其水解的主要位点。众所周知，胆固醇是一种优良的乳化剂或辅助乳化剂，其结构中含有羟基。借助胆固醇和药物的独特相互作用，制备了卡巴他赛胆固醇复合物，可以明显提高卡巴他赛在脂质微球中的化学稳定性，并改善脂质微球的热力学稳定性。本发明发现，卡巴他赛与胆固醇复合物中，胆固醇与卡巴他赛通过氢键形成复合物减少其降。
23、解，有以下原因一方面，氢键可以分散卡巴他赛氧原子电子云密度而阻止氢离子的进攻；并且碳原子有SP2杂化转换为SP3杂化，增强了空间效应的作用，二者共同作用防止了油相内卡巴他赛的降解。另一方面，磷脂分子的亲水基团可与胆固醇的亲水基团紧密结合，限制了卡巴他赛的泄露，进一步抑制了卡巴他赛的水解。另外，卡巴他赛泄露的减少也是提高其热力学稳定性的原因。本发明经傅里叶红外波谱证实了卡巴他赛胆固醇复合物的存在，验证了上述推断的可靠性和合理性。0039由于氨基酸本身即为人体必需的营养成分，所加入的两亲性聚氨基酸，具有优良的生物相容性，对人体无毒害。与小分子磷脂相比，这种两亲性聚合物具有更强的乳化能力临界胶束浓度。
24、远小于磷脂分子，与天然磷脂等其他表面活性剂复配更容易形成稳定的乳滴。而且，本发明中以两亲性聚氨基酸为稳定剂的脂质微球制剂的微观结构不同于普通的脂质微球制剂疏水的消旋聚氨基酸链亲油性远强于磷脂的疏水段，因此能牢牢锚定于油相中；而亲水链段又要远长于磷脂分子的极性头部，故亲水链段能伸展于外周水相中，包绕在乳滴周围，为乳滴提供一层空间屏障，阻止了各个乳滴间的合并，这种特殊的结构特点能大幅增加所制备脂质微球制剂的稳定性，且两亲性聚氨基酸的加入明显延长了卡巴他赛的半衰期。0040本发明公开的卡巴他赛胆固醇复合物，并未在专利和文献中检索到，具有创新性。0041本发明所公开的含卡巴他赛胆固醇复合物和两亲性聚氨。
25、基酸的脂质微球注射液，与参比制剂卡巴他赛聚山梨酯80混合溶液40MGML1相比较，不仅生物利用度高，且在降低了毒性的同时增强了其抗肿瘤疗效。0042本发明公开了一种质量可控，高稳定性，高半衰期，可耐受高压灭菌的含卡巴他赛胆固醇复合物和两亲性聚氨基酸的新型载药脂质微球注射液200NM左右。0043本发明公开的含卡巴他赛胆固醇复合物和两亲性聚氨基酸的脂质微球注射液可耐受高压灭菌，在温度4放置1690天约56个月，其含量、粒径等均不会发生显著变化，药物的半衰期明显延长。0044本发明公开的卡巴他赛脂质微球注射液避开了给药所带来的两次稀释的不便、聚山梨酯80的严重过敏反应等问题，且耐稀释性高，使用方便。
26、，避免了药物浪费，并可以降低毒性提高药效，因此一定能充分发挥此药物的抗肿瘤活性，满足广大的用药需求，并有优异的市场前景。0045本发明的含有卡巴他赛胆固醇复合物和两亲性聚氨基酸的脂质微球注射液详细探讨了卡巴他赛在脂质微球中不稳定的原因以及胆固醇提高药物在脂质微球中稳定性的机制，两亲性聚氨基酸的加入更明显提高了制剂的稳定性，具有创新性。附图说明0046图1是卡巴他赛胆固醇复合物的红外波谱表征；0047图2是CELS的粒径分布及ZETAPOTENTIAL；说明书CN104306333A6/17页90048图3是卡巴他赛于80在水溶液和脂质微球含胆固醇复合物和两亲性聚氨基酸、含胆固醇复合物和不含胆固。
27、醇复合物中的降解动力学；0049图4是卡巴他赛于不同温度下在水溶液和脂质微球含复合物和两亲性聚氨基酸、含复合物和不含复合物中的降解速率图；0050图5是大鼠4MGKG1单次静脉注射卡巴他赛脂质微球注射液和卡巴他赛注射液后平均血药浓度时间曲线；0051图6是小鼠肿瘤体积变化图；0052图7是小鼠体重变化图。具体实施方式0053下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，实例仅为提供解释性说明，不意味着以任何方式对本发明的保护范围予以限制。0054下述的实施例中的百分含量如无特别说明，均为质量百分含量；所提到的卡巴他赛脂质微球注射液如无特殊说明，均为含卡巴他赛胆固醇复合物和两亲性聚氨基酸的脂质微球注。
28、射液。0055实施例10056制备卡巴他赛胆固醇复合物0057将卡巴他赛01G与胆固醇03G置于圆底烧瓶中，缓慢加入乙醚，使胆固醇和药物浸没在乙醚中，在60条件下加热回流反应2小时，得到澄清反应溶液，减压干燥除去溶剂，即得卡巴他赛胆固醇复合物。0058实施例20059制备卡巴他赛胆固醇复合物0060将卡巴他赛01G与胆固醇02G置于圆底烧瓶中，缓慢加入乙酸乙酯，使胆固醇和药物浸没在乙酸乙酯中，在50条件下加热回流反应1小时，得到澄清反应溶液，旋转蒸发蒸发挥干溶剂，即得卡巴他赛胆固醇复合物。0061实施例30062制备卡巴他赛胆固醇复合物0063将卡巴他赛01G与胆固醇025G置于圆底烧瓶中，缓。
29、慢加入氯仿，使胆固醇和药物浸没在氯仿中，在60条件下加热回流反应1小时，得到澄清反应溶液，蒸发挥干溶剂，即得卡巴他赛胆固醇复合物。0064实施例40065制备卡巴他赛胆固醇复合物0066将卡巴他赛01G与胆固醇03G置于圆底烧瓶中，缓慢加入乙醇，使胆固醇和药物浸没在乙醇中，在50条件下加热回流反应1小时，得到澄清反应溶液，蒸发挥干溶剂，即得卡巴他赛胆固醇复合物。0067实施例50068制备卡巴他赛胆固醇复合物0069将卡巴他赛01G与胆固醇04G置于圆底烧瓶中，缓慢加入乙醇，使胆固醇和药物浸没在乙醇中，在40条件下加热回流反应2小时，得到澄清反应溶液，蒸发挥干溶剂，即说明书CN10430633。
30、3A7/17页10得卡巴他赛胆固醇复合物。0070实施例60071卡巴他赛胆固醇复合物的表征0072采用红外光谱学的对卡巴他赛胆固醇复合物进行表征，证实了该复合物的形成。红外光谱学表征见图1。由红外光谱可以看出CO和COC的伸缩振动明显向低频移动，证实了卡巴他赛胆固醇复合物的形成。0073实施例700740075制备方法0076将处方量的卡巴他赛胆固醇复合物、注射用磷脂和处方量的中链甘油三酯，在70下加热搅拌分散均匀得澄清的含药油相；0077将处方量PEG聚谷氨酸苄酯、聚山梨酯80、泊洛沙姆188、注射用甘油加入到适量注射用水中，加热至80，搅拌分散均匀得水相；0078在组织捣碎机搅拌下，将载。
31、药油相缓慢加入水相中，待完全加入后，以8000转/分搅拌3分钟，即得初乳；0079将初乳冷却至室温，用10MOLL1氢氧化钠溶液来调节PH值至7，用注射用水定容至全量，转移至高压均质机中，在600BAR，40条件下均质10次；0080装瓶，充氮气，轧盖密封，121高压蒸汽灭菌10分钟，然后在冷水浴中迅速冷却。0081实施例800820083说明书CN104306333A108/17页110084制备方法0085将处方量的卡巴他赛胆固醇复合物、注射用磷脂和处方量的中链甘油三酯、长链甘油三酯，在75下加热搅拌分散均匀得澄清的含药油相；0086将处方量PEG聚谷氨酸苄酯、聚山梨酯80、泊洛沙姆188。
32、、注射用甘油加入到适量注射用水中，加热至80，搅拌分散均匀得水相；0087在组织捣碎机搅拌下，将载药油相缓慢加入水相中，待完全加入后，以8000转/分搅拌3分钟，即得初乳；0088将初乳冷却至室温，用10MOLL1氢氧化钠溶液来调节PH值至6，用注射用水定容至全量，转移至高压均质机中，在700BAR，40条件下均质10次；0089装瓶，充氮气，轧盖密封，121高压蒸汽灭菌10分钟，然后在冷水浴中迅速冷却。0090实施例900910092制备方法0093将处方量的卡巴他赛胆固醇复合物、注射用磷脂和处方量的中链甘油三酯，在75下加热搅拌分散均匀得澄清的含药油相；0094将处方量PEG聚谷氨酸苄酯、。
33、聚山梨酯80、泊洛沙姆188、注射用甘油加入到说明书CN104306333A119/17页12适量注射用水中，加热至80，搅拌分散均匀得水相；0095在组织捣碎机搅拌下，将载药油相缓慢加入水相中，待完全加入后，以10000转/分搅拌4分钟，即得初乳；0096将初乳冷却至室温，用10MOLL1盐酸溶液来调节PH值至7，用注射用水定容至全量，转移至高压均质机中，在800BAR，40条件下均质7次；0097装瓶，充氮气，轧盖密封，121高压蒸汽灭菌10分钟，然后在冷水浴中迅速冷却。0098实施例1000990100制备方法同制备方法30101实施例1101020103制备方法0104将处方量的卡巴他。
34、赛胆固醇复合物、注射用磷脂和处方量的中链甘油三酯、长链甘油三酯，在70下加热搅拌分散均匀得澄清的含药油相；0105将处方量PEG聚谷氨酸苄酯、泊洛沙姆188、注射用甘油加入到适量注射用水说明书CN104306333A1210/17页13中，加热至75，搅拌分散均匀得水相；0106在组织捣碎机搅拌下，将载药油相缓慢加入水相中，待完全加入后，以10000转/分搅拌3分钟，即得初乳；0107将初乳冷却至室温，用10MOLL1氢氧化钠溶液来调节PH值至65，用注射用水定容至全量，转移至高压均质机中，在800BAR，40条件下均质8次；0108装瓶，充氮气，轧盖密封，121高压蒸汽灭菌10分钟，然后在冷。
35、水浴中迅速冷却。0109实施例1201100111制备方法0112将处方量的卡巴他赛胆固醇复合物、注射用磷脂和处方量的中链甘油三酯、长链甘油三酯，在70下加热搅拌分散均匀得澄清的含药油相；0113将处方量PEG聚谷氨酸苄酯、聚山梨酯80、泊洛沙姆188、注射用甘油加入到适量注射用水中，加热至80，搅拌分散均匀得水相；0114在组织捣碎机搅拌下，将水相缓慢加入载药油相中，待完全加入后，以8000转/分搅拌3分钟，即得初乳；0115将初乳冷却至室温，用10MOLL1氢氧化钠溶液来调节PH值至55，用注射用水定容至全量，转移至高压均质机中，在600BAR，40条件下均质10次；0116装瓶，充氮气，。
36、轧盖密封，121高压蒸汽灭菌10分钟，然后在冷水浴中迅速冷却。0117实施例1301180119说明书CN104306333A1311/17页140120制备方法0121将处方量的卡巴他赛胆固醇复合物、注射用磷脂和处方量的中链甘油三酯，在80下加热搅拌分散均匀得澄清的含药油相；0122将处方量PEG聚谷氨酸苄酯、泊洛沙姆188、注射用甘油加入到适量注射用水中，加热至80，搅拌分散均匀得水相；0123在组织捣碎机搅拌下，将载药油相缓慢加入水相中，待完全加入后，以12000转/分搅拌4分钟，即得初乳；0124将初乳冷却至室温，用10MOLL1氢氧化钠溶液来调节PH值至60，用注射用水定容至全量，转。
37、移至高压均质机中，在900BAR，40条件下均质8次；0125装瓶，充氮气，轧盖密封，121高压蒸汽灭菌10分钟，然后在冷水浴中迅速冷却。0126实施例1401270128制备方法0129将处方量的卡巴他赛胆固醇复合物、注射用磷脂和处方量的中链甘油三酯、长链甘油三酯，在70下加热搅拌分散均匀得澄清的含药油相；0130将处方量PEG聚谷氨酸苄酯、聚山梨酯80、泊洛沙姆188、注射用甘油加入到适量注射用水中，加热至80，搅拌分散均匀得水相；说明书CN104306333A1412/17页150131在组织捣碎机搅拌下，将水相缓慢加入载药油相中，待完全加入后，以8000转/分搅拌3分钟，即得初乳；01。
38、32将初乳冷却至室温，用10MOLL1氢氧化钠溶液来调节PH值至55，用注射用水定容至全量，转移至高压均质机中，在1000BAR，50条件下均质6次；0133装瓶，充氮气，轧盖密封，121高压蒸汽灭菌10分钟，然后在冷水浴中迅速冷却。0134实施例1501350136制备方法0137将处方量的卡巴他赛胆固醇复合物、注射用磷脂和处方量的中链甘油三酯，在70下加热搅拌分散均匀得澄清的含药油相；0138将处方量PEG聚谷氨酸苄酯、聚山梨酯80、泊洛沙姆188、注射用甘油加入到适量注射用水中，加热至80，搅拌分散均匀得水相；0139在组织捣碎机搅拌下，将载药油相缓慢加入水相中，待完全加入后，以1000。
39、0转/分搅拌3分钟，即得初乳；0140将初乳冷却至室温，用10MOLL1盐酸溶液来调节PH值至5，用注射用水定容至全量，转移至高压均质机中，在800BAR，40条件下均质9次；0141装瓶，充氮气，轧盖密封，121高压蒸汽灭菌10分钟，然后在冷水浴中迅速冷却。0142实施例1601430144说明书CN104306333A1513/17页160145制备方法0146将处方量的卡巴他赛胆固醇复合物、注射用磷脂和处方量的中链甘油三酯、长链甘油三酯，在75下加热搅拌分散均匀得澄清的含药油相；0147将处方量PEG聚谷氨酸苄酯、泊洛沙姆188、注射用甘油加入到适量注射用水中，加热至80，搅拌分散均匀得。
40、水相；0148在组织捣碎机搅拌下，将载药油相缓慢加入水相中，待完全加入后，以8000转/分搅拌5分钟，即得初乳；0149将初乳冷却至室温，用10MOLL1氢氧化钠溶液来调节PH值至66，用注射用水定容至全量，转移至高压均质机中，在800BAR，35条件下均质8次；0150装瓶，充氮气，轧盖密封，121高压蒸汽灭菌10分钟，然后在冷水浴中迅速冷却。0151上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的。
41、保护范围之中。0152实施例170153卡巴他赛脂质微球注射液粒径及电位的测定0154粒径和粒度分布是脂质微球最重要的特性之一，乳滴的平均粒径是否随灭菌或时间的延长而增大或粒径分布发生改变，电位的大小及是否随时间而改变，均是衡量脂质微球稳定性的重要指标。对静脉注射用脂质微球的粒度要求目前尚无统一的规定，一般要求乳滴直径80小于1M，乳滴大小均匀，不得有大于5M的乳滴；据文献报道，脂质微球的电位的绝对值大于20较稳定。目前，关于脂质微球的乳滴粒度测定常采用的方法有显微镜法、动态光散射法、激光散射法和COULTER计数法等。而动态光散射法是最常用的方法之一，本发明即采用动态光散射原理测定卡巴他赛脂。
42、质微球注射液的粒径、粒度分布和电位。本发明通过严格控制脂质微球的粒径200NM左右，基于EPR效应，导致小粒子富集在肿瘤组织内部，提高瘤内浓度，从而实现卡巴他赛脂质微球的高效抗肿瘤作用。0155使用NICOMPTMPSS380进行粒度测定的操作方法为将样品用过022M微孔滤膜的注射用水稀释约5000倍，放入样品池内，将光强度INTENSITY调节至300左右，光源为HENE激光0633NM，将操作参数中温度设为测定时室温，开始测定。实验结果见图2。0156实施例18说明书CN104306333A1614/17页170157选用优选处方及制备工艺5制备的含卡巴他赛胆固醇复合物和两亲性聚氨基酸的脂。
43、质微球注射液、含卡巴他赛胆固醇复合物不含两亲性聚氨基酸的脂质微球注射液、相同的工艺制备的不含复合物和两亲性聚氨基酸的卡巴他赛脂质微球注射液和相同含药浓度的含少量乙醇的磷酸盐缓冲液PH65，采用经典恒温法测定降解动力学，评价其稳定性。0158具体操作步骤如下制备上述四种制剂或溶液各三份，分别置于60、80和100恒温水浴中，并于0,05,1,2,4,6,8,10,12,24,33,48,60,72和96H取出样品，稀释适当倍数后，应用HPLC测定其含量。结果见图3、图4。根据阿伦尼乌斯公式可得，含卡巴他赛胆固醇复合物和两亲性聚氨基酸的脂质微球注射液在4、25的货架期分别为169002084天和2。
44、695335天，含卡巴他赛胆固醇复合物的脂质微球注射液在4、25的货架期分别为116151944天和1747213天，与不含复合物的卡巴他赛注射液和卡巴他赛缓冲溶液相比其稳定性获得了极大的提高。试验结果表明含卡巴他赛胆固醇复合物和两亲性聚氨基酸的新型脂质微球注射液的稳定性明显提高。0159实施例190160胆固醇对卡巴他赛脂质微球注射液物理稳定性的影响0161以粒度分布、离心稳定常数为指标，考察含卡巴他赛胆固醇复合物的卡巴他赛脂微球注射液、不含复合物的卡巴他赛脂质微球注射液在高压灭菌前后和冻融循环前后的物理稳定性。结果表1表明卡巴他赛胆固醇复合物可以防止脂质微球注射液在高温灭菌后及冻融循环后粒。
45、度分布变宽，并可以改善脂质微球经高压灭菌过程中离心稳定常数增大的现象，有助于物理稳定性的提高。0162表1卡巴他赛脂质微球注射液在高压灭菌前后和冻融循环前后的粒度分布与离心稳定常数01630164实施例200165卡巴他赛脂质微球注射液大鼠体内药物动力学的研究01661测定方法0167色谱条件ACQUITYBEHC18色谱柱50MM21MMID，17M美国WATERS公司；流动相A2MMOL醋酸铵水溶液，流动相B乙腈，梯度洗脱015MIN，5085B；152MIN，85B；223MIN，8550B；3MIN，50B；流速02MLMIN1；柱温35；进样体积5L。0168质谱条件离子源ESI源；。
46、检测方式正离子检测；扫描方式多反应监测MRM方式，定量分析时的离子反应分别为M/Z83636M/Z55526卡巴他赛和M/Z83225M/Z55108内标拉洛他赛；毛细管电压35KV；锥孔电压25V；离子源温度100；喷雾气与反吹气氮气；去溶剂气流速550LH1；去溶剂气温度400；反吹气流说明书CN104306333A1715/17页18速40LH1；碰撞气氩气；碰撞气流速024MLMIN1；碰撞能量分别为10EV卡巴他赛和8EV内标拉洛他赛。01692实验药品及动物0170实验药品采用优选处方工艺制备的卡巴他赛脂质微球注射液规格50MG/50ML和卡巴他赛聚山梨酯8040MGML1溶液。0。
47、171实验动物WISTAR大鼠，雄性，体重20020G01723样品的处理与测定0173取血浆样品100L置EP管中，加内标溶液10L，加甲基叔丁基醚2ML，涡旋混合10MIN后，13000RMIN1离心10MIN，定量转移上清液18ML于另一EP管中，35下空气流吹干，残渣溶解于100L乙腈水5050中，涡旋混匀5MIN，13000RMIN1离心45MIN，取上清液5L进样分析。01744方法学验证0175经方法学验证卡巴他赛和拉洛他赛内标二者分离良好，内源性物质对测定无干扰，本法具有较好的专属性，分析条件可行；卡巴他赛在52000NGML1范围内线性关系良好，定量下限为5NGML1S/N1。
48、0；准确度与精密度、提取回收率、基质效应和稀释稳定性均符合要求；卡巴他赛在血浆中室温放置6H、预处理后24H8，以及冻融3个循环后和20下放置15D后均具有较好的稳定性。01765试验方法与结果017712只大鼠随机分成2组按4MGKG1的剂量分别于尾静脉注射卡巴他赛注射液和卡巴他赛脂质微球注射液，分别于给药前零时，5MIN，10MIN，20MIN，30MIN，1H，2H，3H，4H，6H，8H，12H和24H于眼眶取血03ML，置预先肝素化的15ML尖底离心试管中，4000RPM离心10MIN，精密吸取上层血浆于20保存待测。用时吸取血浆100L，按“样品处理与测定”项下处理后进样，以当日的。
49、标准曲线计算各时间点样品中卡巴他赛的浓度。结果如图5。由结果可知卡巴他赛脂质微球注射的AUC值明显高于卡巴他赛注射液，即本专利所公开的卡巴他赛脂质微球注射具有较高的生物利用度；经统计矩处理后数据表明脂质微球注射液的半衰期9722H明显高于注射液4220H。0178实施例210179卡巴他赛脂质微球注射液的药效评价01801实验动物SCID小鼠，体重202G，雌雄各半。01812实验药品和试剂0182采用优选处方工艺制备卡巴他赛脂质微球注射液规格50MG/50ML；卡巴他赛聚山梨酯8040MGML1溶液；空白乳剂01833实验方法及结果0184首先，建立肺癌A549移植瘤荷瘤SCID鼠模型，待肿瘤生长到100MM3以上时，根据移植瘤体积大小、按照组间一致原则，将荷瘤小鼠随机分为模型组、。