控制T细胞增殖的方法
领域
所述技术一般涉及免疫领域并部分涉及控制T细胞(如治疗性T细胞)增殖的组合物和方法。所述方法还涉及诱导对象中免疫应答的组合物和方法。
相关专利申请
优先权为2013年3月14日提交的名为“控制T细胞增殖的方法”的美国临时专利申请61/783,445，其通过引用全文纳入本文。
背景
T细胞活化是对抗环境中致病性微生物(如病毒、细菌和寄生虫)、外来蛋白质和有害化学品的保护性免疫中的重要步骤。T细胞在其表面表达受体(即T细胞受体)，所述受体识别抗原呈递细胞表面呈递的抗原。正常免疫应答中，这些抗原结合至T细胞受体，启动胞内变化导致T细胞活化。
嵌合抗原受体(CAR)是人工受体，设计用于赋予T细胞抗原特异性。其包括抗原特异性组分、跨膜组分和胞内组分，这些组分经选择用以活化T细胞并提供特异性免疫。表达嵌合抗原受体的T细胞可用在各种疗法中，包括癌症治疗。虽然具有针对肿瘤的效果，在一些情况中这些疗法会导致副作用，这部分归因于对健康组织的非特异性攻击。需要提供强免疫治疗应答并可以避免毒性副作用的可控T细胞治疗的方法。
概述
本文部分提供CID诱导型嵌合信号分子(CSM)，其可用于例如诱导或提高免疫应答。CSM可单独使用或与嵌合抗原受体(CAR)组合使用，这使得免疫应答特异导向特定的肿瘤细胞。受控的T细胞活化方法避免了早期基于CAR治疗的许多毒性副作用。
本文讨论的嵌合信号分允许细胞中共表达的嵌合抗原受体(CAR)的持久的调节控制。抗原特异性T细胞的活化依赖于配体诱导剂的给予，所述设计用以靶向与疾病或病症有关的细胞抗原。配体诱导剂通过多聚化嵌合信号分子来活化表达CAR的细胞，继而激活NF-κB信号，活化细胞(例如T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、天然杀伤细胞或天然杀伤T细胞)。(参见例如图20)没有配体诱导剂时，T细胞静息或有基线水平活性。配体的常规剂量方案确定了表达CAR的T细胞增殖和活化的速率和量级。
完全活化和肿瘤细胞杀伤仍取决于抗原识别和通过CD3ζ信号传导的NFAT的额外活性。一旦实现完全应答，停止配体给药。若疾病或病症复发，则重启配体剂量，使静息的肿瘤靶标T细胞再扩增和再活化。
在细胞治疗的一个示例中，转导有编码嵌合抗原受体的核酸的T细胞给予患者以治疗癌症(Zhong,X.-S.,(2010)MolecularTherapy18:413-420)。例如，基于人源化单克隆抗体曲妥珠单抗(Herceptin)表达嵌合抗原受体的T细胞已用于治疗癌症患者。然而可能发生不良事件，至少在一个报道中，所述治疗对患者有致命结果(Morgan,R.A.,等,(2010)MolecularTherapy18:843-851)。如本文所述，用可控诱导型安全开关(switch)转导细胞能通过停止给予配体诱导剂来提供能停止不良事件发展的安全开关。虽然可能残留低水平的基线活性，移除诱导剂应能显著降低(若非停止)不良事件的症状。
在细胞治疗的另一示例中，T细胞经修饰从而其表达非功能性TGF-β受体，使其抵抗TGF-β。这使得修饰的T细胞可避免TGF-β引起的细胞毒性，并且使得细胞可用于细胞治疗(Bollard,C.J.,等,(2002)Blood99:3179-3187；Bollard,C.M.,等,(2004)J.Exptl.Med.200:1623-1633)。然而其还会导致T细胞淋巴瘤，或其他 副作用，这是由于修饰的T细胞如今缺少了正常细胞的部分控制；这些治疗性T细胞自身可变为恶性的。用本文所述的基于CSM多肽的可诱导安全开关转导这些修饰的T细胞会提供避免该结果的安全开关。
因此，一些实施方式中的特征为含有核酸的组合物，所述核酸包含编码诱导型嵌合信号分子的多核苷酸，其中所述诱导型嵌合信号分子包含膜靶向区域、多聚化区域和选自CD27、CD28、ICOS、4-1BB、CD40、RANK/TRANCE-R、CD3ζ链以及OX40的共刺激多肽胞质信号区域。在一些实施方式中，所述膜靶向区域选自豆蔻酰化-靶向序列、棕榈酰化-靶向序列、异戊二烯化序列(即法尼基化、牻牛儿酸化(geranyl-geranylation)、CAAX盒)、蛋白质-蛋白质相互作用基序和来自受体的跨膜序列(采用信号肽)。在某些方面，所述膜靶向区域是豆蔻酰化-靶向序列。在一些实施方式中，所述诱导型嵌合信号分子还包含选自CD27、CD28、ICOS、4-1BB、CD40、RANK/TRANCE-R、CD3ζ链以及OX40的第二共刺激多肽胞质信号区域。在一些实施方式中，所述共刺激多肽胞质信号区域包含CD28胞质信号区域和4-1BB胞质信号区域。在一些实施方式中，所述共刺激多肽胞质信号区域包含OX40胞质信号区域和4-1BB胞质信号区域在一些实施方式中，所述诱导型嵌合信号分子还包括CD3ζ多肽。
在一些实施方式中，其中所述多聚化区域选自FKBP、亲环蛋白受体、类固醇受体、四环素受体、重链抗体亚基、轻链抗体亚基、和其突变序列。在一些实施方式中，所述多聚化区域是FKBP12区域。在一些实施方式中，所述FKB12区域是FKB12v36区域。在一些实施方式中，所述多聚化区域是Fv’Fvls。在一些实施方式中，所述多聚化区域结合选自FK506二聚体和二聚化FK506类似物配体的配体。在一些实施方式中，所述配体是AP1903或AP20187。在一些实施方式中，所述多聚化区域具有氨基酸序列SEQIDNO:58或其功能片段。在一些实施方式中，所述多聚化区域由SEQIDNO:57中的核苷酸序列或其功能片段所编码。在一些实施方式中，所述多聚化区域还包含具有氨基酸序列SEQIDNO:60的多肽或其功能片段。在一些实施方式中，所述多聚化区域还包含SEQIDNO:59中的核苷酸序列所编码的多肽或其功能片段。。在一些实施方式中，所述多聚化区域还包含具有氨基酸序列SEQIDNO:60的多肽或其功能片段。在一些实施方式 中，所述多聚化区域还包含SEQIDNO:59中的核苷酸序列所编码的多肽或其功能片段。在一些实施方式中，所述多聚化区域还包含具有氨基酸序列SEQIDNO:58或SEQIDNO:60的多肽或其功能片段。在一些实施方式中，所述多聚化区域还包含SEQIDNO:57或SEQIDNO:59中的核苷酸序列所编码的多肽或其功能片段。
在一些实施方式中，所述核酸包含可操作地连接至所述多核苷酸的启动子序列。在一些实施方式中，所述核酸包含在病毒载体内。在一些实施方式中，所述病毒载体是逆转录病毒载体。在一些实施方式中，所述逆转录病毒载体是鼠白血病病毒载体。在一些实施方式中，所述鼠白血病病毒载体是MoMLV载体。在一些实施方式中，所述逆转录病毒载体是SFG载体。在一些实施方式中，所述病毒载体是腺病毒载体。在一些实施方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些实施方式中，所述核酸包含在质粒内。
本申请的其他特征为用本申请的任何组合物转化或转染的细胞。在一些实施方式中，所述细胞是T细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞、B细胞、NK细胞或NK-T细胞。在一些实施方式中，细胞是T细胞。在一些实施方式中，所述细胞从骨髓中获得或制备。在一些实施方式中，所述细胞从脐带血中获得或制备。在一些实施方式中，所述细胞从外周血中获得或制备。在一些实施方式中，所述细胞从外周血单核细胞中获得或制备。在一些实施方式中，细胞是人细胞。
在一些实施方式中，所述细胞还转化或转染有含多核苷酸的核酸，所述多核苷酸编码包含信号肽、单链可变区片段、CH2-CH3铰链区和CD3ζ多肽的嵌合多肽。在一些实施方式中，所述单链可变区片段结合肿瘤细胞上的抗原。在一些实施方式中，所述单链可变区片段结合细胞上涉及过度增殖性疾病的抗原。在一些实施方式中，其中所述单链可变区片段选自PSMA、αPSCA、αMUC1、αCD19、αROR1、α间皮素、αGD2、αCD123、αMUC16、和αHer2/Neu单链可变区片段。在一些实施方式中，所述单链可变区片段是αCD19单链可变区片段。
还提供诱导免疫应答的方法，所述方法包括用本发明组合物体外或离体转染或转导细胞。在一些实施方式中，所述方法还包括将所述细胞与结合多聚化区域的 配体接触，使所述诱导型嵌合信号分子发生多聚化。一些实施方式中，所述配体是二聚化的。在一些实施方式中，所述配体是二聚化FK506或二聚化FK506样类似物在一些实施方式中，所述配体是AP1903或AP20187。在一些实施方式中，所述方法还包括向所述对象给予所述转染或转化的细胞。在一些实施方式中，所述细胞通过静脉给药来给予所述对象。在一些实施方式中，提供诱导体内免疫应答的方法，所述方法包括给予对象本发明的组合物。在一些实施方式中，所述方法还包括给予所述对象含有结合多聚化区域的配体的组合物，使所述诱导型嵌合信号分子发生多聚化。一些实施方式中，所述配体是二聚化的。在一些实施方式中，所述配体是二聚化FK506或二聚化FK506样类似物在一些实施方式中，所述配体是AP1903或AP20187。
在一些实施方式中，用本发明组合物或细胞治疗的对象诊断有过度增殖性疾病。在其他实施方式中，该对象诊断有肿瘤。在其他实施方式中，所述对象患有癌症。在其他实施方式中，所述对象患有实体瘤。在其他实施方式中，所述细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞或T细胞。在其他实施方式中，所述细胞递送至肿瘤床(tumorbed)。在其他实施方式中，所述癌症存在于所述对象的血液或骨髓中。在其他实施方式中，所述对象患有血液或骨髓疾病。在其他实施方式中，所述对象诊断有可通过干细胞移植得到缓解的任何症状或紊乱。在其他实施方式中，所述对象诊断有镰状细胞贫血或异染色性脑白质病变。在其他实施方式中，所述对象诊断有选自下组的症状：原发性免疫缺陷症、嗜血淋巴组织细胞瘤病(HLH)或其他噬血细胞紊乱、遗传性骨髓衰竭症、血红蛋白病、代谢紊乱和破骨细胞紊乱。在其他实施方式中，所述对象诊断有选自下组的病症：严重联合免疫缺陷(SCID)、联合免疫缺陷(CID)、先天性T细胞缺陷/不足、常见变异型免疫缺陷病(CVID)、慢性肉芽肿性疾病、IPEX(免疫缺陷、多内分泌病变、肠病、X连锁)或IPEX样病、维斯科特-奥尔德里奇综合征、CD40配体缺陷、白细胞粘附缺陷、DOCK8缺陷、IL-10不足/IL-10受体缺陷、GATA2缺陷、X-连锁淋巴细胞增生性疾病(XLP)、软骨毛发发育不良、施戴二氏综合征(ShwachmanDiamondSyndrome)、先天性纯红细胞再生障碍性贫血、先天性角化不良、范可尼贫血、先天性中性粒细胞减少、镰状细胞病、地中海贫血、黏多糖贮积症、鞘脂类代谢障碍和石骨症。在一些实施方式中，所述对象诊断为选自下组的病毒病因学感染：HIV、流感、 疱疹、病毒性肝炎、爱波斯坦-巴尔病、脊髓灰质炎、病毒性脑炎、麻疹、水痘、巨细胞病毒(CMV)、腺病毒(ADV)、HHV-6(人疱疹病毒6、I)和人乳头状瘤病毒，或诊断为选自下组的细菌病因学感染：肺炎、肺结核和梅毒，或诊断为选自下组的寄生病因学感染：疟疾、锥虫病、利什曼病、滴虫病和阿米巴病。
还提供治疗对象中白血病的方法，所述方法包括给予对象本发明的细胞，并给予多聚化配体，其中所述细胞用诱导型CSM和含单链可变区片段的嵌合抗原受体转导或转染。在一些实施方式中，所述单链可变区片段结合CD19。在一些实施方式中，所述多聚化配体是AP1903或AP20187。在一些实施方式中，所述细胞是T细胞。
在一些实施方式中，该对象是人。在一些实施方式中，所述方法还包括确定是否将额外剂量的所述多聚化配体给予所述患者。在一些实施方式中，所述方法还包括将额外剂量的所述多聚化配体给予所述患者，其中所述疾病或病症症状保持或在症状减轻后测到。在一些实施方式中，所述对象在给予本发明的组合物或细胞之前诊断有疾病或病症，在给予多聚化配体之后测到所述疾病或病症，给予所述对象额外剂量的多聚化配体。
在一些实施方式中，所述方法还包括：鉴定对象中病症或疾病是否存在或其阶段，和传递指示以给予结合所述多聚化结合区域的多聚化配体，基于所述对象中鉴定的病症或疾病是否存在或其阶段来维持或调节给予所述患者的所述多聚化配体的后续剂量。
在一些实施方式中，所述病症是癌症。在一些实施方式中，所述病症是白血病。在一些实施方式中，所述病症是实体瘤。
在一些实施方式中，所述方法还包括：相对给予所述多聚化配体之后的肿瘤尺寸和/或肿瘤细胞数量，确定对象中肿瘤尺寸是否增加和/或肿瘤细胞数量是否增加，和在确定肿瘤尺寸增加和/或肿瘤细胞数量增加的事件中给予所述对象额外剂量的所述多聚化配体。在一些实施方式中，相对于给予所述多聚化配体之前的肿瘤尺寸和/或肿瘤细胞，在给予所述多聚化配体之后的肿瘤尺寸和/或肿瘤细胞数量减低。
在一些实施方式中，所述方法还包括相对给予所述多聚化配体之后的表达CD19的B细胞的水平，确定对象中表达CD19的B细胞是否增加，和在确定对象中表达CD19的B细胞增加的事件中给予所述对象额外剂量的所述多聚化配体。在一些实施方式中，相对于给予所述多聚化配体之前的表达CD19的B细胞水平，在给予所述多聚化配体之后的表达CD19的B细胞水平减低。
下述说明、实施例、权利要求和附图中进一步描述某些实施方式。
附图简要说明
附图描述本技术的实施方式但不具限制性。为了说明的清楚和方便，附图未按比例制作，并且在一些情况中，可能夸大或放大多个方面以协助对具体实施方式的理解。
图1提供嵌合抗原受体(CAR)的基因转移的示意图。
图2提供CAR改进和相关毒性的示意图。
图3描绘了相对也表达自杀(凋亡)基因的表达CAR的细胞，CID控制的嵌合信号分子的理论分析。
图4提供了CID控制的CSM的示意图。
图5提供CSM的CID诱导，以及含CAR的T细胞的诱导型CSM活化的示意图。
图6提供CID控制的T细胞杀伤肿瘤细胞的示意图。
图7提供修饰的T细胞的FAC分选分析的结果。
图8提供修饰和对照T细胞中GM-CSF和干扰素λ水平的柱状图。
图9提供修饰和对照T细胞中IL-10和IL-13水平的柱状图。
图10提供修饰和对照T细胞中IL-4和IL-5水平的柱状图。
图11提供修饰和对照T细胞中IL-6和IL-8水平的柱状图。
图12提供修饰和对照T细胞中IL-1β和IL-12-p70水平的柱状图。
图13提供修饰和对照T细胞中IP-10和MIP1α水平的柱状图。
图14提供修饰和对照T细胞中MIP1β和RANTES水平的柱状图。
图15提供修饰和对照T细胞中TNF-α水平的柱状图。
图16：用AP1903对iMC转导的T细胞的活化诱导T细胞对肿瘤细胞的杀伤。用对照载体(缺少MyD88/CD40信号结构域)或用iMC转导的T细胞与CAPAN-1-GFP肿瘤细胞以5:1的T细胞：肿瘤细胞的比例培养。用或不用10nMAP1903培养共培养物。72小时后，通过流式细胞术分析共培养物的GFP+肿瘤细胞(X轴)。
图17描述了不同供体的与图16所述相似实验的结果。
图18：用AP1903对iMC转导的T细胞的活化诱导T细胞杀伤肿瘤细胞。用对照载体(缺少MyD88/CD40信号结构域)或用iMC转导的T细胞与CAPAN-1-GFP肿瘤细胞以5:1的T细胞：肿瘤细胞的比例培养。用或不用10nMAP1903培养共培养物。72小时后，通过流式细胞术分析共培养物的GFP+肿瘤细胞(n＝2)。
图19：用AP1903对iMC转导的T细胞的活化诱导T细胞杀伤肿瘤细胞。用对照载体(缺少MyD88/CD40信号结构域)或用iMC转导的T细胞与CAPAN-1-GFP肿瘤细胞以5:1的T细胞：肿瘤细胞的比例培养。用或不用10nMAP1903培养共培养物。通过荧光显微镜分析共培养物，显示了用10nMAP1903活化时T细胞团的活化(右侧两组图)和GFP+肿瘤细胞的消除。
图20是用嵌合抗原受体(左)转导或转染的细胞的示意图和本文所提供的嵌合信号分子的示例。
图21是用嵌合抗原受体(左)转导或转染的细胞的示意图和本文所提供的嵌合信号分子的示例。
图22是诱导型嵌合抗原受体的质粒图。
详细描述
通常，T细胞治疗的困难在于输注细胞的体内扩增较差。解决该问题的一个方法是通过给予高剂量的IL-2给患者。该治疗帮助T细胞生长和抗肿瘤功能，但对患者极具毒性。这已普遍用于黑素瘤，因为高剂量的IL-2被认为是该疾病的标准护理治疗。由于毒性效果，大多数其他T细胞治疗应用没有使用IL-2与T细胞治疗。T细胞治疗中发生的其他问题为输注T细胞的移植性和持续性较差(也是体内增殖的功能)，这通过T细胞输注之前的淋巴消耗的调节来解决。研究者通常使用化疗(尤其是环磷酰胺)来实现，虽然有些使用抗体，包括坎帕斯。条件作用(conditioning)看起来显著有利于T细胞治疗，这是通过产生淋巴“空间”和消耗竞争生长和存活因子的常规免疫细胞实现的。然而其对患者极具毒性，完全消融正常免疫细胞(例如病原体特异性的)并且不能简单用于一些类型的癌症或年长患者。此外，使用淋巴消融方案可能迫使T细胞治疗变成一项“步骤”而非独立治疗法。
由于各患者需要为其制备独特的细胞产品，T细胞治疗大都被认为是奢侈疗 法。传统T细胞治疗(由反复抗原刺激或肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的分离所生成)在其特异性或功能方面不可重复，会导致极其可变的结果，且在一些情况中，会导致不能生产用于治疗的产物。已开始用天然或嵌合T细胞受体的基因转移解决该问题(高度肿瘤特异T细胞可在2周内生成)，但看起来基因修饰的T细胞相比天然产生的T细胞功能上不同。此外，高度特异的CART细胞或表达优化的TCRα和β链的T细胞可导致脱靶毒性，需要包含自杀基因。
图1显示嵌合抗原受体(CAR)的最基本组分。针对肿瘤特异单克隆抗体的可变区重链(VH)和轻链(VL)与来自T细胞受体复合物CD3ζ链(ζ)进行框内融合。该VH和VL用甘氨酸-丝氨酸挠性接头连接在一起，然后通过间隔子(CH2CH3)接合至跨膜结构域直到scFv原理细胞表面的程度，从而其可与肿瘤抗原相互作用。
转导后，T细胞现在在其表面表达CAR，并且在与肿瘤抗原接触和连接后，信号通过CD3ζ链诱导细胞毒性和细胞活化。
图2显示各种嵌合抗原受体的发展。研究者注意到通过CD3ζ的T细胞活化足以诱导肿瘤特异杀伤，但不足以诱导T细胞增殖和存活。早期临床试验使用仅表达ζ链的CAR修饰的T细胞，其显示基因修饰的T细胞表现出较差的体内存活和增殖。这些构建体称为第一代CAR。
由于通过B7轴的共刺激对于完全的T细胞活化来说是必需的，研究者将共刺激多肽CD28信号结构域加入CAR构建体。该区域通常包含跨膜区域(代替CD3ζ形式)和用于结合PI3K和Lck的YMNM基序。表达仅ζ的CAR的T细胞或表达ζ和CD28的CAR的T细胞之间的比较证明CD28提高体内扩增，这部分归因于活化后IL-2生产增加。包含CD28称为第二代CAR。
在CAR设计中使用共刺激多肽1BB或OX40进一步改善了T细胞的存活率和功效。4-1BB看起来尤其显著地提高了T细胞增殖和存活。第三设计(含3个信号结构域)已被用于PSMACAR(ZhongXS,等,MolTher.2010年2月；18(2):413-20),和CD19CAR中，最著名的是对CLL的治疗(Milone,M.C.,等, (2009)Mol.Ther.17:1453-1464；Kalos,M.,等,Sci.Transl.Med.(2011)3:95ra73；Porter,D.,等,(2011)N.Engl.J.Med.365:725-533)。这些细胞在3个患者中显示出令人瞩目的功能，体内扩增超过1000倍，并且在3个患者中都产生持久的缓解率。
然而，由于CAR的抗肿瘤效果得到改善，其也变的更危险。使用第二代和第三代CAR已有两例引人注意的死亡，考虑到仅少数患者被治疗，该死亡数很高。这些死亡源于脓毒血症，这是高度活化的T细胞引起的由于细胞因子风暴和肿瘤裂解症(Morgan,R.A.,等(2010)Mol.Ther.14:843-851)。
自杀基因针对来自过继转移T细胞的不利副作用提供充分的保护；然而，毒性之后，基因修饰T细胞的消除可能也会消融治疗功效。
T细胞受体信号可用二聚化的化学诱导剂(CID)联合包含结合该CID的多聚化区域的嵌合受体来诱导，T细胞经工程改造以表达CD3ζ链，其连接1、2或3个FKBP片段。所述细胞表达所述嵌合受体，并证明CID依赖的T细胞活性(Spencer,D.M.,等,Science,1993.262:p.1019-1024)。本发明部分提供由CID控制的诱导型嵌合信号分子(CSM)。将表达诱导型CSM的T细胞与CID接触使得细胞活化和并诱导免疫应答。
图3比较了本申请的疗法和使用自杀基因的CAR治疗方法。本申请部分提供体内扩大T细胞增殖和功能的基因工程改造方法，从而逐渐提高抗肿瘤效果。二聚化化学诱导剂用在可控制系统中，以体内活化T细胞来增强其功能和提高频率。
如图4和图5所示，在一些实施方式中，CSM使用具有一个或多个共刺激多肽(例如CD28和4-1BB)的串联多聚化区域(例如Fv结构域)，其具有或不具有CD3ζ链来实现CID依赖性增殖和共刺激。CSM可单独使用以提供共刺激并增强T细胞免疫应答。使用该方法，可用编码CSM的DNA转染或转化T细胞群体(例如具有非特异性靶标的群体)，然后给予对象以提高一般的免疫应答。
该CSM还可在细胞中随着CAR表达，其可包含例如scFv多肽和CD3ζ链。 在本方法中，诱导型CSM分子与CAR联用，从而将CAR信号分为两个单独的功能。由CAR提供的该第二功能提供对工程改造的T细胞的抗原特异性细胞毒性。图4中，所述示例显示具有针对PSMA的特异性的CAR；这些工程改造的T细胞可(例如)给予对象以生成特异免疫应答，例如直接针对前列腺癌肿瘤的特异免疫应答(图6)。
如图22所示，在一些实施方式中，诱导型共刺激多肽(例如CD40胞质区域多肽或截短的MyD88多肽)用于控制嵌合抗原受体自身的活化。编码该修饰的诱导型嵌合抗原受体的多核苷酸可用于转导细胞例如T细胞。所述细胞还可表达本文所述的嵌合信号分子，并且在一些实施方式中，所述嵌合信号分子包含CD3ζ多肽。在一些实施方式中，所述诱导型嵌合抗原受体包含CD40胞质区域多肽和MyD88多肽。
词语“一”或“一个”当与“包含”在权利要求和说明书中联用时，可表示“一”，但也与“一个或多个”，“至少一个”和“一或多于一个”的意思一致。此外，术语“具有”、“包括”、“包含”和“含有”可互换使用，且本领域技术人员知晓其为开放式术语。
本文所使用术语“同种异体”指宿主和供体细胞之间的HLA或MHC基因座的抗原性不同。
因此，从相同物种转移的细胞或组织可能抗原性不同。同系小鼠可在一个或多个基因座处不同(同类)，并且同种异体小鼠可具有相同背景。
本文所用术语“抗原”定义为引发免疫应答的分子。免疫应答可涉及抗体生产或特异免疫竞争细胞的活化，或二者均有。抗原可源自生物体、抗原/蛋白质的亚基、死亡或失活的全细胞或裂解物。示例性的生物体包括但不限于螺杆菌、弯曲菌、梭状芽胞杆菌、白喉棒状杆菌、百日咳杆菌、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、伯氏疏螺旋体、疟原虫、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、乳头状瘤病毒、霍乱弧菌、大肠杆菌、麻疹病毒、轮状病毒、志贺菌、伤寒沙门氏菌、淋病奈瑟球菌。因此，任何大分子(实际上包括所有蛋白质或多肽)都可作为抗原。此外，抗 原可源自重组或基因组DNA。含病原体基因组的核苷酸序列或部分核苷酸序列或能引发免疫应答的蛋白质的基因或基因片段的任何DNA都可合成抗原。此外，本发明并不局限于基因或基因组的完整核酸序列的使用。显然本发明包括但不限于使用多于一种基因或基因组的部分核酸序列，且这些核酸序列以各种组合排列以引发所需的免疫应答。
本文所用术语“癌症”定义为细胞过度增殖，其独特特性(丧失正常控制)导致不受控的生长、缺少分化、局部组织侵入和转移。示例包括但不限于：黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌肺、肝癌、白血病、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、牙龈肿瘤、舌肿瘤、神经母细胞瘤、头癌、颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑癌、结肠癌、肉瘤或膀胱癌。
本文所用的术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用。所有这些术语也包括其后代，其是任意或全部的后代。应理解，由于有意或偶然的突变，所有的后代可能不是相同的。
本文所用术语“cDNA”旨在表示用信使RNA(mRNA)作为模板制备的DNA。相对基因组DNA或从基因组模板、未加工的或部分加工的RNA模板聚合产生的DNA，使用cDNA的优点是cDNA只含对应蛋白质的编码序列。有时则使用全部或部分基因组序列，例如需要非编码区域以优化表达或反义策略中非编码区域例如内含子要被靶向。
如本文所使用，术语“表达构建体”或“转基因”定义为含编码基因产物的核酸的任何类型的基因构建体可插入到载体中，其中部分或所有核酸编码序列能够被转录。转录本翻译为蛋白质，但并非必需。在一些实施方式中，表达包括基因的转录和mRNA翻译为基因产物。在其他实施方式中，表达仅包括编码感兴趣的基因的核酸的转录。术语“治疗性构建体”还可用于表示表达构建体或转基因。表达构建体或转基因可用作(例如)治疗过度增殖疾病或紊乱(例如癌症)的疗法，从而所述表达构建体或转基因为治疗构建体或预防构建体。
如本文所用，术语“表达载体”指含核酸序列的载体，所述核酸序列编码能转录的至少部分基因产物。在一些情况中，RNA分子然后翻译成蛋白质、多肽或肽。在其他情况中，这些序列未经翻译，例如，在反义分子或核酶的产生中。表达载体可含有多种控制序列，其是指特定宿主生物体中可操作连接的编码序列的转录和可能的翻译所需的核酸序列。除了控制转录和翻译的控制序列以外，载体和表达载体可含有还具有其他功能并在下文中描述的核酸序列。
本文所用术语“离体”指身体“外部”。术语“离体”和“体外”本文可互换使用。
如本文所用，术语“功能上等价”，表示共刺激多肽、胞质区域或信号区域时，表示核酸片段、变体、或类似物时，指编码用于共刺激的核酸，其刺激免疫应答以破坏肿瘤或过度增殖疾病。“功能上等价”表示(例如)缺少胞外结构域但在T细胞中表达时能放大T细胞介导的肿瘤杀伤应答的共刺激多肽。
术语“过度增殖疾病”定义为细胞过度增殖引起的疾病。示例性过度增殖疾病包括但不限于癌症和自体免疫疾病。其他过度增殖疾病可包括血管堵塞、再狭窄、动脉粥样硬化或炎性肠病。
本文所用术语“基因”定义为功能性蛋白质、多肽或肽的编码单元。应理解，该功能性术语包括基因组序列、cDNA序列、和小工程改造基因区段，其表达或适于表达蛋白质、多肽、结构域、肽、融合蛋白和突变体。
术语“免疫组合物”或“免疫原”指能引发免疫应答的物质。示例性的免疫原包括例如抗原、在诱导自体免疫疾病中起作用的自体抗原、和癌细胞表面表达的肿瘤相关抗原。
本文所用术语“免疫削弱”指具有降低的或减弱的免疫系统的对象。免疫削弱情况可能是由于免疫系统缺陷或功能丧失或由于提高对感染和/或疾病的易感性的其他因素。虽然该分类可以用于评估的概念基础，免疫削弱的个体常常不能完全归入一组或其他组。身体防御机制的多于一种缺陷都可受到影响。例如，具有HIV 导致的特异T淋巴细胞缺陷的个体还可具有抗病毒治疗的药物引起的嗜中性白血球减少，或由于皮肤和粘膜的完整性受到破坏引起的免疫削弱。免疫削弱状态可由留置中心导管(indwellingcentrallines)或静脉药物滥用引起的其他类型的缺陷所引发；或可由二次恶性肿瘤、营养不良或已感染其他感染物如结核菌或性传播疾病(例如，梅毒或肝炎)所引起。
本文所用术语“药物或药学上可接受的”指分子整体和组合物在给予动物或人时不产生副作用、过敏或其他不良反应。在一些实施方式中，该对象是哺乳动物。在一些实施方式中，该对象是人。
本文所用术语“药学上可接受的运载体”包括任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂等。药学活性物质的这类介质和试剂的用法是本领域熟知的。除非某些常规介质或试剂与本文所述载体或细胞不相容，否则可考虑在治疗组合物中使用任何这些介质或试剂。也可在组合物中纳入补充活性成分。
本文所用术语“多核苷酸”定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，本文所用核酸和多核苷酸可互换使用。核酸是多核苷酸，其可水解为单体“核苷酸”。单体核苷酸和水解为核苷。本文所用多核苷酸包括但不限于本领域任何可用方法(包括但不限于重组方法，即从重组文库或细胞基因组使用常规克隆技术和PCRTM等克隆核酸)和通过合成方法所获得的所有核酸序列。此外，多核苷酸包括多核苷酸的突变，包括但不限于本领域已知方法对核苷酸或核苷的突变。核酸可包括一种或多种多核苷酸。
本文所用术语“多肽”定义为氨基酸残基链，其通常具有限定序列。本文所用术语多肽可与术语蛋白质互换使用。
本文所用术语“启动子”定义为细胞合成器或导入的合成器所识别的DNA序列，需要其起始基因的特异转录。
本文所用术语“调节免疫应答”、“调控免疫应答”或“控制免疫应答”指修饰免疫应答的能力。例如，所述组合物能提高和/或激活免疫应答。此外，所述组合物还能抑制免疫应答。形成调控由与所述组合物一起使用的配体所决定。例如，化学品的二聚化类似物引起共刺激多肽的二聚化，导致T细胞活化；然而化学品的单体类似物不引起共刺激多肽的二聚化，不会导致T细胞活化。
本文所用术语“转染”和“转导”可互换使用，指外源DNA导入真核宿主细胞的过程。转染(或转导)可通过许多方法中任一来实现，包括电穿孔、微注射、基因枪递送、逆转录病毒感染、脂质体转染、超染(superfection)等。
本文所用术语“同系”指细胞、组织或动物的基因型相同或足够相近以致可进行组织移植或免疫相容。例如，相同纯系的同卵双胞胎或动物。同系和同基因和互换使用。
术语“对象”或“患者”在本文中互换使用且包括但不限于，生物体或动物；哺乳动物，包括例如人，非人灵长类(如猴)，小鼠，猪，牛，山羊，兔，大鼠，豚鼠，仓鼠，马，猴，绵羊，或其他非人哺乳动物；和非哺乳动物，包括例如非哺乳类脊椎动物，如鸟、(例如，鸡或鸭)、或鱼，和非哺乳类无脊椎动物。
本文所用术语“疫苗”至含本文提供的组合物的制剂，所述组合物以能给予动物的形式存在。通常，疫苗包含常规盐水或缓冲水性溶液介质，其中悬浮或溶解有组合物。该形式中，所述组合物可方便地组织、缓解或治疗病症。引入对象后，疫苗能引发免疫应答，包括但不限于产生抗体、细胞因子和/或其他细胞应答。
本文所用术语“转录控制下”或“可操作连接”表示启动子相对核酸位于正确位置和方向以控制RNA聚合酶起始和表达基因。
本文所用术语“治疗”、“处理”、“治疗的”或“治”表示预防和/或疗法。例如涉及实体瘤(例如癌性实体瘤)时，该术语指预防性治疗实现的阻止，其提高了对象对实体瘤或癌症的抵抗。在一些示例中，对象可经治疗以阻止癌症，其中所述癌症为 家族性或遗传上相关。例如涉及感染型疾病时，该术语指预防性治疗以及对象感染后为了与感染对抗的治疗(例如降低或消除感染或防止其变得更糟)，所述预防性治疗提高对象对病原体感染的抵抗的，或换句话说，降低对象被病原体感染或显示感染引起的病态迹象的可能性。
血液疾病：本文所用术语“血液疾病”和/或“血液病”指影响血液及其组分(包括但不限于血细胞、红细胞、血蛋白)产生、凝血机制、血液产生、血蛋白产生等和其组合的病症。血液疾病的非限制性示例包括贫血、白血病、淋巴瘤、血液肿瘤、白蛋白血症(albuminemias)、血友病(haemophilias)等。
骨髓疾病：本文所用术语“骨髓疾病”指导致血液细胞和血小板生产下降的病症。在一些骨髓疾病中，正常骨髓结构可由于感染(结核菌)或恶性肿瘤而移位，继而会导致血液细胞和血小板产生方面的疾病。骨髓疾病的非限制性示例包括白血病、细菌性感染(如结核病)、放射病或中毒、全血细胞减少症(apnocytopenia)、贫血、多发性骨髓瘤等。
T细胞和活化的T细胞(包括CD3+细胞)：T细胞(还称为T淋巴细胞)属于血液白细胞，称为淋巴细胞。淋巴细胞通常涉及细胞介导的免疫。“T细胞”中的“T”指细胞源于胸腺或其成熟受到胸腺影响。通过是否存在称为T细胞受体的细胞表面蛋白，T细胞可与其他淋巴细胞类型区分，例如B细胞和天然杀伤细胞(NK)。本文所用术语“活化的T细胞”指T细胞通过识别II类主要组织相容性(MHC)标志物环境中存在的抗原决定簇，已被刺激而产生免疫应答(例如活化的T细胞的克隆扩增)。通过抗原决定簇、细胞因子和/或淋巴因子和分化细胞表面蛋白簇(例如CD3、CD4、CD8等及其组合)的存在来活化T细胞。表达分化蛋白簇的细胞通常对T细胞表面的该蛋白的表达为“阳性”(例如对CD3或CD4表达为阳性的细胞称为CD3+或CD4+)。CD3和CD4蛋白是细胞表面受体或共受体，其可直接和/或间接参与T细胞的信号转导。
外周血：本文所用术语“外周血”指血液的细胞组分(如血液红细胞、血液白细胞和血小板)，其从血液的循环库中获得或制备，且不被隔离在淋巴系统、脾肝 或骨髓内。
脐带血：脐带血与外周血和隔离在淋巴系统、脾肝或骨髓内的血液不同。本文所用术语“脐带血”或“脐血”可互换使用，指胎儿出身后胎盘中和连接的脐带中留存的血液。脐带血常含有干细胞，包括造血干细胞。
“获得或制备”(例如细胞的情况中)表示细胞或细胞培养物从来源分离、纯化或部分纯化，所述来源可为例如脐带血、骨髓或外周血。该术语还可用于原始来源或细胞培养物经培养且细胞经复制的情况中，其中后代细胞在该情况下源自原始来源。
细胞希望比例中的“杀伤”或“杀死”表示细胞通过凋亡的死亡，使用测量凋亡的任何方法进行测量。该术语还可涉及细胞消融。
供体T细胞：本文所用术语“供体T细胞”指通常在同种异体的干细胞移植中给予受者以赋予其抗病毒和/或抗肿瘤免疫的T细胞。供体T细胞常用于抑制骨髓移植物排斥和提高同种异体移植(alloengraftment)的成功率，然而相同的供体T细胞可引起针对宿主抗原的同种异体侵略响应，继而导致移植物抗宿主病(GVHD)。某些活化的供体T细胞相比其他活化的T细胞可引起更高或更低的GVHD响应。供体T细胞还可针对受体肿瘤细胞具备反应性，引起有利的移植物对抗肿瘤的效果。
“功能保守突变体”是给定的氨基酸残基发生变化而不改变蛋白质或酶的总体构型和功能的蛋白质或酶，包括但不限于相似性质的氨基酸置换，所述性质包括极性或非极性特征、尺寸、形状和电荷。对于许多常见已知非遗传性编码氨基酸的保守氨基酸取代本领域已知。其他非编码氨基酸的保守取代可基于其物理性质与遗传上编码的氨基酸的性质的比较来确定。
除了那些视为保守的氨基酸以外的氨基酸可在蛋白质或酶中不同，从而具有相似功能的任何两种蛋白质之间的蛋白质或氨基酸序列的相似比例可不同且可(例 如)至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、更优选至少95％，这根据比对方案来确定。本文所用术语“序列相似性”表示核苷酸或蛋白质序列相关的程度。两个序列之间的相似程度可基于序列相同性和/或保守型百分比。本文所用术语“序列相同性”表示两种核苷酸或氨基酸序列为非变异的程度。本文所用术语“序列比对”表示将两个或更多序列并列以实现最大水平相同性(以及氨基酸序列的情况中的保守型)的过程，其目的是评估相似性程度。比对序列和评估相似性/相同性的大量方法本领域已知，例如聚类法(ClusterMethod)，其中所述相似性基于MEGALIGN算法，以及BLASTN、BLASTP和FASTA。当使用任何这些程序时，优选的设置是得到最高序列相似性的设置。
间充质基质细胞：本文所用术语“间充质基质细胞”或“骨髓来源的间充质基质细胞”指可离体、体外和体内分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞的多能干细胞，并可进一步限定为单核骨髓细胞在标准培养条件下粘附塑料培养皿的并对造血干细胞系标志物阴性和对CD73、CD90和CD105阳性的部分。
胚胎干细胞：本文所用术语“胚胎干细胞”指源自成胚(50-150细胞的早期胚胎)的内细胞团的多潜能干细胞。胚胎干细胞的特征为其能无限自我再生，以及其分化为所有其他三个初级胚层(外胚层、内胚层和中胚层)的衍生物的能力多潜能区别于多能在于多潜能细胞可产生所有细胞类型，而多能细胞(如成人干细胞)尽可产生有限数量的细胞类型。
诱导型多潜能干细胞：本文所用术语“诱导型多潜能干细胞”或“诱导的多潜能干细胞”指成人细胞或分化的细胞，其被基因操作(例如基因表达继而活化多潜能性)、生物操作(例如治疗病毒或逆转录病毒)和/或化学操作(例如小分子、肽等)所“重编程”或诱导以生成能分化为许多类似胚胎干细胞(若非所有细胞类型)的细胞。诱导型多潜能干细胞与胚胎干细胞不同在于其实现中间或最终分化状态(如皮肤细胞、骨细胞、成纤维细胞等)并且然后被诱导去分化，从而重新获得生成多能细胞或多潜能细胞的一些或所有能力。
CD34+细胞:本文所用术语“CD34+细胞”指在细胞表面表达CD34蛋白的细 胞。本文所用“CD34”指细胞表面糖蛋白(例如唾液粘蛋白)，其常作为细胞之间的粘附因子并且参与T细胞进入淋巴结，还是“分化簇”基因家族的成员。CD34还可介导干细胞与骨髓、胞外基质或直接与基质细胞的接合。CD34+细胞常见于脐带和骨髓作为造血干细胞、骨髓间充质干细胞亚组、内皮祖细胞、血管内皮细胞但不是淋巴管(除了胸膜淋巴管)、肥大细胞、间质中和表皮附属结构周围的树突状细胞亚群(其为负因子XIIIa)、以及某些软组织肿瘤(例如，腺泡状软组织肉瘤、前B急性淋巴细胞白血病(Pre-B-ALL)、急性髓系白血病(AML)、AMLM7、隆凸性纤维肉瘤、胃肠道间质瘤、巨细胞成纤维细胞瘤、粒细胞肉瘤、卡波氏肉瘤、脂肪肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、恶性周围神经鞘膜瘤、脑膜血管外皮细胞瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、神经鞘瘤和甲状腺乳头状癌)中的细胞。
肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)指具有各种受体的T细胞，其侵润肿瘤并在靶区域杀死肿瘤细胞。使用本发明方法调节TIL的活性可允许对肿瘤细胞消除的更直接控制。
基因表达载体：本文所用术语“基因表达载体”、“核酸表达载体”或“表达载体”本文可互换使用，通常指可在宿主细胞中复制并用于将基因引入宿主细胞的核酸分子(如质粒、噬菌体、自主复制序列(ARS)、人工染色体、酵母人工染色体(如YAC))。引入到表达载体上的基因可为内源基因(如宿主细胞或生物体中通常可见的基因)或异源基因(如宿主细胞活生物体的基因组中或外部染色体核酸上通常不可见的基因)。通过表达载体引入细胞的基因可为未处理基因或已修饰或工程改造的基因。基因表达载体还可工程改造为含5’和3’非翻译调控序列，其有时可用作增强子序列、启动子区域和/或终止序列，可协助或提高表达载体携带的基因的有效转录。基因表达载体有时还经工程改造以在具体细胞类型、细胞位置或组织类型中复制和/或功能性表达(如转录和翻译)。表达载体有时包括将载体维持在宿主细胞或受体细胞中的可选择标志物。
发育调控启动子：本文所用术语“发育调控启动子”指用作RNA聚合酶转录基因的起始结合位置，所述基因在某些受控的情况下表达，由发育程序或途径启动或受其影响。发育调控启动子常在启动子区域处或附近具有其他控制区域，用于结合 转录活化剂或抑制剂，其可影响发育程序或途径的部分的基因转录。发育调控启动子有时参与转录基因，该基因的产物影响细胞的发育分化。
发育分化细胞：本文所用术语“发育分化细胞”指经历一过程的细胞，所述过程通常涉及特定发育调控基因的表达，通过该过程细胞从较不特异的形式进化为更特异的形式从而行使特定功能。发育分化细胞的非限制性示例是肝细胞、肺细胞、皮肤细胞、神经细胞、血细胞等。发育分化中的改变涉及基因表达(如基因表达模式的改变)、基因重组(如重塑或染色质以分别隐藏或暴露待沉默或表达的基因)、和偶尔涉及DNA序列的变化(如免疫多样性分化)。发育期间的细胞分化可理解为基因调控网络的结果。调控基因和其顺式调控模块是基因调控网络中接受输入(如发育途径或程序中上游表达的蛋白质)并在网络中产生输出(如表达的基因产物在发育途径或程序中其他下游基因上作用)的节点。
术语“过度增殖疾病”定义为细胞过度增殖引起的疾病。示例性过度增殖疾病包括但不限于癌症和自体免疫疾病。其他过度增殖疾病可包括血管堵塞、再狭窄、动脉粥样硬化或炎性肠病。
在一些实施方式中，所述核酸包含在病毒载体内。在一些实施方式中，所述病毒载体是逆转录病毒或慢病毒载体。应理解在一些实施方式中，T细胞离体接触病毒载体，在一些实施方式中，T细胞体内接触所述病毒载体。
工程改造表达构建体
表达构建体编码共刺激多肽和配体结合结构域，所有均为可操作性连接。通常，术语“可操作连接”表示启动子序列功能性连接第二序列，其中所述启动子序列起始并介导对应于第二序列的DNA的转录。更具体地，表达构建体中采用多于一种配体结合结构域。进一步，所述表达构建体包含膜靶向序列。合适的表达构建体可在上述FKBP配体结合元件的两侧包括共刺激多肽元件。表达构建体可插入载体，例如病毒载体或质粒中。所提供方法的步骤可用合适方法进行，这些方法包括 但不限于本文所述转导、转化的方法或提供核酸至抗原呈递细胞的方法。
表达构建体还可包括标志物多肽。.在一些实施方式中，标志物多肽连接至所述共刺激多肽。例如，标志物多肽可通过多肽序列(例如可切割的2A样序列)连接所述共刺激多肽。所述标志物多肽可为例如CD19,ΔCD19或可为例如异源蛋白质，其经选择以不影响诱导型CSM的活性。
2A样序列或“可切割”2A序列源自例如许多不同病毒，包括例如源自明脉扁刺蛾β四体。这些序列有时还称为“肽省略序列(peptideskippingsequence)”。当此类序列置于要分开的两个肽之间的顺反子内时，核糖体会跳过明脉扁刺蛾β四体序列情况中的肽键，Gly和Pro核酸之间的键会被省略。这会剩下2-3个多肽，该情况中为所述共刺激多肽胞质区域和所述标志物多肽。当使用该序列时，编码2A序列5’的肽可在其他羧酸的羧基末端终止，包括Gly残基和2A序列中的任何上游残基。编码2A序列3’的肽可在其他羧酸的氨基末端终止，包括Pro残基和2A序列中的任何下游残基。
共刺激多肽
共刺激多肽分子能通过活化参与细胞存活和增殖的信号途径放大细胞介导的免疫应答。可考虑的共刺激多肽包括但不限于肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族(即CD40RANK/TRANCE-R、OX40、4-1BB)和CD28家族成员(CD28、ICOS)。共刺激蛋白可包括例如CD28,4-1BB,OX40,和CD3ζ链，或例如其胞质区域。多于一种共刺激多肽或共刺激多肽胞质区域可用在本文所述诱导型嵌合信号分子中。例如，诱导型CSM可包括CD28胞质多肽和4-1BB胞质多肽。或例如，诱导型CSM可包括CD28胞质多肽和OX40胞质多肽。或例如，诱导型CSM可包括CD3ζ胞质多肽。
共刺激多肽包括活化NF-κB、Akt途径和/或p38途径的任何分子或多肽。细胞活化系统基于利用重组信号分子，其融合至一个或多个配体结合结构域(即小分子结合结构域)，其中所述共刺激多肽经活化和/或用引起寡聚化的配体调节(即 脂质可穿透、有机、二聚化药物)。可用于共刺激多肽交联或寡聚化的其他系统包括抗体、天然配体和/或人工交叉反应或合成的配体。此外，考虑的其他二聚化系统包括香豆霉素/DNA促旋酶B系统。
可用的共刺激多肽包括活化NF-κB和其他可变区信号级联的那些，例如p38通路和/或Akt通路。该共刺激多肽包括但不限于CD28家族成员(如CD28,ICOS)、TNF受体(即CD40、RANK/TRANCE-R、OX40、4-1BB)。
在某些实施方式中，本发明方法涉及操作基因材料以产生编码可诱导形式的共刺激多肽(例如iCD28、i4-1BB、iCD3-ζ)的表达构建体。该方法涉及产生表达构建体，所述构建体包括例如编码响应胞质结构域的异源核酸序列和用于其表达的组件。可在合适的辅助细胞(病毒颗粒可从此生产)和感染该重组病毒颗粒的细胞中复制该载体。
因此，本文所述的共刺激分子可例如缺少胞外结构域。在具体实施方式中，所述胞外结构域被截短或移除。还考虑胞外结构域可用标准诱变、插入、缺失或替换进行突变以产生不具有功能性胞外结构域的共刺激分子。
在一些实施方式中，所述嵌合信号分子包含CD40胞质区域多肽和截短的MyD88多肽，如图21所示。含CD40胞质区域多肽和截短的MyD88多肽的多肽参见2009年9日21日提交的美国专利申请系列号12/563,991，题目为“通过诱导CD40和模式识别受体衔接自产生免疫应答的方法和组合物”(METHODSANDCOMPOSITIONSFORGENERATINGANIMMUNERESPONSEBYINDUCINGCD40ANDPATTERNRECOGNITIONRECEPTORADAPTERS)，其通过引用全文纳入本文。
在基因治疗的环境中，基因为源自除病毒基因组以外来源的异源多核苷酸序列，其提供载体主链。所述基因源自原核或真核来源例如细菌、病毒、酵母、寄生虫、植物或甚至动物。异源DNA还可源自多于一种来源，即多基因构建体或融合蛋白。异源DNA还可包括调节序列，其源自一种来源并且所述基因来自不同来源。
共刺激多肽可包括但不限于本文提供的氨基酸序列，可包括功能保守突变，包括缺失或截短，且可包括与本文的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％相同性的氨基酸序列。
配体结合区域
表达构建体的配体结合(“二聚化”)结构域可为可使用天然或非天然配体(例如非天然合成配体)进行诱导的任何方便的结构域。多聚化区域或配体结合结构域可为细胞膜之内或之外，取决于构建体的性质和配体的选择。已知各种配体结合蛋白质(包括受体)，包括与上述胞质区域关联的配体结合蛋白质。本文术语“配体结合结构域”可与“受体”互换使用。特别感兴趣的是已知或可容易生成配体(如小有机配体)的配体结合蛋白质。这些配体结合结构域或受体包括FKBP和亲环蛋白受体、类固醇受体、四环素受体、上述其他受体等，以及“非天然”受体，其可获自抗体、特别是重链或轻链亚基、其突变序列、随机程序获得的随机氨基酸序列、组合合成物等。在一些实施方式中，所述配体结合区域选自：FKBP配体结合区域、亲环蛋白受体配体结合区域、类固醇受体配体结合区域、亲环蛋白受体配体结合区域，和四环素受体配体结合区域。通常所述配体结合区域包含FvFvls序列。有时，Fv’Fvls序列还包含其他Fv’序列。示例包括例如Kopytek,S.J.,等,Chemistry&Biology7:313-321(2000)和Gestwicki,J.E.,等,CombinatorialChem.&HighThroughputScreening10:667-675(2007)；ClacksonT(2006)ChemBiolDrugDes67:440-2；Clackson,T.,记载于《化学生物学：从小分子到系统生物学和药物设计》(ChemicalBiology:FromSmallMoleculestoSystemsBiologyandDrugDesign)(Schreiber,s.,等编，威力出版社(Wiley),2007))所述的那些。
多数情况中，配体结合结构域或受体结构域有至少约50氨基酸、少于约350氨基酸、通常少于约200氨基酸作为天然结构域或其截短活性部分。结合结构域可为例如小的(<25kDa，以允许病毒载体的有效转染)、单体、非免疫原性、可通过合成实现、可穿透细胞、非毒性的配体，其被配置用于二聚化。
受体结构域可在胞内或胞外，取决于表达载体的设计和合适配体的可及性。对于疏水配体，结合结构域可在膜的两侧，但对于亲水配体，尤其是蛋白质配体来说，结合结构域通常延伸至细胞膜，除非有转运系统将配体内在化为可用于结合的形式。对于胞内受体来说，所述构建体可编码受体结构域序列的信号肽和跨膜结构域5'或3'，或可具有受体结构域序列的脂质接合信号序列5'。受体结构域位于信号肽和跨膜结构域之间时，所述受体结构域将位于胞外。
编码受体的表达构建体的部分可经诱变用于各种目的。诱变的蛋白质可提供较高的结合亲和性，这样可区分天然形成的受体和诱变受体的配体，为设计受体配体对等提供机会。受体中的变化可涉及已知位于结合位置的氨基酸，使用组合技术的随机诱变，其中关联结合位置的氨基酸或关联构型变化的其他氨基酸的密码子可通过改变(已知的变化或随机的变化)特定氨基酸的密码子而得到诱变，在合适和原核宿主中表达所获蛋白质，然后删选所述蛋白质的结合。
抗体和抗体单元如重链或轻链、尤其是其片段、更尤其可变区的全部或部分，或重链和轻链的融合蛋白(以产生高亲和结合)可用作结合结构域。考虑的抗体包括异味表达人产物的抗体，例如会启动免疫应答和通常在外周(即CND/脑区域之外)表达的胞外结构域。此类示例包括但不限于低亲和神经生长因子受体(LNGFR)和胚胎表面蛋白质(即癌胚抗原)。
此外，抗体可针对半抗原分子制备，其为生理可接受，且为经筛选结合亲和性的个体抗体亚基。编码亚基的cDNA可经缺失恒定区、部分可变区、诱变可变区等来分离和修饰以获得具有对配体的合适亲和性的结合蛋白质结构域。以这种方法，几乎所有生理可接受半抗原化合物可用作配体或为配体提供表位。还可使用天然受体替代抗体单元，其中所述结合结构域已知并有用于结合的有用配体。
寡聚化
虽然其他结合事件例如变购活化可用于启动信号，转导信号通常来自配体介导的嵌合蛋白分子的寡聚化，即配体结合后的寡聚化的结果。嵌合蛋白质的构建体会随着各种结构域的顺序和个体结构域的重复数量而不同。
为了对所述受体进行多聚化，嵌合表面膜蛋白质的配体结合结构域/受体结构域的配体通常为多聚化，意义在于其会具有至少两个结合位点，各结合位点能结合配体受体结构域。“多聚化配体结合区域”表示结合多聚化配体的配体结合区域。术语“多聚化配体”包括二聚化配体。二聚化配体具有能结合配体受体结构域的两个结合位点。理想地，主题配体为小合成有机分子的二聚化或更高级寡聚物，通常不高于约四聚化，所述个体分子一般至少为约150Da且小于约5kDa，通常小于约3kDa。可使用各种成对的合成配体和受体。例如，涉及天然受体的实施方式中，二聚化FK506可与FKBP12受体使用，二聚化环孢菌素A可与亲环蛋白受体使用，二聚化雌激素可与雌激素受体使用，二聚化糖皮质激素可与糖皮质激素受体使用，二聚化四环素可与四环素受体使用，二聚化维生素D可与维生素D受体使用等。可使用其他高级配体如三聚物。对于涉及非天然受体(例如抗体亚基、修饰的抗体亚基、由重链和轻链可变区串联组成并由挠性接头结构域分离的单链抗体、或修饰的受体和其突变序列等)的实施方式来说，可采用各种任何组合。这些配体单元的显著特征是各结合位点能以高亲合力结合受体且其能化学上二聚化。而且，有方法可平衡配体的疏水性/亲水性从而其能以功能水平溶于血清，并在多数应用中扩散通过质膜。
在一些实施方式中，本发明方法使用化学诱导二聚化(CID)技术来生产条件控制的蛋白质或多肽。该技术除了具有诱导型，还具有可逆性，这是由于不稳定二聚化试剂的降解或给予单体竞争抑制剂。
CID系统使用合成的二价配体以快速交联融合至配体结合结构域的信号分子。该系统以用于：启动细胞表面蛋白的寡聚化和活化(Spencer,D.M.,等,Science,1993.262:第1019-1024页；SpencerD.M.等,CurrBiol1996,6:839-847；Blau,C.A.等ProcNatlAcad.Sci.USA1997,94:3076-3081)、或胞质蛋白的的寡聚化和活化(Luo,Z.等Nature1996,383:181-185；MacCorkle,R.A.等ProcNatlAcadSciUSA1998,95:3655-3660)、招募转录因子至DNA元件以调节转录(Ho,S.N.等Nature1996,382:822-826；Rivera,V.M.等Nat.Med.1996,2:1028-1032)或招募信号分子至质膜以刺激信号传导(SpencerD.M.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA1995, 92:9805-9809；Holsinger,L.J.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA1995,95:9810-9814)。
CID系统基于表面受体积聚有效活化下游信号级联的概念。在最简单的实施方式中，CID系统使用可穿透脂质的免疫抑制药物的二聚类似物，FK506，其丧失其正常生物活性而获得交联遗传融合FK506-结合蛋白质(FKBP12)的分子的能力。通过将一种或多种FKBP和豆蔻酰化序列与靶受体的胞质信号结构域融合，可以依赖二聚体药物但不依赖配体和胞外域的方式刺激信号转导。这给系统提供了时间控制，使用单体药物类似物的可逆性和更高的特异性。第三代AP20187/AP1903CID对其结合结构域FKBP12的高亲和性允许重组受体体内特异活化而不会诱导发生内源FKBP12的非特异性副作用。可使用具有氨基酸取代和缺失的FKBP12变体，例如FKBP12v36，其结合二聚体药物。此外，合成的配体抵抗蛋白酶降解，使其比多数递送的蛋白质试剂能更有效地体内活化受体。
所用配体能结合两种或多种配体结合结构域。当嵌合信号分子含多于一种配体结合结构域时，其能结合多于一种配体。配体通常是化学品或非蛋白。示例的配体包括但不限于二聚化FK506(如FK1012)。
其他配体结合区域可为例如二聚化区域或具有摆动取代的修饰的配体结合区域，例如FKBP12(V36)：F36取代为V的人kDaFK506结合蛋白(完整成熟编码序列(氨基酸1-107))为合成的二聚体药物AP1903提供结合位点(Jemal,A.等CACancerJ.Clinic.58,71-96(2008)；Scher,H.I.和Kelly,W.K.,JournalofClinicalOncology11,1566-72(1993))。蛋白质的两个随机拷贝还可用在构建体中，从而高级寡聚物在被AP1903交联后被诱导。
F36V’-FKBP:F36V’-FKBP是密码子摆动形式的F36V-FKBP。其编码与F36V-FKPB相同的多肽序列，但在核苷酸水平仅62％同源。
设计F36V’-FKBP用于降低逆转录病毒载体的重组(Schellhammer,P.F.等J.Urol.157,1731-5(1997))。F36V’-FKBP通过PCR组装程序构建。转基因包含一拷贝的F36V’-FKBP，其直接连接一拷贝的F36V-FKBP。
在一些实施方式中，所述配体是小分子。可选择针对所选配体结合区域合适的配体。通常，配体是二聚化的，有时配体是二聚化FK506或二聚化FK506类似物。在一些实施方式中，配体是AP1903(CAS目录名:2-哌啶羧酸,1-[(2S)-1-氧代-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁基]-,1,2-乙烷二基双[亚氨基(2-氧代-2,1-乙烷二基)氧-3,1-亚苯基[(1R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)亚丙基]]酯,[2S-[1(R*),2R*[S*[S*[1(R*),2R*]]]]]-(9CI)CAS注册号:195514-63-7；分子式:C78H98N4O20分子量:1411.65)。在某些实施方式中，配体是AP20187。在某些实施方式中，配体是AP20187类似物，例如AP1510。在一些实施方式中，某些类似物适于FKBP12，而某些类似物适于FKBP12的摆动形式。在某些实施方式中，嵌合蛋白质中包含一种配体结合区域。在其他实施方式中，包括两种或更多配体结合区域。例如配体结合区域为FKBP12时，且包括这些区域中的两种时，一种(例如)可为摆动形式。
考虑的其他二聚化系统包括香豆霉素/DNA促旋酶B系统。香豆霉素诱导的二聚化激活修饰的Raf蛋白质并刺激MAP激酶级联。参见Farrar等1996.
膜靶向
提供用于转运嵌合蛋白至细胞表面膜的膜靶向序列，其中相同或其他序列可编码嵌合蛋白和细胞表面膜的结合。关联细胞膜的分子含便于膜关联的某些区域，且此类区域可纳入到嵌合蛋白分子中以生成膜靶向分子。例如，一些蛋白质在N端或C末端含酰化序列，且这些酰基部分便于膜的关联。此类序列由酰基转移酶识别且通常符合特定序列基序。某些酰化基序能用单一酰基部分修饰(常跟有数个正电荷残基(如人c-Src:M-G-S-N-K-S-K-P-K-D-A-S-Q-R-R-R)以改善阴离子脂质头部基团)且其他能用多重酰基部分修饰。例如蛋白酪氨酸激酶Src的N端序列可包含单一肉豆蔻酰部分。双酰化区域位于某些蛋白激酶的N末端区域内，例如Src家族成员(如Yes,Fyn,Lck)的亚组和G蛋白α亚基。该双酰化区域常位于所述蛋白的前18个氨基酸内，且符合序列基序Met-Gly-Cys-Xaa-Cys，当Met被切割，Gly被N酰化且Cys残基之一被S酰化。Gly常被肉豆蔻酰化且Cys可被棕榈酰化。还可利用来自G蛋白γ亚基的C末端和其他蛋白质(如网址 ebi.ac.uk/interpro/DisplayIproEntry？ac＝IPR001230)的与序列基序Cys-Ala-Ala-Xaa(所谓“CAAX盒”)一致的酰化区域(可用C15或C10异戊烯基部分进行修饰)。这些和其他酰化基序包括例如Gauthier-Campbell等MolecularBiologyoftheCell15:2205-2217(2004)；Glabati等Biochem.J.303:697-700(1994)和Zlakine等J.CellScience110:673-679(1997)所述的那些，其可纳入嵌合分子以诱导膜定位。在某些实施方式中，来自含酰化基序的蛋白质的未处理序列可被纳入嵌合蛋白中。例如，在一些实施方式中，Lck,Fyn或Yes或G-蛋白α亚基的N端部分，例如该蛋白质的前25个N端氨基酸或更少氨基酸(如含任选突变的未处理序列的约5-约20氨基酸、约10-约19氨基酸、或约15-约19氨基酸)可纳入嵌合蛋白质的N端序列。在某些实施方式中，来自G蛋白γ亚基的含CAAX盒基序序列的约25个氨基酸或更少氨基酸的C末端序列(如含任选突变的未处理序列的约5-约20氨基酸、约10-约18氨基酸或约15-约18氨基酸)可连接至嵌合蛋白质的C末端。
在一些实施方式中，酰基部分的logp值为+1至+6，有时logp值为+3至+4.5。Logp值是疏水性的量度，通常源自辛醇/水分配研究，其中较高疏水性分子以更高频率分配至辛醇，且特征为具有更高logp值。logp值公布为亲酯分子的数量，且logp值可用已知分配过程计算(如ChemicalReviews,Vol.71,6期,599页,进入4493显示的月桂酸具有4.2的logp值)。任何酰基部分可连接至上述肽组分且就抗微生物活性使用已知方法和下述方法进行测试。酰基部分有时例如C1-C20烷基、C2-C20烯基、C2-C20炔基、C3-C6环烷基、C1-C4卤代烷基、C4-C12环烷基烷基、酰基、取代的酰基或酰基(C1-C4)烷基。有时任何含酰基部分为脂肪酸，脂肪酸部分的示例为丙基(C3)、丁基(C4)、戊基(C5)、己基(C6)、庚基(C7)、辛基(C8)、壬基(C9)、癸基(C10)、十一烷基(C11)、月桂基(C12)、肉豆蔻基(C14)、十六烷基(C16)、硬脂基(C18)、二十烷基(C20)、二十二烷基(C22)和二十四烷基部分(C24)，各部分可包含0、1、2、3、4、5、6、7或8个不饱和性(即双键)。酰基部分有时是脂质分子，例如磷脂酰脂(如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱)、鞘脂(例如，鞘磷脂、鞘氨醇、神经酰胺、神经节苷脂、脑苷)或其修饰形式。在某些实施方式中，1、2、3、4、5或更多中酰基部分连接至膜关联区域。
本文所述嵌合蛋白质还包括单次或多次跨膜序列(例如嵌合蛋白质的N末端 或C末端处)。单次跨膜区域发现于某些CD分子、酪氨酸激酶受体、丝氨酸/苏氨酸激酶受体、TGFβ、BMP、激活素和磷酸酶。单次跨膜区域常包括信号肽区域和约20-约25氨基酸的跨膜区域，其多数为疏水氨基酸且可形成α螺旋。正电荷氨基酸的短示踪常位于跨膜区之后以锚定蛋白质于膜上。多次跨膜蛋白质包括离子泵、离子通道和跨膜体，且包括多次跨越膜的两个或更多螺旋。所有或基本所有多次跨膜蛋白有时纳入到嵌合蛋白中。单次和多次跨膜区域的序列已知，且可经选择以纳入嵌合蛋白质分子中。
可使用在宿主中有功能的任何膜靶向序列，且其可与或可不与嵌合蛋白的其他结构域之一关联。在一些实施方式中，该序列包括但不限于豆蔻酰化-靶向序列、棕榈酰化-靶向序列、异戊二烯化序列(即法尼基化、牻牛儿酸化、CAAX盒)、蛋白质-蛋白质相互作用基序或来自受体的跨膜序列(采用信号肽)。示例包括例如KloosterJP等,BiologyoftheCell(2007)99,1-12,Vincent,S.,等NatureBiotechnology21:936-40,1098(2003)所述的那些。
存在可提高蛋白质在各种膜上的保持性的其他蛋白质结构域。例如，约120氨基酸普列克底物蛋白同源(PH)结构域发现于超过200个人蛋白质，其通常涉及胞内信号通路。PH结构域可结合膜内各种磷脂酰肌醇(PI)脂质(如PI(3,4,5)-P3,PI(3,4)-P2,PI(4,5)-P2)且因此在招募蛋白质至不同膜或细胞隔室中其关键作用。通常PI脂质的磷酸化状态经条件，例如通过PI-3激酶或PTEN，因此膜与PH结构域的相互作用不如酰基脂质稳定。
AP1903API通过奥佛拉研究公司(AlphoraResearchInc.)生产，用于注射的AP1903药物产品由AAI制药服务公司(AAIPharmaServicesCorp.)制备。其配制为AP1903在非离子增溶剂SolutolHS15(250mg/mL,BASF)的25％溶液中的5mg/mL溶液。室温下该制剂为清澈溶液。冷冻后，制剂在延长的存储期中经过可逆相变换，形成牛奶状溶液。该相转变在升温至时候后回复。在10mL玻璃瓶中填充8mL(每瓶总计约40mgAP1903用于注射)。
为了使用，AP1903升至室温并在应用前稀释。超过50kg的对象，AP1903通过静脉内输注以100mL磷酸盐中稀释40mg的剂量给药2小时，速率为每小时50mL，使用无DEHP盐水袋和溶液组。低于50kg对象接受0.4mg/kgAP1903。
所有研究用药保持在2℃-8℃之间，避免光照和过热，储存在封闭区域严格限制接触。
确定需要给予AP1903并活化治疗性T细胞(例如嵌合抗原受体和诱导型嵌合信号分子-表达T细胞)后，患者可例如给予单一固定剂量的注射用AP1903(0.4mg/kg)，通过静脉输注2小时，使用无DEHP、无环氧乙烷灭菌输注设备。AP1903剂量对所有患者单独计算，且除非体重变动≥10％否则不再计算。输注前将计算的剂量在100mL0.9％标准盐水中稀释。
在AP1903的先前I期研究中，24个健康志愿者用单剂量的注射用AP1903以0.01,0.05,0.1,0.5和1.0mg/kg的剂量水平静脉输注2小时。AP1903血浆水平与剂量成正比，在0.01–1.0mg/kg剂量范围中平均C最大值为约10–1275ng/mL。初始输注期后，血液浓度显示出快速分配期，血浆水平在剂量后0.5,2和10小时分别下降至最大浓度的约18,7,和1％。注射用AP1903显示出较安全且在所有剂量水平都良好耐受，表明良好的药代动力学概况。IuliucciJD,等JClinPharmacol.41:870-9,2001.
例如注射的AP1903的固定剂量可为0.4mg/kg静脉输注2小时。细胞有效信号传导的体外所需AP1903量为约10–100nM(MW:1412Da)。这等于14–140μg/L或～0.014–0.14mg/kg(1.4–140μg/kg)。该剂量与申请不同，且在某些示例中可更高，在0.1-10nM的范围，或50-150nM、10-200nM、75-125nM、100-500nM、100-600nM、100-700nM、100-800nM或100-900nM的范围。如上所述多至1mg/kg的AP1903剂量在I期研究中良好耐受。
选择性标志物
在某些实施方式中，表达构建体包含核酸构建体，其体外或体内表达通过包 含在表达构建体中的标志物鉴定。此类标志物赋予细胞可鉴定的改变，使得可以容易地鉴定含表达构建体的细胞。通常，药物选择标志物的纳入能协助克隆和选择转化体。例如，对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、叶酸、GPT、博莱霉素和组氨醇有抗性的基因是有用的选择性标志物。或者，使用酶例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)。还可使用含所述胞外、非信号传导结构域或各种蛋白质(如CD34,CD19,LNGFR)的免疫表面标志物，提供了磁性或荧光抗体介导的分选的直接简单的方法。所用选择性标志物并不被认为是重要的，只要其能与编码基因产物的基因同时表达即可。选择性标志物的其他示例包括例如受体如GFP、EGFP、β-gal或氯霉素乙酰基转移酶。在某些实施方式中，标志物蛋白例如CD19用于选择(例如在免疫磁性选择中)输注用的细胞。
控制区域
1.启动子
据信，用于控制感兴趣的多核苷酸表达的特定启动子并不重要，只要其能引导多核苷酸在靶细胞中表达即可。因此，靶向人类细胞时，多核苷酸序列编码区域可例如位于启动子附近并在其控制下，所述启动子能在人类细胞中表达。通常，该启动子可包括人或病毒启动子。
在各种实施方式中，人巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、SV40早期启动子、劳氏肉瘤病毒长末端重复、β-肌动蛋白、大鼠胰岛素启动子和油醛-3-磷酸脱氢酶可用于获得高水平表达的感兴趣编码序列。还考虑使用本领域熟知的其他病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子以实现感兴趣的编码序列的表达，限制条件是，表达水平满足给定的目标。通过使用具有已知特性的启动子，可最优化转染或转化后感兴趣的蛋白质的表达水平和模式。
选择响应特定生理或合成信号而调控的启动子可进行基因产物的诱导型表达。例如在转基因表达(采用多顺反子载体时)对生产该载体的细胞具有毒性时，需要组织或降低一种或多种转基因的表达。对生产细胞系(producercellline)有毒 的转基因的示例为促凋亡和细胞因子基因。数个诱导型启动子细胞可用于生产转基因产物有毒的病毒载体(加入更多诱导型启动子)。
蜕皮激素受体系统(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Invitrogen,Carlsbad,CA))是一种此类系统。该系统经设计以在哺乳动物中对感兴趣的基因表达进行调控。其由严格调控表达的机制组成，实际允许转基因的无基底水平表达，但允许超过200倍的诱导率。该系统基于果蝇的异二聚体蜕皮激素受体，当蜕皮激素或类似物例如莫瑞甾酮A结合该受体时，该受体激活启动子以打开下游转基因的表达，实现高水平mRNA转录。该系统中，异源二聚化受体的两个单体从一种载体组成型表达，而驱动感兴趣基因表达的蜕皮激素响应启动子在另一质粒上。因此将该类系统工程改造入感兴趣的基因转移载体中会有用。然后将含感兴趣基因的质粒和受体单体共转染如生产者细胞系可允许产生基因转移载体而不会表达潜在毒性转基因。转基因的表达可通过蜕皮激素或莫瑞甾酮A在合适的时间激活。
其他可用的诱导型系统为Tet-OffTM或Tet-OnTM系统(Clontech,PaloAlto,CA)，由Gossen和Bujard最初开发(Gossen和Bujard,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551,1992；Gossen等Science,268:1766-1769,1995)。该系统还允许响应四环素或四环素衍生物如多西环素而调控高水平的基因表达。Tet-OnTM系统中，存在多西环素时打开基因表达，而Tet-OffTM系统中，不存在多西环素时打开基因表达。这些系统基于源自大肠杆菌的四环素抗性操纵子的两个调控元件。四环素抑制子结合的四环素操纵子序列，和四环素抑制子蛋白质。感兴趣的基因克隆入质粒位于启动子之后，其中存在四环素响应元件。第二质粒包含称为四环素控制的反式激活子的调控元件，其在Tet-OffTM系统中由源自单纯疱疹病毒的VP16结构域和野生型四环素抑制子组成。没有多西环素时，转录组成型启动。Tet-OnTM系统中，四环素抑制子为非野生型，其在存在多西环素时激活转录。为了生产基因治疗载体，可使用Tet-OffTM系统，从而生产细胞可在存在四环素或多西环素时生长，并阻止潜在毒性基因的表达，但当载体引入患者时，基因表达则组成型开启。
在一些环境中，需要调控基因治疗载体中的转基因表达。例如，具有各种活性强度的不同病毒启动子基于所需表达水平而使用。在哺乳动物细胞中，CMV立 刻早期启动子常用于提供强转录活化。CMV启动子参见Donnelly,J.J.,等1997.Annu.Rev.Immunol.15:617-48。当需要较低水平的转基因表达时，也可使用功效较弱的修饰形式的CMV启动子。需要在造血干细胞中表达转基因时，常使用逆转录启动子例如MLV或MMTV的LTR。可基于所需效果使用的其他病毒启动子包括SV40、RSVLTR、HIV-1和HIV-2LTR、腺病毒启动子例如来自E1A、E2A或MLP区域、AAVLTR、HSV-TK、和禽肉瘤病毒。
在其他示例中，可选择受发育调控且在特定分化细胞中活化的启动子。因此，例如，启动子可不在多潜能干细胞中活化，但例如当多潜能干细胞分化为更成熟细胞，启动子则可被活化。
相似的组织特异性启动子用于在特定组织或细胞中有效转录，从而降低对非靶向组织的潜在毒性和不想要的作用。这些启动子的表达相对强启动子例如CMV启动子可能降低，但可形成更有限的表达和免疫原性。(Bojak,A.,等2002.Vaccine20:1975-79；Cazeaux.,N.,等2002.Vaccine20:3322-31).例如，合适时可使用组织特异启动子例如PSA关联启动子或前列腺特异性腺体激肽释放酶或肌肉肌氨酸激酶基因。
合适的组织特异或分化特异启动子的示例包括但不限于：B29(B细胞)；CD14(单核细胞)；CD43(白细胞和血小板)；CD45(造血细胞)；CD68(巨噬细胞)；结蛋白(肌肉)；弹性蛋白酶-1(胰腺腺泡细胞)；内皮因子(endoglin)(内皮细胞)；纤维连接蛋白(分化细胞，愈合组织)；和Flt-1(内皮细胞)；GFAP(星形细胞)。
在某些指示中，需要在给予基因治疗载体后的特定时间或活化转录。这通过激素或细胞因子可调控的启动子实现。可用的细胞因子和炎症蛋白响应启动子包括K和T激肽原(Kageyama等(1987)J.Biol.Chem.,262,2345-2351)、c-fos、TNF-α、C-反应蛋白(Arcone,等(1988)Nucl.AcidsRes.,16(8),3195-3207)、触珠蛋白(Oliviero等(1987)EMBOJ.,6,1905-1912)、血清淀粉样蛋白A2、C/EBPα、IL-1、IL-6(Poli和Cortese,(1989)Proc.Nat'lAcad.Sci.USA,86,8202-8206)、ComplementC3(Wilson等(1990)Mol.Cell.Biol.,6181-6191)、IL-8、α-1酸糖蛋白(Prowse和 Baumann,(1988)MolCellBiol,8,42-51)、α-1抗胰蛋白酶蛋白、脂蛋白脂肪酶(Zechner等Mol.Cell.Biol.,2394-2401,1988)、血管紧张素原(Ron,等(1991)Mol.Cell.Biol.,2887-2895)、纤维蛋白原、c-jun(可通过佛波酯、TNF-α、UV辐射、视黄酸和过氧化氢诱导)、胶原酶(佛波酯和视黄酸诱导)、金属硫蛋白(重金属和糖皮质激素诱导型)、间质溶解素(可通过佛波酯、干扰素-1和EGF诱导)、α-2巨球蛋白和α-1抗-糜蛋白酶。其他启动子包括例如SV40、MMTV、人免疫缺陷病毒(MV)、莫罗尼病毒、ALV、EB病毒、劳氏肉瘤病毒、人肌动蛋白、肌球蛋白、血红蛋白和肌酸。
考虑任何上述启动子单独或与另一组合可基于所需作用而使用。启动子和其他调控元件经选择从而其在所需细胞或组织中有功能。此外，启动子的列表不应理解为穷尽或限制；本文公开与该启动子联合使用的其他启动子和方法。
2.增强子
增强子是增强位于相同DNA分子的远端位置的启动子转录的基因元件。早期示例包括关联免疫球蛋白和T细胞受体的增强子，二者均侧接数个编码序列且均发生在数个内含子中。许多病毒启动子例如CMV、SV40和逆转录病毒LTR与增强子活性紧密关联且常以类似单一元件的形式处理。增强子更类似启动子进行组织。即其由许多单独元件组成，各元件结合一种或两种转录蛋白质。增强子和启动子的基本区别在于操作上。增强子区域整体刺激远处转录，通常不依赖方向；而启动子或其他组件并非如此。另一方面，启动子在特定位置具有以特定方向直接启动RNA合成的一种或多种元件，而增强子没有这些特异性。启动子和增强子常重叠或连续，通常具有非常相似的模块化组织。增强子亚组包括基因座控制区域(LCR)，其不仅提高转录活性，还可(连同绝缘子元件)在整合入基因组时协助转录元件与相邻序列隔离。
可用任何启动子/增强子组合(按照真核启动子数据库EPDB)以驱动基因表达，虽然需对会将表达限制在特定组织类型或组织亚组中。(参见例如Kutzler,M.A.,和Weiner,D.B.,2008.NatureReviewsGenetics9:776-88)。示例包括但不限于来自人肌动蛋白、肌球蛋白、血红蛋白、肌肉肌氨酸激酶、序列的增强子以 及来自病毒CMV、RSV和EBV的增强子。可选择合适的增强子用于特定应用。如果以递送复合物的部分或额外的基因表达构建体提供合适的细菌聚合酶，真核细胞可支持来自特定细菌启动子的胞质转录。
3.聚腺苷酸化信号
使用cDNA插入时，通常希望包括多聚腺苷酸化信号以实现基因转录本的适当多聚腺苷酸化。多聚腺苷酸化信号的性质据信对本方法的成功实施并非关键，且任何此类序列均可使用，例如人或牛生长激素和SV40多聚腺苷酸化信号和LTR多聚腺苷酸化信号。一种非限制性示例是pCEP3质粒中存在的SV40多聚腺苷酸化信号(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)。还考虑用作表达盒的元件是终止子。这些元件可用于提高信使水平和最小化从所述盒向其他序列的通读。终止或聚(A)信号序列可例如位于mRNA3’末端的保守序列(AAUAAA)的下游约11-30核苷酸处。(Montgomery,D.L.,等1993.DNACellBiol.12:777-83；Kutzler,M.A.,和Weiner,D.B.,2008.NatureRev.Gen.9:776-88)。
4.起始信号和内部核糖体结合位点
编码序列的充分翻译也可能需要特异性启动信号。这些信号包括ATG起始密码子或相邻序列。可能需要提供外源性翻译控制信号，包括ATG启动密码子。该启动密码子与所需编码序列在同一阅读框内，以保证完整插入物的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可为天然或合成的。表达效率可以通过包括合适转录增强子元件等来增强。
在某些实施方式中，使用内部核糖体进入位点(IRES)元件来产生多基因，或多顺反子信使。IRES元件能绕开5’甲基化帽依赖的翻译的核糖体扫描模型，并在内部位置开始翻译(Pelletier和Sonenberg,Nature,334:320-325,1988)。来自小RNA病毒科的两种成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES已经讨论(Pelletier和Sonenberg,1988)以及来自哺乳动物信使的IRES(Macejak和Sarnow,Nature,353:90-94,1991)。IRES元件可连接至异源开放阅读框。多种开放阅读框可一起转 录，各由IRES分隔，形成多顺反子信使。通过IRES元件，核糖体可及各开发阅读框以有效翻译。使用单启动子/增强子来转录单信使可有效表达多重基因(参见美国专利号5,925,565和5,935,819，各通过引用纳入本文)。
序列优化
通过优化转基因中的密码子还可提供蛋白质产量。物种特异的密码子变化可用于提高蛋白质产量。而且，可优化密码子以生产优化的RNA，其可产生更有效的翻译。通过优化纳入RNA中的密码子，可移除诸如导致二级结构不稳定的元件、诸如抑制核糖体结合的二级mRNA结构、或可抑制mRNA核输出的隐蔽序列。(Kutzler,M.A.,和Weiner,D.B.,2008.NatureRev.Gen.9:776-88；Yan.,J.等2007.Mol.Ther.15:411-21；Cheung,Y.K.,等2004.Vaccine23:629-38；Narum.,D.L.,等2001.69:7250-55；Yadava,A.和Ockenhouse,C.F.,2003.Infect.Immun.71:4962-69；Smith.,J.M.,等2004.AIDSRes.Hum.Retroviruses20:1335-47；Zhou,W.,等2002.Vet.Microbiol.88:127-51；Wu,X.,等2004.Biochem.Biophys.Res.Commun.313:89-96；Zhang,W.,等2006.Biochem.Biophys.Res.Commun.349:69-78；Deml,L.A.,等2001.J.Virol.75:1099-11001；Schneider,R.M.,等1997.J.Virol.71:4892-4903；Wang,S.D.,等2006.Vaccine24:4531-40；zurMegede,J.,等2000.J.Virol.74:2628-2635).例如，FBP或其他多聚化区域多肽、共刺激多肽胞质信号区域和CD19序列可通过密码子改变而优化。
前导序列
可加入前导序列以增强mRNA的稳定性并获得更有效的翻译。前导序列通常参与靶向mRNA至内质网。示例包括HIV-1包被糖蛋白(Env)的信号序列(其延缓自身切割)，和IgE基因前导序列(Kutzler,M.A.,和Weiner,D.B.,2008.NatureRev.Gen.9:776-88；Li,V.,等2000.Virology272:417-28；Xu,Z.L.,等2001.Gene272:149-56；Malin,A.S.,等2000.MicrobesInfect.2:1677-85；Kutzler,M.A.,等2005.J.Immunol.175:112-125；Yang.,J.S.,等2002.Emerg.Infect.Dis. 8:1379-84；Kumar.,S.,等2006.DNACellBiol.25:383-92；Wang,S.,等2006.Vaccine24:4531-40)。IgE前导序列可用于增强向内质网的插入(Tepler,I,等(1989)J.Biol.Chem.264:5912)。
可通过选择合适的优化表达的方法来优化和/或控制转基因表达。这些方法包括例如优化启动子、递送方法和基因序列(例如下述文献所述：Laddy,D.J.,等2008.PLoS.ONE3e2517；Kutzler,M.A.,和Weiner,D.B.,2008.NatureRev.Gen.9:776-88)。
核酸
本文所用核酸通常指DNA、RNA或其包括核碱基的衍生物或类似物的分子(一条、两条或更多链)。核碱基包括例如天然产生的DNA(如腺嘌呤"A"、鸟嘌呤"G"、胸腺嘧啶"T"或胞嘧啶"C")或RNA(如A、G、尿嘧啶"U"或C)中的嘌呤或嘧啶碱基。术语“核酸”涵盖术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”，各为术语“核酸”的亚属。核酸长度可为至少、至多或约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000个核苷酸，或其可衍生的任何范围。
本文提供的核酸可具有与其他核酸相同或互补的区域。考虑互补或相同的区 域可为至少5个连续残基，虽然具体可考虑该区域为至少、至多、或约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000个连续核苷酸。
本文所用“杂交”、“杂交的”或“能杂交”表示形成双链或三链分子或具有部分双链或三链性质的分子。本文所用术语“退火”是“杂交”的同义词。“杂交”、“杂交的”或“能杂交”涵盖术语“严谨条件”或“高严谨”和术语“低严谨”或“低严谨条件”。
术语“严谨条件”或“高严谨”表示允许含互补序列的一条或多条核酸链之间或内部的杂交，但排除随机序列的杂交。严谨条件极少(若存在)允许核酸和靶链之间的错配。该条件已知且常用于需要高特异性的应用。非限制性应用包括分离核酸，例如其基因或核酸片段，或检测至少一种特异mRNA转录本或其核酸片段等。
严谨条件可包括低盐和/或高温条件，例如通过约42℃-约70℃时约0.02M–约0.5MNaCl所提供的条件。应理解所需严谨性的温度和离子强度部分由下述决定：特定核酸长度、靶序列的长度和核碱基含量、核酸电荷组成、和杂交环境中甲酰胺、四甲基氯化铵或其他溶剂的存在或浓度。
应理解杂交的这些范围、组成和条件以非限制性示例的方式描述，特定杂交反应所需的严谨性通常通过比较一种或多种阳性或阴性对照根据经验确定。根据所 考虑的应用，可使用各种杂交条件以实现核酸向靶序列的各种程度的敏感性。在非限制性示例中，在严谨条件下不与核酸杂交的相关靶核酸的鉴定或分离可通过低温和/或高离子强度的杂交来实现。该条件称为“低严谨性”或“低严谨条件”，其非限制性示例包括如下进行的杂交：约20℃-约50℃下约0.15M–约0.9MNaCl。可进一步修改所述低或高严谨条件以适合特定应用。
“功能保守突变体”是给定的氨基酸残基发生变化而不改变蛋白质或酶的总体构型和功能的蛋白质或酶，包括但不限于相似性质的氨基酸置换，所述性质包括极性或非极性特征、尺寸、形状和电荷。对于许多常见已知非遗传性编码氨基酸的保守氨基酸取代本领域已知。其他非编码氨基酸的保守取代可基于其物理性质与遗传上编码的氨基酸的性质的比较来确定。
除了那些视为保守的氨基酸以外的氨基酸可在蛋白质或酶中不同，从而具有相似功能的任何两种蛋白质之间的蛋白质或氨基酸序列的相似比例可不同且可(例如)至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、更优选至少95％，这根据比对方案来确定。本文所用术语“序列相似性”表示核苷酸或蛋白质序列相关的程度。两个序列之间的相似程度可基于序列相同性和/或保守型百分比。本文所用术语“序列相同性”表示两种核苷酸或氨基酸序列为非变异的程度。本文所用术语“序列比对”表示将两个或更多序列并列以实现最大水平相同性(以及氨基酸序列的情况中的保守型)的过程，其目的是评估相似性程度。比对序列和评估相似性/相同性的大量方法本领域已知，例如ClusterMethod，其中所述相似性基于MEGALIGN算法，以及BLASTN、BLASTP和FASTA。当使用任何这些程序时，优选的设置是得到最高序列相似性的设置。
核酸修饰
下述任何修饰可用于核酸。修饰的示例包括RNA或DNA主链、糖基或碱基的改变，及其各种组合。核酸中任何合适数量的主链连接、糖和/或碱基均可修饰(例如独立地约％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％多至100％)未修饰的核苷为连 接至β-D-核糖-呋喃糖的1'碳上的碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶中任一。
修饰的碱基为除了1'位置处的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶以外的核苷酸碱基。修饰碱基的非限制性示例包括肌苷、嘌呤，吡啶-4-酮，吡啶-2-酮、苯基，假尿嘧啶、2,4,6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶核苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如，胸腺嘧啶核糖核苷)、5-卤素尿苷(例如，5-溴尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(如6-甲基尿苷)、丙炔等。修饰碱基的其他非限制性示例包括硝基吡咯基(如3-硝基吡咯基),硝基吲哚基(如4-,5-,6-硝基吲哚基)、次黄嘌呤基、异肌苷酸基、2-氮杂-肌苷酸基、7-去氮-肌苷酸基、硝基咪唑基、硝基吡唑基、硝基苯并咪唑基、硝基吲唑基、氨基吲哚基、吡咯嘧啶基、二氟甲苯基、4-氟-6-甲基苯并咪唑、4-甲基苯并咪唑、3-甲基异羟喹啉基、5-甲基异羟喹啉基、3-甲基-7-丙炔基异羟喹啉基、7-氮杂吲哚基、6-甲基-7-氮杂吲哚基、咪唑并吡啶、9-甲基-咪唑并吡啶、吡咯并吡啶基、异羟喹啉基、7-丙炔基异羟喹啉基、丙炔基-7-氮杂吲哚基、2,4,5-三甲基苯基、4-甲基吲哚基、4,6-二甲基吲哚基、苯基、萘基、蒽基、苯乙酰基蒽(phenanthracenyl)、芘基、芪基、并四苯基、并五苯基等。
在一些实施方式中，例如，核酸可包括具有磷酸盐主链修饰的修饰的核酸分子。主链修饰的非限制性示例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、吗啉代、氨基甲酸酰胺、羧甲基、亚氨逐乙酸酯(acetamidate)、聚酰胺、磺酸盐、磺酰胺、氨基甲酸酯、甲缩醛(formacetal)、硫甲缩醛(thioformacetal)和/或烷基硅基修饰。在一些示例中，核苷中天然产生的核糖部分用己糖、多环杂烷基环、或环环己烯基替代。在某些情况中，己糖是阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖或其衍生物。己糖可为D己糖、葡萄糖或甘露糖。在某些示例中，多环杂烷基可为环中含一个氧原子的二环。在某些示例中，多环杂烷基为二环[2.2.1]庚烷、二环[3.2.1]辛烷或二环[3.3.1]壬烷。
硝基吡咯基和硝基吲哚基核碱基是称为通用碱基的化合物种类的成员。通用碱基是可替代四种天然碱基中任一的那些化合物，而不会显著影响寡核苷酸双链的 熔解性能或活性。与关联天然产生的核碱基的稳定化氢键相互作用不同，含3-硝基吡咯基核碱基的寡核苷酸双链可通过堆叠相互作用而单独稳定。使用硝基吡咯基核碱基而没有显著氢键相互作用避免了对特定互补碱基的特异性。此外，4-,5-和6-硝基吲哚基显示出对四种天然碱基非常弱的特异性。制备1-(2'-O-甲基-.β.-D-呋喃核糖基)-5-硝基吲哚的程序参见Gaubert,G.；Wengel,J.TetrahedronLetters2004,45,5629。其他通用碱基包括次黄嘌呤基、异肌苷酸基、2-氮杂-肌苷酸基、7-去氮杂-肌苷酸基、硝基咪唑基、硝基吡唑基、硝基苯并咪唑基、硝基吲唑基、氨基吲哚基、吡咯嘧啶基、和其结构衍生物。
二氟甲苯基是功能为通用碱基的非天然核碱基。二氟甲苯基是天然核碱基胸腺嘧啶的等构物。但与胸腺嘧啶不同，二氟甲苯基对任何天然碱基均没有明显的选择性。其他作为通用碱基的芳香化合物为4-氟-6-甲基苯并咪唑和4-甲基苯并咪唑。此外，相比仅含天然碱基的寡核苷酸序列，相对疏水的异羟喹啉基衍生物3-甲基异羟喹啉基、5-甲基异羟喹啉基、3-甲基-7-丙炔基异羟喹啉基是仅引起寡核苷酸双链稍稍不稳定的通用碱基。其他非天然核碱基包括7-氮杂吲哚基、6-甲基-7-氮杂吲哚基、咪唑并吡啶、9-甲基-咪唑并吡啶、吡咯并吡啶基、异羟喹啉基、7-丙炔基异羟喹啉基、丙炔基-7-氮杂吲哚基、2,4,5-三甲基苯基、4-甲基吲哚基、4,6-二甲基吲哚基、苯基、萘基、蒽基、苯乙酰基蒽(phenanthracenyl)、芘基、芪基、并四苯基、并五苯基和其结构类似物。二氟甲苯基、4-氟-6-甲基苯并咪唑、4-甲基苯并咪唑和上述其他非天然碱基的详述(包括合成方法)参见Schweitzer等J.Org.Chem.,59:7238-7242(1994)。
此外，化学替代物，例如交联剂可用于给反应添加额外的稳定性或不可逆性。交联剂的非限制性示例包括例如1,1-二(重氮乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如与4-叠氮水杨酸的酯、同源双功能亚氨酸酯，包括二琥珀酰亚胺酯如3,3′-二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)、双功能马来酰亚胺如双-N-马来酰亚胺-1,8-辛烷和试剂例如甲基-3-[(p-叠氮苯基)二硫]丙亚酰胺。
核苷酸类似物还可包括“锁定”核酸。某些组合物可用于主要“锚定”或“锁定”内源核酸至具体结构中。锚定核酸用于防止核酸复合物的解离，并因此不仅阻止复 制还可是使内源核酸的标记、修饰和/或克隆得以实现。锁定结构可调控基因表达(即移植或提高转录或复制)，或可用作可稳定结构，其可用于标记或修饰内源核酸序列，或可用于分离内源序列，即用于克隆。
核酸分子不限于仅含RNA或DNA的那些分子，还涵盖化学修饰的核苷酸和非核苷酸。非核苷酸或修饰的核苷酸的比例可为1％-100％(如约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95％)。
核酸制备
在一些实施方式中，提供核酸用作试验或例如治疗中的对照或标准。可通过任何本领域已知技术制备核酸，例如化学合成、酶生产或生物生产。核酸可从生物样品中回收或分离。可算可为重组的或其对于细胞来说可为天然或内源的(由该细胞基因组生产)。考虑生物样品可以提高小核酸分子回收率的方式进行处理。通常该方法涉及用具有胍和洗涤剂的溶液裂解细胞。
核酸合成还可根据标准方法进行。合成核酸的非限制性示例(如合成的寡核苷酸)，包括用磷酸三酯、亚磷酸酯，或亚磷酰胺化学法体外化学合成的核酸和固相技术或通过脱氧核苷三磷酸H-膦酸酯中间体。已公开各种不同核苷酸合成机制。
核酸可用已知技术分离。在具体实施方式中，可使用分离小核酸分子和/或分离RNA分子的方法。色谱是用于从蛋白质或从其他核酸分隔或分离核酸的方法。该方法可涉及凝胶基质电泳、过滤柱、醇沉淀和/或其他色谱。若待使用或评估来自细胞的核酸，方法通常涉及用离液剂(如异硫氰酸胍)和/或洗涤剂(如N-月桂酰肌氨酸)裂解细胞，然后实施分离具体RNA群的方法。
方法还可涉及使用有机溶剂和/或醇来分离核酸。在一些实施方式中，加入细胞裂解物的醇含量实现的醇浓度为约55％至60％。虽然可使用不同醇，乙醇较佳。固体支持物可为任何结构，其包括珠、滤器和柱，可包括用负电基团支持的材料或聚合物。玻璃纤维滤器或柱有效进行该分离程序。
核酸分离过程有时可包括：a)用含胍的裂解液裂解样品中的细胞，产生胍浓度为至少约1M的裂解物；b)用含酚的萃取溶液从裂解物中萃取核酸分子；c)在裂解物中加入醇溶液以形成裂解物/醇混合物，其中混合物中醇的浓度为约35％-约70％；d)将裂解物/醇混合物施加在固体支持物上；e)用离子溶液从固体支持物上洗脱核酸分子；和f)捕获所述核酸分子。样品可经干燥并在适合后续操作的液体和体积中重悬。
基因转移方法
为了介导细胞中转基因表达的效果，需要转移表达构建体至细胞中。该转移使用病毒或非病毒型基因转移方法。本部分提供基因转移方法和组合物的讨论。
通过将表达载体导入细胞来生成含表达载体的转化细胞。用于转化细胞器官、细胞、组织或生物体以与本发明方法一起使用的多核苷酸递送的合适方法实际包括可将多核苷酸(如DNA)引入细胞器官、细胞、组织或生物体的任何方法。
宿主细胞可用作，且已经用作载体的受主。宿主细胞可源自原核或真核细胞，取决于所需结果是载体的复制或载体编码的多核苷酸序列的部分或全部的表达。多种细胞系和培养物可用于宿主细胞，其可通过美国典型培养物保藏中心(ATCC)获取，该组织是活培养物和基因材料的档案库。
可确定合适的宿主。通常这基于载体主链和所需结果。例如可将质粒或粘粒导入原核宿主细胞用于复制许多载体。用作宿主细胞以进行载体复制和/或表达的细菌细胞包括DH5α、JM109和KC8，以及许多市售可得的细菌宿主例如![]()
感受态细胞和SOLOPACK金细胞(加利福尼亚州拉由拉市![]()
)。或者，细菌细胞例如大肠杆菌LE392可用于噬菌体病毒的宿主细胞。可用作宿主细胞的真核细胞包括但不限于昆虫和哺乳动物。用于载体复制和/或表达的哺乳动物真核宿主细胞的示例包括但不限于HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、COS、CHO、Saos和PC12。酵母株系的示例包括但不限于YPH499、YPH500和YPH501。
核酸疫苗可包括但不限于非病毒DNA载体，“裸”DNA和RNA和病毒载体。 用这些疫苗转化细胞的方法和用于优化疫苗中所含基因的表达的方法已知且如本文所述。
核酸或病毒载体转移方法的示例
任何合适方法可用于转移或转化细胞例如T细胞，或用于给予本方法的核苷酸序列或组合物。本文提供某些示例，并还包括例如用阳离子聚合物、脂质样分子和某些市售产物例如IN-VIVO-JETPEI进行递送的方法。
1.离体转化
可用各种方法在离体装置中转染从生物体重移出的血管细胞和组织。例如，犬内皮细胞已通过逆转录基因体外转移而遗传改变并移植到犬内(Wilson等Science,244:1344-1346,1989)。在另一个示例中，Yucatan迷你猪内皮细胞通过逆转录病毒体外转染并用双球囊导管移植入动脉(Nabel等Science,244(4910):1342-1344,1989)。因此，考虑细胞或组织可被移除并用本文所述的多核苷酸离体转染。在具体方面中，可将移植的细胞或组织放入生物体中。例如，动物的树突细胞，用表达载体转染该细胞然后将该转染或转化细胞给回所述动物。
2.注射
在某些实施方式中，抗原呈递细胞或核酸或病毒载体可通过一种或多种注射(即针头注射)给予细胞器官、细胞、组织或生物体，所述注射例如皮下、皮内、肌肉内、静脉内、前列腺内、腹膜内注射等。注射方法包括例如含盐水的组合物的注射。其他实施方式包括通过直接微注射将多核苷酸导入。所用表达载体的量可根据抗原的性质以及所用的细胞器官、细胞、组织或生物体而变化。
皮内、节点内或淋巴内注射是DC给药的一些更常用的方法。皮内注射通过向血流的低速率吸收和向淋巴系统的快速摄入来表征。真皮中存在大量朗格汉斯(Langerhans)树突细胞以及加工的抗原会直接转运至引流淋巴结。需要合适的位置制备以使其正确进行(即减去头发以观察合适的针头位置)。节点内注射可实现 抗原直接递送至淋巴组织。淋巴内注射允许直接给予DC。
3.电穿孔
在某些实施方式中，多核苷酸通过电穿孔引入细胞器官、细胞、组织或生物体。电穿孔涉及细胞和DNA悬液暴露至高压放电。本发明一些变体中，某些细胞壁降解酶例如果胶降解酶用于使靶受体细胞相比未处理细胞更易通过电穿孔转化(美国专利号5,384,253，其通过引用纳入本文)。
通过电穿孔转染真核细胞非常成功。通过该方法，小鼠前B淋巴细胞已用人κ-免疫球蛋白基因转染(Potter等(1984)Proc.Nat'lAcad.Sci.USA,81,7161-7165)，且大鼠肝实质细胞已用氯霉素乙酰基转移酶基因转染(Tur-Kaspa等(1986)Mol.CellBiol.,6,716-718)。
疫苗或eVac的体内电穿孔临床上通过简单注射技术实施。编码肿瘤抗原的DNA载体皮内注射给患者。然后电极将电脉冲施加在皮内空间，引起该处细胞(尤其是留存的树突细胞)摄取DNA载体并表达编码的肿瘤抗原。这些肿瘤抗原表达树突细胞通过局部炎症活化，然后可转移至淋巴结，呈递肿瘤抗原并初免肿瘤抗原特异性T细胞。当用在(例如但不限于)注射核酸或其他方式给予核酸后用电穿孔给予核酸时(所述核酸可通过电穿孔递送至细胞)，其通过电穿孔给予。
电穿孔方法在(例如)Sardesai,N.Y.,和Weiner,D.B.,CurrentOpinioninImmunotherapy23:421-9(2011)和Ferraro,B.等HumanVaccines7:120-127(2011)中描述，其通过引用全文纳入本文。
4.磷酸钙
在其他实施方式中，多核苷酸用磷酸钙沉淀法引入细胞。人KB细胞已用该技术通过腺病毒5DNA(Graham和vanderEb,(1973)Virology,52,456-467)进行转染。同样用该方法，小鼠L(A9)、小鼠C127、CHO、CV-1、BHK、NIH3T3和 HeLa细胞用新霉素标志物基因转染(Chen和Okayama,Mol.CellBiol.,7(8):2745-2752,1987)，且大鼠肝实质细胞通过各种标记基因转染(Rippe等Mol.CellBiol.,10:689-695,1990)。
5.DEAE-右旋糖苷
在另一实施方式中，多核苷酸用DEAE-右旋糖酐然后用聚乙二醇递送至细胞。该方法中，报告质粒引入小鼠骨髓瘤和红白血病细胞(Gopal,T.V.,MolCellBiol.1985May；5(5):1188-90)。
6.超声加载
其他实施方式包括通过直接超声加载将多核苷酸导入。LTK-成纤维细胞已通过超声加载用胸苷激酶基因转染(Fechheimer等(1987)Proc.Nat'lAcad.Sci.USA,84,8463-8467)。
7.脂质体介导的转染
其他实施方式中，多核苷酸可包埋在脂质复合物中例如脂质体。脂质体是水泡性结构，特征为磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有水性介质隔开的多重脂质层。当磷脂悬浮在过量水溶液中时其自动形成。脂质组分经过自重排列，然后形成紧密结构并将水包埋在内，并溶解脂双层之间的溶质(Ghosh和Bachhawat,(1991)载于：肝脏疾病、采用特异性受体和配体的靶向诊断与治疗(LiverDiseases,TargetedDiagnosisandTherapyUsingSpecificReceptorsandLigands).87-104页)。还考虑用Lipofectamine(GibcoBRL公司)或Superfect(凯杰公司)复合的多核苷酸。
8.受体介导的转染
此外，多核苷酸可通过受体介导的递送载剂递送至靶细胞。这通过靶细胞中 发生的受体介导的内吞作用利用大分子的选择性摄取。考虑各种受体的细胞类型特异分布，该递送方法增加另一程度的特异性。
某些受体介导的基因靶向载剂包含细胞受体特异性配体和多核苷酸结合剂。其他包括细胞受体特异性配体，待递送的多核苷酸以可操作地与之结合。数种配体以用作受体介导的基因转移(Wu和Wu,(1987)J.Biol.Chem.,262,4429-4432；Wagner等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87(9):3410-3414,1990；Perales等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:4086-4090,1994；Myers,EPO0273085)，其建立了该技术的可操作性。已讨论任何哺乳细胞类型的环境中的特异递送(Wu和Wu,Adv.DrugDeliveryRev.,12:159-167,1993；其通过引用纳入本文)。在某些方面，选择配体以对应靶细胞群上表达的受体特异性。
在其他实施方式中，细胞特异的多核苷酸靶向载剂的多核苷酸递送载剂组分可包括与脂质体组合的特异结合配体。待递送的多核苷酸包埋在脂质体中且特异结合配体功能性纳入到脂质体膜中。该脂质体因此特异结合靶细胞的受体并递送该内容至细胞。已表明此类系统在(例如)表皮生长因子(EGF)用在受体介导的多核苷酸向细胞的递送中的系统中有功能，所述细胞表现出EGF受体下调。
在其他实施方式中，靶递送载剂的多核苷酸递送载剂组分可为脂质体自身，其可例如包含直接细胞特异性结合的一种或多种脂质或糖蛋白。例如，乳糖基(lactosyl)-神经酰胺、半乳糖-末端无唾液酸神经节苷脂已被纳入脂质体中并观察到肝实质细胞对胰岛素基因摄取的增加(Nicolau等(1987)MethodsEnzymol.,149,157-176)。考虑细胞特异性转化构建体可用类似方式特异递送至靶细胞内。
9.微粒轰击
微粒轰击技术可用于将多核苷酸导入至少一种细胞器官、细胞、组织或生物体内(美国专利号5,550,318；美国专利号5,538,880；美国专利号5,610,042；和PCT申请WO94/09699；各通过引用纳入本文)。该方法基于将DNA包被微粒加速至高速的能力以，使其穿透细胞膜并进入细胞而不杀死细胞(Klein等(1987)Nature,327,70-73)。本领域已知各种微粒轰击技术，许多可用于本方法。
该微粒轰击中，一种或多种颗粒可包被有至少一种多核苷酸并通过推入力将 其递送至细胞。已开发加速小颗粒的数种装置。一种该装置依赖高压放电以产生电流，继而提供原动力(Yang等(1990)Proc.Nat'lAcad.Sci.USA,87,9568-9572)。所用微颗粒由生物惰性物质组成，例如钨或金颗粒或珠。示例性颗粒包括由钨、铂、和(某些示例中)金组成的颗粒，包括例如纳米颗粒。考虑一些情况中，DNA沉积在金属颗粒上不需要用微粒轰击将DNA寄送至受体细胞。然而考虑颗粒可能含DNA而非用DNA包被。DNA包被颗粒可增加DNA通过颗粒轰击的递送水平，但并非必须。
病毒载体介导的转移的方法示例
本发明可使用适于将核苷酸序列或含核苷酸序列的组合物给予细胞或对象的任何病毒载体，从而所述细胞或对象中的细胞可表达该核苷酸序列编码的基因。在某些实施方式中转基因纳入到病毒颗粒中以介导基因向细胞的转移。通常，病毒会在生理条件下简单暴露于合适的宿主细胞，允许病毒的摄入。本方法优选使用各种病毒载体，如下所述。
1.腺病毒(Adenovirus)
腺病毒特别适用于基因转移载体，因为其适中的DNA基因组大小、容易操作、高效价、较宽的细胞范围和高感染型。约36kb病毒基因组由100-200碱基对(bp)的反向末端重复(ITR)所限定，其中含有病毒DNA复制和包装必须的顺式作用元件。含不同转录单元的基因组的早期(E)和晚期(L)区域由病毒复制的发生而分开。
E1区域(E1A和E1B)编码负责病毒基因组和少量细胞基因的转录调控的蛋白质。E2(E2A和E2B)区域的表达导致用于病毒DNA复制的蛋白质的合成。这些蛋白质参与DNA复制后期基因表达和宿主细胞关闭(Renan,M.J.(1990)RadiotherOncol.,19,197-218)。后期基因(L1、L2、L3、L4和L5)(包括主要的病毒衣壳蛋白)的生产仅在主要晚期启动子(MLP)提供的单一初级转录本的重要加工后表达。MLP(位于16.8图单元)在感染的晚期特别有效，从该启动子提供 的所有mRNA都具有5’三联引导(TL)序列，这使其有用于翻译。
为了就基因治疗对腺病毒进行优化，需要最大化携带能力，从而可包括大片段DNA。还非常需要降低某些腺病毒产物关联的毒性和免疫反应。某种程度上，两个目的是一致的，因为消除腺病毒基因作用于二者。通过实施本发明，可能实现这些目的，而保留治疗构建体相对简单的操作能力。
可发生DNA的较大置换，这是因为病毒DNA复制所需的顺式元件都位于线性病毒基因组任一端的反向末端重复(ITR)(100-200bp)中。含ITR's的质粒可在非缺陷型腺病毒存在下复制(Hay,R.T.,等JMolBiol.1984Jun5；175(4):493-510)。因此，腺病毒载体中包含这些元件可允许复制。
此外，病毒包封的包装信号位于病毒基因组左端处的194-385bp(0.5-1.1图定位单元)之间(Hearing等J.(1987)Virol.,67,2555-2558)。该信号模拟病毒噬菌体λDNA中蛋白质识别位点，其中靠近左端但位于粘性末端序列外侧的特定序列介导对将DNA插入头部结构所需的蛋白质的结合。Ad的E1取代载体已证明病毒基因组左端处的450bp(0-1.25图单元)片段能指导293细胞中的包装(Levrero等Gene,101:195-202,1991)。
之前已显示腺病毒基因组的某些区域可纳入哺乳动物细胞的基因组中，从而其编码的基因发生表达。这些细胞系能支持该细胞系编码的腺病毒功能中缺失的腺病毒载体的复制。还已报道复制缺陷型腺病毒载体由“辅助”载体互补，例如野生型病毒或条件缺陷型突变体。
复制缺陷型腺病毒载体可由辅助病毒反式互补。由于存在辅助病毒(需要提供复制功能)会污染任何制备，该发现本身并不允许对复制缺陷型载体的分离。因此，需要能为复制缺陷型载体的复制和/或包装加入特异性的其他元件。所述元件赋予腺病毒载体的包装功能。
已显示腺病毒载体的包装信号存在于常规腺病毒图谱的左端(Tibbetts等 (1977)Cell,12,243-249)。后续研究显示在基因组的E1A(194-358bp)区域存在缺失的突变体生长较差，即使是在补充了早期(E1A)功能的细胞系中亦是如此(Hearing和Shenk,(1983)J.Mol.Biol.167,809-822)。当补偿腺病毒DNA(0-353bp)重组入突变体的右端时，病毒正常包装。进一步的突变分析在到Ad5基因组的左端中鉴定到短、重复、位置依赖性元件。发现若基因组的任一端存在该重复的一拷贝，则足以有效包装，但当向Ad5DNA分子的内部移动时并非如此(Hearing等J.(1987)Virol.,67,2555-2558)。
通过使用突变形式的包装信号，可形成包装有不同效率的的辅助病毒。通常，突变是点突变或缺失。当具有低包装效率的辅助病毒在辅助细胞中生长时，所述病毒被包装(尽管相比野生型病毒其速率变低)，从而允许该辅助子增殖。然而，当这些辅助病毒与含野生型包装信号的病毒在细胞中一起生长时，野生型包装信号相比突变形式而被优先识别。给定有限量的包装因子时，含野生型信号的病毒与辅助病毒相比发生选择性包装。如果偏好性足够大，应可获得接近均一性的原种。
为了改善ADV构建体对具体组织或物种的趋向性，受体结合纤维序列常可在腺病毒分离物之间替换。腺病毒5中发现的例如柯萨奇腺病毒受体(CAR)配体可替代来自腺病毒35的CD46结合纤维序列，使得病毒具有对人造血细胞具有显著改善的结合亲和性。得到的假型摂病毒Ad5f35是数种临床开发的病毒分离物的基础。此外，存在各种生物化学方法以修饰纤维来使病毒重靶向至靶细胞，例如T细胞。这些方法包括使用双功能抗体(一端结合CAR配体，一端结合靶序列)，和纤维的代谢生物素化以允许其与个体的基于亲和素的嵌合配体相关联。或者，可将配体(如通过异双功能接头(如包含PEG)的抗CD205)结合至腺病毒颗粒。
2.逆转录病毒(Retrovirus)
逆转录病毒是一组单链RNA病毒，其特征是能够在被感染细胞中通过逆转录过程使其RNA变成双链DNA(Coffin,(1990)载于：《病毒学》(Virology)编辑，纽约雷文出版社(RavenPress)第1437-1500页)。然后，所得DNA作为原病毒稳定地整合入细胞染色体中并指导病毒蛋白的合成。整合导致接受的细胞及其后代中 保留了该病毒基因序列。逆转录病毒基因组含有三个基因gag,pol和env，它们分别编码衣壳蛋白、聚合酶和包膜成分。gag基因上游所发现的序列(称为Y)起着基因组包装进入毒粒的信号作用。在病毒基因组的5'和3'端有两个长末端重复序列(LTR)。它们含有强的启动子和增强子序列，并且也是整合入宿主细胞基因组所需的(Coffin,1990)。因此，例如，本文技术包括例如细胞，其中用于转导细胞的多核苷酸整合入细胞基因组中。
为了构建逆转录病毒载体，将编码启动子的核酸插入病毒基因组中代替某些病毒序列，产生复制缺陷型病毒。为了生产毒粒，构建一个含有gag,pol和env基因但没有LTR和psi组件的包装细胞系(Mann等(1983)Cell,33,153-159)。当将含有人cDNA以及逆转录病毒LTR和psi序列的重组质粒导入该细胞系(例如通过磷酸钙沉淀)中时，psi序列使得重组质粒的RNA转录物包装进入病毒颗粒，然后该病毒颗粒被分泌到培养基中(Nicolas,J.F.,和Rubenstein,J.L.R.,(1988)载于：《载体：分子克隆载体及其应用的调查》(Vectors:aSurveyofMolecularCloningVectorsandTheirUses)，Rodriquez和Denhardt编)。Nicolas和Rubenstein；Temin等(1986)载于：《基因传递》(GeneTransfer),Kucherlapati(编),纽约殷实出版社(PlenumPress),第149-188页；Mann等1983).然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选方法进行浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能感染各类细胞。然而，许多类型的逆转录病毒的整合和稳定表达需要宿主细胞的分裂(Paskind等(1975)Virology,67,242-248)。
基于通过向病毒包膜化学添加半乳糖残基对逆转录病毒进行的化学修饰开发了设计使逆转录病毒载体特异性靶向的新方法。该修饰能通过脱唾液酸糖蛋白受体来特异性感染细胞(如肝实质细胞)，这应当是所希望的。
设计了重组逆转录病毒靶向的不同方法，其中使用针对逆转录病毒包膜蛋白和特定细胞受体的生物素化抗体。用链亲和素通过生物素组分来连接抗体(Roux等(1989)Proc.Nat'lAcad.Sci.USA,86,9079-9083)。使用针对I类和II类主要组织相容性复合物抗原的抗体，用亲嗜性病毒在体外显示多种人细胞的感染，这些人细胞带有那些表面抗原(Roux等，1989)。
3.腺伴随病毒
AAV使用约4700碱基对的线性单链DNA。反向末端重复侧接所述基因组。基因组中存在两种基因，产生大量不同基因产物。第一种是帽基因，产生三种不同病毒体蛋白质(VP)，称为VP-1、VP-2和VP-3。第二种是rep基因，编码四种非结构蛋白质(NS)。一种或多种这些rep基因产物负责反式活化AAV转录。
AAV中三种启动子由其图单元中和基因组中的位置表示。它们从左至右为p5、p19和p40。转录产生六种转录本，两种在三个启动子处各自启动，其中各对之一发生拼接。源自图单元42-46的拼接位置对各转录本相同。四种非结构蛋白质看起来源自较长的转录本，三种病毒体蛋白全部产生自最小的转录本。
AAV不关联人的任何病理状态。有趣的是，为了有效复制，AAV需要病毒的“辅助”功能，所述病毒例如单纯疱疹病毒I和II、巨细胞病毒、伪狂犬病病毒和腺病毒。特征最佳的辅助病毒即为腺病毒，许多该病的“早期”功能显示出对AAV复制的协助。低水平表达AAVrep蛋白质据信能保持AAV结构表现受控，而辅助病毒感染被认为会移除这种限制。
AAV载体的末端重复可由限制性内切核酸酶消化AAV或质粒(例如p201，其含有修饰的AAV基因组(Samulski等J.Virol.,61:3096-3101(1987)))或通过其他方法而获得，所述其他方法包括但不限于基于已发表的AAV序列化学或酶合成末端重复。可通过例如缺失分析来确定行使功能(即稳定且位点特异的整合)所需的AAVITR的最小序列或部分。还可确定序列的可以耐受哪些微小修饰而保持末端重复引导稳定稳定且位点特异的整合的能力。
基于AAV的载体已被证明是安全且有效的体外基因递送载剂，并且这些载体经潜在离体和体内基因治疗中大量应用的临床前和临床阶段的开发和测试(Carter和Flotte,(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.,770；79-90；Chatteijee,等(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.,770,79-90；Ferrari等(1996)J.Virol.,70,3227-3234；Fisher等(1996)J.Virol.,70,520-532；Flotte等Proc.Nat'lAcad.Sci.USA,90,10613-10617,(1993)；Goodman等(1994),Blood,84,1492-1500；Kaplitt等(1994)Nat'lGenet.,8,148-153； Kaplitt,M.G.,等AnnThoracSurg.1996Dec；62(6):1669-76；Kessler等(1996)Proc.Nat'lAcad.Sci.USA,93,14082-14087；Koeberl等(1997)Proc.Nat'lAcad.Sci.USA,94,1426-1431；Mizukami等(1996)Virology,217,124-130)。
AAV介导的肺内有效基因转移和表达已步入囊肿性纤维化治疗的临床试验(CarterandFlotte,1995；Flotte等Proc.Nat'lAcad.Sci.USA,90,10613-10617,(1993))。相似地，通过AAV介导的基因递送抗肌萎缩基因至骨骼肌对肌肉萎缩症的治疗预期、酪氨酸羟化酶基因递送至大脑对帕金森病的治疗预期、因子IX基因递送至肝脏对B型血友病的治疗预期、以及可能地血管内皮生长因子递送至心脏对心肌梗塞的治疗预期，这些看起来均有希望，因为最近显示AAV介导的在这些器官中转基因非常有效(Fisher等(1996)J.Virol.,70,520-532；Flotte等1993；Kaplitt等1994；1996；Koeberl等1997；McCown等(1996)BrainRes.,713,99-107；Ping等(1996)Microcirculation,3,225-228；Xiao等(1996)J.Virol.,70,8098-8108)。
4.其他病毒载体
本发明中可采用其它病毒载体作为表达构建物。可采用从病毒如牛痘苗病毒(Ridgeway,(1988)载于：《载体：分子克隆载体及其应用的调查》(Vectors:Asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses)第467-492页；和Sugden,(1986)载于,《基因传递》(GeneTransfer)第117-148页；Coupar等Gene,68:1-10,1988)金丝雀痘病毒、以及疱疹病毒获得的载体。这些病毒在用于基因转移入不同哺乳动物细胞中提供了几个有利的特性。
构建物一旦被传递到细胞内，编码治疗性基因的核酸可定位于不同位置并表达。在某些实施方式中，编码治疗性基因的核酸可以稳定地整合入细胞基因组中。该整合可通过同源重组(基因替换)而在相互的位置和方向上，或是可以整合入随机 的非特异性的位置上(基因增加)。在其他实例中，核酸能以分离的DNA游离片段稳定地保持在细胞内。这种核酸片段或“附加体”编码的序列足以能维持于宿主细胞周期之外或与细胞同步进行复制。表达构建物怎样传递到细胞内、核酸保留在细胞内何处，这均取决于所采用的表达构建物的类型。
治疗疾病的方法
本发明还涵盖治疗或预防疾病的方法，其中所述给予(例如通过输注)所述细胞可能有益。
细胞例如T细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞、天然杀伤细胞、天然杀伤T细胞、或祖细胞例如造血干细胞、间充质基质细胞、干细胞、多潜能干细胞和胚胎干细胞可用作细胞治疗。所述细胞可来自供体或可为获自患者的细胞。所述细胞可例如用于再生从而例如替代疾病细胞的功能。所述细胞还可经修饰以表达异源基因从而生物试剂可递送至特定微环境例如疾病骨髓或转移性沉积物。间充质干细胞还可例如用于提供免疫抑制活性，且可用于治疗移植物抗宿主病和自体免疫紊乱。本发明提供的细胞包含安全开关，其在细胞治疗后治疗性细胞的活性需要提高或降低时有价值。例如表达嵌合抗原受体的T细胞提供给患者时，在一些情况中可能有副作用，例如脱靶毒性。停止给予配体会使治疗T细胞返回至非活性状态，保持低、非毒性水平表达。或者例如，治疗性细胞可用于减少肿瘤细胞或降低肿瘤大小，且可不再需要。该情况中，可停止给予配体，且所述治疗细胞不在被活化。若初始治疗后肿瘤细胞恢复或肿瘤大小增加，可再次给予配体，从而活化表达嵌合抗原受体的T细胞并再次治疗患者。
“治疗性细胞”表示用于细胞治疗的细胞，即给予对象以治疗或预防病症或疾病的细胞。
术语“单位剂量”涉及接种量，表示适于哺乳动物的单一剂量的物理离散单元，各单元含预定量的药物组合物，其经计算以关联所需稀释度来产生所需免疫刺激效果。接种量的单位剂量的说明基于药物组合物和待实现的特定免疫效果的独特特征 并由其表示。
有效量的药物组合物(例如本文所述多聚化配体)为获得所选活化诱导型CSM表达T细胞(例如超过60％、70％、80％、85％、90％、95％、或97％，或低于80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、或10％的治疗性细胞被活性化)所需的量。该术语与“足量”同义。有效量还可为实现所需治疗响应的量，所述治疗响应例如相比给予配体诱导剂之前时的状况，降低肿瘤大小、降低肿瘤细胞水平、或降低表达CD19的白血病细胞的量。
任何具体应用的有效量可根据下述条件而不同：治疗疾病或病症的因子、给药的具体组合物、对象大小、和/或疾病或病症的严重度。可凭经验确定本文所述具体组合物的有效量而无需过度的必需实验。
本文所用术语“接触”和“暴露”用于细胞、组织或生物体时，描述将药物组合物和/或其他试剂(例如化疗或放疗试剂)递送给靶细胞、组织或生物体或放置成与所述靶细胞、组织或生物体直接并置所用的方法。为了实现细胞杀伤或静止，以有效杀死所述细胞或阻止其分裂的结合量将药物组合物和/或其他试剂递送给细胞。
给予药物组合物可领先、同时和/或晚于其他试剂，间隔范围数分钟至数周。在分别施加所述药物组合物和其他试剂对所述细胞、组织或生物体的实施方式中，一般需保证各递送的时间之间没有显著的时间段，从而所述药物组合物和试剂仍可在细胞、组织或生物体上产生有利的组合效果。例如该示例中，考虑可将细胞、组织或生物体与2、3、4或更多方案和所述药物组合物基本同时(即少于约1分钟以内)接触。在其他方面，给予所述表达载体之前和/或之后，可将一种或多种试剂从基本同时、约1分钟、至约24小时或至约7天至约1至约8周或更多时间以及其任何延伸范围内给予。此外，可使用本文药物组合物的各种组合方案和一种或多种试剂。
优化和个性化治疗
配体诱导剂的剂量和给药防范可根据确定待处理疾病或病症的水平而优化。例如，可确定患者体内可能残留的任何残留实体瘤的大小、或靶细胞例如肿瘤细胞或表达CD19的B细胞的水平。
例如，初始治疗后确定患者具有临床相关水平的肿瘤细胞或实体瘤给医师提供了可能需要通过给予多聚化配体来活化细胞从而活化嵌合抗原受体表达T细胞。在另一示例中，确定患者用多聚化配体治疗后具有低水平肿瘤细胞或降低的肿瘤大小可指示医师不需要额外剂量的多聚化配体。相似地，用多聚化配体治疗后，确定患者继续表现疾病或病症或症状复发可指示医师可能需要给予至少一个额外剂量的多聚化配体。术语“剂量”包括药剂的量和给药频率，例如下次药剂的时间。术语“剂量水平”指相对对象体重给予的多聚化配体的量。因此提高剂量水平会提高相对对象体重所给予的配体量。此外，提高给药浓度(例如当用连续输注泵给予多聚化配体)意味着每分钟或每秒钟给药浓度提高(因此所给药量也提高)。
因此，例如在某些实施方式中，所述方法还包括：相对给予所述多聚化配体之后的肿瘤尺寸和/或肿瘤细胞数量，确定对象中肿瘤尺寸是否增加和/或肿瘤细胞数量是否增加，和在确定肿瘤尺寸增加和/或肿瘤细胞数量增加的事件中给予所述对象额外剂量的所述多聚化配体。所述方法还包括例如，相对给予所述多聚化配体之后的表达CD19的B细胞的水平，确定对象中表达CD19的B细胞是否增加，和在确定对象中表达CD19的B细胞增加的事件中给予所述对象额外剂量的所述多聚化配体。在这些实施方式中，例如，根据本发明方法所述患者初始用治疗细胞和配体处理。初始处理后，肿瘤大小、肿瘤细胞数量或表达CD19的B细胞数量可例如相对初始处理后降低。初始处理后的某一时间，再次测试患者，或可继续监控所述患者的疾病病症。若确定了例如肿瘤大小、肿瘤细胞数量、或表达CD19的B细胞数量相对刚进行初始处理后的时间有所增加，则可给予额外剂量的配体。该监控和处理程序可持续，由于表达诱导型CSM的细胞保留在患者中，虽然在没有其他配体时其是以相对失活的状态。
可以任何方便的方式提供调节或维持后续药量的指示，例如多聚化配体的后续剂量和/或后续药物剂量。在一些实施方式中可以表格形式提供指示(如物理或 电子介质)。例如，可在表格中提供样品中肿瘤细胞大小或肿瘤细胞的数量或水平，且医师可将病症与疾病的阶段列表或表格进行比较。然后医师可从表格中确定后续药物剂量的指示。在某些实施方式中，可在将病症提供给计算机(如输入计算机储存)后通过计算机显示(如显示器显示)指示。例如，该信息可提供给计算机(如通过用户输入计算机储存或通过计算机网络的远程设备传递给计算机)，计算机中的软件可生成调节或维持后续药物剂量的指示和/或提供后续药物药剂含量。
基于指示确定后续剂量后，医师可给予后续剂量或提供调节剂量的指令给他人或另一实体。本文术语“医师”指做决定者，在某些实施方式中医师是医药专家。在一些实施方式中，做决定着可为计算机或显示的计算机程序输出，健康服务提供者可按指示或计算机显示的后续药物剂量操作。做决定者可直接(如给对象输注后续剂量)或远程(如做决定者可远程改变抽吸参数)给予所述后续剂量。
本文提供的方法包括但不限于递送有效量的活化细胞、核酸或编码该核酸的的表达构建体。通常有效量的药物组合物定义为足以检测并重复实现所需结果的含量，所述结果例如缓解、降低、最小化或限制疾病或病症发展。可使用其他更严格限定，包括消除、根除或治愈疾病。在一些实施方式中，可具有监控生物标记物以评估治疗效果和控制毒性。
给予患者的制剂和途径
考虑临床应用，需要以本发明适用的形式制备药物组合物-表达构建体、表达载体、融合蛋白、转导细胞、活化T细胞、转导T细胞。通常，需要制备基本不含热原以及其他可能对人或动物有害的杂质的组合物。
多聚化配体，例如AP1903可以下述剂量给予，例如约0.01-1mg/kg患者体重、约0.05-0.5mg/kg患者体重、0.1-2mg/kg患者体重、约0.05-1.0mg/kg患者体重、约0.1-5mg/kg患者体重、约0.2-4mg/kg患者体重、约0.3-3mg/kg患者体重、约0.3-2mg/kg患者体重、或约0.3-1mg/kg患者体重、例如约0.1、0.2、 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、或10mg/kg患者体重。在一些实施方式中，所述配体以每药剂0.4mg/kg(例如以5mg/mL的浓度)给予。可提供含配体的药瓶或其他容器，例如所述配体的每药瓶体积例如约0.25ml–约10ml，例如约0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10ml，例如约2ml。
通常希望采用合适的盐和缓冲液来使复合物稳定，并允许靶细胞摄取复合物。当重组细胞引入患者中时，可使用缓冲液。本发明的水性组合物包含溶解或分散在药学上可接受的载体或水性介质中的表达构建物和核酸。该组合物也可称为接种体。术语“药物或药学上可接受的”指分子整体和组合物在给予动物或人时不产生副作用、过敏或其他不良反应。术语“药学上可接受的运载体”包括任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂等。这些用于药物活性物质的介质和试剂是本领域技术人员所熟知的。除非某些常规介质或试剂与本文所述载体或细胞不相容，否则可考虑在治疗组合物中使用任何这些介质或试剂。也可在组合物中纳入补充活性成分。
所述活性组合物可包括经典药物制剂。这些组合物可通过任何常用途径来给药，只要通过该途径可以达到靶组织。途径包括例如口服、鼻内、颊、直肠、鞘或局部。另外，给药可以通过正位、皮内、皮下、肌内、腹腔膜内或静脉内注射。这些组合物通常作为药学上可接受的组合物给予，如本文所述。
适于注射用途的药品形式包括无菌水性溶液或者分散剂和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，剂型都无菌，并是容易装入注射器的流体。它应该在制造和储存条件下稳定，并且在保存过程中能够抵抗微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是包含水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物以及植物油的溶剂或分散介质。可通过使用包衣如卵磷脂、如果是分散体则保持所需粒度以及使用表面活性剂，来维持合适的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等带来对微生物作用的阻碍。在某些示例中，可包括等渗剂如糖或氯化钠。可通过将延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶用于组合物中来延长可注 射组合物的吸收。
为了口服给药，组合物可与赋形剂一起纳入并以非可吸收的漱口水和牙膏形式使用。漱口水可在合适溶剂中以需要量纳入活性成分，所述溶剂例如硼酸钠溶液(朵贝尔氏(Dobell's)溶液)。或者，活性成分可纳入含硼酸钠、甘油和碳酸氢钠的防腐剂中。活性成分还可分散在包括凝胶、浆糊、粉末和浆液的牙膏中。活性成分可以治疗性有效量加入至糊料牙膏中，其可包括例如水、粘合剂、磨料、调味剂、起泡剂和保湿剂。
所述组合物可以中性或盐形式配置。药学上可接受的盐包括例如酸加成盐(用蛋白质的游离氨基基团形成)，其用无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成。用游离羧基形成的盐还可源自无机碱例如钠、钾、铵、钙、或铁的氢氧化物，和有机碱例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。
配置后，溶液可以能够与剂量配方相容的方式和有效的量给予。所述制剂容易以各种药剂形式给予，例如可注射溶液、药物释放胶囊等。例如为了在溶液中胃肠外给药，若需要则所述溶液可经适当缓冲，并且用充分的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些具体水溶液特别适于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内给药。在该情况汇总可使用无菌水性介质。例如，一个剂量可溶于1mlNaCl等渗溶液中，并加入1000ml皮下灌输液体中，或在输注的计划位置注射(参见例如《雷明顿药物科学》第15版1035-1038和1570-1580页)。基于治疗患者的病症会需要对剂量进行变化。负责给药的人在任何情况中均可确定个体对象的合适药量。此外，就人的给药而言，制品应当满足FDA生物制品标准部(OfficeofBiologicsstandards)要求的无菌性、致热原性、常规安全和纯度标准。
可针对患者选择合适的给药方案，并且可例如包括投配方案，其中第0周给予细胞，然后给予二聚化的化学诱导剂，然后以2周间隔给予其他细胞和诱导剂，总计例如2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、或30周。
其他投配方案包括例如给予一剂细胞和一剂诱导剂的方案。在其他示例中，所述方案可包括第0周给予所述细胞和诱导剂，然后以4周间隔给予其他细胞和诱导剂，总计例如4、8、12、16、20、24、28或32周。
可在一期或多于一期中给予细胞剂量，但术语剂量可指给予配体之前所给予的细胞总量。
若需要，所述方法可包括额外的白细胞提取法以获得更多细胞用于治疗。
治疗疾病的方法
本方法还涵盖治疗或预防病原性微生物引起的疾病和/或过度增殖性疾病。
可治疗或预防的疾病包括病毒、细菌、酵母、寄生虫、原生动物、肿瘤细胞等所致的疾病。药物组合物(转导的T细胞、表达载体、表达构建体等)可用作通用免疫增强剂(T细胞活化组合物或系统)且因此用在治疗疾病中。可治疗和/或预防的示例性疾病包括但不限于病毒病因学感染例如HIV、流感、疱疹、病毒性肝炎、爱波斯坦-巴尔病、脊髓灰质炎、病毒性脑炎、麻疹、水痘、巨细胞病毒(CMV)、腺病毒(ADV)、HHV-6(人疱疹病毒6、I)和人乳头状瘤病毒等；或细菌病因学感染例如肺炎、肺结核和梅毒等；或寄生病因学感染：疟疾、锥虫病、利什曼病、滴虫病和阿米巴病等。
可用药物组合物(转导的T细胞、表达载体、表达构建体等)治疗或预防的肿瘤发生前状态和增生状态包括但不限于肿瘤发生前状态和增生状态例如结肠息肉、克罗恩病、溃疡性结肠炎、乳腺病灶等。
癌症包括实体瘤，期可用药物组合物治疗，包括但不限于原发性或转移性黑素瘤、腺癌、鳞状细胞癌、腺鳞细胞癌、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠癌、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、NPC、膀胱癌、宫颈癌等。
其他过度增殖性疾病包括实体瘤，其可用本文所述T细胞活化系统治疗，包括但不限于类风湿关节炎、炎症性肠病、骨关节炎、平滑肌瘤、腺瘤、脂肪瘤、血管瘤、纤维瘤、血管闭塞、再狭窄、动脉粥样硬化、预肿瘤性病变(如腺瘤样增生和前列腺上皮内瘤样病变)、原位癌、口腔毛状白斑或银屑病。
本发明方法中，药物组合物(表达构建体、表达载体、融合蛋白、转导细胞、活化T细胞、转导T细胞)的给予可出于“预防性”或“治疗性”目的。提供预防性时，在任何症状之前给予所述药物组合物。药物组合物的预防性给药用于预防或缓解任何后续的感染或疾病。提供治疗性时，在感染或疾病的症状发作时或之后给予所述药物组合物。因此本文提供的组合物可在预期暴露于致病剂之前或疾病状态时或感染或疾病起始之后提供。
任何组织或器官的实体瘤均可用本发明方法处理，包括例如血管系统中任何表达PSA(例如PSMA)的肿瘤，例如肺、骨、肝、前列腺癌、或大脑中存在的实体瘤，还例如乳房、卵巢、肠、睾丸、结肠、胰腺、肾、膀胱、神经内分泌系统、软组织、骨质和淋巴系统中存在的实体瘤。可治疗的其他实体瘤包括例如胶质母细胞瘤和恶性骨髓瘤。
术语“单位剂量”涉及接种量，表示适于哺乳动物的单一剂量的物理离散单元，各单元含预定量的药物组合物，其经计算以关联所需稀释度产生所需免疫原性效果。接种量的单位剂量的的说明基于药物组合物和待实现的特定免疫效果的独特特征并由其表示。
有效量的药物组合物为实现提高免疫应答的所选结果所需的量，该量可经确定。例如，治疗免疫系统缺陷的有效量可为引起免疫系统活化、导致与抗原接触后发展抗原特异性免疫应答所需的量。该术语与“足量”同义。
任何具体应用的有效量可根据下述条件而不同：治疗疾病或病症的因子、给药的具体组合物、对象大小、和/或疾病或病症的严重度。可凭经验确定本文所述具体组合物的有效量而无需过度的必需实验。
A.基于遗传的治疗
在某些实施方式中，提供具有表达构建体的细胞，所述构建体能提供共刺激多肽，例如本文所述那些例如T细胞。本文所用表达载体和遗传元件的冗长讨论通过引用纳入本部分。在某些示例中，表达载体可为病毒载体，例如腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、痘苗病毒和逆转录病毒。在其他示例中，所述载体可为溶酶体包封的表达载体。
可在体外和离体条件进行基因递送。对于病毒载体，通常可制备病毒载体原液。本申请提供病毒载体介导的离体和体内基因递送的示例。对于体内递送，根据病毒类型和可获得的效价，可递送例如约1、2、3、4、5、6、7、8、或9X104、1、2、3、4、5、6、7、8、或9X105、1、2、3、4、5、6、7、8、或9X106、1、2、3、4、5、6、7、8、或9X107、1、2、3、4、5、6、7、8、或9X108、1、2、3、4、5、6、7、8、或9X109、1、2、3、4、5、6、7、8、或9X1010、1、2、3、4、5、6、7、8、或9X1011或1、2、3、4、5、6、7、8、或9X1012感染型颗粒至患者。通过比较相关摄取效率，可推测脂质体或其他非病毒制剂的相似数据。下文描述作为药学上可接受组合物的制剂。多聚化配体例如AP1903可以例如下述剂量递送：约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、或10mg/kg对象体重。
B.基于细胞的治疗
考虑的其他治疗是给予转导T细胞。所述T细胞可体外转导。本文讨论作为药学上可接受组合物的制剂。
基于细胞的治疗中，转导T细胞可用例如靶抗原核酸(例如mRNA或DNA或蛋白质)转染；用细胞裂解物、蛋白质或核酸脉冲处理；或用细胞电融合。所述细胞、蛋白质、细胞裂解物或核酸可源自细胞例如肿瘤细胞，或其他病原微生物，例如病毒、细菌、原生动物等。
C.联合治疗
为了提高本文表达载体的效力，需要将这些组合物和方法与有效治疗疾病的试剂组合。
在某些实施方式中抗癌剂可与本发明方法组合使用。“抗癌”剂能对对象的癌症产生不利影响，例如通过杀死一种或多种癌细胞、诱导癌细胞凋亡、降低一种或多种癌细胞生长速率、降低转移的发生率或数量、降低肿瘤尺寸、抑制肿瘤生长、减少对肿瘤或一种或多种癌细胞的血液供给、促进对一种或多种癌细胞或肿瘤的免疫应答、阻止或抑制癌症发展、或延长患癌对象的寿命。抗癌剂包括例如化疗剂(化疗)、放射治疗剂(放疗)、外科手术(手术)、免疫治疗剂(免疫疗法)、基因治疗剂(基因疗法)、激素治疗、其他生物制剂(生物治疗)和/替代疗法。
在其他实施方式中，抗生素可与药物组合物联用以治疗和/或预防感染疾病。该抗生素包括但不限于阿米卡星、氨基糖甙类抗生素(如庆大霉素)、阿莫西林、两性霉素B、氨苄西林、锑剂、食用葡萄糖酸锑钠、阿奇霉素、卷曲霉素、头孢噻肟、头孢西丁、头孢曲松钠、氯霉素、克拉霉素、克林霉素、氯苯吩嗪、环丝氨酸、氨苯砜、多西环素、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、氟康唑、氟喹诺酮类药物、异烟肼、伊曲康唑、卡那霉素、酮康唑、二甲胺四环素、氧氟沙星)、对氨基水杨酸、喷他脒、菌素防卫素(polymixindefinsins)、丙硫异烟胺、吡嗪酰胺、乙胺嘧啶磺胺嘧啶、喹诺酮类药物(如环丙沙星)、利福布汀、利福平、司帕沙星、链霉素、磺胺类药物、四环素类药物、氨硫脲、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异恶唑、紫霉素或其组合。
更通常地，该试剂与表达载体以组合量提供，所述量有效杀伤或抑制该细胞和/或微生物增殖。该方法可涉及将细胞与试剂和药物组合物同时或在一段时间内接触，其中药物组合物和试剂分别给予细胞、组织或生物体，产生所需治疗益处。这可通过下述方法实现：将细胞、组织或生物体与单一组合物或包括药物组合物和一种或多种试剂的药理学制剂接触，或将细胞与两种或更多不同组合物或制剂接触，其中一种组合物包括药物组合物，另一种包括一种或多种试剂。
本文所用术语“接触”和“暴露”用于细胞、组织或生物体时，描述药物组合物和 /或其他试剂(例如化疗或放疗试剂)递送给靶细胞、组织或生物体或放置成与所述靶细胞、组织或生物体直接并置所用的方法。为了实现细胞杀伤或静止，以有效杀死所述细胞或阻止其分裂的结合量将药物组合物和/或其他试剂递送给细胞。
药物组合物的给予可先于、同时和/或晚于其他试剂，间隔范围数分钟至数周。在所述药物组合物和其他试剂对所述细胞、组织或生物体分别应用的实施方式中，一般需保证各递送的时间之间没有显著的时间段，从而所述药物组合物和试剂仍可在细胞、组织或生物体上产生有利的组合效果。例如该示例中，考虑可将细胞、组织或生物体与2、3、4或更多方案和所述药物组合物基本同时(即少于约1分钟以内)接触。在其他方面，给予所述表达载体之前和/或之后，可将一种或多种试剂从基本同时、约1分钟、至约24小时或至约7天至约1至约8周或更多时间以及其任何延伸范围内给予。此外，可使用本文药物组合物的各种组合方案和一种或多种试剂。
在一些实施方式中，化疗剂可为Taxotere(多西他赛)或其他紫杉烷，例如卡巴他赛。可在用治疗细胞和诱导剂治疗之前、期间或之后给予化疗剂。例如，可在给予T细胞首次剂量的约1年、11、10、9、8、7、6、5、或4个月或18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2周或1周之前给予化疗剂。或者例如，可在给予T细胞或诱导剂首次剂量的约1周或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、或18周或4、5、6、7、8、9、10或11个月或1年之后给予化疗剂。
给予化疗剂可包括给予多于一种化疗剂。例如可在泰索帝(Taxotere)或其他紫杉烷(例如卡巴他赛)之外给予顺铂。
实施例
下述实施例说明某些实施方式但不限制本技术。
以下部分提供在治疗细胞如T细胞中表达诱导型嵌合信号传导分子的方法以及使用转化细胞的方法的示例。表达诱导型多肽的方法、转化或转染细胞的用途、 和试验描述于例如Spencer,D.M.,等Science262:1019-1024(1993)；2008年7月29日授权的美国专利7,404,950“树突细胞的诱导活化(InducedActivationinDendriticCell)”；2011年4月14日提交的美国专利申请13/087,329“治疗实体瘤的方法(MethodsforTreatingSolidTumors)”；和2011年3月20日提交的美国专利申请13/112,739,“诱导选择性凋亡的方法(MethodsforInducingSelectiveApoptosis)”；其全文通过引用纳入本文。
实施例1：诱导型嵌合信号分子表达载体的构建和评估
载体构建和表达确认
构建适合用作治疗剂的表达载体，所述载体包含融合人FK506结合蛋白(FKBP)如FKBP12v36的信号分子。这些方法还可用于表达一种或多种共刺激多肽。所述诱导型CSM能用小分子药物二聚化(或多聚化)。诱导型CSM的编码核酸与配体结合域的编码核酸融合并插入SFG逆转录病毒或pLenti7慢病毒载体，所述载体还能表达荧光标志物GFP。
所述诱导型CSM多肽包括2、3或更多种FK506结合蛋白，在一些某些实施方式中，包括2或3种FK506结合蛋白(FKBP-例如，FKBP12v36变体，或FKBP12；GenBankAH002818)，含有F36V突变)，其通过Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser接头连接CSM序列。一种或多种FKBP(Fv2)的氨基酸序列是密码子摆动的(例如，各氨基酸密码子的第三核苷酸通过维持初始编码氨基酸的沉默突变来改变)以在逆转录病毒中表达时防止同源重组。所有构建体克隆到SFG或pLenti7.3中。
293T细胞用各个这些构建体转染，诱导后48小时通过流式细胞术分析标记基因GFP或ΔCD19的表达。除了GFP或ΔCD19的表达水平，还通过蛋白质印迹分析所表达基因产物以确认诱导型嵌合信号分子的表达。例如，结合共刺激多肽的抗体可用于蛋白质印迹分析。
转染的293T细胞重悬于含抑肽酶、亮抑酶肽、和苯甲基磺酰氟(德国勃林格殷格翰(Boehringer,Ingelheim))的裂解缓冲液(50％Tris/Gly、10％十二烷基硫酸钠[SDS]、4％β-巯基乙醇、10％甘油、12％水、4％溴酚蓝，0.5％)并在冰上孵育30分钟。30分钟离心后，收集上清，与Laemmli缓冲液(加利福尼亚州赫克里斯的伯乐公司(Bio-Rad))1:2混合，加样到10％SDS–聚丙烯酰胺凝胶上。膜用兔抗共刺激多肽免疫球蛋白G(IgG；科罗拉多州戈尔登的ABR(Affinity BioReagents)；1:500稀释)和小鼠抗GFPIgG(加利福尼亚州伯克利的科文斯(Covance)；1:25,000稀释)探测。然后，印迹暴露于适当过氧化物酶偶联的二抗，并且用增强化学发光(ECL；伊利诺伊州阿灵顿高地的阿莫仙公司(Amersham))检测蛋白质表达。剥离膜并用山羊多克隆抗肌动蛋白(圣克鲁斯生物技术公司(SantaCruzBiotechnology)；1:500稀释)再探测以检查上样等同性。
诱导型CSM表达构建体的评估
细胞系
癌细胞系LNCaP、PC3、DU145和A549以及人胚肾细胞系HEK-293T获自美国模式培养物保藏所(马里兰州罗克维尔市)。细胞维持于含胎牛血清(马萨诸塞州沃尔瑟姆的海克隆(Hyclone))和2mML-谷氨酰胺的完全IMDM(密苏里州圣路易斯的西格玛(Sigma))，处于37℃下，含5％二氧化碳(CO2)的加湿气氛中。转导的T细胞和PHA原始细胞维持于CellgenixDC(Cellgenix)培养基，所述培养基补充有100U/mlIL-2(Cellgenix)。
T细胞活化
用可溶性αCD3和αCD28(加利福尼亚州奥本的美天旎(MiltenyiBiotec))进行T细胞活化以用于扩增和转导。PBMC以1x106细胞/ml重悬于CellgenixDC培养基，所述培养基补充有100U/mlIL-2(Cellgenix)，并用0.2μg/mlαCD3和0.5μg/mlαCD28可溶性抗体刺激。然后，细胞在37℃,5％CO2下培养4天。第4天时，加入1ml含IL-2的新鲜培养基。第7天时，收获细胞并重悬于CellgenixDC培养基以用于转导。
逆转录病毒和慢病毒构建体
诱导型CSM(iCSM)和CAR-CD3.ζ构建体通过BlueHeronBio(华盛顿州博塞尔)合成，所述构建体包括靶向PSMA、PSCA、MUC1和Her2/Neu的密码子优化单链可变片段。iCSM构建体由FKBP12v36结构域组成，所述结构域与共刺激胞内结构域框内连接，包括CD28、4-1BB、和T细胞受体的CD3ζ链。CAR构建体如下产生：用人IgG1-Ch2Ch3结构域和CD3ζ链框内克隆scFv片段。iCSM和CAR-CD3.ζ构建体亚克隆到SFG逆转录病毒骨架或pLenti7.3慢病毒骨架(英杰(Invitrogen))，其共表达祖母绿GFP。通过用编码这些转基因的逆转录病毒 或慢病毒单一或共转导T细胞，来评估iCSM的刺激和共刺激效果以及CAR-CD3.ζ的细胞毒性。
逆转录病毒转导
对于逆转录病毒的瞬时生产，293T细胞用iCSM构建体以及编码gag-pol和RD114包膜的质粒转染，采用GeneJuice转染剂(威斯康星州麦迪逊的Novagen)。转染后48-72小时收获病毒，速冻，约80℃保存待用。对于慢病毒的短暂生成，293T细胞采用GeneJuice用iCAR构建体以及质粒pLP1(gag/pol),pLP2(rev)和pLP/VSVG(VSVGenv)转染。转染后48-72小时收获病毒，速冻，约80℃保存待用。对于大规模逆转录病毒生成，稳定的FLYRD18衍生的逆转录病毒生产细胞系通过VSV-G瞬时假性逆转录病毒上清多次转导产生。转基因表达最高的FLYRD18细胞经单细胞分选，扩增产生最高病毒效价的克隆并用于生成淋巴细胞转导用病毒。在8周以上的连续培养中维持此克隆的转基因表达、功能和逆转录病毒效价。非组织培养处理的24孔板用7μg/ml纤维连接蛋白(Retronectin)(日本志贺县大津市的宝生物工程株式会社)在37℃包被1小时或4℃包被过夜。孔用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，随后如下用逆转录病毒上清包被：与1.5ml上清在37℃孵育板30分钟。然后，T细胞原始细胞以每孔5x105细胞接种于病毒上清，所述上清补充有100U/mlIL-2。转导在60小时时长中进行。转导后，收获细胞，通过流式细胞术就CD19或GFP表达进行表型分型。
iCSM/CAR转导的T细胞的细胞毒性
如上所述，各转导T细胞系的细胞毒性在标准4小时51Cr释放试验中评估。用iCSM、PSMACAR-CD3.ζ或同时iCSM与CAR病毒转导的T细胞相对Cr51-标记靶细胞作比较，包括淋巴细胞刺激的自身植物血球凝集素(PHA)(PHA原始细胞)、LNCaP、PC3或DU145和A549癌细胞系以及表达人PSMA的转基因A549(A549-PSMA)。在完全培养基或1％曲通(Triton)X-100(密苏里州圣路易斯的西格玛)中孵育的靶细胞分别用于测定自发和最大51Cr释放。三重孔中特定裂解的平均百分数计算为100X(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)。除了铬释放试验外，进行共培养实验。在此，转导细胞系LNCaP、PC3、DU145、A549和A549-PSMA以表达荧光mOrange并用作靶细胞。表达mOrange的肿瘤细 胞与非转导或CAR修饰T细胞以1:10肿瘤细胞和T细胞比例在完全培养基中共培养，存在IL-2(50U/ml)。24小时后，载有iCAR的T细胞用100nMAP1903刺激。72小时后，收集细胞，计数并用CD3标记以检测T细胞，mOrange肿瘤细胞的百分数通过流式细胞术(LSRII；BD)分析。
iCSM转导T细胞的表型分析和活化状态
iCAR转导T细胞的细胞表面表型用下列单克隆抗体研究：CD3,CD4,CD8,CD19,CD25,CD27,CD28,CD44,CD45RA,CD45RO,CD62L,CD80,CD83,CD86,CD127,CD134,CD137,HLA-ABC和HLA-DR。进行表型分析，用和未用10-100nMAP1903作为iCSM刺激剂。适当匹配的同种型对照用于各实验且通过LSRII流式细胞仪(BD)分析细胞。用抗F(ab′)2(宾夕法尼亚州西格罗夫的杰克逊免疫研究实验室(JacksonImmunoResearchLaboratories))评价CAR表达。
iCSM转导T细胞的细胞因子生成分析
在100nMAP1903刺激前后(24小时)测量T细胞上清中干扰素γ(IFN-γ)、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10和肿瘤坏死因子-α(TNFα)的浓度，用人Th1/Th2细胞因子流式微珠阵列(BD法敏进公司(Pharmingen))。培养上清中的诱导细胞因子生成通过酶联免疫吸附试验(ELISA；明尼苏达州明尼阿波利斯的安迪生物(R&D系统公司))根据厂商说明书验证。
iCSM转导T细胞的增殖
通过在暴露于AP1903后测量转导和非转导T细胞的细胞生长，评估AP1903经iCSM诱导信号传递的增殖效果。T细胞用10μM二醋酸羧基荧光素、琥珀酰亚胺酯(CFSE)在37℃标记10分钟。孵育后，细胞在PBS中洗涤，随后重悬于CellgenixDC培养基。然后，1x106CFSE标记的iCSM修饰或非转导T细胞在单独CellgenixDC培养基中培养，或用100nMAP1903刺激。5天后，收获细胞并用CD3-PerCP.Cy5.5和CD19-PE标记，通过流式细胞术就CFSE稀释进行分析。
为评估可溶性免疫球蛋白是否影响CAR+T淋巴细胞的增殖和表达，细胞以1×105细胞/孔培养，用获自健康供体的人血浆连续稀释或纯化人免疫球蛋白(杰克逊免疫研究实验室)连续稀释，未添加外源细胞因子。72小时后，细胞用1μCi(0.037MBq)甲基-3[H]胸苷(新泽西州皮斯卡塔韦的安发玛西亚生物技术公司(Amersham PharmaciaBiotech))脉冲，再培养15小时。接着在滤器上收获细胞并干燥，用β-闪烁计数器(TriCarb2500TR；康涅狄格州Meridien的帕卡德生物科学公司(PackardBioScience))测量每分钟计数。实验一式三份进行。在其它实验中，对照和CAR+T淋巴细胞用单独培养基培养，或每2天加入连续稀释的血浆或纯化免疫球蛋白的培养基。然后，用台盼蓝排除法每3天计数细胞。
体内实验
6-8周龄非肥胖型糖尿病严重联合的免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠接受辐照(250rad)，用重悬于Matrigel(BD生物科学(BDBioscience))的10x106-15x106LNCaP肿瘤细胞在右腋皮下注射。2周后，荷瘤(直径约0.5cm)小鼠的尾静脉注入非转导或iCSM/CAR转导T细胞(总共15x106)。小鼠随机分成2组：1组接受CID(50-125μgAP1903，腹膜内，每周2次)且1组仅接受运载体(16.7％丙二醇,22.5％PEG400和1.25％吐温(Tween)80，腹膜内，每周2次)以扩增T细胞。通过卡尺测量评估小鼠肿瘤生长，持续21天。通过第7、14和21天的球后眼出血来采集外周血样品以测量iCSM或对照T细胞的持续性和扩增，使用针对人CD3/人CD19表达T细胞的流式细胞检测分析。
iCSM转导T细胞体内特征的评估
为确保诱导型CSM表达不改变T细胞特征，非转导或非功能诱导型CAR(仅PSMACAR-CD3.ζ)的表型、抗原特异性、增殖潜能和功能与iCSM/CAR转导T细胞作比较。比较转导和非转导细胞中的CD4+、CD8+、CD56+和TCRα/β+细胞数目，这是包括IFN-γ、TNFα、IL-10、IL-4、IL-5和IL-2在内的细胞因子生成。评估呈指数生长CTL的生长特征和对抗原及IL-2(用于增殖)的依赖性，这是抗原刺激后TH1和TH2型细胞因子的表型和分泌数据。
实施例2：在用于治疗的人细胞中使用诱导型CSM
此实施例呈现表达构建体和在人细胞中使用表达构建体的方法。
材料和方法
大规模生成基因修饰的T细胞
T细胞用标准方法从健康志愿者中产生。简言之，来自健康供体或癌症患者的外周血单核细胞(PBMC)用可溶性αCD3和αCD28(加利福尼亚州奥本的美天旎)活化以用于扩增和转导。PBMC以1x106细胞/ml重悬于CellgenixDC培养基，所述培养基补充有100U/mlIL-2(Cellgenix)，并用0.2μg/mlαCD3和0.5μg/mlαCD28可溶性抗体刺激。然后，细胞在37℃,5％CO2下培养4天。第4天时，加入1ml含IL-2的新鲜培养基。第7天时，收获细胞并重悬于CellgenixDC培养基以用于转导。
质粒和逆转录病毒
SFG质粒由诱导型CSM组成，所述诱导型CSM经可切割2A样顺序连接截断的人CD19。诱导型CSM由带F36V突变的人FK506结合蛋白(FKBP12；GenBankAH002818)组成，其经Ser-Gly-Gly-Gly-Ser接头连接人CSM。F36V突变增加FKBP12对合成同二聚体AP20187或AP1903的结合亲和性。2A样顺序编码来自明脉扁刺蛾β四体(Thoseaasigna)昆虫病毒的20氨基酸肽，介导甘氨酸与末端脯氨酸残基间>95％切割，产生iCSMC末端的19个额外氨基酸和CD19N末端的1个额外脯氨酸残基。CD19由在氨基酸333处截短(TDPTRRF)的全长CD19(GenBankNM001770)组成，其使胞质内结构域从242减少到19个氨基酸，移除所有作为磷酸化潜在位点的保守酪氨酸残基。
通过用SFG质粒瞬时转染PhoenixEco细胞系(ATCC产品编号SD3444；弗吉尼亚洲马纳萨斯的ATCC)，制备产生长臂猿白血病病毒(Gal-V)假性逆转录病毒的稳定PG13基克隆。这生成Eco-假性逆转录病毒。PG13包装细胞系(ATCC)用Eco-假性逆转录病毒转导3次以产生每细胞含多个SFG质粒前病毒要素的生产细胞系。进行单细胞克隆，扩增产生最高效价的PG13克隆并用于载体生成。
逆转录病毒转导
用于T细胞活化和扩增的培养基是无血清CellgenixDC培养基(Cellgenix)，所述培养基补充有100U/mlIL-2(Cellgenix)。T细胞通过可溶性抗CD3和抗CD28(美天旎)活化7天，然后用逆转录病毒载体转导。必要时，在转导后第4天实施免疫磁珠选择ΔCD19，阳性部分再扩增2天并冷冻保存。
基因修饰的同种异体耗尽(allodepleted)细胞的放大生产
临床应用的转导工艺放大可采用非组织培养处理的T75培养瓶(纽约州罗切斯特的Nunc)，所述瓶用10ml抗CD30.5μg/ml和抗CD280.2μg/ml或10ml纤连蛋白7在4℃包被过夜。还使用氟化乙烯丙烯袋，经电晕处理以增加细胞粘附(2PF-0072AC,马里兰州盖瑟斯堡的美国Fluoroseal公司(AmericanFluorosealCorporation))。PBMC以1×106细胞/ml接种于抗CD3、抗CD28包被的培养瓶中的培养基，所述培养基补充有100U/mlIL-2。对于逆转录病毒转导，重组纤维连接蛋白包被培养瓶或袋用10ml含逆转录病毒的上清加样一次，持续2-3小时。活化的T细胞以1×106细胞/ml接种于3:1比例的含逆转录病毒载体新鲜培养基与T细胞培养基，所述培养基补充有100U/mlIL-2。第二天早晨收获细胞并在经组织培养处理的T75或T175培养瓶的培养基中扩增，所述培养基补充有100U/mlIL-2，接种密度为约5×105细胞/ml-8×105细胞/ml。
CD19免疫磁性选择
可进行CD19免疫磁性选择，在一个实施例中，在转导后4天进行。细胞用偶联单克隆小鼠抗人CD19抗体(加利福尼亚州奥本的美天旎)的顺磁性微珠标记，在小规模实验中于MS或LS柱上选择，而在大规模实验中于CliniMacsPlus自动分选装置上选择。CD19选定细胞再扩增4天并在转导后8天冷冻保存。这些细胞称为“基因修饰细胞”。
免疫表型和五聚体分析
流式细胞检测分析(FACSCalibur和CellQuest软件；BD公司(BectonDickinson))用下列抗体进行：CD3,CD4,CD8,CD19,CD25,CD27,CD28,CD45RA,CD45RO,CD56和CD62L。发现CD19-PE(克隆4G7；BD公司)产生最优染色且用于所有后续分析。非转导对照用于设置CD19的负栅。用抗F(ab′)2(宾夕法尼亚州西格罗夫的杰克逊免疫研究实验室)评价CAR表达。
统计分析
成对、斯氏双尾t检验用于测定样品间差异的统计学显著性。所有数据表示为均值±1标准偏差。
实施例3：测量AP1903依赖性T细胞活化
目标：用编码信号分子的逆转录病毒载体转导原代T细胞，所述分子连接2个FKBPv36分子从而允许AP1903活化T细胞。此实验中，响应二聚化的细胞因子生成用多重细胞因子珠阵列检测。
方法：
设计和克隆诱导型T细胞分子：
1.2个基于SFG的逆转录病毒载体通过Gibson克隆构建，其中PCR产物扩增自pAd1127-02-iMC并插入pBP0320-SFG-Myr.LFv1.Fv2L.2A.ΔCD19构建体，取代LFv1.Fv2LDNA片段。
a.第一载体中，扩增的PCR产物是Fv’Fv，或其中仅FKBPv36片段插入逆转录病毒主干，在XhoI和SalI位点取代LFv1.Fv2L。此载体称为pBP0171-SFG-Myr.Fv’.Fv.2A.ΔCD19，且是缺乏任何T细胞信号分子的对照载体。
b.第一载体中，扩增的PCR产物是MyD88/CD40.Fv’.Fv(或iMCnoE)。这在XhoI和SalI限制位点插入pBP0320质粒，取代LFv1.Fv2LDNA序列。此载体称为pBP0172-SFG-Myr.iMCnoE.2A.ΔCD19。“noE”后缀表明此iMCDNA不编码抗原表位标签。
生成逆转录病毒：
2.逆转录病毒通过瞬时转染法生成，其中HEK293T细胞用下列质粒转染：
a.SFG逆转录病毒质粒(分别为pBP0171或pBP0172；RV-171或RV-172)
b.逆转录病毒包膜质粒(RD114)
c.Gag/pol质粒(pEQ-PAM-E)
3.48和72小时时，收集来自转染细胞的上清，所述细胞含复制缺陷型逆转录病毒，干冰/乙醇上速冻并于-80℃保存，直至T细胞转导。
4.为转导原代T细胞，来自健康供体的PBMC用抗CD3和抗CD28抗体在T细胞生长培养基中活化，所述培养基补充有100U/mlIL-2。3天后，活化T细胞并收获，备用于逆转录病毒转导。为转导T细胞，非组织培养处理的板首先用重组纤维连接蛋白在4℃过夜包被。然后，移除重组纤维连接蛋白，板用PBS洗。逆转录病毒上清随之用于包被重组纤维连接蛋白平板。随后向孔加入活化的T细胞，离心板以促进病毒粒子结合和转导。48小时后，收获T细胞，通过流式细胞术就 CD3和CD19共表达进行分析以测定病毒转导效率。
通过细胞因子生成分析AP1903诱导的T细胞活化：
5.为评价AP1903依赖性T细胞活化T细胞，1x105非转导(NT)或者用对照逆转录病毒(RV-171)或含iMC的逆转录病毒(RV-172)转导的T细胞一式三份接种于96孔板，在单独培养基或含10nMAP1903的培养基中于37℃5％CO2下培养。
6.24小时后，轻轻混合细胞，将板离心。然后，收集上清并接种到Bio-Plex人细胞因子/趋化因子27-重板，其测量下列细胞因子和趋化因子：
a.碱性FGF,G-CSF,GM-CSF,IFN-γ,IL-1Ra,IL-1β,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-8,IL-7,IL-8,IL-9,IL-10,IL-12p70,IL-13,IL-15,IL-17RA,嗜酸细胞活化趋化因子,IP10,MCP-1,MIP-1α,MIP-1β,PDGF-bb,RANTES,TNF-α和VEGF。
b.随后测量上清中的细胞因子和趋化因子，与板中的标准作比较，使用Bio-PlexMAGPIX多重读数器。
结果：
转导效率
1.两个健康供体的T细胞用逆转录病毒转导，48小时后，通过流式细胞术确定的CD3+CD19+共表达的功效如下：
a.供体063
i.NT＝6.54％
ii.RV-171＝73.9％
iii.RV-172＝54.6％
b.供体707
i.NT＝2.16％
ii.RV-171＝85.2％
iii.RV-172＝73.6％
2.两种载体和供体的转导均非常高，表明其对HEK293T细胞非毒性且病毒效价良好。
细胞因子/趋化因子生成
3.分析细胞因子和趋化因子分泌显示对AP1903二聚化的明显依赖性。以下T细胞生成的细胞因子和趋化因子显示在24小时内诱导，但在用对照载体诱导的T细胞或非转导T细胞中没有。
a.GM-CSF,IFN-γ,IL-13,IL-4,IL-5,IL-6,IL-8,IL-1β,IL-12p70,IP10,MIP-1α,MIP-1β,RANTES和TNF-α
4.另外，其它细胞因子和趋化因子似乎未通过AP1903活化iMC而被诱导。这些包括下列因子：
a.碱性FGF,G-CSF,IL-1Ra,IL-2,IL-7,IL-9,IL-10,IL-15,IL-17RA,嗜酸细胞活化趋化因子,MCP-1,PDGF-bb和VEGF。
某些结果还描述于图7-15。NT＝非转导活化T细胞
RV0171＝SFG-Myr.Fv’.Fv.2A.ΔCD19；RV0172＝SFG＝Myr.MyD88/CD40.Fv’.Fv.2A.ΔCD19.
T细胞用10nMAP1903刺激24小时，接着测定上清的细胞因子水平。
实施例4：测量AP1903依赖性T细胞的细胞毒性：
目的：用编码信号分子的逆转录病毒载体转导原代T细胞，所述分子连接2个FKBPv36分子从而允许AP1903活化T细胞。此实验中，检测两个方面的AP1903活化。首先，如果T细胞非常接近肿瘤细胞，其活化是否诱导肿瘤细胞杀伤？第二，如果T细胞经AP1903活化，其是否增殖？
方法：
设计和克隆诱导型T细胞分子以及生成逆转录病毒
1.所述方法与上面实施例4所述本质上相同。此试验采用同一细胞。
产生GFP-标记的CAPAN-1(胰腺癌)细胞系：
2.CAPAN-1购自ATCC。随后，细胞系通过pBP0168-pcDNA3.1-EGFPluc质粒转染来基因修饰，所述质粒包含用于EGFP/萤火虫荧光素酶融合蛋白的基因以及新霉素抗性基因，能通过G418抗生素培养而随着时间选出稳定转染细胞。培养后，选择有高GFP表达的克隆，继代培养，直到获得具有>95％GFP的细胞系。
共培养iMC激活T细胞与CAPAN-1肿瘤细胞
3.非转导T细胞或者用RV-171(对照载体)或RV-172(iMC载体)转导的细胞以5:1的T细胞与肿瘤细胞比例在培养基中培养，所述培养基补充有50U/ml IL-2，有或没有10nMAP1903。然后，共培养物在37℃和5％CO2孵育72小时。随后，通过荧光显微镜并如下分析培养物中GFP+肿瘤细胞的存在：用0.25％胰蛋白酶/EDTA收获培养物，通过流式细胞术测量培养物中GFP+CD3-肿瘤细胞的频率。
结果：
4.检查共培养孔后，显然在2种供体中，用RV-172(含iMC的载体)转导的T细胞经AP1903刺激后增殖，如大T细胞原始细胞菌落所见。另外，通过荧光显微镜，含RV-172转导T细胞且接受AP1903的共培养物显示极少的活GFP+肿瘤细胞。这些初步观察后，收获T细胞和肿瘤细胞，通过流式细胞术分析以测定剩余CAPAN-1GFP+肿瘤细胞的频率。
5.如显微镜所观察，流式细胞术显示AP1903在含经AP1903处理、iMC转导(RV-172)T细胞的共培养物中有明显效果。GFP+肿瘤细胞减少仅在此情况下出现，但用对照载体转导的T细胞中没有，用RV-172转导且未接受二聚化因子的T细胞中程度较小。
6.总之，这些数据表明iMC在T细胞中的活化能诱导T细胞杀伤和诱导经AP1903处理T细胞的增殖。总体上，iMC能在T细胞中活化且T细胞在iMC二聚化后维持和增加其效应功能。
某些结果还描述于图16-19。
实施例5：离体活化T细胞和给予人受试者
此实施例呈现采用人治疗用修饰T细胞的方法。此实施例中，从CD40和MyD88获得共刺激多肽细胞质区域。这些方法可适合其它细胞，例如NK和NKT细胞以及肿瘤浸润性淋巴细胞，还可适合诱导型CSM，所述CSM包括本文所述其它共刺激多肽细胞质区域。
材料和方法
大规模生成基因修饰的T细胞
T细胞用标准方法从健康志愿者中产生。简言之，来自健康供体或癌症患者的外周血单核细胞(PBMC)用可溶性αCD3和αCD28(加利福尼亚州奥本的美天旎)活化以用于扩增和转导。PBMC以1x106细胞/ml重悬于CellgenixDC培养基，所述培养基补充有100U/mlIL-2(Cellgenix)，并用0.2μg/mlαCD3和0.5μg/ml αCD28可溶性抗体刺激。然后，细胞在37℃,5％CO2下培养4天。第4天时，加入1ml含IL-2的新鲜培养基。第7天时，收获细胞并重悬于CellgenixDC培养基以用于转导。
质粒和逆转录病毒
SFG质粒由诱导型CSM组成，所述诱导型CSM经可切割2A样序列连接截断的人CD19。诱导型CSM由带F36V突变的人FK506结合蛋白(FKBP12；GenBankAH002818)组成，其经Ser-Gly-Gly-Gly-Ser接头连接人CSM。F36V突变增加FKBP12对合成同二聚体AP20187或AP1903的结合亲和性。2A样序列编码来自明脉扁刺蛾β四体昆虫病毒的20氨基酸肽，介导甘氨酸与末端脯氨酸残基间>95％切割，产生诱导型CSMC末端的19个额外氨基酸和CD19N末端的1个额外脯氨酸残基。CD19由在氨基酸333处截短(TDPTRRF)的全长CD19(GenBankNM001770)组成，其使胞质内结构域从242减少到19个氨基酸，移除所有作为磷酸化潜在位点的保守酪氨酸残基。
通过用SFG质粒瞬时转染PhoenixEco细胞系(ATCC产品编号SD3444；弗吉尼亚洲马纳萨斯的ATCC)，制备产生长臂猿白血病病毒(Gal-V)假性逆转录病毒的稳定PG13基克隆。这生成Eco-假性逆转录病毒。PG13包装细胞系(ATCC)用Eco-假性逆转录病毒转导3次以产生每细胞含多个SFG质粒前病毒要素的生产细胞系。进行单细胞克隆，扩增产生最高效价的PG13克隆并用于载体生成。
逆转录病毒转导
用于T细胞活化和扩增的培养基是无血清CellgenixDC培养基(Cellgenix)，所述培养基补充有100U/mlIL-2(Cellgenix)。T细胞通过可溶性抗CD3和抗CD28(美天旎)活化7天，然后用逆转录病毒载体转导。必要时，在转导后第4天实施免疫磁珠选择ΔCD19，阳性部分再扩增2天并冷冻保存。
基因修饰的同种异体耗尽细胞的放大生产
临床应用的转导工艺放大可采用非组织培养处理的T75培养瓶(纽约州罗切斯特的Nunc)，所述瓶用10ml抗CD30.5μg/ml和抗CD280.2μg/ml或10ml 纤连蛋白7在4℃包被过夜。还使用氟化乙烯丙烯袋，经电晕处理以增加细胞粘附(2PF-0072AC,马里兰州盖瑟斯堡的美国Fluoroseal公司)。PBMC以1×106细胞/ml接种于抗CD3、抗CD28包被培养瓶中的培养基，所述培养基补充有100U/mlIL-2。对于逆转录病毒转导，重组纤维连接蛋白包被培养瓶或袋用10ml含逆转录病毒的上清加样一次，持续2-3小时。活化的T细胞以1×106细胞/ml接种于3:1比例的含逆转录病毒载体新鲜培养基与T细胞培养基，所述培养基补充有100U/mlIL-2。第二天早晨收获细胞并在经组织培养处理的T75或T175培养瓶的培养基中扩增，所述培养基补充有100U/mlIL-2，接种密度为约5×105细胞/ml-8×105细胞/ml。
CD19免疫磁性选择
必要时，用于CD19的免疫磁性选择在转导后4天进行。细胞用偶联单克隆小鼠抗人CD19抗体(加利福尼亚州奥本的美天旎)的顺磁性微珠标记，在小规模实验中于MS或LS柱上选择，而在大规模实验中于CliniMacsPlus自动分选装置上选择。CD19选定细胞再扩增4天并在转导后8天冷冻保存。这些细胞称为“基因修饰细胞”。
实施例6：治疗白血病患者
本实施例用本申请方法治疗具有深度治疗难治性白血病的白血病患者，其还可应用于其它病症或疾病，例如其它高增生疾病或实体瘤。所述方法可基本如所述使用，应理解单链可变片段能根据靶抗原而变化。
T细胞用核酸转导，所述核酸包括编码诱导型嵌合信号分子的多核苷酸。T细胞还用核酸转导，所述核酸包括编码嵌合抗原受体的多核苷酸。诱导型CSM的示例包括但不限于图4所示的那些，包括CD28多肽胞质刺激区和4-1BB多肽胞质信号区。诱导型CSM还可包括CD3ζ多肽。所述嵌合抗原受体包括识别CD19的单链可变片段。
患者经历淋巴耗尽调节，然后给予诱导的CD19靶向T细胞。T细胞可以是自体、同种异体或非同种异体的。给予T细胞后，向患者给予配体诱导剂以通过诱导嵌合信号分子来扩增CD19靶向T细胞。例如，所述剂量可以每日、每周2次或每周提供。监控肿瘤细胞水平，配体诱导剂如AP1903的给药方案根据肿瘤细胞负 荷调整。由于考虑未调节、过快速度的T细胞扩增、活化和肿瘤细胞杀伤可能导致不必要伤害患者的更严重细胞因子风暴，给药方案设计成实现完全恢复，其速度限制毒性且不对患者造成大量伤害，例如使患者免于入住医院加护病房。一旦患者实现完全恢复并保持一段可测时间长度的无病状态，例如1个月、3个月、6个月，停止AP1903给药。治疗后，没有配体诱导剂时，CD19靶向T细胞数目减少。可以有低水平的基础信号传递，允许少量静止期CD19靶向T细胞存活。没有配体诱导剂时，这些细胞保持失活且允许正常B细胞恢复。如果在未来任何时间，患者出现白血病复发，恢复给药配体诱导剂AP1903，再激活CD19靶向T细胞并引起患者内完全应答的再诱导。倘若多次复发，此额外给药可重复超过一次。
实施例7：测量CAR转导的T细胞中的iMC活性：
目标：用编码信号分子的逆转录病毒载体转导原代T细胞，所述分子连接2个FKBPv36分子从而允许AP1903活化T细胞。此实验设计成检测含截短MyD88和CD40多肽的诱导型共刺激分子是否改善T细胞对GFP修饰CAPAN-1(胰腺癌)细胞的杀伤，所述T细胞也用CAPAN-1肿瘤细胞上高表达的识别前列腺干细胞抗原(PSCA)的CAR转导。
方法：
设计和克隆诱导型T细胞分子：
1.T细胞转导用RV-172(SFG-Myr.MyD88/CD40.Fv.Fv’.2A.ΔCD19)和RV-89(SFG.PSCAscFv.CH2CH3.CD28.ζ)进行。scFv靶向PSCA，用来自人源化单抗的scFv即1G8(获自US2012077962A1中的人源化抗PSCA)。这连接人IgG1的CH2CH3区，其进而连接含分子跨膜和胞质部分的CD28。CD28连接CD3ζ的胞质部分。
生成逆转录病毒：
2.与前面实施例本质上相同。
产生GFP-标记的CAPAN-1(胰腺癌)细胞系：
3.CAPAN-1购自ATCC。随后，细胞系通过pBP0168-pcDNA3.1-EGFPluc转染来基因修饰，所述质粒包含用于EGFP/萤火虫荧光素酶融合蛋白的基因以及新霉素抗性基因，能通过G418抗生素培养而随着时间选出稳定转染细胞。培养后，选 择有高GFP表达的克隆，继代培养，直到获得具有>95％GFP的细胞系。
共培养iMC激活T细胞与CAPAN-1肿瘤细胞：
4.非转导T细胞或者用RV-89(PSCACAR)和RV-172(iMC载体)共转导的T细胞以5:1的T细胞与肿瘤细胞比例在培养基中培养，所述培养基补充有50U/mlIL-2，有或没有10nMAP1903。然后，共培养物在37℃和5％CO2孵育72小时。随后，通过荧光显微镜并如下分析培养物中GFP+肿瘤细胞的存在：用0.25％胰蛋白酶/EDTA收获培养物，通过流式细胞术测量培养物中GFP+CD3-肿瘤细胞的频率。
结果：
1.通过荧光显微镜检测培养物以评价孔中肿瘤细胞杀伤改善，所述孔包含诱导型共刺激分子-和嵌合抗原受体-转导且接受AP1903的T细胞。
2.流式细胞术用于分析胰蛋白酶消化后培养物中的GFP+细胞，以测定AP1903是否有助于此段培养期(72小时)中的肿瘤细胞数目降低。培养时间段可延长至约5天。流式细胞仪检测图可显示孔中GFP+细胞减少，采用5:1比例，所述细胞用病毒转导且接受AP1903。
3.剩余的活CAPAN-1-GFP细胞根据无AP1903的NTT细胞情况标准化以显示iMC活化对肿瘤细胞杀伤的效果。
实施例8：具体核酸和氨基酸序列的示例
下述序列提供顺序用于诱导型嵌合信号分子(CSM)序列的核苷酸和氨基酸序列的示例。
SEQIDNO:1,豆蔻酸酰化核苷酸
ATGGGGAGTAGCAAGAGCAAGCCTAAGGACCCCAGCCAGCGC
SEQIDNO:2,豆蔻酸酰化氨基酸
MGSSKSKPKDPSQR
SEQIDNO:3，接头序列(Myr和Fv1之间)核苷酸
CTCGAGTCTGGCGGTGGATCCGGAG
SEQIDNO:4，接头序列(Myr和Fv1之间)氨基酸
LESGGGSG
SEQIDNO:5,FKBPv36(Fv1)核苷酸
GGCGTTCAAGTAGAAACAATCAGCCCAGGAGACGGAAGGACTTTCCCCAAACGAGGCCAAACATGCGTAGTTCATTATACTGGGATGCTCGAAGATGGAAAAAAAGTAGATAGTAGTAGAGACCGAAACAAACCATTTAAATTTATGTTGGGAAAACAAGAAGTAATAAGGGGCTGGGAAGAAGGTGTAGCACAAATGTCTGTTGGCCAGCGCGCAAAACTCACAATTTCTCCTGATTATGCTTACGGAGCTACCGGCCACCCCGGCATCATACCCCCTCATGCCACACTGGTGTTTGACGTCGAATTGCTCAAACTGGAA
SEQIDNO:6,FKBPv36(Fv1)氨基酸
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE
SEQIDNO:7，接头序列(Fv1和Fv2之间)核苷酸
GTCGAG
SEQIDNO:8，接头序列(Fv1和Fv2之间)氨基酸
VE
SEQIDNO:9,FKBPv36(Fv2)核苷酸
GGAGTGCAGGTGGAGACGATTAGTCCTGGGGATGGGAGAACCTTTCCAAAGCGCGGTCAGACCTGTGTTGTCCACTACACCGGTATGCTGGAGGACGGGAAGAAGGTGGACTCTTCACGCGATCGCAATAAGCCTTTCAAGTTCATGCTCGGCAAGCAGGAGGTGATCCGGGGGTGGGAGGAGGGCGTGGCTCAGATGTCG GTCGGGCAACGAGCGAAGCTTACCATCTCACCCGACTACGCGTATGGGGCAACGGGGCATCCGGGAATTATCCCTCCCCACGCTACGCTCGTATTCGATGTGGAGCTCTTGAAGCTTGAG
SEQIDNO:10,FKBPv36(Fv2)氨基酸
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE
SEQIDNO:11,接头序列(Fv2和CD28之间)核苷酸
TCTGGCGGTGGATCCGGAGTCGAG
SEQIDNO:12,接头序列(Myr和CD28之间)氨基酸
SGGGSGVE
SEQIDNO:13,CD28核苷酸
TTCTGGGTACTGGTTGTAGTCGGTGGCGTACTTGCTTGTTATTCTCTTCTTGTTACCGTAGCCTTCATTATATTCTGGGTCCGATCAAAGCGCTCAAGACTCCTCCATTCCGATTATATGAACATGACACCTCGCCGACCTGGTCCTACACGCAAACATTATCAACCCTACGCACCCCCCCGAGACTTCGCTGCTTATCGATCC
SEQIDNO:14,CD28氨基酸
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
SEQIDNO:15,接头序列(CD28和4-1BB之间)核苷酸
GGATCC
SEQIDNO:16,接头序列(CD28和4-1BB之间)氨基酸
GS
SEQIDNO:17,4-1BB核苷酸
AGTGTAGTTAAAAGAGGAAGAAAAAAGTTGCTGTATATATTTAAACAACCATTTATGAGACCAGTGCAAACCACCCAAGAAGAAGACGGATGTTCATGCAGATTCCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAATTG
SEQIDNO:18,4-1BB氨基酸
SVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
SEQIDNO:19,接头序列(4-1BB和CD3ζ之间)核苷酸
ACGCGT
SEQIDNO:20,接头序列(4-1BB和CD3ζ之间)氨基酸
TR
SEQIDNO:21,CD3ζ核苷酸
CGGGTCAAATTCAGCCGGAGTGCTGACGCCCCAGCATACCAACAGGGACAAAACCAACTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTAGACGCGAGGAGTACGACGTTCTGGATAAGAGGCGGGGCCGGGACCCAGAGATGGGGGGCAAACCTCAGCGGCGGAAGAACCCGCAGGAGGGTCTTTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTATTCAGAAATTGGGATGAAAGGCGAGAGACGCAGGGGAAAAGGTCACGATGGTCTGTATCAAGGACTGTCAACCGCCACCAAAGACACTTACGATGCGCTCCACATGCAGGCCCTCCCTCCCCGC
SEQIDNO:22,CD3ζ氨基酸
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQIDNO:23,接头序列(CD3ζ和弗林蛋白酶之间)核苷酸
GTCGAC
SEQIDNO:24,接头序列(CD3ζ和弗林蛋白酶之间)氨基酸
VD
SEQIDNO:25,弗林蛋白酶核苷酸
CGCGCAAAGCGT
SEQIDNO:26,弗林蛋白酶氨基酸
RAKR
SEQIDNO:27,V5表位标签核苷酸
GGAAAACCTATACCTAATCCATTGCTGGGCTTAGACTCAACA
SEQIDNO:28,V5表位标签氨基酸
GKPIPNPLLGLDST
SEQIDNO:29,接头序列(V5和P2A之间)核苷酸
GGCAGCGGAAGC
SEQIDNO:30,接头序列(V5和P2A之间)氨基酸
GSGS
SEQIDNO:31,猪捷申病毒-12A(P2A)核苷酸
GCAACGAATTTTTCCCTGCTGAAACAGGCAGGGGACGTAGAGGAAAATCCTGGTCCT
SEQIDNO:32,猪捷申病毒-12A(P2A)氨基酸
ATNFSLLKQAGDVEENPGP
SEQIDNO:33,接头序列(P2A和ΔCD19之间)核苷酸
ACGCGT
SEQIDNO:34,接头序列(P2A和ΔCD19之间)氨基酸
TR
SEQIDNO:35,ΔCD19核苷酸
ATGCCCCCTCCTAGACTGCTGTTTTTCCTGCTCTTTCTCACCCCAATGGAAGTTAGACCTGAGGAACCACTGGTCGTTAAAGTGGAAGAAGGTGATAATGCTGTCCTCCAATGCCTTAAAGGGACCAGCGACGGACCAACGCAGCAACTGACTTGGAGCCGGGAGTCCCCTCTCAAGCCGTTTCTCAAGCTGTCACTTGGCCTGCCAGGTCTTGGTATTCACATGCGCCCCCTTGCCATTTGGCTCTTCATATTCAATGTGTCTCAACAAATGGGTGGATTCTACCTTTGCCAGCCCGGCCCCCCTTCTGAGAAAGCTTGGCAGCCTGGATGGACCGTCAATGTTGAAGGCTCCGGTGAGCTGTTTAGATGGAATGTGAGCGACCTTGGCGGACTCGGTTGCGGACTGAAAAATAGGAGCTCTGAAGGACCCTCTTCTCCCTCCGGTAAGTTGATGTCACCTAAGCTGTACGTGTGGGCCAAGGACCGCCCCGAAATCTGGGAGGGCGAGCCTCCATGCCTGCCGCCTCGCGATTCACTGAACCAGTCTCTGTCCCAGGATCTCACTATGGCGCCCGGATCTACTCTTTGGCTGTCTTGCGGCGTTCCCCCAGATAGCGTGTCAAGAGGACCTCTGAGCTGGACCCACGTACACCCTAAGGGCCCTAAGAGCTTGTTGAGCCTGGAACTGAAGGACGACAGACCCGCACGCGATATGTGGGTAATGGAGACCGGCCTTCTGCTCCCTCGCGCTACCGCACAGGATGCAGGGAAATACTACTGTCATAGAGGGAATCTGACTATGAGCTTTCATCTCGAAATTACAGCACGGCCCGTTCTTTGGCATTGGCTCCTCCGGACTGGAGGCTGGAAGGTGTCTGCCGTAACACTCGCTTACTTGATTTTTTGCCTGTGTAGCCTGGTTGGGATCCTGCATCTTCAGCGAGCCCTTGTATTGCGCCGAAAAAGAAAACGAATGACTGACCCTACACGACGATTCTGA
SEQIDNO:36,ΔCD19氨基酸
MPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLT WSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVSAVTLAYLIFCLCSLVGILHLQRALVLRRKRKRMTDPTRRF
下述是嵌合抗原受体(CAR)序列(按顺序，无scFv片段)的核苷酸和氨基酸序列的示例。
SEQIDNO:37,信号肽核苷酸
ATGGAGTTTGGGCTGTCATGGCTGTTCCTCGTGGCCATTCTCAAAGGGGTCCAGTGTTCTCGC
SEQIDNO:38,信号肽氨基酸
MGFGLSWLFLVAILKGVQCSR
SEQIDNO:39,挠性接头序列核苷酸
GGGGGAGGAGGTTCTGGAGGCGGCGGGAGCGGAGGAGGAGGCAGC
SEQIDNO:40,挠性接头序列氨基酸
GGGGSGGGGSGGGGS
SEQIDNO:41,接头序列(scFv和CH2CH3之间)核苷酸
GGATCC
SEQIDNO:42,接头序列(scFv和CH2CH3之间)氨基酸
GS
SEQIDNO:43,IgG1Ch2Ch3核苷酸
GATCCAGCCGAACCCAAATCCCCCGATAAAACACATACTTGCCCCCCTTGTCCCGCACCAGAATTGCTTGGCGGACCTTCCGTTTTTCTTTTTCCCCCCAAACCTAAAGATACCCTGATGATTTCCCGAACCCCTGAAGTTACGTGCGTAGTCGTAGATGTGTCTCACGAAGATCCAGAAGTAAAATTTAACTGGTACGTAGATGGAGTCGAAGTTCACAACGCAAAGACGAAGCCCCGAGAAGAACAATATAATTCCACATACCGAGTAGTTAGCGTTCTCACCGTACTGCATCAGGACTGGCTTAACGGCAAAGAATATAAATGTAAGGTCTCAAACAAAGCACTCCCAGCCCCTATCGAAAAGACTATCTCCAAAGCTAAAGGACAACCCCGCGAACCCCAGGTCTATACACTTCCCCCCTCACGCGATGAACTCACTAAAAATCAGGTTTCCCTTACTTGTCTTGTCAAAGGCTTCTACCCTAGCGATATCGCAGTCGAATGGGAATCCAATGGCCAGCCCGAAAACAACTATAAAACAACCCCACCTGTCCTCGATTCAGATGGCTCATTCTTTCTCTATTCCAAACTGACTGTAGACAAATCCCGATGGCAACAAGGTAACGTGTTCTCTTGCTCAGTCATGCATGAAGCGCTTCATAACCATTACACACAAAAATCTCTCTCACTGTCTCCCGGAAAGAAGGACCCC
SEQIDNO:44,IgG1CH2CH3氨基酸
DPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDP
SEQIDNO:45,接头序列(scFv和CH2CH3之间)核苷酸
CTCGAG
SEQIDNO:46,接头序列(scFv和CH2CH3之间)氨基酸
LE
SEQIDNO:47,CD3ζ跨膜核苷酸
AAACTGTGTTACCTCCTCGATGGCATCCTCTTTATTTATGGCGTGATTCTGACCGCATTGTTTCTCCGAGTAAAATTCTCTAGATCCGCAGACGCTCCCGCATATCAGCAAGGACAAAATCAGCTTTATAACGAACTTAACCTCGGCAGACGCGAAGAATACGATGTACTGGACAAGAGAAGAGGAAGAGATCCCGAAATGGGCGGAAAACCCCAGAGAAGAAAGAATCCCCAAGAAGGTCTTTATAACGAACTGCAGAAAGATAAAATGGCCGAAGCGTACAGTGAAATTGGTATGAAAGGAGAAAGAAGACGCGGAAAAGGACATGACGGACTCTACCAAGGACTCTCAACTGCTACTAAAGATACATACGACGCCCTTCATATGCAAGCCCTCCCCCCGAGATAA
SEQIDNO:48,CD3ζ跨膜氨基酸
KLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
其他嵌合信号分子序列
SEQIDNO:49,OX40核苷酸
GTTGCCGCCATCCTGGGCCTGGGCCTGGTGCTGGGGCTGCTGGGCCCCCTGGCCATCCTGCTGGCCCTGTACCTGCTCCGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATC
SEQIDNO:50,OX40氨基酸
VAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
SEQIDNO:51,SEQIDNO:225’LTR序列的核苷酸序列
TGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCAT TTTGCAAGGCATGGAAAAATACATAACTGAGAATAGAAAAGTTCAGATCAAGGTCAGGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCAGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTATGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGGGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCGGGTACCCGTGTATCCAATAAACCCTCTTGCAGTTGCATCCGACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGGGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCA
其他序列
SEQIDNO,52来自衣壳蛋白前体核苷酸序列的明脉扁刺蛾β四体(Thoseaasigna)病毒-2A
GCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGGCCC
SEQIDNO,53来自衣壳蛋白前体氨基酸序列的明脉扁刺蛾β四体(Thoseaasigna)病毒-2A
AEGRGSLLTCGDVEENPGP
SEQIDNO:54,3’LTR核苷酸序列
TGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAA GGTCAGGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCAGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGGGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCGGGTACCCGTGTATCCAATAAACCCTCTTGCAGTTGCATCCGACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGGGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCA
SEQIDNO:55,(具有XhoI/SalI位点的接头-Fv1-Fv2-接头的核苷酸序列(Fv2中摆动密码子为小写))
CTCGAGTCTGGCGGTGGATCCGGAGGCGTTCAAGTAGAAACAATCAGCCCAGGAGACGGAAGGACTTTCCCCAAACGAGGCCAAACATGCGTAGTTCATTATACTGGGATGCTCGAAGATGGAAAAAAAGTAGATAGTAGTAGAGACCGAAACAAACCATTTAAATTTATGTTGGGAAAACAAGAAGTAATAAGGGGCTGGGAAGAAGGTGTAGCACAAATGTCTGTTGGCCAGCGCGCAAAACTCACAATTTCTCCTGATTATGCTTACGGAGCTACCGGCCACCCCGGCATCATACCCCCTCATGCCACACTGGTGTTTGACGTCGAATTGCTCAAACTGGAAGTCGAGGGaGTgCAgGTgGAgACgATtAGtCCtGGgGAtGGgAGaACcTTtCCaAAgCGcGGtCAgACcTGtGTtGTcCAcTAcACcGGtATGCTgGAgGAcGGgAAgAAgGTgGActcTtcacGcGAtCGcAAtAAgCCtTTcAAgTTcATGcTcGGcAAgCAgGAgGTgATccGGGGgTGGGAgGAgGGcGTgGCtCAgATGTCgGTcGGgCAaCGaGCgAAgCTtACcATcTCaCCcGAcTAcGCgTAtGGgGCaACgGGgCAtCCgGGaATtATcCCtCCcCAcGCtACgCTcGTaTTcGAtGTgGAgcTcttgAAgCTtGagTCTGGCGGTGGATCCGGAGTCGAC
SEQIDNO:56,(FV’FVLS氨基酸序列)
LESGGGSGGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEVEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGVD
SEQIDNO:57,FKBPv36(Fv1)核苷酸序列
GGCGTTCAAGTAGAAACAATCAGCCCAGGAGACGGAAGGACTTTCCCCAAACGAGGCCAAACATGCGTAGTTCATTATACTGGGATGCTCGAAGATGGAAAAAAAGTAGATAGTAGTAGAGACCGAAACAAACCATTTAAATTTATGTTGGGAAAACAAGAAGTAATAAGGGGCTGGGAAGAAGGTGTAGCACAAATGTCTGTTGGCCAGCGCGCAAAACTCACAATTTCTCCTGATTATGCTTACGGAGCTACCGGCCACCCCGGCATCATACCCCCTCATGCCACACTGGTGTTTGACGTCGAATTGCTCAAACTGGAA
SEQIDNO:58,FKBPv36(Fv1)氨基酸序列
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE
SEQIDNO:59,FKBPv36(Fv2)核苷酸序列
GGaGTgCAgGTgGAgACgATtAGtCCtGGgGAtGGgAGaACcTTtCCaAAgCGcGGtCAgACcTGtGTtGTcCAcTAcACcGGtATGCTgGAgGAcGGgAAgAAgGTgGActcTtcacGcGAtCGcAAtAAgCCtTTcAAgTTcATGcTcGGcAAgCAgGAgGTgATccGGGGgTGGGAgGAgGGcGTgGCtCAgATGTCgGTcGGgCAaCGaGCgAAgCTtACcATcTCaCCcGAcTAcGCgTAtGGgGCaACgGGgCAtCCgGGaATtATcCCtCCcCAcGCtACgCTcGTaTTcGAtGTgGAgcTcttgAAgCTtGag
SEQIDNO:60,FKBPv36(Fv2)氨基酸序列
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE
诱导型MyD88/CD40嵌合多肽的其他序列
SEQIDNO:81,豆蔻酰化多肽核苷酸序列
ATGGGGAGTAGCAAGAGCAAGCCTAAGGACCCCAGCCAGCGC
SEQIDNO:82,豆蔻酰化多肽氨基酸序列
MGSSKSKPKDPSQR
SEQIDNO:83,接头核苷酸序列(接头1)
CTCGAG
SEQIDNO:84,接头氨基酸序列(接头1)
LE
SEQIDNO:85,截短的MyD88多肽核苷酸序列
ATGGCCGCTGGGGGCCCAGGCGCCGGATCAGCTGCTCCCGTATCTTCTACTTCTTCTTTGCCGCTGGCTGCTCTGAACATGCGCGTGAGAAGACGCCTCTCCCTGTTCCTTAACGTTCGCACACAAGTCGCTGCCGATTGGACCGCCCTTGCC GAAGAAATGGACTTTGAATACCTGGAAATTAGACAACTTGAAACACAGGCCGACCCCACTGGCAGACTCCTGGACGCATGGCAGGGAAGACCTGGTGCAAGCGTTGGACGGCTCCTGGATCTCCTGACAAAACTGGGACGCGACGACGTACTGCTTGAACTCGGACCTAGCATTGAAGAAGACTGCCAAAAATATATCCTGAAACAACAACAAGAAGAAGCCGAAAAACCTCTCCAAGTCGCAGCAGTGGACTCATCAGTACCCCGAACAGCTGAGCTTGCTGGGATTACTACACTCGACGACCCACTCGGACATATGCCTGAAAGATTCGACGCTTTCATTTGCTATTGCCCCTCTGACATA
SEQIDNO:86,截短的MyD88多肽氨基酸序列
MAAGGPGAGSAAPVSSTSSLPLAALNMRVRRRLSLFLNVRTQVAADWTALAEEMDFEYLEIRQLETQADPTGRLLDAWQGRPGASVGRLLDLLTKLGRDDVLLELGPSIEEDCQKYILKQQQEEAEKPLQVAAVDSSVPRTAELAGITTLDDPLGHMPERFDAFICYCPSDI
SEQIDNO:87,ΔCD40多肽核苷酸序列
AAGAAAGTTGCAAAGAAACCCACAAATAAAGCCCCACACCCTAAACAGGAACCCCAAGAAATCAATTTCCCAGATGATCTCCCTGGATCTAATACTGCCGCCCCGGTCCAAGAAACCCTGCATGGTTGCCAGCCTGTCACCCAAGAGGACGGAAAAGAATCACGGATTAGCGTACAAGAGAGACAA
SEQIDNO:88,ΔCD40多肽氨基酸序列
KKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ
SEQIDNO:89,接头核苷酸序列(接头2)
GTCGAGTCTGGCGGTGGATCCGGA
SEQIDNO:90,接头氨基酸序列(接头2)
VESGGGSG
SEQIDNO:91,FKBPv36(Fv1)核苷酸序列
GGCGTTCAAGTAGAAACAATCAGCCCAGGAGACGGAAGGACTTTCCCCAAACGAGGCCAAACATGCGTAGTTCATTATACTGGGATGCTCGAAGATGGAAAAAAAGTAGATAGTAGTAGAGACCGAAACAAACCATTTAAATTTATGTTGGGAAAACAAGAAGTAATAAGGGGCTGGGAAGAAGGTGTAGCACAAATGTCTGTTGGCCAGCGCGCAAAACTCACAATTTCTCCTGATTATGCTTACGGAGCTACCGGCCACCCCGGCATCATACCCCCTCATGCCACACTGGTGTTTGACGTCGAATTGCTCAAACTGGAA
SEQIDNO:92,FKBPv36(Fv1)氨基酸序列
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE
SEQIDNO:93,接头核苷酸序列(接头3)
GTCGAG
SEQIDNO:94,接头氨基酸序列(接头3)
VE
SEQIDNO:95,FKBPv36(Fv2)核苷酸序列
GGaGTgCAgGTgGAgACgATtAGtCCtGGgGAtGGgAGaACcTTtCCaAAgCGcGGtCAgACcTGtGTtGTcCAcTAcACcGGtATGCTgGAgGAcGGgAAgAAgGTgGActcTtcacGcGAtCGcAAtAAgCCtTTcAAgTTcATGcTcGGcAAgCAgGAgGTgATccGGGGgTGGGAgGAgGGcGTgGCtCAgATGTCgGTcGGgCAaCGaGCgAAgCTtACcATcTCaCCcGAcTAcGCgTAtGGgGCaACgGGgCAtCCgGGaATtATcCCtCCcCAcGCtACgCTcGTaTTcGAtGTgGAgcTcttgAAgCTtGag
SEQIDNO:95,FKBPv36(Fv2)氨基酸序列
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE
SEQIDNO:96,接头核苷酸序列(接头4)
TCTGGCGGTGGATCCGGAGTCGAC
SEQIDNO:97,接头氨基酸序列(接头4)
SGGGSGVD
SEQIDNO:98，弗林蛋白酶共有切割位点核苷酸序列
CGCGCAAAGCGT
SEQIDNO:99，弗林蛋白酶共有切割位点氨基酸序列
RAKR
SEQIDNO:100,V5表位核苷酸序列
GGAAAACCTATACCTAATCCATTGCTGGGCTTAGACTCAACA
SEQIDNO:101,V5表位核苷酸序列
GKPIPNPLLGLDST
SEQIDNO:102,接头核苷酸序列(接头5)
GGCAGCGGAAGC
SEQIDNO:103,接头氨基酸序列(接头5)
GSGS
SEQIDNO:104,P2A核苷酸序列
GCAACGAATTTTTCCCTGCTGAAACAGGCAGGGGACGTAGAGGAAAATCCTGGTCCT
SEQIDNO:105,P2A氨基酸序列
ATNFSLLKQAGDVEENPGP
SEQIDNO106,接头核苷酸序列(接头6)
ACGCGT
SEQIDNO:107,接头氨基酸序列(接头6)
TR
SEQIDNO:108,ΔCD19核苷酸序列
ATGCCCCCTCCTAGACTGCTGTTTTTCCTGCTCTTTCTCACCCCAATGGAAGTTAGACCTGAGGAACCACTGGTCGTTAAAGTGGAAGAAGGTGATAATGCTGTCCTCCAATGCCTTAAAGGGACCAGCGACGGACCAACGCAGCAACTGACTTGGAGCCGGGAGTCCCCTCTCAAGCCGTTTCTCAAGCTGTCACTTGGCCTGCCAGGTCTTGGTATTCACATGCGCCCCCTTGCCATTTGGCTCTTCATATTCAATGTGTCTCAACAAATGGGTGGATTCTACCTTTGCCAGCCCGGCCCCCCTTCTGAGAAAGCTTGGCAGCCTGGATGGACCGTCAATGTTGAAGGCTCCGGTGAGCTGTTTAGATGGAATGTGAGCGACCTTGGCGGACTCGGTTGCGGACTGAAAAATAGGAGCTCTGAAGGACCCTCTTCTCCCTCCGGTAAGTTGATGTCACCTAAGCTGTACGTGTGGGCCAAGGACCGCCCCGAAATCTGGGAGGGCGAGCCTCCATGCCTGCCGCCTCGCGATTCACTGAACCAGTCTCTGTCCCAGGATCTCACTATGGCGCCCGGATCTACTCTTTGGCTGTCTTGCGGCGTTCCCCCAGATAGCGTGTCAAGAGGACCTCTGAGCTGGACCCACGTACACCCTAAGGGCCCTAAGAGCTTGTTGAGCCTGGAACTGAAGGACGACAGACCCGCACGCGATATGTGGGTAATGGAGACCGGCCTTCTGCTCCCTCGCGCTACCGCACAGGATGCAGGGAAATACTACTGTCATAGAGGGAATCTGACTATGAGCTTTCATCTCGAAATTACAGCACGGCCCGTTCTTTGGCATTGGCTCCTCCGGACTGGAGGCTGGAAGGTGTCTGCCGTAACACTCGCTTACTTGATTTTTTGCCTGTGTAGCCTGGTTGGGATCCTGCATCTTCAGCGAGCCCTTGTATTGCGCCGAAAAAGAAAACGAATGACTGACCCTACACGACGATTCTGA
SEQIDNO:109,ΔCD19氨基酸序列
MPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKA WQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVSAVTLAYLIFCLCSLVGILHLQRALVLRRKRKRMTDPTRRF*
实施例9：代表性实施方式
下文提供了本技术的某些实施方式的示例。
A1.一种含有核酸的组合物，所述核酸包含编码嵌合蛋白的多核苷酸，其中所述嵌合蛋白包含膜靶向区域、多聚化区域和选自CD27、CD28、ICOS、4-1BB以及OX40的共刺激多肽胞质信号区域。
A2.如实施方式A1所述的组合物，其中所述诱导型嵌合蛋白还包含选自CD27、CD28、ICOS、4-1BB以及OX40的第二共刺激多肽胞质信号区域。
A3.如实施方式A2所述的组合物，其中所述共刺激多肽胞质信号区域包含CD28胞质信号区域和4-1BB胞质信号区域。
A4.如实施方式A2所述的组合物，其中所述共刺激多肽胞质信号区域包含CD28胞质信号区域多肽和4-1BB胞质信号区域多肽。
A5.如实施方式A1-A4中任一项所述的组合物，其中所述嵌合蛋白还包含CD3ζ多肽。
A6.如实施方式A1-A4中任一项所述的组合物，其中所述多聚化配体结合区域选自：FKBP配体结合区域、亲环蛋白受体配体结合区域、类固醇受体配体结合区域、亲环蛋白受体配体结合区域、和四环素受体配体结合区域。
A7.实施方式A1-A6中任一项所述的组合物，其中所述配体结合区域包含Fv’Fvls氨基酸序列。
A8实施方式A1-A6中任一项所述的组合物，其中所述配体结合区域包含FKBPv36氨基酸序列。
A9.实施方式A8所述的组合物，其中所述配体结合区域包含Fv1和Fv2w氨基酸序列。
A10.实施方式A1-A9中任一项所述的组合物，其中所述核酸包含可操作连 接至所述核酸序列的启动子序列。
A10.1.实施方式A8所述的组合物，其中所述启动子是发育调控的且所述嵌合多肽在发育分化细胞中表达。
A10.2.实施方式A10或A10.1所述的组合物，其中所述启动子是组织特异性的且所述嵌合多肽杂特异组织中表达。
A10.3.实施方式A10所述的组合物，其中所述启动子在活化的T细胞中活化。
A10.4.实施方式A10-A10.3中任一项所述的组合物，其中所述启动子包含5’LTR序列。
A11.实施方式A1-A10中任一项所述的组合物，其中所述核酸包含在病毒载体内。
A12.如实施方式A11所述的组合物，其中所述病毒载体是慢病毒载体。
A13.实施方式A1-A10中任一项所述的组合物，其中所述核酸包含在质粒内。
A14.转化或转染有实施方式A1-A13中任一项所述的组合物的细胞。
A15.如实施方式A14所述的细胞，其中所述细胞是T细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞、B细胞或NK细胞。
A16.实施方式A15所述的细胞，其中所述细胞还转化或转染有含核酸序列的核酸，所述核酸序列包含信号肽、单链可变区片段、CH2-CH3铰链区和CD3ζ多肽的嵌合多肽。
A17.如实施方式A16所述的细胞，其中所述单链可变区片段结合肿瘤细胞上的抗原。
A18.如实施方式A16所述的细胞，其中所述单链可变区片段结合细胞上涉及过度增殖性疾病的抗原。
A19.实施方式A17或A18所述的细胞，其中所述信号链可变区片段选自αPSMA、αPSCA、αMUC1、αCD19、αROR1、α间皮素、αGD2和αHer2Neu。
A20.实施方式A1-A13中任一项所述的细胞，或实施方式A14-A17中任一项所述的细胞，其中所述多聚化区域结合二聚化配体。
A21.如实施方式A20所述的组合物或细胞，其中所述配体是二聚化FK506 或二聚化FK506样类似物。
A22.如实施方式A21所述的组合物，其中所述配体是AP1903。
A23.一种诱导免疫应答的方法，所述方法包括用实施方式A1-A13中任一项所述的组合物体外或离体转染或转导细胞。
A24.实施方式A23所述的方法，所述方法还包括将所述细胞与结合多聚化区域的配体接触，从而导致多聚化。
A25.如实施方式A24所述的方法，其中所述配体是二聚化的。
A26.如实施方式A24所述的方法，其中所述配体是二聚化FK506或二聚化FK506样类似物。
A27.如实施方式A24所述的方法，其中所述配体是AP1903。
A28.如实施方式A23-A27中任一项所述的方法，还包括将所述转染或转化的细胞给予对象。
A29.如实施方式A28所述的方法，其中所述细胞通过皮内和皮下给药来给予所述对象。
A30.一种诱导体内免疫应答的方法，所述方法包括给予对象实施方式A1-A13中任一项所述的组合物。
A31.实施方式A30所述的方法，所述方法还包括将含有结合多聚化区域的配体的组合物给予对象，从而导致多聚化。
A32.如实施方式A31所述的方法，其中所述配体是二聚化的。
A33.如实施方式A31所述的方法，其中所述配体是二聚化FK506或二聚化FK506样类似物。
A34.如实施方式A31所述的方法，其中所述配体是AP1903。
A35.如实施方式A28-A34中任一项所述的方法，其中所述对象诊断有过度增殖性疾病。
A36.如实施方式A28-A34中任一项所述的方法，其中所述对象诊断有肿瘤。
B1.用含有核酸的组合物转化或转染的细胞，所述核酸包含编码诱导型嵌合信号分子的多核苷酸，其中所述诱导型嵌合信号分子包含膜靶向区域、多聚化区域和缺失TIR结构域的截短的MyD88多肽。
B1.1.如实施方式B1所述的细胞，其中所述诱导型嵌合信号分子还包含缺失所述胞外结构域的胞质CD40多肽。
B1.2.用含有核酸的组合物转化或转染的细胞，所述核酸包含编码诱导型嵌合信号分子的多核苷酸，其中所述诱导型嵌合信号分子包含膜靶向区域、多聚化区域和缺失胞外结构域的胞质CD40多肽。
B2.如实施方式B1或B1.2所述的细胞，其中所述截短的MyD88多肽具有氨基酸序列SEQIDNO:86或其功能片段。
B2.1.如实施方式B1.1或B1.2所述的细胞，其中所述胞质CD40多肽具有氨基酸序列SEQIDNO:88或其功能片段。
B3.如实施方式B1-B2.1中任一项所述的细胞，其中所述膜靶向区域是豆蔻酰化-靶向序列。
B4-B6.保留
B7.如实施方式B1-B3中任一项所述的细胞，其中所述诱导型嵌合信号分子还包括CD3ζ多肽。
B8.如实施方式B1-B7中任一项所述的细胞，其中所述多聚化区域选自FKBP、亲环蛋白受体、类固醇受体、四环素受体、重链抗体亚基、轻链抗体亚基、和其突变序列。
B9.如实施方式B1-B8中任一项所述的细胞，其中所述多聚化区域是FKBP12区域。
B10.如实施方式B1-B9中任一项所述的细胞，其中所述FKBP12区域是 FKB12v36区域。
B11.如实施方式B1-B8中任一项所述的细胞，其中所述多聚化区域是Fv’Fvls。
B12.如实施方式B1-B8中任一项所述的细胞，其中所述多聚化区域结合选自FK506二聚体和二聚化FK506类似物配体的配体。
B13.如实施方式B1-B12中任一项所述的细胞，其中所述配体是AP1903或AP20187。
B14.如实施方式B1-B13中任一项所述的细胞，其中所述多聚化区域具有氨基酸序列SEQIDNO:58或其功能片段。
B15.如实施方式B1-B14中任一项所述的细胞，其中所述多聚化区域由SEQIDNO:57中的核苷酸序列或其功能片段所编码。
B16.如实施方式B14所述的细胞，其中所述多聚化区域还包含具有氨基酸序列SEQIDNO:60的多肽或其功能片段。
B17.如实施方式B15所述的细胞，其中所述多聚化区域还包含SEQIDNO:59中的核苷酸序列所编码的多肽或其功能片段。
B18.如实施方式B14或B16所述的细胞，其中所述多聚化区域还包含具有氨基酸序列SEQIDNO:60的多肽或其功能片段。
B19.如实施方式B15或B17所述的细胞，其中所述多聚化区域还包含SEQIDNO:59中的核苷酸序列所编码的多肽或其功能片段。
B20.如权利要求B14、B16或B18所述的细胞，其中所述多聚化区域还包含 具有氨基酸序列SEQIDNO:58或SEQIDNO:60的多肽或其功能片段。
B21.如实施方式B15、B17或B19所述的细胞，其中所述多聚化区域还包含由SEQIDNO:57或SEQIDNO:59中的核苷酸序列所编码的多肽或其功能片段。
B22.如实施方式B1-B21中任一项所述的细胞，其中所述核酸包含可操作连接至所述多核苷酸的启动子序列。
B23.如实施方式B1-B22中任一项所述的细胞，其中所述核酸包含在病毒载体内。
B24.如实施方式B23所述的细胞，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体。
B25.如实施方式B24所述的细胞，其中所述逆转录病毒载体是鼠白血病病毒载体。
B26.如实施方式B24所述的细胞，其中所述逆转录病毒载体是SFG载体。
B27.如实施方式B23所述的细胞，其中所述病毒载体是腺病毒载体。
B28.如实施方式B23所述的细胞，其中所述病毒载体是慢病毒载体。
B29.如实施方式B1-B22中任一项所述的细胞，其中所述核酸包含在质粒内。
B30.保留.
B31.如实施方式B1-B30中任一项所述的细胞，其中所述细胞是T细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞、NK-T细胞或NK细胞。
B32.如实施方式B31所述的细胞，其中所述细胞是T细胞。
B33.如实施方式B1-B32中任一项所述的细胞，其中所述细胞获自骨髓或从其制备。
B34.如实施方式B1-B32中任一项所述的细胞，其中所述细胞获自脐带血或从其制备。
B35.如实施方式B1-B32中任一项所述的细胞，其中所述细胞获自外周血或从其制备。
B36.如实施方式B1-B32中任一项所述的细胞，其中所述细胞获自外周血单核细胞或从其制备。
B37.如实施方式B31-B36中任一项所述的细胞，其中所述细胞是人细胞。
B38.如实施方式B1-B37中任一项所述的细胞，其中所述细胞还转化或转染有含多核苷酸的核酸，所述多核苷酸编码包含信号肽、单链可变区片段、CH2-CH3铰链区和CD3ζ多肽的诱导型嵌合信号分子。
B38.1.如实施方式B38所述的细胞，其中所述诱导型嵌合信号分子不包括CD3ζ多肽。
B38.2.如实施方式B38或B38.1所述的细胞，其中所述诱导型嵌合信号分子包括CD3ζ多肽。
B39.如实施方式B38-B38.2中任一项所述的细胞，其中所述单链可变区片段结合肿瘤细胞上的抗原。
B40.如实施方式B38-B38.2中任一项所述的细胞，其中所述单链可变区片段 结合细胞上涉及过度增殖性疾病的抗原。
B41.如实施方式B38-B40中任一项所述的细胞，其中所述单链可变区片段选自PSMA,αPSCA、αMUC1、αCD19、αROR1、α间皮素、αGD2、αCD123、αMUC16、和αHer2/Neu单链可变区片段。
B42.如实施方式B38-B40中任一项所述的细胞，其中所述单链可变区片段是αCD19单链可变区片段。
B42.1.如实施方式B38-B40中任一项所述的细胞，其中所述单链可变区片段是αPSCA单链可变区片段。
B43.一种诱导免疫应答的方法，所述方法包括将实施方式B1-B42.1所述的细胞与结合多聚化区域的配体接触，使所述诱导型嵌合信号分子发生多聚化。
B44.如实施方式B43所述的方法，其中所述细胞体内接触所述配体。
B45.如实施方式B43或B44所述的方法，其中所述配体是二聚化的。
B46.如实施方式B45所述的方法，其中所述配体是二聚化FK506或二聚化FK506样类似物。
B47.如实施方式B45所述的方法，其中所述配体是AP1903或AP20187。
B48.如实施方式B43-B47中任一项所述的方法，还包括将所述转染或转化的细胞给予对象。
B49.如实施方式B48所述的方法，其中所述细胞通过静脉内给药来给予所述对象。
B50-B56.保留。
B56.如实施方式B43-B49中任一项所述的方法，其中所述对象诊断有肿瘤。
B57.如实施方式B43-B49中任一项所述的方法，其中所述对象患有癌症。
B58如实施方式B43-B49中任一项所述的方法，其中所述对象患有实体瘤。
B59.如实施方式B58所述的方法，其中所述细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞或T细胞。
B60.如实施方式B58或B59所述的方法，其中所述细胞递送至肿瘤床。
B61.如实施方式B57所述的方法，其中所述癌症存在于所述对象的血液或骨髓中。
B62.如实施方式B43-B49中任一项所述的方法，其中所述对象患有血液或骨髓疾病。
B63.如实施方式B43-B49中任一项所述的方法，其中所述对象诊断有可通过干细胞移植得到缓解的任何症状或紊乱。
B64.如实施方式B43-B49中任一项所述的方法，其中所述对象诊断有镰状细胞贫血或异染色性脑白质病变。
B65.如实施方式B43-B49中任一项所述的方法，其中所述患者诊断有选自下组的症状：原发性免疫缺陷症、嗜血淋巴组织细胞瘤病(HLH)或其他噬血细胞紊乱、遗传性骨髓衰竭症、血红蛋白病、代谢紊乱和破骨细胞紊乱
B66.如实施方式B43-B49中任一项所述的方法，其中所述病症选自：严重 联合免疫缺陷(SCID)、联合免疫缺陷(CID)、先天性T细胞缺陷/不足、常见变异型免疫缺陷病(CVID)、慢性肉芽肿性疾病、IPEX(免疫缺陷、多内分泌病变、肠病、X连锁)或IPEX样病、维斯科特-奥尔德里奇综合征、CD40配体缺陷、白细胞粘附缺陷、DOCK8缺陷、IL-10不足/IL-10受体缺陷、GATA2缺陷、X-连锁淋巴细胞增生性疾病(XLP)、软骨毛发发育不良、施戴二氏综合征(ShwachmanDiamondSyndrome)、先天性纯红细胞再生障碍性贫血、先天性角化不良、范可尼贫血、先天性中性粒细胞减少、镰状细胞病、地中海贫血、黏多糖贮积症、鞘脂类代谢障碍和石骨症。
B67.一种治疗对象白血病的方法，所述方法包括将实施方式B1-B42.1中任一项所述的细胞给予对象和将多聚化配体给予对象。
B68.如实施方式B67所述的方法，其中所述单链可变区片段结合CD19。
B69.如实施方式B67或B68所述的方法，其中所述多聚化配体是AP1903或AP20187。
B70.如实施方式B67-B69中任一项所述的方法，其中所述细胞是T细胞。
B71.如实施方式B43-B70中任一项所述的方法，其中所述对象是人。
B72.如实施方式B43-B71中任一项所述的方法，所述方法还包括确定是否将额外剂量的所述多聚化配体给予所述患者。
B73.如实施方式B43-B72中任一项所述的方法，所述方法还包括将额外剂量的所述多聚化配体给予所述患者，其中所述疾病或病症症状保持或在症状减轻后测到。
B74.如实施方式B73所述的方法，其中所述对象在给予实施方式1-42.1中任一项所述的细胞之前诊断有疾病或病症，在给予多聚化配体之后测到所述疾病或 病症，给予所述对象额外剂量的多聚化配体。
B75.如实施例B43-B74中任一项所述的方法，所述方法还包括：
鉴定对象中病症或疾病是否存在或其阶段，和
传递指示以给予结合所述多聚化结合区域的多聚化配体，基于所述对象中鉴定的病症或疾病是否存在或其阶段来维持或调节给予所述患者的所述多聚化配体的后续剂量。
B76.如实施方式B72-B75中任一项所述的方法，其中所述病症是癌症。
B77.如实施方式B72-B75中任一项所述的方法，其中所述病症是白血病。
B78.如实施方式B72-B75中任一项所述的方法，其中所述病症是实体瘤。
B79.如实施方式B78所述的方法，该方法还包括：
相对给予所述多聚化配体之后的肿瘤尺寸和/或肿瘤细胞数量，确定对象中肿瘤尺寸是否增加和/或肿瘤细胞数量是否增加，和
在确定肿瘤尺寸增加和/或肿瘤细胞数量增加的事件中给予所述对象额外剂量的所述多聚化配体。
B80.如实施方式B77所述的方法，该方法还包括：
相对给予所述多聚化配体之后的表达CD19的B细胞的水平，确定对象中表达CD19的B细胞是否增加，和
在确定对象中表达CD19的B细胞增加的事件中给予所述对象额外剂量的所述多聚化配体。
B81.如实施方式B79所述的方法，其中相对于给予所述多聚化配体之前的肿瘤尺寸和/或肿瘤细胞，在给予所述多聚化配体之后的肿瘤尺寸和/或肿瘤细胞数量减低。
B82.如实施方式B80所述的方法，其中相对于给予所述多聚化配体之前的表达CD19的B细胞水平，在给予所述多聚化配体之后的表达CD19的B细胞水平减低。
B83.如实施方式B43-B74所述的方法，其中所述对象诊断为选自下组的病毒病因学感染：HIV、流感、疱疹、病毒性肝炎、爱波斯坦-巴尔病、脊髓灰质炎、病毒性脑炎、麻疹、水痘、巨细胞病毒(CMV)、腺病毒(ADV)、HHV-6(人疱疹病毒6、I)和人乳头状瘤病毒，或诊断为选自下组的细菌病因学感染：肺炎、肺结核和梅毒，或诊断为选自下组的寄生病因学感染：疟疾、锥虫病、利什曼病、滴虫病和阿米巴病。
C1.一种包含核酸的组合物，所述核酸包含编码诱导型嵌合抗原受体的多核苷酸，其中所述诱导型嵌合抗原受体包含多聚化区域、缺失TIR结构域的截短的MyD88多肽，和单链可变区片段。
C1.1.如实施方式C1所述的组合物，其中所述诱导性嵌合抗原受体还包含缺失所述胞外结构域的胞质CD40多肽。
C1.2.一种包含核酸的组合物，所述核酸包含编码诱导型嵌合抗原受体的多核苷酸，其中所述诱导型嵌合抗原受体包含多聚化区域、缺失胞外结构域的胞质CD40多肽，和单链可变区片段。
C2.如实施方式C1或C1.2所述的组合物，其中所述截短的MyD88多肽具有氨基酸序列SEQIDNO:86或其功能片段。
C2.1.如实施方式C1.1或C1.2所述的组合物，其中所述胞质CD40多肽具有氨基酸序列SEQIDNO:88或其功能片段。
C3-C6.保留
C7.如实施方式C1-C2.1中任一项所述的组合物，其中所述诱导型嵌合抗原受体还包括CD3ζ多肽。
C8.如实施方式C1-C7中任一项所述的组合物，其中所述多聚化区域选自FKBP、亲环蛋白受体、类固醇受体、四环素受体、重链抗体亚基、轻链抗体亚基、和其突变序列。
C9.如实施方式C1-C8中任一项所述的组合物，其中所述多聚化区域是FKBP12区域。
C10.如实施方式C1-C9中任一项所述的组合物，其中所述多聚化区域是FKB12v36区域。
C11.如实施方式C1-C8中任一项所述的组合物，其中所述多聚化区域是Fv’Fvls。
C12.如实施方式C1-C8中任一项所述的组合物，其中所述多聚化区域结合选自FK506二聚体和二聚化FK506类似物配体的配体。
C13.如实施方式C1-C12中任一项所述的组合物，其中所述配体是AP1903或AP20187。
C14.如实施方式C1-C13中任一项所述的组合物，其中所述多聚化区域具有氨基酸序列SEQIDNO:58或其功能片段。
C15.如实施方式C1-C14中任一项所述的组合物，其中所述多聚化区域由SEQIDNO:57中的核苷酸序列或其功能片段所编码。
C16.如实施方式C14所述的组合物，其中所述多聚化区域还包含具有氨基 酸序列SEQIDNO:60的多肽或其功能片段。
C17.如实施方式C15所述的组合物，其中所述多聚化区域还包含SEQIDNO:59中的核苷酸序列所编码的多肽或其功能片段。
C18.如实施方式C14或C16所述的组合物，其中所述多聚化区域还包含具有氨基酸序列SEQIDNO:60的多肽或其功能片段。
C19.如实施方式C15或C17所述的组合物，其中所述多聚化区域还包含SEQIDNO:59中的核苷酸序列所编码的多肽或其功能片段。
C20.如权利要求C14、C16或C18所述的组合物，其中所述多聚化区域还包含具有氨基酸序列SEQIDNO:58或SEQIDNO:60的多肽或其功能片段。
C21.如实施方式C15、C17或C19所述的组合物，其中所述多聚化区域还包含由SEQIDNO:57或SEQIDNO:59中的核苷酸序列所编码的多肽或其功能片段。
C22.如实施方式C1-C21中任一项所述的组合物，其中所述核酸包含可操作连接至所述多核苷酸的启动子序列。
C23.如实施方式C1-C22中任一项所述的组合物，其中所述核酸包含在病毒载体内。
C24.如实施方式C23所述的细胞，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体。
C25.如实施方式C24所述的组合物，其中所述逆转录病毒载体是鼠白血病病毒载体。
C26.如实施方式C24所述的组合物，其中所述逆转录病毒载体是SFG载体。
C27.如实施方式C23所述的组合物，其中所述病毒载体是腺病毒载体。
C28.如实施方式C23所述的细胞，其中所述病毒载体是慢病毒载体。
C29.如实施方式C1-C22中任一项所述的细胞，其中所述核酸包含在质粒内。
C30.转导或转化有实施方式C1-C29中任一项所述的组合物的细胞。
C31.如实施方式C30所述的细胞，其中所述细胞是T细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞、NK-T细胞或NK细胞。
C32.如实施方式C31所述的细胞，其中所述细胞是T细胞。
C33.如实施方式C1-C3中任一项所述的细胞，其中所述细胞获自骨髓或从其制备。
C34.如实施方式C1-C3中任一项所述的细胞，其中所述细胞获自脐带血或从其制备。
C35.如实施方式C1-C3中任一项所述的细胞，其中所述细胞获自外周血或从其制备。
C36.如实施方式C1-C3中任一项所述的细胞，其中所述细胞获自外周血单核细胞或从其制备。
C37.如实施方式C31-C3中任一项所述的细胞，其中所述细胞是人细胞。
C38.保留。
C39.如实施方式C1-C37中任一项所述的细胞，其中所述单链可变区片段结合肿瘤细胞上的抗原。
C40.如实施方式C1-C37中任一项所述的细胞，其中所述单链可变区片段结合细胞上的抗原，所述细胞涉及过度增殖性疾病。
C41.如实施方式C1-C40中任一项所述的细胞，其中所述单链可变区片段选自PSMA,αPSCA、αMUC1、αCD19、αROR1、α间皮素、αGD2、αCD123、αMUC16、和αHer2/Neu单链可变区片段。
C42.如实施方式C1-C40中任一项所述的细胞，其中所述单链可变区片段是αCD19单链可变区片段。
C42.1.如实施方式C1-C40中任一项所述的细胞，其中所述单链可变区片段是αPSCA单链可变区片段。
C43.一种诱导免疫应答的方法，所述方法包括将实施方式C1-C42.1所述的细胞与结合多聚化区域的配体接触，使所述诱导型嵌合抗原受体发生多聚化。
C44.如实施方式C43所述的方法，其中所述细胞体内接触所述配体。
C45.如实施方式C43或C44所述的方法，其中所述配体是二聚化的。
C46.如实施方式C45所述的方法，其中所述配体是二聚化FK506或二聚化FK506样类似物。
C47.如实施方式C45所述的方法，其中所述配体是AP1903或AP20187。
C48.如实施方式C43-C47中任一项所述的方法，还包括将所述转染或转化的细胞给予对象。
C49.如实施方式C48所述的方法，其中所述细胞通过静脉内给药来给予所述对象。
C50-C56.保留。
C56.如实施方式C43-C49中任一项所述的方法，其中所述对象诊断有肿瘤。
C57.如实施方式C43-C49中任一项所述的方法，其中所述对象患有癌症。
C58如实施方式C43-C49中任一项所述的方法，其中所述对象患有实体瘤。
C59.如实施方式C58所述的方法，其中所述细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞或T细胞。
C60.如实施方式C58或C59所述的方法，其中所述细胞递送至肿瘤床。
C61.如实施方式C57所述的方法，其中所述癌症存在于所述对象的血液或骨髓中。
C62.如实施方式C43-C49中任一项所述的方法，其中所述对象患有血液或骨髓疾病。
C63.如实施方式C43-C49中任一项所述的方法，其中所述对象诊断有可通过干细胞移植得到缓解的任何症状或紊乱。
C64.如实施方式C43-C49中任一项所述的方法，其中所述对象诊断有镰状细胞贫血或异染色性脑白质病变。
C65.如实施方式C43-C49中任一项所述的方法，其中所述患者诊断有选自 下组的症状：原发性免疫缺陷症、嗜血淋巴组织细胞瘤病(HLH)或其他噬血细胞紊乱、遗传性骨髓衰竭症、血红蛋白病、代谢紊乱和破骨细胞紊乱
C66.如实施方式C43-C49中任一项所述的方法，其中所述病症选自：严重联合免疫缺陷(SCID)、联合免疫缺陷(CID)、先天性T细胞缺陷/不足、常见变异型免疫缺陷病(CVID)、慢性肉芽肿性疾病、IPEX(免疫缺陷、多内分泌病变、肠病、X连锁)或IPEX样病、维斯科特-奥尔德里奇综合征、CD40配体缺陷、白细胞粘附缺陷、DOCK8缺陷、IL-10不足/IL-10受体缺陷、GATA2缺陷、X-连锁淋巴细胞增生性疾病(XLP)、软骨毛发发育不良、施戴二氏综合征(ShwachmanDiamondSyndrome)、先天性纯红细胞再生障碍性贫血、先天性角化不良、范可尼贫血、先天性中性粒细胞减少、镰状细胞病、地中海贫血、黏多糖贮积症、鞘脂类代谢障碍和石骨症。
C67.一种治疗对象白血病的方法，所述方法包括将实施方式C1-C42.1中任一项所述的细胞给予对象和将多聚化配体给予对象。
C68.如实施方式C67所述的方法，其中所述单链可变区片段结合CD19。
C69.如实施方式C67或C68所述的方法，其中所述多聚化配体是AP1903或AP20187。
C70.如实施方式C67-C69中任一项所述的方法，其中所述细胞是T细胞。
C71.如实施方式C43-C70中任一项所述的方法，其中所述对象是人。
C72.如实施方式C43-C71中任一项所述的方法，所述方法还包括确定是否将额外剂量的所述多聚化配体给予所述患者。
C73.如实施方式C43-C72中任一项所述的方法，所述方法还包括将额外剂量的所述多聚化配体给予所述患者，其中所述疾病或病症症状保持或在症状减轻后 测到。
C74.如实施方式C73所述的方法，其中所述对象在给予实施方式1-42.1中任一项所述的细胞之前诊断有疾病或病症，在给予多聚化配体之后测到所述疾病或病症，给予所述对象额外剂量的多聚化配体。
C75.如实施例C43-C74中任一项所述的方法，所述方法还包括：
鉴定对象中病症或疾病是否存在或其阶段，和
传递指示以给予结合所述多聚化结合区域的多聚化配体，基于所述对象中鉴定的病症或疾病是否存在或其阶段来维持或调节给予所述患者的所述多聚化配体的后续剂量。
C76.如实施方式C72-C75中任一项所述的方法，其中所述病症是癌症。
C77.如实施方式C72-C75中任一项所述的方法，其中所述病症是白血病。
C78.如实施方式C72-C75中任一项所述的方法，其中所述病症是实体瘤。
C79.如实施方式C78所述的方法，该方法还包括：
相对给予所述多聚化配体之后的肿瘤尺寸和/或肿瘤细胞数量，确定对象中肿瘤尺寸是否增加和/或肿瘤细胞数量是否增加，和
在确定肿瘤尺寸增加和/或肿瘤细胞数量增加的事件中给予所述对象额外剂量的所述多聚化配体。
C80.如实施方式C77所述的方法，该方法还包括：
相对给予所述多聚化配体之后的表达CD19的B细胞的水平，确定对象中表达CD19的B细胞是否增加，和
在确定对象中表达CD19的B细胞增加的事件中给予所述对象额外剂量的所述多聚化配体。
C81.如实施方式C79所述的方法，其中相对于给予所述多聚化配体之前的肿瘤尺寸和/或肿瘤细胞，在给予所述多聚化配体之后的肿瘤尺寸和/或肿瘤细胞数量减低。
C82.如实施方式C80所述的方法，其中相对于给予所述多聚化配体之前的表达CD19的B细胞水平，在给予所述多聚化配体之后的表达CD19的B细胞水平减低。
C83.如实施方式C43-C74所述的方法，其中所述对象诊断为选自下组的病毒病因学感染：HIV、流感、疱疹、病毒性肝炎、爱波斯坦-巴尔病、脊髓灰质炎、病毒性脑炎、麻疹、水痘、巨细胞病毒(CMV)、腺病毒(ADV)、HHV-6(人疱疹病毒6、I)和人乳头状瘤病毒，或诊断为选自下组的细菌病因学感染：肺炎、肺结核和梅毒，或诊断为选自下组的寄生病因学感染：疟疾、锥虫病、利什曼病、滴虫病和阿米巴病。
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本文中引用的各专利、专利申请、出版物和文献的全部内容均通过引用纳入本文。对上述专利、专利申请、出版物和文献的引用并不表示承认上述任何内容是相关的现有技术，也并不表示承认这些出版物或文献的内容或日期。
可以对上述内容进行改变而不背离本技术的基本方面。尽管参考一个或多个具体实施方式充分详细描述了本技术，但是本领域普通技术人员应认识到可对本申请中具体公开的实施方式进行改变，而这些改良和改进在本技术的范围和精神内。
本文中适当地说明性描述的技术可在没有任何本文未具体公开的元素的情况下实施。因此，例如，在本文的各个例子中，术语“包括”、“基本由……组成”和“由……组成”中的任何一个都可用其它两个中的任意一个代替。已经使用的术语和表达用作说明而非限制性的术语，此类术语和表达的使用并不排除对所显示和所描 述的特征或其部分的任何等价物，以及在要求权利的本技术范围内可进行各种改良。术语“一个”或“一种”表示一种或多种其修饰的元素(例如“一种试剂”可表示一种或多种试剂)，除非上下文清楚表示所描述的是元素之一或是一种以上的元素。本文所使用的术语“约”表示在基础参数的10％范围内的数值(即±10％)，在一列数值的开头处使用的术语“约”表示修饰该列数值中的每个数值(即“约1、2和3”指约1、约2和约3)。例如，“约100克”的重量能包含90克-110克的重量。此外，当本文描述数值列表(例如，约50％、60％、70％、80％、85％或86％)时，该列表包含其所有中间值和分数值(例如，54％、85.4％)。因此，应理解，尽管通过代表性实施方式和任选的特征具体公开了本技术，但是本领域技术人员能对本文所公开内容进行改良和变化，应认为此类改良和变化落在本技术的范围内。
本技术的某些实施方式在所附的权利要求中列出。