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1、10申请公布号CN104220082A43申请公布日20141217CN104220082A21申请号201080031174422申请日20100511CNCMI261820010129CNCMI386520071115CNCMI344620050607CNCMI211619990112CGMCC137242003103109159929020090511EP09159925820090511EPA61K35/74200601A23L1/30200601A23L1/29200601A61P37/0420060171申请人雀巢产品技术援助有限公司地址瑞士沃韦72发明人A梅赛尼尔S努特恩G普里乌。
2、特74专利代理机构北京市中咨律师事务所11247代理人凌立黄革生54发明名称包含益生菌的成年胃肠不耐患者专用营养制剂57摘要本发明涉及成人营养领域。具体而言，本发明涉及预期用于胃肠道功能受损的成人的营养组合物。本发明的一个实施方案涉及包含益生微生物的对胃肠道功能受损的成人施用的营养组合物。益生微生物可以是非复制型，例如生物活性的热处理的益生微生物。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2012011086PCT国际申请的申请数据PCT/EP2010/0563962010051187PCT国际申请的公布数据WO2010/130701EN2010111883生物保藏信息51INTCL权利要。
3、求书1页说明书16页附图12页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书16页附图12页10申请公布号CN104220082ACN104220082A1/1页21对患有胃肠道功能受损的成人施用的组合物，其向患者提供完全营养，且包含益生微生物。2权利要求1的组合物，其具有0914KCAL/ML的范围内的热量密度、380400MOSM/KG水的范围内的重量摩尔渗透压浓度，且包含占组合物卡路里的约2327的蛋白质源、占组合物卡路里的约3438的糖类源和占组合物卡路里的约3741的脂质源，且具有701至801的范围内的NPCN比率。3前述权利要求中任一项的组合物，其包含N6N。
4、3脂肪酸比率在151至21的范围内和/或MCTLCT比率在5545至4555的范围内的脂质源。4前述权利要求中任一项的组合物，其包含约7983自由水。5前述权利要求中任一项的组合物，其中所述益生微生物包含非复制型益生微生物。6前述权利要求中任一项的组合物，其以对应于约106至1012CFU的量包含益生微生物。7权利要求56中任一项的组合物，其中通过热处理，优选通过在至少715下高温处理至少1秒来使所述非复制型益生微生物成为非复制型。8权利要求7的组合物，其中所述热处理是在约715150下高温处理约1120秒，且优选是高温/短时间HTST处理或超高温UHT处理。9权利要求8的组合物，其用于预防或。
5、治疗炎性障碍。10权利要求7的组合物，其中所述热处理在约70150的温度范围内进行约3分钟至2小时，优选在80140的范围内进行5分钟至40分钟。11权利要求10的组合物，其用于预防或治疗与免疫防御损伤相关的障碍。12前述权利要求中任一项的组合物，其中所述益生菌的至少90、优选至少95、更优选至少98、最优选至少99、理想地至少999、最理想地全部是非复制型。13前述权利要求中任一项的组合物，其中所述益生微生物选自双歧杆菌、乳杆菌、丙酸杆菌或其组合，例如长双歧杆菌、乳双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、类干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、路氏乳杆菌、鼠。
6、李糖乳杆菌、约氏乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、乳乳球菌、嗜热链球菌、乳乳球菌、二乙酰乳乳球菌、乳脂乳球菌、保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌、德氏乳杆菌、大肠杆菌和/或其组合。14前述权利要求中任一项的组合物，其中所述益生微生物选自长双歧杆菌NCC3001、长双歧杆菌NCC2705、短双歧杆菌NCC2950、乳双歧杆菌NCC2818、约氏乳杆菌LA1、类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007、路氏乳杆菌DSM17983、路氏乳杆菌ATCC55730、嗜热链球菌NCC2019、嗜热链球菌NCC2059、干酪乳杆菌NCC4006、嗜酸乳杆菌NCC3009、干酪乳杆菌ACADC6002NCC。
7、1825、尼氏大肠杆菌、保加利亚乳杆菌NCC15、乳乳球菌NCC2287或其组合。15前述权利要求中任一项的组合物，其每个日剂量包含约0,005MG1000MG非复制型微生物。权利要求书CN104220082A1/16页3包含益生菌的成年胃肠不耐患者专用营养制剂0001本发明涉及成人营养领域。具体而言，本发明涉及预期用于胃肠道功能受损的成人的营养组合物。本发明的一个实施方案涉及包含益生微生物的对胃肠道功能受损的成人施用的营养组合物。益生微生物可以是非复制型，例如生物活性的热处理益生微生物。0002成人具有基于例如其年龄、性别或体力活动水平的具体营养需要。平衡的饮食通常可以满足那些需要，并向身体。
8、提供所有所需营养物。0003但是，一些成人患有胃肠GI道功能受损。因此，并非总是想要或能够向身体供给足量营养物。0004这类成人通常患有例如食欲降低、体积不耐、便秘或腹泻，其或者不允许足够的食物摄取，或者不允许从所摄入的食物正确吸收所需营养物。0005已针对这类情况开发了专用营养组合物，使得甚至在不利情况下也仍然可以满足这类患者的特殊需要。0006通常，在食物摄取不足的情况下，处理食物组合物中的常量营养物，以使它们更易于吸收。0007然而，还希望支持肠道功能，使得消化系统更有效地工作。0008胃肠道功能受损引起的营养不良通常弱化免疫系统。0009还希望组合物具有抗炎作用。0010因此，希望以在。
9、疾病或从疾病恢复的情况下降低炎症程度的天然组合物和/或以允许肠道更好地起作用的手段，不仅向患者提供营养支持，而且提供免疫系统支持。0011因此，本领域中存在对营养组合物的需要，该营养组合物允许根据成年患者的具体需要向他们提供专用营养，同时减少炎症、强化免疫系统和/或改善消化。优选通过使用天然成分来达到此目的，该天然成分可以在无副作用的情况下安全施用，且易于用工业处理掺入营养补充物中。0012本发明人已满足了此需要。因此，本发明的目的是改进现有技术的状态和提供满足上述需要的对成人施用的营养组合物。0013令本发明人惊奇地，他们可以通过独立权利要求的主题来达到此目的。从属权利要求进一步发展了本发明。
10、的想法。0014因此，本发明人提出提供包含益生菌的对患有胃肠道功能受损的成人施用的具体的口服营养组合物。0015为了本发明的目的，将成人理解为至少18岁的人类。0016发现益生菌能够在液体营养组合物的构架中提供它们的健康益处。0017对具体患者施用的液体营养组合物通常具有超过包含益生菌的酸奶饮料的保质期的保质期，由于可以在延长的保质期内确保益生菌的存活力的不确定性，目前未在这类营养组合物中加入益生菌。0018本发明人现在能够显示，甚至非复制型益生菌也可以提供益生菌的健康益处，且甚至可以具有改善的益处。0019因此，本发明的一个实施方案是对成人施用的组合物，该组合物提供对患者的完说明书CN104。
11、220082A2/16页4全营养，且包含益生微生物。0020成人可以患有例如胃肠道功能受损。0021如果患者从此组合物获得所有所需营养物而无需其他食物来源，则该组合物提供完全营养。0022本发明的组合物可以作为通过管饲口服施用的营养组合物或作为通过管饲肠内施用的营养组合物提供。0023本发明的营养组合物向胃肠道损伤患者提供中度高热量、非常高蛋白质、100酶水解乳清的全元素医学食物。0024设计此组合物来满足患者的需要，该患者可以经历氧化应激、炎症和/或进食不耐。0025存在于组合物中的肽可以完全或部分基于乳清，以便于胃排空。作为完全基于乳清的蛋白质源，可以使用酶水解的乳清蛋白。0026本发明的。
12、一个实施方案是组合物，该组合物具有0914KCAL/ML的范围内的热量密度CALORICDENSITY、380400MOSM/KG水的范围内的重量摩尔渗透压浓度，且包含占组合物卡路里CALORIES的约2327的蛋白质源、占组合物卡路里的约3438的糖类源和占组合物卡路里的约3741的脂质源。0027非常高的蛋白质含量支持身体在应激期间的需要。0028因此，组合物可以具有701至801的范围内的NPCN比率。通过计算每天提供的氮的克数1GN625G蛋白质，并用总的非蛋白质千卡数KCALORIES除以氮的克数来计算非蛋白质千卡与氮之比率NPCN。0029通常，将NPCN比率在801的范围内的营养。
13、补充物用于最严重应激的患者，NPCN比率在1001的范围内的营养补充物用于严重应激的患者，而NPCN比率在1501的范围内的营养补充物用于未应激的患者。0030本发明的组合物可以包含具有151至21的范围内的N6N3脂肪酸比率，和/或5545至4555的范围内的MCTLCT比率的脂质源。0031大量的N3脂肪酸有助于调节炎症反应。平衡肽谱和MCT油促进吸收和GI耐受。选择高MCTLCT比率来降低脂肪吸收障碍的可能性。0032本发明的组合物可以包含纤维来帮助促进健康的肠道微生物区系。可以使用豌豆纤维、寡聚果糖、菊粉及其组合。纤维可以以56G/L的量存在。在一个实施方案中，使用寡聚果糖和菊粉的组合。
14、。0033通常，本发明的组合物包含约7983自由水。自由水是满足最低流体需要必不可少的。通常，胃肠道功能受损的患者饮水不足。0034本发明的组合物可以用于肿瘤患者、IBD炎性肠病、短肠综合征、败血症、危重症、胃肠道损伤、胃肠道瘘、感染、恶心、呕吐、手术前和手术后病症、压力性溃疡、伤口处理、静脉淤滞性溃疡、呼吸机依赖性、烧伤、重症监护条件、局限性肠炎、腹泻、脂肪吸收障碍、谷蛋白不耐、代谢亢进、消化和吸收受损、乳糖不耐、肠道功能受限、代谢应激状态、呼吸性疾病、过渡进食TPN后、早期手术后进食、肠切除、胰腺炎或其组合的营养管理。0035组合物可以包含部分或仅包含非复制型益生微生物。0036发明人惊奇。
15、地看到，例如就免疫强化作用而言和/或就抗炎作用而言，非复制型说明书CN104220082A3/16页5益生微生物可以甚至比复制型益生微生物更有效。0037这是令人惊奇的，因为通常将益生菌定义为“在以足够的量施用时赋予宿主健康益处的活微生物”FAO/WHO指南。绝大多数公开的文献涉及活益生菌。此外，几项研究调查通过非复制型细菌传递的健康益处，它们中的大多数显示，例如通过热处理失活益生菌导致它们声称的健康益处的丧失RACHMILEWITZ，D等，2004，GASTROENTEROLOGY126520528；CASTAGLIUOLO等，2005，FEMSIMMUNOLMEDMICROBIOL4319。
16、7204；GILL，HS和KJRUTHERFURD，2001，BRJNUTR86285289；KAILA，M等，1995，ARCHDISCHILD725153。一些研究显示，灭活益生菌可以保留一些健康作用RACHMILEWITZ，D等，2004，GASTROENTEROLOGY126520528；GILL，HS和KJRUTHERFURD，2001，BRJNUTR86285289，但显然，到目前为止，本领域中认为活益生菌更有效。0038本发明的组合物可以以任意有效量，例如以对应于约106至1012CFU/G干重的量包含益生微生物。0039益生微生物可以是非复制型益生微生物。0040“非复制型”益。
17、生微生物包含经热处理的益生菌。这包含失活、死亡、不能生活和/或作为诸如DNA、代谢物、胞质化合物和/或细胞壁物质的片段存在的微生物。0041“非复制型”意指通过经典平板接种法不能检测到活细胞和/或菌落形成单位。这类经典平板接种法总结在微生物学书籍JAMESMONROEJAY，MARTINJLOESSNER，DAVIDAGOLDEN2005MODERNFOODMICROBIOLOGY第7版，SPRINGERSCIENCE，NEWYORK，NY790P中。通常，活细胞的缺乏可以显示如下用不同浓度的细菌制剂“非复制型”样品接种并在适当条件下孵育有氧和/或缺氧环境下至少24小时后琼脂平板上无可见菌落或。
18、液体生长培养基中无增加的浊度。0042为了本发明的目的，将益生菌定义为“对宿主的健康或康乐具有有益作用的微生物细胞制剂或微生物细胞的成分”。SALMINENS，OUWEHANDABENNOY等“PROBIOTICSHOWSHOULDTHEYBEDEFINED”TRENDSFOODSCITECHNOL19991010710。0043使用非复制型益生微生物的可能性提供了几个优势。在严重无免疫应答的患者中，由于发生菌血症的潜在风险，可以将活益生菌的使用限制在例外病例中。可以无任何问题地使用非复制型益生菌。0044此外，非复制型益生微生物的提供允许热重构，同时保持健康益处。0045本发明的组合物以足以。
19、至少部分产生健康益处的量包含益生微生物和/或非复制型益生微生物。将足以达到此目的的量定义为“治疗有效剂量”。对此目的有效的量将取决于本领域技术人员已知的许多因素，如患者的体重和一般健康状态，且取决于食物基质的作用。0046在预防性应用中，以足以至少部分降低发生障碍的风险的量对易感该障碍或处于该障碍的风险的消费者施用本发明的组合物。将这种量定义为“预防有效剂量”。同样，精确的量取决于许多因素，如患者的健康状态和体重，且取决于食物基质的作用。0047本领域技术人员将能够适当地调节治疗有效剂量和/或预防有效剂量。0048一般而言，本发明的组合物以治疗有效剂量和/或以预防有效剂量包含益生微生物和/或非。
20、复制型益生微生物。0049通常，治疗有效剂量和/或预防有效剂量在每个日剂量约0,005MG1000MG益生微说明书CN104220082A4/16页6生物和/或非复制型益生微生物的范围内。0050就数值量而言，“短时间高温”处理的非复制型微生物可以以对应于104至1012等同CFU/G干组合物的量存在于组合物中。显然，非复制型微生物不形成菌落，因此，此术语应理解为从104至1012CFU/G复制型细菌获得的非复制型微生物的量。这包含失活、不能存活或死亡或作为诸如DNA或细胞壁或胞质化合物的片段存在的微生物。换言之，按照该量的微生物的菌落形成能力CFU来表示组合物所包含的微生物的量，就如同所有微。
21、生物都是活的一样，而不考虑它们实际上是否是非复制型，如失活或死亡、片段化或任意或所有这些状态的混合。0051优选地，非复制型微生物以等同于104至109CFU/G干组合物的量、甚至更优选以等同于105至109CFU/G干组合物的量存在。0052可以通过本领域已知的任意方法使益生菌成为非复制型。0053使益生菌株成为非复制型的目前可获得的技术通常是热处理、照射、紫外光或使用化学试剂福尔马林、多聚甲醛。0054可以优选使用在食品工业中的工业环境下相对易于应用的技术来使益生菌成为非复制型。0055目前市场上的大多数包含益生菌的产品是在其产生过程中经热处理的产品。因此便于能够与所产生的产品一起或至少以。
22、相似的方式热处理益生菌，同时益生菌保持或改善了它们的有益特性或甚至获得新的对消费者有益的特性。0056但是，通过热处理失活益生微生物在文献中一般与益生活性的至少部分丧失相关。0057本发明人现已惊奇地发现，例如通过热处理使益生微生物成为非复制型未导致益生健康益处的丧失，相反，可以增强现有健康益处和甚至产生新的健康益处。0058因此，本发明的一个实施方案是组合物，其中通过热处理使非复制型益生微生物成为非复制型。0059这种热处理可以在至少715下进行至少1秒。0060可以使用长期热处理或短期热处理。0061在目前的工业规模中，通常优选短期热处理，如UHT样热处理。这类热处理减少了细菌接种量，并减。
23、少了处理时间，从而减少了营养物的破坏。0062发明人首次表明，无论它们的起始特性如何，在高温下短时间热处理的益生微生物都显示抗炎免疫特性。具体而言，通过此热处理，产生了新的抗炎特性，或增强了现有抗炎特性。0063因此，即使活对应物不是抗炎菌株，现在也可能通过使用对应于典型的可在工业上应用的热处理的具体热处理参数来产生具有抗炎免疫特性的非复制型益生微生物。0064因此，例如，热处理可以是在约715150下高温处理约1120秒。高温处理可以是高温/短时间HTST处理或超高温UHT处理。0065可以在约715150下对益生微生物进行约1120秒的短期高温处理。0066更优选可以在约90140，例如9。
24、0120下对微生物进行约130秒的短期高温处理。0067此高温处理使微生物成为至少部分非复制型。说明书CN104220082A5/16页70068高温处理可以在正常大气压下进行，但也可以在高压下进行。典型的压力范围为1至50BAR，优选1至10BAR，甚至更优选2至5BAR。显然，应用热时，优选在液体或固体的介质中热处理益生菌。因此，所应用的理想压力将取决于其中提供了微生物的组合物的性质，且取决于所用温度。0069高温处理可以在约715150、优选约90120、甚至更优选约120140的温度范围内进行。0070高温处理可以短期进行约1120秒、优选约130秒、甚至更优选约515秒。0071此给。
25、定的时间范围指益生微生物经受给定的温度的时间。注意，取决于其中提供了微生物的组合物的性质和量及取决于所使用的加热器的结构，热应用的时间可以不同。0072通常，但是，通过高温短时间HTST处理、巴氏瞬间灭菌法或超高温UHT处理来处理本发明的组合物和/或微生物。0073UHT处理是涉及通过在超过135275杀死牛奶中的细菌孢子所需的温度的温度下短时间约110秒加热组合物来对它进行至少部分灭菌的超高温处理或超热处理都缩写为UHT。例如，用超过135的温度以此方式处理牛奶允许细菌接种量在使得能够进行连续流操作的必要保持时间至25秒内减少。0074存在两种主要的UHT系统类型直接系统和间接系统。在直接系。
26、统中，通过蒸汽注射或蒸汽注入来处理产品，而在间接系统中，用板式换热器、管式换热器或刮面式换热器热处理产品。可以在产物制备方法的任意一个或多个步骤应用UHT系统的组合。0075HTST处理定义如下高温/短时间设计来达到牛奶中存活微生物数目的5个对数降低，杀死99,9999的巴斯德消毒法。认为这足以破坏几乎所有酵母、霉菌和常见的腐败细菌，以及确保充分破坏常见的致病耐热生物。在HTST法中，将牛奶加热至7171611520秒。0076巴氏瞬间灭菌法是易腐饮料，如果汁和蔬菜汁、啤酒及乳制品的热巴斯德消毒法。它在灌装入容器中之前进行，以杀死腐败微生物、使产品更安全和延长它们的保质期。液体在受控连续流中移。
27、动，同时经受715160至74165的温度约15至30秒。0077为了本发明的目的，术语“短时间高温处理”将包括例如高温短时间HTST处理、UHT处理和巴氏瞬间灭菌法。0078由于这种热处理提供具有改善的抗炎特性的非复制型益生菌，本发明的组合物可以用于预防或治疗炎性障碍。0079不具体限制可以通过本发明的组合物治疗或预防的炎性障碍。例如，它们可以选自急性炎症，如败血症；烧伤；和慢性炎症，如炎性肠病，例如局限性肠炎、溃疡性结肠炎、隐窝炎；坏死性小肠结肠炎；皮肤炎症，如UV或化学药品诱导的皮肤炎症、湿疹、反应性皮肤；肠易激综合症；眼睛炎症；变态反应、哮喘；及其组合。0080如果用长期热处理来使益生。
28、微生物成为非复制型，则这种热处理可以在约70150的温度范围内进行约3分钟至2小时，优选在80140的范围内进行5分钟至40分钟。0081虽然现有技术一般教导，就发挥它们的益生特性而言，通过长期热处理使之成为非复制型的细菌通常不如活细胞有效，但本发明人能够表明，与它们的活对应物相比，热处理的益生菌在刺激免疫系统中更优。说明书CN104220082A6/16页80082本发明还涉及包含益生微生物的组合物，通过在至少约70下热处理至少约3分钟来使该益生微生物成为非复制型。0083通过体外免疫特性分析IMMUNOPROFILING确认了非复制型益生菌的免疫强化作用。所使用的体外模型使用来自人外周血单。
29、核细胞PBMC的细胞因子谱分析PROFILING，且作为用于测试免疫调节化合物的标准模型在本领域被广为接受SCHULTZ等，2003，JOURNALOFDAIRYRESEARCH70，165173；TAYLOR等，2006，CLINICALANDEXPERIMENTALALLERGY，36，12271235；KEKKONEN等，2008，WORLDJOURNALOFGASTROENTEROLOGY，14，11921203。0084几个作者/研究小组已用体外PBMC测定来例如根据益生菌的免疫特性，即它们的抗炎或促炎特征来分类它们KEKKONEN等，2008，WORLDJOURNALOFGASTR。
30、OENTEROLOGY，14，11921203。例如，已显示此测定允许预测益生候选者在肠结肠炎的小鼠模型中的抗炎作用FOLIGNE，B等，2007，WORLDJGASTROENTEROL13236243。此外，此测定常用作临床试验中的读出，并显示导致与临床结果相关的结果SCHULTZ等，2003，JOURNALOFDAIRYRESEARCH70，165173；TAYLOR等，2006，CLINICALANDEXPERIMENTALALLERGY，36，12271235。0085变应性疾病在过去几十年中已稳步增加，且目前WHO将它们视为流行病。一般而言，认为变态反应由免疫系统的TH1和TH2应答。
31、之间的不平衡引起，该不平衡导致趋向于产生TH2介质MDIATOR的强趋势。因此，可以通过恢复免疫系统的TH1和TH2双臂间的恰当平衡来缓解、下调或预防变态反应。这意味着必需降低TH2应答，或至少瞬时增强TH1应答。后者可以是通常伴随例如更高水平的IFN、TNF和IL12的免疫强化应答的特征。KEKKONEN等，2008，WORLDJOURNALOFGASTROENTEROLOGY，14，11921203；VILJANENM等，2005，ALLERGY，60，494500。0086因此，本发明的组合物允许治疗或预防与免疫防御损伤相关的障碍。0087因此，不具体限制可以通过本发明的组合物治疗或预防。
32、的与免疫防御损伤相关的障碍。0088例如，它们可以选自感染，尤其是细菌、病毒、真菌和/或寄生虫感染；吞噬细胞缺乏；低至严重的免疫抑制水平，如由应激或免疫抑制药物、化学疗法或放射治疗诱导的那些；较低免疫活性的免疫系统的天然状态，如新生儿的那些；变态反应；及其组合。0089本发明中所述的组合物还允许增强患者对疫苗，尤其是对口服疫苗的应答。0090任意量的非复制型微生物都将是有效的。但是，一般优选至少90、优选至少95、更优选至少98、最优选至少99、理想地至少999、最理想地所有的益生菌是非复制型。0091在本发明的一个实施方案中，所有微生物都是非复制型。0092因此，在本发明的组合物中，至少90。
33、、优选至少95、更优选至少98、最优选至少99、理想地至少999、最理想地所有的益生菌可以是非复制型。0093为了本发明的目的，可以使用所有益生微生物。0094例如，益生微生物可以选自双歧杆菌BIFIDOBACTERIA、乳杆菌LACTOBACILLI、丙酸杆菌PROPIONIBACTERIA或其组合，例如长双歧杆菌BIFIDOBACTERIUMLONGUM、乳双歧杆菌BIFIDOBACTERIUMLACTIS、动物双歧杆菌BIFIDOBACTERIUMANIMALIS、短双说明书CN104220082A7/16页9歧杆菌BIFIDOBACTERIUMBREVE、婴儿双歧杆菌BIFIDOBAC。
34、TERIUMINFANTIS、青春双歧杆菌BIFIDOBACTERIUMADOLESCENTIS、嗜酸乳杆菌LACTOBACILLUSACIDOPHILUS、干酪乳杆菌LACTOBACILLUSCASEI、类干酪乳杆菌LACTOBACILLUSPARACASEI、唾液乳杆菌LACTOBACILLUSSALIVARIUS、路氏乳杆菌LACTOBACILLUSREUTERI、鼠李糖乳杆菌LACTOBACILLUSRHAMNOSUS、约氏乳杆菌LACTOBACILLUSJOHNSONII、植物乳杆菌LACTOBACILLUSPLANTARUM、发酵乳杆菌LACTOBACILLUSFERMENTUM、。
35、乳乳球菌LACTOCOCCUSLACTIS、嗜热链球菌STREPTOCOCCUSTHERMOPHILUS、乳乳球菌、二乙酰乳乳球菌LACTOCOCCUSDIACETYLACTIS、乳脂乳球菌LACTOCOCCUSCREMORIS、保加利亚乳杆菌LACTOBACILLUSBULGARICUS、瑞士乳杆菌LACTOBACILLUSHELVETICUS、德氏乳杆菌LACTOBACILLUSDELBRUECKII、大肠杆菌ESCHERICHIACOLI和/或其混合物。0095本发明的组合物可以例如包含选自长双歧杆菌NCC3001、长双歧杆菌NCC2705、短双歧杆菌NCC2950、乳双歧杆菌NCC28。
36、18、约氏乳杆菌LA1、类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007、路氏乳杆菌DSM17983、路氏乳杆菌ATCC55730、嗜热链球菌NCC2019、嗜热链球菌NCC2059、干酪乳杆菌NCC4006、嗜酸乳杆菌NCC3009、干酪乳杆菌ACADC6002NCC1825、尼氏大肠杆菌ESCHERICHIACOLINISSLE、保加利亚乳杆菌NCC15、乳乳球菌NCC2287或其组合的益生微生物。0096所有这些菌株或是在布达佩斯条约BUDAPESTTREATY下保藏和/或是可商购获得的。0097已在布达佩斯条约下保藏的菌株如下0098长双歧杆菌NCC3001ATCCBAA9990。
37、099长双歧杆菌NCC2705CNCMI26180100短双歧杆菌NCC2950CNCMI38650101乳双歧杆菌NCC2818CNCMI34460102类干酪乳杆菌NCC2461CNCMI21160103鼠李糖乳杆菌NCC4007CGMCC137240104嗜热链球菌NCC2019CNCMI14220105嗜热链球菌NCC2059CNCMI41530106乳乳球菌NCC2287CNCMI41540107干酪乳杆菌NCC4006CNCMI15180108干酪乳杆菌NCC1825ACADC60020109嗜酸乳杆菌NCC3009ATCC7003960110保加利亚乳杆菌NCC15CNCMI11。
38、980111约氏乳杆菌LA1CNCMI12250112路氏乳杆菌DSM17983DSM179830113路氏乳杆菌ATCC55730ATCC557300114尼氏大肠杆菌1917DSM66010115本领域技术人员将理解，它们可以自由地组合本文中所述的本发明的所有特征，而不偏离所公开的发明的范围。0116本发明的其他优势和特征从以下实施例和附图显而易见。说明书CN104220082A8/16页100117图1A和B显示用“短时间高温”处理的益生菌的抗炎免疫特性的增强。0118图2显示变为抗炎型的非抗炎益生菌株，即用“短时间高温”处理后显示显著的体外抗炎免疫特性的非抗炎益生菌株。0119图3A和。
39、B显示用于市售产品中的益生菌株，其在用“短时间高温”处理后显示增强的或新的体外抗炎免疫特性。0120图4A和B显示乳制品起子菌株即LC1起子菌株，其在高温下热处理时显示增强的或新的体外抗炎免疫特性。0121图5显示非抗炎益生菌株，其在用HTST处理处理后显示体外抗炎免疫特性。0122图6以它们的活体形式和热处理140，15秒形式用益生菌株和乳制品起子菌株产生的PBMC数据IL12P40、IFN、TNF、IL10上的主成分分析。每个点代表通过其NCC编号或名称来辨别的一个活的或热处理的菌株。0123图7显示活的和热处理85、20分钟的菌株的IL12P40/IL10比率。总体上，与本发明的“短时间。
40、高温”处理相反，在85下热处理20分钟导致IL12P40/IL10比率的增加图1、2、3、4和5。0124图8显示来自用热处理的细菌刺激的人PBMC的体外细胞因子分泌的增强。0125图9显示在用盐水攻击的OVA致敏小鼠阴性对照、用OVA攻击的OVA致敏小鼠阳性对照及用OVA攻击并用热处理的或活的短双歧杆菌NCC2950处理的OVA致敏小鼠中观察到的腹泻强度的百分比。结果显示为腹泻强度的百分比从4个独立实验计算的平均值SEM，100的腹泻强度对应于阳性对照用变应原致敏和攻击组中发生的症状。0126实施例10127方法学0128细菌制剂0129一般认为通过活益生菌对宿主免疫系统传递的健康益处是菌株。
41、特异性的。已显示在体外诱导高水平IL10和/或诱导低水平促炎细胞因子PBMC测定的益生菌是有效的体内抗炎菌株FOLIGN，B等，2007，WORLDJGASTROENTEROL13236243。0130用几种益生菌株来研究热处理的益生菌的抗炎特性。这些菌株是长双歧杆菌NCC3001、长双歧杆菌NCC2705、短双歧杆菌NCC2950、乳双歧杆菌NCC2818、类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007、干酪乳杆菌NCC4006、嗜酸乳杆菌NCC3009、干酪乳杆菌ACADC6002NCC1825和尼氏大肠杆菌。还测试了包括商业上用来产生NESTLLC1发酵产物的一些菌株的几个起子培。
42、养物菌株嗜热链球菌NCC2019、嗜热链球菌NCC2059、保加利亚乳杆菌NCC15和乳乳球菌NCC2287。0131在针对各菌株优化的条件下在515L生物反应器中培养细菌细胞。可以使用所有典型的细菌生长培养基。这类培养基为本领域技术人员已知。调节PH至55时，连续加入30碱溶液NAOH或CAOH2。适当时，通过用CO2处理顶空来维持无氧条件。在标准有氧条件下培养大肠杆菌。0132通过离心5,000G、4收集细菌细胞，并以适当的体积重悬在磷酸缓冲盐溶液PBS中，以达到约1091010CFU/ML的终浓度。用15的甘油将部分制剂冷冻在80。通过以下来热处理另一部分细胞0133超高温140，15秒。
43、；通过直接的蒸汽注射；说明书CN104220082A109/16页110134高温短时间HTST74、90和120，15秒，通过直接的蒸汽注射；0135水浴中长时间低温85，20分钟0136热处理后，使样品在80下保持冷冻直至使用。0137细菌制剂的体外免疫特性分析0138评估了活的和热处理的细菌制剂的免疫特性即从体外人血细胞诱导特异性细胞因子分泌的能力。从血液滤器分离了人外周血单核细胞PBMC。通过细胞密度梯度分开后，收集单核细胞，并用HANKS平衡盐溶液洗涤两次。然后将细胞重悬在补充了10胎牛血清BIOCONCEPT，巴黎，法国、1L谷氨酰胺SIGMA、1青霉素/链霉素SIGMA和01庆大。
44、霉素SIGMA的ISCOVESMODIFIEDDULBECCOSMEDIUMIMDM，SIGMA中。用活细菌和热处理细菌等于7106CFU/孔在48孔板中孵育PBMC7106细胞/孔36小时。在来自划分为两个分开的实验的8个个体供体的PBMC上测试了活的和热处理的细菌的作用。孵育36小时后，将培养板冻存在20，直至细胞因子测量。平行即在同一实验中在同一批次的PBMC上进行活细菌和它们的热处理对应物的细胞因子谱分析。0139按照厂家的说明，通过ELISARDDUOSETHUMANIL10、BDOPTEIAHUMANIL12P40、BDOPTEIAHUMANTNF、BDOPTEIAHUMANIFN。
45、测定孵育36小时后的细胞培养物上清中的细胞因子IFN、IL12P40、TNF和IL10水平。IFN、IL12P40和TNF是促炎细胞因子，而IL10是有效的抗炎介质。结果表示为4个个体供体的平均值PG/MLSEM，且代表各用4个供体进行的两个单独的实验。针对各菌株计算了IL12P40/IL10比率作为体内抗炎作用的预测值FOLIGN，B等，2007，WORLDJGASTROENTEROL13236243。0140将通过ELISA见上文测定的各菌株的数值型细胞因子值PG/ML转入BIONUMERICSV510软件APPLIEDMATHS，SINTMARTENSLATEM，比利时。对此数据集进行了。
46、主成分分析PCA，定尺度技术DIMENSIONINGTECHNIQUE。此分析中包括减去性状的平均值和除以性状的方差。0141结果0142通过超高温UHT/高温短时间HTST样处理产生的抗炎特性0143对所研究的益生菌株进行了一系列热处理超高温UHT、高温短时间HTST和8520分钟，并在体外将它们的免疫特性与活细胞的免疫特性相比较。在用人PBMC孵育时，活微生物益生菌和/或乳制品起子培养物诱导了不同水平的细胞因子产生图1、2、3、4和5。这些微生物的热处理以温度依赖方式改变了由PBMC产生的细胞因子的水平。“短时间高温”处理120或140，15秒产生了具有抗炎免疫特性的非复制型细菌图1、2、。
47、3和4。事实上，UHT样处理的菌株140，15秒诱导较少的促炎细胞因子TNF、IFN、IL12P40，同时保持或诱导其他IL10产生与活对应物相比。与活细胞相比，对于任意UHT样处理的菌株，产生的IL12P40/IL10比率更低图1、2、3和4。此观测结果对通过HTST样处理的处理细菌，即经受12015秒图1、2、3和4或74和9015秒图5的细菌也正确。热处理UHT样或HTST样处理对益生菌株图1、2、3和5和乳制品起子培养物图4的体外免疫特性具有相似的作用。用活的和热处理140，15秒的益生菌株和乳制品起子菌株产生的PBMC数据上的主成分分析揭示，活菌株全沿X轴散布，说明菌株显示非常不同的。
48、体外免疫特性，从促炎细胞因子的低诱导者左侧至高诱说明书CN104220082A1110/16页12导者右侧。热处理的菌株聚集在图的左侧，显示热处理的菌株较少地诱导促炎细胞因子图6。相反，在85下热处理20分钟的细菌比活细胞诱导更多的促炎细胞因子和更少的IL10，导致更高的IL12P40/IL10比率图7。0144通过UHT样和HTST样处理增强或产生了抗炎特性0145无论它们各自的起始免疫特性活细胞如何，UHT和HTST处理的菌株都显示抗炎特性。显示了已知在体内为抗炎型且显示体外抗炎特性的益生菌株长双歧杆菌NCC3001、长双歧杆菌NCC2705、短双歧杆菌NCC2950、乳双歧杆菌NCC28。
49、18在“短时间高温”处理后显示增强的体外抗炎特性。如图1中所示，UHT样处理的双歧杆菌属BIFIDOBACTERIUM菌株的IL12P40/IL10比率低于来自活对应物的那些，从而显示UHT样处理的样品的改善的抗炎特性。更令人惊奇地，还针对非抗炎型活菌株确认了通过UHT样和HTST样处理产生抗炎特性。活的鼠李糖乳杆菌NCC4007和类干酪乳杆菌NCC2461都在体外显示高的IL12P40/IL10比率图2和5。显示了这两种活菌株对小鼠中TNBS诱导的结肠炎无保护作用。鼠李糖乳杆菌NCC4007和类干酪乳杆菌NCC2461诱导的IL12P40/IL10比率在“短时间高温”处理UHT或HTST后显著降低，达到与用双歧杆菌属菌株获得的那些一样低的水平。这些低IL12P40/IL10比率由低水平的IL12P40产生与无变化鼠李糖乳杆菌NCC4007或显著诱导类干酪乳杆菌NCC2461的IL10分泌的组合引起图2。0146因此0147可以通过UHT样和HTST样热处理来增强活微生物的抗炎特性例如长双歧杆菌NCC2705、长双歧杆菌NCC3001、。