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本发明公开了一组用于识别结缔组织生长因子的核酸适配子及其应用，通过SELEX方法成功筛选了特异性识别蛋白质CTGF全长及N端或者C端氨基酸片段的核酸适配子。结果表明，经人工合成大量制备的核酸适配子可以特异性识别并结合蛋白质CTGF全长及氨基酸片段，且具有较高的特异性及灵敏性。核酸适配子在亲和力和特异性方面可与抗体媲美，甚至优于抗体，有望被开发成为体内外检测蛋白质CTGF的全长及N端或者C端氨基酸片段的有力工具。

1.  用于识别结缔组织生长因子的核酸适配子，其特征在于，所述核酸适配子的核酸序列如SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2、SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.6所示。

2.  如权利要求1所述的用于识别结缔组织生长因子的核酸适配子，其特征在于：在所述核酸适配子的核苷酸的5′端或3′端带有生物素标签。

3.  如权利要求1所述的用于识别结缔组织生长因子的核酸适配子，其特征在于：
核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示的核酸适配子命名为C-ap11，其结构为：

核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示的核酸适配子命名为C-ap12，其结构为：

核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示的核酸适配子命名为C-ap14，其结构为：

核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示的核酸适配子命名为C-ap15，其结构为：

核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示的核酸适配子命名为C-ap17p，其结构为：

核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示的核酸适配子命名为C-ap18，其结构为：


4.  如权利要求3所述的用于识别结缔组织生长因子的核酸适配子，其特征在于：所述核酸适配子C-ap11，C-ap12，C-ap14，C-ap15及C-ap18特异性识别CTGF全长及C末端氨基酸片段。

5.  如权利要求3所述的用于识别结缔组织生长因子的核酸适配子，其特征在于：所述核酸适配子C-ap17P特异性识别CTGF全长及N末端氨基酸片段。

6.  权利要求1所述的核酸适配子在制备识别结缔组织生长因子的检测试剂中的应用。

7.  权利要求1所述的核酸适配子在制备识别结缔组织生长因子的检测试剂盒中的应用。

8.  含有权利要求1所述的核酸适配子的检测试剂。

用于识别结缔组织生长因子的核酸适配子及其应用
技术领域
本发明属于蛋白质检测技术领域，具体涉及一组用于识别结缔组织生长因子的核酸适配子及其应用。
背景技术
结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)，是新近发现的一种强力的促进肝纤维化因子，在肝纤维化发生发展过程中起着中心作用。CTGF是分泌型蛋白，是高度保守的CCN家族成员之一，具有促进细胞增殖，促进细胞外基质沉积，介导细胞粘附，刺激细胞迁移，促进软骨形成及骨骼发育等多种生物学作用。CTGF在肝纤维化肝组织中表达上调，其表达水平与肝纤维化程度正相关。
指数富集式配体系统进化技术(SELEX)技术是90年代建立的一项筛选技术，基本思想是：体外化学合成一个单链寡核苷酸库，由于每个不同序列的单链核酸可以自身折叠形成特异的二级结构，不同二级结构的单链核酸就有可能与不同靶分子或一个靶分子中的不同位点依照热力学原理结合，从而筛选出与靶分子结合的短链核酸即特异的适配子。基本过程为，将随机寡核苷酸文库与靶物质混合，使靶物质与核酸结合，然后洗掉未与靶物质结合的核酸，分离与靶物质结合的核酸分子，以此核酸分子为模板进行PCR扩增，再进行下一轮的筛选过程。通过重复的筛选与扩增，一些与靶物质不结合或与靶物质有低亲和力、中亲和力的DNA或RNA分子被洗去，而与靶物质高有亲和力的DNA分子或RNA分子从非常大的随机库中分离出来，且纯度随过程的进行而增高，最后占据产物的大多数，称之为适配子。核酸适配子在亲和力和特异性方面可与抗体媲美，甚至优于抗体，并且具有抗体所不具备的其他一些优点：①靶分子范围更广，几乎没有任何限制。目前筛选适配子的靶分子包括金属离子、小分子化合物、糖类、核酸、碱基类似物、多肽与蛋白质、甚至完整的病毒颗粒、 致病菌和活细胞等等。②适配子通过体外筛选，不依靠动物、细胞及内环境，毒素和毒素结合位点也可作为靶标；③适配子筛选周期更短，筛选过程已经自动化，能应用于大规模的工业生产；④适配子稳定性好,可长期保存,能在常温下运输；⑤化学合成的适配子精确度高，重复性强，生产中很少存在批次间的差异；⑥结合能力强。甚至强于天然配基,解离常数(K_d)多在pmol/L－nmol/L之间；⑦适配子没有免疫原性，没有毒性和明显的副作用。可用于体内诊断或治疗；⑧报告子如荧光素或生物素等可与适配子精确地结合在操作者能识别的位点上；⑧结合特异性强。通过反向SELEX筛选，可以有效减弱以至消除既与靶分子结合、又与靶分子类似物结合的核酸分子，从而筛选出高度特异结合靶分子的适配子。适配子能够分辨出靶分子结构上细微的差别，甚至可以区分1个甲基或1个羟基的差别。核苷酸、氨基酸的适配子能将它们与突变体、镜像体区分开来。⑨便于修饰。可以在合成时精确、定点、随意连接其他功能基团和分子，如巯基、氨基和荧光素、生物素、酶等。
发明内容
本发明的目的在于提供一组用于识别结缔组织生长因子的核酸适配子及其应用。
本发明是通过以下技术方案来实现：
用于识别结缔组织生长因子的核酸适配子，所述核酸适配子的核酸序列如SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2、SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.6所示。
在所述核酸适配子的核苷酸的5′端或3′端带有生物素标签。
核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示的核酸适配子命名为C-ap11，其结构为：

核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示的核酸适配子命名为C-ap12，其结构为： 

核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示的核酸适配子命名为C-ap14，其结构为： 

核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示的核酸适配子命名为C-ap15，其结构为： 

核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示的核酸适配子命名为C-ap17p，其结构为： 

核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示的核酸适配子命名为C-ap18，其结构为： 

所述核酸适配子C-ap11，C-ap12，C-ap14，C-ap15及C-ap18特异性识别CTGF全长及C末端氨基酸片段。
所述核酸适配子C-ap17P特异性识别CTGF全长及N末端氨基酸片段。
核酸序列如SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2、SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.6所示的核酸适配子在制备识别结缔组织生长因子的检测试剂中的应用。
核酸序列如SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2、SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.6所示的核酸适配子在制备识别结缔组织生长因子的检测试剂盒中的应用。
含有核酸序列如SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2、SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.6所示的核酸适配子的检测试剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明公开了一种识别蛋白质CTGF的核酸适配子序列，通过SELEX方法成功筛选了特异性识别蛋白质CTGF全长及氨基酸片段的核酸适配子。经过生物素标记后的核酸适配子可以应用于特异性识别并结合重组人CTGF的全长及N末端或者C末端氨基酸片段。结果表明，经人工合成大量制备的核酸适配子C-ap11，C-ap12，C-ap14，C-ap15及C-ap18可以特异性识别CTGF全长及C末端氨基酸片段，其中C-ap12，C-ap14，C-ap15及C-ap18具有很强的结合能力；C-ap17P可以特异性识别CTGF全长及N末端氨基酸片段且具有很强的结合能力。因此，C-ap12，C-ap14，C-ap15，C-ap18及C-ap17P有望被开发为CTGF全长及N末端及C末端氨基酸片段的体外检测试剂盒，且可能具有较高的特异性及灵敏性。
附图说明
图1为筛选的核酸适配子与重组人CTGF结合图；
图2为与重组人CTGF特异性结合印迹图；
图3-1至图3-6分别为筛选的核酸适配子C-ap11，C-ap12，C-ap14，C-ap15，C-ap17及C-ap18结合重组人CTGF的解离常数分析图；
图4-1至图4-6为筛选的核酸适配子C-ap11，C-ap12，C-ap14，C-ap15，C-ap17及C-ap18二级结构图；
图5为带有固定序列的C-ap17P与无固定序列的C-ap17特异性结合印迹图；
图6-1，图6-2分别为带有固定序列的C-ap17P与无固定序列的C-ap17结合重组人CTGF的解离常数分析图；
图7-1，图7-2分别为带有固定序列的C-ap17P与无固定序列的C-ap17结 合重组人CTGF的二级结构图；
图8-1，图8-2分别为CTGF的氨基末端及羧基末端片段的原核表达及纯化图；
图9为C-ap11，C-ap12，C-ap14，C-ap15，C-ap17P及C-ap18图与CTGF的氨基末端及羧基末端片段特异性结合图；
图10为C-ap17P在体外细胞培养基中的生物稳定性分析图。
具体实施方式
本发明提供一种通过SELEX技术筛选的特异性识别重组人CTGF的新分子，成功筛选了识别重组人CTGF的核酸适配子，人工合成的随机的单链DNA文库通过SELEX方法筛选出与重组人CTGF特异性结合的单链DNA，经测序获得该单链DNA序列后，通过人工合成大量制备，并进行生物素标记。结果表明经过人工制备的带有生物素标签的核酸适配子可以特异性的识别重组人CTGF的全长及N末端或者C末端氨基酸片段，且具有很强的结合能力。下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
1、SELEX技术筛选核酸适配子
随机单链DNA(ssDNA)文库的构建和引物合成
1)构建并人工合成长度为76个碱基(nt)的随机ssDNA文库，两端为18个碱基的固定序列，中间为40个碱基的随机序列，文库容量大约为1015～1016(Takara公司，大连，中国)。
5′–GGACAAGAATCACCGCTC–N40–CGTACAGGAGGCATACAG–3′
2)合成引物： 
上游引物：5′–GGACAAGAATCACCGCTC–3′
下游引物：5′–CTGTATGCCTCCTGTACG–3′
微孔板为介质的SELEX筛选
1)微孔板包被方法：将重组人CTGF(ProSpec-Tany TechnoGene Ltd公司，以色列)溶于50mM碳酸盐缓冲液(pH 9.5)包被于Nunc 96孔酶联板上，每孔50ng重组人CTGF溶于100μL 50mM碳酸盐缓冲液，4℃过夜，3％牛血清白蛋白(BSA)(SHMCK缓冲液配制)封闭，4℃过夜，备用。
2)SELEX筛选方法： 
a)取200ng ssDNA文库溶于100μL SHMCK缓冲液(20mM Hepes，120mM NaCl，5mM KCl，1mM MgCl2，1mM CaCl2，pH 7.4)。将ssDNA 95℃热变性5分钟，立即冰浴15分钟，室温下放置5分钟。文库溶液中加入10μg酵母tRNA及100μg BSA。酵母tRNA及BSA用于去除文库中与其结合的ssDNA。
b)混合溶液加入BSA包被的微孔内，37℃孵育1小时，反筛去除与BSA(SHMCK缓冲液配制)结合的ssDNA。然后，将孔内液体转移至重组人CTGF包被孔，37℃孵育1小时。弃去微孔中液体，用含有0.05％Tween-20的SHMCK缓冲液洗涤微孔，洗6遍，洗去未结合的ssDNA。
c)微孔内加入洗脱缓冲液(7M尿素，0.5M NH4Ac，1mM EDTA，0.2％SDS)，95℃孵育10分钟。洗脱下来的与CTGF结合的ssDNA，经酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，将ssDNA溶解于20μL TE缓冲液中。
d)对称PCR方法扩增筛选获得的ssDNA，PCR产物为双链DNA(dsDNA)，对称PCR体系为：


对称PCR反应条件为： 
95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，51℃退火30秒，72℃延伸30秒，反应20个循环，72℃10分钟。
a)PCR产物经酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，将dsDNA溶解于20μL TE缓冲液中。 
b)不对称PCR方法获得ssDNA，不对称PCR体系为：

不对称PCR反应条件为： 
95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，51℃退火30秒，72℃延伸30秒，反应15个循环，72℃10分钟。
(1)不对称PCR产物经10％变性丙烯酰胺胶(SDS-PAGE)电泳，银染分析ssDNA条带。切下含有ssDNA条带的丙烯酰胺胶，经Column PAGE Oligo Gel DNA Extraction Kit回收ssDNA。回收的ssDNA以吸光度OD260/280定量，用于下一轮筛选。
(2)按照上述筛选方法，筛选8轮后获得的ssDNA经对称PCR方法获得dsDNA。dsDNA与pGEM-T easy载体连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α细胞。转化后挑取50个克隆，克隆经鉴定后测序。
(3)测序后，根据适配子的长度及序列同源性，筛选出18条核酸适配子，核酸序列如下表1所示：
表1

2、核酸适配子与重组人CTGF全长的结合能力分析
(1)微孔板包被方法：重组人CTGF溶于50mM碳酸盐缓冲液(pH 9.5)包被于Nunc 96孔酶联板上，每孔20ng重组人CTGF溶于100μL 50mM碳酸盐缓冲液，4℃过夜，3％牛血清白蛋白(BSA)(SHMCK缓冲液配制)封闭，4℃过夜，用于后续结合实验。
(2)以含有所筛核酸适配子序列的T载体质粒为模板，不对称PCR方法获得带有生物素标签的ssDNA(biotin-ssDNA)，不对称PCR体系为：


不对称PCR反应条件为： 
95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，51℃退火30秒，72℃延伸30秒，反应15个循环，72℃10分钟。
(3)核酸适配子与重组人CTGF全长的结合实验
1)biotin-ssDNA按上述方法回收。回收的biotin-ssDNA(100nM)溶于100μL SHMCK缓冲液(20mM Hepes，120mM NaCl，5mM KCl，1mM MgCl2，1mM CaCl2，pH 7.4)。将ssDNA 95℃热变性5分钟，立即冰浴15分钟，室温下放置5分钟。
2)复性后的biotin-ssDNA分别加入BSA包被的微孔及重组人CTGF包被的微孔内，37℃孵育1小时。弃去微孔中液体，用含有0.05％Tween-20的SHMCK缓冲液洗涤微孔，洗6遍，洗去未结合的ssDNA。
3)BSA包被的微孔及重组人CTGF包被的微孔内，每孔加入SHMCK稀释后的辣根过氧化物酶标记的链霉素(HRP-streptavidin，1：5000)100μL，37℃孵育1小时。弃去微孔中液体，用含有0.05％Tween-20的SHMCK缓冲液洗涤微孔，洗6遍，显色。
4)利用酶标仪在波长为450nm条件下进行分析，结果如图1。结果显示带有固定序列的核酸适配子C-ap11P，C-ap12P，C-ap14P，C-ap15P，C-ap17P，C-ap18P与CTGF的结合能力明显高于BSA。统计数据为均值±标准误，T检验分析显示差异具有显著性(*P<0.05)。
3、以斑点印迹实验验证核酸适配子与CTGF结合的特异性 
(1)重组人CTGF及BSA分别点在醋酸纤维素膜上，每个斑点为20ng重组人CTGF或BSA。1％人血清白蛋白(SHMCK缓冲液稀释)封闭。
(2)人工合成核酸适配子C-ap11，C-ap12，C-ap14，C-ap15，C-ap17，C-ap18，并在5′端或3′端人工标记生物素标签(Takara，大连，中国)，核酸适配子的序列及标记方式如下表2所示：
表2

注：C-ap17P是指C-ap17携带两端固定序列后形成的适配子，表格中框内序列为两端固定序列。
(3)斑点印迹实验 
1)复性后的带生物素标签的核酸适配子C-ap11，C-ap12，C-ap14，C-ap15，C-ap17，C-ap18(各100nM)与带有重组人CTGF或BSA的醋酸纤维素膜孵育，37℃孵育1小时。ssDNA文库为对照。
2)TBSTE(10mM Tris/HCl，100mM NaCl，0.05mM EDTA，0.05％Tween-20，pH 7.0)洗膜，每5分钟一次，洗3遍。
3)TBSTE稀释后的HRP-streptavidin(1:5000)与膜孵育，37℃孵育1小时。TBSTE洗膜，每5分钟一次，洗3遍。
4)ECL(enhanced chemiluminescence)显影，如图2。结果显示C-ap11，C-ap12，C-ap14，C-ap15，C-ap17及C-ap18均与重组人CTGF结合，可显示斑点，其中C-ap11，C-ap12，C-ap14，C-ap15及C-ap18可显示明显的斑点，表示与CTGF的结合能力更强。以上适配子均不与BSA结合，不显示斑点。
4、筛选出的核酸适配子解离常数(Kd)分析
(1)微孔板包被方法：重组人CTGF溶于50mM碳酸盐缓冲液(pH 9.5)包被于Nunc 96孔酶联板上，每孔20ng重组人CTGF溶于100μL 50mM碳酸 盐缓冲液，4℃过夜，3％牛血清白蛋白(BSA)(SHMCK缓冲液配制)封闭，4℃过夜。
(2)解离常数分析方法：
1)核酸适配子以SHMCK缓冲液稀释成10nM，20nM，50nM，100nM，200nM，400nM。适配子经上述方法变性后复性，加入CTGF包被的微孔。37℃孵育1小时。弃去微孔中液体，用含有0.05％Tween-20的SHMCK缓冲液洗涤微孔，洗6遍，洗去未结合的ssDNA。
2)每孔加入SHMCK稀释后的HRP-streptavidin(1:5000)100μL，37℃孵育1小时。弃去微孔中液体，用含有0.05％Tween-20的SHMCK缓冲液洗涤微孔，洗6遍，显色。
3)酶标仪波长450nm条件下进行分析。
4)分析数据经GraphPad Prism v5.0软件分析，获得Kd值。
(3)结果显示如图3-1–图3-6。C-ap11Kd为7.376nM，C-ap12Kd为3.893nM，C-ap14Kd为5.561nM，C-ap15Kd为5.234nM，C-ap17Kd为10.96nM，C-ap18Kd为9.734nM。
5、筛选出的核酸适配子二级结构分析
核酸适配子C-ap11，C-ap12，C-ap14，C-ap15，C-ap17，C-ap18的二级结构经RNA Structure v3.5软件分析，二级结构显示如图4-1–图4-6。
6、C-ap11，C-ap12，C-ap14，C-ap15及C-ap18对比分析
C-ap11与C-ap12的核酸序列极其相似，仅相差三个胞嘧啶；C-ap14与C-ap15的核酸序列也极其相似，仅相差三个鸟嘌呤。二级结构分析结果显示，C-ap11与C-ap12的结构相似，含有两个序列相似的碱基环，并形成夹臂样的结构；C-ap14与C-ap15的结构也相似，也含有两个序列相似的碱基环，并形成夹臂样的结构。我们预测这种夹臂结构可能有利于适配子与CTGF结合。同时，C-ap11，C-ap12与C-ap14，C-ap15的二级结构互为镜像，这就解释了这 四条核酸适配子都可以与重组人CTGF结合，且具有较强的结合能力。其中C-ap12，C-ap14及C-ap15的结合能力强于C-ap11，这可能与生物素标记位置不同有关，C-ap12，C-ap14及C-ap15标记在5′端，而C-ap11标记在3′端。
C-ap18的序列及二级结构与上述四条核酸适配子不同。C-ap18含有3个环形结构，且紧密相连，虽然C-ap18也可以较好的结合CTGF，但它的Kd值低于C-ap11，C-ap12，C-ap14及C-ap15。这一现象提示C-ap11，C-ap12，C-ap14及C-ap15的碱基环所形成的夹臂结构可能更有利于与重组人CTGF结合。
7、C-ap17P，C-ap17与重组人CTGF全长的结合能力对比分析
(1)以斑点印迹实验对比C-ap17P，C-ap17与CTGF结合的特异性
按上述方法进行斑点印迹实验，结果显示C-ap17P，C-ap17均与重组人CTGF结合，显示出斑点印迹，但不与BSA形成斑点印迹，如图5所示。
(2)C-ap17P与C-ap17解离常数及二级结构对比分析
C-ap17仅具有一个环形结构，解离常数分析显示C-ap17的Kd值为10.96nM；但两端带有固定序列的C-ap17P在结合实验中却表现出了明显的结合能力。经分析C-ap17P与CTGF结合的Kd值为3.648nM，明显小于C-ap17，如图6-1，图6-2所示。二级结构分析显示C-ap17仅具有一个环形结构，而C-ap17P含有三个环形结构并形成夹臂结构。这种夹臂结构可能有利于适配子与重组人CTGF结合。如图7-1，图7-2所示。
(3)因此，我们舍弃C-ap17，而选择C-ap17P，用于结合重组人CTGF。
8、核酸适配子结合重组人CTGF区域分析
(1)原核表达CTGF氨基酸片段CTGFN及CTGFC。
1)以质粒pRc/CMV-CTGF为模板，扩增CTGFN及CTGFC核酸序列：
CTGFN上游引物：5′–GGAATTCATGACCGCCGCCAGTA–3′
CTGFN下游引物： 
5′–CCAGCTGTAGCACCACCACCACCACCACTGGGCCAAACGTGTCTTC–3′
CTGFC上游引物：5′–GGAATTCATGGACCCAACTATGATTAGAG–3′
CTGFC下游引物： 
5′–CCAGCTGTAGCACCACCACCACCACCACTGCCATGTCTCCGTACATC–3′
2)PCR产物与pGEM-T easy载体连接，克隆CTGFN及CTGFC核酸片段。
3)CTGFN及CTGFC核酸片段克隆如pET-28a(+)载体，获得pET-28-CTGFN及pET-28-CTGFC。
4)重组质粒pET-28-CTGFN及pET-28-CTGFC转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，表达带有His标签的重组蛋白CTGFN及CTGFC。
5)利用Ni-NTA系统变性纯化重组蛋白CTGFN及CTGFC，如图8-1，图8-2。
(2)重组蛋白CTGFN及CTGFC溶于50mM碳酸盐缓冲液(pH 9.5)包被于Nunc 96孔酶联板上，每孔20ng重组蛋白CTGFN及CTGFC分别溶于100μL 50mM碳酸盐缓冲液，4℃过夜，3％牛血清白蛋白(BSA)(SHMCK缓冲液配制)封闭，4℃过夜。
(3)结合实验
1)经变性复性后C-ap11，C-ap12，C-ap14，C-ap15，C-ap17P，C-ap18以SHMCK缓冲液稀释成200nM，加入CTGF包被的微孔。37℃孵育1小时。弃去微孔中液体，用含有0.05％Tween-20的SHMCK缓冲液洗涤微孔，洗6遍，洗去未结合的ssDNA。
2)每孔加入SHMCK稀释后的HRP-streptavidin(1:5000)100μL，37℃孵育1小时。弃去微孔中液体，用含有0.05％Tween-20的SHMCK缓冲液洗 涤微孔，洗6遍，显色。
3)酶标仪波长450nm条件下进行分析。结果如图9所示。其中C-ap12，C-ap14，C-ap15，C-ap18与CTGFC具有很强的结合能力，C-ap17P与CTGFN有很强的结合能力，而C-ap11显示出与CTGFC有较弱的结合能力。
9、核酸适配子生物稳定性的初步研究结果
(1)高糖细胞培养基DMEM中加入10％胎牛血清，100U/mL青霉素及100U/mL链霉素配制成完全培养基。将200ng C-ap17P溶于10μL SHMCK缓冲液中，经变性复性后加入200μL完全细胞培养基。混合物置于细胞培养箱，37℃孵育。分别于0,4,8,12,16,20,24,48及72小时，从混合物中取样5μL，并以样品作为模板扩增双链DNA。
PCR体系为：

对称PCR反应条件为： 
95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，51℃退火30秒，72℃延伸30秒，反应20个循环，72℃10分钟。
(2)PCR产物经10％变性丙烯酰胺胶(SDS-PAGE)电泳，银染分析双链DNA条带，如图10。结果显示在C-ap17P与完全培养基孵育24小时内，均可以从混合物中扩增出双链DNA，但超过24小时后不能从混合物中扩增出 双链DNA。因此，结果说明C-ap17P在体外细胞培养条件中可以稳定存在至多24小时。
目前蛋白质的识别及检测主要以抗体为主，核酸适配子在亲和力和特异性方面可与抗体媲美，甚至优于抗体，并且具有抗体所不具备的其他一些优点：靶分子范围更广；筛选周期更短，筛选过程已经自动化，能应用于大规模的工业生产；稳定性好，可长期保存，能在常温下运输；化学合成的适配子精确度高，重复性强，生产中很少存在批次间的差异；结合能力强，解离常数(K_d)多在pmol/L－nmol/L之间；适配子没有免疫原性，没有毒性和明显的副作用，可用于体内诊断或治疗；可以精确修饰。因此，核酸适配子具有更为广阔的应用前景。
综合本发明的以上结果表明，经过人工制备的带有生物素标签的核酸适配子C-ap11，C-ap12，C-ap14，C-ap15及C-ap18可以特异性的识别重组人CTGF的全长及N末端氨基酸片段，其中C-ap12，C-ap14，C-ap15及C-ap18具有很强结合能力。C-ap17P可以特异性的识别重组人CTGF的全长及C末端氨基酸片段且具有很强的结合能力。因此，C-ap12，C-ap14，C-ap15，C-ap18及C-ap17P有望被开发成为体内外检测蛋白质CTGF的全长及N末端或者C末端氨基酸片段的有力工具。