一种逆流超声处理谷朊蛋白酶解的方法.pdf

本发明一种逆流超声处理谷朊蛋白酶解的方法，涉及生物工程领域。更具体地，涉及一种超声促进谷朊蛋白酶解制备活性肽的方法。此方法中采用在酶解过程中施加超声辅助处理，避免了超声预处理时产生的谷朊蛋白粉聚集和吸附问题，简化了生产工艺，降低了成本，同时通过超声有效地促进谷朊蛋白的酶解，提高的多肽产物的活性。

1.  一种适用于谷朊蛋白酶解的方法，其特征在于，在谷朊蛋白酶解反应过程中施加超声辅助处理。

2.  根据权利要求1所述的谷朊蛋白酶解的方法，其特征在于按照下述步骤进行：
取谷朊蛋白粉，加水混匀，配成5~12%（W/W）的料液，调节pH为8.0~8.5，温度为50~55℃，加入1~2%（E/S）的碱性蛋白酶，通过加入NaOH维持pH恒定，在酶解过程中施加超声，超声功率为400~800W，反应液以逆流循环的方式通过超声探头，酶解反应120~150 min后，煮沸灭酶15 min，离心分离(8000 r/min、15 min) 取上清液测定活性。

3.  根据权利要求2所述的谷朊蛋白酶解的方法，其特征在于调节pH为8.0~8.5，温度为50~55℃。

4.  根据权利要求2所述的谷朊蛋白酶解的方法，其特征在于加入1~2%（E/S）的碱性蛋白酶，通过加入NaOH维持pH恒定。

5.  根据权利要求2所述的谷朊蛋白酶解的方法，其特征在于在酶解过程中施加超声，超声功率为400~800W，反应液以逆流循环的方式通过超声探头。

6.  根据权利要求2所述的谷朊蛋白酶解的方法，其特征在于酶解反应120~150 min后，煮沸灭酶15 min，离心分离(8000 r/min、15 min) 取上清液测定活性。

一种逆流超声处理谷朊蛋白酶解的方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，更具体地，涉及一种超声促进谷朊蛋白酶解制备活性肽的方法。
背景技术
由于安全性高、毒副作用小，食品蛋白活性肽成为近年来的研究热点之一。已报道有以牛奶、乳酪、大豆、鱼肉、蔬菜、小麦及大米蛋白等为原料，经蛋白酶酶解或者微生物发酵制备各种功能的生物活性肽。
我国是盛产小麦的大国，谷朊蛋白粉是小麦淀粉生产的副产物，含蛋白质70%以上，是价廉物美的植物性蛋白资源，目前主要用做动物饲料，综合利用率较低。谷朊蛋白粉中主要成分是醇溶蛋白（Zein），约占总蛋白的50%左右，醇溶蛋白含有大量的非极性氨基酸，不溶于水，此外还缺乏色氨酸和赖氨酸，营养价值低，很难被生物体吸收。
正因为谷朊蛋白富含大量的非极性氨基酸，用于酶解制备高活性的降血压肽是非常有利的。目前活性肽的生产主要是采用蛋白酶水解的方法。但是，常规酶解存在水解效率低、水解速度慢、水解度低、酶利用率低和生产成本较高等缺点。
超声波是一种纵波，在介质中传播时，会产生热效应、机械效应和空化效应，引起介质的一些特性变化。因为上述特性，超声波技术对有效成分的提取、高分子的降解、酶解反应等都有较好的促进作用。其中超声波酶促反应具有高效、廉价、无污染、操作简单、技术易推广应用等特点，通过强化传质传热等可提高酶促反应速度和有效成分的产率。国内外大量研究表明超声波辅助处理蛋白酶解，可以改变蛋白质的构像，加快反应速率，提高产物的活性。Atequad等研究发现，超声空化对木瓜蛋白酶构象、紫外光谱以及催化活性都有不同程度的影响（Atequad N, Iqbal J. Effect of ultrasound on papain[J]. Indian J. Biochem. Biophys，1985, 22(3): 190-192. ）。丁青芝等研究表明超声预处理原料的方式效果最为明显，可以有效地促进菜籽饼粕蛋白的酶解，提高产物的ACE抑制活性（丁青芝, 马海乐, 骆琳等. 超声处理对菜籽蛋白酶解效果的影响[J]. 农业工程学报, 2009, 25(1): 294-299. ）。Rose等研究表明利用超声辅助预处理谷朊蛋白对提高酶解效率，加快反应速度等是非常有价值的（Rosemond Godbless Dadzie, 小麦谷朊蛋白ACE抑制肽超声辅助酶解制备技术研究[D], 江苏大学，2013）。
但是在生产应用中发现，与其他的蛋白不同，谷朊蛋白粉与水的混合物在经过超声预处理之后，会絮凝成团，团状物粘性比较高，会吸附在容器表面，不容易转移取出，这大大增加了生产难度，使之应用受到了一定的限制。
发明内容
本发明的目的是为了克服已有技术存在的问题，提供一种工艺简单的超声促进谷朊蛋白酶解制备活性肽方法。
为了实现上述发明目的，其具体的技术方案如下：
取谷朊蛋白粉，加水混匀，配成5~12%（W/W）的料液，调节pH为8.0~8.5，温度50~55℃，加入1~2%（E/S）的碱性蛋白酶，通过加入NaOH维持pH恒定，在酶解过程中施加超声，超声功率为400~800W，反应液以逆流循环的方式通过超声探头，酶解反应120~150 min后，煮沸灭酶15 min，离心分离（8000 r/min、15 min）取上清液，测定活性。
本发明的优点：采用在酶解过程中施加超声辅助处理，避免了超声预处理时产生的谷朊蛋白粉聚集和吸附问题，简化了生产工艺，降低了成本，同时通过超声有效地促进谷朊蛋白的酶解，提高了多肽产物的活性（增幅为15.9~30.7%）。下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为逆流超声处理设备结构示意图，1为聚能式超声波探头，2为超声波控制器，3为超声杯型腔，4为进料口，5为循环泵，6为盛液器，7为出料口。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是，对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。
图1为本发明的逆流超声处理设备，该设备配有超声波控制器2，控制超声参数，聚能式超声波探头1对进料口4进入超声杯型腔3的物料进行处理，超声的同时启动循环泵5对料液进行循环，6为盛液器，7为出料口。
实施例中降血压肽的活性测定方法
FAPGG（1.0 mmol/L）：取FAPGG 3.994 mg加基质缓冲液，定容至10 mL，溶解混合，置4℃避光放置。
基质缓冲液：HEPES 1.910 g，NaCl 1.755 g，用双蒸馏水溶解后，用NaOH调到pH8.3，再补充水到100 mL，置4℃备用。
采用N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸（FAPGG）作为血管紧张素转移酶（ACE）的底物，用酶标仪测定样品的ACE抑制活性。测定波长为340 nm。对照孔加入ACE（0.1U/mL）10μL，FAPGG（1.0mmol/L）50μL，缓冲液40μL，样品孔加入ACE（0.1U/mL）10μL，FAPGG（1.0mmol/L）50μL，样品液40μL，在37℃的环境中反应30 min。设空白孔的初始吸光度为a1，样品孔的初始吸光度为b2，在37℃的环境中反应30 min后再次测定在340 nm的吸光度，反应后空白孔的吸光度为a2，样品孔的吸光度为b2，空白的吸光度减少值A=a1-a2，样品的吸光度减少B=b1-b2，抑制率I=(A-B)/A。
对照例1~5：
1、安装逆流超声设备如图1（主要由聚能式超声探头1、杯型超声腔3、循环泵5、盛液器6和恒温器等组成），将超声探头置于杯型超声腔中，超声腔进出口通过两条管道与盛液器连接，物料的定向循环流动由安装在进出口管道上的循环泵完成，盛液器的温度由恒温器控制。
2、在物料杯中加入一定量的谷朊蛋白和1.5%（E/S）碱性蛋白酶，恒温，反应期间用0.5 M NaOH调节pH稳定。酶解反应120 min后，煮沸灭酶15 min，离心分离（8000 r/min、15 min）取上清液，配置成蛋白含量为1.0 g/L溶液，测定活性。
实施例1~5：
1、  逆流超声设备的安装同对照例。
2、  在物料杯中加入一定量的谷朊蛋白和1.5%（E/S）碱性蛋白酶，恒温，打开超声设
备，在酶解过程中施加超声处理，反应期间用0.5 M NaOH调节pH稳定。酶解反应120 min后，煮沸灭酶15 min，离心分离(8000 r/min、15 min) 取上清液，配置成蛋白含量为1.0 g/L溶液，测定活性。
对照例1~5和实施例1~5的谷朊蛋白酶解参数及结果如下所示：