一种用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的DNA核酸适配体及其筛选方法和应用.pdf

本发明公开一种用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的DNA核酸适配体及其筛选方法和应用。在每轮筛选过程中，引入两次反筛的步骤，首先将前一轮的单链DNA文库与正常细胞结合，以去除与正常石斑鱼细胞结合的非特异ssDNA，然后将上清与被石斑鱼虹彩病毒感染的细胞进行结合筛选，从被石斑鱼虹彩病毒感染的细胞上分离得到的ssDNA，然后再和正常细胞结合，分离得到上清。PCR扩增文库制备出单链的DNA文库。重复以上的筛选流程，与第一轮筛选的正常细胞数目相比，将筛选过程中正常细胞的数目提高2-6倍，与第一轮筛选的文库与细胞的结合时间相比，在随后的筛选过程中，文库与正常细胞结合时间从0.5h增加至1h，文库与病毒感染细胞结合时间从1h缩短至0.5h，以提高每轮的筛选效率。

1.  一种用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的DNA核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的核苷酸序列上结合有用于检测的标记。

2.  根据权利要求1所述的用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的DNA核酸适配体，其特征在于，其核苷酸序列上的任一位置能够被磷酸化、甲基化、氨基化、疏化或同位素化。

3.  根据权利要求1所述的用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的DNA核酸适配体，其特征在于，所述的用于检测的标记为异硫氰酸荧光素、羧基四甲基罗丹明、生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料、聚乙二醇、肽段、蛋白、叶酸或酶标记。

4.  权利要求1所述的DNA核酸适配体的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、合成以下随机单链DNA文库和引物：
随机文库Library50：
5’-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG(50N)CGAAGGACGCAGATGAAGTCTC
5’引物：5’-FITC-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3’；
5’引物：5’-TAMRA-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3’；
3’引物：5’-Biotin-GAGACTTCATCTGCGTCCTTCG-3’；
(2)、Cell-SELEX筛选流程：用石斑鱼虹彩病毒感染正常的石斑鱼脾细胞GS细胞，细胞继续培养48h，去除培养基后用缓冲液洗涤被感染的GS细胞，将步骤(1)中的随机文库溶解后首先与正常GS细胞在冰上孵育结合0.5h得到上清，然后将上清与被感染的GS细胞进行孵育结合1h，孵育完成后去除液体并用缓冲液洗涤GS细胞，然后将洗涤后的GS细胞于85～94℃加热2～10min，离心得到上清1，将上清1与正常的GS细胞在冰上孵育结合，用与得到上清1相同的方法得到上清2，即为被虹彩病毒感染的GS细胞的特异性核酸适配体文 库；
(3)、文库扩增：利用步骤(1)中的合成的引物对步骤(2)中筛选得到的特异性核酸适配体文库进行PCR扩增，得到扩增产物双链DNA；
(4)、DNA单链文库的制备：将链酶亲和素标记的磁珠与步骤(3)中的双链DNA在常温下孵育，利用双链DNA上的标记与磁珠上链酶亲和素的亲和作用，将双链DNA结合到磁珠表面，在磁珠中加入碱液反应后，回收得到上清液，将上清液通过除盐柱收集到含有DNA单链文库的溶液；
(5)、重复多轮筛选：将步骤(4)中收集的DNA单链文库代替步骤(2)中的随机文库，重复以上步骤(2)-(4)至少14次，与第一轮筛选的正常细胞数目相比，将筛选过程中正常GS细胞的数目提高2-6倍，与第一轮筛选的文库与细胞的结合时间相比，在随后的筛选过程中，文库与正常GS细胞结合时间从0.5h增加至1h，文库与病毒感染细胞结合时间从1h缩短至0.5h，以提高每轮的筛选效率，即得到用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的DNA核酸适配体。

5.  根据权利要求4所述的DNA核酸适配体的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中所述的培养基为L15培养基。

6.  根据权利要求4所述的DNA核酸适配体的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中所述的缓冲液为PBS缓冲液。

7.  根据权利要求4所述的DNA核酸适配体的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中所述的PCR扩增，其扩增体系为：1000μl：10×buffer 100μl，dNTP(2.5mM)80μl，模板100μl，5’引物30μl，3’引物30μl，rTaq酶10μl，dsH₂O 650μl，扩增程序为：94℃2min，94℃1min，60℃30sec， 72℃1min，经过12轮循环，72℃5min。

8.  一种用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的DNA核酸适配体。

9.  权利要求1所述的DNA核酸适配体在进行石斑鱼虹彩病毒的感染检测中的应用。

一种用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的DNA核酸适配体及其筛选方法和应用
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种可用于细胞水平和组织水平上石斑鱼虹彩病毒(SGIV)感染检测的DNA核酸适配体及其筛选方法和应用。
背景技术：
核酸适配体是由指数富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选得到的一类新型检测和治疗工具。指数富集的配基系统进化技术是一类广受关注的新型检测和治疗的生物文库技术。它利用人工合成的、容量约为10¹⁴～10¹⁵的随机寡核苷酸文库与靶物质结合，经过多轮筛选获得靶物质的核酸适配体。利用该技术筛选得到的核酸适配体具有与单克隆抗体相当的高特异性和高亲和性，由于筛选是在体外进行的化学过程，所以从金属离子、有机染料等简单体系，到病毒、细胞、组织等复杂体系，均可作为筛选对象，而且核酸适配体没有免疫原性，温度变化引起的变性是可逆的，筛选时间短费用低，得到的核酸适配体易于合成和修饰。因此，核酸适配体不仅在新药研发领域具有广阔前景而引人瞩目，其在重大疾病的生物医学基础研究、疾病诊断领域同样显示出广阔的应用前景。
我国是水产养殖大国，石斑鱼是最名贵的海水养殖鱼类之一，具有极高经济价值。然而，近年来在石斑鱼中暴发和流行的虹彩病毒等严重地威胁了石斑鱼的海水养殖，造成了巨大的经济损失。目前国际上在水产动物疾病，包括石斑鱼虹彩病毒快速诊断的方法主要包括基于细菌学、病毒学、寄生虫学及组织病理学的传统方法，基于抗体的免疫学检测方法，针对特异性病原的抗体的血清学检测技术以及分子生物学技术等。这些方法各有优点同时也存在严重不足，所以必须着力开发新型的、特异性更强、灵敏性更高、操作更简便的核酸适配体来 检测和控制石斑鱼虹彩病毒(SGIV)感染。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种高特异性、高灵敏度、无免疫原性、稳定易修饰、便于合成和保存的用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的DNA核酸适配体。
本发明的用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的DNA核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的核苷酸序列上结合有用于检测的标记。
上述DNA核酸适配体，其核苷酸序列上的任一位置可以被磷酸化、甲基化、氨基化、疏化或同位素化。
所述的用于检测的标记优选为：异硫氰酸荧光素(FITC)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料、聚乙二醇、肽段、蛋白、叶酸或酶标记。
上述DNA核酸适配体，不论是经部分取代或者经过修饰后，都具有与原核酸适配体基本相同或者类似的分子结构、理化性质和功能，都可用于石斑鱼虹彩病毒(SGIV)检测。
本发明的第二个目的提供一种上述DNA核酸适配体的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、合成以下随机单链DNA文库和引物：
随机文库Library50：
5’-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG(50N)CGAAGGACGCAGATGAAGTCTC
5’引物：5’-FITC-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3’；
5’引物：5’-TAMRA-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3’；
3’引物：5’-Biotin-GAGACTTCATCTGCGTCCTTCG-3’；
(2)、Cell-SELEX筛选流程：用石斑鱼虹彩病毒感染正常的石斑鱼脾细胞GS细胞，细胞继续培养48h，去除培养基后用缓冲液洗涤被感染的GS细胞，将步骤(1)中的随机文库溶解后首先与正常GS细胞在冰上孵育结合0.5h得到上清，然后将上清与被感染的GS细胞进行孵育结合1h，孵育完成后去除液体并用缓冲液洗涤GS细胞，然后将洗涤后的GS细胞于85～94℃加热2～10min，离心得到上清1，将上清1与正常的GS细胞在冰上孵育结合，用与得到上清1相同的方法得到上清2，即为被虹彩病毒感染的GS细胞的特异性核酸适配体文库；
(3)、文库扩增：利用步骤(1)中的合成的引物对步骤(2)中筛选得到的特异性核酸适配体文库进行PCR扩增，得到扩增产物双链DNA；
(4)、DNA单链文库的制备：将链酶亲和素标记的磁珠与步骤(3)中的双链DNA在常温下孵育，利用双链DNA上的标记与磁珠上链酶亲和素的亲和作用，将双链DNA结合到磁珠表面，在磁珠中加入碱液反应后，回收得到上清液，将上清液通过除盐柱收集到含有DNA单链文库的溶液；
(5)、重复多轮筛选：将步骤(4)中收集的DNA单链文库代替步骤(2)中的随机文库，重复以上步骤(2)-(4)至少14次，与第一轮筛选的正常细胞数目相比，将筛选过程中正常GS细胞的数目提高2-6倍，与第一轮筛选的文库与细胞的结合时间相比，在随后的筛选过程中，文库与正常GS细胞结合时间从0.5h增加至1h，文库与病毒感染细胞结合时间从1h缩短至0.5h，以提高每轮的筛选效率，即得到用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的DNA核酸适配体。
优选，步骤(2)中所述的培养基为L15培养基。
优选，步骤(2)中所述的缓冲液为PBS缓冲液。
优选，步骤(3)中所述的PCR扩增，其扩增体系为1000μl：10×buffer 100μl，dNTP(2.5mM)80μl，模板100μl，5’引物30μl，3’引物30μl，rTaq酶10μl，dsH₂O 650μl，扩增程序为：94℃2min，94℃1min，60℃30sec，72℃1min，经过12轮循环，72℃5min。
步骤(4)中所述的回收得到上清液，优选通过磁性分离架回收。
本发明的第三个目的是提供一种用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的试剂盒，其特征在于，含有上述SEQ ID NO：1所示的DNA核酸适配体。
本发明的第四个目的是提供上述用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的DNA核酸适配体在进行石斑鱼虹彩病毒的感染检测中的应用。
本发明将随机DNA单链文库首先与正常细胞在冰上孵育后，回收到的上清1与被病毒感染的GS细胞在冰上孵育，收集感染细胞高温变性回收到上清2后，再次与正常细胞冰上孵育，从而最大限度地去除与正常细胞结合的非特异单链DNA，实现提高筛选效率的目的。
与现有的技术相比，本发明的优点在于：本发明通过优化的细胞SELEX筛选得到的核酸适配体，与现有的蛋白抗体相比具有更高的亲和力和特异性，而且还具有蛋白抗体所不具备的特点，包括无免疫原性；分子量小，便于体外化学合成；易于对核酸适配体的不同部位进行修饰和取代；序列稳定易于运输和保存；制备周期短，重现性好；便于标记等。采用本发明的核酸适配体进行石斑鱼虹彩病毒的感染检测时，操作简单迅速，可以在细胞水平和组织水平上检测到虹彩病毒的感染，解离常数均在纳摩尔范围以内，并应用于相关的检测试剂盒。这对于虹彩病毒感染的快速检测具有重要意义，在虹彩病毒感染的检测领域有良好的应用前景。
附图说明：
图1是本发明实施例中流式细胞仪检测异硫氰酸荧光素(FITC)标记的第9轮、10轮、11轮、12轮、13轮、14轮筛选文库与被虹彩病毒感染的GS细胞的结合情况，其中，A为感染SGIV的GS靶细胞，B为正常的GS对照细胞；
图2是本发明实施例中流式细胞仪检测筛选得到的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的序列1的核酸适配体与被虹彩病毒感染的GS细胞结合能力的检测结果；
图3是本发明实施例中羧基四甲基罗丹明(TAMRA)标记的序列1的核酸适配体与被虹彩病毒感染的GS细胞、正常GS细胞染色荧光强度差异比较(图中的两组图片，左边是明场的成像，右边是荧光通道的成像，是同一照片中不同通道的信息)；
图4是本发明实施例中羧基四甲基罗丹明(TAMRA)标记的序列1的核酸适配体与被虹彩病毒感染的石斑鱼肝脏组织、正常石斑鱼肝脏组织染色荧光强度差异比较(图中的两组图片，左边是明场的成像，右边是荧光通道的成像，是同一照片中不同通道的信息)。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中的实验材料如无特殊说明，均是从常规的生化试剂公司购买所得到。
实施例1：
1、合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物
随机文库Library50：
5’-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG(50N)CGAAGGACGCAGATGAAGTCTC
5’引物：5’-FITC-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3’；
5’引物：5’-TAMRA-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3’；
3’引物：5’-Biotin-GAGACTTCATCTGCGTCCTTCG-3’；
2、Cell-SELEX筛选获得特异性识别被SGIV感染的GS细胞的核酸适配体
2.1L15培养基中加入10％胎牛血清培养GS细胞至铺满培养瓶底95％，在培养瓶中加入石斑鱼虹彩病毒(SGIV)，石斑鱼虹彩病毒感染正常的石斑鱼脾细胞GS细胞，继续培养48h后，去除被病毒感染的细胞的培养瓶中的培养基，用15ml PBS洗涤被感染的GS细胞；
2.2将10nmol上述随机文库溶解在300μl binding buffer中，95℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，用binding buffer补充至1mL，将处理后的随机文库与2.1中被SGIV感染的GS细胞在冰上孵育1h；
2.3孵育结合完成后，将培养瓶中的液体除去，用10mL的PBS洗涤培养瓶中细胞；用细胞刮刀将细胞刮下并混匀在1mL PBS中，将细胞混液转移到EP管中，94℃恒温水浴5min，12000g离心收集上清，即为感染SGIV的GS细胞的特异核酸适配体库。
3、PCR扩增筛选文库
取200μl筛选得到的感染SGIV的GS细胞的特异核酸适配体库进行PCR扩增，具体的扩增条程序是：94℃2min，94℃1min，60℃30sec，72℃1min，经过12轮循环，72℃5min。第一轮筛选后得到的上清，要全部用于进行PCR扩增，得到扩增产物。
4、DNA单链文库的制备
将100μl链酶亲和素标记的磁珠与步骤3中PCR扩增所得的双链DNA在常温下孵育30min，利用双链DNA上的生物素与磁珠上链酶亲和素的亲和作用，将双链DNA结合到磁 珠表面，将EP管放在磁性分离器上除去上清，用1mLPBS洗涤磁珠，然后在EP管中加入400ul 200mM NaOH溶液，常温反应15min，利用磁性分离架回收得到上清；除盐柱用10mL无菌水洗涤后，将上清液加入除盐柱，靠重力作用自然滴完。加入1mL无菌水，收集到含有DNA单链文库的溶液。
5、如上反复筛选
将步骤4中得到的DNA单链文库代替步骤(2)中的随机文库，重复步骤2-4所示的阳性筛选过程、PCR扩增及单链DNA文库的制取过程14次。
6、阴性筛选
在第二轮及第二轮以后筛选中，用正常的GS细胞为对照，将步骤5后筛选得到的DNA单链文库进行阴性筛选以提高筛选效率。具体的阴性筛选过程为：培养GS细胞至铺满培养瓶底，用15ml PBS洗涤细胞；将筛选得到的DNA文库溶解、95℃恒温水浴、冰浴后，与经前述处理后的正常GS细胞在冰上孵育0.5h，孵育完成后收集细胞孵育后的溶液；然后将此溶液与被SGIV感染的GS细胞进行冰浴结合1h；将感染SGIV的GS细胞经85～94℃恒温水浴加热2～10min，12000g离心收集到上清1后，再将此上清1与经前述处理后的另一瓶正常GS细胞在冰上孵育1h，收集到的上清2即为经过两次反筛的高特异性识别感染SGIV的GS细胞的核酸适配体。
7、15轮筛选
将步骤6中收集到的上清溶液，经过步骤3的PCR扩增和步骤4的单链DNA文库制备后，依次重复进行步骤6、步骤2、步骤3和步骤4的过程，利用流式细胞术检测所得文库对感染SGIV的GS细胞识别能力的增强情况，与第一轮筛选的正常细胞数目相比，将筛选过程 中正常GS细胞的数目提高2-6倍，与第一轮筛选的文库与细胞的结合时间相比，在随后的筛选过程中，文库与正常GS细胞结合时间从0.5h增加至1h，文库与病毒感染细胞结合时间从1h缩短至0.5h，以提高每轮的筛选效率，直至15轮筛选后，文库对被感染SGIV的GS细胞识别能力达到最强。将所得扩增产物经克隆测序分析后，最终得到本实施例的1条可用于检测SGIV感染的核酸适配体，序列如SEQ ID NO：1所示。
8、利用流式细胞术检测筛选过程中核酸适配体文库的富集情况
将感染SGIV的GS细胞用无酶消化液处理，1000g离心除去上清，用5mLPBS离心洗涤三次。将300nM异硫氰酸荧光素(FITC)标记的第9轮、10轮、11轮、12轮、13轮、14轮筛选文库溶于1mL的binding buffer中，然后与经上述处理后的细胞在冰上孵育结合30min，1000g离心去上清，用5mLPBS离心洗涤三次，最终将细胞混匀在500μl PBS中，用于流式细胞仪检测。以与Library结合的细胞为对照1，以各轮文库与正常GS细胞的结合为对照2，检测结果如图1所示。该结果证实，经过14轮的筛选，得到的筛选文库对感染SGIV的GS靶细胞具有较强的特异性识别能力(图1A)，而对正常的GS对照细胞无识别(图1B)。
9、利用流式细胞术检测本实施例中四条异硫氰酸荧光素(FITC)标记的核酸适配体对感染SGIV的GS细胞的结合效果及其特异性
细胞的处理、细胞与核酸适配体的孵育结合过程如上述所示，流式细胞术的检测结果如图2所示，结果证实，序列1的核酸适配体均对靶细胞感染SGIV的GS细胞具有较强的特异性识别能力。
10、荧光显微镜检测本实施例中四条羧基四甲基罗丹明(TAMRA)标记的核酸适配体与感染SGIV的GS细胞的结合效果及其特异性
在六孔板中的盖玻片上培养GS细胞，接入SGIV后继续培养48h，获得感染SGIV的GS细胞细胞，在另一盖玻片上培养正常GS细胞作为对照，去除培养基，用10mL PBS洗涤细胞。加入含有300nM上述本实施例中的核酸适配体的1mL binding buffer，冰浴结合30min。反应结束后，去除上清，用10mL PBS清洗三次，略干燥后，将盖玻片放在载玻片上用抗荧光淬灭剂封片，观察。如图3所示，序列1的核酸适配体均对感染SGIV的GS细胞具有特异性结合能力，而对正常GS细胞几乎没有结合能力，该结果与流式细胞仪的检测结果一致。
11、核酸适配体对被虹彩病毒感染的石斑鱼肝脏组织的特异性结合测试
用羧基四甲基罗丹明(TAMRA)标记的序列1核酸适配体，对感染SGIV的石斑鱼肝脏组织冰冻切片进行特异性结合检测，将核酸适配体与正常石斑鱼肝脏组织冰冻切片的结合结果作为对照。首先将冰冻切片用100mL PBS洗涤3次，将切片与200μl含有300nM TAMRA标记的核酸适配体的binding buffer室温孵育结合60min，然后将组织放在摇床上用100mL PBS洗涤，对照正常组织的染色和洗涤方法相同。待组织略干燥后，用抗荧光淬灭剂封片，在荧光显微镜下观察。如图4所示，序列1所示的核酸适配体均对感染SGIV的石斑鱼肝脏组织具有较强的特异性结合能力，而对正常石斑鱼肝脏组织几乎没有结合能力。这与感染SGIV的石斑鱼细胞的荧光显微镜观察结果和流式细胞仪检测结果一致。