一种噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物及其作为Bcl-2家族蛋白拮抗剂的应用 【技术领域】
本发明涉及一种噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物及其作为Bcl-2家族蛋白拮抗剂的应用，特别是2-(芳基亚甲基)-5-芳基-7-甲基-3-氧代-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物与作为Bcl-2家族蛋白拮抗剂的应用。该类化合物能够抑制Bcl-2家族蛋白成员Bcl-xL与天然底物多肽(Bid BH3多肽)的结合，可作为Bcl-2家族蛋白的小分子抑制剂用于抑制其抗凋亡活性，并有望开发成为一类新型的抗肿瘤药物。
背景技术
细胞凋亡(某些情况下又可称为细胞程序性死亡)是一种去除衰老细胞或异常细胞的正常死亡机制，该机制的紊乱与多种疾病的发生有直接的关系。自上世纪90年代以来，人们逐渐发现肿瘤的发生是细胞的增殖与凋亡失衡所致(Okada，H.；Mak，T.W.Nat.Rev.Cancer 2004，4，592-603)。研究表明在多种肿瘤细胞中凋亡机制被抑制，肿瘤细胞因而得以过度增生；另外，凋亡机制被抑制也使得肿瘤细胞对化疗药物的抵抗性增强(Igney，F.H.；Krammer，P.H.Nat.Rev.Cancer 2002，2，277-288)。因此，设法恢复肿瘤细胞中的凋亡机制成为当今抗肿瘤药物设计的一条新思路，在国际上得到了广泛重视(Reed，J.C.Nat.Rev.Drug Discov.2002，1，111-121；Andersen，M.H.；Becker，J.C.；Straten，P.Nat.Rev.Drug Discov.2005，4，399-409.)。
在与细胞凋亡有关的药物靶点中，Bcl-2(B-cell lymphoma2)相关蛋白是较早得到研究的一类。该类蛋白可分为三个家族：Bcl-2家族，Bax家族和BH3-only家族。其中，Bcl-2家族成员(Bcl-2，Bcl-xL，Mcl-1，Bcl-w等)起着抗细胞凋亡的作用，后两个家族的成员起促细胞凋亡的作用。目前人们认为Bcl-2相关蛋白主要是在细胞凋亡的线粒体途径中发挥作用。其中经活化的Bax家族蛋白(Bax、Bak等)可以结合在线粒体膜上使得细胞色素C从线粒体中释放出来从而最终导致凋亡的发生；而Bcl-2、Bcl-xL等抗凋亡蛋白则能够与Bax和Bak相结合，使其不能发挥作用；另外，一些BH3-only家族成员(Bim，Bad，Bid，Bik等)又能够与Bcl-2家族成员相结合，抑制其抗凋亡作用。因此，Bcl-2相关蛋白之间的平衡与否对细胞凋亡起着至关重要的调控作用。研究表明，多种类型的肿瘤细胞至少过量表达其中一种Bcl-2家族蛋白，但是在正常细胞中这些蛋白的表达水平则相对较低。使用有机小分子拮抗这些蛋白的功能有望恢复肿瘤细胞中的凋亡机制，从而达到消除肿瘤的目的(Huang，Z.Curr.Opin.Drug Discov.Devel.2000，3，565-574；Cory，S.；Adams，J.M.Nat.Rev.Cancer 2002，2，647-656)。
有机小分子对Bcl-2家族蛋白的抑制活性通常用荧光偏振(FluorescencePolarization，简称FP)方法检测(Zhang，H.；Nimmer，P.；Rosenberg，S.H.；Ng，S.C.；Joseph，M.Anal.Biochem.2002，307，70-75)。该方法是基于分子在均相溶液中的自由旋转，当一个荧光标记的分子被一个平面的极化光所激发时，其发射光可发射到一个固定的平面，而该发射光的极化水平与分子的旋转速度成反比。荧光标记的小分子在均相体系里处于高速旋转状态，发射光表现为除极化，得到一个较低的极化值，而非荧光标记的大分子旋转速度远远低于荧光标记的小分子，当小分子和大分子发生特异性结合后，复合物的旋转速度与大分子的旋转速度相比变化不明显，而远远低于荧光标记小分子的旋转速度，极化值显著升高。当该方法用于检测小分子抑制Bcl-2家族蛋白与天然底物多肽的结合时，在荧光标记多肽与蛋白共存的体系中加入待测化合物，如果化合物也能够与蛋白特异性结合，则会与荧光标记多肽发生竞争从而抑制其与蛋白的结合，进而导致荧光极化值降低。因此通过检测荧光极化值的变化情况就可以测得化合物的活性。
【发明内容】
本发明的第一个目的是提供一种新的噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物。
本发明的第二个目的是提供一种噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物用于制备抑制Bcl-xL与天然底物多肽结合的小分子抑制剂和抗肿瘤药物的应用。
本发明所提供的一种新的噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物具有如下的结构式：
式中R1为(Z)-1-苄基-1H吲哚-3-亚甲基；R2为4-溴苯基、4-甲氧基苯基、4-乙基苯基、4-乙酰氧基苯基、3，4-二乙酰氧基苯基或2，5-二甲氧基苯基；R3为苯胺基或乙氧基。
限制条件是：当R3为苯胺基时，R1为(Z)-1-苄基-1H吲哚-3-亚甲基，R2为4-溴苯基、4-甲氧基苯基、4-乙基苯基、4-乙酰氧基苯基、3，4-二乙酰氧基苯基或2，5-二甲氧基苯基；当R3为乙氧基时，R1为(Z)-1-苄基-1H吲哚-3-亚甲基，R2为4-乙基苯基。
本发明的用于制备抑制Bcl-xL与天然底物多肽结合的小分子抑制剂和抗肿瘤药物的噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物没有上述的限制，具体地说是具有如下的结构式的2-(芳基亚甲基)-5-芳基-7-甲基-3-氧代-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物：
式VII
式中R1为(Z)-1-苄基-1H吲哚-3-亚甲基、(Z)-1-(2-氟苄基)-1H吲哚-3-亚甲基、(E)-1-乙氧羰基甲基-1H吲哚-3-亚甲基、2-吲哚啉酮、(Z)-吡啶-4-亚甲基、(E)-5-甲基呋喃-2-亚甲基、(E)-3-甲基苯基亚甲基、(E)-3-氟苯基亚甲基、(Z)-2，3-二氯苯基亚甲基或(Z)-2，5-二甲氧基苯基亚甲基；R2为苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、3-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、4-乙基苯基、4-乙酰氧基苯基、3，4-二乙酰氧基苯基、2，4-二甲氧基苯基、2，5-二甲氧基苯基或噻吩-2-基；R3为苯胺基或乙氧基。没有前述的限制条件。可以进一步描述为如下的化合物：
式VIIa 式VIIb 式VIIc
式VIId 式VIIe 式VIIf
式VIIg 式VIIh 式VIIi
式VIIj 式VIIk 式VIIl
式VIIm 式VIIn 式VIIo
式VIIp 式VIIq 式VIIr
式VIIs 式VIIt 式VIIu
实验表明，上述噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物为抑制Bcl-2家族蛋白成员Bcl-xL与天然底物多肽(Bid BH3多肽)相结合的有效成分，基于荧光偏振(FP)原理的活性测试表明该类化合物具有微摩尔级的活性。FP方法检测此类化合物抑制Bcl-xL与N端用5-FAM标记的Bid BH3多肽(序列为：5-FAM-QEDIIRNIARHLAQVGDSMDR)结合的活性如下：
1)(Z)-2-((1-(2-氟苄基)-1H-吲哚)-3-亚甲基)-7-甲基-3-氧代N-苯基-5-(噻吩-2-基)-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VII a)的抑制常数Ki为0.53μM；
2)(Z)-2-((1-苄基1H-吲哚)-3-亚甲基)-5-(3-甲氧基苯基)-7-甲基-3-氧代N-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VII b)的抑制常数Ki为1.8μM；
3)(Z)-5-(2，4-二甲氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-2-(2-氧代吲哚啉-3-亚基)N-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VII c)的抑制常数Ki为24.5μM；
4)(Z)-2-((1-(2-氟苄基)-1H-吲哚)-3-亚甲基)-5-(4-氟苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VII d)的抑制常数Ki为2.4μM；
5)(E)-2-(3-((5-(4-甲氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-6-(苯基氨甲酰基)-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-2-亚基)甲基)-1H-吲哚)-1-乙酸乙酯(式VII e)在10μM下的抑制率为44.1％；
6)(Z)-2-((1-苄基-1H-吲哚)-3-亚甲基)-5-(2，5-二甲氧基苯基)-7-甲基-3-氧代N-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VII f)在10μM下的抑制率为44.1％；
7)(E)-7-甲基-2-((5-甲基呋喃)-2-亚甲基)-3-氧代-N，5-二苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VII g)在10μM下的抑制率为23.4％；
8)(Z)-5-(4-氯苯基)-7-甲基-3-氧代N-苯基-2-(吡啶-4-亚甲基)-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VII h)在10μM下的抑制率为18.7％；
9)(Z)-5-(3-甲氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2-(吡啶-4-亚甲基)-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VII i)在10μM下的抑制率为13.7％；
10)(E)-2-(3-氟苯基亚甲基)-5-(4-甲氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VII j)在10μM下的抑制率为6.9％；
11)(Z)-2-(2，3-二氯苯基亚甲基)-5-(4-氟苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VII k)在10μM下的抑制率为4.6％；
12)(Z)-2-(2，5-二甲氧基苯基亚甲基)-7-甲基-3-氧代-5-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-甲酸乙酯(式VII l)在10μM下的抑制率为2.5％；
13)(E)-5-(4-甲氧基苯基)-7-甲基-2-(3-甲基苯基亚甲基)-3-氧代-N-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VII m)在10μM下的抑制率为1.6％；
14)(Z)-2-((1-苄基-1H-吲哚)-3-亚甲基)-5-(4-甲氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VII n)的抑制常数Ki为11.6μM；；
15)(Z)-2-((1-苄基-1H-吲哚)-3-亚甲基)-5-(4-溴苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VII o)的抑制常数Ki为3.8μM；；
16)(Z)-2-((1-苄基-1H-吲哚)-3-亚甲基)-7-甲基-3-氧代-5-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-甲酸乙酯(式VII p)的抑制常数Ki为1.4μM；
17)(Z)-2-((1-苄基-1H-吲哚)-3-亚甲基)-5-(4-乙基)苯基-7-甲基-3-氧代-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-甲酸乙酯(式VII q)的抑制常数Ki为1.2μM；
18)(Z)-2-((1-苄基-1H-吲哚)-3-亚甲基)-7-甲基-3-氧代--5-苯基-N-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VII r)的抑制常数Ki为4.8μM；
19)(Z)-2-((1-苄基-1H-吲哚)-3-亚甲基)-5-(4-乙基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VII s)的抑制常数Ki为11.2μM；
20)(Z)-2-((1-苄基-1H-吲哚)-3-亚甲基)-5-(3，4-二乙酰氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VII t)的抑制常数Ki为2.6μM；
21)(Z)-2-((1-苄基-1H-吲哚)-3-亚甲基)-5-(4-乙酰氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VII u)的抑制常数Ki为4.5μM；
本发明的噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物还可以用于制备抗肿瘤药物。
实验表明，噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物对人乳腺癌MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞显示出抑制活性，是一类具有广泛应用价值的抗肿瘤先导化合物。其中化合物VII b对MDA-MB-231的CC50值(50％Cytotoxic Concentration，半数细胞毒浓度)为5.45μM；化合物VII c对MCF-7的CC50值为24.56μM。
本发明的有益效果在于所涉及的噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物是一类结构新颖的Bcl-2家族蛋白抑制剂，具有微摩尔级的分子水平抑制活性，而且对肿瘤细胞具有较强的细胞毒活性，因此作为先导化合物具有良好的潜力和应用前景，有望开发成为靶向Bcl-2家族蛋白的抗肿瘤药物。
【附图说明】
图1-图12为噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物(VII a～VII a)的荧光偏振测活曲线
图13-图14为噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物的MTT测活曲线
其中，图13为噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物VII b对MDA-MB-231细胞系细胞毒性测定(CC50＝5.45μM)；图14为噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物VII c对MCF-7细胞系细胞毒性测定(CC50＝24.56μM)。
【具体实施方式】
实施例1：(Z)-2-((1-苄基-1H-吲哚)-3-亚甲基)-5-(3，4-二乙酰氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VII t)的制备
一、4-(3，4-二羟基苯基)-6-甲基-N-苯基-2-硫代-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-甲酰胺(式IV d)的合成
将1.772g(10mmol)的乙酰乙酰苯胺，761.2mg(10mmol)的硫脲，1.381g(10mmol)的3，4-二羟基苯甲醛混合，加入25ml乙醇，再加入250mg(1.45mmol)的对甲基苯磺酸，回流反应24小时，直接抽滤，得灰色粉末状固体式IV d(1.767g，产率50％)。
经检测，结构正确，检测结果如下：mp 162-166℃；IR(KBr)：v3195，1568，1479，1444，1384，1332，1286，1236，1194，1152，1118，932，879，752，692，506cm-1；1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ9.87(s，1H)，9.64(s，1H)，9.31(s，1H)，8.94(s，1H)，8.87(s，1H)，7.54(d，J＝7.5Hz，2H)，7.25(t，J＝7.8Hz，2H)，7.00(t，J＝7.5Hz，1H)，6.65(d，J＝8.1Hz，2H)，6.50(dd，J＝8.4Hz，J＝2.1Hz，1H)，5.24(d，J＝2.4Hz，1H)，2.04(s，3H)；13C NMR(100MHz，CD3OD)：δ175.4，167.9，146.7，146.5，139.2，135.6，135.0，129.7，125.5，121.8，119.2，116.4，114.9，109.9，57.6，16.7；MS(ESI)(m/z)：356(M+H+)，378(M+Na+)；HRMS(ESI)(m/z)：Calcd forC18H18N3O3S(M+H+)：356.1069，Found：356.1069.
二、(Z)-2-((1-苄基-1H-吲哚)-3-亚甲基)-5-(3，4-二乙酰氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VII t)的合成
将0.118g(0.33mmol)的4-(3，4-二羟基苯基)-6-甲基-N-苯基-2-硫代-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-甲酰胺(式IV d)，0.032g(0.34mmol)的氯乙酸，0.078g(0.33mmol)的1-苄基-1H吲哚-3-甲醛，0.200g(2.44mmol)的醋酸钠，1.0mL(17.47mmol)的醋酸和0.5mL(5.30mmol)的醋酸酐搅拌混合，换氩气三次，油浴80度反应过夜，得红褐色溶液，TLC显示原料已经反应完毕，加冰水10mL，得黄褐色悬浊液，抽滤，水洗，乙醇重结晶得化合物式VII t(深黄色结晶52mg，产率22％)。
经检测，结构正确，检测结果如下：mp 247-254℃；IR(KBr)：v 3277，3059，2924，1771，1706，1641，1598，1568，1519，1502，1467，1440，1385，1370，1335，1257，1214，1186，1162，1111，1013，892，743，701cm-1；1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ10.06(s，1H)，8.12(s，1H)，8.07(s，1H)，7.93(d，J＝7.5Hz，1H)，7.56(t，J＝6.9Hz，3H)，7.37-7.16(m，12H)，7.07(t，J＝7.5Hz，1H)，6.26(s，1H)，5.62(s，2H)，2.24(d，J＝1.5Hz，6H)，2.14(s，3H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)：δ168.4，168.1，165.5，165.2，154.4，142.6，142.5，142.0，137.9，137.4，136.7，135.7，130.4，129.2，129.1，129.0，129.0，128.5，128.1，127.3，126.8，126.4，125.2，124.8，124.0，123.9，123.0，122.0，120.5，119.2，114.2，113.6，111.7，110.6，55.5，51.1，21.5，20.9，20.7；MS(ESI)(m/z)：697(M+H+)，719(M+Na+)，735(M+K+)；HRMS(MALDI)(m/z)：Calcdfor C40H33N4O6S(M+H+)：697.2121，Found：697.2115.
实施例2：式VII f，VII l，VII n，VII o，VII p，VII q，VII r，VII s和VII u的制备
一、式IV a-c，IV e-i的合成
在与实施例1中合成IV d类似的条件下，从相应的β二羰基化合物式I a-c，I e-i，不同取代的醛式II a-c，II e-i和硫脲式III得到化合物式IV a-c，IV e-i：4-苯基-6-甲基-N-苯基-2-硫代-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-甲酰胺(式IV a)；4-(4-乙基苯基)-6-甲基-N-苯基-2-硫代-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-甲酰胺(式IV b)；4-(2，5-二甲氧基苯基)-6-甲基-N-苯基-2-硫代-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-甲酰胺(式IV c)；4-(4-甲氧基苯基)-6-甲基-N-苯基-2-硫代-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-甲酰胺(式IV e)；4-(4-羟基苯基)-6-甲基-N-苯基-2-硫代-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-甲酰胺(式IV f)；4-(4-溴苯基)-6-甲基-N-苯基-2-硫代-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-甲酰胺(式IV g)；4-苯基-6-甲基-2-硫代-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-甲酸乙酯(式IV h)；4-(4-乙基苯基)-6-甲基-2-硫代-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-甲酸乙酯(式IV i)。
二、式VII f，VII l，VII n，VII o，VII p，VII q，VII r，VII s和VII u的合成
在与实施例1中合成VII t类似的条件下，从相应的Biginelli产物式IV a-c，IV e-i和相应的醛式V f，V l，V n-s，V u得到化合物VII f，VII l，VII n-s，I u：(Z)-2-((1-苄基-1H-吲哚)-3-亚甲基)-5-(2，5-二甲氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VII f)；(Z)-2-(2，5-二甲氧基苯基亚甲基)-7-甲基-3-氧代-5-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-甲酸乙酯(式VII l)；(Z)-2-((1-苄基-1H-吲哚)-3-亚甲基)-5-(4-甲氧基苯基)-7-甲基-3-氧代N-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VII n)；(Z)-2-((1-苄基-1H-吲哚)-3-亚甲基)-5-(4-溴苯基)-7-甲基-3-氧代N-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VII o)；(Z)-2-((1-苄基-1H-吲哚)-3-亚甲基)-7-甲基-3-氧代-5-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-甲酸乙酯(式VII p)；(Z)-2-((1-苄基-1H-吲哚)-3-亚甲基)-5-(4-乙基)苯基-7-甲基-3-氧代-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-甲酸乙酯(式VII q)；(Z)-2-((1-苄基-1H-吲哚)-3-亚甲基)-7-甲基-3-氧代--5-苯基N-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VII r)；(Z)-2-((1-苄基-1H-吲哚)-3-亚甲基)-5-(4-乙基苯基)-7-甲基-3-氧代N-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VII s)；(Z)-2-((1-苄基-1H-吲哚)-3-亚甲基)-5-(4-乙酰氧基苯基)-7-甲基-3-氧代N-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VII u)。
实施例3：噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物对Bcl-xL抑制作用的荧光偏振检测
谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合的Bcl-xL(GST-Bcl-xL)蛋白在大肠杆菌BL21中表达，经谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱亲和层析的方法分离纯化；荧光标记多肽为N端用5-FAM标记的Bid BH3多肽(序列为：5-FAM-QEDIIRNIARHLAQVGDSMDR)；化合物VII f和VII l，VII n-VII u用上述方法制备，其余化合物购自SPECS公司。
一、化合物式VII a-VII d，VII n-VII u的抑制常数测定
在测试缓冲液(1×磷酸盐缓冲溶液，含0.02％(w/v)NaN3)中加入GST-Bcl-xL的1×PBS溶液和化合物不同浓度的DMSO溶液，混匀后室温避光孵育30min；再加入荧光标记多肽的1×PBS溶液(终浓度为10nM)，使各溶液的总体积均为200μL，混匀后室温避光孵育20min；将上述溶液及校正溶液1(1nM fluorescein)和校正溶液2(10mM NaOH)各取60μL转移至黑色384孔板中(平行三组)，立即在酶标仪上进行荧光偏振的检测，以485nM为激发波长，535nM为发射波长，将校正溶液的荧光偏振值定为20mP，测得各浓度下的荧光偏振值(mP)并计算抑制率，拟合得到半数抑制浓度IC50，抑制常数使用如下公式求得：Ki＝[I]50/([L]50/Kd+[P]0/Kd+1)([I]50：达到半数抑制时游离的抑制剂的浓度；[L]50：达到半数抑制时游离的荧光标记多肽的浓度；[P]0：没有抑制时游离的蛋白浓度；Kd：蛋白与荧光标记多肽的解离常数)。结果见表1-表12：
表1：化合物VII a的荧光偏振检测结果
表2：化合物VII b的荧光偏振检测结果
表3：化合物VII c的荧光偏振检测结果
表4：化合物VII d的荧光偏振检测结果
表5：化合物VII n的荧光偏振检测结果
表6：化合物VII o的荧光偏振检测结果
表7：化合物VII p的荧光偏振检测结果
表8：化合物VII q的荧光偏振检测结果
表9：化合物VII r的荧光偏振检测结果
表10：化合物VII s的荧光偏振检测结果
表11：化合物VII t的荧光偏振检测结果
表12：化合物VII u的荧光偏振检测结果
二、化合物VII e-VII m的抑制活性检测
在测试缓冲液(1×磷酸盐缓冲溶液，含0.02％(w/v)NaN3)中加入GST-Bcl-xL的1×PBS溶液，分别加入DMSO(2μL)和待测化合物的DMSO溶液(终浓度为10μM)，混匀后室温避光孵育30min；再加入荧光标记多肽的1×PBS溶液(终浓度为10nM)，使各溶液的总体积均为200μL，混匀后室温避光孵育20min；将上述溶液及校正溶液1(1nM fluorescein)和校正溶液2(10mM NaOH)各取60μL转移至黑色384孔板中(平行三组)，立即在酶标仪上进行荧光偏振的检测，以485nM为激发波长，535nM为发射波长，将校正溶液的荧光偏振值定为20mP，测得各化合物的荧光偏振值(mP)。
结果见表13：
表13：化合物VII e-VII m的荧光偏振检测结果
化 合 物 GST-Bcl-x L的浓度 GST-Bcl-x L与多肽的 解离常数 Kd 对照mP±SD 荧光标记多 肽mP±SD 化合物 mP±SD 抑 制 率 ％ VI I e 160nM 78.7nM 158.48±4.47 128.71±15.5 1 145.34±3.83 44. 1 VI I f 132nM 55.3nM 183.18±1.96 108.77±8.11 150.39±5.27 44. 1 VI 160nM 78.7nM 168.93±12.8 99.44±14.63 152.64±0.06 23.
I g 5 4 VI I h 87.5nM 75nM 168.56±2.57 120.82±9.19 159.63±3.01 18. 7 VI I i 160nM 78.7nM 175.93±5.93 117.87±7.90 167.97±16.4 3 13. 7 VI I j 160nM 78.7nM 175.93±5.93 117.87±7.90 171.94±0.21 6.9 VI I k 160nM 78.7nM 175.93±5.93 117.87±7.90 173.28±3.75 4.6 VI I l 132nM 55.3nM 144.01±3.56 85.11±2.74 142.55±3.55 2.5 VI I m 160nM 78.7nM 158.48±4.47 128.71±15.5 1 158±5.61 1.6
实施例4：噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物对人乳腺癌MDA-MB-231细胞系的细胞毒性检测
一、化合物VII a，VII b，VII d，VII e在10μM下对MDA-MB-231细胞抑制率测定
4×104/ml MDA-MB-231细胞悬液100μL每孔，孵育一天后，与不同的待测化合物溶液混合(终浓度10μM)，37℃，5％CO2培养2天，采用MTT比色法检测细胞毒性。570nm TECAN GENios Pro多功能酶标仪测定OD值，计算细胞抑制率。
表6：化合物VII a，VII b，VII d，VII e在10μM下对MDA-MB-231细胞抑制率测定
二、化合物VII b对MDA-MB-231的细胞毒性检测
4×104/ml MDA-MB-231细胞悬液100μL每孔，孵育一天后，加入混合了不同浓度化合物的DMEM培养液，37℃，5％CO2培养2天，采用MTT比色法检测细胞毒性。570nm TECAN GENios Pro多功能酶标仪测定OD值，计算CC50值(50％Cytotoxic Concentration)为5.45μM。
表7：化合物VII b对MDA-MB-231细胞毒性
实施例5：噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物对人乳腺癌MCF-7细胞系的细胞毒性检测
一、化合物VII b-VII e在10μM下对MCF-7细胞抑制率测定
6×104/ml MCF-7细胞悬液100μL每孔，孵育一天后，与不同的待测化合物溶液混合(终浓度10μM)，37℃，5％CO2培养4天，采用MTT比色法检测细胞毒性。570nm TECAN GENios Pro多功能酶标仪测定OD值，计算细胞抑制率。
表8：化合物VII b-VII e在10μM下对MCF-7细胞抑制率测定
二、化合物VII c对MCF-7的细胞毒性检测
6×104/ml MCF-7细胞悬液100μL每孔，孵育一天后，加入混合了不同浓度化合物的DMEM培养液，37℃，5％CO2培养4天，采用MTT比色法检测细胞毒性。570nm TECAN GENios Pro多功能酶标仪测定OD值，计算CC50值(50％Cytotoxic Concentration)为24.56μM。
表9：化合物VII c对MCF-7细胞毒性