一个与黄瓜单性结实主效QTL紧密连锁的分子标记INDELT47.pdf

本发明公开了与单性结实主效QTL Parth2.1连锁的分子标记方法，属于生物技术领域。首先公开了与QTL Parth2.1紧密连锁的分子标记Indel-T-47，同时公开了该标记的引物Indel-T-47F/Indel-T-47R。在含有Parth2.1的分离群体中，该标记与单性结实性显著相关。在含有Parth2.1的全雌自交系材料中，标记引物Indel-T-47F/Indel-T-47R在强单性结实株系中均能扩增出155bp产物，是Parth2.1的峰值标记，与Parth2.1紧密连锁。本发明公开的与Parth2.1紧密连锁分子标记，可用于全雌黄瓜单性结实分子标记辅助育种。

1.  黄瓜单性结实主效QTL Parth2.1的分子标记Indel-T-47，其特征在于：该分子标记的引物序列为：
Indel-T-47F：5’-TCAAACGAAAGGTAAGGAGGAATG-3’
Indel-T-47R：5’-AGGCCTGAAGAGAGCTTCAAAGTA-3’
且Indel-T-47是Parth2.1的峰值标记。

2.  黄瓜单性结实主效QTL Parth2.1的分子标记方法，其特征包括：以待鉴定材料的DNA作为模板，用权利要求1所述的分子标记Indel-T-47的引物对进行PCR扩增；对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析；能扩增出155bp特异条带的植株为含有黄瓜单性结实主效QTL Parth2.1的植株。

3.  根据权利要求2所述的黄瓜单性结实主效QTL Parth2.1的分子标记方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)以待鉴定材料的DNA为模板，用权利要求1所述的分子标记Indel-T-47的引物对进行PCR扩增；PCR扩增反应的总体系为20μl，包括：10×buffer(含Mg²⁺)2.0μL，dNTP 2.0μL，正、反向引物各1μL，Taq酶(5U·μL^-1)0.25μL、DNA(10ng)1.0μL，ddH₂O，12.75μL。反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30S，72℃延伸1min 20s，35个循环；72℃延伸5min，10℃保存。
PCR产物检测：反应产物在7％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用硝酸银染色。
(2)标记引物鉴定Parth2.1：能扩增出155bp特异条带的植株为含有Parth2.1的植株。

4.  权利要求1所述的分子标记在分子标记辅助育种中的应用。

5.  权利要求1所述的分子标记在鉴定全雌黄瓜种质单性结实能力中的应用。

一个与黄瓜单性结实主效QTL紧密连锁的分子标记Indel-T-47
技术领域
本发明公开了黄瓜单性结实主效QTL的分子标记，属于蔬菜分子遗传育种技术领域，可用于黄瓜全雌种质的单性结实能力鉴定及分子标记辅助育种。
背景技术
黄瓜是我国大面积栽培的主要蔬菜之一，具有极高的社会价值和经济效益。单性结实是指子房不经过授粉受精或别的刺激而发育成果实的现象。单性结实能力强的黄瓜品种，具有显著的增产潜力，一般可提高产量20％以上，且单性结实的果实因无籽，瓜瓤少，果肉厚，使得品质得到提高，商品性好。因此，单性结实性是与黄瓜产量和品质密切相关的重要经济性状，是黄瓜品种选育的目标性状之一，在黄瓜育种中极具利用价值。
目前，黄瓜单性结实材料或品种的选育主要依靠田间束花隔离进行表型鉴定，该方法不仅耗时长，需要大量的人力和物力，且单性结实容易受外界条件的影响，表型选择效率不高，选育难度大，育成的黄瓜品种存在单性结实性不稳定，易受栽培环境影响等弊端。近年来，随着分子标记技术的发展，许多研究者利用与目标性状QTL连锁的分子标记对种质进行辅助选择，这一方法不受基因表达和环境因素的影响，可在早代进行选择且操作简单，很大程度上提高了选择的速度和准确性。其中InDel(Insertion/Deletion)分子标记是基于全基因组重测序开发的标记，因其在基因组内分布广、密度大、稳定性和多态率高，检测容易且具有共显性遗传，重复性好、对DNA质量要求较低等优点，可以高效准确地用于遗传图谱构建，利用与目标性状连锁的分子标记进行辅助育种。
基于上述目的，本发明开展了黄瓜单性结实遗传机制和单性结实QTL定位研究。以强单性结实自交系‘EC1’为母本，非单性结实自交系‘8419s-1’为父本，构建了F_2:3群体和F_4:5剩余杂合体群体(RHL，Residual heterozygous line)，利用F_2:3群体对黄瓜单性结实主效QTL位点进行定位，利用F_4:5剩余杂合体群体对该主效QTL进行验证，同时结合双亲重测序结果的分析，开发并筛选与主效QTL位点紧密连锁的InDel标记，以及利用F_3:4群体和7份全雌黄瓜种质材料验证该标记对单性结实的选择效果。该标记可为黄瓜单性结实分子标记辅助选择育种提供新型、高效、实用的分子标记。
发明内容
本发明的目的是提供与黄瓜单性结实主效QTL Parth2.1紧密连锁的分子标记InDel-T-47，并应用这个标记进行黄瓜单性结实种质材料的鉴定。
本发明通过以下技术方案得以实现：
黄瓜自交系‘EC1’中单性结实主效QTL Parth2.1紧密连锁的分子标记InDel-T-47，其上游引物序列为TCAAACGAAAGGTAAGGAGGAATG，下游引物序列为AGGCCTGAAGAGAGCTTCAAAGTA。
本发明还公开了该引物鉴定黄瓜单性结实材料的方法，即用该标记引物对待鉴定材料经行PCR扩增，扩增出155bp特异条带的材料，都具有较强的单性结实能力。
上述引物用于鉴定黄瓜种质材料单性结实能力的具体方法为：
1.以待鉴定材料的DNA作为模板，用InDel-T-47分子标记引物进行PCR扩增；
2.PCR扩增反应体系组成为：10×buffer(含Mg²⁺)2.0μL，dNTP2.0μL，正、反向引物各1μL，Taq酶(5U·μL^-1)0.25μL、DNA(10ng)1.0μL，ddH₂O，12.75μL，反应总体积为20μL。反应程序为94℃预变性5min，每个循环95℃预变性30s，60℃退火30S，72℃延伸1min 20s，35个循环；72℃延伸5min，10℃保存；
3.PCR产物检测：反应产物在7％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用硝酸银染色。电泳结果如果能扩增出155bp特异条带的植株为含有Parth2.1的植株。
有益效果：
1.本发明公开的‘EC1’中与单性结实主效QTL Parth2.1位点紧密连锁的分子标记引物(InDel-T-47F/InDel-T-47R)是根据双亲基因组重测序的结果设计而成，用来鉴定植株是否含有Parth2.1，与已有文献中公布的ALFP等标记相比，方法简单、方便、扩增稳定。
2.标记引物InDel-T-47F/InDel-T-47R扩增的产物是Parth2.1的峰值标记，与已有文献中公开的分子标记相比，本发明的分子标记与Parth2.1的遗传距离更近，利用分子标记辅助选择Parth2.1的准确性更高。
附图说明
图1：利用F_2:3群体进行Parth2.1定位，白色框和斜纹框分别表示2013年春季和秋季的检测结果。
图2：利用F_4:5RHL群体缩短的Parth2.1区段及标记Indel-T-47在2号染色体上的位置
注：网纹框表示缩短的Parth2.1区段，黑色实心圆点表示Parth2.1的峰值位置，LOD值为9.1。
图3：用双亲、强单性结实、非单性结实自交系DNA作为模板，用本发明中的标记引物Indel-T-47F/Indel-T-47R进行PCR扩增，结果显示在EC1(泳道1)和强单性结实自交系(泳道4-8)中扩增出155bp的单条带，而在非单性结实亲本(泳道2)和自交系(泳道9-10)中均未扩增出相应的条带。
注：泳道1，12：Marker；泳道2：.EC1；泳道3：8419s-1；泳道4：F1；泳道5-9：强单性结实自交系；泳道10-11：非单性结实自交系
具体实施方式
在2013年春、秋两季对“EC1×8419s-1”构建的F_2:3群体进行了单性结实表型鉴定。选用1335对SSR引物和173对InDel引物在‘EC1’和‘8419s-1’之间进行多态引物筛选，然后将232对多态引物在16个F₂单株上继续筛选，最终133个SSR引物和9个InDel引物在145个F₂单株中进行PCR扩增，用JoinMap4.0构建连锁图谱，并用Windows QTL Cartographer v2.5软件定位黄瓜单性结实相关QTL。结果显示，位于2号染色体上的主效QTL Parth2.1在两个环境中均可被检测到，可解释的表型变异率分别为17.4％和10.2％。从F_3:4群体中筛选含有Parth2.1的剩余杂合单株并构建F_4:5群体。利用该群体对主效区间进行标记加密，并结合该群体内单株单性结实的表型鉴定，将Parth2.1区段进一步缩短，Indel-T-47是该区段的峰值标 记，与Parth2.1紧密连锁。
1.与Parth2.1紧密连锁分子标记引物设计
在上述分子标记连锁图谱构建和黄瓜单性结实主效QTL Parth2.1发掘的研究中，分子标记Indel-T-47是Parth2.1的峰值标记(图2)。该标记引物是通过双亲全基因组重测序，利用SAMTOOLS软件检测长度小于50bp的小片段插入与缺失位点，并根据该位点上下游200bp的序列，用Premier 5.0软件设计而成。
标记Indel-T-47引物序列为：Indel-T-47F：5’-TCAAACGAAAGGTAAGGAGGAATG-3’，Indel-T-47R：5’-AGGCCTGAAGAGAGCTTCAAAGTA-3’。
2.标记引物Indel-T-47F/Indel-T-47R在F_3:4群体中的分子检测
为了验证该分子标记的准确性，本实验室利用Indel-T-47F/Indel-T-47R引物在F_3:4群体单株中进行PCR扩增检测，结合单株的表型鉴定进行卡方测验，结果显示χ²＝20.14＞χ²_0.01，8＝18.48，表明Indel-T-47标记与单性结实极显著相关。扩增产物含有155bp特异条带的植株单性结实率的平均值极显著高，于不含该条带的植株(表1)。
表1 Indel-T-47F/Indel-T-47R引物不同基因型植株单性结实率的显著性分析

注：a，b，c表示P＜0.05，A，B，C表示P＜0.01，单性结实率进行了反正弦转换
PCR扩增反应体系组成为：10×buffer(含Mg²⁺)2.0μL，dNTP 2.0μL，正、反向引物各1μL，Taq酶(5U·μL^-1)0.25μL、DNA(10ng)1.0μL，ddH₂O，12.75μL，反应总体积为20μL。反应程序为94℃预变性5min，每个循环95℃预变性30s，60℃退火30S，72℃延伸1min 20s，35个循环；72℃延伸5min，10℃保存。PCR产物检测：反应产物在7％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用硝酸银染色。
3.标记引物Indel-T-47F/Indel-T-47R在黄瓜全雌种质材料中的分子检测
利用标记引物Indel-T-47F/Indel-T-47R在双亲、5份强单性结实和2份非单性结实全雌种质材料(表2)中进行PCR扩增检测(条件和方法同上)。结果表明：在‘EC1’亲本和强单性结实种质材料中都能扩增出155bp的单条带，而在‘8419s-1’亲本和非单性结实材料中均未扩增出该条带(图3)。
表2 7份不同单性结实能力的全雌黄瓜材料