一株高表达NEURITIN截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株及其应用.pdf

本发明公开了一株高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株及其应用，所述重组菌株为巴斯德毕赤酵母，其保藏编号为CGMCC NO：9912。本发明提供了一株毕赤酵母重组菌株表达的Neuritin截短体蛋白与目前市场上所售的大肠杆菌表达的Neuritin截短体蛋白相比，真核细胞表达的外源蛋白具有翻译后修饰的生物活性，且外源基因稳定整合于酵母染色体内，能稳定传代且易于规模化培养等优点。适当浓度的Neuritin能够促进损伤后早期坐骨神经的再生和功能恢复，为外周神经损伤的治疗提供了一个新的方法，具有良好的应用前景。

1.  一株高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为 巴斯德毕赤酵母GS115-pPIC9K-neuritin-1-20110415，其保藏编号为CGMCC NO：9912。

2.  根据权利要求1所述的高表达的Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株，其特征在 于，所述Neuritin截短体蛋白为缺少信号肽和GPI锚定位点的可溶性蛋白。

3.  权利要求1或2所述的高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株的应用。

4.  根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为所述重组菌株表达的Neuritin 截短体蛋白在促进坐骨神经损伤后再生修复药物制备中的应用。

一株高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，更具体地，本发明涉及一株能稳定高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株及其应用。
背景技术
各种神经损伤和神经系统退行性病变(如老年痴呆、帕金森病等)一直是困扰人类的一大疾患，且这类疾患呈现出高发生率、高致残率、高耗费、低死亡率等特点，给社会和家庭带来了沉重的负担。治疗各类神经系统疾病和神经损伤的关键是提高受损神经的修复能力，众多的实验表明，各类神经营养因子可以为神经再生提供良好的微环境，在防止神经细胞的退变和促进神经突起的生长方面均起着十分重要的作用。
Neuritin(CPG15，NRN1)是近年发现的神经营养因子，在神经突触可塑性、保护受损神经元和促进神经再生过程中有重要的作用。因此，获取高纯度且具有天然活性的Neuritin蛋白对治疗各种神经退行性疾病如老年痴呆症、阿尔茨海默病等有着良好的应用前景。利用基因工程技术制备大量Neuritin重组蛋白，是生物学功能研究和临床需要的基础。
当代医学对神经系统疾病和神经损伤还缺少有效的治疗和/或预防的药物。
发明内容
有鉴于此，为了克服上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一株能稳定高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株及其应用。
为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一株高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株——巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-pPIC9K-neuritin-1-20110415，所述巴斯德毕赤酵母GS115-pPIC9K-neuritin-1-20110415，其保藏编号为CGMCC NO：9912。
本发明的高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株命名为巴斯德毕赤酵母GS115-pPIC9K-neuritin-1-20110415，其于2014年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO：9912。
在其中一些实施例中，所述Neuritin截短体蛋白为缺少信号肽和GPI锚定位点的可溶性蛋白。
本发明还提供了上述高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株的应用。
在其中一些实施例中，所述应用为所述重组菌株表达的Neuritin截短体蛋白在促进坐骨神经损伤后再生修复的药物制备中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一株能稳定高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株，并对其表达的蛋白制定了活性单位。与目前市场上所售的大肠杆菌表达的Neuritin截短体蛋白相比，真核细胞表达的外源蛋白具有翻译后修饰的生物活性，且外源基因稳定整合于酵母染色体内，能稳定传代且易于规模化培养等优点。通过动物实验发现：Neuritin能够促进损伤后早期坐骨神经的再生和功能恢复，为外周神经损伤的治疗提供了一个新的方法，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1中的SDS-PAGE筛选高表达菌株表达Neuritin蛋白的图谱；
图2为本发明实施例2中的SDS-PAGE分析纯化的融合蛋白的图谱；
图3为本发明实施例3中western-blot鉴定Neuritin与His标签结果；
图4为本发明实施例3中Neuritin截短体蛋白对PC12细胞的作用，其中A为阴性对照(PBS)；B为阴性对照组(6×His，20μg/ml)；C为实验组(Neuritin，20μg/ml)；
图5为本发明实施例3中Neuritin截短体蛋白对鸡胚背根神经节细胞的作用；其中A为空白对照组(10×)，B为阴性对照组(6×His，20μg/ml,10×),C为阴性对照组(BSA，20μg/ml,10×)，D为实验组(Neuritin，24μg/ml，10×)；
图6为实施例4的不同时间段各组实验大鼠SFI恢复趋势图；
图7为实施例4的不同时间段各组实验大鼠NCV恢复率比较结果图；
图8为实施例4的不同时间段各组实验大鼠肌张力的结果图；
图9为实施例4在第4周各实验组的神经HE染色的结果图(200×)，其中：A为生理盐水组，B为Neuritin 5μg组；
图10为实施例4在第4周不同实验组的神经髓鞘染色的结果图(400×)；其中：A为生理盐水组，B为Neuritin 5μg组；
图11为实施例4的不同时间各实验组有髓神经纤维通过率比较的结果图；
图12为实施例4在第4周神经纤维镀银染色的结果图(200×)；其中：A为生理盐水组，B为Neuritin 5μg组；
图13为实施例4在第4周的免疫组化检测GAP43的结果图；其中：A为生理盐水组，B为Neuritin 5μg组；
图14为实施例4在第4周的免疫组化检测NF200的结果图；其中：A为生理盐水组，B为Neuritin 5μg组。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例中所使用的试剂均来源于市售。
如无特殊说明，以下实施例中的实验方法，均为常规方法。
实施例1 高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株的筛选
本实施例中的高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株的筛选步骤如下：
1、构建重组毕赤酵母
按照中国发明专利CN200810227347-“Neuritin截短体蛋白活性片段及其表达系统和专用载体”中实施例1的方法，以neuritin截短体为模板，扩增neuritin截短体片段，PCR产物用EcoRⅠ、NotⅠ限制性内切酶酶切、纯化后进行酶切产物的连接，转染DH5α感受态细胞，挑取PCR鉴定为阳性的阳性转化子与毕赤酵母GS115感受态细胞电转化，将菌液涂布在MD板上，30℃培养至菌落出现，即为重组毕赤酵母；
2、筛选高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株
将MD板上的单菌落分别接种至200μl YPD培养液的96孔板，30℃培养2d。然后取新的96孔板，每孔加入190μl YPD，吸取10μl第一批96孔板中培养的菌液加入到新板中，各孔一一对应，30℃培养过夜。再取新的96孔板，每孔仍加入190μl YPD，吸取10ul第二批96孔板中培养的菌液加入到新板中，各孔一一对应，30℃培养过夜。从第三批96孔板中各吸取10μl菌液加到含有0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0mg/ml G418的YPD板上，并编号。30℃培养2-5d， 至菌落出现。挑取筛选后的单菌落于10μl无菌水中，煮沸10min，将菌液置-80℃冰箱10min，再煮沸10min，离心后取上清液作为模板作PCR检测，体系如下：

PCR循环参数:94℃预变性4min，然后94℃变性60s、63℃退火30s、72℃延伸60s，进行30个循环，最后72℃延伸5min。待反应完毕，1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。挑选PCR鉴定为阳性的转化子送往上海基康公司测序，挑取测序结果正确的菌落诱导，通过SDS-PAGE进行高表达筛选，具体实施步骤如下：
(1)、单克隆菌落接种至5mlYPD培养基中，30℃摇菌24h。
(2)、取100μl至20ml BMGY培养基中，30℃培养至OD600值2-6。
(3)、将OD600值达2-6的BMGY培养基离心，6000rpm离心5min，弃上清，沉淀加入BMMY培养基中重悬。
(4)、30℃诱导培养，每隔24h补加甲醇，使其终浓度为1％。
(5)、诱导培养至72h时，BMMY培养基离心，14000rpm离心30min，收集上清。 
(6)、将硫酸铵固体分批加入上清蛋白液，使充分溶解，4℃过夜盐析。
(7)、将盐析后的蛋白液离心，14000rpm离心30min，弃上清，收集沉淀。
(8)、蛋白沉淀用2ml PBS重悬，取100μl重悬后的蛋白加4x loading buffer混匀，100℃，8min。
(9)、15％聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳液为1×Tris-Gly，浓缩胶：起始电压为80V，20min；分离胶：110V，60min。未诱导菌液作为阴性对照。
(10)、电泳结束后，凝胶用考马斯亮蓝R-250染色6h以上。
(11)、凝胶置于脱色液中脱色2～3h，期间换液2-3次，使之完全脱色至条带清晰可见，比较各目的条带的颜色与宽度判断蛋白的表达量。SDS-PAGE的图谱如图1所示。
图1结果可见，第6泳道表达量最高，筛选出1株表达Neuritin截短体蛋白最高的单克隆菌株，命名为巴斯德毕赤酵母GS115-pPIC9K-neuritin-1-20110415，其于2014年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：9912，巴斯德毕赤酵母GS115-pPIC9K-neuritin-1-20110415的其中一段序列如SEQ ID No：1所示，其中中间划线部分为neuritin序列，上下游为酵母的序列。
GCCGATACGACTTTTACGACACTTGAGAAGATCAAAAAACAACTAATTATTCGAAGGATCCAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACGTAGAATTCCATCATCATCATCATCATGCGGGCAAGTGCGATGCGGTCTTCAAGGGCTTTTCGGACTGTTTGCTCAAGCTGGGCGACAGCATGGCCAACTACCCGCAGGGCCTGGACGACAAGACGAACATCAAGACCGTGTGCACATACTGGGAGGATTTCCACAGCTGCACGGTCACAGCCCTTACGGATTGCCAGGAAGGGGCGAAAGATATGTGGGATAAACTGAGAAAAGAATCCAAAAACCTCAACATCCAAGGCAGCTTATTCGAACTCTGCGGCAGCGGCTGAGCGGCCGCGAATTAATTCGCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCAC(SEQ ID No：1)。
实施例2 实施例1筛选得到毕赤酵母重组菌株高表达Neuritin截短体蛋白的纯化
具体实施步骤如下：
(1)利用实施例1所筛选出的高表达菌株进行大量诱导表达蛋白；
(2)运行AKTA纯化系统后，先用8mol/L尿素清洗亲和层析柱，1ml/min，30min；
(3)0.22um过滤后的ddH₂O冲洗亲和层析柱，1ml/min，20min；
(4)0.1mol/L NiSO₄，1ml/min，10min；
(5)ddH₂O，1ml/min，10min；
(6)1×start buffer平衡层析柱，1ml/min，10min；
(7)收集的蛋白液体，0.7ml/min；
(8)1×start buffer(20mM磷酸钠，0.5M NaCl，10mM咪唑，pH7.4)再次平衡层析柱，1ml/min，直至蛋白吸收检测线平衡；
(9)线性梯度洗脱，start buffer和elution buffer(20mM磷酸钠，0.5M NaCl，250mM咪唑，pH7.4)分别以0-100％的比例进柱，即咪唑浓度逐渐增加，并收集洗脱蛋白液；
(10)洗脱完后，50mM EDTA清洗柱子，1ml/min，10min；
(11)ddH₂O，1ml/min，10min；
(12)超滤除盐:层析所得蛋白移入超滤管3K中，4℃，4000g离心30min，然后用磷酸盐缓冲液洗5次，每次30min，取出截留液，稀释至一定体积，用Bradford法测定蛋白浓度，分装后置于-80℃冰箱；
(13)SDS-PAGE鉴定纯化后蛋白的纯度，Bandscan扫描SDS-PAGE，测定目的蛋白的百分比。
结果：SDS-PAGE检测所收集的蛋白(图2)，分子量大约11KD，与理论值相符，纯度95﹪以上。
实施例3 实施例2纯化的Neuritin截短体蛋白的鉴定
1、Western blot鉴定表达的蛋白，具体实施步骤如下：
(1)电泳：浓缩胶80v，30min；分离胶：110v，1h。
(2)转膜：用半干转膜仪将蛋白从胶转至PVDF膜上，由下向上依次放置：滤纸、膜、胶、滤纸，并用试管赶出各层间的气泡，设置电压与时间：21V，42min。
(3)封闭：将膜放置于5％脱脂奶粉(TBST溶解)中，摇床上室温封闭2h。
(4)孵育一抗：6×His单抗1：2000稀释于5％脱脂奶粉-TBST溶液，摇床上4℃过夜。
(5)洗涤：将膜正面向上，加入TBST液，振荡洗涤5min 1次，15min 3次。
(6)孵育二抗：HRP标记的抗鼠IgG的二抗1：15000稀释于5％脱脂奶粉(TBST溶解)中，摇床上室温孵育2h。
(7)洗涤：将膜正面向上，加入TBST液，振荡洗涤5min 1次，10min 3次。
(8)显色：将ECL试剂A和B各1.5ml在干净的培养皿中混合；将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触孵育5min，将膜去尽残液，移至发光板上，用保鲜膜包好无气泡。
(9)曝光：暗室中，曝光30秒，根据条带的深浅缩短或延长曝光时间，以达最佳曝光 效果；曝光完成后，迅速将胶片显影、定影，见图3。
2、Neuritin截短体蛋白的一级结构鉴定与分析
将纯化后的Neuritin冻干粉交中国科学院上海生命科学研究院蛋白质组学研究分析中心(上海中科新生命生物科技有限公司)，由该分析中心分别采用生物质谱技术完成Neuritin酵母表达产物的分子量鉴定。
由北京博扬生命科技有限发展公司采用生物质谱技术(质谱系统为Thermo Fisher公司LTQ Obitrap XL)完成Neuritin酵母表达产物氨基酸全序列的鉴定。
3、Neuritin截短体蛋白活性鉴定，具体实施步骤如下：
3.1Neuritin截短体蛋白对PC12细胞的影响 
基础培养基为1.5％胎牛血清1640，每孔总液体量为125μl
(1)取对数生长期PC12细胞，0.25％胰酶+0.02％EDTA混合消化细胞。
(2)用含15％马血清，2.5％胎牛血清的F-12K培养基终止消化并在倒置显微镜下计数。
(3)按每孔悬液100μl，细胞密度为6×10³个/ml接种至96孔板中。
(4)实验设为3组：阴性对照组和实验组。其中阴性对照组又分为空白对照组和6×His蛋白对照组。每组设5个孔。
(5)空白对照组加入25μl PBS，6×HIS对照组中6×His蛋白浓度为20μg/ml。
(6)实验组加入Neuritin，终浓度设为20μg/ml。
(7)培养48h后，按上述步骤给细胞换液，在第3d观察结果，见图4。
3.2Neuritin截短体蛋白对鸡胚背根神经节的影响：
基础培养基为1.5％胎牛血清RPMI 1640，每孔总液体量为200μl
(1)分别取40μl的多聚赖氨酸于96孔板，涂布均匀，37℃，5％CO₂培养箱中包被4小时后，用PBS冲洗3遍，置于超净台内晾干。
(2)取孵化8天的受精鸡蛋，以酒精棉灭菌，击破大头，除去皮、去膜层；以弯嘴钳夹取鸡胚，并将之置于解剖镜台面上，去除头部、内脏，展开四肢，使脊柱露出。
(3)在解剖显微镜下挑取神经节，每孔中保证有2-3个完整的神经节。
(4)实验设为3组：阴性对照组实验组；其中阴性对照组又分为空白对照组、6×His蛋白对照组和牛血清白蛋白(BSA)对照组。
(5)空白对照组不加Neuritin截短体蛋白，BSA对照组加入BSA，终浓度20μg/ml；6×His 蛋白对照组中6×His蛋白的浓度为20μg/ml。
(6)实验组Neuritin截短体蛋白浓度设为8、16、24μg/ml。
(7)将DRG置于37℃培养箱中培养2-4d，观察并比较3组中神经节的神经纤维生长情况。
(8)继续培养，通过观察DRG的开始裂解时间来判断Neuritin对DRG存活时间的影响，见图5。
结果：经Western blot，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对分子量和氨基酸序列鉴定，确定纯化的蛋白为Neuritin截短体蛋白，经活性鉴定，表明纯化后蛋白具有较高的活性。
实施例4 实施例1的毕赤酵母重组菌株高表达Neuritin截短体蛋白对大鼠神经损伤修复的功能
1.建立大鼠坐骨神经损伤模型
1.1分组
Wister大鼠110只，体重200～220g，雌雄各半。随机分为5组：生理盐水组、假手术组、Neuritin处理组(包括两个浓度：3μg和5μg)。每组20只，余10只备用。
1.2模型建立
(1)大鼠用戊巴比妥钠(0.5％戊巴比妥钠40mg/Kg)腹腔注射麻醉，俯位固定，备皮消毒、铺无菌巾单。
(2)手术方式：取左大腿后外侧纵切口，长约3cm，切开皮肤，经肌间钝性分离，在股二头肌与半健肌、半膜肌间仔细分离并充分显露左侧坐骨神经。假手术组到此为止，逐层缝合皮肤。
(3)其余各组继续操作：在坐骨结节下方8mm，用无齿蚊式钳钳夹坐骨神经30s(钳夹至第一扣)，造成重度钳夹损伤模型。钳夹后见损伤处长约5mm，神经组织变成菲薄，损伤处神经外膜用9-0显微缝线标记，将神经复位，依次缝合筋膜、皮肤。
2.给药剂量和方法
假手术组不给予任何治疗，其余各组分别于神经损伤处，放入浸有Neuritin 1.5μg/100g和Neuritin 2.5μg/100g的明胶海绵(0.5×0.5×0.5cm)；NS组放入浸有生理盐水的同样大小明胶海绵，常规缝合伤口。术后第一天开始，于损伤处Neuritin组分别局部注射Neuritin 1.5μg/100g(溶于1ml生理盐水)和Neuritin 2.5μg/100g(溶于1ml生理盐水)，每日肌注一次，连续一周；2～4 周隔日肌注一次，5～6周每隔2日肌注一次。NS组同法给予等量生理盐水(1ml)。分别于术后2、4、6、8周测试相应指标及进行组织取材。
3.动物的饲养 
所有实验大鼠采用笼养管理，全价营养颗粒饲料喂养(石河子大学实验动物中心提供)，自由饮水，饲养管理条件一致，并由同一动物饲养员负责日常管理。
4.一般情况观察和步态恢复
(1)术后每日观察大鼠伤口愈合、步态、足部皮肤的变化、肌肉萎缩的情况以及整体状态。手术取材时观察神经损伤处肿胀、粘连及神经外膜情况。
(2)展爪反射：表现为大鼠被抓握时后足各趾充分外展，坐骨神经损伤后趾下垂，并拢不展开为展爪反射消失:能展开为展爪反射恢复；能展开且与健侧相同则为正常。
5.坐骨神经功能指数(SFI)测试
于术后2周，4周，6周，8周行足迹实验。自制大鼠足印行走箱，宽9cm、长60cm，一侧开门，将白纸放在箱底。大鼠双侧后足蘸墨汁后即放入通道的一端，待其自行走向另一端，每条宣纸上每侧足留下3-4个足印，选实验侧(E)及正常侧足(N)清晰的足印测量3个变量，精确到0.1mm，重复3次算出每只鼠各变量的平均值。
①PL(足印长度):即足跟到足尖的最长距离。
②TS(足趾宽度):第1-5趾连线的最长距离。
③T1(中间足趾距离):第2-4趾连线的最长距离。
将3个变量带入Bain公式计算出SFI。
SFI＝-38.3(EPL-NPL)/NPL+109.5(ETS-NTS)/NTS+13.3(EIT-NIT)/NIT-8.8
以0为SFI的正常值，-100为神经完全断离指标，计算出SFI的恢复率(实验侧/自身健侧*100％)，进行统计学处理。
结果：大鼠健侧足趾充分张开，足印完整；伤侧足趾拘挛屈曲，不能充分张开，跛行，足趾直接距离缩小或缺如，足印不完整。假手术组和模型组的SFI恢复率之间的显著性差异，表明大鼠坐骨神经模型建立成功，从SFI恢复率上，Neuritin组SFI恢复率早于生理盐水组，第4周开始，给予Neuritin的模型组，其SFI恢复率明显高于给予生理盐水的模型组，且呈现一定的剂量效应关系且2-4周Neuritin 5μg的恢复率高于Neuritin 3μg。(图6)说明坐骨神经损伤后，早期局部及时给予Neuritin并辅以持续的肌肉注射，可以明显促进坐骨神经的功能恢复。
6.神经电生理测试
室温25℃条件下，采用BL-420E多功能生物信号记录系统进行进行电生理检查。检测时，首先在麻醉下钝性分离出双侧大鼠坐骨神经，用金属夹夹住切口边缘组织以接地。将刺激电极和记录电极分别钩在神经夹伤处近侧端和远侧端，调节好电极的位置，保持电极与神经干良好的接触，刺激近侧端，找出引起动作电位的阈值及最大刺激强度，再用最大刺激强度刺激数次，读出神经干动作电位潜伏期，测量两刺激电极间的距离以算出两侧坐骨神经干动作电位传导速度。神经干传导速度(nerve conductive velocity，NCV)计算公式：神经冲动传导速度＝冲动传导距离/冲动传导所需时间。将实验侧与自身健侧比较得出神经干冲动传导恢复率(％),数据进行统计学处理。
结果：当神经干损伤后，神经冲动的传导速度会减慢，测定实验侧神经传导速度并与健侧相比较，在一定程度上可以反映神经再生的情况。Neuritin组的神经传导速度在第4周时开始恢复，比生理盐水组提前2周，至第8周时仍保持较高水平，见图7。
7.肌张力测定 
将两侧腓肠肌在跟键止点处切断并稍作游离后，通过1-0丝线将其断端连于张力换能器，与系统相连。使其前负荷稳定在50g，随即用最大刺激强度，50Hz，波宽2ms的连续方波刺激坐骨神经3s，记录两侧腓肠肌最大强直收缩张力。以自身健侧为对比，计算其恢复率(实验侧数值/健侧数值×100％)，数据进行统计学处理。
结果：Neuritin组从第6周起肌张力恢复率显著高于生理盐水组，一直持续到第8周。电生理实验结果再一次提示在坐骨神经损伤早期给予Neuritin有助于神经功能尽快恢复，见图8。
8.肌肉、神经切片的HE染色
(1)切片60℃烘烤30min,使腊熔化。 
(2)脱蜡：二甲苯Ⅰ液中浸泡5min，二甲苯Ⅱ液中浸泡5min，二甲苯Ⅲ液中浸泡5min。
(3)脱水透明：依次无水乙醇、90％乙醇、80％乙醇和70％乙醇各浸泡5min。
(4)清水冲洗2遍，苏木素染液染5min。
(5)清水冲洗2～3遍，1％盐酸酒精快速分化5～10s。
(6)蓝化：清水冲洗2～3遍，浸泡5min，可在镜下观察染色效果。
(7)伊红染色3min，清水冲洗2～3遍。
(8)脱水：依次70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、无水乙醇各浸泡5min。
(9)透明：二甲苯Ⅰ液中浸泡5min，二甲苯Ⅱ液中浸泡5min。
(10)封片：盖破片滴加中性树胶封片。
结果：Schwann cell的增殖可以为轴突和神经再生提供良好的再生微环境，损伤后第2周Neuritin组即出现明显的Schwann cell增殖，而生理盐水组在第6周时才出现大量Schwann cell，见图9。
9.神经切片的镀银染色
(1)切片常规脱腊至水。
(2)切片放入20％硝酸银中60℃染色15min。
(3)切片ddH₂O冲洗2～3遍后，放入氨银工作液染5～15min不等，镜下观察神经染成黄色为止。氨银工作液在使用之前滴加10滴1％甲醛溶液。
(4)流水冲洗2～3遍，1％硫代硫酸钠透明2min。
(5)流水冲洗后常规脱水、透明、封片。
结果：损伤后第4周Neuritin组即出现纤细的新生神经纤维，至第6周时纤维增粗，密度增加，排列紧致，而生理盐水组至第8周才出现上述变化，表明Neuritin组在纤维粗细及数量上均明显高于生理盐水组，且新生纤维出现时间也较生理盐水组早，见图12。
10.双侧坐骨神经标本石蜡切片的髓鞘染色(砂罗铬花青法)
(1)切片常规脱腊至水。
(2)A液(砂锣铬花青染液)染色15～20min,流水冲洗1～2min。
(3)B液(10％硫酸铁铵水溶液)分化1～5min,至胶原纤维和肌纤维接近无色或淡灰色，髓鞘呈清晰的蓝色为止，每次取出水洗后在镜下观察控制。
(4)流水冲洗5～10min，加C液(荧光桃红染液)复染数s，稍后水洗。
(5)常规脱水、透明、封片。
结果：相对于生理盐水组，损伤后两周Neuritin组髓鞘变性较轻，第4周即出现不同程度的髓鞘再生，且新生的髓鞘密度、厚度均高于生理盐水组，其中Neuritin 5μg组作用较Neuritin3μg明显，见图10。
11.有髓神经纤维通过率(Pass ratio,PR)
在放大400倍下，利用ImagePlus图象分析软件，计数损伤远端3mm处及健侧相应部位神经有髓神经纤维数。按下列公式计算：
有髓神经纤维的密度＝有髓神经纤维的数量/单位面积。 
单位区域面积的选择以神经纤维分布为主，避开以结缔组织、脂肪组织、血管为主的区域。随机选取5个高倍视野计数取平均值。将实验侧与健侧相比，得出有髓神经纤维通过率(％)。数据进行统计学分析。
结果：损伤后Neuritin组的有髓神经纤维恢复率在2、4、6周均高于生理盐水组，且Neuritin5μg高于Neuritin 3μg，见图11。
12.免疫组化染色 
Ⅰ抗为鼠抗单克隆抗体，Ⅱ抗为羊抗IgG。按免疫组织化学SP法操作。DAB显色，显微镜观察。每个标本随机选择2张切片,每张切片随机选择4个视野,用Image-Pro Plus分析软件进行图像分析，测定阳性产物的累加积分光密度值(IOD SUM)和面积(AREA SUM)，计算平均密度值(Mean density,IOD/AREA)，IOD/AREA比值越大表示阳性产物表达越强。具体步骤如下：
(1)切片常规脱腊至水。步骤同8(1)～(3)。
(2)清水冲洗3遍。
(3)切片放入0.3％H₂O₂甲醛，室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶活性。
(4)抗原修复：切片放入0.01M枸橼酸溶液中，微波加热煮沸10min。
(5)切片冷却20-30min，PBS冲洗3遍。
(6)A液(山羊血清)封闭，室温20min。
(7)甩去多余液体，滴加I抗(NF200和GAP43)，4℃冰箱过夜。
(8)第二天，将切片放入37℃烤箱中复温45min。
(9)PBS冲洗3遍，小心擦去切片周围的PBS，滴加B液(Ⅱ抗：羊抗鼠IgG)50μL,放入37℃烤箱中20min。
(10)PBS冲洗3遍，滴加C液(辣根酶标记链霉卵白素)50μL，放入37℃烤箱中20min。
(11)PBS冲洗3遍，甩去多余液体。
(12)滴加DAB显色液，显微镜下观察，显色后，立即用清水冲洗。
(13)苏木素复染2min。
(14)清水冲洗2～3遍，1％盐酸酒精快速分化5～10s
(15)清水冲洗2～3遍，浸泡5min。
(16)脱水：依次70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、无水乙醇各浸泡5min。
(17)透明：二甲苯Ⅰ液中浸泡5min，二甲苯Ⅱ液中浸泡5min。
(18)封片：盖破片滴加中性树胶封片。
结果：Neuritin增加了突起再生的标志物GAP43(图13)和NF200(图14)的表达。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。