乳酸脱氢酶表达盒、 转化酵母和乳酸的制造方法 技术领域 本发明涉及乳酸脱氢酶表达盒、 具有该盒的转化酵母和包括培养该酵母的乳酸的 制造方法， 更具体的是， 涉及高乳酸生产能力的乳酸脱氢酶表达盒、 具有该盒的转化酵母和 包括培养该酵母的乳酸的制造方法。
背景技术
近年来， 在向资源循环型社会构建的趋势下， 以植物等的生物量作为原料的聚合 物备受关注。这其中， 已经清楚了， 聚乳酸 ( 以下有时简称为 “PLA” ) 作为生物量原料的聚 合物具有优异的性质。
PLA 的 原 料 乳 酸，通 过 培 养 以 乳 杆 菌 属 (Lactobacillus) 和 乳 球 菌 属 (Lactococcus) 为代表的总称为所谓乳酸菌的微生物来制造。 使用乳酸菌的乳酸的生产， 其 由糖产生的乳酸收率和乳酸生产速度优异。但是， 获得的乳酸为 L- 乳酸和 D- 乳酸的混合 物。因此， 在光学纯度上存在问题。在 PLA 生产中使用的乳酸需要高光学纯度。
人们尝试制造光学纯度高的乳酸。例如， 人们尝试了采用转化酵母， 生产 L- 乳酸 和 D- 乳酸 ( 例如， 专利文献 1-3， 非专利文献 1)。酵母原本不具有生产乳酸的能力。在这 些文献中报道了， 通过基因重组技术， 将编码将丙酮酸转化为乳酸的乳酸脱氢酶的基因导 入酵母， 获得了光学纯度非常高的乳酸。另一方面， 在通过酵母进行的乳酸生产中， 乳酸收 率、 乳酸生产速度都比乳酸菌要差。因此， 为了使用酵母以低成本生产乳酸， 需要同时提高 乳酸收率、 乳酸生产速度。
为了使乳酸收率、 乳酸生产速度一起提高， 开发了一边用分离膜过滤具有乳酸生 产能力的酵母， 一边进行培养的技术 ( 参照例如专利文献 4)。但是， 即使采用这种技术， 也 存在在培养过程中乳酸收率、 乳酸生产速度都逐渐降低的问题。
专利文献 1 ： 特表 2001-516584 号公报
专利文献 2 ： 特开 2003-93060 号公报
专利文献 3 ： 特开 2005-137306 号公报
专利文献 4 ： 国际公开第 2007/97260 号小册子
非专利文献 1 ： Ishida， Takahashi 等人， J.Biosci.Bioeng， 101(2)， p.172-177， (2006) 发明内容 发明要解决的问题
本发明鉴于上述问题， 其目的在于提供使得同时实现高的光学纯度、 乳酸收率和 乳酸生产速度成为可能的、 在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母一边进行连续培 养中为了防止乳酸收率和乳酸生产速度降低所必要的编码乳酸脱氢酶的基因表达盒、 具有 该盒的酵母和培养该酵母而制造乳酸的方法。
用于解决问题的方法
本发明人为了解决上述问题， 进行了积极的研究， 结果发现， 在一边用分离膜过滤 具有乳酸生产能力的酵母一边进行连续培养中， 通过一边用分离膜过滤具有乳酸脱氢酶表 达盒的酵母， 其中所述乳酸脱氢酶表达盒含有培养开始后 50 小时以后基因表达量为全部 基因平均相对表达量的 5 倍以上的基因的启动子， 一边进行培养， 能够不导致乳酸收率和 乳酸生产速度降低， 稳定地长时间连续培养， 从而完成了本发明。
也就是说， 本发明为一种在启动子的下游连接了编码乳酸脱氢酶的基因的乳酸脱 氢酶表达盒， 其特征在于该启动子是在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母一边进 行连续培养中， 培养开始后 50 小时之后基因表达量为全部基因平均相对表达量的 5 倍以 上的基因的启动子。优选前述启动子为指数缺陷的抑制 (suppression of exponential defect)1 基因 (SED1 基因 )、 细胞壁关联蛋白质 2 基因 (CWP2 基因 ) 或烯醇化酶 1 基因 (ENO1 基因 ) 的启动子， 更优选地为包含选自以下 (a) ～ (c) 的碱基序列的启动子。
(a) 包含序列号 1 ～ 3 任一项所示的碱基序列的启动子 ；
(b) 包含与含有序列号 1 ～ 3 任一项所示的碱基序列或其一部分的碱基序列在严 格条件下杂交的碱基序列的启动子 ；
(c) 包含在序列号 1 ～ 3 任一项记载的碱基序列中， 缺失、 替代和 / 或添加了 1 个 或多个碱基的碱基序列的启动子。 根据本发明的其它优选方式为含有以下的选自 (a) 组的启动子和选自 (b) 组的编 码乳酸脱氢酶的基因的乳酸脱氢酶表达盒。
(a)
(1) 包含序列号 1 ～ 3 任一项所示的碱基序列的启动子 ；
(2) 包含与含有序列号 1 ～ 3 任一项所示的碱基序列或其一部分的碱基序列在严 格条件下杂交的碱基序列的启动子 ；
(3) 包含在序列号 1 ～ 3 任一项所示的碱基序列中缺失、 替代和 / 或添加了 1 个或 多个碱基的碱基序列的启动子 ；
(b)
(1) 包含序列号 4 ～ 6 任一项所示碱基序列的编码乳酸脱氢酶的基因 ；
(2) 包含与含有序列号 4 ～ 6 任一项所示的碱基序列或其一部分的碱基序列在严 格条件下杂交的碱基序列的编码乳酸脱氢酶的基因 ；
(3) 包含在序列号 4 ～ 6 任一项所示的碱基序列中缺失、 替代和 / 或添加了 1 个或 多个碱基的碱基序列的编码乳酸脱氢酶的基因。
本发明的其它优选方式为在染色体中具有至少一个上述任一乳酸脱氢酶表达盒 的转化酵母。优选地， 选自指数缺陷的抑制 1 基因 (SED1 基因 )、 细胞壁关联蛋白质 2 基因 (CWP2 基因 ) 或烯醇化酶 1 基因 (ENO1 基因 ) 的至少一个基因被上述乳酸脱氢酶表达盒替 代的酵母。
上述转化酵母优选属于酵母属 (Genus Saccharomyces)。上述转化酵母如果是酿 酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)， 则更为优选。
此外， 本发明还提供了包括培养上述转化酵母的培养步骤的乳酸的制造方法。优 选地， 前述培养步骤为用分离膜过滤培养液、 从滤液中回收乳酸、 再将未滤过液保持在或返 流到培养液中， 并在培养液中追加培养基的连续培养。
发明的效果
本发明中， 一边用分离膜过滤具有乳酸脱氢酶表达盒的酵母一边进行培养， 其中 所述乳酸脱氢酶表达盒包含在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母一边进行连续 培养中， 培养开始后 50 小时之后基因表达量为全部基因平均相对表达量的 5 倍以上的基因 的启动子。其结果是， 能够以高收率、 高生产速度、 长时间稳定地进行高光学纯度的乳酸的 生产。
附图的简要说明
[ 图 1] 图 1 是用于说明本发明中使用的膜分离型的连续发酵装置的一个实施方式 的概要侧面图。
[ 图 2] 图 2 是用于说明能够在本发明中使用的其它膜分离型连续发酵装置的一个 实施方式的概要侧面图。
[ 图 3] 图 3 是用于说明本发明中使用的分离膜元件的一个实施方式的概要斜视 图。
[ 图 4] 图 4 是用于说明本发明中使用的其它分离膜元件的其它实施方式的概要斜 视图。
[ 图 5] 图 5 是用于说明表达载体 pTRS11 的图。
符号的说明
1 发酵反应槽
2 分离膜元件 2
3 水位差控制装置
4 第 2 标签序列
5 搅拌机
6 液位传感器
7 培养基供给泵
8 pH 调整溶液供给泵
9 pH 传感器·控制装置
10 温度调节器
11 发酵培养液循环泵
12 膜分离槽
13 支持板
14 流路材料
15 分离膜
16 凹部
17 集水管
18 分离膜束
19 上部树脂密封层
20 下部树脂密封层
21 支持框
22 集水管用于实施发明的最佳方式
[ 乳酸脱氢酶表达盒 ]
本发明的乳酸脱氢酶表达盒是编码乳酸脱氢酶的基因 (ldh 基因 ) 连接在启动子 下游的乳酸脱氢酶 (LDH ： 乳酸脱氢酶， 以下称为 “LDH” ) 表达盒， 在一边用分离膜过滤具有 乳酸生产能力的酵母一边进行连续培养中， 前述启动子为培养开始后 50 小时之后基因表 达量为全部基因平均相对表达量的 5 倍以上的基因的启动子的乳酸脱氢酶表达盒。
本说明书中所谓 “ldh 基因”是指编码具有将还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 和丙酮酸转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD+) 和 L- 乳酸或 NAD+ 和 D- 乳酸 的活性的 LDH 的基因。
作为本发明中使用的 ldh 基因， 只要是编码具有上述活性的 LDH 的 ldh 基因， 可以使用任意一种， 但优选是乳酸菌和枯草杆菌等细菌来源的 ldh 基因和人、 牛、 青蛙、 疟原虫等真核生物来源的 ldh 基因。这其中， 作为细菌来源， 可以适当使用干酪乳杆 菌 (Lactobacillus casei)， 植 物 乳 杆 菌 (Lactobacillus plantarum)， 保加利亚乳杆 菌 (Lactobacillus bulgaricus)， Lactobacillus sasei， 德 氏 乳 杆 菌 (Lactobacillus delbrueckii)， 约 氏 乳 杆 菌 (Lactobacillus johnsonii)， 瑞 士 乳 杆 菌 (Lactobacillus helveticus)， 弯 曲 乳 杆 菌 (Lactobacillus curvatus)， 嗜 酸 乳 杆 菌 (Lactobacillus acidophilus)， 肠膜明串珠菌 (Leuconostoc mesenteroides)、 乳明串珠菌 (Leuconostoc lactis)、 乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis)， 戊糖片球菌 (Pediococcus pentosaceus)， 乳 酸 片 球 菌 (Pediococcus acidilactici)， 枯 草 芽 孢 杆 菌 (Bacillus subtilis)， 嗜热 脂肪芽孢杆菌 (Bacillus stcarothermophilus) 来源的 ldh 基因。此外作为真核生物 来源， 可以适当使用米根霉 (Rhizopus oryzae)， 人 (Homo sapiens)， 牛 (Bos taurus)， 非 洲 爪 蟾 (Xenopus laevis)， 家 犬 (Canis familiaris)、 密 西 西 比 短 吻 鳄 (Alligator mississippiensis)、 灰 色 短 尾 负 鼠 (Monodelphis domestica)、 中 华 鳖 (Pelodiscus sinensis)、 白斑角鲨 (Squalus acanthias)、 恶性疟原虫 (Plamodium falciparum)、 间日 疟原虫 (Plamodium vivax)、 三日疟原虫 (Plamodium marariae)、 蛋形疟原虫 (Plamodium ovale) 来源的 ldh 基因。
本发明中使用的 ldh 基因中还包括由于遗传多态性和诱变等产生的变异型基 因。这里所谓的遗传多态性， 是由于基因上的自然突变导致基因的碱基序列部分发生变 化。此外， 所谓诱变， 是指通过人工在基因中导入变异， 例如， 使用定点诱变导入用试剂盒 (Mutan-K(TakaraBio 公司制 )) 的方法、 使用随机突变导入用试剂盒 (BD Diversify PCR Random Mutagenesis(CLONTECH 公司制 )) 的方法等进行。
作为本发明中使用的克隆 ldh 基因的方法， 没有特别的限制， 可以使用已知的方 法。 例如， 基于已知的基因信息， 可以列举使用 PCR( 聚合酶链反应 ) 法扩增取得必需的遗传 区域的方法， 以同源性和酶活性为指标从基因组文库或 cDNA 文库中克隆的方法等。此外， 还可以是基于已知的蛋白质信息化学合成或基因工程合成的方法。
作为本发明中使用的乳酸脱氢酶 (LDH) 表达盒， 只要是在具有该 LDH 表达盒的细 胞内， 由 ldh 基因经 mRNA 能够表达 LDH 的碱基序列即可， 并没有特别限定。优选为连续具 有启动子、 ldh 基因和终止子的碱基序列。这里， 所谓终止子， 是指使由基因向 mRNA 转录终 止的序列， 通常是指存在于染色体中的基因的 3 末端侧的下游序列。本发明中使用的 “具有乳酸生产能力的酵母” ， 是可以通过同化葡萄糖、 蔗糖、 果糖 等糖来生产乳酸的酵母， 优选是通过基因重组导入了 ldh 基因的酵母。
这里， 对向酵母导入 ldh 基因的方法进行说明。作为向酵母导入 ldh 基因的方法， 可以列举在表达载体中整合有 ldh 基因的 ldh 基因表达载体转化酵母的方法、 在染色体上 的目标位置通过同源重组插入 ldh 基因的方法、 或通过非同源重组在染色体中随机插入 ldh 基因的方法等。
作为整合 ldh 基因的表达载体， 可以使用广泛应用于酵母的表达载体。广泛应用 于酵母的表达载体是指具有酵母细胞内自主复制所必需的序列、 大肠杆菌细胞内自主复制 所必需的序列、 酵母选择标记和大肠杆菌选择标记， 而且为了使整合的 ldh 基因表达， 理想 的是还具有调节其表达的操纵基因、 启动子、 终止子或增强子等所谓的调节序列。
这里， 所谓酵母细胞内自主复制所必需的序列， 是指例如酵母的自主复制起始点 (ARS1) 和着丝粒序列的组合、 或酵母的 2μm 质粒的复制起始点的序列。所谓大肠杆菌内 自主复制所必需的序列， 是例如大肠杆菌的 ColE1 复制起始点的序列。此外， 作为酵母选 择标记， 可以列举 URA3 或 TRP1 等营养需求性互补基因或 G418 抗性基因或新霉素抗性基 因等耐药基因。 大肠杆菌的选择标记可以列举氨苄青霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因等 抗生素抗性基因。作为调节序列， 只要是可以表达 ldh 基因的调节序列， 则没有特别限制， 作为一个例子， 可以列举酸性磷酸酶基因 (PHO5)、 甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶基因 (TDH1， 2， 3)、 醇脱氢酶基因 (ADH1， 2， 3， 4， 5， 6， 7) 基因、 半乳糖代谢类基因 (GAL1， 7， 10)、 细胞色素 c 基 因 (CYC1)、 磷酸丙糖异构酶基因 (TPI1)、 磷酸甘油酸激酶基因 (PGK1)、 磷酸果糖激酶基因 (PFK1)、 丙酮酸脱羧酶基因 (PDC1， 5， 6) 等的启动子序列和 TDH3 基因等的终止子序列。然 而， 表达载体并不限于此。
通过在上述表达载体的启动子下游导入 ldh 基因， 可以获得能够表达 ldh 基因的 载体。通过用后述的方法将获得的 ldh 基因表达载体转化酵母， 可以在酵母中导入 ldh 基 因。
此外， 通过在染色体中插入 ldh 基因， 能够在酵母中导入 ldh 基因。在染色体中插 入 ldh 基因的方法没有特别限制， 有以下方法， 如通过后述的方法将含有 ldh 基因的 DNA 转 化酵母， 通过非同源重组将 ldh 基因插入到染色体中随机的位置处的方法， 通过同源重组 将含有 ldh 基因的 DNA 导入到目标位置的方法等。优选的是通过同源重组的方法。
作为将含有 ldh 基因的 DNA 通过同源重组插入染色体中目的位置的方法， 可以列 举使用被设计成在含有 ldh 基因的 DNA 的上游和下游添加与导入目的位置同源的部分的引 物进行 PCR， 用后述方法将获得的 PCR 片段转化酵母的方法， 但不限于此。 此外， 为了容易地 进行转化株选择， 优选在上述 PCR 片段中含有酵母选择标记。
这里使用的调整 PCR 片段的方法， 可以通过例如下述 (1) ～ (3) 的步骤 1 ～ 3 的 步骤进行。而且， 这里， 对于在丙酮酸脱羧酶 1 基因 (PDC1 基因 ) 启动子下游导入 ldh 基因 的方法进行例示。
(1) 步骤 1 ： 以在 ldh 基因的下游连接了终止子的质粒作为模板， 以引物 1， 2 作为 引物对， 通过 PCR 扩增含有 ldh 基因和终止子的片段。这里， 引物 1 被设计成添加 40bp 以 上与 PDC1 基因的上游侧同源的序列， 基于来源于质粒中终止子下游的序列来设计引物 2。
(2) 步骤 2 ： 以具有酵母选择标记的质粒例如 pRS424、 pRS426 等作为模板， 以引物3， 4 作为引物对， 通过 PCR 扩增含有酵母选择标记的片段。这里， 引物 3 被设计成添加 30bp 以上与步骤 1 的 PCR 片段的终止子下游序列具有同源性的序列， 引物 4 被设计成添加 40bp 以上与 PDC1 基因的下游侧同源的序列。
(3) 步骤 3 ： 通过以步骤 1， 2 中获得的 PCR 片段的混合物作为模板， 以引物 1， 4作 为引物对， 进行 PCR， 获得了在两末端添加了对应于 PDC1 基因的上游侧和下游侧的序列的 含有 ldh 基因、 终止子和酵母选择标记的 PCR 片段。
此外， 在作为 LDH 表达盒导入染色体时， 上述步骤 1 中使用的 PCR 模板质粒， 采用 携带了任意启动子、 ldh 基因和终止子的质粒， 引物 1 只要被设计成在导入目的位置添加 40bp 以上的同源序列， 且能够扩增启动子、 ldh 基因、 终止子即可。
在酵母中导入上述获得的 ldh 基因表达载体或 PCR 片段时， 可以使用转化、 转导、 转染、 共转染或电穿孔等方法。具体有例如， 采用醋酸锂的方法和原生质体法等。
作为获得的转化株的培养方法， 可以使用例如， 记载于 M.D.Rose 等人， “Methods In Yeast Genetics” ， Cold Spring Harbor Laboratory Press(1990) 等中的已知的方法。 导入了 ldh 基因表达载体或 PCR 片段的酵母， 可以根据表达载体或 PCR 片段具有的酵母选 择标记， 通过在营养非添加培养基或药剂添加培养基中培养进行选择。 本发明的所谓 “一边用分离膜过滤一边进行连续培养” 是指， 用分离膜过滤培养 液， 从滤液中回收生产物， 与此同时将未滤过液保持在或返流到前述培养液中， 并且在前述 培养液中追加发酵原料的连续培养。使用的分离膜优选为多孔性膜， 并希望其不容易发生 培养时使用的酵母导致的堵塞， 而且过滤性能具有长期间稳定持续的性能。本发明中使用 的分离膜的材质为陶瓷或有机高分子， 优选为有机高分子。
接着， 就本发明中的 “基因表达量为全部基因平均相对表达量的 5 倍以上的基因” 进行说明。本发明中所谓基因表达量， 是指由基因转录的信使 RNA(mRNA) 量， 所谓全部基因 的平均相对表达量， 优选登录在酵母属基因组数据库 (http://www.yeastgenome.org/) 的 全部基因的平均表达量， 即使缺少 1 个或多个基因也没关系。也就是说， 所谓 “基因表达量 为全部基因平均相对表达量的 5 倍以上的基因” 是指 mRNA 量为全部基因的平均 mRNA 量的 5 倍以上的基因。此外， 本发明的本质在于使用基因表达量更多的基因的启动子， 因此优选 基因表达量为全部基因平均相对表达量的 7 倍以上、 更优选 10 倍以上的基因。
本发明中， 作为测定全部基因的平均相对表达量的方法， 可以列举 Northern 印迹 法、 qPCR( 定量 PCR) 法、 实时 PCR 法或 DNA 微阵列法等。前面 3 种方法是通常测定各个基 因表达量的方法
， 而 DNA 微阵列法中， 进行固定在阵列上的探针和预先用荧光标识的 mRNA 之间的 杂交， 通过用专用扫描仪测定荧光强度， 可以同时测定携带在阵列上的全部基因的表达量， 因此优选 DNA 微阵列法。在用扫描仪进行的荧光强度的测定中， 理想的是用发生荧光强度 的饱和度的斑点数尽可能少， 而且全体荧光强度提高的激光强度进行测定。这种激光强度 在每份测定样本都不同， 可以通过简单的研究来测定。
作为本发明中使用的 DNA 微阵列， 只要是携带了酵母全部基因的微阵列即可， 没 有特别的限制， 可以合适地使用 Affymetrix 公司制造的 “GeneChip”或东丽公司制造的 “3D-Gene” 等。优选 “3D-Gene” 。
这里， 将 “基因表达量为全部基因平均相对表达量的 5 倍以上的基因” 定义为， 使
用 DNA 微阵列测定全部基因的荧光强度， 显示比这些基因的平均值大 5 倍以上的值的基因。 而且， 将 “基因表达量为全部基因平均相对表达量的 7 倍以上的基因” 定义为显示出大 7 倍 以上的值的基因。此外， 还将基因表达量为全部基因平均相对表达量的 10 倍以上的基因” 定义为显示出大 10 倍以上的值的基因。
本发明中， 所谓在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母一边进行连续培养 中， 培养开始后 50 小时之后基因表达量为全部基因平均相对表达量的 5 倍以上的基因的启 动子是指， 在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母一边进行连续培养中， 培养开始 后 50 小时之后的某个时间点， 取样酵母， 使用从该酵母提取的全 RNA， 通过用上述 DNA 微阵 列进行测定能够确定的基因的启动子。
本发明中所谓 “启动子” ， 是指与由基因向 mRNA 的转录开始相关的碱基序列， 通常 是指存在于染色体中的基因的 5 末端侧的上游序列。作为启动子的碱基序列长度， 优选为 1 ～ 3000bp、 更优选 1 ～ 1000bp， 只要是能够起始存在于下游的基因的 mRNA 转录的碱基序 列即可， 没有特别限定。此外， 使启动子的转录活性提高的变异和操作是已知的， 本发明中 还包括通过已知方法改变的启动子。
本发明中， 作为在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母一边进行连续培养 中， 培养开始后 50 小时后基因表达量为全部基因平均相对表达量的 5 倍以上、 优选 7 倍以 上、 更优选 10 倍以上的基因的启动子， 可以列举 CDC19( 细胞分裂周期 19) 基因， IPP1( 无机 焦磷酸酶 1) 基因、 ARF1(ADP- 核糖基化因子 1) 基因， CUP5 基因、 RPL28( 核糖体蛋白 L28) 基因、 TRX2( 硫氧还蛋白 2) 基因， HSP104( 热休克蛋白 104) 基因， AHP1( 烷基过氧化氢还原 酶 1) 基因， YMR122W-A， CIT1( 柠檬酸合酶 1) 基因， RPS15( 核糖体蛋白 S15) 基因， ALD4( 醛 脱氢酶 4) 基因， YPL225W， HSP26( 热休克激蛋白 26) 基因， PGK1( 磷酸甘油酸激酶 1) 基因， SED1( 指数缺陷的抑制 1) 基因， MFA1( 交配因子 1) 基因， HYP2( 含 hypusine 的蛋白质 2) 基 因， HSP12( 热休克蛋白 12) 基因， QCR6( 泛醇细胞色素 C 还原酶复合物 6) 基因， HXK1( 己糖 激酶 1) 基因， TDH3( 甘油醛 3 磷酸脱氢酶 3) 基因， ENO1( 烯醇化酶 1) 基因， BGL2(β 葡聚糖 酶 2) 基因， YJL133C-A， QCR8( 泛醇细胞色素 C 还原酶复合物 8) 基因， FBA1( 果糖 1， 6- 二磷 酸醛缩酶 1) 基因， CWP2( 细胞壁关联蛋白质 2) 基因， CCW12( 细胞壁关联蛋白质 12) 基因， TMA10( 翻译机制相关蛋白 10) 基因， SIP18 基因， HOR7( 高渗透压应答 7) 基因， CCW14( 细 胞壁关联蛋白质 14) 基因， PIR3( 含内部重复的蛋白 13) 基因， CYS3( 胱硫醚酶 3) 基因， CDC48( 细胞分裂周期 48) 基因， LYS20( 高柠檬酸合酶 20) 基因， HSP31( 热休克蛋白 31) 基 因， ARG5， 6( 乙酰谷氨酸激酶 5， 6) 基因， RPS24A(40S 核糖体蛋白 S24) 基因， RPL29( 核糖体 蛋白 L29) 基因， RPL24A( 核糖体蛋白 L24) 基因， ADH4( 醇脱氢酶 4) 基因， MUP1( 蛋氨酸吸 收 1) 基因， RPL11B( 核糖体蛋白 L11B) 基因， THI4( 硫胺生合成 4 基因 ) 基因， RPL24B( 核糖 体蛋白 L24B) 基因， RPS0A(40S 核糖体蛋白质 SA) 基因， RPL27A( 核糖体蛋白质 L27A) 基因， RPL16A( 核糖体蛋白质 L16A) 基因， RPS21B(40S 核糖体蛋白质 S21B) 基因， RPS5(40S 核糖 体蛋白质 S5) 基因， HOM6( 高丝氨酸脱氢酶 6) 基因， PDC5( 丙酮酸脱羧酶 5) 基因， THI7( 硫 胺生合成 7) 基因， MET17( 半胱氨酸合酶 17) 基因， ECM40( 氨基酸 N- 乙酰基转移酶 40) 基 因， ARG1( 精氨酸酶 1) 基因、 ZPS1( 锌·pH/ 调控的表层蛋白质 1) 基因， IDH2( 异柠檬酸脱 氢酶 2) 基因的启动子， 尤为优选 SED1 基因、 CWP2 基因或 ENO1 基因的启动子。
更优选为包含选自以下 (a) ～ (c) 的碱基序列的启动子，(a) 包含下述序列号 1 ～ 3 任一项所示的碱基序列的启动子 ；
(b) 包含与含有下述序列号 1 ～ 3 任一项所示的碱基序列或其一部分的碱基序列 在严格条件下杂交的碱基序列的启动子 ；
(c) 包含在下述序列号 1 ～ 3 任一项所示的碱基序列中缺失、 替代和 / 或添加了 1 个或多个碱基的碱基序列的启动子。
序列号 1 ： (SED1 基因 ： 酿酒酵母来源 )
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说明书9/32 页attctcttct tgccatccct tttcctatct ttgttctttt ataacttcat cacattcgct acacactaac aagaaaaaaa 序列号 3 ： (ENO1 基因 ： 酿酒酵母来源 ) tagaaagcat actatactat tcgacacttc ctttcaatcc aaaaaagaca tctaccgtga aggtgccgta gagtatcgcg gatatacgcc gcggaaacca ggcaaacaat tgaaaagaaa atcgaagccg tctagagtta ccactagtca gatgccgcgg cagcaataac acaacacaat ggttagtagc aacctgaatt tgccgtgaag cgggacaacc agaaaagtcg tctataaatg ggcggggttt taagagtgca tatcacaaat tgtcgcatta cattacttga cgcaaaagcg tttgaaataa tgacgaaaaa aaataccgct tctaggcggg ttatctactg atccgagctt cacctgcata tttggacgac ctttacttac accaccaaaa ccctgataac gtccactaat tgagcgatta cctgagcggt agacttgcat actgcaaatc gtaagtagca acgtctcaagcttctcataa tcaagaataatggaattaac ttaccatatc aattttgagg gcacttgagc cggtcattga ccggcacgtg ccgcggaacc gaaggaagaa ccactaggat accactttcg cctcttttgt gtcaaaactgagtcactttt gccaaaaact aactctctgc acctcatgca tgcatgcatg cgatcatcgt gccagatatt aaaaaaagaa agcacccaaa cctctcccgc ttgcagcatg tatggaaaccttgtcacctc acttaattct agctagccta ccctgcaagt caagaggtct ccgtgattcc
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而且， 本说明书中， 所谓 “严格条件” ， 是指与其它序列相比较而言探针以更大的程 度 ( 例如比背景大至少 2 倍 ) 与其目标序列杂交的条件。严格条件为序列依存性， 根据进 行杂交的环境而不同。这里， 作为严格条件， 是在 50％甲酰胺存在下， 杂交温度为 37℃， 更 严格的条件为约 42℃。进一步严格条件为在甲酰胺存在下， 杂交温度为约 65℃。
本发明为含有上述任一启动子的乳酸脱氢酶表达盒。
此外， 本发明为含有以下的选自 (a) 组的启动子和选自 (b) 组的编码乳酸脱氢酶 的基因的乳酸脱氢酶表达盒，
(a)
(1) 包含上述序列号 1 ～ 3 任一项所示的碱基序列的启动子，
(2) 包含与上述含有序列号 1 ～ 3 任一项所示的碱基序列或其一部分的碱基序列 在严格条件下杂交的碱基序列的启动子，
(3) 包含在上述序列号 1 ～ 3 任一项所示的碱基序列中缺失、 替代和 / 或添加了 1 个或多个碱基的碱基序列的启动子，
(b)
(1) 包含下述序列号 4 ～ 6 任一项所示碱基序列的编码乳酸脱氢酶的基因，
(2) 包含与含有下述序列号 4 ～ 6 任一项所示的碱基序列或其一部分的碱基序列 在严格条件下杂交的碱基序列的编码乳酸脱氢酶的基因，
(3) 包含在下述序列号 4 ～ 6 任一项所示的碱基序列中缺失、 替代和 / 或添加了 1 个或多个碱基的碱基序列的编码乳酸脱氢酶的基因。11101939426 A CN 101939429
说明书aggaggagtc cctgtgccat tagaagacaa cccccaagat tgacggccgg tcaacatctt tcatcgtctc ccaaaaaccg tggggcagaa gagactcgag tgcaccccga ttgtggacag tgtccgtagc ccacaatggt10/32 页序列号 4 ： 非洲爪蟾 (Xenopus laevis) 来源 atggcaactg tgaaggataa actcatccac aatgtggtca aacaaggtca ccattgtggg tgtgggggcc gtgggcatgg cagaaggatt tggcagatga gcttgcactt gttgatgtga gaaatgatgg atctccagca tggcagtctg ttccttcgta aaagattaca gcgtcactgc aaactccaag ctggtagttg caggagggag agagtcgcct gaatctggtt cagcgcaatg attcccaaca ttgtcaagta cagccccaac tgcaccctgc gacattctga catatgtggc ctggaagatc agtggattcc agcggctgca atttggactc tgcccgtttc cgttacctca cacacccaga gctgccacgg ttgggtcatt ggggaacacg tggagtgggg tgaatgtggc tggcgtgtcc ctgaaaaccc gacgcagaca aggagaactg gaaggaggtg cacaagcagg gtgatcaagc tgaagggcta cacctcctgg gctattggcc gagagtatcc tgaagaacct ccgccgagtc catcccatttgctcccccag cagtgtcctg actgaagggg tgtctcaggg ggcccgtcag caaattcatc caacccagtg tgtcattggc gtttgggatc tgtgccagtg tattgggagt cgcctatgaa tgacctgtct caagggcatg cttgggcatc caagagcgcatacggcgtga ataatgatgt tttcctcagt gtcccctgtg tgttgggcaa acagacgtgg ttaacatgac gctgaaggca gatgaagagg atcgcttacg gacaccctgt gggccatcca gaaggagctg cagttctag 序列号 5 ： 人 (Homo sapiens) 来源 atggcaactc taaaggatca gctgatttat aatcttctaa aggaagaaca aataagatta cagttgttgg ggttggtgct gttggcatgg cctgtgccat atgaaggact tggcagatga acttgctctt gttgatgtca tcgaagacaa gagatgatgg atctccaaca tggcagcctt ttccttagaa caccaaagat aaagactata atgtaactgc aaactccaag ctggtcatta tcacggctgg caagagggag aaagccgtct taatttggtc cagcgtaacg tgaacatatt attcctaatg ttgtaaaata cagcccgaac tgcaagttgc ttattgtttc gatatcttga cctacgtggc ttggaagata agtggttttc ccaaaaaccg agtggttgca atctggattc agcccgattc cgttacctga tgggggaaag cacccattaa gctgtcatgg gtgggtcctt ggggaacatg gagattccag tggagtggaa tgaatgttgc tggtgtctct ctgaagactc tgcacccaga gataaagata aggaacagtg gaaagaggtt cacaagcagg tggttgagag gtgatcaaac tcaaaggcta cacatcctgg gctattggac tctctgtagc gagagtataa tgaagaatct taggcgggtg cacccagttt ccaccatgat tacggaataa aggatgatgt cttccttagt gttccttgca ttttgggaca tcagaccttg tgaaggtgac tctgacttct gaggaagagg cccgtttgaa gatacacttt gggggatcca aaaggagctg caattttaa 序列号 6 ： 肠膜明串珠菌 (Leuconostoc mesenteroides) 来源 atgaagattt ttgcttacgg cattcgtgat gatgaaaagc catcacttga gcggctaacc cagagattga agtggactac acacaagaat tattgacacc12gaccccccag cagtatctta attgaaggga tgtctctggc ggcacgtcag taaattcatc aaatccagtg tgttattgga gctgggagtt tgtgcctgta tttagggact tgcttatgag agatttggca taagggtctt gaatggaatc gaagagtgcaagaatggaaa tgaaacagct101939426 A CN 101939429
说明书11/32 页aagttggctg agggatcaga ttcagctgtt gtttatcaac aattggacta tacacgtgaa
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[ 转化酵母 ]
本发明为在染色体中含有至少一个上述乳酸脱氢酶表达盒的转化酵母。 本发明中 的转化酵母可以在能够由乳酸脱氢酶表达盒表达 LDH 的染色体中的任意位置上导入该乳 酸脱氢酶表达盒。优选为选自 SED1 基因、 CWP2 基因或 ENO1 基因中的至少一个基因被上述 乳酸脱氢酶表达盒替代的酵母。
本 发 明 中 使 用 的 酵 母 如 果 是 能 够 导 入 乳 酸 脱 氢 酶 表 达 盒 的 酵 母， 就可以 合 适 地 使 用。 作 为 其 中 一 例， 可 以 列 举 属 于 酵 母 属 (Saccharomyces)、 裂殖酵母 属 (Schizosaccharomyces)、接 合 酵 母 属 (Zygosaccharomyces)、克 鲁 维 酵 母 属 (Kluyveromyces) 或假丝酵母属 (Candida) 的酵母。优选属于酵母属的酵母。更优选为酿 酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)。
[ 乳酸的制造方法 ]
本发明为包括培养上述转化酵母的乳酸的制造方法。培养时可以采用分批培养、 流加培养 ( 补料分批培养 )、 恒化器培养或连续培养中的任一种方式。优选连续培养。更 优选的是， 用分离膜过滤培养液， 从滤液中回收乳酸， 再将未滤过液保持在或返流到培养液 中， 且在培养液中追加培养基的连续培养。
作为本发明中使用的酵母的发酵原料， 可以是促进发酵培养的酵母的生长， 能够 使作为目的发酵生产物的乳酸良好生产的原料。作为发酵原料， 可以优选使用例如合适地 含有碳源、 氮源、 无机盐类以及根据需要添加的氨基酸和维生素等有机微量营养素的液体 培养基。
作为上述碳源， 可使用例如葡萄糖、 蔗糖、 果糖、 半乳糖、 乳糖等糖类、 含有这些糖 类的淀粉糖化液、 甘薯糖蜜、 甜菜糖蜜、 高级糖蜜 (High Test Molasses)、 甘蔗汁、 以及醋 酸、 延胡索酸等有机酸、 乙醇等醇类和甘油等。这里所谓糖类是指多元醇的最初氧化生成 物， 具有一个醛基或酮基， 且具有醛基的糖被分类为醛糖、 具有酮基的糖被分类为酮糖的碳 水化合物。此外， 作为上述氮源， 可以使用例如氨气、 氨水、 铵盐类、 尿素、 硝酸盐类、 其它辅助 使用的有机氮源例如油粕类、 大豆加水分解液、 酪蛋白分解物、 其它氨基酸、 维生素类、 玉米 浆、 酵母或酵母提取物、 肉膏、 蛋白胨等的肽类、 各种发酵菌体及其加水分解物等。
此外， 作为上述无机盐类， 可以适当添加例如磷酸盐， 镁盐、 钙盐、 铁盐、 和锰盐等。
在为了本发明使用的酵母的生长而需要特定营养素的情形时， 可以添加作为制品 的营养物， 或者含有该营养物的天然物。而且， 根据需要还可以添加使用消泡剂。
本发明中， 所谓发酵培养液是指在发酵原料中能够获得酵母增殖的结果的液体。 追加的发酵原料的组成还可以根据培养开始时发酵原料组成适当改变。 在发酵原料组成变 化成追加的发酵原料的组成时， 优选目的乳酸的生产性变高的变化。例如， 通过使氮源、 无 机盐类、 氨基酸和维生素等有机微量营养素相对于上述碳源的重量比率降低， 就有可能可 以实现乳酸的生产成本降低、 即广义的乳酸的生产性提高。另一方面， 通过使氮源、 无机盐 类、 氨基酸和维生素等有机微量营养素相对于上述碳源的重量比率增加， 就有可能使乳酸 的生产性提高。
本发明中， 发酵培养液中糖类等发酵原料的浓度优选保持在 5g/L 以下。更优选在 3g/L 以下， 更为优选在 1g/L 以下。其理由是， 使发酵培养液的抽取导致的发酵原料的流失 降到最小限。因此， 理想的是发酵培养液中发酵原料的浓度尽可能小。
酵母的发酵培养通常多在 pH 为 3-8， 温度为 20-40℃的范围进行。由于生产物质 乳酸为酸性物质， 因此用碱性物质、 以及尿素、 碳酸钙和氨气等将发酵培养液的 pH 调节到 上述范围内的预先确定的值。
在酵母的发酵培养中， 如果需要提高氧的供给速度， 可以采用在空气中添加氧， 将 氧浓度保持在 21％以上， 加压发酵培养液， 提高搅拌速度或者提高通气量等手段， 提高氧的 供给速度。相反， 在需要降低氧的供给速度时， 也可以在空气中混合二氧化碳气体、 氮和氩 等不含氧的气体再进行供给。
本发明中， 可以在培养初期进行分批培养或补料分批培养， 在酵母浓度提高后开 始连续培养 ( 抽取 )， 也可以接种高浓度的酵母菌体， 在培养开始的同时进行连续培养。从 适当时期开始， 可以进行发酵原料液的供给和培养物的抽取。发酵原料液供给和培养物的 抽取开始时间不一定需要相同。 此外， 发酵原料液的供给和培养物的抽取可以是连续的， 也 可以是间歇的。可以在发酵原料液中添加如上所示的对菌体增殖所必需的营养素， 使得菌 体增殖得以连续进行。
为了获得有效的生产性， 发酵培养液中酵母的浓度优选在发酵培养液的环境变得 不适于酵母增殖且死亡率不升高的范围下， 以高浓度状态维持。 作为其中一例， 通过将酵母 浓度， 作为干燥重量维持在 5g/L 以上， 可以获得更好的生产效率。此外， 只要不导致连续发 酵装置运作上的不方便或生产效率降低， 酵母浓度的上限值就没有特别限定。
使具有发酵生产能力的新鲜菌体增殖的同时进行的连续培养操作， 在培养管理 上， 通常优选在单一的发酵反应槽中进行。 然而， 如果是菌体增殖的同时生成乳酸的连续培 养法， 则发酵反应槽的数目是任意的。 由于发酵反应槽的容量小等原因， 也可以使用多个发 酵反应槽。 这种情况下， 即使用配管并列或串联地连接多个发酵反应槽进行连续培养， 也可 以获得发酵生产物的高生产性。
由本发明的乳酸的制造方法制造的包含于培养液中的乳酸的分离·纯化， 还可以通过组合已知的离子交换、 浓缩、 蒸馏和晶析等方法来进行。
本发明的乳酸的制造方法中使用的发酵装置的 1 个例子， 其主要由用于制造乳酸 的容纳本发明的转化酵母的发酵反应槽， 以及用于过滤分离转化酵母和培养液的含有多孔 性膜的分离膜元件构成。分离膜元件可以设置在发酵反应槽的内部或外部。
在通过用分离膜过滤本发明的培养液， 从滤液中回收乳酸， 再将未滤过液保持在 或返流到培养液中， 并在培养液中追加培养基的连续培养所进行的乳酸的制造方法中， 优 选使用平均细孔径为 0.01μm 以上且不到 1μm 的多孔性膜作为分离膜， 在作为过滤压力的 膜间差压在 0.1 至 20kPa 的范围内进行过滤处理。因此， 尤其是， 由于不需要使发酵反应槽 内保持在加压状态， 因此不需要使发酵培养液在过滤分离装置和发酵反应槽间循环的动力 手段， 也可以通过在发酵反应槽内部设置分离膜元件使发酵培养装置紧凑。
下面就本发明中作为分离膜优选使用的多孔性膜的结构进行说明。本发明中的 多孔性膜具有适应被处理水的水质和用途的分离性能和透水性能， 从阻止性能和透水性能 和耐污性这些分离性能方面来看， 优选含有多孔质树脂层的多孔性膜。这样的多孔性膜在 多孔质基材的表面具有起分离功能层作用的多孔质树脂层。 多孔质基材是支持多孔质树脂 层、 给予分离膜强度的物质。 多孔质基材的材质为有机材料和无机材料等， 并没有特殊限定， 但理想的是使用 有机纤维。优选的多孔质基材为使用纤维素纤维、 三乙酸纤维素纤维、 聚酯纤维、 聚丙烯纤 维和聚乙烯纤维等有机纤维构成的织布或无纺布， 这其中， 优选使用密度控制比较容易、 制 造也容易的便宜的无纺布。
另外， 多孔质树脂层起到上述这种分离功能层的作用， 可以优选使用有机高分子 膜。 作为有机高分子膜的材质， 可以列举， 例如聚乙烯类树脂、 聚丙烯类树脂、 聚氯乙烯类树 脂、 聚偏氟乙烯类树脂、 聚砜类树脂、 聚醚砜类树脂、 聚丙烯腈类树脂、 纤维素类树脂和三乙 酸纤维素类树脂等。有机高分子膜也可以是以这些树脂作为主要成分的树脂混合物。这其 中， 作为主要成分， 是指其成分含有 50 重量％以上、 优选 60 重量％以上。其中， 作为构成多 孔质树脂层的材料， 优选通过溶液进行的制膜容易、 且物理的耐久性和耐药性优异的聚氯 乙烯类树脂、 聚偏氟乙烯类树脂、 聚砜类树脂、 聚醚砜类树脂和聚丙烯腈类树脂， 最优选聚 偏氟乙烯类树脂或以其作为主要成分的树脂。
这里， 作为聚偏氟乙烯类树脂， 优选使用偏氟乙烯的均聚物， 其它还优选使用与可 以与偏氟乙烯共聚的乙烯类单体的共聚体。作为可以与偏氟乙烯共聚的乙烯类单体， 可以 列举四氟乙烯、 六氟丙烯和三氯一氟乙烯等。
本发明中使用的分离膜可以是平膜， 也可以是中空纤维膜。 如果是平膜， 其平均厚 度根据其用途来选择， 但优选在 20μm 以上 5000μm 以下， 更优选在 50μm 以上 2000μm 以 下的范围内选择。
如上所述， 本发明中使用的分离膜， 理想的是由多孔质基材和多孔质树脂层形成 的多孔性膜。 此时， 多孔质树脂层可以浸透在多孔质基材中， 多孔质树脂层也可以不浸透在 多孔质基材中， 这根据用途进行选择。多孔质基材的平均厚度优选在 50μm 以上 3000μm 以下的范围内选择。此外， 多孔性膜为中空纤维膜时， 中空纤维的内径优选在 200μm 以上 5000μm 以下的范围选择， 膜厚优选在 20μm 以上 2000μm 以下的范围内选择。此外， 在中 空纤维的内部还可以含有由有机纤维或无机纤维制成筒状的织物或编物。
首先， 就多孔性膜中的平膜的制作法进行简要说明。
在多孔质基材的表面上形成含有前述树脂和溶剂的原液的被膜， 同时使该原液浸 渍于多孔质基材中。然后， 只使具有被膜的多孔质基材的被膜侧表面与含有非溶剂的凝固 浴接触， 使树脂凝固， 同时在多孔质基材的表面上形成多孔质树脂层。 原液通过使树脂溶解 于溶剂中来制备。原液中还可以含有非溶剂。从制膜性的角度考虑， 原液温度通常优选在 15 ～ 120℃的范围内选择。
这里， 还可以在原液中添加开孔剂。 开孔剂具有在浸渍于凝固浴时被提取， 使树脂 层成为多孔质的作用。通过添加开孔剂， 可以控制平均细孔径的大小。开孔剂具有在浸渍 于凝固浴时被提取， 使树脂层成为多孔质的作用。开孔剂优选在凝固浴的溶解性高。作为 开孔剂， 可以使用例如氯化钙或碳酸钙等无机盐。此外， 作为开孔剂， 可以使用聚乙二醇和 聚丙二醇等聚氧化烯类、 聚乙烯醇、 聚乙烯醇缩丁醛和聚丙烯酸等水溶性高分子化合物和 甘油。
此外， 溶剂为溶解树脂的溶剂。 溶剂作用于树脂和开孔剂， 促进它们形成多孔质树 脂层。作为这样的溶剂， 可以使用 N- 甲基吡咯烷酮 (NMP)、 N， N- 二甲基乙酰胺 (DMAc)、 N， N- 二甲基甲酰胺 (DMF)、 二甲亚砜 (DMSO)、 N- 甲基 -2- 吡咯烷酮、 甲基乙基酮、 四氢呋喃、 四 甲基脲、 磷酸三甲酯、 环己酮、 异佛尔酮、 γ- 丁内酯、 甲基异戊基酮、 邻苯二甲酸二甲酯、 丙 二醇甲基醚、 碳酸异丙烯酯、 双丙酮醇、 甘油三乙酸酯、 丙酮和甲基乙基酮等。这其中， 优选 使用树脂溶解性高的 NMP、 DMAc、 DMF 和 DMSO。这些溶剂可以单独使用， 也可以两种以上混 合使用。原液可以以优选 5 重量％以上 60 重量％以下浓度， 使前述树脂溶解于上述溶剂中 来制备。 此外， 还可以在溶剂中添加例如聚乙二醇、 聚乙烯醇、 聚乙烯吡咯烷酮和甘油等溶 剂以外的成分。非溶剂为不溶解树脂的液体。非溶剂起到控制树脂凝固的速度， 从而控制 细孔大小的作用。作为非溶剂， 可以使用水、 甲醇和乙醇等醇类。其中， 从价格方面考虑， 优 选水或甲醇。非溶剂也可以是这些物质的混合物。
下面， 就多孔性膜中的中空纤维膜的制作方法简要说明。
中空纤维膜可以通过从二重管式金属口外侧的管吐出包含树脂和溶剂的原液， 并 从二重管式金属口内侧的管吐出中空部形成用流体， 然后在冷却浴中冷却固化的方式制 作。
原液可以通过使上述平膜的制造方法中所述的树脂以优选 20 重量％以上 60 重 量％以下的浓度溶解于上述平膜的制造方法中所述的溶剂中来制备。此外， 通常可以使 用气体或液体作为中空部形成用流体。此外， 在获得的中空纤维膜的外表面上还可以涂覆 ( 层叠 ) 新的多孔性树脂层。层叠可以是为了使中空纤维膜的性质例如亲水性·疏水性或 细孔径等变化成所希望的性质而进行的。层叠的新的多孔性树脂层可以通过以下方式制 造， 即通过使树脂溶解于溶剂的原液与含有非溶剂的凝固浴接触， 使树脂凝固。 该树脂的材 质优选使用例如与上述有机高分子膜的材质同样的材质。 此外， 作为层叠方法， 可以将中空 纤维膜浸渍于原液中， 也可以在中空纤维膜的表面上涂布原液， 层叠后， 挤出付着的原液的 一部分， 用气刀吹掉， 调整叠层量。
本发明中使用的分离膜还可以通过与支持体组合， 形成分离膜元件。使用支持板 作为支持体， 该支持板的至少一面上配备本发明中使用的分离膜的分离膜元件是本发明使
用的具有分离膜的分离膜元件的一个优选的实施方式。 该实施方式中， 膜面积难以变大时， 为了扩大透水量， 优选在支持板的两面配置分离膜。
作为分离膜的多孔性膜的平均细孔径， 如果在如上所述的 0.01μm 以上不到 1μm 的范围内， 则此膜兼具菌体和污泥等不泄漏的高排除率， 以及高透水性， 而且还可以不容易 堵塞地长时间保持透水性， 而且能够以更高的精度和再现性的实施。 在使用细菌类时， 多孔 性膜的平均细孔径优选在 0.4μm 以下， 平均细孔径如果不到 0.2μm， 可以更合适的实施。 平均细孔径如果过小， 透水量可能降低， 因此本发明中， 平均细孔径为 0.01μm 以上， 优选 为 0.02μm 以上， 更优选为 0.04μm 以上。
这 里， 可 以 通 过 测 定 在 倍 率 10,000 倍 的 扫 描 型 电 子 显 微 镜 观 察 下， 在 9.2μm×10.4μm 的范围内可以观察到的所有细孔的直径， 进行平均后求得平均细孔径。
上述平均细孔径的标准偏差 σ 优选在 0.1μm 以下。而且， 平均细孔径的标准偏 差小， 即细孔径的大小一致， 能够获得均匀的透过液。为了使发酵运转管理变得容易， 理想 的是平均细孔径的标准偏差越小越好。
平 均 细 孔 径 的 标 准 偏 差 σ 可 以 通 过 下 述 ( 式 1) 计 算 得 出， 其中以在上述 9.2μm×10.4μm 范围内能够观察到的细孔数作为 N， 以测定的各个直径作为 Xk， 以细孔直 径的平均值作为 X(ave)。
····( 式 1)在本发明使用的分离膜中， 发酵培养液的透过性是要点之一， 作为透过性的指标， 可以采用使用前的分离膜的纯水透过系数。本发明中， 分离膜的纯水透过系数， 在通过 逆浸透膜， 使用 25 ℃温度的纯化水， 以落差高度 1m 测定透水量计算时， 优选为 2×10-9m3/ (m2·s·Pa) 以上。纯水透过系数如果为 2×10-9m3/(m2·s·Pa) 以上 6×10-7m3/(m2·s·Pa) 以下， 则可以获得实用上充分的透过水量。更优选的纯水透过系数为 2×10-9m3/(m2· s· Pa) -7 3 2 以上 1×10 m /(m ·s·Pa) 以下。
本发明中使用的分离膜的膜表面粗糙度是影响分离膜堵塞的因子。 膜表面粗糙度 优选在 0.1μm 以下时， 可以合适地使分离膜的剥离系数和膜抵抗性降低， 能够以更低的膜 间差压实施连续发酵。由于通过抑制堵塞可以进行稳定的连续发酵， 因此优选表面粗糙度 越小越好。
此外， 通过降低分离膜的膜表面粗糙度， 可以期待在微生物的过滤中， 膜表面发生 的剪切力降低， 微生物的破坏受到抑制， 分离膜的堵塞也受到抑制， 因此可以实现长期稳定 的过滤。
这里， 膜表面粗糙度可以使用下述的原子力显微镜装置 (AFM)， 用下述的装置和条 件进行测定。此外， 使用的原子力显微镜装置 (AFM) 也可以与以下装置相同或更好。
·装置 ： 原子力显微镜装置 (Digital Instruments( 株 ) 制 Nanoscope IIIa)
·条件 ： 探针 SiN 悬臂 (Digital Instruments( 株 ) 制 )
： 扫描模式 接触模式 ( 气中测定 )
水中轻敲 ( 水中测定 )
10μm、 25μm 四方 ( 气中测定 )
5μm、 10μm 四方 ( 水中测定 )
： 扫描分辨率 512×512
·样品制备 ： 测定时膜样品是常温浸渍在乙醇中 15 分钟后， 浸渍于 RO 水中 24 小 时并洗净后， 风干再用。所谓 RO 水， 是指用作为过滤膜的一种的逆浸透膜 (RO 膜 ) 进行过 滤， 排除了离子和盐类等不纯物的水。RO 膜孔的大小大约为 2nm 以下。
膜表面粗糙度 drough 根据上述的 AFM 获得的各点的 Z 轴方向的高度， 用下述的 ( 式 2) 计算。： 扫描范围
····( 式 2)
drough ： 表面粗糙度 (μm) Zn ： Z 轴方向的高度 (μm) ： 扫描范围的平均高度 (μm)N： 测定样品数
本发明中， 用分离膜过滤处理微生物时的膜间差压， 如果是微生物和培养基成分 不容易堵塞的条件就可以了， 但使膜间差压在 0.1kPa 以上 20kPa 以下的范围进行过滤处理 是重要的。膜间差压优选在 0.1kPa 以上 10kPa 以下范围， 更优选在 0.1kPa 以上 5kPa 的范 围。 在偏离上述膜间差压的范围时， 急速发生微生物和培养基成分的堵塞， 导致透过水量降 低， 会在连续发酵运行中产生麻烦。
作为过滤的驱动力， 通过利用发酵培养液与分离膜处理水的液位差 ( 水位差 ) 的 虹吸管， 可以在分离膜上产生膜间差压。此外， 作为过滤的驱动力， 也可以在分离膜处理水 侧设置吸引泵， 也可以在分离膜的发酵培养液侧设置加压泵。膜间差压可以通过使发酵培 养液与分离膜处理水的液位差发生变化来控制。 此外， 为了产生膜间差压而使用泵时， 可以 通过吸引压力控制膜间差压， 而且还可以通过导入发酵培养液侧的压力的气体或液体的压 力控制膜间差压。在进行这些压力控制时， 以发酵培养液侧的压力与分离膜处理水侧的压 力的差作为膜间差压， 可以用于控制膜间差压。
此外， 本发明中使用的分离膜， 作为过滤处理的膜间差压， 优选具有在 0.1kPa 以 上 20kPa 以下的范围内能够进行过滤处理的性能。此外， 本发明中使用的分离膜， 如上所 述， 使用前的纯水透过系数在通过逆浸透膜， 使用 25℃温度的纯化水， 以落差高度 1m 测定 -9 3 2 透水量计算时， 优选为 2×10 m /(m ·s·Pa) 以上的范围， 更优选 2×10-9m3/(m2·s·Pa) 以 上 6×10-7m3/(m2·s·Pa) 以下的范围。
本发明的乳酸的制造方法中使用的连续发酵装置中的分离膜元件设置在发酵反 应槽内部的一个代表性例子示于图 1。图 1 是用于说明本发明中使用的膜分离型连续发酵 装置的一个实施方式的概要侧面图。图 1 中， 膜分离型连续发酵装置基本由发酵培养酵母 的发酵反应槽 1 和用于控制该发酵反应槽 1 中的发酵培养液量的水位差控制装置 3 构成。 在发酵反应槽 1 内配设分离膜元件 2， 该分离膜元件 2 中整合了多孔性膜。作为该多孔性 膜， 合适的是使用例如国际公开第 2002/064240 号小册子中公开的分离膜和分离膜元件。接着， 就通过图 1 的膜分离型连续发酵装置进行的连续发酵的实施方式进行说 明。通过培养基供给泵 7， 将培养基连续地或间歇地投入发酵反应槽 1。就培养基而言， 在 投入到发酵反应槽 1 内之前， 可以根据需要进行加热杀菌、 加热灭菌或采用过滤器的灭菌 处理。发酵生产时， 根据需要， 可以用发酵反应槽 1 内的搅拌机 5 搅拌发酵反应槽 1 内的发 酵液。此外， 根据需要， 可以用气体供给装置 4， 给发酵反应槽 1 内供给所需要的气体。此 时， 可以回收供给的气体， 再循环供给给气体供给装置 4。 此外， 根据需要， 可以通过 pH 传感 器· 控制装置 9 和 pH 调整溶液供给泵 8 来调整发酵反应槽 1 内发酵液的 pH。此外， 根据需 要， 可以通过用温度调节器 10 调节发酵反应槽 1 内发酵培养液的温度进行生产性高的发酵 生产。
这里， 尽管例示了在通过测量设备· 控制装置进行的发酵培养液的物理化学条 件的调节中 pH 和温度的调节， 但根据需要， 可以进行溶解氧和 ORP(Oxidation-reduction Potential ： 氧化还原电位 ) 的控制， 而且还可以通过在线化学传感器等分析装置测定发酵 培养液中的乳酸的浓度， 控制以其作为指标的物理化学的条件。 此外， 就培养基的连续的或 间歇投入的实施方式而言， 也没有特别限定， 以通过上述测量设备装置进行的发酵培养液 的物理化学环境的测定值作为指标， 适当调节培养基投入量和速度。
用设置于发酵反应槽 1 内的分离膜元件 2， 将发酵培养液过滤· 分离成酵母和发酵 生产物， 再从装置系统中取出。此外， 通过将被过滤·分离的酵母留在装置系统内， 装置系 统内的酵母可以维持高浓度， 因而可以进行高生产性的发酵生产。这里， 由分离膜元件 2 进 行的过滤· 分离通过与发酵反应槽 1 水面的水位差压进行， 不需要特别的动力。此外， 根据 需要， 通过液位传感器 6 和水位差压控制装置 3， 可以适当调节分离膜元件 2 的过滤·分离 速度和发酵反应槽 1 内的发酵液量。尽管例示了由上述分离膜元件 2 进行的过滤· 分离通 过水位差压进行， 然而根据需要， 还可以通过泵或通过液体或气体等进行的吸引过滤或加 压装置系统内， 进行过滤·分离。
下面， 本发明的乳酸的制造方法中使用的发酵装置中的分离膜元件设置在发酵反 应槽外部的代表性的一个例子示于图 2 的概要图中。图 2 是用于说明可以在本发明使用的 其它膜分离型连续发酵装置的一个实施方式的概要侧面图。
图 2 中， 膜分离型连续发酵装置基本由用于培养发酵酵母的发酵反应槽 1， 和通过 发酵培养液循环泵 11 与该发酵反应槽 1 连接的内部具有分离膜元件 2 的膜分离槽 12， 以及 用于控制发酵反应槽 1 内发酵培养液量的水位差控制装置 3 构成。这里， 分离膜元件 2 中 整合了多孔性膜。作为该多孔性膜， 合适的是使用例如国际公开第 2002/064240 号小册子 中公开的分离膜和分离膜元件。
图 2 中， 用培养基供给泵 7 将培养基投入到发酵反应槽 1 中， 根据需要， 可以用搅 拌机 5 搅拌发酵反应槽 1 内的发酵培养液。而且， 根据需要， 可以通过气体供给装置 4 供给 所需气体。此时， 可以回收供给的气体， 再循环供给给气体供给装置 4。此外， 根据需要， 可 以通过 pH 传感器·控制装置 9 和 pH 调整溶液供给泵 8 来调整发酵培养液的 pH。此外， 根 据需要， 可以通过用温度调节器 10 调节发酵培养液的温度， 进行生产性高的发酵生产。而 且， 装置内的发酵培养液通过发酵培养液循环泵 11， 在发酵反应槽 1 和膜分离槽 12 之间循 环。含有发酵生产物的发酵培养液被分离膜元件 2 过滤·分离成酵母和发酵生产物， 可以 从装置系统中取出作为发酵生产物的乳酸。此外， 由于被过滤· 分离的酵母留在装置系统内， 因此装置系统内的酵母可以维持 高浓度， 因而可以进行高生产性的发酵生产。这里， 由分离膜元件 2 进行的过滤· 分离通过 与膜分离槽 12 水面的水位差压进行， 不需要特别的动力。此外， 根据需要， 通过液位传感器 6 和水位差压控制装置 3， 可以适当地调节分离膜元件 2 的过滤· 分离速度和装置系统内的 发酵培养液量。此外， 根据需要， 还可以通过气体供给装置 4 向膜分离槽 12 内供给所需气 体。
如上所述， 尽管通过分离膜元件 2 进行的过滤· 分离可以通过水位差压进行， 但根 据需要还可以通过泵或通过液体或气体等进行的吸引过滤或加压装置系统内， 进行过滤和 分离。通过这种手段， 可以调整控制膜间差压。
下面， 用以下附图简要说明本发明中使用的分离膜元件的合适的实施方式的例子 国际公开第 2002/064240 号小册子中公开的分离膜和分离膜元件。图 3 是用于说明本发明 中使用的分离膜元件的一个实施方式的概要斜视图。
分离膜元件， 如图 3 所示， 由在具有刚性的支持板 13 的两面依次配置流路材料 14 和前述分离膜 15 而构成。支持板 13 在其两面具有凹部 16。分离膜 15 过滤发酵培养液。 流路材料 14 是使经分离膜 15 过滤的滤液有效流到支持板 13 的材料。流到支持板 13 的滤 液通过支持板 13 的凹部 16， 经集水管 17， 被取出到连续发酵装置外部。作为用于取出滤液 的动力， 可以使用水位差压、 泵、 通过液体或气体等进行的吸引过滤、 或对装置系统内加压 等方法。
图 4 使用于说明本发明中使用的其它分离膜元件的其它实施方式的概要斜视图。 分离膜元件， 如图 4 所示， 主要由中空纤维膜 ( 多孔性膜 ) 构成的分离膜束 18 和上部树脂 密封层 19 以及下部树脂密封层 20。分离膜束 18 被上部树脂密封层 19 和下部树脂密封层 20 以束状被粘着和固定。由下部树脂密封层 20 进行的粘着和固定形成了密封分离膜束 18 的中空纤维膜 ( 多孔性膜 ) 的中空部， 防止培养液漏出的结构。另一方面， 上部树脂密封层 19 不密封分离膜束 18 的中空纤维膜 ( 多孔性膜 ) 的内孔， 形成了滤液流到集水管 22 的结 构。该分离膜元件可以通过支持框 21 设置在连续发酵装置内。由分离膜束 18 过滤的含有 发酵生产物的滤液通过中空纤维膜的中空部， 经集水管 22， 被取出到连续发酵装置外部。 作 为用于取出滤液的动力， 可以使用水位差压、 泵、 通过液体或气体等进行的吸引过滤、 或对 装置系统内加压等方法。
本发明的乳酸的制造方法中使用的连续发酵装置的分离膜元件的构成部件， 优选 是耐高压蒸气灭菌操作的部件。连续发酵装置内如果可以灭菌， 就可以避免在连续发酵时 被不优选的微生物污染的危险， 可以实现更稳定的连续发酵。构成分离膜元件的部件优选 对高压蒸气灭菌操作的条件即 121℃ 15 分钟， 有耐性。分离膜元件部件可优选选择例如不 锈钢或铝等金属、 聚酰胺类树脂、 氟类树脂、 聚碳酸酯类树脂、 聚缩醛类树脂、 聚对苯二甲酸 丁二醇酯类树脂、 PVDF、 改性聚苯醚类树脂和聚砜类树脂等树脂。
在本发明的乳酸的制造方法中使用的连续发酵装置中， 分离膜元件可以按图 1 所 示的那样设置在发酵反应槽内， 也可以如图 2 所示的那样设置在发酵反应槽外。分离膜元 件设置在发酵反应槽外时， 可以另外设置膜分离槽， 在其内部设置分离膜元件， 可以一边使 培养液在发酵反应槽和膜分离槽之间循环， 一边通过分离膜元件连续过滤培养液。
本发明的乳酸的制造方法中使用的连续发酵装置中， 理想的是， 膜分离槽可以进行高压蒸气灭菌。如果膜分离槽可以进行高压蒸气灭菌， 则容易避免杂菌导致的污染。
比较分批式发酵而言， 按照本发明的通过连续发酵进行的乳酸制造方法进行连续 发酵时， 能够获得高体积生产速度， 可以进行极有效的发酵生产。其中， 连续培养中的发酵 生产速度按以下的 ( 式 3) 计算。
发酵生产速度 (g/L/ 小时 ) ＝抽取液中的生产物浓度 (g/L)× 发酵培养液抽取速 度 (L/ 小时 )÷ 装置的运转液量 (L) ····( 式 3)
此外， 通过分批培养进行的发酵生产速度用消耗所有原料碳源时的生产物量 (g) 除以碳源消耗所需时间 ( 小时 ) 和该时间点的发酵培养液量 (L) 求出。
此外， 本发明的本质是， 通过一边用分离膜过滤具有乳酸脱氢酶表达盒的酵母一 边进行培养， 不会导致乳酸收率和乳酸生产速度的降低， 可以稳定地进行长期间的连续培 养， 因此理想的是上述连续培养实施至少 100 小时以上， 优选 200 小时以上， 更优选 300 小 时以上， 其中所述乳酸脱氢酶表达盒包含启动子， 所述启动子是在一边用分离膜过滤具有 乳酸生产能力的酵母一边进行连续培养中， 培养开始后 50 小时之后基因表达量为全部基 因平均相对表达量的 5 倍以上、 优选 7 倍以上、 更优选 10 倍以上的上述基因的启动子。
此外， 本发明中可以生产 D- 乳酸、 L- 乳酸中的任一种。
通过本发明的乳酸的制造方法获得的乳酸主要可以作为聚乳酸原料提供。
实施例
以下， 用实施例说明本发明的实施方式， 这些实施例都是例示， 但本发明不限于实 施例。
( 参考例 1) 具有乳酸生产能力的酵母的制作
本发明中， 作为具有乳酸生产能力的酵母， 采用 PDC1 启动子的下游导入了具有序 列号 4 所记载的碱基序列的非洲爪蟾来源的 ldh 基因的酵母。非洲爪蟾来源的 ldh 基因的 克隆通过 PCR 法进行。在 PCR 中， 以从非洲爪蟾肾脏来源的 cDNA 文库 (STRATAGENE 公司 制 ) 按照附带的操作规程制备的噬菌粒 DNA 作为模板。
PCR 扩增反应中使用 KOD-Plus 聚合酶 ( 东洋纺公司制 )， 反应缓冲液、 dNTPmix 等采用试剂盒附带的产品。如上所述， 制备 50ng/ 样品的按照附带的操作规程制备的噬菌 粒 DNA， 50pmol/ 样品的引物， 和 1 单位 / 样品的 KOD-Plus 聚合酶这样的 50μl 的反应系。 用 PCR 扩增装置 iCycler(BIO-RAD 公司制 )， 使反应溶液在 94 ℃温度热变性 5 分钟后， 以 94℃ ( 热变性 ) ： 30 秒、 55℃ ( 引物的退火 ) ： 30 秒、 68℃ ( 互补链的延伸 ) ： 1 分钟为一个 循环进行 30 个循环， 然后冷却到 4℃。并且， 对基因扩增用引物 ( 序列号 7， 8) 分别按在 5 末端侧添加 SalI 识别序列、 3 末端侧添加 NotI 识别序列的方式制备。
序列号 7 ： gtcgacatgg caactgtgaa ggataa
序列号 8 ： gcggccgcct agaactgcag ctcctt
纯化 PCR 扩增片段， 用 T4 多核苷酸激酶 (TakaraBio 公司制 ) 对末端磷酸化后， 连 接到 pUC118 载体 ( 用限制性酶 HincII 切断， 对切断面进行脱磷酸化处理 ) 中。用 DNA 连 接试剂盒 Ver.2(TakaraBio 公司制 ) 进行连接。用连接溶液转化大肠杆菌 DH5α 的感受态 细胞 (TakaraBio 公司制 )， 接种到含 50μg/mL 抗生素氨苄青霉素的 LB 板上， 培养一晚。生 长的菌落， 用小型制备法回收质粒 DNA， 用限制性酶 SalI 和 NotI 切断， 选择出导入了非洲爪 蟾来源的 ldh 基因的质粒。这一系列操作都按照附带的操作规程进行。用限制性酶 SalI 和 NotI 切断插入了上述非洲爪蟾来源的 ldh 基因的 pUC118 载 体， 通过 1％琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 片段， 按照常规方法纯化含有非洲爪蟾来源的 ldh 基 因的片段。获得的含有 ldh 基因的片段连接到图 5 所示的表达载体 pTRS11 的 XhoI/NotI 切断部位， 用与上述相同方法回收质粒 DNA， 通过用限制性酶 XhoI 和 NotI 切断， 选择出插入 了非洲爪蟾来源的 ldh 基因的表达载体。以后， 这样制成的整合了非洲爪蟾来源的 ldh 基 因的表达载体称为 pTRS102。
以该 pTRS102 作为扩增模板， 通过以寡核苷酸 ( 序列号 9， 10) 作为引物对的 PCR， 扩增出含有非洲爪蟾来源的 ldh 基因和 TDH3 终止子序列的 1.3kb 的 PCR 片段。这里， 序列 号 9 被设计成添加了对应于 PDC1 基因的起始密码子上游 60bp 的序列。
序列号 9 ：
tctcaattat tattttctac tcataacctc acgcaaaata acacagtcaa atcaatcaaa
atggcaactg tgaaggataa actca
序列号 10 ：
aggcgtatca cgaggccctt
然后， 以质粒 pRS424 作为扩增模板， 通过以寡核苷酸 ( 序列号 11， 12) 作为引物对 的 PCR， 扩增出含有作为酵母选择标记的 TRP1 基因的 1.2kb 的 PCR 片段。这里， 序列号 12 被设计成添加了对应于 PDC1 基因终止密码子下游 60bp 的序列。 序列号 11 ：
gaattaattc ttgaagacga aagggcctcg tgatacgcct agattgtact gagagtgcac
序列号 12 ：
tatttttcgt tacataaaaa tgcttataaa actttaacta ataattagag attaaatcgc
ctgtgcggta tttcacaccg
用 1％琼脂糖凝胶电泳分离各个 DNA 片段， 按常规方法纯化。 通过以混合了由此获 得的各 1.3kb 片段、 1.2kb 片段的混合物作为扩增模板， 以寡核苷酸 ( 序列号 9， 12) 作为引 物对的 PCR 法， 扩增出了在 5 末端·3 末端分别添加了对应于 PDC1 基因的上游·下游 60bp 序列的连接了非洲爪蟾来源的 ldh 基因、 TDH3 终止子和 TRP1 基因的约 2.5kb 的 PCR 片段。
用 1％琼脂糖凝胶电泳分离上述 PCR 片段， 按常规方法纯化后， 转化酵母酿酒酵母 NBRC10505 株， 用色氨酸非添加培养基进行培养， 选择出非洲爪蟾来源的 ldh 基因导入在染 色体上的 PDC1 基因启动子的下游的转化株。
按下述方式对上述获得的转化株为非洲爪蟾来源的 ldh 基因导入在染色体上 PDC1 基因启动子下游的酵母进行确认。首先， 用基因组 DNA 提取试剂盒 Gen とるくん (TakaraBio 公司制 ) 制备转化株的基因组 DNA， 以其作为扩增模板， 通过以寡核苷酸 ( 序列 号 12， 13) 作为引物对的 PCR， 确认获得了约 2.8kb 的扩增 DNA 片段。而且， 非转化株中， 通 过上述 PCR 获得了约 2.1kb 的扩增 DNA 片段。以下， 将上述非洲爪蟾来源的 ldh 基因导入 在染色体上 PDC1 基因启动子下游的转化株称为 B2 株。而且， PDC1 基因的上游和下游序列 可以从酵母属基因组数据库 (URL ： http://www.yeastgenome.org/) 获得。
序列号 13 ： caaatatcgt ttgaatattt ttccg
以下， 获得了使记载于国际公开 WO2007/043253 号小册子中的 pdc1 基因被置换成 TRP1 标记， 并且 pdc5 基因中有温度感受性变异的酵母 SW015 株与上述获得的 B2 株发生接
合的 2 倍体细胞。使该 2 倍体细胞在子囊形成培养基中形成子囊。用显微操作器解剖子 囊， 获得各个单倍体细胞， 研究各个单倍体细胞的营养需求性。从获得的单倍体细胞中， 选 择出在 pdc1 基因座插入了非洲爪蟾来源的 ldh 基因， 且 pdc5 基因中具有温度感受性变异 的 (34℃下不能生长 ) 株。获得的酵母株称为 SU014 株。
此外， 通过在下述所示条件下用 HPLC 法测定在 SC 培养基 (METHODS IN YEAST GENETICS 2000EDITION、 CSHL PRESS) 上培养了转化细胞的培养上清中含有乳酸确定了 SU014 株是否具有乳酸生产能力。
柱： Shim-Pack SPR-H( 岛津公司制 )
移动相 ： 5mM 对甲苯磺酸 ( 流速 0.8mL/ 分钟 )
反应液 ： 5mM 对甲苯磺酸、 20mM Bis-Tris、 0.1mM EDTA·2Na( 流速 0.8mL/ 分钟 )
检测方法 ： 导电性
温度 ： 45℃
此外， L- 乳酸的光学纯度测定在以下条件下通过 HPLC 法测定。
柱： TSK-gel Enantio LI( 注册商标 ： 东曹公司制 )
移动相 ： 1mM 硫酸铜水溶液
流速 ： 1.0ml/ 分钟
检测方法 ： UV254nm
温度 ： 30℃
另外， L- 乳酸的光学纯度用下式计算。
光学纯度 (％ ) ＝ 100×(L-D)/(L+D)
其中， L 表示 L- 乳酸的浓度， D 表示 D- 乳酸的浓度。
HPLC 分析的结果是， 检测到了 L- 乳酸， D- 乳酸为检测限界以下。根据以上研究， 确认了该 SU014 株具有 L- 乳酸生产能力。
( 参考例 2) 分离膜的制作方法
本发明中， 使用按以下方法制作的多孔性膜作为分离膜。
分别使用聚偏氟乙烯 (PVDF) 树脂作为树脂， 分子量为约 20,000 的聚乙二醇 (PEG) 作为开孔剂， N， N- 二甲基乙酰胺 (DMAc) 作为溶剂， 并且使用纯水作为非溶剂， 在 90℃的温 度下将它们充分搅拌， 获得了具有以下组成的原液。
·PVDF ： 13.0 重量％
·PEG ： 5.5 重量％
·DMAc ： 78.0 重量％
·纯水 ： 3.5 重量％
接着， 上述原液在冷却到 25℃的温度后， 涂布在密度为 0.48g/cm3、 厚度为 220μm 的聚酯纤维制无纺布 ( 多孔质基材 ) 上， 涂布后， 立即浸渍于 25 ℃的纯水中 5 分钟， 再浸 渍于 80℃温度的热水中 3 次， 洗出 DMAc 和 PEG， 获得了具有多孔质树脂层的多孔性膜 ( 分 离膜 )。在该分离膜的涂布了原液的一侧， 用倍率 10,000 倍的扫描型电子显微镜观察多 孔质树脂层表面的 9.2μm×10.4μm 的范围， 能够观察到的所有细孔的直径的平均值为 0.02μm。对该分离膜的纯水透水量进行评价， 结果是 2×10-9m3/(m2·s·Pa)。通过逆浸透 膜， 使用 25℃温度的纯化水， 以落差高度 1m 进行透水量的测定。平均细孔径的标准偏差为0.0055μm， 膜表面粗糙度为 0.1μm。
( 参考例 3) 具有乳酸生产能力的酵母通过分离膜进行的过滤连续培养
本发明中， 使用参考例 1 中制作的 SU014 株， 通过图 1 所示的连续培养装置进行过 滤连续培养。使用表 1 所示组成的乳酸发酵培养基作为培养基。该培养基， 在 121℃温度 15 分钟、 高压 (2 个大气压 ) 蒸气灭菌处理后再使用。作为分离膜元件部件， 使用不锈钢和 聚砜树脂的成型品， 使用参考例 2 中制作的多孔性膜作为分离膜。本实施例中的运转条件 只要没有预先特别说明， 为如下条件。
反应槽容量 ： 2(L)
发酵反应槽容量 ： 1.5(L)
使用分离膜 ： PVDF 过滤膜 ( 参考例 2 中制作 )
膜分离元件有效过滤面积 ： 120 平方 cm
温度调整 ： 30(℃ )
发酵反应槽通气量 ： 空气 0.01(L/ 分钟 )、 氮气 0.19(L/ 分钟 )
发酵反应槽搅拌速度 ： 800( 转 / 分钟 )
pH 调整 ： 用 1N NaOH 调整到 pH5
消泡剂 ： 每 3 小时添加 200μl 灭菌的消泡剂 PE-L( 和光纯药公司制 )
灭菌 ： 含有分离膜元件的培养槽和使用的培养基全都用高压灭菌器进行 121℃、 20 分钟的高压蒸气灭菌
[ 表 1]
首先， 在试管中用 10ml 的乳酸发酵培养基振荡培养 SU014 株一晚 ( 前前前培养 )。 将获得的培养液接种在 100ml 新鲜的乳酸发酵培养基中， 在 500ml 容坂口烧瓶中 30℃振荡 培养 24 小时 ( 前前培养 )。将前前培养液接种于图 1 所示的连续培养装置的 1.5L 的乳酸 发酵培养基 ( 葡萄糖浓度为 70g/L) 中， 用附带的搅拌机 5 以 400 转 / 分钟搅拌反应槽 1， 进 行反应槽 1 的通气量的调整、 温度调整、 pH 调整， 进行 24 小时培养 ( 前培养 )。前培养结束 后， 立即进行乳酸发酵培养基的连续供给， 一边控制膜透过水量以使得连续培养装置的发 酵液量达 1.5L， 一边进行连续培养， 通过连续培养进行乳酸的制造。适当地， 测定膜透过发
酵液中生产的乳酸浓度和残存葡萄糖浓度。此外， 根据该乳酸和由葡萄糖浓度计算出的投 入葡萄糖， 求出乳酸对糖收率、 乳酸生产速度。 而且， 葡萄糖浓度的测定中采用 “葡萄糖 Test Wako C” ( 注册商标 )( 和光纯药公司制 )。其结果确认了， 可以实现长达 200 小时的稳定的 连续培养， 经过 200 小时后， 乳酸蓄积浓度降低导致了乳酸对糖收率和乳酸生产速度降低。
( 实施例 1) 连续培养中的基因表达变化
为了研究参考例 3 中进行的连续培养中的基因表达量的变化， 获得自参考例 3 中 进行的连续培养开始 70 小时和 210 小时的培养液样品， 从酵母菌体中提取总 RNA。如下进 行总 RNA 的提取， 将获得的酵母按达到 OD600 ＝ 0.2 悬浮于 10ml 的破碎用缓冲液 (50mM 醋 酸钠 (pH5.3)、 10mM EDTADEPC 处理 )， 转移到 50ml 管中。加入 500μl 的 20％ SDS， 并加入 预先保温在 65℃的 12ml 的苯酚 ( 破碎缓冲液饱和 )， 用旋涡混合器搅拌 5 秒。65℃保温 4 分钟后， 在干冰 / 乙醇浴中快速冷却到室温。在室温离心分离 (5 分钟， 12000G)， 将水性上 清转移到新的 50ml 管中， 加入等量 PCI(pH5.3)， 进行提取。将该水性上清转移到新的 50ml 管中， 加入等量的氯仿， 进行提取。将该水性上清转移到新的 50ml 管中， 加入 1/10 量的 3M 醋酸钠 (pH5.3)， 进行乙醇沉淀。用 80％乙醇清洗沉淀物两次， 进行干燥， 溶解于无 RNA 水 中， 将其作为总 RNA 样本。
用吸光度计测定上述获得的总 RNA 样本的浓度， 采用其中 1μg， 用于 DNA 微阵列分 析。作为 DNA 微阵列， 使用东丽公司制的 “3D-Gene” ， 具体按照附带的操作规程。扫描仪使 用 ScanArray Express(PerkinElmer)， 扫描在 Cyanine 5(PMT 值 55％ )( 培养开始后经过 210 小时后的平均荧光光度测定用 )、 Cyanine 3(PMT 值 70％ )( 培养开始后经过 70 小时后 的平均荧光光度测定用 ) 的条件下进行， 获得图像。根据获得的图像， 用 GenePix Pro 5.0 软件 (Axon Instruments)， 将各点的荧光强度数值化， 计算出其中间值。然后， 计算出各样 品中所有点的平均荧光强度。
其结果是， 作为培养开始后 70 小时的样品中显示出平均荧光强度的 10 倍以上数 值的基因， 可以确认 CDC19 基因， IPP1 基因、 ARF1 基因， CUP5 基因、 RPL28 基因、 TRX2 基因， HSP104 基因， AHP1 基因， YMR122W-A， CIT1 基因， RPS15 基因， ALD4 基因， YPL225W、 HSP26 基 因， PGK1 基因， SED1 基因， MFA1 基因、 HYP2 基因， HSP12 基因， QCR6 基因， HXK1 基因， TDH3 基 因， ENO1 基因， BGL2 基因， YJL133C-A， QCR8 基因， FBA1 基因， CWP2 基因， CCW12 基因， TMA10 基因， SIP18 基因， HOR7 基因， CCW14 基因、 PIR3 基因， 而且， 作为培养开始后 210 小时的样 品中显示出平均荧光强度的 10 倍以上数值的基因， 可以确认 CYS3 基因， CDC48 基因， LYS20 基因， HSP31 基因， ARG5， 6 基因， RPS24A 基因， RPL29 基因， RPL24A 基因， ADH4 基因， MUP1 基 因， RPL11B 基因， THI4 基因， RPL24B 基因， RPS0A 基因， RPL27A 基因， RPL16A 基因， RPS21B 基 因， RPS5 基因， HOM6 基因， PDC5 基因， THI7 基因， MET17 基因， ECM40 基因， ARG1 基因、 ZPS1 基因， IDH2 基因， CDC19 基因、 IPP1 基因， ARF1 基因， RPL28 基因， TRX2 基因， HSP104 基因， AHP1 基因， CIT1 基因， RPS15 基因， ALD4 基因， YPL225X， CCW12 基因。其结果示于表 2。
[ 表 2]
根据该结果， 清楚了在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母一边进行连续 培养中， 培养开始后 50 小时之后基因表达量为全部基因平均相对表达量的 10 倍以上的基 因。
( 实施例 2)ldh 基因向 SED1、 CWP2、 ENO1 基因座的导入
基于实施例 1 中获得的结果， 在 SED1 基因、 CWP2 基因和 ENO1 基因座中导入序列 号 4 记载的 ldh 基因。
向 SED1 基因座的导入， 以参考例 1 制作的 pTRS102 作为扩增模板， 通过以寡核苷 酸 ( 序列号 10， 14) 作为引物对的 PCR， 扩增了含有非洲爪蟾来源的 ldh 基因和 TDH3 终止子 序列的 1.3kb 的 PCR 片段。这里， 序列号 14 被设计成添加了对应于 SED1 基因起始密码子 上游 60bp 的序列。
序列号 14 ：
tattgattta tagtcgtaac tacaaagaca agcaaaataa aatacgttcg ctctattaag
Atggcaactg tgaaggataa actca
接着， 以质粒 pRS423 作为扩增模板， 通过以寡核苷酸 ( 序列号 11， 15) 作为引物对 的 PCR， 扩增了含有作为酵母选择标记的 HIS3 基因的约 1.3kb 的 PCR 片段。这里， 序列号 18 被设计成添加了对应于 SED1 基因终止密码子下游 60bp 的序列。
序列号 15 ：
aaaaaataac ataatactga aagaaagcat taagaaggcg gatgtgtcaa acaccaccgt ctgtgcggta tttcacaccg
用 1％琼脂糖凝胶电泳分离各个 DNA 片段， 按常规方法纯化。 以混合了由此获得的 两种约 1.3kb 片段的混合物作为扩增模板， 通过以寡核苷酸 ( 序列号 14， 15) 作为引物对的 PCR 法， 扩增出了在 5 末端·3 末端分别添加了对应于 SED1 基因上游·下游 60bp 的序列的 连接了非洲爪蟾来源的 ldh 基因、 TDH3 终止子和 HIS3 基因的约 2.6kb 的 PCR 片段。
用 1％琼脂糖凝胶电泳分离上述 PCR 片段， 按常规方法纯化后， 转化 SU014 株， 用未 添加组氨酸的培养基进行培养， 选择出非洲爪蟾来源的 ldh 基因导入在染色体上的 SED1 基 因启动子下游的转化株。
按下述方式对上述获得的转化株为非洲爪蟾来源的 ldh 基因导入在染色体上 SED1 基因启动子下游的酵母进行确认。首先， 用基因组 DNA 提取试剂盒 Gen とるくん (TakaraBio 公司制 ) 制备转化株的基因组 DNA， 以其作为扩增模板， 通过以寡核苷酸 ( 序列 号 16， 17) 作为引物对的 PCR， 确认获得了约 2.9kb 的扩增 DNA 片段。另外， 非转化株中， 通 过上述 PCR 获得了约 1.4kb 的扩增 DNA 片段。以下， 将上述非洲爪蟾来源的 ldh 基因导入 在染色体上 SED1 基因启动子下游的转化株称为 SU015 株。
序列号 16 ：
tagattggcc gtaggggctg
序列号 17 ：
cacgcaacgc gtaagaaaca
然后， 向 CWP2 基因座的导入， 以参考例 1 制作的 pTRS102 作为扩增模板， 通过以寡 核苷酸 ( 序列号 10， 18) 作为引物对的 PCR， 扩增了含有非洲爪蟾来源的 ldh 基因和 TDH3 终 止子序列的 1.3kb 的 PCR 片段。其中， 序列号 21 被设计成添加了对应于 CWP2 基因的起始 密码子上游 60bp 的序列。
序列号 18 ：
cttctcataa tcaagaataa ataacttcat cacattcgct acacactaac aagaaaaaaa
atggcaactg tgaaggataa actca
然后， 以质粒 pRS423 作为扩增模板， 通过以寡核苷酸 ( 序列号 11， 19) 作为引物对 的 PCR， 扩增了含有作为酵母选择标记的 HIS3 基因的 1.3kb 的 PCR 片段。这里， 序列号 19 被设计成添加了对应于 CWP2 基因的终止密码子下游 60bp 的序列。
序列号 19 ：
ctagtaaaac cgaaaatttt gaaaaaagcc atatagatat tataaaaaat cagagatttc
ctgtgcggta tttcacaccg
用 1％琼脂糖凝胶电泳分离各个 DNA 片段， 按常规方法纯化。 以混合了由此获得的 两种约 1.3kb 片段的混合物作为扩增模板， 通过以寡核苷酸 ( 序列号 18， 19) 作为引物对的 PCR 法， 扩增出了在 5 末端·3 末端分别添加了对应于 CWP2 基因的上游·下游 60bp 的序列 的、 连接了非洲爪蟾来源的 ldh 基因、 TDH3 终止子和 HIS3 基因的约 2.6kb 的 PCR 片段。
用 1％琼脂糖凝胶电泳分离上述 PCR 片段， 按常规方法纯化后， 转化 SU014 株， 用组 氨酸非添加培养基培养， 选择出非洲爪蟾来源的 ldh 基因导入在染色体上的 CWP2 基因启动 子下游的转化株。
按下述方式对上述获得的转化株为非洲爪蟾来源的 ldh 基因导入在染色体上 CWP2 基因启动子下游的酵母进行确认。首先， 用基因组 DNA 提取试剂盒 Gen とるくん (TakaraBio 公司制 ) 制备转化株的基因组 DNA， 以其作为扩增模板， 通过以寡核苷酸 ( 序列 号 20， 21) 作为引物对的 PCR， 确认获得了约 2.9kb 的扩增 DNA 片段。另外， 非转化株中， 通 过上述 PCR 获得了约 0.7kb 的扩增 DNA 片段。以下， 将上述非洲爪蟾来源的 ldh 基因导入 在染色体上 CWP2 基因启动子下游的转化株称为 SU016 株。
序列号 20 ：
aaacagagaa atgtaacgtt
序列号 21 ：
cattcgaaga gaaatcacag
然后， 向 ENO1 基因座的导入， 以参考例 1 制作的 pTRS102 作为扩增模板， 通过以寡 核苷酸 ( 序列号 10， 22) 作为引物对的 PCR， 扩增了含有非洲爪蟾来源的 ldh 基因和 TDH3 终 止子序列的 1.3kb 的 PCR 片段。其中， 序列号 22 被设计成添加了对应于 ENO1 基因的起始 密码子上游 60bp 的序列。
序列号 22 ：
ctagctattt ttcataaaaa accaagcaac tgcttatcaa cacacaaaca ctaaatcaaa
atggcaactg tgaaggataa actca
然后， 以质粒 pRS426 作为扩增模板， 通过以寡核苷酸 ( 序列号 11， 23) 作为引物对 的 PCR， 扩增了含有作为酵母选择标记的 URA3 基因的约 1.3kb 的 PCR 片段。这里， 序列号 23 被设计成添加了对应于 ENO1 基因的终止密码子下游 60bp 的序列。
序列号 23 ：
gaaaatgaaa taaatgacaa aaaaacgtgt tttttggact agaaggctta atcaaaagct
ctgtgcggta tttcacaccg
用 1％琼脂糖凝胶电泳分离各个 DNA 片段， 按常规方法纯化。以混合了由此获得 的两种 1.3kb 片段的混合物作为扩增模板， 通过以寡核苷酸 ( 序列号 22， 23) 作为引物对的PCR 法， 扩增出了在 5 末端·3 末端分别添加了对应于 ENO1 基因的上游·下游 60bp 的序列 的、 连接了非洲爪蟾来源的 ldh 基因、 TDH3 终止子和 URA3 基因的约 2.6kb 的 PCR 片段。
用 1％琼脂糖凝胶电泳分离上述 PCR 片段， 按常规方法纯化后， 转化 SU014 株， 用未 添加尿嘧啶的培养基培养， 选择出非洲爪蟾来源的 ldh 基因导入在染色体上 ENO1 基因启动 子下游的转化株。
按下述方式对上述获得的转化株为非洲爪蟾来源的 ldh 基因导入在染色体上 ENO1 基因启动子下游的酵母进行确认。首先， 用基因组 DNA 提取试剂盒 Gen とるくん (TakaraBio 公司制 ) 制备转化株的基因组 DNA， 以其作为扩增模板， 通过以寡核苷酸 ( 序列 号 24， 25) 作为引物对的 PCR， 确认获得了约 2.9kb 的扩增 DNA 片段。另外， 非转化株中， 通 过上述 PCR 获得了约 1.7kb 的扩增 DNA 片段。以下， 将上述非洲爪蟾来源的 ldh 基因导入 在染色体上 ENO1 基因启动子下游的转化株称为 SU017 株。
序列号 24 ：
aaggtatgcc tctccccgga
序列号 25 ：
cggatacacg cgtcaccaca
然后， 在 SU015 株的 ENO1 基因座上导入非洲爪蟾来源的 ldh 基因。非洲爪蟾来源 的 ldh 基因向 SU015 株的 ENO1 基因座的导入和确认， 用上述获得 SU017 株时进行的方法中 除了使用 SU015 株代替 SU014 株之外其余相同的方法进行。 将获得的转化株称为 SU018 株。
( 实施例 3) 乳酸生产酵母的制作 2
3-1 人来源和肠膜明串珠菌来源的 ldh 基因的克隆
接着， 进行序列号 5、 6 中记载的人来源和肠膜明串珠菌来源的 ldh 基因的克隆。 首 先， 人来源的 ldh 基因的克隆方法如下所述。
培养回收人乳癌株化细胞 (MCF-7) 后， 用 TRIZOL 试剂 (Invitrogen 公司制 ) 提取 总 RNA， 以获得的总 RNA 作为模板， 通过采用 SuperScript Choice System(Invitrogen 公司 制 ) 的逆转录反应进行 cDNA 的合成。这些操作的详细内容按照各个自带的操作规程。以 获得的 cDNA 作为后续 PCR 的扩增模板。
以上述操作获得的 cDNA 作为扩增模板， 通过以序列号 26 和序列号 27 表示的寡核 苷酸作为引物对， 通过 KOD-Plus- 聚合酶进行的 PCR， 克隆 ldh 基因。纯化各 PCR 扩增片段， 用 T4 多核苷酸激酶 ( 宝酒造株式会社制 ) 磷酸化末端后， 连接到 pUC118 载体 ( 用限制性 酶 HincII 切断， 对切断面进行了脱磷酸化处理 ) 中。连接用 DNA 连接试剂盒 Ver.2( 宝酒 造株式会社制 ) 进行。用连接质粒产物转化大肠杆菌 DH5α， 回收质粒 DNA， 获得亚克隆了 人来源 ldh 基因 ( 登录号 ： AY009108、 序列号 5) 的质粒。用限制性酶 XhoI 和 NotI 消化获 得的插入了 ldh 基因的 pUC118 质粒， 将获得的各 DNA 片段插入到酵母表达用载体 pTRS11 的 XhoI/NotI 切断部位。这样一来， 获得了人来源 ldh 基因表达质粒 pTRS48。
下面， 肠膜明串珠菌来源的 ldh 基因的克隆方法如下所述。
肠膜明串珠菌来源 ldh 基因， 参考 Res.Microbiol， 146， 291-302(1995) 中记载的 序列 ( 序列号 6)， 通过应用 PCR 法的基因全合成进行克隆。全合成时， 按在 5 末端侧上添 加 XhoI 识别序列， 在 3 末端侧上添加 NotI 识别序列进行， 将 PCR 片段 TA 克隆到 pTA2 载体 中。连接用 DNA 连接试剂盒 Ver.2( 宝酒造株式会公司制 ) 进行。用连接质粒产物转化大肠杆菌 DH5α， 回收质粒 DNA， 获得亚克隆了肠膜明串珠菌来源的 ldh 基因 ( 序列号 6) 的质 粒。用限制性酶 XhoI 和 NotI 消化获得的插入了 ldh 基因的 pTA2 质粒， 将获得的各 DNA 片 段插入到酵母表达用载体 pTRS11 的 XhoI/NotI 切断部位。这样一来， 获得了肠膜明串珠菌 来源的 ldh 基因表达质粒 pTRS152。
3-2 人来源和肠膜明串珠菌来源的 ldh 基因向染色体的导入
接着， 将序列号 5 和 6 中记载的 ldh 基因导入 PDC1 基因、 SED1 基因、 CWP2 基因和 ENO1 基因座。
以质粒 pTRS48 和 pTRS152 作为扩增模板， 通过以序列号 28、 10(pTRS48)， 序列号 29、 10(pTRS152) 表示的寡核苷酸作为引物对的 PCR， 分别扩增出 1.3kb 的含有人来源 ldh 基因和酿酒酵母来源的 TDH3 基因的终止子序列的 DNA 片段， 和含有肠膜明串珠菌来源的 ldh 基因和酿酒酵母来源的 TDH3 基因的终止子序列的 DNA 片段。此外， 通过以质粒 pRS424 作为扩增模板， 以序列号 11 和序列号 12 表示的寡核苷酸作为引物对的 PCR， 扩增出 1.2kb 的含酿酒酵母来源的 TRP1 基因的 DNA 片段。通过 1.5％琼脂糖凝胶电泳分离各个 DNA 片 段， 按常规方法纯化。通过以混合了由此获得的 1.3kb 片段、 1.2kb 片段的混合物作为扩增 模板， 以序列号 28， 12 和序列号 29， 12 表示的寡核苷酸作为引物对的 PCR 法获得的产物， 对 其分别进行 1.5％琼脂糖凝胶电泳， 按照常规方法制备了连接有人来源 LDH 基因和 TRP1 基 因的 2.5kb 的 DNA 片段、 连接有肠膜明串珠菌来源的 ldh 基因和 TRP1 基因的 2.5kb 的 DNA 片段。按照常规方法， 用该 2.5kb 的 DNA 片段转化出芽酵母 NBRC10505 株， 成为色氨酸非需 求性。
按上述方式获得的转化株为人来源的 ldh 基因或肠膜明串珠菌来源的 ldh 基因导 入在染色体上 PDC1 基因启动子下游的酵母的确认按照与参考例 1 所示的方法相同的方法 进行。
然后， 用与参考例 1 相同的方法， 制备人来源 ldh 基因或肠膜明串珠菌来源 ldh 基 因被导入在染色体上 PDC1 基因启动子下游的酵母中， pdc5 基因中具有温度感受性变异的 酵母。分别被称为 SU019 株、 SU024 株。
向 SED1、 CWP2、 ENO1 基因座的导入用与实施例 2 相同的方法， 改变引物进行。改变 的引物如下所述。
SED1 基因座导入用引物
为人来源 ldh 基因时用序列号 30 代替实施例 2 中使用的序列号 14 的引物， 为肠 膜明串珠菌来源的 ldh 基因时， 变化成序列号 33 的引物， 用获得的 PCR 片段， 将 SU019， 024 株分别转化成组氨酸非需求型。将获得的转化株分别称为 SU020 株 ( 人来源 ldh 基因导入 株 )， SU025 株 ( 肠膜明串珠菌来源的 ldh 基因导入株 )。
CWP2 基因座导入用引物
为人来源 ldh 基因时用序列号 31 代替实施例 2 中使用的序列号 18 的引物， 为肠 膜明串珠菌来源的 ldh 基因时， 将序列号 31 换成序列号 34 的引物， 用获得的 PCR 片段分别 转化 SU019， 024 株成组氨酸非需求型。将获得的转化株分别称为 SU021 株 ( 人来源 ldh 基 因导入株 )， SU026 株 ( 肠膜明串珠菌来源的 ldh 基因导入株 )。
ENO1 基因座导入用引物
为人来源 ldh 基因时用序列号 32 代替实施例 2 中使用的序列号 22 的引物， 为肠膜明串珠菌来源的 ldh 基因时， 变成序列号 35 的引物， 用获得的 PCR 片段， 分别转化 SU019， 024 株成尿嘧啶非需求型。将获得的转化株分别称为 SU022 株 ( 人来源 ldh 基因导入株 )， SU027 株 ( 肠膜明串珠菌来源的 ldh 基因导入株 )。再将 SU020， 025 株同样转化成尿嘧啶 非需求型型， 分别获得了 SU023 株 ( 人来源 ldh 基因导入株 )， SU028 株 ( 肠膜明串珠菌来 源的 ldh 基因导入株 )。
( 实施例 4) 通过分批培养进行的乳酸发酵试验
使用参考例 1(SU014) 和实施例 2、 3 中获得的 SU015 ～ SU028 株， 通过分批培养进 行乳酸发酵试验。将表 1 所示的乳酸发酵培养基置于 10mL 试管中， 在其中分别接种少量的 SU014 ～ SU028 株， 于 30℃培养一晚 ( 前前培养 )。然后， 将新鲜的表 1 所示的 100mL 乳酸 发酵培养基装入容量为 500ml 的三角烧瓶， 将各前前培养液分别总量接种， 30℃振荡培养 24 小时 ( 前培养 )。然后， 在投入了 1L 表 1 所示的乳酸发酵培养基的小型发酵罐 ( 丸菱バ イオエンジ社制， 容量 5L) 中分别接种所有前培养开始 24 小时后的前培养液， 使搅拌速度 (120 转 / 分钟 )、 通气量 (0.1L/ 分钟 )、 温度 (30℃ )、 pH(pH5) 维持一定， 进行培养 ( 本培 养 )。而且， 用 1NNaOH 进行中和， 用天秤测定重量变化， 测量投入量。对本培养开始后 40 小 时的培养液进行离心分离， 对获得的上清进行膜过滤后， 按参考例 1 所示的方法， 计算乳酸 蓄积浓度。葡萄糖浓度的测定采用 “葡萄糖 Test WakoC” ( 注册商标 )( 和光纯药公司制 )。
根据测定结果计算出的乳酸的对糖收率示于表 3。 此外， 用参考例 1 所示的方法测 定乳酸的光学纯度的结果是， SU014 ～ 023 中只检测到 L- 乳酸， D- 乳酸在检测限界以下， SU024 ～ 028 中只检测到 D- 乳酸， L- 乳酸在检测限界以下。
[ 表 3]
根据该结果， 可以确认， 在酵母中导入了在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力 的酵母一边进行连续培养中、 培养开始后 50 小时之后基因表达量为全部基因平均相对 表达量的 10 倍以上的基因的启动子下游具有 ldh 基因的乳酸脱氢酶表达盒的 SU015 ～ SU018( 非洲爪蟾来源的 ldh 基因导入株 )、 SU020 ～ 024( 人来源 ldh 基因导入株 )、 SU025 ～ 028( 肠膜明串珠菌来源的 ldh 基因导入株 ) 中， 分别与 SU014、 SU019、 SU024 相比， 均获得 了高乳酸收率。
( 实施例 5) 通过连续培养进行的乳酸发酵试验
用实施例 2、 3 获得的转化酵母 SU015 ～ 028， 通过图 1 所示的连续培养装置进行过 滤连续培养。使用表 1 所示组成的乳酸发酵培养基的葡萄糖浓度改变成 70g/L 的培养基作 为培养基。该培养基在 121℃高压 (2 个大气压 ) 蒸气灭菌处理 15 分钟后再使用。作为分 离膜元件部件， 使用不锈钢和聚砜树脂的成型品。使用参考例 2 中制作的多孔性膜作为分 离膜。本实施例中的运转条件只要没有预先特别说明， 为如下条件。
反应槽容量 ： 2(L)
发酵反应槽容量 ： 1.5(L)
使用分离膜 ： PVDF 过滤膜 ( 参考例 2 中制作 )
膜分离元件有效过滤面积 ： 120 平方 cm
温度调整 ： 30(℃ )
发酵反应槽通气量 ： 空气 0.01(L/ 分钟 )、 氮气 0.19(L/ 分钟 )
发酵反应槽搅拌速度 ： 800( 转 / 分钟 )
pH 调整 ： 用 5N 氢氧化钙调整到 pH5
消泡剂 ： 每 3 小时添加 200μl 灭菌的消泡剂 PE-L( 和光纯药公司制 )
灭菌 ： 含有分离膜元件的培养槽和使用的培养基全都用的高压灭菌器进行 121℃、 20 分钟的高压蒸气灭菌
首先， 在试管中用 10ml 表 1 所示的乳酸发酵培养基振荡培养 SU015 ～ SU028 株 一晚 ( 前前前培养 )。在新鲜的表 1 所示的 100ml 乳酸发酵培养基中分别接种所有获得的 培养液， 用 500ml 容坂口烧瓶， 30℃振荡培养 24 小时 ( 前前培养 )。将前前培养液接种于 图 1 所示的连续培养装置的 1.5L 的乳酸发酵培养基中， 用附带的搅拌机 5 以 400 转 / 分钟 搅拌反应槽 1， 进行反应槽 1 的通气量的调整、 温度调整、 pH 调整， 进行 24 小时培养 ( 前培 养 )。前培养结束后， 立即进行乳酸发酵培养基的连续供给， 一边控制膜透过水量以使得连 续培养装置的发酵液量达 1.5L， 一边进行连续培养， 通过连续培养进行乳酸的制造。适当 地， 测定膜透过发酵液中生产的乳酸浓度和残存葡萄糖浓度。乳酸蓄积浓度的测定用参考 例 1 所示的方法进行， 葡萄糖浓度测定采用 “葡萄糖 Test Wako C” ( 注册商标 )( 和光纯药 公司制 )。 此外， 根据该乳酸和由葡萄糖浓度计算出的投入葡萄糖， 求出乳酸对糖收率、 乳酸 生产速度， 与参考例 1 的结果一起示于表 4、 表 5。计算用式 3 进行， 表中的时间表示培养开 始后经过的时间。
[ 表 4]
[ 表 5]
其结果表明， 在酵母中导入了在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母一边 进行连续培养中， 培养开始后 50 小时之后基因表达量为全部基因平均相对表达量的 10 倍 以上的基因的启动子下游具有 ldh 基因的乳酸脱氢酶表达盒的 SU015 ～ SU018、 SU020 ～ 023 和 SU025 ～ 028 株中， 直到 300 小时都能够稳定维持高收率和高生产速度。另一方面， 在参考例 1(SU014) 和 SU019、 SU024 株中， 如果超过 200 小时， 收率·乳酸生产速度急速减 少。此外， 按参考例 1 所示的方法测定各样品的光学纯度时， SU014 ～ 023 中只检测到 L- 乳 酸， D- 乳酸在检测限界以下， 在 SU024 ～ 028 中只检测到 D- 乳酸， L- 乳酸在检测限界以下。
背景技术
近年来， 在向资源循环型社会构建的趋势下， 以植物等的生物量作为原料的聚合 物备受关注。这其中， 已经清楚了， 聚乳酸 ( 以下有时简称为 “PLA” ) 作为生物量原料的聚 合物具有优异的性质。
PLA 的 原 料 乳 酸，通 过 培 养 以 乳 杆 菌 属 (Lactobacillus) 和 乳 球 菌 属 (Lactococcus) 为代表的总称为所谓乳酸菌的微生物来制造。 使用乳酸菌的乳酸的生产， 其 由糖产生的乳酸收率和乳酸生产速度优异。但是， 获得的乳酸为 L- 乳酸和 D- 乳酸的混合 物。因此， 在光学纯度上存在问题。在 PLA 生产中使用的乳酸需要高光学纯度。
人们尝试制造光学纯度高的乳酸。例如， 人们尝试了采用转化酵母， 生产 L- 乳酸 和 D- 乳酸 ( 例如， 专利文献 1-3， 非专利文献 1)。酵母原本不具有生产乳酸的能力。在这 些文献中报道了， 通过基因重组技术， 将编码将丙酮酸转化为乳酸的乳酸脱氢酶的基因导 入酵母， 获得了光学纯度非常高的乳酸。另一方面， 在通过酵母进行的乳酸生产中， 乳酸收 率、 乳酸生产速度都比乳酸菌要差。因此， 为了使用酵母以低成本生产乳酸， 需要同时提高 乳酸收率、 乳酸生产速度。
为了使乳酸收率、 乳酸生产速度一起提高， 开发了一边用分离膜过滤具有乳酸生 产能力的酵母， 一边进行培养的技术 ( 参照例如专利文献 4)。但是， 即使采用这种技术， 也 存在在培养过程中乳酸收率、 乳酸生产速度都逐渐降低的问题。
专利文献 1 ： 特表 2001-516584 号公报
专利文献 2 ： 特开 2003-93060 号公报
专利文献 3 ： 特开 2005-137306 号公报
专利文献 4 ： 国际公开第 2007/97260 号小册子
非专利文献 1 ： Ishida， Takahashi 等人， J.Biosci.Bioeng， 101(2)， p.172-177， (2006) 发明内容 发明要解决的问题
本发明鉴于上述问题， 其目的在于提供使得同时实现高的光学纯度、 乳酸收率和 乳酸生产速度成为可能的、 在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母一边进行连续培 养中为了防止乳酸收率和乳酸生产速度降低所必要的编码乳酸脱氢酶的基因表达盒、 具有 该盒的酵母和培养该酵母而制造乳酸的方法。
用于解决问题的方法
本发明鉴于上述问题， 其目的在于提供使得同时实现高的光学纯度、 乳酸收率和 乳酸生产速度成为可能的、 在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母一边进行连续培 养中为了防止乳酸收率和乳酸生产速度降低所必要的编码乳酸脱氢酶的基因表达盒、 具有 该盒的酵母和培养该酵母而制造乳酸的方法。
用于解决问题的方法
本发明人为了解决上述问题， 进行了积极的研究， 结果发现， 在一边用分离膜过滤 具有乳酸生产能力的酵母一边进行连续培养中， 通过一边用分离膜过滤具有乳酸脱氢酶表 达盒的酵母， 其中所述乳酸脱氢酶表达盒含有培养开始后 50 小时以后基因表达量为全部 基因平均相对表达量的 5 倍以上的基因的启动子， 一边进行培养， 能够不导致乳酸收率和 乳酸生产速度降低， 稳定地长时间连续培养， 从而完成了本发明。
也就是说， 本发明为一种在启动子的下游连接了编码乳酸脱氢酶的基因的乳酸脱 氢酶表达盒， 其特征在于该启动子是在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母一边进 行连续培养中， 培养开始后 50 小时之后基因表达量为全部基因平均相对表达量的 5 倍以 上的基因的启动子。优选前述启动子为指数缺陷的抑制 (suppression of exponential defect)1 基因 (SED1 基因 )、 细胞壁关联蛋白质 2 基因 (CWP2 基因 ) 或烯醇化酶 1 基因 (ENO1 基因 ) 的启动子， 更优选地为包含选自以下 (a) ～ (c) 的碱基序列的启动子。
(a) 包含序列号 1 ～ 3 任一项所示的碱基序列的启动子 ；
(b) 包含与含有序列号 1 ～ 3 任一项所示的碱基序列或其一部分的碱基序列在严 格条件下杂交的碱基序列的启动子 ；
(c) 包含在序列号 1 ～ 3 任一项记载的碱基序列中， 缺失、 替代和 / 或添加了 1 个 或多个碱基的碱基序列的启动子。 根据本发明的其它优选方式为含有以下的选自 (a) 组的启动子和选自 (b) 组的编 码乳酸脱氢酶的基因的乳酸脱氢酶表达盒。
(a)
(1) 包含序列号 1 ～ 3 任一项所示的碱基序列的启动子 ；
(2) 包含与含有序列号 1 ～ 3 任一项所示的碱基序列或其一部分的碱基序列在严 格条件下杂交的碱基序列的启动子 ；
(3) 包含在序列号 1 ～ 3 任一项所示的碱基序列中缺失、 替代和 / 或添加了 1 个或 多个碱基的碱基序列的启动子 ；
(b)
(1) 包含序列号 4 ～ 6 任一项所示碱基序列的编码乳酸脱氢酶的基因 ；
(2) 包含与含有序列号 4 ～ 6 任一项所示的碱基序列或其一部分的碱基序列在严 格条件下杂交的碱基序列的编码乳酸脱氢酶的基因 ；
(3) 包含在序列号 4 ～ 6 任一项所示的碱基序列中缺失、 替代和 / 或添加了 1 个或 多个碱基的碱基序列的编码乳酸脱氢酶的基因。
本发明的其它优选方式为在染色体中具有至少一个上述任一乳酸脱氢酶表达盒 的转化酵母。优选地， 选自指数缺陷的抑制 1 基因 (SED1 基因 )、 细胞壁关联蛋白质 2 基因 (CWP2 基因 ) 或烯醇化酶 1 基因 (ENO1 基因 ) 的至少一个基因被上述乳酸脱氢酶表达盒替 代的酵母。
上述转化酵母优选属于酵母属 (Genus Saccharomyces)。上述转化酵母如果是酿 酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)， 则更为优选。
此外， 本发明还提供了包括培养上述转化酵母的培养步骤的乳酸的制造方法。优 选地， 前述培养步骤为用分离膜过滤培养液、 从滤液中回收乳酸、 再将未滤过液保持在或返 流到培养液中， 并在培养液中追加培养基的连续培养。
发明的效果
本发明中， 一边用分离膜过滤具有乳酸脱氢酶表达盒的酵母一边进行培养， 其中 所述乳酸脱氢酶表达盒包含在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母一边进行连续 培养中， 培养开始后 50 小时之后基因表达量为全部基因平均相对表达量的 5 倍以上的基因 的启动子。其结果是， 能够以高收率、 高生产速度、 长时间稳定地进行高光学纯度的乳酸的 生产。
附图的简要说明
[ 图 1] 图 1 是用于说明本发明中使用的膜分离型的连续发酵装置的一个实施方式 的概要侧面图。
[ 图 2] 图 2 是用于说明能够在本发明中使用的其它膜分离型连续发酵装置的一个 实施方式的概要侧面图。
[ 图 3] 图 3 是用于说明本发明中使用的分离膜元件的一个实施方式的概要斜视 图。
[ 图 4] 图 4 是用于说明本发明中使用的其它分离膜元件的其它实施方式的概要斜 视图。
[ 图 5] 图 5 是用于说明表达载体 pTRS11 的图。
符号的说明
1 发酵反应槽
2 分离膜元件 2
3 水位差控制装置
4 第 2 标签序列
5 搅拌机
6 液位传感器
7 培养基供给泵
8 pH 调整溶液供给泵
9 pH 传感器·控制装置
10 温度调节器
11 发酵培养液循环泵
12 膜分离槽
13 支持板
14 流路材料
15 分离膜
16 凹部
17 集水管
18 分离膜束
19 上部树脂密封层
20 下部树脂密封层
21 支持框
22 集水管用于实施发明的最佳方式
[ 乳酸脱氢酶表达盒 ]
本发明的乳酸脱氢酶表达盒是编码乳酸脱氢酶的基因 (ldh 基因 ) 连接在启动子 下游的乳酸脱氢酶 (LDH ： 乳酸脱氢酶， 以下称为 “LDH” ) 表达盒， 在一边用分离膜过滤具有 乳酸生产能力的酵母一边进行连续培养中， 前述启动子为培养开始后 50 小时之后基因表 达量为全部基因平均相对表达量的 5 倍以上的基因的启动子的乳酸脱氢酶表达盒。
本说明书中所谓 “ldh 基因”是指编码具有将还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 和丙酮酸转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD+) 和 L- 乳酸或 NAD+ 和 D- 乳酸 的活性的 LDH 的基因。
作为本发明中使用的 ldh 基因， 只要是编码具有上述活性的 LDH 的 ldh 基因， 可以使用任意一种， 但优选是乳酸菌和枯草杆菌等细菌来源的 ldh 基因和人、 牛、 青蛙、 疟原虫等真核生物来源的 ldh 基因。这其中， 作为细菌来源， 可以适当使用干酪乳杆 菌 (Lactobacillus casei)， 植 物 乳 杆 菌 (Lactobacillus plantarum)， 保加利亚乳杆 菌 (Lactobacillus bulgaricus)， Lactobacillus sasei， 德 氏 乳 杆 菌 (Lactobacillus delbrueckii)， 约 氏 乳 杆 菌 (Lactobacillus johnsonii)， 瑞 士 乳 杆 菌 (Lactobacillus helveticus)， 弯 曲 乳 杆 菌 (Lactobacillus curvatus)， 嗜 酸 乳 杆 菌 (Lactobacillus acidophilus)， 肠膜明串珠菌 (Leuconostoc mesenteroides)、 乳明串珠菌 (Leuconostoc lactis)、 乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis)， 戊糖片球菌 (Pediococcus pentosaceus)， 乳 酸 片 球 菌 (Pediococcus acidilactici)， 枯 草 芽 孢 杆 菌 (Bacillus subtilis)， 嗜热 脂肪芽孢杆菌 (Bacillus stcarothermophilus) 来源的 ldh 基因。此外作为真核生物 来源， 可以适当使用米根霉 (Rhizopus oryzae)， 人 (Homo sapiens)， 牛 (Bos taurus)， 非 洲 爪 蟾 (Xenopus laevis)， 家 犬 (Canis familiaris)、 密 西 西 比 短 吻 鳄 (Alligator mississippiensis)、 灰 色 短 尾 负 鼠 (Monodelphis domestica)、 中 华 鳖 (Pelodiscus sinensis)、 白斑角鲨 (Squalus acanthias)、 恶性疟原虫 (Plamodium falciparum)、 间日 疟原虫 (Plamodium vivax)、 三日疟原虫 (Plamodium marariae)、 蛋形疟原虫 (Plamodium ovale) 来源的 ldh 基因。
本发明中使用的 ldh 基因中还包括由于遗传多态性和诱变等产生的变异型基 因。这里所谓的遗传多态性， 是由于基因上的自然突变导致基因的碱基序列部分发生变 化。此外， 所谓诱变， 是指通过人工在基因中导入变异， 例如， 使用定点诱变导入用试剂盒 (Mutan-K(TakaraBio 公司制 )) 的方法、 使用随机突变导入用试剂盒 (BD Diversify PCR Random Mutagenesis(CLONTECH 公司制 )) 的方法等进行。
作为本发明中使用的克隆 ldh 基因的方法， 没有特别的限制， 可以使用已知的方 法。 例如， 基于已知的基因信息， 可以列举使用 PCR( 聚合酶链反应 ) 法扩增取得必需的遗传 区域的方法， 以同源性和酶活性为指标从基因组文库或 cDNA 文库中克隆的方法等。此外， 还可以是基于已知的蛋白质信息化学合成或基因工程合成的方法。
作为本发明中使用的乳酸脱氢酶 (LDH) 表达盒， 只要是在具有该 LDH 表达盒的细 胞内， 由 ldh 基因经 mRNA 能够表达 LDH 的碱基序列即可， 并没有特别限定。优选为连续具 有启动子、 ldh 基因和终止子的碱基序列。这里， 所谓终止子， 是指使由基因向 mRNA 转录终 止的序列， 通常是指存在于染色体中的基因的 3 末端侧的下游序列。本发明中使用的 “具有乳酸生产能力的酵母” ， 是可以通过同化葡萄糖、 蔗糖、 果糖 等糖来生产乳酸的酵母， 优选是通过基因重组导入了 ldh 基因的酵母。
这里， 对向酵母导入 ldh 基因的方法进行说明。作为向酵母导入 ldh 基因的方法， 可以列举在表达载体中整合有 ldh 基因的 ldh 基因表达载体转化酵母的方法、 在染色体上 的目标位置通过同源重组插入 ldh 基因的方法、 或通过非同源重组在染色体中随机插入 ldh 基因的方法等。
作为整合 ldh 基因的表达载体， 可以使用广泛应用于酵母的表达载体。广泛应用 于酵母的表达载体是指具有酵母细胞内自主复制所必需的序列、 大肠杆菌细胞内自主复制 所必需的序列、 酵母选择标记和大肠杆菌选择标记， 而且为了使整合的 ldh 基因表达， 理想 的是还具有调节其表达的操纵基因、 启动子、 终止子或增强子等所谓的调节序列。
这里， 所谓酵母细胞内自主复制所必需的序列， 是指例如酵母的自主复制起始点 (ARS1) 和着丝粒序列的组合、 或酵母的 2μm 质粒的复制起始点的序列。所谓大肠杆菌内 自主复制所必需的序列， 是例如大肠杆菌的 ColE1 复制起始点的序列。此外， 作为酵母选 择标记， 可以列举 URA3 或 TRP1 等营养需求性互补基因或 G418 抗性基因或新霉素抗性基 因等耐药基因。 大肠杆菌的选择标记可以列举氨苄青霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因等 抗生素抗性基因。作为调节序列， 只要是可以表达 ldh 基因的调节序列， 则没有特别限制， 作为一个例子， 可以列举酸性磷酸酶基因 (PHO5)、 甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶基因 (TDH1， 2， 3)、 醇脱氢酶基因 (ADH1， 2， 3， 4， 5， 6， 7) 基因、 半乳糖代谢类基因 (GAL1， 7， 10)、 细胞色素 c 基 因 (CYC1)、 磷酸丙糖异构酶基因 (TPI1)、 磷酸甘油酸激酶基因 (PGK1)、 磷酸果糖激酶基因 (PFK1)、 丙酮酸脱羧酶基因 (PDC1， 5， 6) 等的启动子序列和 TDH3 基因等的终止子序列。然 而， 表达载体并不限于此。
通过在上述表达载体的启动子下游导入 ldh 基因， 可以获得能够表达 ldh 基因的 载体。通过用后述的方法将获得的 ldh 基因表达载体转化酵母， 可以在酵母中导入 ldh 基 因。
此外， 通过在染色体中插入 ldh 基因， 能够在酵母中导入 ldh 基因。在染色体中插 入 ldh 基因的方法没有特别限制， 有以下方法， 如通过后述的方法将含有 ldh 基因的 DNA 转 化酵母， 通过非同源重组将 ldh 基因插入到染色体中随机的位置处的方法， 通过同源重组 将含有 ldh 基因的 DNA 导入到目标位置的方法等。优选的是通过同源重组的方法。
作为将含有 ldh 基因的 DNA 通过同源重组插入染色体中目的位置的方法， 可以列 举使用被设计成在含有 ldh 基因的 DNA 的上游和下游添加与导入目的位置同源的部分的引 物进行 PCR， 用后述方法将获得的 PCR 片段转化酵母的方法， 但不限于此。 此外， 为了容易地 进行转化株选择， 优选在上述 PCR 片段中含有酵母选择标记。
这里使用的调整 PCR 片段的方法， 可以通过例如下述 (1) ～ (3) 的步骤 1 ～ 3 的 步骤进行。而且， 这里， 对于在丙酮酸脱羧酶 1 基因 (PDC1 基因 ) 启动子下游导入 ldh 基因 的方法进行例示。
(1) 步骤 1 ： 以在 ldh 基因的下游连接了终止子的质粒作为模板， 以引物 1， 2 作为 引物对， 通过 PCR 扩增含有 ldh 基因和终止子的片段。这里， 引物 1 被设计成添加 40bp 以 上与 PDC1 基因的上游侧同源的序列， 基于来源于质粒中终止子下游的序列来设计引物 2。
(2) 步骤 2 ： 以具有酵母选择标记的质粒例如 pRS424、 pRS426 等作为模板， 以引物3， 4 作为引物对， 通过 PCR 扩增含有酵母选择标记的片段。这里， 引物 3 被设计成添加 30bp 以上与步骤 1 的 PCR 片段的终止子下游序列具有同源性的序列， 引物 4 被设计成添加 40bp 以上与 PDC1 基因的下游侧同源的序列。
(3) 步骤 3 ： 通过以步骤 1， 2 中获得的 PCR 片段的混合物作为模板， 以引物 1， 4作 为引物对， 进行 PCR， 获得了在两末端添加了对应于 PDC1 基因的上游侧和下游侧的序列的 含有 ldh 基因、 终止子和酵母选择标记的 PCR 片段。
此外， 在作为 LDH 表达盒导入染色体时， 上述步骤 1 中使用的 PCR 模板质粒， 采用 携带了任意启动子、 ldh 基因和终止子的质粒， 引物 1 只要被设计成在导入目的位置添加 40bp 以上的同源序列， 且能够扩增启动子、 ldh 基因、 终止子即可。
在酵母中导入上述获得的 ldh 基因表达载体或 PCR 片段时， 可以使用转化、 转导、 转染、 共转染或电穿孔等方法。具体有例如， 采用醋酸锂的方法和原生质体法等。
作为获得的转化株的培养方法， 可以使用例如， 记载于 M.D.Rose 等人， “Methods In Yeast Genetics” ， Cold Spring Harbor Laboratory Press(1990) 等中的已知的方法。 导入了 ldh 基因表达载体或 PCR 片段的酵母， 可以根据表达载体或 PCR 片段具有的酵母选 择标记， 通过在营养非添加培养基或药剂添加培养基中培养进行选择。 本发明的所谓 “一边用分离膜过滤一边进行连续培养” 是指， 用分离膜过滤培养 液， 从滤液中回收生产物， 与此同时将未滤过液保持在或返流到前述培养液中， 并且在前述 培养液中追加发酵原料的连续培养。使用的分离膜优选为多孔性膜， 并希望其不容易发生 培养时使用的酵母导致的堵塞， 而且过滤性能具有长期间稳定持续的性能。本发明中使用 的分离膜的材质为陶瓷或有机高分子， 优选为有机高分子。
接着， 就本发明中的 “基因表达量为全部基因平均相对表达量的 5 倍以上的基因” 进行说明。本发明中所谓基因表达量， 是指由基因转录的信使 RNA(mRNA) 量， 所谓全部基因 的平均相对表达量， 优选登录在酵母属基因组数据库 (http://www.yeastgenome.org/) 的 全部基因的平均表达量， 即使缺少 1 个或多个基因也没关系。也就是说， 所谓 “基因表达量 为全部基因平均相对表达量的 5 倍以上的基因” 是指 mRNA 量为全部基因的平均 mRNA 量的 5 倍以上的基因。此外， 本发明的本质在于使用基因表达量更多的基因的启动子， 因此优选 基因表达量为全部基因平均相对表达量的 7 倍以上、 更优选 10 倍以上的基因。
本发明中， 作为测定全部基因的平均相对表达量的方法， 可以列举 Northern 印迹 法、 qPCR( 定量 PCR) 法、 实时 PCR 法或 DNA 微阵列法等。前面 3 种方法是通常测定各个基 因表达量的方法
， 而 DNA 微阵列法中， 进行固定在阵列上的探针和预先用荧光标识的 mRNA 之间的 杂交， 通过用专用扫描仪测定荧光强度， 可以同时测定携带在阵列上的全部基因的表达量， 因此优选 DNA 微阵列法。在用扫描仪进行的荧光强度的测定中， 理想的是用发生荧光强度 的饱和度的斑点数尽可能少， 而且全体荧光强度提高的激光强度进行测定。这种激光强度 在每份测定样本都不同， 可以通过简单的研究来测定。
作为本发明中使用的 DNA 微阵列， 只要是携带了酵母全部基因的微阵列即可， 没 有特别的限制， 可以合适地使用 Affymetrix 公司制造的 “GeneChip”或东丽公司制造的 “3D-Gene” 等。优选 “3D-Gene” 。
这里， 将 “基因表达量为全部基因平均相对表达量的 5 倍以上的基因” 定义为， 使
用 DNA 微阵列测定全部基因的荧光强度， 显示比这些基因的平均值大 5 倍以上的值的基因。 而且， 将 “基因表达量为全部基因平均相对表达量的 7 倍以上的基因” 定义为显示出大 7 倍 以上的值的基因。此外， 还将基因表达量为全部基因平均相对表达量的 10 倍以上的基因” 定义为显示出大 10 倍以上的值的基因。
本发明中， 所谓在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母一边进行连续培养 中， 培养开始后 50 小时之后基因表达量为全部基因平均相对表达量的 5 倍以上的基因的启 动子是指， 在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母一边进行连续培养中， 培养开始 后 50 小时之后的某个时间点， 取样酵母， 使用从该酵母提取的全 RNA， 通过用上述 DNA 微阵 列进行测定能够确定的基因的启动子。
本发明中所谓 “启动子” ， 是指与由基因向 mRNA 的转录开始相关的碱基序列， 通常 是指存在于染色体中的基因的 5 末端侧的上游序列。作为启动子的碱基序列长度， 优选为 1 ～ 3000bp、 更优选 1 ～ 1000bp， 只要是能够起始存在于下游的基因的 mRNA 转录的碱基序 列即可， 没有特别限定。此外， 使启动子的转录活性提高的变异和操作是已知的， 本发明中 还包括通过已知方法改变的启动子。
本发明中， 作为在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母一边进行连续培养 中， 培养开始后 50 小时后基因表达量为全部基因平均相对表达量的 5 倍以上、 优选 7 倍以 上、 更优选 10 倍以上的基因的启动子， 可以列举 CDC19( 细胞分裂周期 19) 基因， IPP1( 无机 焦磷酸酶 1) 基因、 ARF1(ADP- 核糖基化因子 1) 基因， CUP5 基因、 RPL28( 核糖体蛋白 L28) 基因、 TRX2( 硫氧还蛋白 2) 基因， HSP104( 热休克蛋白 104) 基因， AHP1( 烷基过氧化氢还原 酶 1) 基因， YMR122W-A， CIT1( 柠檬酸合酶 1) 基因， RPS15( 核糖体蛋白 S15) 基因， ALD4( 醛 脱氢酶 4) 基因， YPL225W， HSP26( 热休克激蛋白 26) 基因， PGK1( 磷酸甘油酸激酶 1) 基因， SED1( 指数缺陷的抑制 1) 基因， MFA1( 交配因子 1) 基因， HYP2( 含 hypusine 的蛋白质 2) 基 因， HSP12( 热休克蛋白 12) 基因， QCR6( 泛醇细胞色素 C 还原酶复合物 6) 基因， HXK1( 己糖 激酶 1) 基因， TDH3( 甘油醛 3 磷酸脱氢酶 3) 基因， ENO1( 烯醇化酶 1) 基因， BGL2(β 葡聚糖 酶 2) 基因， YJL133C-A， QCR8( 泛醇细胞色素 C 还原酶复合物 8) 基因， FBA1( 果糖 1， 6- 二磷 酸醛缩酶 1) 基因， CWP2( 细胞壁关联蛋白质 2) 基因， CCW12( 细胞壁关联蛋白质 12) 基因， TMA10( 翻译机制相关蛋白 10) 基因， SIP18 基因， HOR7( 高渗透压应答 7) 基因， CCW14( 细 胞壁关联蛋白质 14) 基因， PIR3( 含内部重复的蛋白 13) 基因， CYS3( 胱硫醚酶 3) 基因， CDC48( 细胞分裂周期 48) 基因， LYS20( 高柠檬酸合酶 20) 基因， HSP31( 热休克蛋白 31) 基 因， ARG5， 6( 乙酰谷氨酸激酶 5， 6) 基因， RPS24A(40S 核糖体蛋白 S24) 基因， RPL29( 核糖体 蛋白 L29) 基因， RPL24A( 核糖体蛋白 L24) 基因， ADH4( 醇脱氢酶 4) 基因， MUP1( 蛋氨酸吸 收 1) 基因， RPL11B( 核糖体蛋白 L11B) 基因， THI4( 硫胺生合成 4 基因 ) 基因， RPL24B( 核糖 体蛋白 L24B) 基因， RPS0A(40S 核糖体蛋白质 SA) 基因， RPL27A( 核糖体蛋白质 L27A) 基因， RPL16A( 核糖体蛋白质 L16A) 基因， RPS21B(40S 核糖体蛋白质 S21B) 基因， RPS5(40S 核糖 体蛋白质 S5) 基因， HOM6( 高丝氨酸脱氢酶 6) 基因， PDC5( 丙酮酸脱羧酶 5) 基因， THI7( 硫 胺生合成 7) 基因， MET17( 半胱氨酸合酶 17) 基因， ECM40( 氨基酸 N- 乙酰基转移酶 40) 基 因， ARG1( 精氨酸酶 1) 基因、 ZPS1( 锌·pH/ 调控的表层蛋白质 1) 基因， IDH2( 异柠檬酸脱 氢酶 2) 基因的启动子， 尤为优选 SED1 基因、 CWP2 基因或 ENO1 基因的启动子。
更优选为包含选自以下 (a) ～ (c) 的碱基序列的启动子，(a) 包含下述序列号 1 ～ 3 任一项所示的碱基序列的启动子 ；
(b) 包含与含有下述序列号 1 ～ 3 任一项所示的碱基序列或其一部分的碱基序列 在严格条件下杂交的碱基序列的启动子 ；
(c) 包含在下述序列号 1 ～ 3 任一项所示的碱基序列中缺失、 替代和 / 或添加了 1 个或多个碱基的碱基序列的启动子。
序列号 1 ： (SED1 基因 ： 酿酒酵母来源 )
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说明书9/32 页attctcttct tgccatccct tttcctatct ttgttctttt ataacttcat cacattcgct acacactaac aagaaaaaaa 序列号 3 ： (ENO1 基因 ： 酿酒酵母来源 ) tagaaagcat actatactat tcgacacttc ctttcaatcc aaaaaagaca tctaccgtga aggtgccgta gagtatcgcg gatatacgcc gcggaaacca ggcaaacaat tgaaaagaaa atcgaagccg tctagagtta ccactagtca gatgccgcgg cagcaataac acaacacaat ggttagtagc aacctgaatt tgccgtgaag cgggacaacc agaaaagtcg tctataaatg ggcggggttt taagagtgca tatcacaaat tgtcgcatta cattacttga cgcaaaagcg tttgaaataa tgacgaaaaa aaataccgct tctaggcggg ttatctactg atccgagctt cacctgcata tttggacgac ctttacttac accaccaaaa ccctgataac gtccactaat tgagcgatta cctgagcggt agacttgcat actgcaaatc gtaagtagca acgtctcaagcttctcataa tcaagaataatggaattaac ttaccatatc aattttgagg gcacttgagc cggtcattga ccggcacgtg ccgcggaacc gaaggaagaa ccactaggat accactttcg cctcttttgt gtcaaaactgagtcactttt gccaaaaact aactctctgc acctcatgca tgcatgcatg cgatcatcgt gccagatatt aaaaaaagaa agcacccaaa cctctcccgc ttgcagcatg tatggaaaccttgtcacctc acttaattct agctagccta ccctgcaagt caagaggtct ccgtgattcc
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而且， 本说明书中， 所谓 “严格条件” ， 是指与其它序列相比较而言探针以更大的程 度 ( 例如比背景大至少 2 倍 ) 与其目标序列杂交的条件。严格条件为序列依存性， 根据进 行杂交的环境而不同。这里， 作为严格条件， 是在 50％甲酰胺存在下， 杂交温度为 37℃， 更 严格的条件为约 42℃。进一步严格条件为在甲酰胺存在下， 杂交温度为约 65℃。
本发明为含有上述任一启动子的乳酸脱氢酶表达盒。
此外， 本发明为含有以下的选自 (a) 组的启动子和选自 (b) 组的编码乳酸脱氢酶 的基因的乳酸脱氢酶表达盒，
(a)
(1) 包含上述序列号 1 ～ 3 任一项所示的碱基序列的启动子，
(2) 包含与上述含有序列号 1 ～ 3 任一项所示的碱基序列或其一部分的碱基序列 在严格条件下杂交的碱基序列的启动子，
(3) 包含在上述序列号 1 ～ 3 任一项所示的碱基序列中缺失、 替代和 / 或添加了 1 个或多个碱基的碱基序列的启动子，
(b)
(1) 包含下述序列号 4 ～ 6 任一项所示碱基序列的编码乳酸脱氢酶的基因，
(2) 包含与含有下述序列号 4 ～ 6 任一项所示的碱基序列或其一部分的碱基序列 在严格条件下杂交的碱基序列的编码乳酸脱氢酶的基因，
(3) 包含在下述序列号 4 ～ 6 任一项所示的碱基序列中缺失、 替代和 / 或添加了 1 个或多个碱基的碱基序列的编码乳酸脱氢酶的基因。11101939426 A CN 101939429
说明书aggaggagtc cctgtgccat tagaagacaa cccccaagat tgacggccgg tcaacatctt tcatcgtctc ccaaaaaccg tggggcagaa gagactcgag tgcaccccga ttgtggacag tgtccgtagc ccacaatggt10/32 页序列号 4 ： 非洲爪蟾 (Xenopus laevis) 来源 atggcaactg tgaaggataa actcatccac aatgtggtca aacaaggtca ccattgtggg tgtgggggcc gtgggcatgg cagaaggatt tggcagatga gcttgcactt gttgatgtga gaaatgatgg atctccagca tggcagtctg ttccttcgta aaagattaca gcgtcactgc aaactccaag ctggtagttg caggagggag agagtcgcct gaatctggtt cagcgcaatg attcccaaca ttgtcaagta cagccccaac tgcaccctgc gacattctga catatgtggc ctggaagatc agtggattcc agcggctgca atttggactc tgcccgtttc cgttacctca cacacccaga gctgccacgg ttgggtcatt ggggaacacg tggagtgggg tgaatgtggc tggcgtgtcc ctgaaaaccc gacgcagaca aggagaactg gaaggaggtg cacaagcagg gtgatcaagc tgaagggcta cacctcctgg gctattggcc gagagtatcc tgaagaacct ccgccgagtc catcccatttgctcccccag cagtgtcctg actgaagggg tgtctcaggg ggcccgtcag caaattcatc caacccagtg tgtcattggc gtttgggatc tgtgccagtg tattgggagt cgcctatgaa tgacctgtct caagggcatg cttgggcatc caagagcgcatacggcgtga ataatgatgt tttcctcagt gtcccctgtg tgttgggcaa acagacgtgg ttaacatgac gctgaaggca gatgaagagg atcgcttacg gacaccctgt gggccatcca gaaggagctg cagttctag 序列号 5 ： 人 (Homo sapiens) 来源 atggcaactc taaaggatca gctgatttat aatcttctaa aggaagaaca aataagatta cagttgttgg ggttggtgct gttggcatgg cctgtgccat atgaaggact tggcagatga acttgctctt gttgatgtca tcgaagacaa gagatgatgg atctccaaca tggcagcctt ttccttagaa caccaaagat aaagactata atgtaactgc aaactccaag ctggtcatta tcacggctgg caagagggag aaagccgtct taatttggtc cagcgtaacg tgaacatatt attcctaatg ttgtaaaata cagcccgaac tgcaagttgc ttattgtttc gatatcttga cctacgtggc ttggaagata agtggttttc ccaaaaaccg agtggttgca atctggattc agcccgattc cgttacctga tgggggaaag cacccattaa gctgtcatgg gtgggtcctt ggggaacatg gagattccag tggagtggaa tgaatgttgc tggtgtctct ctgaagactc tgcacccaga gataaagata aggaacagtg gaaagaggtt cacaagcagg tggttgagag gtgatcaaac tcaaaggcta cacatcctgg gctattggac tctctgtagc gagagtataa tgaagaatct taggcgggtg cacccagttt ccaccatgat tacggaataa aggatgatgt cttccttagt gttccttgca ttttgggaca tcagaccttg tgaaggtgac tctgacttct gaggaagagg cccgtttgaa gatacacttt gggggatcca aaaggagctg caattttaa 序列号 6 ： 肠膜明串珠菌 (Leuconostoc mesenteroides) 来源 atgaagattt ttgcttacgg cattcgtgat gatgaaaagc catcacttga gcggctaacc cagagattga agtggactac acacaagaat tattgacacc12gaccccccag cagtatctta attgaaggga tgtctctggc ggcacgtcag taaattcatc aaatccagtg tgttattgga gctgggagtt tgtgcctgta tttagggact tgcttatgag agatttggca taagggtctt gaatggaatc gaagagtgcaagaatggaaa tgaaacagct101939426 A CN 101939429
说明书11/32 页aagttggctg agggatcaga ttcagctgtt gtttatcaac aattggacta tacacgtgaa
acattgacag ctttagctaa cgttggtgtt actaacttgt cattgcgtaa cgttggtaca
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[ 转化酵母 ]
本发明为在染色体中含有至少一个上述乳酸脱氢酶表达盒的转化酵母。 本发明中 的转化酵母可以在能够由乳酸脱氢酶表达盒表达 LDH 的染色体中的任意位置上导入该乳 酸脱氢酶表达盒。优选为选自 SED1 基因、 CWP2 基因或 ENO1 基因中的至少一个基因被上述 乳酸脱氢酶表达盒替代的酵母。
本 发 明 中 使 用 的 酵 母 如 果 是 能 够 导 入 乳 酸 脱 氢 酶 表 达 盒 的 酵 母， 就可以 合 适 地 使 用。 作 为 其 中 一 例， 可 以 列 举 属 于 酵 母 属 (Saccharomyces)、 裂殖酵母 属 (Schizosaccharomyces)、接 合 酵 母 属 (Zygosaccharomyces)、克 鲁 维 酵 母 属 (Kluyveromyces) 或假丝酵母属 (Candida) 的酵母。优选属于酵母属的酵母。更优选为酿 酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)。
[ 乳酸的制造方法 ]
本发明为包括培养上述转化酵母的乳酸的制造方法。培养时可以采用分批培养、 流加培养 ( 补料分批培养 )、 恒化器培养或连续培养中的任一种方式。优选连续培养。更 优选的是， 用分离膜过滤培养液， 从滤液中回收乳酸， 再将未滤过液保持在或返流到培养液 中， 且在培养液中追加培养基的连续培养。
作为本发明中使用的酵母的发酵原料， 可以是促进发酵培养的酵母的生长， 能够 使作为目的发酵生产物的乳酸良好生产的原料。作为发酵原料， 可以优选使用例如合适地 含有碳源、 氮源、 无机盐类以及根据需要添加的氨基酸和维生素等有机微量营养素的液体 培养基。
作为上述碳源， 可使用例如葡萄糖、 蔗糖、 果糖、 半乳糖、 乳糖等糖类、 含有这些糖 类的淀粉糖化液、 甘薯糖蜜、 甜菜糖蜜、 高级糖蜜 (High Test Molasses)、 甘蔗汁、 以及醋 酸、 延胡索酸等有机酸、 乙醇等醇类和甘油等。这里所谓糖类是指多元醇的最初氧化生成 物， 具有一个醛基或酮基， 且具有醛基的糖被分类为醛糖、 具有酮基的糖被分类为酮糖的碳 水化合物。此外， 作为上述氮源， 可以使用例如氨气、 氨水、 铵盐类、 尿素、 硝酸盐类、 其它辅助 使用的有机氮源例如油粕类、 大豆加水分解液、 酪蛋白分解物、 其它氨基酸、 维生素类、 玉米 浆、 酵母或酵母提取物、 肉膏、 蛋白胨等的肽类、 各种发酵菌体及其加水分解物等。
此外， 作为上述无机盐类， 可以适当添加例如磷酸盐， 镁盐、 钙盐、 铁盐、 和锰盐等。
在为了本发明使用的酵母的生长而需要特定营养素的情形时， 可以添加作为制品 的营养物， 或者含有该营养物的天然物。而且， 根据需要还可以添加使用消泡剂。
本发明中， 所谓发酵培养液是指在发酵原料中能够获得酵母增殖的结果的液体。 追加的发酵原料的组成还可以根据培养开始时发酵原料组成适当改变。 在发酵原料组成变 化成追加的发酵原料的组成时， 优选目的乳酸的生产性变高的变化。例如， 通过使氮源、 无 机盐类、 氨基酸和维生素等有机微量营养素相对于上述碳源的重量比率降低， 就有可能可 以实现乳酸的生产成本降低、 即广义的乳酸的生产性提高。另一方面， 通过使氮源、 无机盐 类、 氨基酸和维生素等有机微量营养素相对于上述碳源的重量比率增加， 就有可能使乳酸 的生产性提高。
本发明中， 发酵培养液中糖类等发酵原料的浓度优选保持在 5g/L 以下。更优选在 3g/L 以下， 更为优选在 1g/L 以下。其理由是， 使发酵培养液的抽取导致的发酵原料的流失 降到最小限。因此， 理想的是发酵培养液中发酵原料的浓度尽可能小。
酵母的发酵培养通常多在 pH 为 3-8， 温度为 20-40℃的范围进行。由于生产物质 乳酸为酸性物质， 因此用碱性物质、 以及尿素、 碳酸钙和氨气等将发酵培养液的 pH 调节到 上述范围内的预先确定的值。
在酵母的发酵培养中， 如果需要提高氧的供给速度， 可以采用在空气中添加氧， 将 氧浓度保持在 21％以上， 加压发酵培养液， 提高搅拌速度或者提高通气量等手段， 提高氧的 供给速度。相反， 在需要降低氧的供给速度时， 也可以在空气中混合二氧化碳气体、 氮和氩 等不含氧的气体再进行供给。
本发明中， 可以在培养初期进行分批培养或补料分批培养， 在酵母浓度提高后开 始连续培养 ( 抽取 )， 也可以接种高浓度的酵母菌体， 在培养开始的同时进行连续培养。从 适当时期开始， 可以进行发酵原料液的供给和培养物的抽取。发酵原料液供给和培养物的 抽取开始时间不一定需要相同。 此外， 发酵原料液的供给和培养物的抽取可以是连续的， 也 可以是间歇的。可以在发酵原料液中添加如上所示的对菌体增殖所必需的营养素， 使得菌 体增殖得以连续进行。
为了获得有效的生产性， 发酵培养液中酵母的浓度优选在发酵培养液的环境变得 不适于酵母增殖且死亡率不升高的范围下， 以高浓度状态维持。 作为其中一例， 通过将酵母 浓度， 作为干燥重量维持在 5g/L 以上， 可以获得更好的生产效率。此外， 只要不导致连续发 酵装置运作上的不方便或生产效率降低， 酵母浓度的上限值就没有特别限定。
使具有发酵生产能力的新鲜菌体增殖的同时进行的连续培养操作， 在培养管理 上， 通常优选在单一的发酵反应槽中进行。 然而， 如果是菌体增殖的同时生成乳酸的连续培 养法， 则发酵反应槽的数目是任意的。 由于发酵反应槽的容量小等原因， 也可以使用多个发 酵反应槽。 这种情况下， 即使用配管并列或串联地连接多个发酵反应槽进行连续培养， 也可 以获得发酵生产物的高生产性。
由本发明的乳酸的制造方法制造的包含于培养液中的乳酸的分离·纯化， 还可以通过组合已知的离子交换、 浓缩、 蒸馏和晶析等方法来进行。
本发明的乳酸的制造方法中使用的发酵装置的 1 个例子， 其主要由用于制造乳酸 的容纳本发明的转化酵母的发酵反应槽， 以及用于过滤分离转化酵母和培养液的含有多孔 性膜的分离膜元件构成。分离膜元件可以设置在发酵反应槽的内部或外部。
在通过用分离膜过滤本发明的培养液， 从滤液中回收乳酸， 再将未滤过液保持在 或返流到培养液中， 并在培养液中追加培养基的连续培养所进行的乳酸的制造方法中， 优 选使用平均细孔径为 0.01μm 以上且不到 1μm 的多孔性膜作为分离膜， 在作为过滤压力的 膜间差压在 0.1 至 20kPa 的范围内进行过滤处理。因此， 尤其是， 由于不需要使发酵反应槽 内保持在加压状态， 因此不需要使发酵培养液在过滤分离装置和发酵反应槽间循环的动力 手段， 也可以通过在发酵反应槽内部设置分离膜元件使发酵培养装置紧凑。
下面就本发明中作为分离膜优选使用的多孔性膜的结构进行说明。本发明中的 多孔性膜具有适应被处理水的水质和用途的分离性能和透水性能， 从阻止性能和透水性能 和耐污性这些分离性能方面来看， 优选含有多孔质树脂层的多孔性膜。这样的多孔性膜在 多孔质基材的表面具有起分离功能层作用的多孔质树脂层。 多孔质基材是支持多孔质树脂 层、 给予分离膜强度的物质。 多孔质基材的材质为有机材料和无机材料等， 并没有特殊限定， 但理想的是使用 有机纤维。优选的多孔质基材为使用纤维素纤维、 三乙酸纤维素纤维、 聚酯纤维、 聚丙烯纤 维和聚乙烯纤维等有机纤维构成的织布或无纺布， 这其中， 优选使用密度控制比较容易、 制 造也容易的便宜的无纺布。
另外， 多孔质树脂层起到上述这种分离功能层的作用， 可以优选使用有机高分子 膜。 作为有机高分子膜的材质， 可以列举， 例如聚乙烯类树脂、 聚丙烯类树脂、 聚氯乙烯类树 脂、 聚偏氟乙烯类树脂、 聚砜类树脂、 聚醚砜类树脂、 聚丙烯腈类树脂、 纤维素类树脂和三乙 酸纤维素类树脂等。有机高分子膜也可以是以这些树脂作为主要成分的树脂混合物。这其 中， 作为主要成分， 是指其成分含有 50 重量％以上、 优选 60 重量％以上。其中， 作为构成多 孔质树脂层的材料， 优选通过溶液进行的制膜容易、 且物理的耐久性和耐药性优异的聚氯 乙烯类树脂、 聚偏氟乙烯类树脂、 聚砜类树脂、 聚醚砜类树脂和聚丙烯腈类树脂， 最优选聚 偏氟乙烯类树脂或以其作为主要成分的树脂。
这里， 作为聚偏氟乙烯类树脂， 优选使用偏氟乙烯的均聚物， 其它还优选使用与可 以与偏氟乙烯共聚的乙烯类单体的共聚体。作为可以与偏氟乙烯共聚的乙烯类单体， 可以 列举四氟乙烯、 六氟丙烯和三氯一氟乙烯等。
本发明中使用的分离膜可以是平膜， 也可以是中空纤维膜。 如果是平膜， 其平均厚 度根据其用途来选择， 但优选在 20μm 以上 5000μm 以下， 更优选在 50μm 以上 2000μm 以 下的范围内选择。
如上所述， 本发明中使用的分离膜， 理想的是由多孔质基材和多孔质树脂层形成 的多孔性膜。 此时， 多孔质树脂层可以浸透在多孔质基材中， 多孔质树脂层也可以不浸透在 多孔质基材中， 这根据用途进行选择。多孔质基材的平均厚度优选在 50μm 以上 3000μm 以下的范围内选择。此外， 多孔性膜为中空纤维膜时， 中空纤维的内径优选在 200μm 以上 5000μm 以下的范围选择， 膜厚优选在 20μm 以上 2000μm 以下的范围内选择。此外， 在中 空纤维的内部还可以含有由有机纤维或无机纤维制成筒状的织物或编物。
首先， 就多孔性膜中的平膜的制作法进行简要说明。
在多孔质基材的表面上形成含有前述树脂和溶剂的原液的被膜， 同时使该原液浸 渍于多孔质基材中。然后， 只使具有被膜的多孔质基材的被膜侧表面与含有非溶剂的凝固 浴接触， 使树脂凝固， 同时在多孔质基材的表面上形成多孔质树脂层。 原液通过使树脂溶解 于溶剂中来制备。原液中还可以含有非溶剂。从制膜性的角度考虑， 原液温度通常优选在 15 ～ 120℃的范围内选择。
这里， 还可以在原液中添加开孔剂。 开孔剂具有在浸渍于凝固浴时被提取， 使树脂 层成为多孔质的作用。通过添加开孔剂， 可以控制平均细孔径的大小。开孔剂具有在浸渍 于凝固浴时被提取， 使树脂层成为多孔质的作用。开孔剂优选在凝固浴的溶解性高。作为 开孔剂， 可以使用例如氯化钙或碳酸钙等无机盐。此外， 作为开孔剂， 可以使用聚乙二醇和 聚丙二醇等聚氧化烯类、 聚乙烯醇、 聚乙烯醇缩丁醛和聚丙烯酸等水溶性高分子化合物和 甘油。
此外， 溶剂为溶解树脂的溶剂。 溶剂作用于树脂和开孔剂， 促进它们形成多孔质树 脂层。作为这样的溶剂， 可以使用 N- 甲基吡咯烷酮 (NMP)、 N， N- 二甲基乙酰胺 (DMAc)、 N， N- 二甲基甲酰胺 (DMF)、 二甲亚砜 (DMSO)、 N- 甲基 -2- 吡咯烷酮、 甲基乙基酮、 四氢呋喃、 四 甲基脲、 磷酸三甲酯、 环己酮、 异佛尔酮、 γ- 丁内酯、 甲基异戊基酮、 邻苯二甲酸二甲酯、 丙 二醇甲基醚、 碳酸异丙烯酯、 双丙酮醇、 甘油三乙酸酯、 丙酮和甲基乙基酮等。这其中， 优选 使用树脂溶解性高的 NMP、 DMAc、 DMF 和 DMSO。这些溶剂可以单独使用， 也可以两种以上混 合使用。原液可以以优选 5 重量％以上 60 重量％以下浓度， 使前述树脂溶解于上述溶剂中 来制备。 此外， 还可以在溶剂中添加例如聚乙二醇、 聚乙烯醇、 聚乙烯吡咯烷酮和甘油等溶 剂以外的成分。非溶剂为不溶解树脂的液体。非溶剂起到控制树脂凝固的速度， 从而控制 细孔大小的作用。作为非溶剂， 可以使用水、 甲醇和乙醇等醇类。其中， 从价格方面考虑， 优 选水或甲醇。非溶剂也可以是这些物质的混合物。
下面， 就多孔性膜中的中空纤维膜的制作方法简要说明。
中空纤维膜可以通过从二重管式金属口外侧的管吐出包含树脂和溶剂的原液， 并 从二重管式金属口内侧的管吐出中空部形成用流体， 然后在冷却浴中冷却固化的方式制 作。
原液可以通过使上述平膜的制造方法中所述的树脂以优选 20 重量％以上 60 重 量％以下的浓度溶解于上述平膜的制造方法中所述的溶剂中来制备。此外， 通常可以使 用气体或液体作为中空部形成用流体。此外， 在获得的中空纤维膜的外表面上还可以涂覆 ( 层叠 ) 新的多孔性树脂层。层叠可以是为了使中空纤维膜的性质例如亲水性·疏水性或 细孔径等变化成所希望的性质而进行的。层叠的新的多孔性树脂层可以通过以下方式制 造， 即通过使树脂溶解于溶剂的原液与含有非溶剂的凝固浴接触， 使树脂凝固。 该树脂的材 质优选使用例如与上述有机高分子膜的材质同样的材质。 此外， 作为层叠方法， 可以将中空 纤维膜浸渍于原液中， 也可以在中空纤维膜的表面上涂布原液， 层叠后， 挤出付着的原液的 一部分， 用气刀吹掉， 调整叠层量。
本发明中使用的分离膜还可以通过与支持体组合， 形成分离膜元件。使用支持板 作为支持体， 该支持板的至少一面上配备本发明中使用的分离膜的分离膜元件是本发明使
用的具有分离膜的分离膜元件的一个优选的实施方式。 该实施方式中， 膜面积难以变大时， 为了扩大透水量， 优选在支持板的两面配置分离膜。
作为分离膜的多孔性膜的平均细孔径， 如果在如上所述的 0.01μm 以上不到 1μm 的范围内， 则此膜兼具菌体和污泥等不泄漏的高排除率， 以及高透水性， 而且还可以不容易 堵塞地长时间保持透水性， 而且能够以更高的精度和再现性的实施。 在使用细菌类时， 多孔 性膜的平均细孔径优选在 0.4μm 以下， 平均细孔径如果不到 0.2μm， 可以更合适的实施。 平均细孔径如果过小， 透水量可能降低， 因此本发明中， 平均细孔径为 0.01μm 以上， 优选 为 0.02μm 以上， 更优选为 0.04μm 以上。
这 里， 可 以 通 过 测 定 在 倍 率 10,000 倍 的 扫 描 型 电 子 显 微 镜 观 察 下， 在 9.2μm×10.4μm 的范围内可以观察到的所有细孔的直径， 进行平均后求得平均细孔径。
上述平均细孔径的标准偏差 σ 优选在 0.1μm 以下。而且， 平均细孔径的标准偏 差小， 即细孔径的大小一致， 能够获得均匀的透过液。为了使发酵运转管理变得容易， 理想 的是平均细孔径的标准偏差越小越好。
平 均 细 孔 径 的 标 准 偏 差 σ 可 以 通 过 下 述 ( 式 1) 计 算 得 出， 其中以在上述 9.2μm×10.4μm 范围内能够观察到的细孔数作为 N， 以测定的各个直径作为 Xk， 以细孔直 径的平均值作为 X(ave)。
····( 式 1)在本发明使用的分离膜中， 发酵培养液的透过性是要点之一， 作为透过性的指标， 可以采用使用前的分离膜的纯水透过系数。本发明中， 分离膜的纯水透过系数， 在通过 逆浸透膜， 使用 25 ℃温度的纯化水， 以落差高度 1m 测定透水量计算时， 优选为 2×10-9m3/ (m2·s·Pa) 以上。纯水透过系数如果为 2×10-9m3/(m2·s·Pa) 以上 6×10-7m3/(m2·s·Pa) 以下， 则可以获得实用上充分的透过水量。更优选的纯水透过系数为 2×10-9m3/(m2· s· Pa) -7 3 2 以上 1×10 m /(m ·s·Pa) 以下。
本发明中使用的分离膜的膜表面粗糙度是影响分离膜堵塞的因子。 膜表面粗糙度 优选在 0.1μm 以下时， 可以合适地使分离膜的剥离系数和膜抵抗性降低， 能够以更低的膜 间差压实施连续发酵。由于通过抑制堵塞可以进行稳定的连续发酵， 因此优选表面粗糙度 越小越好。
此外， 通过降低分离膜的膜表面粗糙度， 可以期待在微生物的过滤中， 膜表面发生 的剪切力降低， 微生物的破坏受到抑制， 分离膜的堵塞也受到抑制， 因此可以实现长期稳定 的过滤。
这里， 膜表面粗糙度可以使用下述的原子力显微镜装置 (AFM)， 用下述的装置和条 件进行测定。此外， 使用的原子力显微镜装置 (AFM) 也可以与以下装置相同或更好。
·装置 ： 原子力显微镜装置 (Digital Instruments( 株 ) 制 Nanoscope IIIa)
·条件 ： 探针 SiN 悬臂 (Digital Instruments( 株 ) 制 )
： 扫描模式 接触模式 ( 气中测定 )
水中轻敲 ( 水中测定 )
10μm、 25μm 四方 ( 气中测定 )
5μm、 10μm 四方 ( 水中测定 )
： 扫描分辨率 512×512
·样品制备 ： 测定时膜样品是常温浸渍在乙醇中 15 分钟后， 浸渍于 RO 水中 24 小 时并洗净后， 风干再用。所谓 RO 水， 是指用作为过滤膜的一种的逆浸透膜 (RO 膜 ) 进行过 滤， 排除了离子和盐类等不纯物的水。RO 膜孔的大小大约为 2nm 以下。
膜表面粗糙度 drough 根据上述的 AFM 获得的各点的 Z 轴方向的高度， 用下述的 ( 式 2) 计算。： 扫描范围
····( 式 2)
drough ： 表面粗糙度 (μm) Zn ： Z 轴方向的高度 (μm) ： 扫描范围的平均高度 (μm)N： 测定样品数
本发明中， 用分离膜过滤处理微生物时的膜间差压， 如果是微生物和培养基成分 不容易堵塞的条件就可以了， 但使膜间差压在 0.1kPa 以上 20kPa 以下的范围进行过滤处理 是重要的。膜间差压优选在 0.1kPa 以上 10kPa 以下范围， 更优选在 0.1kPa 以上 5kPa 的范 围。 在偏离上述膜间差压的范围时， 急速发生微生物和培养基成分的堵塞， 导致透过水量降 低， 会在连续发酵运行中产生麻烦。
作为过滤的驱动力， 通过利用发酵培养液与分离膜处理水的液位差 ( 水位差 ) 的 虹吸管， 可以在分离膜上产生膜间差压。此外， 作为过滤的驱动力， 也可以在分离膜处理水 侧设置吸引泵， 也可以在分离膜的发酵培养液侧设置加压泵。膜间差压可以通过使发酵培 养液与分离膜处理水的液位差发生变化来控制。 此外， 为了产生膜间差压而使用泵时， 可以 通过吸引压力控制膜间差压， 而且还可以通过导入发酵培养液侧的压力的气体或液体的压 力控制膜间差压。在进行这些压力控制时， 以发酵培养液侧的压力与分离膜处理水侧的压 力的差作为膜间差压， 可以用于控制膜间差压。
此外， 本发明中使用的分离膜， 作为过滤处理的膜间差压， 优选具有在 0.1kPa 以 上 20kPa 以下的范围内能够进行过滤处理的性能。此外， 本发明中使用的分离膜， 如上所 述， 使用前的纯水透过系数在通过逆浸透膜， 使用 25℃温度的纯化水， 以落差高度 1m 测定 -9 3 2 透水量计算时， 优选为 2×10 m /(m ·s·Pa) 以上的范围， 更优选 2×10-9m3/(m2·s·Pa) 以 上 6×10-7m3/(m2·s·Pa) 以下的范围。
本发明的乳酸的制造方法中使用的连续发酵装置中的分离膜元件设置在发酵反 应槽内部的一个代表性例子示于图 1。图 1 是用于说明本发明中使用的膜分离型连续发酵 装置的一个实施方式的概要侧面图。图 1 中， 膜分离型连续发酵装置基本由发酵培养酵母 的发酵反应槽 1 和用于控制该发酵反应槽 1 中的发酵培养液量的水位差控制装置 3 构成。 在发酵反应槽 1 内配设分离膜元件 2， 该分离膜元件 2 中整合了多孔性膜。作为该多孔性 膜， 合适的是使用例如国际公开第 2002/064240 号小册子中公开的分离膜和分离膜元件。接着， 就通过图 1 的膜分离型连续发酵装置进行的连续发酵的实施方式进行说 明。通过培养基供给泵 7， 将培养基连续地或间歇地投入发酵反应槽 1。就培养基而言， 在 投入到发酵反应槽 1 内之前， 可以根据需要进行加热杀菌、 加热灭菌或采用过滤器的灭菌 处理。发酵生产时， 根据需要， 可以用发酵反应槽 1 内的搅拌机 5 搅拌发酵反应槽 1 内的发 酵液。此外， 根据需要， 可以用气体供给装置 4， 给发酵反应槽 1 内供给所需要的气体。此 时， 可以回收供给的气体， 再循环供给给气体供给装置 4。 此外， 根据需要， 可以通过 pH 传感 器· 控制装置 9 和 pH 调整溶液供给泵 8 来调整发酵反应槽 1 内发酵液的 pH。此外， 根据需 要， 可以通过用温度调节器 10 调节发酵反应槽 1 内发酵培养液的温度进行生产性高的发酵 生产。
这里， 尽管例示了在通过测量设备· 控制装置进行的发酵培养液的物理化学条 件的调节中 pH 和温度的调节， 但根据需要， 可以进行溶解氧和 ORP(Oxidation-reduction Potential ： 氧化还原电位 ) 的控制， 而且还可以通过在线化学传感器等分析装置测定发酵 培养液中的乳酸的浓度， 控制以其作为指标的物理化学的条件。 此外， 就培养基的连续的或 间歇投入的实施方式而言， 也没有特别限定， 以通过上述测量设备装置进行的发酵培养液 的物理化学环境的测定值作为指标， 适当调节培养基投入量和速度。
用设置于发酵反应槽 1 内的分离膜元件 2， 将发酵培养液过滤· 分离成酵母和发酵 生产物， 再从装置系统中取出。此外， 通过将被过滤·分离的酵母留在装置系统内， 装置系 统内的酵母可以维持高浓度， 因而可以进行高生产性的发酵生产。这里， 由分离膜元件 2 进 行的过滤· 分离通过与发酵反应槽 1 水面的水位差压进行， 不需要特别的动力。此外， 根据 需要， 通过液位传感器 6 和水位差压控制装置 3， 可以适当调节分离膜元件 2 的过滤·分离 速度和发酵反应槽 1 内的发酵液量。尽管例示了由上述分离膜元件 2 进行的过滤· 分离通 过水位差压进行， 然而根据需要， 还可以通过泵或通过液体或气体等进行的吸引过滤或加 压装置系统内， 进行过滤·分离。
下面， 本发明的乳酸的制造方法中使用的发酵装置中的分离膜元件设置在发酵反 应槽外部的代表性的一个例子示于图 2 的概要图中。图 2 是用于说明可以在本发明使用的 其它膜分离型连续发酵装置的一个实施方式的概要侧面图。
图 2 中， 膜分离型连续发酵装置基本由用于培养发酵酵母的发酵反应槽 1， 和通过 发酵培养液循环泵 11 与该发酵反应槽 1 连接的内部具有分离膜元件 2 的膜分离槽 12， 以及 用于控制发酵反应槽 1 内发酵培养液量的水位差控制装置 3 构成。这里， 分离膜元件 2 中 整合了多孔性膜。作为该多孔性膜， 合适的是使用例如国际公开第 2002/064240 号小册子 中公开的分离膜和分离膜元件。
图 2 中， 用培养基供给泵 7 将培养基投入到发酵反应槽 1 中， 根据需要， 可以用搅 拌机 5 搅拌发酵反应槽 1 内的发酵培养液。而且， 根据需要， 可以通过气体供给装置 4 供给 所需气体。此时， 可以回收供给的气体， 再循环供给给气体供给装置 4。此外， 根据需要， 可 以通过 pH 传感器·控制装置 9 和 pH 调整溶液供给泵 8 来调整发酵培养液的 pH。此外， 根 据需要， 可以通过用温度调节器 10 调节发酵培养液的温度， 进行生产性高的发酵生产。而 且， 装置内的发酵培养液通过发酵培养液循环泵 11， 在发酵反应槽 1 和膜分离槽 12 之间循 环。含有发酵生产物的发酵培养液被分离膜元件 2 过滤·分离成酵母和发酵生产物， 可以 从装置系统中取出作为发酵生产物的乳酸。此外， 由于被过滤· 分离的酵母留在装置系统内， 因此装置系统内的酵母可以维持 高浓度， 因而可以进行高生产性的发酵生产。这里， 由分离膜元件 2 进行的过滤· 分离通过 与膜分离槽 12 水面的水位差压进行， 不需要特别的动力。此外， 根据需要， 通过液位传感器 6 和水位差压控制装置 3， 可以适当地调节分离膜元件 2 的过滤· 分离速度和装置系统内的 发酵培养液量。此外， 根据需要， 还可以通过气体供给装置 4 向膜分离槽 12 内供给所需气 体。
如上所述， 尽管通过分离膜元件 2 进行的过滤· 分离可以通过水位差压进行， 但根 据需要还可以通过泵或通过液体或气体等进行的吸引过滤或加压装置系统内， 进行过滤和 分离。通过这种手段， 可以调整控制膜间差压。
下面， 用以下附图简要说明本发明中使用的分离膜元件的合适的实施方式的例子 国际公开第 2002/064240 号小册子中公开的分离膜和分离膜元件。图 3 是用于说明本发明 中使用的分离膜元件的一个实施方式的概要斜视图。
分离膜元件， 如图 3 所示， 由在具有刚性的支持板 13 的两面依次配置流路材料 14 和前述分离膜 15 而构成。支持板 13 在其两面具有凹部 16。分离膜 15 过滤发酵培养液。 流路材料 14 是使经分离膜 15 过滤的滤液有效流到支持板 13 的材料。流到支持板 13 的滤 液通过支持板 13 的凹部 16， 经集水管 17， 被取出到连续发酵装置外部。作为用于取出滤液 的动力， 可以使用水位差压、 泵、 通过液体或气体等进行的吸引过滤、 或对装置系统内加压 等方法。
图 4 使用于说明本发明中使用的其它分离膜元件的其它实施方式的概要斜视图。 分离膜元件， 如图 4 所示， 主要由中空纤维膜 ( 多孔性膜 ) 构成的分离膜束 18 和上部树脂 密封层 19 以及下部树脂密封层 20。分离膜束 18 被上部树脂密封层 19 和下部树脂密封层 20 以束状被粘着和固定。由下部树脂密封层 20 进行的粘着和固定形成了密封分离膜束 18 的中空纤维膜 ( 多孔性膜 ) 的中空部， 防止培养液漏出的结构。另一方面， 上部树脂密封层 19 不密封分离膜束 18 的中空纤维膜 ( 多孔性膜 ) 的内孔， 形成了滤液流到集水管 22 的结 构。该分离膜元件可以通过支持框 21 设置在连续发酵装置内。由分离膜束 18 过滤的含有 发酵生产物的滤液通过中空纤维膜的中空部， 经集水管 22， 被取出到连续发酵装置外部。 作 为用于取出滤液的动力， 可以使用水位差压、 泵、 通过液体或气体等进行的吸引过滤、 或对 装置系统内加压等方法。
本发明的乳酸的制造方法中使用的连续发酵装置的分离膜元件的构成部件， 优选 是耐高压蒸气灭菌操作的部件。连续发酵装置内如果可以灭菌， 就可以避免在连续发酵时 被不优选的微生物污染的危险， 可以实现更稳定的连续发酵。构成分离膜元件的部件优选 对高压蒸气灭菌操作的条件即 121℃ 15 分钟， 有耐性。分离膜元件部件可优选选择例如不 锈钢或铝等金属、 聚酰胺类树脂、 氟类树脂、 聚碳酸酯类树脂、 聚缩醛类树脂、 聚对苯二甲酸 丁二醇酯类树脂、 PVDF、 改性聚苯醚类树脂和聚砜类树脂等树脂。
在本发明的乳酸的制造方法中使用的连续发酵装置中， 分离膜元件可以按图 1 所 示的那样设置在发酵反应槽内， 也可以如图 2 所示的那样设置在发酵反应槽外。分离膜元 件设置在发酵反应槽外时， 可以另外设置膜分离槽， 在其内部设置分离膜元件， 可以一边使 培养液在发酵反应槽和膜分离槽之间循环， 一边通过分离膜元件连续过滤培养液。
本发明的乳酸的制造方法中使用的连续发酵装置中， 理想的是， 膜分离槽可以进行高压蒸气灭菌。如果膜分离槽可以进行高压蒸气灭菌， 则容易避免杂菌导致的污染。
比较分批式发酵而言， 按照本发明的通过连续发酵进行的乳酸制造方法进行连续 发酵时， 能够获得高体积生产速度， 可以进行极有效的发酵生产。其中， 连续培养中的发酵 生产速度按以下的 ( 式 3) 计算。
发酵生产速度 (g/L/ 小时 ) ＝抽取液中的生产物浓度 (g/L)× 发酵培养液抽取速 度 (L/ 小时 )÷ 装置的运转液量 (L) ····( 式 3)
此外， 通过分批培养进行的发酵生产速度用消耗所有原料碳源时的生产物量 (g) 除以碳源消耗所需时间 ( 小时 ) 和该时间点的发酵培养液量 (L) 求出。
此外， 本发明的本质是， 通过一边用分离膜过滤具有乳酸脱氢酶表达盒的酵母一 边进行培养， 不会导致乳酸收率和乳酸生产速度的降低， 可以稳定地进行长期间的连续培 养， 因此理想的是上述连续培养实施至少 100 小时以上， 优选 200 小时以上， 更优选 300 小 时以上， 其中所述乳酸脱氢酶表达盒包含启动子， 所述启动子是在一边用分离膜过滤具有 乳酸生产能力的酵母一边进行连续培养中， 培养开始后 50 小时之后基因表达量为全部基 因平均相对表达量的 5 倍以上、 优选 7 倍以上、 更优选 10 倍以上的上述基因的启动子。
此外， 本发明中可以生产 D- 乳酸、 L- 乳酸中的任一种。
通过本发明的乳酸的制造方法获得的乳酸主要可以作为聚乳酸原料提供。
实施例
以下， 用实施例说明本发明的实施方式， 这些实施例都是例示， 但本发明不限于实 施例。
( 参考例 1) 具有乳酸生产能力的酵母的制作
本发明中， 作为具有乳酸生产能力的酵母， 采用 PDC1 启动子的下游导入了具有序 列号 4 所记载的碱基序列的非洲爪蟾来源的 ldh 基因的酵母。非洲爪蟾来源的 ldh 基因的 克隆通过 PCR 法进行。在 PCR 中， 以从非洲爪蟾肾脏来源的 cDNA 文库 (STRATAGENE 公司 制 ) 按照附带的操作规程制备的噬菌粒 DNA 作为模板。
PCR 扩增反应中使用 KOD-Plus 聚合酶 ( 东洋纺公司制 )， 反应缓冲液、 dNTPmix 等采用试剂盒附带的产品。如上所述， 制备 50ng/ 样品的按照附带的操作规程制备的噬菌 粒 DNA， 50pmol/ 样品的引物， 和 1 单位 / 样品的 KOD-Plus 聚合酶这样的 50μl 的反应系。 用 PCR 扩增装置 iCycler(BIO-RAD 公司制 )， 使反应溶液在 94 ℃温度热变性 5 分钟后， 以 94℃ ( 热变性 ) ： 30 秒、 55℃ ( 引物的退火 ) ： 30 秒、 68℃ ( 互补链的延伸 ) ： 1 分钟为一个 循环进行 30 个循环， 然后冷却到 4℃。并且， 对基因扩增用引物 ( 序列号 7， 8) 分别按在 5 末端侧添加 SalI 识别序列、 3 末端侧添加 NotI 识别序列的方式制备。
序列号 7 ： gtcgacatgg caactgtgaa ggataa
序列号 8 ： gcggccgcct agaactgcag ctcctt
纯化 PCR 扩增片段， 用 T4 多核苷酸激酶 (TakaraBio 公司制 ) 对末端磷酸化后， 连 接到 pUC118 载体 ( 用限制性酶 HincII 切断， 对切断面进行脱磷酸化处理 ) 中。用 DNA 连 接试剂盒 Ver.2(TakaraBio 公司制 ) 进行连接。用连接溶液转化大肠杆菌 DH5α 的感受态 细胞 (TakaraBio 公司制 )， 接种到含 50μg/mL 抗生素氨苄青霉素的 LB 板上， 培养一晚。生 长的菌落， 用小型制备法回收质粒 DNA， 用限制性酶 SalI 和 NotI 切断， 选择出导入了非洲爪 蟾来源的 ldh 基因的质粒。这一系列操作都按照附带的操作规程进行。用限制性酶 SalI 和 NotI 切断插入了上述非洲爪蟾来源的 ldh 基因的 pUC118 载 体， 通过 1％琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 片段， 按照常规方法纯化含有非洲爪蟾来源的 ldh 基 因的片段。获得的含有 ldh 基因的片段连接到图 5 所示的表达载体 pTRS11 的 XhoI/NotI 切断部位， 用与上述相同方法回收质粒 DNA， 通过用限制性酶 XhoI 和 NotI 切断， 选择出插入 了非洲爪蟾来源的 ldh 基因的表达载体。以后， 这样制成的整合了非洲爪蟾来源的 ldh 基 因的表达载体称为 pTRS102。
以该 pTRS102 作为扩增模板， 通过以寡核苷酸 ( 序列号 9， 10) 作为引物对的 PCR， 扩增出含有非洲爪蟾来源的 ldh 基因和 TDH3 终止子序列的 1.3kb 的 PCR 片段。这里， 序列 号 9 被设计成添加了对应于 PDC1 基因的起始密码子上游 60bp 的序列。
序列号 9 ：
tctcaattat tattttctac tcataacctc acgcaaaata acacagtcaa atcaatcaaa
atggcaactg tgaaggataa actca
序列号 10 ：
aggcgtatca cgaggccctt
然后， 以质粒 pRS424 作为扩增模板， 通过以寡核苷酸 ( 序列号 11， 12) 作为引物对 的 PCR， 扩增出含有作为酵母选择标记的 TRP1 基因的 1.2kb 的 PCR 片段。这里， 序列号 12 被设计成添加了对应于 PDC1 基因终止密码子下游 60bp 的序列。 序列号 11 ：
gaattaattc ttgaagacga aagggcctcg tgatacgcct agattgtact gagagtgcac
序列号 12 ：
tatttttcgt tacataaaaa tgcttataaa actttaacta ataattagag attaaatcgc
ctgtgcggta tttcacaccg
用 1％琼脂糖凝胶电泳分离各个 DNA 片段， 按常规方法纯化。 通过以混合了由此获 得的各 1.3kb 片段、 1.2kb 片段的混合物作为扩增模板， 以寡核苷酸 ( 序列号 9， 12) 作为引 物对的 PCR 法， 扩增出了在 5 末端·3 末端分别添加了对应于 PDC1 基因的上游·下游 60bp 序列的连接了非洲爪蟾来源的 ldh 基因、 TDH3 终止子和 TRP1 基因的约 2.5kb 的 PCR 片段。
用 1％琼脂糖凝胶电泳分离上述 PCR 片段， 按常规方法纯化后， 转化酵母酿酒酵母 NBRC10505 株， 用色氨酸非添加培养基进行培养， 选择出非洲爪蟾来源的 ldh 基因导入在染 色体上的 PDC1 基因启动子的下游的转化株。
按下述方式对上述获得的转化株为非洲爪蟾来源的 ldh 基因导入在染色体上 PDC1 基因启动子下游的酵母进行确认。首先， 用基因组 DNA 提取试剂盒 Gen とるくん (TakaraBio 公司制 ) 制备转化株的基因组 DNA， 以其作为扩增模板， 通过以寡核苷酸 ( 序列 号 12， 13) 作为引物对的 PCR， 确认获得了约 2.8kb 的扩增 DNA 片段。而且， 非转化株中， 通 过上述 PCR 获得了约 2.1kb 的扩增 DNA 片段。以下， 将上述非洲爪蟾来源的 ldh 基因导入 在染色体上 PDC1 基因启动子下游的转化株称为 B2 株。而且， PDC1 基因的上游和下游序列 可以从酵母属基因组数据库 (URL ： http://www.yeastgenome.org/) 获得。
序列号 13 ： caaatatcgt ttgaatattt ttccg
以下， 获得了使记载于国际公开 WO2007/043253 号小册子中的 pdc1 基因被置换成 TRP1 标记， 并且 pdc5 基因中有温度感受性变异的酵母 SW015 株与上述获得的 B2 株发生接
合的 2 倍体细胞。使该 2 倍体细胞在子囊形成培养基中形成子囊。用显微操作器解剖子 囊， 获得各个单倍体细胞， 研究各个单倍体细胞的营养需求性。从获得的单倍体细胞中， 选 择出在 pdc1 基因座插入了非洲爪蟾来源的 ldh 基因， 且 pdc5 基因中具有温度感受性变异 的 (34℃下不能生长 ) 株。获得的酵母株称为 SU014 株。
此外， 通过在下述所示条件下用 HPLC 法测定在 SC 培养基 (METHODS IN YEAST GENETICS 2000EDITION、 CSHL PRESS) 上培养了转化细胞的培养上清中含有乳酸确定了 SU014 株是否具有乳酸生产能力。
柱： Shim-Pack SPR-H( 岛津公司制 )
移动相 ： 5mM 对甲苯磺酸 ( 流速 0.8mL/ 分钟 )
反应液 ： 5mM 对甲苯磺酸、 20mM Bis-Tris、 0.1mM EDTA·2Na( 流速 0.8mL/ 分钟 )
检测方法 ： 导电性
温度 ： 45℃
此外， L- 乳酸的光学纯度测定在以下条件下通过 HPLC 法测定。
柱： TSK-gel Enantio LI( 注册商标 ： 东曹公司制 )
移动相 ： 1mM 硫酸铜水溶液
流速 ： 1.0ml/ 分钟
检测方法 ： UV254nm
温度 ： 30℃
另外， L- 乳酸的光学纯度用下式计算。
光学纯度 (％ ) ＝ 100×(L-D)/(L+D)
其中， L 表示 L- 乳酸的浓度， D 表示 D- 乳酸的浓度。
HPLC 分析的结果是， 检测到了 L- 乳酸， D- 乳酸为检测限界以下。根据以上研究， 确认了该 SU014 株具有 L- 乳酸生产能力。
( 参考例 2) 分离膜的制作方法
本发明中， 使用按以下方法制作的多孔性膜作为分离膜。
分别使用聚偏氟乙烯 (PVDF) 树脂作为树脂， 分子量为约 20,000 的聚乙二醇 (PEG) 作为开孔剂， N， N- 二甲基乙酰胺 (DMAc) 作为溶剂， 并且使用纯水作为非溶剂， 在 90℃的温 度下将它们充分搅拌， 获得了具有以下组成的原液。
·PVDF ： 13.0 重量％
·PEG ： 5.5 重量％
·DMAc ： 78.0 重量％
·纯水 ： 3.5 重量％
接着， 上述原液在冷却到 25℃的温度后， 涂布在密度为 0.48g/cm3、 厚度为 220μm 的聚酯纤维制无纺布 ( 多孔质基材 ) 上， 涂布后， 立即浸渍于 25 ℃的纯水中 5 分钟， 再浸 渍于 80℃温度的热水中 3 次， 洗出 DMAc 和 PEG， 获得了具有多孔质树脂层的多孔性膜 ( 分 离膜 )。在该分离膜的涂布了原液的一侧， 用倍率 10,000 倍的扫描型电子显微镜观察多 孔质树脂层表面的 9.2μm×10.4μm 的范围， 能够观察到的所有细孔的直径的平均值为 0.02μm。对该分离膜的纯水透水量进行评价， 结果是 2×10-9m3/(m2·s·Pa)。通过逆浸透 膜， 使用 25℃温度的纯化水， 以落差高度 1m 进行透水量的测定。平均细孔径的标准偏差为0.0055μm， 膜表面粗糙度为 0.1μm。
( 参考例 3) 具有乳酸生产能力的酵母通过分离膜进行的过滤连续培养
本发明中， 使用参考例 1 中制作的 SU014 株， 通过图 1 所示的连续培养装置进行过 滤连续培养。使用表 1 所示组成的乳酸发酵培养基作为培养基。该培养基， 在 121℃温度 15 分钟、 高压 (2 个大气压 ) 蒸气灭菌处理后再使用。作为分离膜元件部件， 使用不锈钢和 聚砜树脂的成型品， 使用参考例 2 中制作的多孔性膜作为分离膜。本实施例中的运转条件 只要没有预先特别说明， 为如下条件。
反应槽容量 ： 2(L)
发酵反应槽容量 ： 1.5(L)
使用分离膜 ： PVDF 过滤膜 ( 参考例 2 中制作 )
膜分离元件有效过滤面积 ： 120 平方 cm
温度调整 ： 30(℃ )
发酵反应槽通气量 ： 空气 0.01(L/ 分钟 )、 氮气 0.19(L/ 分钟 )
发酵反应槽搅拌速度 ： 800( 转 / 分钟 )
pH 调整 ： 用 1N NaOH 调整到 pH5
消泡剂 ： 每 3 小时添加 200μl 灭菌的消泡剂 PE-L( 和光纯药公司制 )
灭菌 ： 含有分离膜元件的培养槽和使用的培养基全都用高压灭菌器进行 121℃、 20 分钟的高压蒸气灭菌
[ 表 1]
首先， 在试管中用 10ml 的乳酸发酵培养基振荡培养 SU014 株一晚 ( 前前前培养 )。 将获得的培养液接种在 100ml 新鲜的乳酸发酵培养基中， 在 500ml 容坂口烧瓶中 30℃振荡 培养 24 小时 ( 前前培养 )。将前前培养液接种于图 1 所示的连续培养装置的 1.5L 的乳酸 发酵培养基 ( 葡萄糖浓度为 70g/L) 中， 用附带的搅拌机 5 以 400 转 / 分钟搅拌反应槽 1， 进 行反应槽 1 的通气量的调整、 温度调整、 pH 调整， 进行 24 小时培养 ( 前培养 )。前培养结束 后， 立即进行乳酸发酵培养基的连续供给， 一边控制膜透过水量以使得连续培养装置的发 酵液量达 1.5L， 一边进行连续培养， 通过连续培养进行乳酸的制造。适当地， 测定膜透过发
酵液中生产的乳酸浓度和残存葡萄糖浓度。此外， 根据该乳酸和由葡萄糖浓度计算出的投 入葡萄糖， 求出乳酸对糖收率、 乳酸生产速度。 而且， 葡萄糖浓度的测定中采用 “葡萄糖 Test Wako C” ( 注册商标 )( 和光纯药公司制 )。其结果确认了， 可以实现长达 200 小时的稳定的 连续培养， 经过 200 小时后， 乳酸蓄积浓度降低导致了乳酸对糖收率和乳酸生产速度降低。
( 实施例 1) 连续培养中的基因表达变化
为了研究参考例 3 中进行的连续培养中的基因表达量的变化， 获得自参考例 3 中 进行的连续培养开始 70 小时和 210 小时的培养液样品， 从酵母菌体中提取总 RNA。如下进 行总 RNA 的提取， 将获得的酵母按达到 OD600 ＝ 0.2 悬浮于 10ml 的破碎用缓冲液 (50mM 醋 酸钠 (pH5.3)、 10mM EDTADEPC 处理 )， 转移到 50ml 管中。加入 500μl 的 20％ SDS， 并加入 预先保温在 65℃的 12ml 的苯酚 ( 破碎缓冲液饱和 )， 用旋涡混合器搅拌 5 秒。65℃保温 4 分钟后， 在干冰 / 乙醇浴中快速冷却到室温。在室温离心分离 (5 分钟， 12000G)， 将水性上 清转移到新的 50ml 管中， 加入等量 PCI(pH5.3)， 进行提取。将该水性上清转移到新的 50ml 管中， 加入等量的氯仿， 进行提取。将该水性上清转移到新的 50ml 管中， 加入 1/10 量的 3M 醋酸钠 (pH5.3)， 进行乙醇沉淀。用 80％乙醇清洗沉淀物两次， 进行干燥， 溶解于无 RNA 水 中， 将其作为总 RNA 样本。
用吸光度计测定上述获得的总 RNA 样本的浓度， 采用其中 1μg， 用于 DNA 微阵列分 析。作为 DNA 微阵列， 使用东丽公司制的 “3D-Gene” ， 具体按照附带的操作规程。扫描仪使 用 ScanArray Express(PerkinElmer)， 扫描在 Cyanine 5(PMT 值 55％ )( 培养开始后经过 210 小时后的平均荧光光度测定用 )、 Cyanine 3(PMT 值 70％ )( 培养开始后经过 70 小时后 的平均荧光光度测定用 ) 的条件下进行， 获得图像。根据获得的图像， 用 GenePix Pro 5.0 软件 (Axon Instruments)， 将各点的荧光强度数值化， 计算出其中间值。然后， 计算出各样 品中所有点的平均荧光强度。
其结果是， 作为培养开始后 70 小时的样品中显示出平均荧光强度的 10 倍以上数 值的基因， 可以确认 CDC19 基因， IPP1 基因、 ARF1 基因， CUP5 基因、 RPL28 基因、 TRX2 基因， HSP104 基因， AHP1 基因， YMR122W-A， CIT1 基因， RPS15 基因， ALD4 基因， YPL225W、 HSP26 基 因， PGK1 基因， SED1 基因， MFA1 基因、 HYP2 基因， HSP12 基因， QCR6 基因， HXK1 基因， TDH3 基 因， ENO1 基因， BGL2 基因， YJL133C-A， QCR8 基因， FBA1 基因， CWP2 基因， CCW12 基因， TMA10 基因， SIP18 基因， HOR7 基因， CCW14 基因、 PIR3 基因， 而且， 作为培养开始后 210 小时的样 品中显示出平均荧光强度的 10 倍以上数值的基因， 可以确认 CYS3 基因， CDC48 基因， LYS20 基因， HSP31 基因， ARG5， 6 基因， RPS24A 基因， RPL29 基因， RPL24A 基因， ADH4 基因， MUP1 基 因， RPL11B 基因， THI4 基因， RPL24B 基因， RPS0A 基因， RPL27A 基因， RPL16A 基因， RPS21B 基 因， RPS5 基因， HOM6 基因， PDC5 基因， THI7 基因， MET17 基因， ECM40 基因， ARG1 基因、 ZPS1 基因， IDH2 基因， CDC19 基因、 IPP1 基因， ARF1 基因， RPL28 基因， TRX2 基因， HSP104 基因， AHP1 基因， CIT1 基因， RPS15 基因， ALD4 基因， YPL225X， CCW12 基因。其结果示于表 2。
[ 表 2]
根据该结果， 清楚了在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母一边进行连续 培养中， 培养开始后 50 小时之后基因表达量为全部基因平均相对表达量的 10 倍以上的基 因。
( 实施例 2)ldh 基因向 SED1、 CWP2、 ENO1 基因座的导入
基于实施例 1 中获得的结果， 在 SED1 基因、 CWP2 基因和 ENO1 基因座中导入序列 号 4 记载的 ldh 基因。
向 SED1 基因座的导入， 以参考例 1 制作的 pTRS102 作为扩增模板， 通过以寡核苷 酸 ( 序列号 10， 14) 作为引物对的 PCR， 扩增了含有非洲爪蟾来源的 ldh 基因和 TDH3 终止子 序列的 1.3kb 的 PCR 片段。这里， 序列号 14 被设计成添加了对应于 SED1 基因起始密码子 上游 60bp 的序列。
序列号 14 ：
tattgattta tagtcgtaac tacaaagaca agcaaaataa aatacgttcg ctctattaag
Atggcaactg tgaaggataa actca
接着， 以质粒 pRS423 作为扩增模板， 通过以寡核苷酸 ( 序列号 11， 15) 作为引物对 的 PCR， 扩增了含有作为酵母选择标记的 HIS3 基因的约 1.3kb 的 PCR 片段。这里， 序列号 18 被设计成添加了对应于 SED1 基因终止密码子下游 60bp 的序列。
序列号 15 ：
aaaaaataac ataatactga aagaaagcat taagaaggcg gatgtgtcaa acaccaccgt ctgtgcggta tttcacaccg
用 1％琼脂糖凝胶电泳分离各个 DNA 片段， 按常规方法纯化。 以混合了由此获得的 两种约 1.3kb 片段的混合物作为扩增模板， 通过以寡核苷酸 ( 序列号 14， 15) 作为引物对的 PCR 法， 扩增出了在 5 末端·3 末端分别添加了对应于 SED1 基因上游·下游 60bp 的序列的 连接了非洲爪蟾来源的 ldh 基因、 TDH3 终止子和 HIS3 基因的约 2.6kb 的 PCR 片段。
用 1％琼脂糖凝胶电泳分离上述 PCR 片段， 按常规方法纯化后， 转化 SU014 株， 用未 添加组氨酸的培养基进行培养， 选择出非洲爪蟾来源的 ldh 基因导入在染色体上的 SED1 基 因启动子下游的转化株。
按下述方式对上述获得的转化株为非洲爪蟾来源的 ldh 基因导入在染色体上 SED1 基因启动子下游的酵母进行确认。首先， 用基因组 DNA 提取试剂盒 Gen とるくん (TakaraBio 公司制 ) 制备转化株的基因组 DNA， 以其作为扩增模板， 通过以寡核苷酸 ( 序列 号 16， 17) 作为引物对的 PCR， 确认获得了约 2.9kb 的扩增 DNA 片段。另外， 非转化株中， 通 过上述 PCR 获得了约 1.4kb 的扩增 DNA 片段。以下， 将上述非洲爪蟾来源的 ldh 基因导入 在染色体上 SED1 基因启动子下游的转化株称为 SU015 株。
序列号 16 ：
tagattggcc gtaggggctg
序列号 17 ：
cacgcaacgc gtaagaaaca
然后， 向 CWP2 基因座的导入， 以参考例 1 制作的 pTRS102 作为扩增模板， 通过以寡 核苷酸 ( 序列号 10， 18) 作为引物对的 PCR， 扩增了含有非洲爪蟾来源的 ldh 基因和 TDH3 终 止子序列的 1.3kb 的 PCR 片段。其中， 序列号 21 被设计成添加了对应于 CWP2 基因的起始 密码子上游 60bp 的序列。
序列号 18 ：
cttctcataa tcaagaataa ataacttcat cacattcgct acacactaac aagaaaaaaa
atggcaactg tgaaggataa actca
然后， 以质粒 pRS423 作为扩增模板， 通过以寡核苷酸 ( 序列号 11， 19) 作为引物对 的 PCR， 扩增了含有作为酵母选择标记的 HIS3 基因的 1.3kb 的 PCR 片段。这里， 序列号 19 被设计成添加了对应于 CWP2 基因的终止密码子下游 60bp 的序列。
序列号 19 ：
ctagtaaaac cgaaaatttt gaaaaaagcc atatagatat tataaaaaat cagagatttc
ctgtgcggta tttcacaccg
用 1％琼脂糖凝胶电泳分离各个 DNA 片段， 按常规方法纯化。 以混合了由此获得的 两种约 1.3kb 片段的混合物作为扩增模板， 通过以寡核苷酸 ( 序列号 18， 19) 作为引物对的 PCR 法， 扩增出了在 5 末端·3 末端分别添加了对应于 CWP2 基因的上游·下游 60bp 的序列 的、 连接了非洲爪蟾来源的 ldh 基因、 TDH3 终止子和 HIS3 基因的约 2.6kb 的 PCR 片段。
用 1％琼脂糖凝胶电泳分离上述 PCR 片段， 按常规方法纯化后， 转化 SU014 株， 用组 氨酸非添加培养基培养， 选择出非洲爪蟾来源的 ldh 基因导入在染色体上的 CWP2 基因启动 子下游的转化株。
按下述方式对上述获得的转化株为非洲爪蟾来源的 ldh 基因导入在染色体上 CWP2 基因启动子下游的酵母进行确认。首先， 用基因组 DNA 提取试剂盒 Gen とるくん (TakaraBio 公司制 ) 制备转化株的基因组 DNA， 以其作为扩增模板， 通过以寡核苷酸 ( 序列 号 20， 21) 作为引物对的 PCR， 确认获得了约 2.9kb 的扩增 DNA 片段。另外， 非转化株中， 通 过上述 PCR 获得了约 0.7kb 的扩增 DNA 片段。以下， 将上述非洲爪蟾来源的 ldh 基因导入 在染色体上 CWP2 基因启动子下游的转化株称为 SU016 株。
序列号 20 ：
aaacagagaa atgtaacgtt
序列号 21 ：
cattcgaaga gaaatcacag
然后， 向 ENO1 基因座的导入， 以参考例 1 制作的 pTRS102 作为扩增模板， 通过以寡 核苷酸 ( 序列号 10， 22) 作为引物对的 PCR， 扩增了含有非洲爪蟾来源的 ldh 基因和 TDH3 终 止子序列的 1.3kb 的 PCR 片段。其中， 序列号 22 被设计成添加了对应于 ENO1 基因的起始 密码子上游 60bp 的序列。
序列号 22 ：
ctagctattt ttcataaaaa accaagcaac tgcttatcaa cacacaaaca ctaaatcaaa
atggcaactg tgaaggataa actca
然后， 以质粒 pRS426 作为扩增模板， 通过以寡核苷酸 ( 序列号 11， 23) 作为引物对 的 PCR， 扩增了含有作为酵母选择标记的 URA3 基因的约 1.3kb 的 PCR 片段。这里， 序列号 23 被设计成添加了对应于 ENO1 基因的终止密码子下游 60bp 的序列。
序列号 23 ：
gaaaatgaaa taaatgacaa aaaaacgtgt tttttggact agaaggctta atcaaaagct
ctgtgcggta tttcacaccg
用 1％琼脂糖凝胶电泳分离各个 DNA 片段， 按常规方法纯化。以混合了由此获得 的两种 1.3kb 片段的混合物作为扩增模板， 通过以寡核苷酸 ( 序列号 22， 23) 作为引物对的PCR 法， 扩增出了在 5 末端·3 末端分别添加了对应于 ENO1 基因的上游·下游 60bp 的序列 的、 连接了非洲爪蟾来源的 ldh 基因、 TDH3 终止子和 URA3 基因的约 2.6kb 的 PCR 片段。
用 1％琼脂糖凝胶电泳分离上述 PCR 片段， 按常规方法纯化后， 转化 SU014 株， 用未 添加尿嘧啶的培养基培养， 选择出非洲爪蟾来源的 ldh 基因导入在染色体上 ENO1 基因启动 子下游的转化株。
按下述方式对上述获得的转化株为非洲爪蟾来源的 ldh 基因导入在染色体上 ENO1 基因启动子下游的酵母进行确认。首先， 用基因组 DNA 提取试剂盒 Gen とるくん (TakaraBio 公司制 ) 制备转化株的基因组 DNA， 以其作为扩增模板， 通过以寡核苷酸 ( 序列 号 24， 25) 作为引物对的 PCR， 确认获得了约 2.9kb 的扩增 DNA 片段。另外， 非转化株中， 通 过上述 PCR 获得了约 1.7kb 的扩增 DNA 片段。以下， 将上述非洲爪蟾来源的 ldh 基因导入 在染色体上 ENO1 基因启动子下游的转化株称为 SU017 株。
序列号 24 ：
aaggtatgcc tctccccgga
序列号 25 ：
cggatacacg cgtcaccaca
然后， 在 SU015 株的 ENO1 基因座上导入非洲爪蟾来源的 ldh 基因。非洲爪蟾来源 的 ldh 基因向 SU015 株的 ENO1 基因座的导入和确认， 用上述获得 SU017 株时进行的方法中 除了使用 SU015 株代替 SU014 株之外其余相同的方法进行。 将获得的转化株称为 SU018 株。
( 实施例 3) 乳酸生产酵母的制作 2
3-1 人来源和肠膜明串珠菌来源的 ldh 基因的克隆
接着， 进行序列号 5、 6 中记载的人来源和肠膜明串珠菌来源的 ldh 基因的克隆。 首 先， 人来源的 ldh 基因的克隆方法如下所述。
培养回收人乳癌株化细胞 (MCF-7) 后， 用 TRIZOL 试剂 (Invitrogen 公司制 ) 提取 总 RNA， 以获得的总 RNA 作为模板， 通过采用 SuperScript Choice System(Invitrogen 公司 制 ) 的逆转录反应进行 cDNA 的合成。这些操作的详细内容按照各个自带的操作规程。以 获得的 cDNA 作为后续 PCR 的扩增模板。
以上述操作获得的 cDNA 作为扩增模板， 通过以序列号 26 和序列号 27 表示的寡核 苷酸作为引物对， 通过 KOD-Plus- 聚合酶进行的 PCR， 克隆 ldh 基因。纯化各 PCR 扩增片段， 用 T4 多核苷酸激酶 ( 宝酒造株式会社制 ) 磷酸化末端后， 连接到 pUC118 载体 ( 用限制性 酶 HincII 切断， 对切断面进行了脱磷酸化处理 ) 中。连接用 DNA 连接试剂盒 Ver.2( 宝酒 造株式会社制 ) 进行。用连接质粒产物转化大肠杆菌 DH5α， 回收质粒 DNA， 获得亚克隆了 人来源 ldh 基因 ( 登录号 ： AY009108、 序列号 5) 的质粒。用限制性酶 XhoI 和 NotI 消化获 得的插入了 ldh 基因的 pUC118 质粒， 将获得的各 DNA 片段插入到酵母表达用载体 pTRS11 的 XhoI/NotI 切断部位。这样一来， 获得了人来源 ldh 基因表达质粒 pTRS48。
下面， 肠膜明串珠菌来源的 ldh 基因的克隆方法如下所述。
肠膜明串珠菌来源 ldh 基因， 参考 Res.Microbiol， 146， 291-302(1995) 中记载的 序列 ( 序列号 6)， 通过应用 PCR 法的基因全合成进行克隆。全合成时， 按在 5 末端侧上添 加 XhoI 识别序列， 在 3 末端侧上添加 NotI 识别序列进行， 将 PCR 片段 TA 克隆到 pTA2 载体 中。连接用 DNA 连接试剂盒 Ver.2( 宝酒造株式会公司制 ) 进行。用连接质粒产物转化大肠杆菌 DH5α， 回收质粒 DNA， 获得亚克隆了肠膜明串珠菌来源的 ldh 基因 ( 序列号 6) 的质 粒。用限制性酶 XhoI 和 NotI 消化获得的插入了 ldh 基因的 pTA2 质粒， 将获得的各 DNA 片 段插入到酵母表达用载体 pTRS11 的 XhoI/NotI 切断部位。这样一来， 获得了肠膜明串珠菌 来源的 ldh 基因表达质粒 pTRS152。
3-2 人来源和肠膜明串珠菌来源的 ldh 基因向染色体的导入
接着， 将序列号 5 和 6 中记载的 ldh 基因导入 PDC1 基因、 SED1 基因、 CWP2 基因和 ENO1 基因座。
以质粒 pTRS48 和 pTRS152 作为扩增模板， 通过以序列号 28、 10(pTRS48)， 序列号 29、 10(pTRS152) 表示的寡核苷酸作为引物对的 PCR， 分别扩增出 1.3kb 的含有人来源 ldh 基因和酿酒酵母来源的 TDH3 基因的终止子序列的 DNA 片段， 和含有肠膜明串珠菌来源的 ldh 基因和酿酒酵母来源的 TDH3 基因的终止子序列的 DNA 片段。此外， 通过以质粒 pRS424 作为扩增模板， 以序列号 11 和序列号 12 表示的寡核苷酸作为引物对的 PCR， 扩增出 1.2kb 的含酿酒酵母来源的 TRP1 基因的 DNA 片段。通过 1.5％琼脂糖凝胶电泳分离各个 DNA 片 段， 按常规方法纯化。通过以混合了由此获得的 1.3kb 片段、 1.2kb 片段的混合物作为扩增 模板， 以序列号 28， 12 和序列号 29， 12 表示的寡核苷酸作为引物对的 PCR 法获得的产物， 对 其分别进行 1.5％琼脂糖凝胶电泳， 按照常规方法制备了连接有人来源 LDH 基因和 TRP1 基 因的 2.5kb 的 DNA 片段、 连接有肠膜明串珠菌来源的 ldh 基因和 TRP1 基因的 2.5kb 的 DNA 片段。按照常规方法， 用该 2.5kb 的 DNA 片段转化出芽酵母 NBRC10505 株， 成为色氨酸非需 求性。
按上述方式获得的转化株为人来源的 ldh 基因或肠膜明串珠菌来源的 ldh 基因导 入在染色体上 PDC1 基因启动子下游的酵母的确认按照与参考例 1 所示的方法相同的方法 进行。
然后， 用与参考例 1 相同的方法， 制备人来源 ldh 基因或肠膜明串珠菌来源 ldh 基 因被导入在染色体上 PDC1 基因启动子下游的酵母中， pdc5 基因中具有温度感受性变异的 酵母。分别被称为 SU019 株、 SU024 株。
向 SED1、 CWP2、 ENO1 基因座的导入用与实施例 2 相同的方法， 改变引物进行。改变 的引物如下所述。
SED1 基因座导入用引物
为人来源 ldh 基因时用序列号 30 代替实施例 2 中使用的序列号 14 的引物， 为肠 膜明串珠菌来源的 ldh 基因时， 变化成序列号 33 的引物， 用获得的 PCR 片段， 将 SU019， 024 株分别转化成组氨酸非需求型。将获得的转化株分别称为 SU020 株 ( 人来源 ldh 基因导入 株 )， SU025 株 ( 肠膜明串珠菌来源的 ldh 基因导入株 )。
CWP2 基因座导入用引物
为人来源 ldh 基因时用序列号 31 代替实施例 2 中使用的序列号 18 的引物， 为肠 膜明串珠菌来源的 ldh 基因时， 将序列号 31 换成序列号 34 的引物， 用获得的 PCR 片段分别 转化 SU019， 024 株成组氨酸非需求型。将获得的转化株分别称为 SU021 株 ( 人来源 ldh 基 因导入株 )， SU026 株 ( 肠膜明串珠菌来源的 ldh 基因导入株 )。
ENO1 基因座导入用引物
为人来源 ldh 基因时用序列号 32 代替实施例 2 中使用的序列号 22 的引物， 为肠膜明串珠菌来源的 ldh 基因时， 变成序列号 35 的引物， 用获得的 PCR 片段， 分别转化 SU019， 024 株成尿嘧啶非需求型。将获得的转化株分别称为 SU022 株 ( 人来源 ldh 基因导入株 )， SU027 株 ( 肠膜明串珠菌来源的 ldh 基因导入株 )。再将 SU020， 025 株同样转化成尿嘧啶 非需求型型， 分别获得了 SU023 株 ( 人来源 ldh 基因导入株 )， SU028 株 ( 肠膜明串珠菌来 源的 ldh 基因导入株 )。
( 实施例 4) 通过分批培养进行的乳酸发酵试验
使用参考例 1(SU014) 和实施例 2、 3 中获得的 SU015 ～ SU028 株， 通过分批培养进 行乳酸发酵试验。将表 1 所示的乳酸发酵培养基置于 10mL 试管中， 在其中分别接种少量的 SU014 ～ SU028 株， 于 30℃培养一晚 ( 前前培养 )。然后， 将新鲜的表 1 所示的 100mL 乳酸 发酵培养基装入容量为 500ml 的三角烧瓶， 将各前前培养液分别总量接种， 30℃振荡培养 24 小时 ( 前培养 )。然后， 在投入了 1L 表 1 所示的乳酸发酵培养基的小型发酵罐 ( 丸菱バ イオエンジ社制， 容量 5L) 中分别接种所有前培养开始 24 小时后的前培养液， 使搅拌速度 (120 转 / 分钟 )、 通气量 (0.1L/ 分钟 )、 温度 (30℃ )、 pH(pH5) 维持一定， 进行培养 ( 本培 养 )。而且， 用 1NNaOH 进行中和， 用天秤测定重量变化， 测量投入量。对本培养开始后 40 小 时的培养液进行离心分离， 对获得的上清进行膜过滤后， 按参考例 1 所示的方法， 计算乳酸 蓄积浓度。葡萄糖浓度的测定采用 “葡萄糖 Test WakoC” ( 注册商标 )( 和光纯药公司制 )。
根据测定结果计算出的乳酸的对糖收率示于表 3。 此外， 用参考例 1 所示的方法测 定乳酸的光学纯度的结果是， SU014 ～ 023 中只检测到 L- 乳酸， D- 乳酸在检测限界以下， SU024 ～ 028 中只检测到 D- 乳酸， L- 乳酸在检测限界以下。
[ 表 3]
根据该结果， 可以确认， 在酵母中导入了在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力 的酵母一边进行连续培养中、 培养开始后 50 小时之后基因表达量为全部基因平均相对 表达量的 10 倍以上的基因的启动子下游具有 ldh 基因的乳酸脱氢酶表达盒的 SU015 ～ SU018( 非洲爪蟾来源的 ldh 基因导入株 )、 SU020 ～ 024( 人来源 ldh 基因导入株 )、 SU025 ～ 028( 肠膜明串珠菌来源的 ldh 基因导入株 ) 中， 分别与 SU014、 SU019、 SU024 相比， 均获得 了高乳酸收率。
( 实施例 5) 通过连续培养进行的乳酸发酵试验
用实施例 2、 3 获得的转化酵母 SU015 ～ 028， 通过图 1 所示的连续培养装置进行过 滤连续培养。使用表 1 所示组成的乳酸发酵培养基的葡萄糖浓度改变成 70g/L 的培养基作 为培养基。该培养基在 121℃高压 (2 个大气压 ) 蒸气灭菌处理 15 分钟后再使用。作为分 离膜元件部件， 使用不锈钢和聚砜树脂的成型品。使用参考例 2 中制作的多孔性膜作为分 离膜。本实施例中的运转条件只要没有预先特别说明， 为如下条件。
反应槽容量 ： 2(L)
发酵反应槽容量 ： 1.5(L)
使用分离膜 ： PVDF 过滤膜 ( 参考例 2 中制作 )
膜分离元件有效过滤面积 ： 120 平方 cm
温度调整 ： 30(℃ )
发酵反应槽通气量 ： 空气 0.01(L/ 分钟 )、 氮气 0.19(L/ 分钟 )
发酵反应槽搅拌速度 ： 800( 转 / 分钟 )
pH 调整 ： 用 5N 氢氧化钙调整到 pH5
消泡剂 ： 每 3 小时添加 200μl 灭菌的消泡剂 PE-L( 和光纯药公司制 )
灭菌 ： 含有分离膜元件的培养槽和使用的培养基全都用的高压灭菌器进行 121℃、 20 分钟的高压蒸气灭菌
首先， 在试管中用 10ml 表 1 所示的乳酸发酵培养基振荡培养 SU015 ～ SU028 株 一晚 ( 前前前培养 )。在新鲜的表 1 所示的 100ml 乳酸发酵培养基中分别接种所有获得的 培养液， 用 500ml 容坂口烧瓶， 30℃振荡培养 24 小时 ( 前前培养 )。将前前培养液接种于 图 1 所示的连续培养装置的 1.5L 的乳酸发酵培养基中， 用附带的搅拌机 5 以 400 转 / 分钟 搅拌反应槽 1， 进行反应槽 1 的通气量的调整、 温度调整、 pH 调整， 进行 24 小时培养 ( 前培 养 )。前培养结束后， 立即进行乳酸发酵培养基的连续供给， 一边控制膜透过水量以使得连 续培养装置的发酵液量达 1.5L， 一边进行连续培养， 通过连续培养进行乳酸的制造。适当 地， 测定膜透过发酵液中生产的乳酸浓度和残存葡萄糖浓度。乳酸蓄积浓度的测定用参考 例 1 所示的方法进行， 葡萄糖浓度测定采用 “葡萄糖 Test Wako C” ( 注册商标 )( 和光纯药 公司制 )。 此外， 根据该乳酸和由葡萄糖浓度计算出的投入葡萄糖， 求出乳酸对糖收率、 乳酸 生产速度， 与参考例 1 的结果一起示于表 4、 表 5。计算用式 3 进行， 表中的时间表示培养开 始后经过的时间。
[ 表 4]
[ 表 5]
其结果表明， 在酵母中导入了在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母一边 进行连续培养中， 培养开始后 50 小时之后基因表达量为全部基因平均相对表达量的 10 倍 以上的基因的启动子下游具有 ldh 基因的乳酸脱氢酶表达盒的 SU015 ～ SU018、 SU020 ～ 023 和 SU025 ～ 028 株中， 直到 300 小时都能够稳定维持高收率和高生产速度。另一方面， 在参考例 1(SU014) 和 SU019、 SU024 株中， 如果超过 200 小时， 收率·乳酸生产速度急速减 少。此外， 按参考例 1 所示的方法测定各样品的光学纯度时， SU014 ～ 023 中只检测到 L- 乳 酸， D- 乳酸在检测限界以下， 在 SU024 ～ 028 中只检测到 D- 乳酸， L- 乳酸在检测限界以下。
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