一种肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体及其用途.pdf

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1、10申请公布号CN104147612A43申请公布日20141119CN104147612A21申请号201410415968022申请日20140822A61K47/48200601A61P35/00200601C07K5/083200601A61K31/4745200601A61K31/706820060171申请人亚飞（上海）生物医药科技有限公司地址201203上海市浦东新区张江高科技园区蔡伦路780号4楼N座72发明人刘辰刘源74专利代理机构上海信好专利代理事务所普通合伙31249代理人张静洁贾慧琴54发明名称一种肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体及其用途57摘要本发明公开了一种肿瘤。

2、微环境特异激活的小分子靶向偶联体及其用途，该化合物具有如下通式其中，R1可为常规基团或特殊功能基团,R2为THR，VAL,ILE或ALA中的任意一种氨基酸；R3为ALA,VAL，THR，或ASN中的任意一种氨基酸，R4为通过羟基或氨基连接的药物基团，该药物的通式为R4H。本发明肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体使用能够有效封闭被联接药物R4的毒性,然后只在肿瘤微环境中利用天冬酰胺肽链内切酶靶向激活,使最终药物带有了新的靶向、激活和代谢特性,增加了治疗肿瘤的效果,并产生了新的肿瘤适应症和对抗肿瘤转移产生作用,产生了全新的结构和功能。51INTCL权利要求书4页说明书23页19中华人民共和国国家。

3、知识产权局12发明专利申请权利要求书4页说明书23页10申请公布号CN104147612ACN104147612A1/4页21一种肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，该偶联体具有如下通式其中，R1可为常规基团或特殊功能基团,R2为THR，VAL，ILE或ALA，中的任意一种氨基酸；R3为ALA，THR，VAL或ASN中的任意一种氨基酸，R4为通过羟基或氨基连接的药物基团，该药物的通式为R4H。2如权利要求1所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，R1可为常规基团或特殊功能基团,即R1选择氢、甲基、聚乙二醇、琥珀酰、2甲氧基乙氧基乙酰基、6马来酰亚胺己酰、N羟基氨基。

4、1,8辛二酸1单酰基中任意一种。3如权利要求1所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，R2选择THR、R3选择ALA,该药物的通式为4如权利要求1所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，R2选择VAL、R3选择ALA,该药物的通式为5如权利要求1所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，R2选择ILE、R3选择ALA,该药物的通式为6如权利要求1所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，R2选择ALA、R3选择ALA,该药物的通式为7如权利要求1所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，R4是通过羟基连接的药物基团，R4。

5、R5O，R5与酰基结合形成偶联体，该偶联体的通式为权利要求书CN104147612A2/4页3该药物的通式为R5OH，该药物选择喜树碱、10羟基喜树碱、拓扑替康、氟脲苷、去氧氟尿苷、阿糖胞苷、依托泊苷、氟达拉滨、依托泊苷、卡培他滨、长春新碱、埃坡霉素B中的任意一种。8如权利要求7所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，该偶联体是以R1R2R3天冬酰胺酰基对氨基苯甲醇为关键中间体制备；优选地，制备该偶联体的反应路线如下该路线是使得R1R2R3天冬酰胺酰基对氨基苯甲醇经氯甲酸对硝基苯酚酯或三光气活化反应生成活性碳酸酯或氯甲酸酯后，再与含有醇羟基的药物R5OH反应，生成偶联体碳酸二酯。

6、产物。9如权利要求1所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，R4是通过氨基连接药物的基团，R4R6NH，R6与酰基结合形成偶联体，该偶联体的通式为该药物的通式为R6NH2，该药物选择柔红霉素、表阿霉素、甲氨蝶呤、氟达拉滨、吉西他滨、阿糖胞苷、美法仑、尼莫司汀、米托蒽醌中的任意一种。10如权利要求9所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，该偶联体是以R1R2R3天冬酰胺酰基对氨基苯甲醇为关键中间体制备；优选地，制备该偶联体的反应路线如下该路线是使得R1R2R3天冬酰胺酰基对氨基苯甲醇经氯甲酸对硝基苯酚酯或三光气活化反应生成活性碳酸酯或氯甲酸酯后，再与含有氨基的药物。

7、R6NH2反应，生成偶联体碳酸二酯产物。11如权利要求1所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，R1选择2甲氧基乙氧基乙酰基,R2选择THR,R3选择ALA,R4选择10羟基喜树碱,该偶联体的结构式为S1权利要求书CN104147612A3/4页412如权利要求1所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，R1选择2甲氧基乙氧基乙酰基,R2选择ALA,R3选择ALA,R4选择喜树碱,该偶联体的结构式为S213如权利要求1所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，R1选择化合物N羟基氨基1,8辛二酸1单酰基,R2选择ALA,R3选择ALA,R4选择卡培他。

8、滨,该偶联体的结构式为S314如权利要求1所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，R1选择22甲氧基乙氧基乙酰基,R2选择THR,R3选择ALA,R4选择柔红霉素,该偶联体的结构式为S415如权利要求1所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，R1选择6马来酰亚胺基己酰,R2选择ALA,R3选择ALA,R4选择柔红霉素,该偶联体的结构式为S5权利要求书CN104147612A4/4页516一种根据权利要求1所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体的用途，其特征在于，该偶联体用于制备偶联药物，该偶联药物在肿瘤组织或天冬氨酸激活实验中取得很高的激活释放效率。17一种。

9、根据权利要求1所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体的用途，其特征在于，该偶联体用于制备抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物能用于不同抗癌症类型的治疗和免疫治疗，所述的不同癌症类型包括膀胱、脑、乳房/乳腺、宫颈、结肠直肠、食管、肾、肝、肺、鼻咽、胰腺、前列腺、皮肤、胃、子宫、卵巢、睾丸和血液学的癌症。权利要求书CN104147612A1/23页6一种肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体及其用途技术领域0001本发明属于药物化学领域，涉及一种抗肿瘤药物化合物，具体地，一种肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体及其用途。背景技术0002在肿瘤微环境中，肿瘤细胞表达分泌大量的天冬酰胺肽链内切酶。肿瘤相关巨噬细。

10、胞M2型区别于单核细胞和炎症型巨噬细胞M1型确认标记也是天冬酰胺肽链内切酶的表达。肿瘤分泌的细胞因子诱导单核细胞转化为肿瘤相关巨噬细胞,肿瘤相关巨噬细胞能够刺激产生强烈的免疫抑制和直接帮助肿瘤细胞浸润和转移,同时肿瘤细胞转移时通常分泌大量的蛋白酶水解酶以降解细胞间质。因此,因此结合生物化学及药效药理学检测筛选,不断合成新的化合物,筛选出利用天冬酰胺肽链内切酶可以激活,通过连接臂扩展偶联药物，而又在血液中稳定的化学偶联体,并同时具有靶向和激活的特征化合物。由于化合物中的不同结构能够封闭和改变药物的特性,而肿瘤微环境特异激活的小分子靶向能够释放药物的封闭,所以整体偶联体的靶向、激活、稳定、溶解性、。

11、代谢、毒性和药效等功能产生巨大影响。0003因此，需要提供一种能将作用药物与功能化合物链接起来，变为靶向激活药物的偶联体。发明内容0004本发明的目的为开发抗肿瘤药物而创造新的具有激活功能等复杂功能的偶联体，提供一类能被天冬酰胺肽链内切酶高效特异性激活等复杂功能的偶联体,该偶联体的结构可以用于抗肿瘤药物中的一部分,能起到改变连接药物的靶向、激活、稳定、溶解性、代谢、毒性和药效的特性。0005为达到上述目的，本发明提供了一种肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，该偶联体具有如下通式00060007其中，R1为常规功能基团或保护基团,R2为THR苏氨酸，VAL缬氨酸,ILE异亮氨酸或ALA丙氨酸，。

12、中的任意一种氨基酸；R3为ALA，THR，VAL或ASN天冬氨酸中的任意一种氨基酸，R4为通过羟基或氨基连接的药物基团，该药物的通式为R4H。0008上述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其中，R1选择氢、亲水基团、疏水基团、氨基保护基团、聚乙二醇、琥珀酰、葡糖苷酸、6马来酰亚胺己酰，2甲氧基乙氧基、己酰基中的任意一种。说明书CN104147612A2/23页70009上述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其中，R2选择THR、R3选择ALA,该药物的通式为00100011上述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其中，R2选择VAL、R3选择ALA,该药物的通式为0012001。

13、3上述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其中，R2选择ILE、R3选择ALA,该药物的通式为00140015上述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其中，R2选择ALA、R3选择ALA,该药物的通式为00160017上述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其中，R4是通过羟基连接的药物基团，R4R5O，R5与酰基结合形成偶联体，该偶联体的通式为该药物的通式为R5OH，该药物选择喜树碱、10羟基喜树碱、拓扑替康、氟脲苷、去氧氟尿苷、阿糖胞苷、依托泊苷、氟达拉滨、依托泊苷、卡培他滨、长春新碱、埃坡霉素B中的任意一种。0018上述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其中，该偶联体是。

14、以R1R2R3天冬酰胺酰基对氨基苯甲醇为关键中间体制备；优选地，制备该偶联体的反应路线如下0019说明书CN104147612A3/23页80020该路线是使得R1R2R3天冬酰胺酰基对氨基苯甲醇经氯甲酸对硝基苯酚酯或三光气活化反应生成活性碳酸酯或氯甲酸酯后，再与含有醇羟基的药物R5OH反应，生成偶联体碳酸二酯产物。0021上述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其中，R4是通过氨基连接药物的基团，R4R6NH，R6与酰基结合形成偶联体，该偶联体的通式为该药物的通式为R6NH2，该药物选择柔红霉素、表阿霉素、甲氨蝶呤、氟达拉滨、吉西他滨、阿糖胞苷、美法仑、尼莫司汀、米托蒽醌中的任意一种。0。

15、022上述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其中，该偶联体是以R1R2R3天冬酰胺酰基对氨基苯甲醇为关键中间体制备；优选地，制备该偶联体的反应路线如下00230024该路线是使得R1R2R3天冬酰胺酰基对氨基苯甲醇经氯甲酸对硝基苯酚酯或三光气活化反应生成活性碳酸酯或氯甲酸酯后，再与含有氨基的药物R6NH2反应，生成偶联体碳酸二酯产物。0025上述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其中，所述的连接体具有S1S5、S7S27中的任意一种结构。0026本发明还提供了一种上述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体的用途，该偶联体用于制备偶联药物，该偶联药物在肿瘤组织或天冬氨酸激活实验中取得。

16、很高的激活释放效率。0027本发明还提供了一种上述的特异激活的偶联体的用途，该偶联体用于制备抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物能用于不同抗癌症类型的治疗和免疫治疗，所述的不同癌症类型包括膀胱、脑、乳房/乳腺、宫颈、结肠直肠、食管、肾、肝、肺、鼻咽、胰腺、前列腺、皮肤、胃、子宫、卵巢、睾丸和血液学的癌症。0028肿瘤相关巨噬细胞M2型区别于单核细胞和炎症型巨噬细胞M1型确认标记就是天冬酰胺肽链内切酶的表达。肿瘤分泌的细胞因子诱导单核细胞转化为肿瘤相关巨噬细胞,肿瘤相关巨噬细胞能够刺激产生强烈的免疫抑制和直接帮助肿瘤细胞浸润和转移。说明书CN104147612A4/23页90029由于天冬酰胺肽链内切酶特异。

17、性激活的偶联体的不同部分对最终药物在靶向、激活、稳定、毒性和药效等功能产生巨大影响,本发明天冬酰胺肽链内切酶特异性激活的偶联体的使用能够有效降低被联接药物的毒性,使最终药物带有了新的靶向、激活和代谢特性,增加了治疗肿瘤的效果,并产生了新的肿瘤适应症和对抗肿瘤转移产生作用,产生了全新的结构和功能。0030本发明通过试验发现该偶联体的特性如下1该偶联体可以通过基团转换,将R4更换为多个对肿瘤具有治疗或辅助治疗效果的药物。2通过天冬酰胺肽链内切酶的特异性激活，只有肿瘤微环境中的肿瘤细胞或肿瘤相关巨噬细胞释放有效药物，以达到靶向激活的目的。如果药物无法激活,药物是一个无细胞毒性或低毒的药物,不会杀害正。

18、常细胞。3该偶联体在非肿瘤微环境的部位是稳定不激活的,如心脏组织。4该偶联体的构象效应导致在血液和正常器官细胞的中性PH值是稳定不激活的。5联接后药物相比被联接药物毒性大大降低。6天冬酰胺肽链内切酶是从ASN处切断，从代谢产物分析该偶联体中的对氨基苯甲醇能够逐渐释放掉落,起到了辅助激活的作用。7对氨基苯甲醇能够延长连接臂,有效降低连接上药物后对天冬酰胺肽链内切酶反应中心接近的空间位阻。8偶联体能在多种肿瘤激活,加上溶解性的改变,直接能够改变被联接药物肿瘤适应症限制的情况,开发成为广谱性或特殊针对性抗肿瘤药物。9肿瘤细胞转移时通常分泌大量的蛋白酶水解酶以降解细胞间质,因此联接后的靶向药物对肿瘤转。

19、移治疗具有特殊的疗效。10R1与药物的激活释放,以及药物的溶解性,稳定性和有效性都密切相关。R1除了连接常规基团,还可以连接特殊的亲水基团或靶向基团,给药物的带来特殊功能和提高药物的药效。具体实施方式0031以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地说明。0032实施例1化合物中间体的合成00331NN苄氧羰基L丙氨酰L丙氨酸甲酯I的合成00340035将N苄氧羰基L丙氨酸100G,045MOL溶于N,N二甲基甲酰胺3L中，搅拌下加入1羟基苯并三氮唑简称HOBT，726G,054MOL和1乙基3二甲基氨基丙基碳酰二亚胺盐酸盐简称EDC，1033G,054MOL，搅拌反应1小时后，冰浴至0下滴加。

20、L丙氨酸甲酯462G,045MOL和N,N二异丙基乙基胺1738G,134MOL的N,N二甲基甲酰胺1L溶液，滴加完毕后在室温下搅拌10H，减压蒸除溶剂，粗产品溶于二氯甲烷2L，依次用饱和氯化铵溶液、水和饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后粗产物重结晶后得到白色固体I，101G，收率731。00362NN苄氧羰基L丙氨酰L丙氨酸II的合成0037说明书CN104147612A5/23页100038将NN苄氧羰基L丙氨酰L丙氨酸甲酯100G,034MOL溶于四氢呋喃2L和水1L的混合溶液中，冷却至0下滴加1M的氢氧化锂溶液400ML，搅拌反应10小时，滴加浓盐酸中和至PH6。

21、，旋转蒸发除去大部分四氢呋喃，剩余水相用二氯甲烷1L3萃取，有机相经无水硫酸钠干燥，减压蒸干得到白色固体II88G，收率922。003934NN芴甲氧羰基N三苯甲基L天冬酰胺酰基氨基苄醇III的合成00400041于三口瓶中加入N芴甲氧羰基N三苯甲基L天冬酰胺20G,003MOL、27偶氮苯并三氮唑N,N,N,N四甲基脲六氟磷酸酯HATU15G,004MOL、N,N二甲基甲酰胺DMF200ML，搅拌30MIN。然后0下分别加入对氨基苄醇41G,003MOL的DMF溶液5ML和N,N二异丙基乙胺DIPEA87G,006MOL，室温下搅拌3H，旋转蒸发除去大部分DMF，残余物溶于乙酸乙酯200ML。

22、，依次用饱和氯化铵溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后，蒸除溶剂，所得粗产品经打浆得白色固体III213G,收率90。004244NN三苯甲基L天冬酰胺酰基氨基苯甲醇IV的合成00430044将4NN芴甲氧羰基N三苯甲基L天冬酰胺酰基氨基苄醇130G,18MMOL溶于N,N二甲基甲酰胺80ML的混合溶液中，加入哌啶30ML，室温下搅拌2H，减压蒸出溶剂，然后置于真空干燥箱高真空干燥除去少量的哌啶，得淡黄色固体IV,未经纯化直接用于下一步。004554NNNN苄氧羰基L丙氨酰L丙氨酰N三苯甲基L天冬酰说明书CN104147612A106/23页11胺酰基氨基苯甲醇V的合成004600。

23、47于三口瓶中加入NN苄氧羰基L丙氨酰L丙氨酸60G,204MMOL、苯并三氮唑N,N,N,N四甲基脲六氟磷酸酯HBTU116G,306MMOL和DMF50ML，冰浴下搅拌30MIN。然后0下分别加入化合物4NN三苯甲基L天冬酰胺酰基氨基苯甲醇的DMF溶液50ML和N,N二异丙基乙胺789G,612MMOL，室温下搅拌过夜，减压蒸除溶剂，残余物溶于乙酸乙酯200ML，依次用饱和氯化铵溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后，蒸除溶剂，所得粗产品经重结晶得白色固体V15G,收率97。004864NNL丙氨酰L丙氨酰N三苯甲基L天冬酰胺酰基氨基苯甲醇VI的合成00490050将4NNNN苄。

24、氧羰基L丙氨酰L丙氨酰N三苯甲基L天冬酰胺酰基氨基苯甲醇50G,661MMOL溶于THF150ML中，加入10钯炭1G，通入氢气，常温常压下搅拌反应5H，过滤除去钯炭，用甲醇洗涤，合并滤液和洗液，旋转蒸发除去大部分溶剂得到粗品，经柱层析得到白色固体VI20G,收率49。005174NNNN22甲氧基乙氧基乙酰基L丙氨酰基L丙氨酰基N三苯甲基L天冬酰胺酰基氨基苄醇VII的合成00520053将22甲氧基乙氧基乙酸432MG,322MMOL溶于N,N二甲基甲酰胺20ML中，加入苯并三氮唑N,N,N,N四甲基脲六氟磷酸酯HBTU183G,483MMOL，搅拌说明书CN104147612A117/23。

25、页1230MIN，然后滴加4NNL丙氨酰L丙氨酰N三苯甲基L天冬酰胺酰基氨基苯甲醇20G,322MMOL和N,N二异丙基乙胺124G,961MMOL的N,N二甲基甲酰胺20ML，完毕后缓慢升至室温搅拌10H。减压蒸除大部分DMF，所得残余物溶于乙酸乙酯200ML,依次用饱和的氯化铵溶液和饱和的氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋转蒸发除去溶剂，所得粗产品经硅胶柱层析得白色固体VII12G,收率50。005484NNNN22甲氧基乙氧基乙酰基L丙氨酰L丙氨酰L天冬酰胺酰基氨基苄醇VIII的合成00550056将化合物4NNNN22甲氧基乙氧基乙酰基L丙氨酰基L丙氨酰基N三苯甲基L天冬酰胺酰基。

26、氨基苄醇VII10G,136MMOL溶于二氯甲烷10ML中，加入三氟乙酸2ML，室温下搅拌5小时。反应液经水洗后分液后，有机相无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，高真空蒸除残余的三氟乙酸，粗品经柱层析分离得X600MG,收率89。005794NNNN22甲氧基乙氧基乙酰基L丙氨酰L丙氨酰L天冬酰胺酰基氨基苄醇对硝基苯酚碳酸二酯的合成00580059化合物4NNNN22甲氧基乙氧基乙酰基L丙氨酰L丙氨酰L天冬酰胺酰基氨基苄醇500MG,101MMOL溶于二氯甲烷10ML中，氮气保护冰浴至5下，依次滴加氯甲酸对硝基苯酯406MG,202MMOL的二氯甲烷溶液和吡啶160MG，203MMOL，完毕后室温下。

27、搅拌过夜，反应液经水洗后分液后，有机相无水硫酸钠干燥。旋蒸除去溶剂，所得粗产品经柱层析分离得产物为淡黄色固体450MG,收率67。0060中间体连接不同的药物或化合物0061实施例2化合物4NNNN22甲氧基乙氧基乙酰基L苏氨酰L丙氨酰L天冬酰胺酰基氨基苄醇10羟基喜树碱碳酸二酯S1的合成00620063将4NNNN22甲氧基乙氧基乙酰基L丙氨酰L丙氨酰L天冬酰胺酰基氨基苄醇对硝基苯酚碳酸二酯330MG，05MMOL和10羟基喜树碱说明书CN104147612A128/23页13182MG,05MMOL用干燥的N,N二甲基甲酰胺10ML溶解，冷却至0下加入4二甲氨基吡啶DMAP122MG,10。

28、MMOL和1羟基苯并三氮唑27MG,02MMOL，室温搅拌过夜。将反应液倒入乙酸乙酯100ML中，依次用水50ML3和饱和食盐水50ML洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去溶剂得到粗产物，经柱层析分离纯化得目标产物S1为淡黄色固体82MG,收率19。0064实施例3化合物4NNNN22甲氧基乙氧基乙酰基L丙氨酰L丙氨酰L天冬酰胺酰基氨基苄醇喜树碱碳酸二酯S2的合成00650066将三光气600MG，202MMOL溶于干燥的二氯甲烷10ML中，冷至10下，氮气保护下滴加化合物4NNNN22甲氧基乙氧基乙酰基L丙氨酰L丙氨酰L天冬酰胺酰基氨基苄醇500MG,101MMOL和吡啶035ML,1212M。

29、MOL的二氯甲烷10ML溶液，0下搅拌反应1小时，自然升至室温下搅拌2小时后，滴加喜树碱348MG，1MMOL的二氯甲烷10ML溶液，室温下反应6小时，反应液依次用水30ML，饱和碳酸氢钠20ML和饱和食盐水20ML洗涤，无水硫酸钠干燥后过滤，减压蒸干，残余物经硅胶柱层析得到白色固体291MG，335。0067实施例4化合物4NNNN8N羟基氨基1,8辛二酸1单酰基L丙氨酰L丙氨酰L天冬酰胺酰基氨基苄醇卡培他滨碳酸二酯S3的合成00680069将4NNNN8N羟基氨基1,8辛二酸1单酰基L丙氨酰L丙氨酰L天冬酰胺酰基氨基苄醇对硝基苯酚碳酸二酯715MG，10MMOL和卡培他滨360MG,10M。

30、MOL用干燥的N,N二甲基甲酰胺20ML溶解，冷却至0下加入DMAP244MG,20MMOL和1羟基苯并三氮唑27MG,02MMOL，室温搅拌过夜。将反应液倒入乙酸乙酯100ML中，依次用水100ML3和饱和食盐水100ML洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去溶剂得到粗产物，经柱层析分离纯化得目标产物S3为淡黄色固体198MG,收率21。0070实施例5化合物4NNNN22甲氧基乙氧基乙酰基L苏氨酰L丙氨酰L天冬酰胺酰氨基苯甲醇柔红霉素氨基甲酸酯S4的合成0071说明书CN104147612A139/23页140072将4NNNN22甲氧基乙氧基乙酰基L苏氨酰L丙氨酰L天冬酰胺酰基氨基苄醇对硝基。

31、苯酚碳酸二酯264MG,04MMOL和N,N二异丙基乙基胺1ML溶于N,N二甲基甲酰胺10ML中，20下滴加柔红霉素211MG,04MMOL的N,N二甲基甲酰胺10ML溶液，完毕后室温下反应3小时，反应液倒入甲基叔丁基醚中，搅拌半小时后过滤，所得红色固体经柱层析纯化后得到红色固体产物S4177MG，产率422。0073实施例6化合物S5的合成007414NNNN6马来酰亚胺己酰L丙氨酰L丙氨酰N三苯甲基L天冬酰胺酰氨基苯甲醇的合成007500766马来酰亚胺己酸120MG,057MMOL溶于N,N二甲基甲酰胺20ML中，加入1羟基苯并三氮唑92MG,068MMOL和N,N二异丙基乙基胺019M。

32、L,115MMOL，氮气保护下加入4NNNL丙氨酰L丙氨酰N三苯甲基L天冬酰胺酰氨基苯甲醇353MG,057MMOL，搅拌半小时后冰浴至0下滴加1乙基3二甲基氨基丙基碳酰二亚胺盐酸盐120MG,062MMOL的N,N二甲基甲酰胺10ML溶液，完毕后升至室温下搅拌过夜，将反应液倒入乙酸乙酯150ML中，依次用水100ML3、5稀盐酸50ML和5碳酸钠50ML洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥，减压蒸干后硅胶柱层析得到产物为白色固体300MG,收率648。007724NNNN6马来酰亚胺基己酰L丙氨酰L丙氨酰L天冬酰胺酰氨基苯甲醇的合成00780079化合物4NNNN6马来酰亚胺己酰L丙氨酰L丙氨酰N三。

33、苯甲基L天冬酰胺酰氨基苯甲醇163MG,02MMOL溶于二氯甲烷5ML中，加入三氟乙酸2ML，室温下搅拌5小时。反应液经水洗后分液后，有机相无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，高真空蒸除残余的三氟乙酸，粗品经柱层析分离得产物为淡黄色固体97MG,收率85。008034NNNN6马来酰亚胺基己酰L丙氨酰L丙氨酰L天冬酰胺说明书CN104147612A1410/23页15酰氨基苯甲醇对硝基苯酚碳酸二酯的合成00810082化合物4NNNN6马来酰亚胺基己酰L丙氨酰L丙氨酰L天冬酰胺酰氨基苯甲醇814MG,10MMOL溶于二氯甲烷100ML中，冰浴至0，氮气保护下依次滴加氯甲酸对硝基苯酯406MG,20M。

34、MOL的二氯甲烷20ML溶液和吡啶016ML，20MMOL。滴加完毕后升至室温下搅拌过夜，反应液经水洗分液后，有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，所得粗产品经柱层析分离得产物为白色固体597MG,收率81。008344NNNN6马来酰亚胺基己酰L丙氨酰L丙氨酰L天冬酰胺酰氨基苯甲醇柔红霉素氨基甲酸酯S5的合成008400854NNNN6马来酰亚胺基己酰L丙氨酰L丙氨酰L天冬酰胺酰氨基苯甲醇对硝基苯酚碳酸二酯200MG,027MMOL溶于N,N二甲基甲酰胺30ML中，加入柔红霉素盐酸盐152MG,027MMOL，氮气保护下冰浴至5，滴加N,N二异丙基乙基胺01ML,06MMOL的N,N二甲基甲。

35、酰胺2ML的溶液，完毕后升至室温下搅拌反应过夜，反应液倒入甲基叔丁基醚600ML中，搅拌半小时后，过滤，收集红色沉淀经硅胶柱层析得到产物为红色固体S5164MG,收率54。0086实施例7化合物4NNNN6马来酰亚胺基己酰L丙氨酰L丙氨酰L天冬酰胺酰氨基苯甲醇MMAE氨基甲酸酯S6的合成008700884NNNN6马来酰亚胺基己酰L丙氨酰L丙氨酰L天冬酰胺酰氨基苯甲醇对硝基苯酚碳酸二酯298MG,040MMOL溶于N,N二甲基甲酰胺30ML中，加入MMAEMONOMETHYLAURISTATIN的简称盐酸盐305MG,040MMOL，氮气保护下冰浴至5，滴加N,N二异丙基乙基胺01ML,06M。

36、MOL的N,N二甲基甲酰胺2ML的溶液，完毕后升至室温下搅拌反应过夜，反应液倒入甲基叔丁基醚600ML中，搅拌半小时后，过滤，收集红色沉淀经硅胶柱层析得到产物为红色固体S6434MG,收率824。0089化合物S1,S2,S3,S4,S5的合成结果如下表，质谱MS检测结果S1,S2,S3,S4,S5说明书CN104147612A1511/23页16的对应质荷比分别为916,885,880,1079,1513,与结构计算获得分子量相同，如表1所示。0090表1S1S5的性状和质谱测试数据00910092R2和R3的不同,只是氨基酸连接时原料不同,其不同氨基酸侧链对于合成过程没有影响,与上述的方法。

37、一致,只是将对应的R2氨基酸和R3氨基酸用于合成过程。R4的连接反应如上述,只是催化条件和反应药物的不同。0093实施例8化合物S7S180094当R1选择H,R2选择THR,R3选择ALA时，肿瘤微环境特异激活的小分子靶向连接基团可以成功通过羟基连接的化合物，即R4是喜树碱S7、10羟基喜树碱S8、拓扑替康S9、氟脲苷S10、去氧氟尿苷S11、阿糖胞苷S12、氟达拉滨S13、依托泊苷S14、卡培他滨S15、吉西他滨S16、长春新碱S17、埃坡霉素BS18。00950096肿瘤微环境特异激活的小分子靶向喜树碱S70097说明书CN104147612A1612/23页170098肿瘤微环境特异激。

38、活的小分子靶向10羟基喜树碱S800990100肿瘤微环境特异激活的小分子靶向拓扑替康S901010102肿瘤微环境特异激活的小分子靶向氟脲苷S1001030104肿瘤微环境特异激活的小分子靶向去氧氟尿苷S110105说明书CN104147612A1713/23页180106肿瘤微环境特异激活的小分子靶向阿糖胞苷S1201070108肿瘤微环境特异激活的小分子靶向氟达拉滨S1301090110肿瘤微环境特异激活的小分子靶向依托泊苷S1401110112肿瘤微环境特异激活的小分子靶向卡培他滨S150113说明书CN104147612A1814/23页190114肿瘤微环境特异激活的小分子靶向吉西。

39、他滨S1601150116肿瘤微环境特异激活的小分子靶向长春新碱S1701170118肿瘤微环境特异激活的小分子靶向埃坡霉素BS180119实施例9化合物S19S270120当R1选择H,R2和R3选择ALA时，肿瘤微环境特异激活的小分子靶向连接基团可以成功通过氨基连接的化合物，即R4是柔红霉素S19、表阿霉素S20、氟达拉滨S21、吉西他滨S22、尼莫司汀S23、米托蒽醌S24、甲氨蝶呤S25、阿糖胞苷S26、美法仑S27。0121说明书CN104147612A1915/23页200122肿瘤微环境特异激活的小分子靶向柔红霉素S1901230124肿瘤微环境特异激活的小分子靶向表柔比星S20。

40、01250126肿瘤微环境特异激活的小分子靶向氟达拉滨S2101270128肿瘤微环境特异激活的小分子靶向吉西他滨S220129说明书CN104147612A2016/23页210130肿瘤微环境特异激活的小分子靶向尼莫司汀S2301310132肿瘤微环境特异激活的小分子靶向米托蒽醌S2401330134肿瘤微环境特异激活的小分子靶向甲氨蝶呤S2501350136肿瘤微环境特异激活的小分子靶向阿糖胞苷S260137说明书CN104147612A2117/23页220138肿瘤微环境特异激活的小分子靶向美法仑S270139实施例10肿瘤微环境特异激活的小分子靶向联接基团连接不同R4化合物的条件各。

41、不相同01401所述化合物中，R4通过羟基连接与通过氨基连接的方法完全不同。0141与药物R6的通过氨基连接的反应是否可以成功完全取决于R6的选择,例如与喜树碱的反应不同于与MMAE的反应，主要在于与MMAE的反应是通过其MMAE的氨基的强亲核性发生反应824，而与喜树碱的反应是通过喜树碱上羟基的亲核性置换对硝基苯酚的反应，由于羟基的亲核性要弱于氨基的亲核性，与对硝基苯酚相当或稍弱，因此使该步反应理论上无法进行。0142我们通过对几十种催化剂的筛选合成反应都失败了,只有当在该步反应中加入HOBT等作为催化剂使用时，并严格固定到所筛选的温度时,由于HOBT的羟基能与对硝基苯酚PNP交换互变，从而。

42、形成更易离去的结合HOBT过渡态，最后通过控制反应截止时间,才能有效的与喜树碱的羟基交换的活性反应,而不产生大量反应杂质,得到目前的最大产率19。01432AAN天冬酰胺氨基苯甲醇对硝基苯酚碳酸二酯与药物R5的通过氨基连接的反应是否可以成功完全取决于R5的选择0144R5上的氨基的空间位阻以及取代基对连接反应有决定性影响，脂肪族取代的氨基与R1R2R3天冬酰胺氨基苯甲醇对硝基苯酚碳酸二酯的连接反应可以在温和条件下获得较高产量如MMAE，但是芳香族氨基由于氨基的孤对电子与芳香环共轭，降低了其亲核性，同样反应条件下得不到产物。只有通过高通量的筛选、剧烈的反应条件，例如尼莫司汀与R1R2R3天冬酰胺。

43、氨基苯甲醇对硝基苯酚碳酸二酯的连接反应,最终筛选到只有用DMAP做碱，在80到85的温度,才能得到少量产物收率20。01453所述化合物中R1选择对R4连接有不同影响。0146不同的R1基团对R1R2R3天冬酰胺氨基苯甲醇对硝基苯酚碳酸二酯与R4的对接反应的条件有重要影响，比如4NNNN6马来酰亚胺基己酰L丙氨酰L丙氨酰L天冬酰胺氨基苯甲醇对硝基苯酚碳酸二酯与喜树碱对接反应得不到产物。因此只有通过筛选不同的反应物和实验条件才能获得产物,例如，采用4NNNN22甲氧基乙氧基乙酰基L丙氨酰L丙氨酰L天冬酰胺酰基氨基苄醇对硝基苯酚碳酸二酯才可以与喜树碱在特定的温度条件下得到相应产说明书CN10414。

44、7612A2218/23页23物。0147实施例11肿瘤微环境特异激活的小分子靶向联接基团连接不同的化合物具有不同的激活效率0148联接基团与连接的化合物基团间的相互构效关系决定了激活效果。肿瘤微环境特异激活的小分子靶向联接基团在我们的实验中,在37下10微克/毫升酸化的天冬酰胺肽链内切酶中或不同肿瘤组织匀浆30微克/毫升中加入1毫克/毫升的S1,S2,S3,S4和S5,S6,通过HPLC能够检测反应物的减小和产物增加，从而比较天冬酰胺肽链内切酶的激活效率,通过筛选发现S1,S2,S3,S4和S5具有很高的被肿瘤组织激活的效率,而S6被肿瘤组织激活的效率较低表2。我们的实验结果发现,S3中R1。

45、为N羟基氨基1,8辛二酸1单酰基能够靶向结合肿瘤高表达的金属蛋白酶MMP2,而S5中R1为6马来酰亚胺基己酰能够靶向结合肿瘤高表达的组织蛋白酶MMP2,因此更为提高靶向激活效果。0149表2S1,S2,S3,S4和S5,S6的激活测定01500151说明书CN104147612A2319/23页240152实施例12肿瘤微环境特异激活的小分子靶向联接基团连接不同的化合物具有不同的激活效率0153联接基团与连接的化合物基团间的相互构效关系决定了激活效果。肿瘤微环境特异激活的小分子靶向联接基团在我们的实验中,在3710微克/毫升酸化的天冬酰胺肽链内切酶中加入1毫克/毫升的S7S27化合物,通过HP。

46、LC能够检测反应物的减小和产物增加，从而比较天冬酰胺肽链内切酶的激活效率，如表3所示。0154表3S7S27的激活测定0155化合物S7S8S9S10S11S12S13S14激活效率757555864954662736796853化合物S15S16S17S18S19S20S21S22激活效率846234894935893267954975化合物S23S24S25S26S27激活效率9159077447857350156由表3可以看出，通过实验发现最终不同化合物具有不同的被天冬酰胺肽链内切酶激活的效率,筛选合成的S7S27化合物激活效率基本大于60,S6,S16,S20激活效率较低小30。天冬酰。

47、胺肽链内切酶的激活位点是天冬酰胺酰基对氨基苯甲醇的连接处，激活断裂后，对氨基苯甲醇能够自释放，而进一步释放出R4H药物。天冬酰胺肽链内切酶的酶活中心位于球囊状内陷的底部,切割位点需要接近酶活中心,这时所连接的化合物对切割位点是否有空间位阻和改变连接位点的极性变为非常重要。通过筛选实验的结果,推测S6,S8,S20空间位阻和极性影响激活,因此出现S6,S8,S20激活效率较低,其他化合物激活效率较高的情况。0157结果与讨论结果说明该肿瘤微环境特异激活的小分子靶向联接基团可以连接和激活不同的化合物,并大部分具有很高的激活效率,支持权利要求中的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体的激活效果,R4的。

48、可选择S1S5,S7,S9S19,S21S27。0158实施例13S1,S2,S3,S4，S5和S6注射液在裸鼠NUDEMICE中的药效研究0159试验目的通过小鼠的肿瘤治疗模型，了解S1,S2,S3,S4，S5和S6化合物的抗肿瘤药效。0160治疗药物S1,S2,S3,S4，S5和S6注射液，试验时用生理盐水稀释到相应浓度。0161方法和结果01621动物裸鼠，68周龄，全为雌性；01632产生肿瘤模型01641人乳腺癌MDAMB231细胞从美国模式培养物集存库AMERICANTYPECULTURECOLLECTION，ATCC购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10。

49、胎牛血清达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基简称，DMEM培养液在37，说明书CN104147612A2420/23页255的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。01652肿瘤产生，将5106PANC1细胞皮下注射到裸鼠NUDEMICE小鼠背部，待肿瘤长至少达100MM3左右时随机分组，开始治疗,以开始治疗当天为第一天。01663治疗过程根据S1,S2,S3,S4，S5和S6临床用药使用IV静脉注射，S1,S2,S3,S4，S5和S6都使用262微摩/公斤剂量，每周一次给药，共4周。01674分组与结果测量如下表4所示0168表4S1,S2,S3,S4，S5和S6药物对裸鼠治疗肿瘤的效果0169017001715结果与讨论如表4所示，与各对照组,柔红霉素组和S6比较，在S1,S2,S3,S4和S5具有更强肿瘤生长抑制的效果,说明偶联体对药物的疗效带来的巨大的提高。也说明激活效率与治疗效果有一定相关性。实验结果发现,S3中R1为N羟基氨基1,8辛二酸1单酰基能够靶向结合肿瘤高表达的金属蛋白酶MMP2,而S5中R1为6马来酰亚胺基己酰能够靶向结合肿瘤高表达的组织蛋白酶MMP2,从而更为提高靶向治疗效果。0172实。