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1、10申请公布号CN104147006A43申请公布日20141119CN104147006A21申请号201410304794022申请日20140626A61K31/4375200601A61P1/1620060171申请人中国药科大学地址211198江苏省南京市江宁区龙眠大道639号72发明人强晓妍张壮伟许露露王印行张鹏成王永辰陈欢李睿岩张玉彬54发明名称盐酸去亚甲基小檗碱在制备预防和/或治疗异烟肼致药源性肝损伤药物中的应用57摘要本发明公开了如式I所示的盐酸去亚甲基小檗碱在制备预防和/或治疗异烟肼致药源性肝损伤药物中的应用。51INTCL权利要求书1页说明书8页附图4页19中华人民共和国。
2、国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书8页附图4页10申请公布号CN104147006ACN104147006A1/1页21如式I所示的盐酸去亚甲基小檗碱在制备预防和/或治疗异烟肼致药源性肝损伤药物中的应用。2一种预防或治疗异烟肼致药源性肝损伤的药物组合物，其特征在于，含有药物有效剂量的如式I所示盐酸去亚甲基小檗碱及药用载体。3根据权利要求2的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物可以是片剂、胶囊、丸剂、注射剂、缓释剂及各种微粒给药系统。权利要求书CN104147006A1/8页3盐酸去亚甲基小檗碱在制备预防和/或治疗异烟肼致药源性肝损伤药物中的应用技术领域0001本发明涉及生物医。
3、药领域，具体涉及盐酸去亚甲基小檗碱在制备预防和/或治疗异烟肼致药源性肝损伤药物中的应用。背景技术0002异烟肼ISONIAZID，INH作为最重要的抗结核首选药物之一，但在临床使用中被广泛报道导致肝转氨酶升高，约有1020的患者存在不同程度的肝毒性，更有约16的患者出现严重的中毒性肝炎。由于异烟肼临床处方用药周期较长和肝脏毒副作用，因而，患者在服药期间需定期严密观察肝功能指标。通常认为INH通过N乙酰基转移酶2NACETYLTRANSFERASE2，NAT2等酶的催化下生成乙酰异烟肼、异烟酸、乙酰肼和肼等代谢产物，其中肼被认为是最主要的毒性代谢产物之一，可与肝中生物大分子共价结合，可直接与肝细。
4、胞发生过氧化反应，并诱发DNA损伤而介导凋亡的发生，引起不可逆的肝损伤。0003细胞色素P4502E1CYP2E1主要负责内源和外源化合物在体内的生物转化。药物在体内经CYP2E1代谢可产生大量自由基，导致脂质过氧化以及DNA双链断裂，造成不同程度的细胞损伤，因而，CYP2E1被认为是人体对药物介导的氧化应激损伤敏感性的重要标志物之一。氧化应激是由于生物体内活性氧的生成与机体解毒和修复损伤能力失衡造成的，在INH引起的肝损伤中发挥着重要作用。研究表明，INH的代谢产物肼和乙酰肼在肝脏内经CYP2E1氧化代谢后引起氧化应激，影响肝脏内的抗氧化酶系统，引起肝脏内还原型GSHGLUTATHIONE，。
5、GSH等抗氧化物耗竭，使肝细胞功能发生紊乱，最终导致氧化型肝损伤。0004目前临床上用于预防和/或治疗异烟肼药源性肝损伤的药物不多。葡醛内酯治疗可以改善患者服用异烟肼转氨酶升高。甘草酸制剂、水飞蓟素类、五味子乙酸和还原型谷胱甘肽等药物有不同程度的抗氧化、抗炎和保护肝细胞膜及细胞器等作用，临床应用可保护肝脏，防止药源性肝损伤。这些药物有的价格昂贵，有的效果不显著，有些作用机理不明确。因此，研发安全有效保护异烟肼致药源性肝损伤的治疗药物已成为当前药物研究的热点领域之一。0005盐酸去亚甲基小檗碱，如式I所示，又名去亚甲基小檗碱盐酸盐或脱亚甲基小檗碱盐酸盐。0006说明书CN104147006A2/。
6、8页40007盐酸去亚甲基小檗碱式I的英文名为DEMETHYLENEBERBERINEHYDROCHLORIDE或DEMETHYLENEBERBERINECHLORIDE。本发明专利将它简称为DMB。式I中的骨架结构为去亚甲基小檗碱，它是盐酸去亚甲基小檗碱的活性成份。国际纯粹与应用化学联合会IUPAC将式I中的有机结构部分去亚甲基小檗碱命名9，10DIMETHOXY5，6DIHYDROISOQUINOLINO2，1BISOQUINOLIN7IUM2，3DIOL，其中文名为9，10二甲氧基5，6二氢异喹啉2，1B异喹啉7鎓2，3二羟基。它的分子式C19H18NO4，分子量为32435。化学文摘号。
7、CAS为25459910。去亚甲基小檗碱可以与无机酸或有机酸形成多种盐，如氯化盐、硫酸盐、磷酸盐、溴化盐、碘化盐、枸橼酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、苹果酸盐和琥珀酸盐等分子形式存在。0008去亚甲基小檗碱存在于天然药用植物芸香科植物黄柏CORTEXPHELLODENDRICHINENSIS中，由于含量较低，相关活性研究很少。有报道认为它在体外对多种革兰阳性及阴性菌均具有抑菌作用。近年来人们对小檗碱研究非常活跃，发现小檗碱除抗菌活性外，还具有降血糖、降血脂、抗炎、抗病毒和抗肿瘤等药理作用。人们在研究小檗碱体内代谢过程中，发现小檗碱在体内经肝脏代谢亦可产生去亚甲基小檗碱，但对该代谢产物DMB在预防和。
8、/或治疗异烟肼致药源性肝损伤的治疗作用研究未见报道。0009迄今为止，现有技术中没有关于盐酸去亚甲基小檗碱或去亚甲基小檗碱对预防和/或治疗异烟肼致药源性肝损伤作用的记载和报道。发明内容0010为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种预防和/或治疗异烟肼致药源性肝损伤的化合物，特别是提供了如式I所示的盐酸去亚甲基小檗碱DMB作为预防和/或治疗异烟肼致药源性肝损伤药物的应用。0011本发明通过建立异烟肼致药源性肝损伤动物模型，观察盐酸去亚甲基小檗碱对异烟肼致药源性肝损伤的预防与治疗作用并探讨其作用机理。研究结果表明，盐酸去亚甲基小檗碱DMB对异烟肼致药源性肝损伤具有预防保护和治疗作用。00。
9、12本发明通过MTT法，细胞水平分析DMB对异烟肼致肝损伤的保护作用，研究结果表明在人源肝癌细胞系HEPG2中，盐酸去亚甲基小檗碱DMB呈剂量依赖性的提高异烟肼致损的细胞存活率。相对于单纯暴露于25MM异烟肼而言，125M和25MDMB分别提高异烟肼致损细胞存活率16和33。在人源正常永生化细胞系L02中，同样观察到DMB对异烟肼损伤的逆转作用，相较于单纯暴露于25MM异烟肼，25MDMB提高异烟肼致损细胞存活率27。因此，从细胞水平上，可以判断盐酸去亚甲基小檗碱DMB的对异烟肼所致的药源性肝损伤有一定的保护作用。0013本发明通过以小鼠为动物模型，研究发现盐酸去亚甲基小檗碱对异烟肼引起的小鼠。
10、肝损伤具有保护作用。本发明以小鼠为动物试验模型，通过给药治疗，考察盐酸去亚甲基小檗碱DMB对异烟肼引起的小鼠肝损伤的预防性治疗作用。按照药理学剂量换算，小鼠每日灌胃相当于人日常用量的异烟肼100MG/KG21天，使小鼠模拟临床使用异烟肼时造成的药源性肝损伤，同时分别给予DMB15MG/KGIP和30MG/KGIP药物治疗，研究给予DMB治疗对异烟肼引起的肝损伤小鼠肝功能以及肝氧化损伤的保护作用。正常对照组以及模型组给予相同体积的赋形剂，21天后处死动物。实验结果分析表明，小鼠经连续21天异说明书CN104147006A3/8页5烟肼灌胃后，与对照组小鼠相比，模型组小鼠ALT升高345。与模型组。
11、相比，DMB给药组小鼠ALT均下降约45，并恢复至正常水平及以下；小鼠经连续21天异烟肼灌胃后，与对照组小鼠相比，模型组小鼠AST升高1032，与模型组相比，DMB给药组小鼠AST均下降约30，并恢复至接近正常水平。同时给予DMB治疗能显著降低异烟肼所致肝损伤引起的ALT、AST升高。由此可见，DMB具有明显的抗异烟肼致药源性肝损伤和保护肝功能的作用。0014此外，小鼠经连续21天异烟肼灌胃后，与对照组相比，模型组异烟肼引起的肝损伤导致小鼠肝脏脂质过氧化物MDA升高750，GSH降低270，GPX活性分别降低117。而与模型组相比，DMB低剂量15MG/KG，IP和高剂量30MG/KG，IP给。
12、药组MDA分别降低143和452，而GPX活性分别提高了78、和249，以及DMB高剂量组GSH升高365，恢复至接近正常水平。并且DMB对脂质过氧化物MDA的降低、GSH的升高和GPX活性的提高具有显著的浓度依赖性，高剂量组的治疗效果优于低剂量组。因此，DMB具有降低脂质过氧化产物MDA水平，促进GSH再生，增强肝脏自由基的清除，防止脂质过氧化的能力。0015肝脏病理学研究结果表明正常对照组肝脏形态未见异常，肝细胞排列规则；模型组肝脏有明显嗜酸性病变和脂肪浸润现象。而给药组上述病变明显减轻，恢复至接近正常对照组水平，其中DMB低剂量给药组的嗜酸性病变显著减少，但仍有少量脂肪浸润以及细胞水肿现。
13、象，DMB高剂量给药组几乎未见异常病变现象。实验结果表明盐酸去亚甲基小檗碱DMB能有效预防治疗异烟肼引起的肝损伤小鼠肝脏病变。蛋白质免疫印迹实验结果表明小鼠经连续21天异烟肼灌胃后，与对照组相比，模型组小鼠肝脏CYP2E1表达量显著升高，给药DMB30MG/KG，IP后小鼠肝脏CYP2E1表达量明显降低，实验结果表明盐酸去亚甲基小檗碱DMB通过有效降低肝脏CYP2E1的蛋白表达，从而减轻由肝药酶表达增加导致的氧化应激损伤，可有效缓解环节异烟肼引起的肝损伤。0016本发明所用盐酸去亚甲基小檗碱DMB产品采用常规化学与分离纯化法制得。本实验室采用高效液相色谱HPLC分析检测，其纯度达98以上，并经。
14、化学法、质谱MS法和核磁共振1HNMR法分析鉴定，表明本研究所用盐酸去亚甲基小檗碱DMB产品化学结构正确。此项研究表明盐酸去亚甲基小檗碱DMB其纯度和化学结构符合开展体内、外生物学活性和药理作用研究要求。0017本发明还涉及含有作为活性成份的盐酸去亚甲基小檗碱和常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。通常本发明药物组合物含有0195重量的盐酸去亚甲基小檗碱。在单元剂型中本发明化合物一般含量为01100MG。0018本发明化合物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形。
15、式。0019本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。0020本发明化合物或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和穴位注射等。0021给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混说明书CN104147006A4/8页6悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。0022本发明化合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微。
16、粒给药系统。0023例如为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进。
17、剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。0024例如为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、单硬脂酸甘油脂、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂如琼脂粉、干燥粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。0025例如为了将给药单元制成胶囊，将有效成份本发明化合物盐。
18、酸去亚甲基小檗碱与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。0026例如，将本发明化合物盐酸去亚甲基小檗碱制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂、分散剂、渗透压调节剂、增溶剂和PH调节剂。如稀释可选用水、乙醇、聚乙二醇、1，3丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂、脂肪酸酯等。渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、甘油、葡。
19、萄糖、磷酸盐、醋酸盐等；增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基B环糊精等；PH调节剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等。如制备冻干粉针剂，还可以加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。0027此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或香料等。这些辅料是本领域常用的。0028本发明所用的无菌介质都可以通过本领域技术人员众所周知的标准技术制得。可将它们灭菌，例如通过经由细菌过虑器过滤、通过向组合物中加入灭菌剂、通过将组合物放射处理、或通过将组合物加热灭菌。还可以在临用前将它们制成无菌可注射介质。0029为了达到用药目的，增加治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任。
20、何公知的给药方法给药。当然用于实施本发明化合物的给药途径取决于疾病和需要治疗的部位。因为本发明化合物的药动学和药效学特征会有某种程度的不同，因此在组织中获得治疗浓度的最优选方法是逐渐增加剂量并监测临床效果。对于逐渐增加治疗剂量，初始剂量将取决说明书CN104147006A5/8页7于给药途径。0030对于任何特定患者，本发明化合物药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有较大范围的变化。根据所治疗患者的病症，可能必须对剂量作出某些改变，并且在任何情况下，都由医师决定。
21、个体患者的合适剂量。0031给药剂量是指不包括载体重量在内当使用载体时的化合物的重量。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明化合物组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。可以是单一剂量形式给药或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药；这受限于给药医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用并调整剂量。0032去亚甲基小檗碱既是药用植物芸香科植物黄柏中存在的天然产物，又是小檗碱在体内肝脏中的代谢产物，天然环保，无毒高。
22、效。本发明提供了盐酸去亚甲基小檗碱在制备预防和/或治疗异烟肼致药源性肝损伤药物中的应用。0033术语0034ALT谷丙转氨酶；0035AST谷草转氨酶；0036DMB盐酸去亚甲基小檗碱；0037DMSO二甲亚砜；0038GPX谷胱甘肽过氧化物酶；0039GSH谷胱甘肽；0040INH异烟肼；0041IP腹腔注射；0042MDA丙二醛附图说明0043图1DMB对异烟肼所致HEPG2和L02细胞损伤的保护作用0044其中，ADMB和INH对HEPG2细胞的生长影响；BDMB和INH对L02细胞的生长影响0045图2DMB预防性治疗改善异烟肼引起的肝损伤小鼠肝功能0046其中，ADMB和INH对小鼠。
23、血清ALT的影响；BDMB和INH对小鼠血清AST的影响0047图3DMB改善预防性治疗对异烟肼引起的肝氧化应激损伤0048其中，ADMB和INH对小鼠肝组织MDA的影响；BDMB和INH对小鼠肝组织GSH的影响；CDMB和1NH对小鼠肝组织GPX的影响0049图4DMB对异烟肼所致药源性肝损伤病理形态的影响0050其中，A正常小鼠肝组织HE染色图400；B异烟肼损伤模型小鼠肝组织HE染色图400；CDMB低剂量组小鼠肝组织HE染色图400；DDMB高剂量组小鼠肝组织HE染色400。黑色箭头标注为嗜酸性病变部位，红色箭头标注为脂肪浸润病变部位。说明书CN104147006A6/8页80051图。
24、5DMB对异烟肼引起的肝损伤小鼠肝药酶CYP2E1表达的抑制作用具体实施方式0052下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。0053一、体外生物活性试验0054实施例1盐酸去亚甲基小檗碱DMB对异烟肼致药源性肝损伤保护作用0055方法通过MTT法，细胞水平分析DMB对异烟肼致药源性肝损伤的保护作用。取对数生长期的人肝癌细胞HEPG2或人源正常永生化细胞系L02ATCC接种于96孔细胞培养板COSTAR内，以添加10胎牛血清兰州民海生物工程有限公司，批号20120927的DMEM培养基GIBICO，批号1312056培养至一定融合度后，除正常对照组加入相。
25、同赋形剂外，均加入终浓度为25MM的异烟肼，给药组同时加入终浓度分别为625，125或25M的DMB，各组同时进行6个复孔。孵育24小时后，换以含有10MTT无血清DMEM孵育4H，吸尽各孔液体后，每孔加入150UL二甲亚砜DMSO，37摇床混匀15分钟后，490NM读取相应吸光度值。存活率计算方法如下存活率100对照孔吸光度值样本孔吸光度值/对照孔吸光度值100。0056结果实验结果显示，在人源肝癌细胞系HEPG2中，盐酸去亚甲基小檗碱DMB呈剂量依赖性的提高异烟肼致损的细胞存活率，相较于单纯暴露于25MM异烟肼，125M和25MDMB分别提高细胞存活率16，33。在人源正常永生化细胞系L0。
26、2中，同样观察到DMB对异烟肼损伤的逆转作用，相较于单纯暴露于25MM异烟肼，25MDMB提高细胞存活率27。如图1所示。因此，盐酸去亚甲基小檗碱DMB的对异烟肼所致的药源性肝损伤可能有一定的保护作用。此细胞水平的药效结果是后续整体水平药理作用研究的重要前提和保障。0057二、体内药理实验研究0058实施例2DMB预防性治疗对异烟肼引起的肝损伤小鼠肝功能的保护作用0059方法雄性ICR小鼠，体重2224克，随机分为4组，每组8只。4组分别为正常对照组、模型组、DMB低剂量给药组15MG/KG，IP、DMB高剂量给药组30MG/KG，IP。所有小鼠每日灌胃给予相当于人日常用量的异烟肼100MG/。
27、KG。同时给药组小鼠腹腔注射分别给予高、低剂量的DMB，每天一次，其余各组给予相同体积赋形剂，共21天。末次给药后禁食过夜，摘眼球取血，静置30分钟，离心3000RPM/10MIN，常规分离血清。用南京建成试剂盒分析测定血清中ALT和AST活性。0060结果实验结果如表1所示。小鼠经连续21天异烟肼灌胃后，与对照组小鼠相比，模型组小鼠ALT升高345。与模型组相比，DMB低剂量给药组、DMB高剂量给药组小鼠ALT分别下降461、421。小鼠经连续21天异烟肼灌胃后，与对照组小鼠相比，模型组小鼠AST升高1032，与模型组相比，DMB低剂量给药组、DMB高剂量给药组小鼠AST分别下降378、27。
28、9，并恢复至接近正常水平。同时给予DMB治疗能显著降低异烟肼所致肝损伤引起的ALT、AST升高。由此可见，DMB具有明显的抗异烟肼致药源性肝损伤和保护肝功能的作用。如图2所示。0061表1DMB预防性治疗降低对异烟肼引起的肝损伤小鼠ALT和AST的影响说明书CN104147006A7/8页900620063N8，MEANVARIANCEP005，P001，P0001VSMODEL0064实施例3DMB预防性治疗对异烟肼引起的肝氧化损伤的保护作用0065方法雄性ICR小鼠，体重2224克，随机分为4组，每组8只。4组分别为正常对照组、模型组、DMB低剂量15MG/KG，IP给药组和DMB高剂量3。
29、0MG/KG，IP给药组。所有小鼠每日灌胃给予相当于人日常用量的异烟肼100MG/KG。同时给药组小鼠腹腔注射分别给予高、低剂量的DMB，每天一次，其余各组给予相同体积赋形剂，共21天。末次给药后禁食过夜，处死动物，不同小鼠取同一部位肝组织，于冰浴上以PBS制成10肝匀浆。按照试剂盒南京建成说明测定肝组织中脂质过氧化物MDA水平。DTNB法测定抗氧化物质GSH。根据试剂盒南京建成说明分析肝脏中抗氧化酶GPX水平。0066结果实验结果如表2所示。小鼠经连续21天异烟肼灌胃后，与对照组相比，模型组异烟肼引起的肝损伤导致小鼠肝脏脂质过氧化物MDA升高750，GSH降低270，GPX活性分别降低116。
30、。与模型组相比，DMB低剂量和高剂量组MDA分别降低143和452，而GPX活性分别提高了78、和249，以及DMB高剂量组GSH升高365，恢复至接近正常水平。另外，DMB对脂质过氧化物MDA的降低、GSH的升高和GPX活性的提高具有显著的浓度依赖性，高剂量组的治疗效果优于低剂量组。由此可见，DMB具有降低脂质过氧化产物MDA水平，促进GSH再生，增强肝脏自由基的清除，防止脂质过氧化的能力。如图3所示。0067表2DMB预防性治疗对异烟肼引起的肝氧化损伤的保护作用00680069N8，MEANVARIANCEP005，P001，P0001VSMODEL0070实施例4DMB预防性治疗对异烟肼。
31、引起的肝损伤病理学改变的保护作用0071方法雄性ICR小鼠，体重2224克，随机分为4组，每组8只。组分别为正常对照组、模型组、DMB低剂量15MG/KG，IP给药组和DMB高剂量30MG/KG，IP给药组。所有小鼠每日灌胃给予相当于人日常用量的异烟肼100MG/KG。同时给药组小鼠腹腔注射分别给说明书CN104147006A8/8页10予高、低剂量DMB，每天一次，其余各组给予相同体积赋形剂，共21天。末次给药后禁食过夜，处死动物，不同小鼠取肝脏大叶同一部位组织以10甲醛固定，HE染色进行病理学检查。0072结果肝脏病理学研究结果表明，正常对照组肝脏形态未见异常，肝细胞排列规则；模型组肝脏有。
32、明显嗜酸性病变和脂肪浸润现象。而给药组上述病变明显减轻，恢复至接近正常对照组水平，其中DMB低剂量给药组的嗜酸性病变显著减少，但仍有少量脂肪浸润以及细胞水肿现象，DMB高剂量给药组几乎未见异常病变现象。实验结果表明盐酸去亚甲基小檗碱DMB能有效预防治疗异烟肼引起的肝损伤小鼠肝脏病变。如图4所示。0073实施例5DMB预防性治疗对异烟肼引起的肝损伤小鼠肝药酶CYP2E1表达活性的抑制作用0074方法雄性ICR小鼠，体重2224克，随机分为3组，每组8只。3组分别为正常对照组、模型组和DMB高剂量30MG/KG，IP给药组。所有小鼠每日灌胃给予相当于人日常用量的异烟肼100MG/KG。同时给药组小。
33、鼠腹腔注射分别给予高、低剂量DMB，每天一次，其余各组给予相同体积赋形剂，共21天。末次给药后禁食过夜，处死动物，不同小鼠取同一部位肝组织01G，用于蛋白质免疫印迹分析，检测细胞色素P450CYP2E1的表达量。蛋白质免疫印迹实验中内参GAPDH购于BIOWORLD公司中国上海，CYP2E1抗体购于ANBO公司美国旧金山。0075结果小鼠经连续21天异烟肼灌胃后，与对照组相比，模型组小鼠肝脏CYP2E1表达量显著升高，CYP2E1能增加肝脏ROS的生成，引起肝细胞的氧化损伤。给药DMB后小鼠肝脏CYP2E1表达量明显降低，实验结果表明盐酸去亚甲基小檗碱DMB通过有效降低肝脏CYP2E1的蛋白表达，减轻由肝药酶表达增加导致的氧化应激损伤，能有效缓解环节异烟肼引起的肝损伤。如图5所示。说明书CN104147006A101/4页11图1说明书附图CN104147006A112/4页12图2说明书附图CN104147006A123/4页13图3说明书附图CN104147006A134/4页14图4图5说明书附图CN104147006A14。