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双特异性抗 -HER 抗体
    相关申请
     本 申 请 根 据 35USC 119(e) 要 求 2009 年 3 月 20 日 提 交 的 美 国 临 时 申 请 号 61/210562 的优先权的权益， 其公开的全文通过引用并入本文。
     发明领域
     本发明涉及抗 HER 抗体， 包括多特异性抗 HER 抗体， 其具有对于至少两种不同 HER 受体的结合特异性， 以及所述抗体治疗疾病或病症的用途。
     发明背景
     受体酪氨酸激酶的 HER 家族是细胞生长、 分化和存活的重要介质。该受体家族包 括四个独特的成员， 包括表皮生长因子受体 (EGFR、 ErbB1 或 HER1)、 HER2(ErbB2 或 p185neu)、 HER3(ErbB3) 和 HER4(ErbB4 或 tyro2)。
     由 erbB1 基因编码的 EGFR 已被认为是人类恶性肿瘤的病因。 具体而言， 在乳腺癌、 膀胱癌、 肺癌、 头癌、 颈癌和胃癌以及成胶质细胞瘤中已经观察到 EGFR 表达的升高。 EGFR 受 体表达的升高常常与由同样的肿瘤细胞的 EGFR 配体， 转化生长因子 α(TGF-α) 的产量增 加有关， 其通过自分泌刺激途径导致受体活化。 Baselga 和 Mendelsohn Pharmac.Ther.( 药 学理论 )64 ： 127-154(1994)。针对 EGFR 或其配体 TGF-α 和 EGF 的单克隆抗体已经作为治 疗此类恶性肿瘤的治疗剂进行了评估。 参见例如 Baselga 和 Mendelsohn， 见上文 ； Masui 等， Cancer Research( 癌症研究 )44 ： 1002-1007(1984) ； 和 Wu 等， J.Clin.Invest.( 临床研究 杂志 )95 ： 1897-1905(1995)。
     HER 家族的第二个成员 HER2(p185neu) 最初被鉴定成转化基因的产物， 来自经化 学处理的大鼠的成神经细胞瘤。neu 原癌基因的活化形式产生自所编码蛋白质跨膜区中 的点突变 ( 缬氨酸变成谷氨酸 )。在乳腺癌和卵巢癌中观察到 neu 的人同系物的扩增， 而 且 这 与 预 后 不 良 有 关 (Slamon 等， Science( 科 学 )， 235 ： 177-182(1987) ； Slamon 等， Science( 科学 )， 244 ： 707-712(1989) ； 和美国专利 4,968,603)。在其它癌瘤中也已观察 到 HER2 的过表达 ( 频繁但不均一， 原因在于基因扩增 )， 所述癌瘤包括胃、 子宫内膜、 唾液 腺、 肺、 肾、 结肠、 甲状腺、 胰和膀胱的癌瘤。参见 King 等， Science( 科学 )， 229 ： 974(1985) ； Yokota 等， Lancet( 柳叶刀 ) ： 1： 765-767(1986) ； Fukushige 等， Mol Cell Biol.( 分子细 胞生物学 )， 6： 955-958(1986) ； Guerin 等， Oncogene Res.( 癌基因研究 )， 3： 21-31(1988) ； Cohen 等， Oncogene( 癌基因 )， 4： 81-88(1989) ； Yonemura 等， Cancer Res.( 癌症研究 )， 51 ： 1034(1991) ； Borst 等， Gynecol.Oncol.， 38 ： 364(1990) ； Weiner 等， Cancer Res.( 癌 症 研 究 )， 50 ： 421-425(1990) ； Kern 等， Cancer Res.( 癌 症 研 究 )， 50 ： 5184(1990) ； Park 等， Cancer Res.( 癌 症 研 究 )， 49 ： 6605(1989) ； Zhau 等， Mol.Carcinog.( 分 子 致 癌 作 用 )， 3： 254-257(1990) ； Aasland 等， Br.J.Cancer( 英 国 癌 症 杂 志 )57 ： 358-363(1988) ； Williams 等， Pathobiology( 病 理 学 )59 ： 46-52(1991) ； 和 McCann 等， Cancer( 癌 症 )， 65 ： 88-92(1990) 等。HER2 可在前列腺癌中过表达 (Gu 等， Cancer Lett.( 癌症通讯 )99 ： 185-9(1996) ； Ross 等， Hum.Pathol.( 人类病理学 )28 ： 827-33(1997) ； Ross 等， Cancer( 癌症 )79 ： 2162-70(1997) ； 和 Sadasivan 等， J.Urol.( 泌尿学杂志 )150 ： 126-31(1993))。 neu
     已经描述了针对大鼠 p185 和人 HER2 蛋白质产物的抗体。Drebin 及其同事 制备了针对大鼠 neu 基因产物， p185neu 的抗体。参见例如 Drebin 等， Cell( 细胞 )41 ： 695-706(1985) ； Myers 等， Meth.Enzym.( 酶学方法 )198 ： 277-290(1991) ； 和 WO94/22478。 neu Drebin 等， Oncogene( 癌基因 )2 ： 273-277(1988) 报道了与 p185 的两个独特区域有反应 性的抗体混合物对植入裸鼠的 neu 转化 NIH-3T3 细胞产生协同的抗肿瘤作用。还可参见 1998 年 10 月 20 日颁发的美国专利 5,824,311。
     Hudziak 等， Mol.Cell.Biol.( 分 子 细 胞 生 物 学 )9(3) ： 1165-1172(1989) 描 述 了一组 HER2 抗体的生成， 并利用人乳房肿瘤细胞系 SK-BR-3 鉴定。通过 72 小时后单 层细胞的结晶紫染色测定了暴露于抗体后 SK-BR-3 细胞的相对细胞增殖。利用此测定 法， 用称作 4D5 的抗体获得了最大抑制， 它抑制细胞增殖达 56 ％。该组其它抗体在此测 定法中将细胞增殖降低至较低程度。还发现抗体 4D5 使过表达 HER2 的乳房肿瘤细胞 系对 TNF-α 的细胞毒性作用变得敏感。还可参见 1997 年 10 月 14 日颁发的美国专利 5,677,171。Hudziak 等人的文章中讨论的 HER2 抗体还在以下文献中进行了表征 ： Fendly 等， Cancer Research( 癌症研究 )50 ： 1550-1558(1990) ； Kotts 等， In Vitro( 体外 )26(3) ： 59A(1990) ； Sarup 等， Growth Regulation( 生 长 调 节 )1 ： 72-82(1991) ； Shepard 等， J.Clin.Immunol.( 临床免疫学 )11(3) ： 117-127(1991) ； Kumar 等， Mol.Cell.Biol.( 分子 细胞生物学 )11(2) ： 979-986(1991) ； Lewis 等， Cancer Immunol.Immunother.( 癌症免疫 学和免疫疗法 )37 ： 255-263(1993) ； Pietras 等， Oncogene( 癌基因 )9 ： 1829-1838(1994) ； Vitetta 等， Cancer Research( 癌症研究 )54 ： 5301-5309(1994) ； Sliwkowski 等， J.Biol. Chem.( 生 物 化 学 杂 志 )269(20) ： 14661-14665(1994) ； Scott 等， J.Biol.Chem.( 生 物 化 学 杂 志 )266 ： 14300-5(1991) ； D ′ souza 等， Proc.Natl.Acad.Sci.( 美 国 国 家 科 学 院 学 报 )91 ： 7202-7206(1994) ； Lewis 等， Cancer Research( 癌症研究 )56 ： 1457-1465(1996) ； 和 Schaefer 等， Oncogene( 癌基因 )15 ： 1385-1394(1997)。
     鼠 HER2 抗体 4D5 的重组人源化型式 ((huMAb4D5-8， rhuMAb HER2， 曲妥珠单抗 (trastuzumab) 或 美国专利 5,821,337) 在临床上对患有 HER2 过表达的转 移性乳腺癌并已接受广泛的早期抗癌疗法的患者起作用 (Baselga 等， J.Clin.Oncol.( 临 床肿瘤学杂志 )14 ： 737-744(1996))。曲妥珠单抗在 1998 年 9 月 25 日得到了食品和药品 管理局的销售许可， 可用于治疗所患肿瘤过表达 HER2 蛋白质的转移性乳腺癌患者。
     以 下 文 献 中 描 述 了 具 有 各 种 特 性 的 其 它 HER2 抗 体 ： Tagliabue 等， Int. J.Cancer( 国 际 癌 症 杂 志 )47 ： 933-937(1991) ； McKenzie 等， Oncogene( 癌 基 因 )4 ： 543-548(1989) ； Maier 等， Cancer Res.( 癌 症 研 究 )51 ： 5361-5369(1991) ； Bacus 等， Molecular Carcinogenesis( 分 子 致 癌 作 用 )3 ： 350-362(1990) ； Stancovski 等， PNAS(USA)88 ： 8691-8695(1991) ； Bacus 等， Cancer Research( 癌 症 研 究 )52 ： 2580-2589(1992) ； Xu 等， Int.J.Cancer( 国际癌症杂志 )53 ： 401-408(1993) ； WO94/00136 ； Kasprzyk 等， Cancer Research( 癌 症 研 究 )52 ： 2771-2776(1992) ； Hancock 等， Cancer Res.( 癌 症 研 究 )51 ： 4575-4580(1991) ； Shawver 等， Cancer Res.( 癌 症 研 究 )54 ： 1367-1373(1994) ； Arteaga 等， Cancer Res.( 癌症研究 )54 ： 3758-3765(1994) ； Harwerth 等， J.Biol.Chem.( 生 物 化 学 杂 志 )267 ： 15160-15167(1992) ； 美 国 专 利 5,783,186 ； 和Klapper 等， Oncogene( 癌基因 )14 ： 2099-2109(1997)。
     同 源 性 筛 选 使 得 HER 受 体 家 族 的 两 个 其 它 成 员 得 以 鉴 定 ： HER3( 美 国 专 利 5,968,511， 5,183,884 和 5,480,968 以 及 Kraus 等， PNAS(USA)86 ： 9193-9197(1989)) 和 HER4( 欧洲专利申请 599,274 ； Plowman 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， ( 美国国家科学院学 报 )， 90 ： 1746-1750(1993) ； 和 Plowman 等， Nature( 自然 )， 366 ： 473-475(1993))。这两种 受体均在至少有些乳腺癌细胞系中展示出表达升高。
     通常发现 HER 受体在细胞中有多种组合， 而且认为它的异二聚化增加了对各种 HER 配体的细胞应答的多样性 (Earp 等， Breast Cancer Research and Treatment( 乳腺癌 研究和治疗 )35 ： 115-132(1995))。EGFR 受到 6 种不同配体的结合 ： 表皮生长因子 (EGF)、 转化生长因子 α(TGF-α)、 双调蛋白、 肝素结合表皮生长因子 (HB-EGF)、 β 动物纤维素和 epiregulin(Groenen 等， Growth Factors( 生长因子 )11 ： 235-257(1994))。由单一基因 的可变剪接产生的一个调蛋白蛋白质家族是 HER3 和 HER4 的配体。调蛋白 (heregulin) 家 族 包 括 α、 β 和 γ 调 蛋 白 (Holmes 等， Science( 科 学 )， 256 ： 1205-1210(1992) ； 美 国 专 利 5,641,869 ； 和 Schaefer 等， Oncogene( 癌 基 因 )15 ： 1385-1394(1997)) ； neu 分 化因子 (NDFs) ； 神经胶质生长因子 (GGFs) ： 乙酰胆碱受体诱导活性 (ARIA) ； 及感觉和 运 动 神 经 元 衍 生 因 子 (SMDF)。 有 关 综 述 参 见 Groenen 等， Growth Factors( 生 长 因 子 )11 ： 235-257(1994) ； Lemke， G.Molec.& Cell.Neurosci.( 分 子 和 细 胞 神 经 科 学 )7 ： 247-262(1996) 和 Lee 等， Pharm.Rev.( 药 学 综 述 )47 ： 51-85(1995)。 还 鉴 定 了 另 外 三 种 HER 配体 ： 神经调节蛋白 -2(NRG-2)， 据报道它结合 HER3 或 HER4(Chang 等， Nature( 自 然 )387509-512(1997) ； 和 Carraway 等， Nature( 自然 )387 ： 512-516(1997)) ； 神经调节蛋 白 -3， 它结合 HER4(Zhang 等， PNAS(USA)94(18) ： 9562-7(1997)) ； 和神经调节蛋白 -4， 它 结合 HER4(Harari 等， Oncogene( 癌基因 )18 ： 2681-89(1999))。HB-EGF、 β 动物纤维素和 epiregulin 也结合 HER4。
     尽管 EGF 和 TGFα 不结合 HER2， 但是 EGF 刺激 EGFR 和 HER2 形成异二聚体， 它活化 EGFR 并导致异二聚体中 HER2 的转磷酸作用。二聚化作用和 / 或转磷酸作用似乎活化 HER2 酪氨酸激酶。 参见 Earp 等， 见上文。 同样， 当 HER3 与 HER2 共表达时， 形成有活性的信号复合 物， 而针对 HER2 的抗体能破坏此复合物 (Sliwkowski 等， J.Biol.Chem.( 生物化学杂志 )， 269(20) ： 14661-14665(1994))。此外， 在与 HER2 共表达时， HER3 对调蛋白 (HRG) 的亲和力 提高到了更高的亲和力状态。关于 HER2-HER3 蛋白质复合物还可参见 Levi 等， Journal of Neuroscience( 神经科学杂志 )15 ： 1329-1340(1995) ； Morrissey 等， Proc.Natl.Acad.Sci. USA( 美国国家科学院学报 )92 ： 1431-1435(1995) ； 和 Lewis 等， Cancer Res.( 癌症研究 )， 56 ： 1457-1465(1996)。HER4， 与 HER3 类似， 与 HER2 形成有活性的信号复合物 (Carraway 和 Cantley， Cell( 细胞 )78 ： 5-8(1994))。
     目前靶向 HER 途径的治疗剂用于治疗疾病诸如乳腺癌、 非小细胞肺癌、 结肠直 肠癌、 头和颈癌和胰腺癌。尽管这些治疗剂具有一些成功， 存在涉及天然和诱导抗性 和 毒 性 的 问 题。Arteaga CL.J Clin Oncol ( 临 床 肿 瘤 学 杂 志 )21 ： 289-91s(2003) ； Hoshi S， 等， Gan To Kagaku Ryoho 31 ： 1209-13(2004) ； Viloria-Petit AM， 和 Kerbel RS.Int J Radiat Oncol Biol Phys 58 ： 914-26(2004) ； Bianco R， 等， Endocr Relat Cancer 12 ： S159-71(2005) ； Engelman JA， 和 Janne PA.， Clin Cancer Res( 临 床 癌 症研 究 )14 ： 2895-9(2008) ； Davoli A， 等， Cancer Chemother Pharmacol.( 癌 症 化 疗 药 学 )65(4) ： 611-23(2010) ； Pohlmann PR， 等， Clin Cancer Res( 临床癌症研究 ).15(24) ： 7479-7491(2009)。具体地， 靶向 HER1(EGFR) 的治疗剂常常与不希望的副作用相关， 诸如显 著水平的皮肤毒性。Robert， 等， Lancet Oncology( 柳叶刀肿瘤学 )6 ： 491-500(2005).
     因此， 存在开发靶向 HER 途径的改善的治疗剂的需要。
     发明概述
     本发明提供多特异性抗体， 其包含特异性结合至少两个 HER 受体的抗原结合结构 域， 所述 HER 受体选自由 (a)EGFR 和 HER2， (b)EGFR 和 HER3， 和 (c)EGFR 和 HER4 组成的组。 所述抗体抑制至少一个所述 HER 受体的生物学活性。在具体的实施方案中， 所述多特异性 抗体特异性结合其靶标 HER 受体并且不特异性结合非靶标 HER 受体。因此， 在一个实施方 案中， 所述抗体特异性结合 EGFR 和 HER3 但是不特异性结合 HER2 或 HER4。在另一个实施方 案中， 所述抗体特异性结合 EGFR 和 HER2 但是不特异性结合 HER3 或 HER4。在另一个实施方 案中， 所述抗体特异性结合 EGFR 和 HER4 但是不特异性结合 HER2 或 HER3。本发明也提供特 异性结合靶标 HER 受体的单特异性抗体。
     本发明一方面提供能够特异性结合 EGFR 和另一个 HER 受体的多特异性抗体， 其比 传统 EGFR 拮抗剂， 诸如西妥昔单抗 (cetuximab) 毒性更低。在一个实施方案中， 所述毒性 是皮肤病学毒性。在一个实施方案中， 多特异性 HER 抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的 抗原结合结构域。 一方面， 本发明提供多特异性抗体， 其包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结 构域。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体比 EGFR 拮抗剂毒性更低。在一个实施方案 中， 所述多特异性抗体抑制 EGFR 和 HER3 中至少一个的生物学活性。在一个实施方案中， 所 述抗体抑制 EGF 结合 EGFR。在另一个实施方案中， 所述抗体抑制 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸 化。在一些实施方案中， 所述抗体抑制肿瘤细胞生长。在一个实施方案中， 所述多特异性抗 体特异性结合 EGFR 和 HER3 但是不特异性结合 HER2 或 HER4。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含以低于 10-6M 的 Kd 特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含以低于 10-6M 的 Kd 特 异性结合 EGFR 并且以低于 10-7M 的 Kd 特异性结合 HER3 的抗原结合结构域。
     在一个实施方案中， 包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域的多特 异 性 抗 体 包 含 (a)HVR-H1， 其 包 含 氨 基 酸 序 列 LSGDWIH(SEQ ID NO ： 48) ； (b)HVR-H2， 其 包 含 氨 基 酸 序 列 VGEISAAGGYTD(SEQ ID NO ： 51) ； 和 (c)HVR-H3， 其包含氨基酸序列 ARESRVSFEAAMDY(SEQ ID NO ： 53) ； 和 (d)HVR-L1， 其包含氨基酸序列 NIATDVA(SEQ ID NO ： 55) ； (e)HVR-L2， 其包含氨基酸序列 SASF(SEQ ID NO ： 56) ； 和 (f)HVR-L3， 其包含氨基酸序 列 SEPEPYT(SEQ ID NO ： 57)。
     在一个实施方案中， 包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域的多特异性 抗体包含 (a) 重链可变结构域， 其与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 30 具有至少 95％的序列同一 性； (b) 轻链可变结构域， 其与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 具有至少 95％的序列同一性 ； 或 (c) 如 (a) 中的重链可变结构域序列和如 (b) 中的轻链可变结构域序列。在一个实施方案 中， 包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域的多特异性抗体包含 SEQ ID NO ： 30 的 重链可变结构域序列。在一个实施方案中， 包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构
     域的多特异性抗体包含 SEQ ID NO ： 29 的轻链可变结构域序列。 在另一个实施方案中， 包含 特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域的多特异性抗体包含 SEQ ID NO ： 30 的重链可 变结构域序列和 SEQ ID NO ： 29 的轻链可变结构域序列。
     在一些实施方案中， 包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域的多特异性 抗体是全长 IgG1 抗体。
     本发明的一方面提供编码所述多特异性 HER 抗体的分离的核酸。另一方面提供包 含编码所述多特异性 HER 抗体的核酸的宿主细胞。还一方面提供产生多特异性 HER 抗体的 方法， 包括培养包含编码所述多特异性 HER 抗体的核酸的宿主细胞， 从而产生所述的抗体。
     本发明一方面提供包含多特异性 HER 抗体和细胞毒性剂的免疫缀合物。另一方面 提供包含多特异性 HER 抗体和药用载体的药物制剂。
     本发明一方面提供治疗患有癌症的个体的方法， 包括向所述个体施用有效量的多 特异性 HER 抗体。在一个实施方案中， 所述多特异性 HER 抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域。在一个实施方案中， 通过所述多特异性 HER 抗体治疗的癌症包含表达 EGFR 和 HER3 的细胞。在一个实施方案中， 通过所述多特异性 HER 抗体治疗的癌症是乳腺 癌 (breast cancer)、 结肠直肠癌 (colorectal cancer)、 胰腺癌 (pancreatic cancer)、 头 和颈癌 (head and neck cancer)、 黑素瘤 (melanoma)、 卵巢癌 (ovarian cancer)、 前列腺癌 (prostate cancer) 或非小细胞肺癌 (non-small lung cell cancer)。 本发明另一方面提供抑制个体中 HER 受体生物学活性的方法， 包括向所述个体施 用有效量的多特异性 HER 抗体。在一个实施方案中， 所述多特异性 HER 抗体包含特异性结 合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域。
     本发明一方面提供用作药物的多特异性 HER 抗体。另一方面提供用于治疗癌症， 诸如乳腺癌、 结肠直肠癌、 胰腺癌、 头和颈癌、 黑素瘤、 卵巢癌、 前列腺癌或非小细胞肺癌的 多特异性 HER 抗体。另一方面提供用于抑制 HER 受体的生物学活性的多特异性 HER 抗体。 在一个实施方案中， 所述多特异性 HER 抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构 域。
     本发明另一方面提供用于制备药物的多特异性 HER 抗体。在一个实施方案中， 所 述药物可用于治疗癌症， 诸如乳腺癌、 结肠直肠癌、 胰腺癌、 头和颈癌、 黑素瘤、 卵巢癌、 前列 腺癌或非小细胞肺癌。在一个实施方案中， 所述药物用于抑制 HER 受体的生物学活性。在 一个实施方案中， 所述多特异性 HER 抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域。 在一个实施方案中， 所述多特异性 HER 抗体比传统 EGFR 拮抗剂， 诸如西妥昔单抗毒性更低。
     附图简述
     图 1 显示在 A431 异种移植模型中通过抗 EGFR 抗体 D1.5 抑制肿瘤生长。
     图 2 显示具有双重特异性的克隆的结合特异性。
     图 3 显示使用选择的具有双重特异性 ( 抗 EGFR/HER3 和抗 EGFR/HER2 抗体 ) 的抗 体抑制 TGF-α- 诱导的 EGFR 磷酸化。
     图 4 显示抗 -EGFR/HER3 抗体阻断调蛋白结合 HER3-ECD-Fc。
     图 5 显示在 MCF7 细胞中通过抗 EGFR/HER3 双特异性抗体抑制 HRG 诱导的受体磷 酸化。
     图 6 显示通过抗 EGFR/HER3 抗体抑制 MDA-175 细胞的细胞增殖。
     图 7 是显示在 4D5-Fv 结构上定位的 D1.5-100 热点的图。
     图 8 概述了使用鸟枪文库对于 D1.5-100EGFR-HER3 抗体亲和力成熟的策略。
     图 9 显示两个选择的亲和力成熟的抗体 (DL7 和 DL11) 对于 EGFR 和 HER3 两者是 特异性的。
     图 10 ： A) 显示亲和力成熟的抗体 DL7 和 DL11 与母体抗体 D1.5 对于 EGFR 的抑制 功能的比较。B) 显示亲和力成熟的抗体 DL7 和 DL11 与单特异性抗 HER3 抗体 DL3.6 对于 HER3 反式激活的抑制功能的比较。
     图 11A) 提供图显示 DL11 与培妥珠单抗 (pertuzumab)， 抗 EGFR 抗体， 和抗 HER3 抗 体， 或 DL3.6， D1.5， 或 D1.5+DL3.6 的组合相比对于 H1666 细胞生长抑制功能的比较， 所述 细胞是 NSCLC 细胞系， 表达 HER2， HER3， EGFR 和 EGFR 配体， 生长用 HRG 刺激。B) 提供图显 示 DL11 与培妥珠单抗， 抗 EGFR 抗体和抗 HER3 抗体， 或 DL3.6， D1.5 或 D1.5+DL3.6 的组合 相比对于 H1666HSCLC 系生长抑制功能的比较， 生长用 HRG 和 TGFα 刺激。
     图 12A) 提供图显示通过 DL11 与 pMab， 抗 EGFR 抗体， 和抗 HER3 抗体相比较抑制 HCA-7 细胞的增殖， 该细胞是结肠直肠癌细胞系， 表达 HER2， HER3 和 EGFR。细胞生长用 HRG 刺激。B) 提供图显示如图 12A 中的 HCA-7 细胞生长的抑制， 除了细胞生长用 HRG+TGFα 刺 激。
     图 13 显示 Calu-3 细胞增殖的抑制， 所述细胞是 NSCLC 系， 过表达 HER2 并且具有 正常水平的 HER3 和 EGFR。细胞生长用 HRG 刺激， 抗体以剂量依赖方式测试。
     图 14 概述了对于 D1.5-201 亲和力成熟的分选策略。
     图 15 显示通过 DL11， DL11b 和 DL11f 抑制 MDA-175 细胞增殖。
     图 16 显示 DL11f 抑制调蛋白诱导的 HER3 磷酸化和 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化。
     图 17 是显示在 HCA-7 肿瘤移植模型中通过 DL11 和 DL11f 抑制肿瘤生长的图。
     图 18 是显示在 H358NSCLC 异种移植模型中通过 DL11f 抑制肿瘤生长的图。
     图 19 显示通过 DL3-11b， DL3.6b 和 DL3.6 抑制 HRG 诱导的 HER3 磷酸化。
     图 20 ： 通过 DL3-11b， DL3.6b 和 DL3.6 抑制 MDA-175 细胞增殖。
     图 21 是显示在 FaDu 癌症模型中通过 DL11f 抑制肿瘤生长的图。
     图 22 是显示在 BxPC3 胰腺癌模型中通过 DL11f 抑制肿瘤生长的图。
     图 23 是显示在 Calu-3 非小细胞肺癌模型中通过 DL11f 抑制肿瘤生长的图。
     图 24 是显示在 A431 上皮癌模型中通过 DL11f 抑制肿瘤生长的图。
     图 25 是显示在 MAXF44 乳腺癌模型中通过 DL11f 抑制肿瘤生长的图。
     图 26 是显示在 DU145 前列腺癌模型中通过 DL11f 抑制肿瘤生长的图。
     图 27 是显示在 OVXF550 卵巢癌模型中通过 DL11f 抑制肿瘤生长的图。
     图 28 显示在数个细胞系中 DL11f 诱导 ADCC。
     图 29 显示 DL11f-N297A 缺少 ADCC 活性。
     图 30 显示在 H292NSCLC 癌症模型中通过 DL11f 和 DL11f-N297A 抑制肿瘤生长。
     图 31A-C 是提供关于 EGFR 拮抗剂疗法观察到的非临床和临床毒性信息的表。
     图 32 是提供关于疹 / 脱屑和痤疮 / 痤疮样疹分级信息的表。
     图 33 提供具有 Kabat 编号的数个抗 HER 抗体的重链可变结构域和轻链可变结构 域的氨基酸比对。图 33A 显示下述抗体的轻链可变结构域 ： D1(SEQ ID NO ： 58) ； D1.5(SEQID NO ： 24) ； D1.5-100(SEQ ID NO ： 40) ； DL11(SEQ ID NO ： 27) ； DL11b(SEQ ID NO ： 29) ； DL11f(SEQ ID NO ： 29)。图 33B 显示下述抗体的重链可变结构域 ： D1(SEQ ID NO ： 25) ； D1.5(SEQ ID NO ： 25) ； D1.5-100(SEQ ID NO ： 25) ； DL11(SEQ ID NO ： 28) ； DL11b(SEQ ID NO ： 28) ； DL11f(SEQ ID NO ： 30)。
     发明详述
     I. 定义
     除非另有定义， 本文使用的所有专门术语、 符号和其它科学术语意图具有本发明 所属领域技术人员普遍理解的含义。在一些情况下， 为了清楚和 / 或易于引用， 本文定义了 具有普遍理解含义的术语， 并且本文包含此类定义没有必要解释为其代表了与本领域通常 理解的实质上的差异。 本文中描述或提到的技术和程序一般得到了本领域技术人员的充分 理解， 而且利用常规方法得以普遍采用， 诸如例如下列文献中记载的广泛应用的分子克隆 的方法 ： Sambrook 等人， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual( 分子克隆 ： 实验室指 南 ) 第二版 (1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， N.Y.。 如果合适， 涉及使用市售的试剂盒和试剂的程序一般根据制造商规定的方案和 / 或参数进 行， 除非另有说明。 在描述本发明的方法、 试剂盒及其用途之前， 应当理解本发明不限于所述具体方 法、 方案、 细胞系、 动物种或属、 构建物和试剂， 因为它们当然可以变化。还应当理解本文所 用术语只是为了描述具体实施方案， 并非意图限制本发明的范围， 只有所附权利要求才对 本发明范围进行了限制。
     必须注意的是， 在用于本文及所附权利要求时， 除非上下文另有明确规定， 单数形 式 “一个” 、 “一种” 和 “所述″包括复数所指物。
     在本说明书和权利要求书全文中， 词语 “包括” 或变体诸如 “包含” 或 “含有” ， 应当 理解为意指包括所述的整数 ( 整体 ) 或整数 ( 整体 ) 的组， 但是不排除任何其它整数 ( 整 体 ) 或整数 ( 整体 ) 的组。
     本文中术语 “抗体” 以其最广义使用， 特别是涵盖单克隆抗体、 多克隆抗体、 多特异 性抗体和抗体片段， 只要它们表现出所希望的生物学活性。术语 “多特异性抗体” 以最广义 使用， 具体涵盖包含这样的抗原结合结构域的抗体， 所述抗原结合结构域具有多表位特异 性 ( 即， 能够特异性结合一种生物分子上的两个或多个不同表位或能够特异性结合在两种 或多种不同生物分子上的表位 )。 抗原结合结构域的一个具体实例是 VHVL 单元， 其由重链可 变结构域 (VH) 和轻链可变结构域 (VL) 构成。此类多特异性抗体包括但不限于全长抗体、 具 有两个或多个 VL 和 VH 结构域的抗体、 抗体片段如 Fab、 Fv、 dsFv、 scFv、 双抗体 (diabodies)、 双特异性双抗体和三链抗体 (triabodies)、 已被共价或非共价连接的抗体片段。 “双特异性 抗体” 是包含这样的抗原结合结构域的多特异性抗体， 所述抗原结合结构域能够特异性结 合一个生物分子上的两个不同表位， 或能够特异性结合两个不同生物分子上的表位。双特 异性抗体在本文中也称为具有 “双特异性” 或是 “双特异性的” 。
     在 某 些 实 施 方 案 中， 本 发 明 的 抗 体 对 于 其 靶 标 HER 或 HERs 具 有 的 解 离 常 数 (Kd) ≤ 1μM， ≤ 100nM， ≤ 10nM， ≤ 1nM， ≤ 0.1nM， ≤ 0.01nM， 或≤ 0.001nM( 例如 10-8M 以 下， 例如 10-8M 至 10-13M， 例如， 10-9M 至 10-13M)。
     基本的 4 链抗体单元是由两条相同的轻链 (L) 和两条相同的重链 (H) 构成的异四
     聚体糖蛋白 (IgM 抗体由 5 个基本的异四聚体单元及称作 J 链的另外多肽组成， 因此包含 10 个抗原结合位点 ； 而分泌型 IgA 抗体可聚合形成包含 2-5 个基本的 4 链单元及 J 链的多价 装配物 )。在 IgG 的情况中， 4 链单元通常约 150,000 道尔顿。每条轻链通过一个共价二硫 键与重链相连， 而取决于重链的同种型， 通过一个或多个二硫键彼此连接两条重链。 每条重 链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在 N- 末端具有一个可变结构域 (VH)， 接 着是三个 ( 对于每种 α 和 γ 链 ) 和四个 ( 对于 μ 和 ε 同种型 ) 恒定结构域 (CH)。每条 轻链在 N- 末端具有一个可变结构域 (VL)， 接着是其另一端的一个恒定结构域 (CL)。VL 与 VH 排列在一起， 而 CL 与重链的第一恒定结构域 (CH1) 排列在一起。特定的氨基酸残基被认为 在轻链和重链可变结构域之间形成界面。成对的 VH 和 VL 一起形成一个抗原结合位点。关 于不同类别抗体的结构和性质， 参见如 Basic and Clinical Immunology ( 基本和临床酶 学 )， 第八版， Daniel P.Stites， Abba I.Terr 和 Tristram G.Parslow( 编辑 )， Appleton & Lange， Norwalk， CT， 1994， 第 71 页和第 6 章。
     来自任何脊椎动物物种的轻链， 根据其恒定结构域氨基酸序列， 可归入两种称作 κ 和 λ 的截然不同型中的一种。根据其重链恒定结构域 (CH) 氨基酸序列， 免疫球蛋白可 归入不同的类或同种型。有五类免疫球蛋白 ： IgA、 IgD、 IgE、 IgG 和 IgM， 分别具有称作 α、 δ、 γ、 ε 和 μ 的重链。根据 CH 序列和功能的相对较小差异， γ 和 α 类可进一步分为亚 类， 例如人表达下列亚类 ： IgG1、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA1 和 IgA2。
     术语 “可变的” 指可变结构域中的某些区段在抗体序列中差异广泛的情况。V 结 构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而， 变异性并非均匀分布于 可变结构域跨越的 110 个氨基酸。而 V 区由 15-30 个氨基酸， 称作构架区 (FR) 的相对不 变异的区段及将构架区分开的称作 “高变区” 或 HVR 的极度变异的较短区域组成。天然重 链和轻链的可变结构域各自包含四个 FRs， 它们大多采取 β- 折叠构象， 通过形成环状连接 且在有些情况中形成 β- 折叠结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过 FR 非常接近的保持在一起， 并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成 ( 参 见 Kabat 等， Sequences of Proteins of Immunological Interest ( 免疫学感兴趣的蛋 白质的序列 )， 第五版 .Public Health Service( 公共卫生署 )， National Institutes of Health( 国立卫生研究所 )， Bethesda， MD.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的 结合， 但展现出多种效应子功能， 如在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC) 中抗体的参 与。
     术语 “高变区” 、 “HVR” 或 “HV” 在用于本文时指抗体可变结构域中序列上高度可 变和 / 或形成结构上定义的环的区域。通常， 抗体包含六个 HVR ： 三个在 VH 中 (HVR-H1、 HVR-H2、 HVR-H3)， 三个在 VL 中 (HVR-L1、 HVR-L2、 HVR-L3)。在天然抗体中， H3 和 L3 展示这 六个 HVR 的最大多样性， 而且认为特别是 H3 在赋予抗体以精细特异性中发挥独特作用。参 见例如 Xu 等， 免疫性 (Immunity)13 ： 37-45(2000) ； Johnson 和 Wu 于 ： 分子生物学中的方法 (Methods in Molecular Biology)248 ： 1-25(Lo， 编辑， Human 出版社， Totowa， NJ， 2003)。 事实上， 仅由重链组成的天然存在骆驼科动物 (camelid) 抗体在缺乏轻链时是有功能的且 稳定的。参见例如 Hamers-Casterman 等， 自然 (Nature)363 ： 446-448(1993) ； Sheriff 等， 自然结构生物学 (Nature Struct.Biol.)3 ： 733-736(1996)。
     HVRs 一般包含来自高变环和 / 或 “互补决定区” (CDRs) 的氨基酸残基， 后者具有最高的序列变异性和 / 或参与抗原识别。本文中使用且涵盖许多 HVR 的叙述。Kabat 互 补性决定区 (CDR) 是以序列变异性为基础的， 而且是最常用的 (Kabat 等， 免疫学感兴趣的 蛋白质的序列 (Sequences of Proteins of Immunological Interest)， 第 5 版 . 公共卫 生署 (Public Health Service)， 国立卫生研究所 (National Institutes of Health)， Bethesda， MD.(1991))。Chothia 改为指结构环的位置 (Chothia 和 Lesk 分子生物学杂志 (J.Mol.Biol.)196 ： 901-917(1987))。AbM HVR 代表 Kabat HVR 与 Chothia 结构环之间的 折衷， 而且由 Oxford Molecular 的 AbM 抗体建模软件使用。 “contact” HVR 是以对可获得 的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些 HVR 中每一个的残基。
     HVR 可包括如下 “延伸的 HVR” ： VL 中的 24-36 或 24-34(L1)、 46-56 或 50-56(L2) 和 89-97 或 89-96(L3) 及 VH 中 的 26-35(H1)、 50-65 或 47-65(H2) 和 93-102、 94-102 或 95-102(H3)。对于这些定义中的每一个， 可变结构域残基是依照 Kabat 等， 见上文编号的。
     “构架” 或 “FR” 残基指除本文中所定义的 HVR 残基之外的那些可变结构域残基。
     术语 “依照 Kabat 的可变结构域残基编号方式” 或 “依照 Kabat 的氨基酸位置编号 方式” 及其变化形式指 Kabat 等， 见上文中的用于抗体编制的重链可变结构域或轻链可变 结构域编辑的编号系统。使用此编号系统， 实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨 基酸， 对应于可变结构域 FR 或 HVR 的缩短或插入。例如， 重链可变结构域可包含 H2 的残基 52 后的单一氨基酸插入 ( 依照 Kabat 为残基 52a) 及重链 FR 残基 82 后的插入残基 ( 例如 依照 Kabat 为残基 82a、 82b 和 82c 等 )。给定抗体的残基 Kabat 编号方式可通过将抗体序 列与 “标准” Kabat 编号序列对比同源区来确定。
     Kabat 编号系统一般在提及可变结构域中的残基 ( 大约是轻链的残基 1-107 和 重 链 的 残 基 1-113) 时 使 用 ( 例 如 Kabat 等， 免 疫 学 感 兴 趣 的 序 列 (Sequences of Immunological Interest). 第 5 版 . 公共卫生署 (Public Health Service)， 国立卫生研 究所 (National Institutes of Health)， Bethesda， Md.(1991))。 “EU 编号系统” 或 “EU 索 引” 一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用 ( 例如在 Kabat 等中报道的 EU 索引， 见上文 )。 “如在 Kabat 中所述的 EU 索引” 指人 IgG1EU 抗体的残基编号。除非本文中另有
     说明， 提及抗体可变结构域中的残基编号指根据 Kabat 编号系统的残基编号方式。除非本 文中另有说明， 提及抗体恒定结构域中的残基编号指根据 EU 编号系统的残基编号方式 ( 例 如参见 WO 2006/073941)。
     “亲和力” 是指分子 ( 例如抗体 ) 的单一结合位点与其结合配偶体 ( 例如抗原 ) 之 间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明， 在用于本文时， “结合亲和力” 指反映结 合对的成员 ( 例如抗体与抗原 ) 之间 1 ∶ 1 相互作用的内在结合亲和力。分子 X 对其配偶 体 Y 的亲和力通常可用解离常数 (Kd) 来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测 量， 包括本文中所描述的。
     “亲和力成熟的” 抗体指这样的抗体， 在该抗体的一个或多个 HVRs 或构架区中具 有一处或多处改变、 导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的母体抗体相比有所提 高。在一个实施方案中， 亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的 亲和力。亲和力成熟的抗体可使用本领域已知的某些方法来生成。例如， Marks 等， 生物 / 技术 (Bio/Technology)10 ： 779-783(1992) 记载了通过 VH 和 VL 结构域改组进行的亲和 力成熟。以下文献记载了 HVR 和 / 或构架残基的随机诱变 ： 例如 ： Barbas 等， 美国国家科 学 院 学 报 (Proc.Nat.Acad.Sci.USA)91 ： 3809-3813(1994) ； Schier 等， 基 因 (Gene)169 ： 147-155(1995) ； Yelton 等， 免疫学杂志 (J.Immunol.)155 ： 1994-2004(1995) ； Jackson 等， 免疫学杂志 (J.Immunol.)154(7) ： 3310-9(1995) ； 及 Hawkins 等， 分子生物学杂志 (J.Mol. Biol.)226 ： 889-896(1992)。
     抗体的 “种类” 是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种主要种 类的抗体 ： IgA， IgD， IgE， IgG， 和 IgM， 并且这些中的一些可以进一步分为亚类 ( 同种型 )， 例如 IgG1， IgG2， IgG3， IgG4， IgA1， 和 IgA2。对应于不同种类的免疫球蛋白的重链恒定结构域 分别被称为 α， δ， ε， γ 和 μ。
     术语 “单克隆抗体” 在用于本文时指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体， 即除 了可能的变体 ( 该变体可在产生单克隆抗体的过程中出现， 此类变体通常少量存在 ) 之外， 构成群体的各个抗体基本上相似并结合相同的表位。此类单克隆抗体典型的包括包含结 合靶标的可变区的抗体， 其中该抗体是通过包括从众多抗体中选择该抗体在内的过程得到 的。例如， 选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、 噬菌体克隆或重组 DNA 克隆的集合 中选择独特克隆。应当理解， 所选择的抗体可进一步改变， 例如为了提高对靶标的亲和力、 将抗体人源化、 提高其在细胞培养物中的产量、 降低其在体内的免疫原性、 创建多特异性抗 体等， 而且包含改变后的可变区序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。 除它们的特异性外， 单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语 “单克隆” 表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征， 不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗 体。例如， 将根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成， 包括杂交瘤法 ( 例如， Kohler 等， Nature( 自 然 )， 256 ： 495(1975) ； Harlow 等， 抗体 ： A Laboratory Manual( 抗 体： 实验室指南 )， (Cold Spring Harbor Laboratory Press， 第二版 .1988) ； Hammerling 等， 在： Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas( 单 克 隆 抗 体 和 T 细 胞 杂 交 瘤 )563-681， (Elsevier， N.Y.， 1981) 中、 重组 DNA 法 ( 参见例如， 美国专利 4,816,567)、 噬 菌 体 展 示 技 术 ( 参 见 例 如， Clackson 等， Nature( 自 然 )， 352 ： 624-628(1991) ； Marks 等， J.Mol.Biol.( 分子生物学杂志 )， 222 ： 581-597(1991) ； Sidhu 等， J.Mol.Biol.( 分子生 物 学 杂 志 )338(2) ： 299-310(2004) ； Lee 等， J.Mol.Biol.( 分 子 生 物 学 杂 志 )340(5) ： 1073-1093(2004) ； Fellouse， Proc.Nat.Acad.Sci.USA( 美 国 科 学 院 学 报 )101(34) ： 12467-12472(2004) ；和 Lee 等 J.Immunol.Methods( 免 疫 学 方 法 杂 志 )284(1-2) ： 119-132(2004)、 及用于从具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列 的基因的动物生成人或人样抗体的技术 ( 参见例如， WO98/24893， WO/9634096， WO/9633735 和 WO/9110741， Jakobovits 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美 国 科 学 院 学 报 )， 90 ： 2551(1993) ； Jakobovits 等， Nature( 自 然 )， 362 ： 255-258(1993) ； Bruggemann 等， Year in Immuno.( 免疫学年鉴 )， 7： 33(1993) ； 美国专利 5,545,806、 5,569,825、 5,591,669( 均 为 GenPharm 的 ) ； 5,545,807 ； WO 97/17852、 美国专利 5,545,807 ； 5,545,806 ； 5,569,825 ； 5,625,126 ； 5,633,425 ； 和 5,661,016， 和 Marks 等， Bio/Technology( 生 物 / 技 术 )， 10 ： 779-783(1992) ； Lonberg 等， Nature( 自 然 )， 368 ： 856-859(1994) ； Morrison， Nature( 自 然 )， 368 ： 812-813(1994) ； Fishwild 等， Nature Biotechnology( 自 然 ： 生 物 技 术 )， 14 ： 845-851(1996) ； Neuberger， Nature Biotechnology( 自然 ： 生物技术 )， 14 ： 826(1996) ； 和 Lonberg 和 Huszar， Intern.Rev.Immunol.( 国际免疫学综述 )， 13 ： 65-93(1995)。
     “完整” 抗体是包含抗原结合位点和 CL 以及至少重链恒定结构域 CH1、 CH2 和 CH3 的 抗体。该恒定结构域可以是天然序列恒定结构域 ( 例如人天然序列恒定结构域 ) 或其氨基 酸序列变体。优选地， 该完整抗体具有一种或多种效应子功能。
     “抗体片段” 包含完整抗体的一部分， 优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体 片段的例子包括 Fv、 Fab、 Fab′、 F(ab′ )2、 Fab’ -SH ； 双抗体 ； 线性抗体 ( 参见美国专利 5,641,870， 实施例 2 ； Zapata 等， Protein Eng.( 蛋白质工程 )8(10) ： 1057-1062(1995)) ； 单链抗体分子 ( 例如 scFv)。 在本说明书中以及在说明书全文中， 提及抗体和抗体的多种性 质， 同样的内容也适用于功能性抗体片段， 例如双重作用 Fab 片段。
     “线性抗体” 的表述通常是指 Zapata 等， Protein Eng.( 蛋白质工程 )， 8(10) ： 1057-1062(1995) 描述的抗体。这些抗体包含一对串联的 Fd 片段 (VH-CH1-VH-CH1)， 其与互 补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。 在优选实施方案中， 所述片段是 “功能性的” ， 即在 性质上保留相应完整抗体结合靶标 HER 受体的能力， 并且如果完整抗体还抑制 HER 的活化 或功能， 在性质上也保留此类抑制特性。 在性质上保留意指以同样的方法活性被保留， 但是 结合亲和力和 / 或活性的程度可能不同。
     用木瓜蛋白酶消化抗体产生称作 “Fab” 片段的两个相同的抗原结合片段， 和一个 残余 “Fc” 片段， 其名称反映了它易于结晶的能力。Fab 片段由完整轻链及重链可变结构域 (VH) 和一条重链第一恒定结构域 (CH1) 组成。胃蛋白酶处理抗体产生一个较大 F(ab’ )2 片 段， 它粗略相当于两个通过二硫键相连的 Fab 片段， 具有二价抗原结合活性且仍能够交联 抗原。Fab’ 片段因在 CH1 结构域的羧基末端增加了少数残基 ( 包括来自抗体铰链区的一个 或多个半胱氨酸 ) 而与 Fab 片段有所不同。Fab’ -SH 是本文中对其中恒定结构域的半胱氨 酸残基携带一个游离硫醇基的 Fab’ 的称谓。F(ab’ )2 抗体片段最初是作为成对 Fab’ 片段 生成的， 在 Fab’ 片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
     Fc 片段包含通过二硫键保持在一起的两条重链的羧基末端部分。 抗体的效应子功 能是由 Fc 区中的序列决定的， 该区还是由在某些类型细胞上发现的 Fc 受体 (FcR) 所识别 的部分。“Fv” 由紧密、 非共价结合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二 聚体组成。 从这两个结构域的折叠中突出了六个高变环 ( 重链和轻链各 3 个环 )， 贡献出抗 原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而， 即使是单个可变结构域 ( 或只 包含对抗原特异的三个 HVRs 的半个 Fv) 也具有识别和结合抗原的能力， 尽管亲和力通常低 于完整结合位点。
     “单链 Fv” 也可缩写为 “sFv”或 “scFv” ， 是包含连接成一条多肽链的抗体 VH 和 VL 结构域的抗体片段。优选的是， sFv 多肽在 VH 和 VL 结构域之间还包含多肽接头， 使得 sFv 形成期望的抗原结合结构。关于 sFv 的综述参见 Pluckthun 于 .The Pharmacology of Monoclonal Antibodies( 单克隆抗体药理学 )， vol.113， Rosenburg 和 Moore 编辑， Springer-Verlag， New York， pp.269-315(1994) ； Borrebaeck 1995。
     术语 “双抗体 (diabodies)” 是指如下制备的小抗体片段， 通过使用短接头 ( 大 约 5-10 个残基 ) 在 VH 和 VL 结构域之间构建 sFv 片段 ( 见前段 ) 从而获得该 V 结构域的 链间而非链内配对而产生二价片段， 即具有两种抗原结合位点的片段。双抗体在例如 EP 404,097 ； WO 93/11161 ； 和 Hollinger 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美国科学院学报 )， 90 ： 6444-6448(1993) 中有更充分的描述。 与参照抗体 “结合相同表位的抗体” 是指这样的抗体， 其在竞争测定中阻断 50％以 上的所述参照抗体与其抗原的结合， 反之， 参照抗体在竞争测定中阻断 50％以上的该抗体 与其抗原的结合。
     术语 “嵌合” 抗体是指这样的抗体， 其中一部分重链和 / 或轻链来源于特定来源或 物种， 而剩余的重链和 / 或轻链来源于不同来源或物种。
     “人抗体” 指具有这样的氨基酸序列的抗体， 所述氨基酸序列对应于这样抗体的氨 基酸序列， 所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源， 其利用人抗体库或其它人抗体 编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
     “人共有构架” 是指这样的构架， 即在选择人免疫球蛋白 VL 或 VH 构架序列中， 其 代表最常出现的氨基酸残基。一般而言， 对人免疫球蛋白 VL 或 VH 序列的选择是从可变结 构域序列的亚型中选择。一般而言， 该序列的亚型是如 Kabat 等， Sequences of Proteins of Immunological Interest( 免疫学感兴趣的蛋白质的序列 )， 第五版， NIH Publication 91-3242， Bethesda MD(1991)， 1-3 卷中的亚型。在一个实施方案中， 对于 VL， 该亚型是如 Kabat 等 ( 见上文 ) 中的亚型 κI。在一个实施方案中， 对于 VH， 该亚型是如 Kabat 等 ( 见 上文 ) 中的亚型 III。
     非人 ( 例如啮齿动物 ) 抗体的 “人源化” 形式指最低限度包含衍生自非人抗体的 序列的嵌合抗体。在极大程度上， 人源化抗体指人免疫球蛋白 ( 受体抗体 ) 中的受体的 高变区残基用具有期望抗体特异性、 亲和力和能力的非人物种 ( 供体抗体 ) 诸如小鼠、 大 鼠、 兔或非人灵长类动物的高变区残基替换的人免疫球蛋白。在有些情况中， 将人免疫球 蛋白的构架区 (FR) 残基用相应的非人残基替换。此外， 人源化抗体可包含在受体抗体或 供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言， 人 源化抗体将包含基本上全部的至少一个、 通常两个如下可变结构域， 其中所有或基本上所 有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环， 且所有或基本上所有 FRs 是人免疫球蛋白序列 的 FRs。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区 (Fc)， 通常是人免疫球蛋白
     的恒定区。更多细节参见 Jones 等， Nature( 自然 )321 ： 522-525(1986) ； Riechmann 等， Nature( 自然 )332 ： 323-329(1988) ； 和 Presta， Curr.Op.Struct.Biol.( 结构生物学新观 点 )2 ： 593-596(1992)。
     “结合” 目的抗原的本发明的抗体是这样的抗体， 其与抗原以足够的亲和力结合， 从而该抗体可用作靶向蛋白质或表达该抗原的细胞或组织的诊断和 / 或治疗剂。关于抗体 与靶标分子的结合， 术语 “特异性结合” 或 “特异性结合至” 或 “特异于” 特定多肽或特定多 肽靶标上的表位指可测量出不同于非特异性相互作用的结合。 特异性结合可通过例如测定 分子的结合并与对照分子的结合比较来确定。例如， 特异性结合可通过与对照分子的竞争 来测定， 所述对照分子与靶标相似， 例如与过量的未标记靶标竞争。在这种情况中， 若经标 记靶标与探针的结合受到过量未标记靶标的竞争性抑制， 则指示特异性结合。在一个具体 实施方案中， “特异性” 结合是指抗体与其特定的靶标 HER 受体的结合， 并且不与其它特定 的非 - 靶标 HER 受体结合。例如， 抗体特异性结合 EGFR 和 HER3 但是不特异性结合 HER2 或 HER4， 或抗体特异性结合 EGFR 和 HER2 但是不特异性结合 HER3 或 HER4， 或抗体特异性结合 EGFR 和 HER4 但是不特异性结合 HER2 或 HER3。
     “HER 受体” 是属于 HER 受体家族的受体蛋白酪氨酸激酶， 包括 EGFR(ErbB1， HER1)， HER2(ErbB2)， HER3(ErbB3) 和 HER4(ErbB4) 受体。HER 受体通常将包含胞外结构域， 它可结 合 HER 配体和 / 或与另一个 HER 受体分子二聚化 ； 亲脂性跨膜结构域 ； 保守的胞内酪氨酸激 酶结构域 ； 和含有几个可被磷酸化的酪氨酸残基的羧基末端信号传导结构域。HER 受体可 以是 “天然序列” HER 受体或其 “氨基酸序列变体” 。优选的， HER 受体是天然序列人 HER 受 体。 “HER 途径” 是指由 HER 受体家族介导的信号传导网络。
     术语 “ErbB1” 、 “HER1” 、 “表皮生长因子受体” 和 “EGFR” 在本文中可互换使用， 指例 如 Carpenter 等， Ann.Rev.Biochem.56 ： 881-914(1987) 公开的 EGFR， 包括其天然存在的突 变体形式 ( 如 Ullrich 等， Nature( 自然 )(1984)309 ： 418425 和 Humphrey 等， PNAS(USA)87 ： 4207-4211(1990) 中的缺失突变体 EGFR) 及其变体， 诸如 EGFRvIII。EGFR 的变体也包括缺 失的、 置换的和插入的变体， 例如在 Lynch 等， (New England Journal of Medicine( 新英 格兰医学杂志 )2004， 350 ： 2129)， Paez 等， (Science( 科学 )2004， 304 ： 1497)， 和 Pao 等， (PNAS 2004， 101 ： 13306) 中描述的那些。
     在本文中， “EGFR 胞外结构域” 或 “EGFR ECD” 是指 EGFR 在细胞外的结构域， 锚定 到细胞膜或在循环中， 包括其片段。在一个实施方案中， EGFR 的胞外结构域可包括四个结 构域 ： “结构域 I” ( 氨基酸残基从约 1-158)， “结构域 II” ( 氨基酸残基 159-336)， “结构域 III” ( 氨基酸残基 337-470)， 和 “结构域 IV” ( 氨基酸残基 471-645)， 其中边界是近似的， 可有大约 1-3 个氨基酸的变化。
     表述 “ErbB2”和 “HER2”在本文中可互换使用， 指例如 Semba 等， PNAS(USA)82 ： 6497-6501(1985) 和 Yamamoto 等， Nature( 自然 )319 ： 230-234(1986) 中描述的人 HER2 蛋 白 (GenBank 编号 X03363)。术语 “erbB2” 指编码人 HER2 的基因， “neu” 指编码大鼠 p185neu 的基因。优选的 HER2 是天然序列人 HER2。
     在本文中， “HER2 胞外结构域” 或 “HER2ECD” 是指 HER2 在细胞外的结构域， 锚定 到细胞膜或在循环中， 包括其片段。在一个实施方案中， HER2 的胞外结构域可包含四个
     结构域 ： “结构域 I” ( 氨基酸残基从约 1-195， “结构域 II” ( 氨基酸残基从约 196-319)， “结构域 III” ( 氨基酸残基从约 320-488)， 和 “结构域 IV” ( 氨基酸残基从约 489-630) ( 残基编号不含信号肽 )。参见 Garrett 等， Mol.Cell.( 分子细胞 ).11 ： 495-505(2003)， Cho 等， Nature( 自 然 )421 ： 756-760(2003)， Franklin 等， Cancer Cell( 癌 细 胞 )5 ： 317-328(2004)，和 Plowman 等， Proc.Natl.Acad.Sci.( 美 国 国 家 科 学 院 学 报 )90 ： 1746-1750(1993)。
     “ErbB3”和 “HER3”指 例 如 美 国 专 利 5,183,884 和 5,480,968 以 及 Kraus 等， PNAS(USA)86 ： 9193-9197(1989) 中公开的受体多肽。
     在本文中， “HER3 胞外结构域” 或 “HER3ECD” 是指 HER3 在细胞外的结构域， 锚定到 细胞膜或在循环中， 包括其片段。在一个实施方案中， HER3 的胞外结构域可包含四个结构 域： 结构域 I， 结构域 II， 结构域 III， 和结构域 IV。 在一个实施方案中， HER3ECD 包含氨基酸 1-636( 编号包括信号肽 )。在一个实施方案中， HER3 结构域 III 包含氨基酸 328-532( 编 号包括信号肽 )。
     术语 “ErbB4″和 “HER4” 在本文中是指例如在欧洲专利申请 599,274 ； Plowman 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美国国家科学院学报 )， 90 ： 1746-1750(1993) ； 和 Plowman 等， Nature( 自然 )， 366 ： 473-475(1993) 中公开的受体多肽， 包括其同种型， 例如在 1999 年 4 月 22 日公布的 WO99/19488 中所公开的。
     “HER 配体”指结合和 / 或活化 HER 受体的多肽。本文中特别感兴趣的 HER 配 体是天然序列人 HER 配体， 诸如表皮生长因子 (EGF)(Savage 等， J.Biol.Chem.( 生物化 学杂志 )247 ： 7612-7621(1972)) ； 转化生长因子 α(TGF-α)(Marquardt 等， Science( 科 学 )223 ： 1079-1082(1984)) ； 双 调 蛋 白， 又 称 为 神 经 鞘 瘤 (schwanoma) 或 角 质 形 成 细 胞 自 分 泌 生 长 因 子 (Shoyab 等， Science( 科 学 )243 ： 1074-1076(1989) ； Kimura 等， Nature( 自然 )348 ： 257-260(1990) ； 和 Cook 等， Mol.Cell.Biol.( 分子细胞生物学 )11 ： 2547-2557(1991)) ； β 动 物 纤 维 素 (Shing 等， Science( 科 学 )259 ： 1604-1607(1993) ； 和 Sasada 等， Biochem.Biophys.Res.Commun.190 ： 1173(1993)) ； 肝素结合表皮生长因子 (HB-EGF)(Higashiyama 等， Science( 科学 )251 ： 936-939(1991)) ； epiregulin(Toyoda 等， J.Biol.Chem.( 生 物 化 学 杂 志 )270 ： 7495-7500(1995) ； 和 Komurasaki 等， Oncogene( 癌 基因 )15 ： 2841-2848(1997)) ； 调蛋白 ( 见下文 ) ； 神经调节蛋白 -2(NRG-2)(Carraway 等， Nature( 自 然 )387 ： 512-516(1997)) ； 神 经 调 节 蛋 白 -3(NRG-3)(Zhang 等， Proc.Natl. Acad.Sci.( 美 国 国 家 科 学 院 学 报 )94 ： 9562-9567(1997)) ； 神 经 调 节 蛋 白 -4(NRG-4) (Harari 等， Oncogene( 癌基因 )18 ： 2681-89(1999)) ； 和 cripto(CR-1)(Kannan 等， J.Biol. Chem.( 生物化学杂志 )272(6) ： 3330-3335(1997))。 结合 EGFR 的 HER 配体包括 EGF， TGF-α， 双调蛋白， β 动物纤维素， HB-EGF 和 epiregulin。结合 HER3 的 HER 配体包括调蛋白和 NRG-2。能够结合 HER4 的 HER 配体包括 β 动物纤维素， epiregulin， HB-EGF， NRG-2， NRG-3， NRG-4， 和调蛋白。
     “调蛋白” (HRG) 在用于本文时指由调蛋白基因产物编码的多肽， 如美国专利 5,641,869， 或 Marchionni 等， Nature( 自然 )， 362 ： 312-318(1993) 所公开的。调蛋白的 例子包括调蛋白 -α、 调蛋白 -β1、 调蛋白 -β2 和调蛋白 -β3(Holmes 等， Science( 科 学 )， 256 ： 1205-1210(1992) ； 及 美 国 专 利 5,641,869) ； neu 分 化 因 子 (NDF)(Peles 等，Cell( 细 胞 )69 ： 205-216(1992)) ； 乙 酰 胆 碱 受 体 诱 导 活 性 (ARIA)(Falls 等， Cell( 细 胞 )72 ： 801-815(1993)) ； 神 经 胶 质 生 长 因 子 (GGFs)(Marchionni 等， Nature( 自 然 )， 362 ： 312-318(1993)) ； 感 觉 和 运 动 神 经 元 衍 生 因 子 (SMDF)(Ho 等， J.Biol.Chem.( 生 物 化学杂志 )270 ： 14523-14532(1995)) ； γ- 调蛋白 (Schaefer 等， Oncogene( 癌基因 )15 ： 1385-1394(1997))。
     “HER 二聚体” 在本文中指包含至少两个 HER 受体的非共价结合二聚体。当表达 两种或多种 HER 受体的细胞暴露于 HER 配体时可形成此类复合物， 可通过免疫沉淀进行 分离并通过 SDS-PAGE 进行分析， 如例如 Sliwkowski 等， J.Biol.Chem.( 生物化学杂志 )， 269(20) ： 14661-14665(1994) 所述。其它蛋白质， 诸如细胞因子受体亚基 ( 如 gp130) 可与 所述二聚体结合。
     “HER 异二聚体” 在本文中是指包含至少两个不同 HER 受体的非共价结合异二聚 体， 诸如 EGFR-HER2， EGFR-HER3， EGFR-HER4， HER2-HER3 或 HER2-HER4 异二聚体。
     “HER 抑制剂” 是干扰 HER 活化或功能的试剂。 HER 抑制剂的实例包括 HER 抗体 ( 例 如 EGFR， HER2， HER3， 或 HER4 抗体 ) ； EGFR- 靶向药物 ； 小分子 HER 拮抗剂 ； HER 酪氨酸激酶 抑制剂 ； HER2 和 EGFR 双重酪氨酸激酶抑制剂诸如拉帕替尼 (lapatinib)/GW572016 ； 反义 分子 ( 参见例如 WO2004/87207) ； 和 / 或结合下游信号传导分子诸如 MAPK 或 AKt 或干扰它 们的功能的试剂。优选地， HER 抑制剂是结合 HER 受体的抗体。
     “HER 二聚化抑制剂” 或 “HDI” 是抑制 HER 同二聚体或 HER 异二聚体形成的试剂。 优选地， HER 二聚化抑制剂是抗体。然而， HER 二聚化抑制剂也包括肽和非肽小分子， 和抑制 HER 同二聚体或异二聚体形成的其它化学实体。
     “抑制 HER 二聚化” 的抗体是这样的抗体， 其抑制或干扰 HER 二聚体的形成， 而不论 其根本机制。在一个实施方案中， 此类抗体在 HER2 的异二聚化结合位点结合 HER2。二聚 化抑制抗体的一个特别实例是培妥珠单抗 (Pmab) 或 MAb 2C4。HER 二聚化抑制剂的其它实 例包括结合 EGFR 并抑制其与一个或多个其它 HER 受体二聚化的抗体 ( 例如 EGFR 单克隆抗 体 806， MAb 806， 其结合活化的或 “未束缚的” EGFR， 参见 Johns 等， J.Biol.Chem.( 生物化 学杂志 )279(29) ： 30375-30384(2004)) ； 结合 HER3 并抑制其与一个或多个其它 HER 受体二 聚化的抗体 ； 结合 HER4 并抑制其与一个或多个其它 HER 受体二聚化的抗体 ； 肽二聚化抑制 剂 ( 美国专利 6,417,168) ； 反义二聚化抑制剂等。
     用于本文中时， “EGFR 拮抗剂” 或 “EGFR 抑制剂” 是指特异性结合 EGFR 并阻止或 降低其信号传导活性， 并且不特异性结合 HER2， HER3， 或 HER4 的那些化合物。这类试剂的 实例包括结合 EGFR 的抗体和小分子。结合 EGFR 的抗体的实例包括 MAb 579(ATCC CRL HB 8506)， MAb 455(ATCC CRL HB8507)， MAb 225(ATCC CRL 8508)， MAb 528(ATCC CRL 8509) ( 参见， 美国专利 4,943,533， Mendelsohn 等 ) 及其变体， 如嵌合化 225(C225 或西妥昔单 抗 (Cetuximab) ； ) 和改型的人 225(H225)( 参见， WO 96/40210， Imclone Systems Inc.) ； IMC-11F8， 一种全长人的 EGFR 靶向抗体 (Imclone) ； 结合 II 型 突变体 EGFR 的抗体 ( 美国专利 5,212,290) ； 结合 EGFR 的人源化和嵌合抗体， 如美国专 利 5,891,996 中所描述的 ； 及结合 EGFR 的人抗体， 如 ABX-EGF 或帕尼单抗 (Panitumumab) ( 参 见 WO98/50433， Abgenix/Amgen) ； EMD 55900(Stragliotto 等 Eur.J.Cancer( 欧 洲 癌 症 杂 志 )32A ： 636-640(1996)) ； EMD7200( 马 妥 珠 单 抗 (matuzumab))， 一 种 针 对 EGFR 的人源化 EGFR 抗体， 其与 EGF 和 TGF-α 二者竞争 EGFR 结合 ； (EMD/Merck) ； 人 EGFR 抗体， HuMax-EGFR(GenMab) ； 已知为 E1.1， E2.4， E2.5， E6.2， E6.4， E2.11， E6.3 和 E7.6.3 并且 在 US 6,235,883 中描述的完整人抗体 ； MDX-447(Medarex Inc) ； 和 mAb 806 或人源化 mAb 806(Johns 等， 生 物 化 学 杂 志 (J.Biol.Chem.)279(29) ： 30375-30384(2004))。 抗 -EGFR 抗体可缀合细胞毒性剂， 从而产生免疫缀合物 ( 参见， 例如 EP659,439A2， Merck Patent GmbH)。EGFR 拮抗剂包括小分子， 诸如在下述各项中描述的化合物 ： 美国专利 5,616,582， 5,457,105 ， 5,475,001 ， 5,654,307 ， 5,679,683 ， 6,084,095 ， 6,265,410 ， 6,455,534 ， 6,521,620 ， 6,596,726 ， 6,713,484 ， 5,770,599 ， 6,140,332 ， 5,866,572 ， 6,399,602 ， 6,344,459， 6,602,863， 6,391,874， 6,344,455， 5,760,041， 6,002,008， 和 5,747,498， 以 及下述 PCT 公布 ： WO98/14451， WO98/50038， WO99/09016， 和 WO99/24037。具体的小分子 EGFR 拮抗剂包括 OSI-774(CP-358774， 厄洛替尼 (erlotinib)， Genentech/OSI 制 药 公 司 (OSI Pharmaceuticals)) ； PD 183805(CI 1033， 2- 丙 烯 酰 胺， N-[4-[(3- 氯 -4- 氟 苯 基 ) 氨 基 ]-7-[3-(4- 吗 啉 基 ) 丙 氧 基 ]-6- 喹 唑 啉 基 ]-， 二 盐酸盐， 辉瑞公司 (Pfizer Inc.)) ； ZD1839， 吉非替尼 (gefitinib) 易瑞沙 4-(3’ - 氯 -4’ - 氟 苯 胺 基 )-7- 甲 氧 基 -6-(3- 吗 啉 代 丙 氧 基 ) 喹 唑 啉， 阿斯利康 (AstraZeneca)) ； ZM105180((6- 氨 基 -4-(3- 甲 基 苯 基 - 氨 基 )- 喹 唑 啉， Zeneca) ； BIBX-1382(N8-(3- 氯 -4- 氟 - 苯基 )-N2-(1- 甲基 - 哌啶 -4- 基 )- 嘧啶并 [5， 4-d] 嘧啶 -2， 8- 二胺， Boehringer Ingelheim) ； PKI-166((R)-4-[4-[(1- 苯基乙基 ) 氨基 ]-1H- 吡咯并 [2， 3-d] 嘧啶 -6- 基 ]- 苯酚 ) ； (R)-6-(4- 羟基苯基 )-4-[(1- 苯基乙基 ) 氨基 ]-7H- 吡 咯并 [2， 3-d] 嘧啶 ) ； CL-387785(N-[4-[(3- 溴苯基 ) 氨基 ]-6- 喹唑啉基 ]-2- 丁炔酰胺 (butynamide)) ； EKB-569(N-[4-[(3- 氯 -4- 氟 苯 基 ) 氨 基 ]-3- 氰 基 -7- 乙 氧 基 -6- 喹 啉 基 ]-4-( 二 甲 基 氨 基 )-2- 丁 烯 酰 胺 )(Wyeth) ； AG1478(Sugen) ； 和 AG1571(SU 5271 ； Sugen).
     “HER 抗体” 是结合 HER 受体的抗体。任选地， HER 抗体还干扰 HER 活化或功能。 具体的 HER2 抗体包括培妥珠单抗和曲妥珠单抗。具体 EGFR 抗体的实例包括西妥昔单抗 (cetuximab) 和帕尼单抗 (panitumumab)。
     涉及 HER 抗体的专利公开包括 ： US 5,677,171， US 5,720,937， US 5,720,954， US 5,725,856， US 5,770,195， US 5,772,997， US 6,165,464， US 6,387,371， US 6,399,063， US2002/0192211A1 ， US 6,015,567 ， US 6,333,169 ， US 4,968,603 ， US 5,821,337 ， US 6,054,297， US 6,407,213， US 6,719,971， US 6,800,738， US2004/0236078A1， US 5,648,237， US 6,267,958， US 6,685,940， US 6,821,515， WO98/17797， US 6,333,398， US 6,797,814， US 6,339,142， US 6,417,335， US 6,489,447， WO99/31140， US2003/0147884A1， US2003/0170234A1 ，US2005/0002928A1 ，US 6,573,043 ，US2003/0152987A1 ， WO99/48527 ， US2002/0141993A1 ， WO01/00245 ， US2003/0086924 ， US2004/0013667A1 ， WO00/69460， WO01/00238， WO01/15730， US 6,627,196B1， US 6,632,979B1， WO01/00244， US2002/0090662A1 ， WO01/89566 ， US2002/0064785 ， US2003/0134344 ， WO 04/24866 ， US2004/0082047， US2003/0175845A1， WO03/087131， US2003/0228663， WO2004/008099A2， US2004/0106161， WO2004/048525， US2004/0258685A1， US 5,985,553， US 5,747,261， US 4,935,341， US 5,401,638,US 5,604,107， WO 87/07646， WO 89/10412， WO 91/05264，EP 412,116 B1， EP 494,135 B1， US 5,824,311， EP 444,181 B1， EP 1,006,194 A2， US 2002/0155527A1， WO 91/02062， US 5,571,894， US 5,939,531， EP 502,812 B1， WO 93/03741 ， EP 554,441 B1 ， EP 656,367 A1 ， US 5,288,477 ， US 5,514,554 ， US 5,587,458， WO 93/12220， WO 93/16185， US 5,877,305， WO 93/21319， WO 93/21232， US 5,856,089， WO 94/22478， US 5,910,486， US 6,028,059， WO 96/07321， US 5,804,396， US 5,846,749， EP 711,565， WO 96/16673， US 5,783,404， US 5,977,322， US 6,512,097， WO 97/00271， US 6,270,765， US 6,395,272， US 5,837,243， WO 96/40789， US 5,783,186， US 6,458,356， WO 97/20858， WO 97/38731， US 6,214,388， US 5,925,519， WO 98/02463， US 5,922,845， WO 98/18489， WO 98/33914， US 5,994,071， WO 98/45479， US 6,358,682 B1， US 2003/0059790， WO 99/55367， WO 01/20033， US 2002/0076695A1， WO 00/78347， WO 01/09187， WO01/21192， WO01/32155， WO01/53354， WO01/56604， WO 01/76630， WO02/05791， WO 02/11677， US 6,582,919， US2002/0192652A1， US 2003/0211530A1， WO 02/44413， US 2002/0142328， US 6,602,670 B2， WO 02/45653， WO 02/055106， US 2003/0152572， US 2003/0165840 ，WO02/087619 ，WO03/006509 ，WO03/012072 ，WO 03/028638 ，US 2003/0068318， WO 03/041736， EP1,357,132， US 2003/0202973， US 2004/0138160， US 5,705,157， US 6,123,939， EP 616,812 B1， US 2003/0103973， US 2003/0108545， US 6,403,630 B1， WO 00/61145， WO 00/61185， US 6,333,348B1， WO 01/05425， WO 01/64246， US 2003/0022918， US 2002/0051785A1， US 6,767,541， WO 01/76586， US 2003/0144252， WO 01/87336 ， US 2002/0031515A1 ， WO 01/87334 ， WO 02/05791 ， WO 02/09754 ， US 2003/0157097， US 2002/0076408， WO 02/055106， WO 02/070008， WO 02/089842 和 WO 03/86467。
     “HER 活化” 是指任一种或多种 HER 受体的活化或磷酸化。一般而言， HER 活化导 致信号转导 ( 例如由 HER 受体胞内激酶结构域磷酸化 HER 受体或底物多肽中的酪氨酸残基 所导致 )。HER 活化可由 HER 配体结合包含目的 HER 受体的 HER 二聚体介导。结合 HER 二 聚体的 HER 配体可活化二聚体中一种或多种 HER 受体的激酶结构域， 从而导致一种或多种 HER 受体中酪氨酸残基的磷酸化和 / 或另外的底物多肽 ( 诸如 Akt 或 MAPK 胞内激酶 ) 中酪 氨酸残基的磷酸化。
     “磷酸化” 是指向蛋白质 ( 诸如 HER 受体或其底物 ) 添加一个或多个磷酸基。
     HER2 上的 “异二聚化结合位点” 是指 HER2 的胞外结构域中的区， 其在与 EGFR， HER3 或 HER4 形成二聚体时接触 EGFR， HER3 或 HER4 的胞外结构域中的区或与其相互作用。发现 所述区在 HER2 的结构域 II 中。Franklin 等， Cancer Cell( 癌细胞 )5 ： 317-328(2004)。
     “结合 HER2 的异二聚化结合位点” 的 HER2 抗体与结构域 II 中的残基结合 ( 并且 任选地也结合 HER2 胞外结构域的其它结构域如结构域 I 和 III 中的残基 )， 能够至少在一 定程度上在空间上阻碍 HER2-EGFR， HER2-HER3， 或 HER2-HER4 异二聚体的形成。Franklin 等， Cancer Cell( 癌细胞 )5 ： 317-328(2004) 表征了 HER2- 培妥珠单抗晶体结构， 其存放在 RCSB 蛋白质数据库 (RCSB Protein Data Bank)(ID 编号 IS78) 中， 描述了结合 HER2 的异二 聚化结合位点的示例性抗体。
     “结合 HER2 的结构域 II” 的抗体结合结构域 II 中的残基， 并且任选地结合 HER2 的其它结构域如结构域 I 和 III 中的残基。在用于描述本文中所公开的各种抗体时， “分离的” 指已经鉴定且从其表达所在的 细胞或细胞培养物中分开和 / 或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指通常会干扰该多 肽的诊断或治疗用途的物质， 可包括酶、 激素、 和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。 在优选的实施方案中， 将该抗体纯化至 (1) 足以通过使用转杯式测序仪获得至少 15 个残基 的 N- 末端或内部氨基酸序列的程度， 或 (2) 根据使用考马斯蓝 ( 或优选银染 ) 非还原性或 还原性条件下的 SDS-PAGE 达到同质。由于多肽天然环境的至少一种成分不会存在， 因此分 离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而， 分离的多肽通常通过至少一个纯化步骤来制 备。在一些实施方案中， 多特异性抗 HER 抗体是分离的抗体。
     术语 “控制序列” 指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的 DNA 序列。例如， 适于原核生物的控制序列包括启动子、 任选的操纵基因序列、 和核糖体结合位 点。已知真核细胞能利用启动子、 多腺苷酸化信号、 和增强子。
     若核酸与另一核酸序列处于功能性关系中， 则该核酸是 “可操作连接” 的。例如， 若前序列或分泌前导序列的 DNA 表达成参与多肽分泌的前蛋白， 则它与该多肽的 DNA 可操 作连接 ； 若启动子或增强子影响编码序列的转录， 则它与该序列可操作连接 ； 或者， 若核糖 体结合位点的位置促进翻译， 则它与编码序列可操作连接。通常， “可操作连接″指相连的 DNA 序列是邻接的， 而且在分泌前导序列的情况中指邻接且处于阅读框中。然而， 增强子不 必邻接。连接可通过在方便的限制性位点处的连接反应来实现。如果没有此类位点， 那么 可依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
     关于参照多肽序列的 “百分比 (％ ) 氨基酸序列同一性” ， 定义为将候选序列与参 照多肽序列在进行序列比对 ( 并在必要时导入空隙 ) 以获取最大百分比序列同一性， 且不 将任何保守置换视为序列同一性的部分之后， 候选序列中的氨基酸残基与参照多肽序列中 的氨基酸残基相同的百分数。可使用本领域技术内的各种方法进行序列比对以便测定氨 基酸序列同一性百分比， 例如， 使用公众可得到的计算机软件如 BLAST、 BLAST-2、 ALIGN 或 Megalign(DNASTAR) 软件。 本领域技术人员可以决定比对序列的适宜参数， 包括对所比较的 序列全长获得最大比对所需的任何算法。 然而， 为此目的， 氨基酸序列同一性％值使用序列 比较计算机程序 ALIGN-2 产生。ALIGN-2 序列比对计算机程序的作者是 Genentech， Inc.， 该源代码已经随用户文档提交至美国版权局 (Washington D.C.， 20559)， 其美国版权注册 登记号为 TXU510087。公众可通过 Genentech， Inc.(South San Francisco， 加利福尼亚 ) 得到 ALIGN-2 程序， 或者可以从该源代码进行编译。 ALIGN-2 程序应当为在 UNIX 操作系统， 包括在数字 UNIXV4.0D 上使用而进行编译。ALIGN-2 程序设定了所有序列比对参数并且不 变。
     在 ALIGN-2 应用于氨基酸序列比较的情况中， 给定氨基酸序列 A 相对于 (to)、 与 (with)、 或针对 (against) 给定氨基酸序列 B 的氨基酸序列同一性％ ( 或者这样说 ： 给定氨 基酸序列 A 具有或含有相对于、 与或针对给定氨基酸序列 B 的某一％氨基酸序列同一性 ) 如下计算 ：
     X/Y 比值乘以 100，
     其中 X 是用序列比对程序 ALIGN-2 在该程序的 A 和 B 比对中评分为相同匹配的氨 基酸残基数， 且其中 Y 是 B 中的氨基酸残基总数。可以理解， 当氨基酸序列 A 与氨基酸序列 B 的长度不相等时， A 相对于 B 的氨基酸序列同一性％将不等于 B 相对于 A 的氨基酸序列同一性％。除非另外特别指出， 如在紧前面的段落中所述， 使用 ALIGN-2 计算机程序获得在本 文中所用的所有的％氨基酸序列同一性的值。
     杂交反应的 “严格性” 可以容易地由本领域普通技术人员确定， 而且通常凭经验根 据探针长度、 洗涤温度、 和盐浓度来计算。 通常， 较长的探针要求较高的温度以正确退火， 而 较短的探针需要较低的温度。 杂交通常依赖于互补链存在于低于其解链温度的环境中时变 性 DNA 重新退火的能力。探针和可杂交序列之间所期望的同源性程度越高， 可使用的相对 温度也越高。 因此可以认为， 较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格， 而较低温度也就 较不严格。关于杂交反应严格性的其它细节和解释， 参见 Ausubel 等， Current Protocols in Molecular Biology ( 现代分子生物学实验方案 )， Wiley Interscience Publishers， (1995)。
     本文中所定义的 “严格条件”或 “高严格性条件”可如下确定 ： (1) 采用低离子 强度和高温进行洗涤， 例如 0.015M 氯化钠 /0.0015M 柠檬酸钠 /0.1 ％十二烷基硫酸钠， 50℃ ； (2) 在杂交过程中采用变性剂， 诸如甲酰胺， 例如 50％ (v/v) 甲酰胺及 0.1％牛血清 白蛋白 /0.1％ Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮 /50mM 磷酸钠缓冲液 pH 6.5， 其含 750mM 氯 化钠、 75mM 柠檬酸钠， 42℃ ； 或 (3) 在采用 50％甲酰胺、 5XSSC(0.75M NaCl， 0.075M 柠檬酸 钠 )、 50mM 磷酸钠 (pH 6.8)、 0.1 ％焦磷酸钠、 5X Denhardt 氏溶液、 超声波处理的鲑鱼精 DNA(50μg/ml)、 0.1 ％ SDS、 和 10 ％硫酸右旋糖苷的溶液中于 42 ℃杂交过夜， 并在 42 ℃于 0.2XSSC( 氯化钠 / 柠檬酸钠 ) 中洗涤 10 分钟， 接着在含 EDTA 的 0.1XSSC 中于 55℃进行 10 分钟高严格性洗涤。 “中等严格条件″可以如 Sambrook 等， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual ( 分子克隆 ： 实验室指南 )， New York ： Cold Spring Harbor Press， 1989 所述来鉴定， 包括 使用比上文所述较不严格的洗涤溶液和杂交条件 ( 例如温度、 离子强度和％ SDS)。中等严 格条件的一个例子是于 37℃在含 20％甲酰胺、 5XSSC(150mM NaCl， 15mM 柠檬酸三钠 )、 50mM 磷酸钠 (pH 7.6)、 5X Denhardt 氏溶液、 10％硫酸右旋糖苷、 和 20mg/ml 变性剪切的鲑鱼精 DNA 的溶液中温育过夜， 接着在 1XSSC 中于约 37-50℃洗涤滤膜。技术人员将认识到如何根 据需要来调整温度、 离子强度等以适应诸如探针长度等因素。
     抗体 “效应子功能” 指那些可归于抗体 Fc 区 ( 天然序列 Fc 区或氨基酸序列变体 Fc 区 ) 的生物学活性， 且其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的例子包括 ： C1q 结合 和补体依赖性细胞毒性 ； Fc 受体结合 ； 抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC) ； 吞噬作用 ； 细胞表面受体 ( 例如 B 细胞受体 ) 的下调 ； 和 B 细胞活化。
     “抗体依赖性细胞介导的细胞毒性” 或 “ADCC” 指如下细胞毒性形式， 其中某些细胞 毒性细胞 ( 例如天然杀伤 (NK) 细胞、 嗜中性粒细胞和巨噬细胞 ) 上存在的 Fc 受体 (FcRs) 所结合的分泌型 Ig 使这些细胞毒性效应细胞特异性结合携带抗原的靶细胞， 随后用细胞 毒素杀死该靶细胞。所述抗体 “武装” 细胞毒性细胞， 而且绝对是这类杀伤所必需的。介 导 ADCC 的 主 要 细 胞 (NK 细 胞 ) 只 表 达 FcγRIII， 而 单 核 细 胞 表 达 FcγRI、 FcγRII 和 FcγRIII。Ravetch 和 Kinet， Annu.Rev.Immunol.( 免疫学年度评论 )9 ： 457-92(1991) 的 464 页表 3 总结了造血细胞上的 FcR 表达。 为了评估目的分子的 ADCC 活性， 可进行体外 ADCC 测定法， 诸如美国专利 5,500,362 或 5,821,337 中所记载的。可用于此类测定法的效应细 胞包括外周血单核细胞 (PBMC) 和天然杀伤 (NK) 细胞。备选地或额外地， 可在体内评估目
     的分子的 ADCC 活性， 例如在动物模型中， 诸如 Clynes 等 (Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.( 美 国科学院学报 ))95 ： 652-656(1998) 所披露的。
     “Fc 受体” 或 “FcR” 描述与抗体 Fc 区结合的受体。优选的 FcR 是天然序列的人 FcR。此外， 优选的 FcR 是与 IgG 抗体结合的 FcR(γ 受体 )， 而且其包括 FcγRI， FcγRII 和 FcγRIII 亚类的受体， 包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII 受体包括 FcγRIIA(“活化受体” ) 和 FcγRIIB(“抑制受体” )， 它们具有相似的氨基酸序列， 区别 主要在于其胞质结构域。活化受体 FcγRIIA 在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨 酸的活化基序 (ITAM)。抑制受体 FcγRIIB 在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸 的抑制基序 (ITIM)( 参见综述 M.in Annu.Rev.Immunol.( 免疫学年度评论 )15 ： 203-234(1997))。FcR 的综述参见 Ravetch 和 Kinet， Annu.Rev.Immunol.( 免疫学年度评 论 )9 ： 457-492(1991) ； Capel 等， Immunomethods( 免疫方法 )4 ： 25-34(1994) ； 和 de Haas 等， J.Lab.Clin.Med.( 实验室临床医学杂志 )126 ： 330-41(1995)。术语 “FcR” 在本文中涵 盖其它 FcR， 包括未来将会鉴定的 FcR。该术语还包括新生儿受体 (FcRn)， 它负责将母体的 IgG 转移给胎儿 (Guyer 等， J.Immunol.( 免疫学杂志 )117 ： 587(1976) 和 Kim 等， J.Immunol. ( 免疫学杂志 )24 ： 249(1994))。
     “人效应细胞” 指表达一种或多种 FcR 并执行效应子功能的白细胞。优选的是， 该 细胞至少表达 FcγRIII 并执行 ADCC 效应子功能。介导 ADCC 的人白细胞的例子包括外周 血单核细胞 (PBMc)、 天然杀伤 (NK) 细胞、 单核细胞、 细胞毒性 T 细胞和嗜中性粒细胞 ； 其中 优选 PBMC 和 NK 细胞。效应细胞可以从天然来源， 例如从血液分离。
     “补体依赖性细胞毒性” 或 “CDC”指存在补体时靶细胞的溶解作用。经典补体 途径的激活是由补体系统第一组分 (C1q) 结合与其同族抗原结合的 ( 适当子类的 ) 抗体 起始的。为了评估补体激活， 可进行 CDC 测定法， 例如 Gazzano-Santoro 等， J.Immunol. Methods( 免疫学方法杂志 )202 ： 163(1996) 所记载的。
     用于本文时， “治疗 (treatment)” ( 及其语法变体， 诸如 “treat” 或 “treating” ) 指在尝试改变待治疗的个体的天然进程中的临床介入， 并且可以为了预防或在临床病理学 的进程中进行。 治疗的理想效果包括但不限于防止疾病发生或复发， 缓和症状， 消除疾病的 任何直接或间接病理学后果， 预防转移， 减少疾病进展速率， 改善或减轻疾病状态和症状缓 解或改善的预后。在一些实施方案中， 本发明的抗体用于延迟疾病的发生或延缓疾病的进 展。 术语 “治疗有效量” 指治疗受试者中疾病或病症的抗体或抗体片段的量。对于肿 瘤 ( 例如癌性肿瘤 )， 抗体或抗体片段的治疗有效量可减少癌细胞数量 ； 减小原发性肿瘤大 小； 抑制 ( 即减慢到一定程度并优选停止 ) 癌细胞浸润到周围器官中 ； 抑制 ( 即减慢到一定 程度并优选停止 ) 肿瘤转移 ； 在一定程度抑制肿瘤生长 ； 和 / 或在一定程度上缓解一或多 种与病症相关的症状。抗体或抗体片段在达到可以预防现存癌细胞生长和 / 或杀死现存癌 细胞的程度时， 其可为细胞生长抑制性和 / 或细胞毒性的。对于癌症治疗， 体内效力可以通 过， 例如评价存活期、 疾病进展时间 (TTP)、 应答率 (RR)、 应答期、 和 / 或生活质量来测量。
     “减小或抑制” 的意思是导致优选地 20％或更高、 更优选地 50％或更高、 并且最优 选地 75％、 85％、 90％、 95％、 或更高的总体降低。减小或抑制可以涉及在治疗的病症的症 状、 转移灶的存在或大小、 原发性肿瘤的大小、 或血管源性病症中血管的大小或数目。
     术语 “癌症” 和 “癌性” 是指或者描述哺乳动物中一般特征在于细胞生长不受调控 的生理学状态。这种定义包含良性和恶性癌症。 “癌症早期” 的意思是无侵袭性或转移性的 癌症， 或分类为 0、 I、 或 II 期的癌症。
     术语 “癌前” 是指一般在癌症之前或发展成癌症的状态或生长。
     “非转移性” 是指癌症是良性的， 或保持在原发位点并且未侵入淋巴或血管系统或 原发位点以外的其它组织。一般而言， 非转移性癌症是 0、 I、 或 II 期癌症中的任何癌症， 并 且有时是 III 期癌症。
     “药用载体” 是指药物制剂中不同于活性成分的成分， 其对受试者是无毒的。药用 载体包括但不限于缓冲剂、 赋形剂、 稳定剂或防腐剂。
     术语 “抗癌治疗” 是指有效用于治疗癌症的治疗。抗癌治疗剂的实例包括， 但不限 于， 例如， 化疗剂、 生长抑制剂、 细胞毒性剂、 放射性治疗中所用的试剂、 抗血管发生剂、 细胞 凋亡剂、 抗微管蛋白剂和其它治疗癌症的试剂， 抗 -CD20 抗体， 血小板来源的生长因子抑制 TM 剂 ( 例如， Gleevec ( 甲磺酸伊马替尼 (Imatinib Mesylate)))， COX-2 抑制剂 ( 例如， 塞来 考昔 (celecoxib))， 干扰素， 细胞因子， 结合下述一种或多种靶标的拮抗剂 ( 例如， 中和抗 体)： EGFR， ErbB2， ErbB3， ErbB4， PDGFR-beta， BlyS， APRIL， BCMA 或 VEGF 受体， TRAIL/Apo2， 和其它生物活性和有机化学剂等。它们的组合也包含在本发明中。
     “化 疗 剂”是 有 效 用 于 治 疗 癌 症 的 化 合 物。 化 疗 剂 的 实 例 包 括 烷 基 化 试 剂，如 塞 替 哌 (thiotepa) 和 环 磷 酰 胺 (cyclosphosphamide) 烷 基 磺 酸 酯 (alkyl sulfonates) 如 白 消 安 (busulfan)， 英 丙 舒 凡 (improsulfan) 和 哌 泊 舒 凡 (piposulfan) ； 吖 丙 啶 类 (aziridines) 如 苯 佐 替 派 (benzodopa)、 卡波 醌 (carboquone)、美 妥 替 哌 (meturedopa) 和 乌 瑞 替 哌 (uredopa) ； 乙撑亚胺类 (ethylenimines) 和甲基蜜胺类 (methylamelamines)， 包括六甲蜜胺 (altretamine)、 曲 他 胺 (triethylenemelamine)、 三 亚 乙 基 磷 酰 胺 (triethylenephosphoramide)、 三乙烯 硫 代 磷 酸 胺 (triethylenethiophosphoramide) 和 三 羟 甲 蜜 胺 (trimethylomelamine) ； 聚 乙 酸 类 (acetogenins)( 特 别 是 布 拉 他 辛 (bullatacin) 和 布 拉 他 辛 酮 (bullatacinone)) ； Δ-9- 四 氢 大 麻 酚 (delta-9-tetrahydrocannabinol)( 屈 大 麻 酚 (dronabinol)、 )； β- 拉 帕 醌 (beta-lapachone) ； 拉 帕 醇 (lapachol) ； 秋 水 仙 碱 (colchicines) ； 桦 木 酸 (betulinic acid) ； 喜 树 碱 (camptothecin)( 包 括 合 成 的 类 似 物 托 泊 替 康 (topotecan) (irinotecan) CPT-11( 伊 立 替 康 乙 酰 喜 树 碱 (acetylcamptothecin)、 scopolectin和 9- 氨 基 喜 树 碱 (9-aminocamptothecin)) ； 苔 藓 抑 素 (bryostatin) ； callystatin ； CC-1065( 包括其阿多来新 (adozelesin)、 卡折来新 (carzelesin) 和比折来新 (bizelesin) 合成类似物 )； 鬼 臼 毒 素 (podophyllotoxin) ； 鬼 臼 酸 (podophyllinic acid) ； 替尼 泊 苷 (teniposide) ； 隐 藻 素 类 (cryptophycins)( 特 别 是 隐 藻 素 1 和 隐 藻 素 8) ； 多 拉 司 他 汀 (dolastatin) ； 倍 癌 霉 素 (duocarmycin)( 包 括 合 成 的 类 似 物、 KW-2189 和 CB1-TM1) ； 艾 榴 素 (eleutherobin) ； pancratistatin ； 匍 枝 珊 瑚 醇 (sarcodictyin) ； 海 绵 素 (spongistatin) ； 氮 芥 (nitrogen mustards) 如 苯 丁 酸 氮 芥 (chlorambucil)、 萘 氮 芥 (chlornaphazine)、 胆 磷 酰 胺 (chlorophosphamide)、 雌 莫 司 汀 (estramustine)、 异 环 磷 酰 胺 (ifosfamide)、 氮 芥 (mechlorethamine)、 盐 酸 氧 氮 芥 (mechlorethamineoxide hydrochloride)、美 法 仑 (melphalan)、新 氮 芥 (novembichin)、苯 芥 胆 甾 醇 (phenesterine)、 泼 尼 莫 司 汀 (prednimustine)、 曲 磷 胺 (trofosfamide)、 尿嘧啶氮 芥 (uracil mustard) ； 亚 硝 基 脲 类 (nitrosoureas) 如 卡 莫 司 汀 (carmustine)、氯 脲 菌 素 (chlorozotocin)、 福 莫 司 汀 (fotemustine)、 洛 莫 司 汀 (lomustine)、 尼莫司 汀 (nimustine) 和 雷 莫 司 汀 (ranimnustine) ； 抗 生 素 如 烯 二 炔 类 (enediyne) 抗 生 素 ( 例 如 加 利 车 霉 素 (calicheamicin)， 尤 其 是 加 利 车 霉 素 γ1I 和 加 利 车 霉 素 ωIl( 参 见 例 如 Nicolaou 等， Angew， Chem.Intl.Ed.Engl.33 ： 183-186(1994)) ； CDP323( 一 种 口 服 α-4 整 合 素 抑 制 剂 ) ； 烯 二 炔 蒽 环 类 抗 生 素 (dynemicin)， 包括烯二炔蒽环 类抗生素 A； 埃 斯 波 霉 素 (esperamicin) ； 以 及 新 制 癌 菌 素 (neocarzinostatin) 生 色 团 和 相 关 色 素 蛋 白 烯 二 炔 类 抗 生 素 生 色 团 )、 阿 克 拉 霉 素 (aclacinomysins)、 放 线 菌 素 (actinomycin)、 蒽 霉 素 (authramycin)、 偶 氮 丝 氨 酸 (azaserine)、 博来霉素 (bleomycins)、放 线 菌 素 C(cactinomycin)、 carabicin、洋 红 霉 素 (carminomycin)、 嗜 癌 霉 素 (carzinophilin)、 色 霉 素 (chromomycins)、 放 线 菌 素 D(dactinomycin)、 柔 红 霉 素 (daunorubicin)、 地 托 比 星 (detorubicin)、 6- 重 氮 -5- 氧 代 -L- 正 亮 氨 酸 (6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、 多 柔 比 星 (doxorubicin)( 包 括 吗 啉 代 - 多 柔 比 星 (morpholino-doxorubicin)、氰 基 吗 啉 代 - 多 柔 比 星 (cyanomorpholino-doxorubicin)、 2- 吡 咯 啉 - 多 柔 比 星 (2-pyrrolino-doxorubicin)、 盐酸多柔比星脂质体注射剂 聚乙二醇化脂质体多柔比星 脂 质 体 多 柔 比 星 TLC D-99 和 脱 氧 多 柔 比 星 (deoxydoxorubicin))、 表柔 比 星 (epirubicin)、 依 索 比 星 (esorubicin)、 伊 达 比 星 (idarubicin)、 马塞罗霉素 (marcellomycin)、 丝 裂 霉 素 类 (mitomycins) 如 丝 裂 霉 素 C、 麦 考 酚 酸 (mycophenolic acid)、 诺 拉 霉 素 (nogalamycin)、 橄 榄 霉 素 (olivomycins)、 培 洛 霉 素 (peplomycin)、 紫 菜 霉 素 (porfiromycin)、 嘌 呤 霉 素 (puromycin)、 三 铁 阿 霉 素 (quelamycin)、 罗多比 星 (rodorubicin)、 链 黑 霉 素 (streptonigrin)、 链 佐 星 (streptozocin)、 杀结核菌素 (tubercidin)、 乌 苯 美 司 (ubenimex)、 净 司 他 丁 (zinostatin)、 佐 柔 比 星 (zorubicin) ； 抗 代 谢 物 如 甲 氨 喋 呤 (methotrexate)、 吉 西 他 滨 (gemcitabine) 氟 (tegafur) 卡 培 他 滨 (capecitabine) 替加 epothilone和 5- 氟 尿 嘧 啶 (5-fluorouracil)(5-FU) ； 叶 酸 类 似 物 如 二 甲 叶 酸 (denopterin)、 甲 氨 喋 呤、 喋 罗 呤 (pteropterin)、 三 甲 曲 沙 (trimetrexate) ； 嘌呤类似物如氟达拉 滨 (fludarabine)、 6- 巯 嘌 呤 (6-mercaptopurine)、 硫 咪 嘌 呤 (thiamiprine)、 硫鸟嘌 呤 (thioguanine) ； 嘧 啶 类 似 物 如 安 西 他 滨 (ancitabine)、 阿 扎 胞 苷 (azacitidine)、 6- 氮 尿 苷 (6-azauridine)、卡 莫 氟 (carmofur)、阿 糖 胞 苷 (cytarabine)、双 脱 氧 尿 苷 (dideoxyuridine)、去 氧 氟 尿 苷 (doxifluridine)、依 诺 他 滨 (enocitabine)、 氟 尿 苷 (floxuridine) ； 雄 激 素 类， 诸 如 卡 鲁 睾 酮 (calusterone)、 丙酸屈他雄酮 (dromostanolone propionate)、 环 硫 雄 醇 (epitiostanol)、 美 雄 烷 (mepitiostane)、 睾 内酯 (testolactone) ； 抗肾上腺药 (anti-adrenals) 如氨鲁米特 (aminoglutethimide)、 米 托 坦 (mitotane)、 曲 洛 司 坦 (trilostane) ； 叶 酸 补 偿 剂 如 亚 叶 酸 (frolinic acid) ； 醋 葡 醛 内 酯 (aceglatone) ； 羟 醛 磷 酰 胺 配 糖 (aldophosphamide glycoside) ； 5- 氨 基 酮 戊 酸 (aminolevulinic acid) ； 恩 尿 嘧 啶 (eniluracil) ； 安 吖 啶 (amsacrine) ；bestrabucil ； 比 生 群 (bisantrene) ； 依 达 曲 沙 (edatraxate) ； defofamine ； 秋水仙 胺 (demecolcine) ；地 吖 醌 (diaziquone) ； elfornithine ；依 利 醋 铵 (elliptinium acetate ； 埃坡霉素 (epothilone) ； 依托格鲁 (etoglucid) ； 硝酸镓 (gallium nitrate) ； 羟 基 脲 (hydroxyurea) ； 香 菇 多 糖 (lentinan) ； 氯 尼 达 明 (lonidainine) ； 美登木素生 物 碱 类 (maytansinoids) 如 美 登 素 (maytansine) 和 安 丝 菌 素 (ansamitocins) ； 米托 胍 腙 (mitoguazone) ； 米 托 蒽 醌 (mitoxantrone) ； 莫 哌 达 醇 (mopidanmol) ； 尼曲吖啶 (nitraerine) ； 喷司他丁 (pentostatin) ； 异丙嗪 (phenamet) ； 吡柔比星 (pirarubicin) ； 洛索蒽醌 (losoxantrone) ； 2- 乙基酰肼 (2-ethylhydrazide) ； 丙卡巴肼 (procarbazine) ； 多 糖 复 合 物 (JHS Natural Products(JHS 天 然 产 品 )， Eugene， OR) ； 雷佐生 (razoxane) ； 利索新 (rhizoxin) ； 西佐喃 (sizofiran) ； 锗螺胺 (spirogermanium) ； 细交 链孢菌酮酸 (tenuazonic acid) ； 三亚胺醌 (triaziquone) ； 2， 2’ ， 2’ - 三氯三乙胺 (2， 2’ ， 2” -trichlorotriethylamine) ； 单端孢霉烯族化合物 (trichothecenes)( 特别是 T-2 毒 素、 verracurin A、 杆孢菌素 A(roridin A) 和蛇形菌素 (anguidine)) ； 乌拉坦 (urethan) ； 长 春 地 辛 (vindesine) 达 卡 巴 嗪 (dacarbazine) ； 甘 露 莫 司 汀 (mannomustine) ； 二 溴 甘 露 醇 (mitobronitol) ； 二 溴 卫 矛 醇 (mitolactol) ； 哌 泊 溴 烷 (pipobroman) ； gacytosine ； 阿 糖 胞 苷 (arabinoside)(“Ara-C” )； 塞替哌 (thiotepa) ； 紫杉烷类化合物 (taxoid)， 例如紫杉醇 (paclitaxel) 的白蛋白改造的纳米颗粒制剂 (ABRAXANETM) 和多西他塞 (docetaxel) 苯丁酸氮芥 (chloranbucil) ； 6- 硫鸟嘌呤 (6-thioguanine) ； 巯嘌呤 (mercaptopurine) ； 甲 氨 喋 呤 ；铂 药 剂 如 顺 铂 (cisplatin)，奥 沙 利 铂 (oxaliplatin)( 例 如， 和 卡 铂 (carboplatin) ； 防 止 微 管 蛋 白 聚 合 形 成 微 管 的 vincas， 包括 长 春 碱 (vinblastine) vindesine 长 春 新 碱 (vincristine) 和长春瑞滨 (vinorelbine) 紫杉醇依托泊苷 (etoposide)(VP-16) ； 异环磷酰胺 (ifosfamide) ； 米托蒽醌 (mitoxantrone) ； leucovorin ； 诺 安 托 (novantrone) ； 依 达 曲 沙 (edatrexate) ； 道 诺 霉 素 (daunomycin) ； 氨 基 喋 呤 (aminopterin) ； 伊 班 膦 酸 盐 (ibandronate) ； 拓 扑 异 构 酶 抑 制 剂 RFS 2000 ； 二 氟 甲 基 鸟 氨 酸 (difluoromethylornithine)(DMFO) ； 类 视 黄 酸 类 (retinoids)， 诸如 视 黄 酸 (retinoic acid)， 包 括 贝 沙 罗 汀 (bexarotene) (bisphosphonates) 如 氯 膦 酸 盐 (clodronate)( 例 如， 替膦酸盐 (etidronate) 来 膦 酸 盐 (zoledronate) 帕米膦酸盐 (pamidronate) 或 二膦酸盐类 )、 依NE-58095、 唑来膦酸 (zoledronic acid)/ 唑 阿 仑 膦 酸 盐 (alendronate) 替鲁膦酸盐 (tiludronate) 或利塞膦酸盐 (risedronate) 曲沙他滨 (troxacitabine)(1， 3- 二氧戊环核 苷胞嘧啶类似物 ) ； 反义寡核苷酸， 特别是抑制在涉及异常细胞增殖的信号传导途径中基 因的表达的那些， 诸如例如， PKC-α、 Raf、 H-Ras 和表皮生长因子受体 (EGF-R) ； 疫苗诸如 疫苗和基因治疗疫苗、 例如， 疫苗、 疫苗和 如， 疫苗 ； 拓扑异构酶 1 抑制剂 ( 例如 rmRH ( 例 BAY439006( 索 拉 非 尼 (sorafenib) ； Bayer) ； SU-11248( 舒 尼 替 尼(sunitinib)， (bortezomib)Pfizer) ； 哌立福辛 (perifosine)， COX-2 抑制剂 ( 例如塞来 CCI-779 ； 替 匹 法 尼 (tipifarnib)(R11577) ； orafenib， 匹考昔 (celecoxib) 或艾托考昔 (etoricoxib))， 蛋白体抑制剂 ( 例如 PS341) ； 硼替佐米 ABT510 ； Bcl-2 抑 制 剂 诸 如 奥 利 美 生 钠 (oblimersensodium)蒽 醌 (pixantrone) ； EGFR 抑 制 剂 ( 参 见 下 文 定 义 ) ； 酪氨酸激酶抑制剂 ( 参见下文定 义)； 丝氨酸 - 苏氨酸激酶抑制剂诸如雷帕霉素 (rapamycin)( 西罗莫司 (sirolimus)， 法 尼 基 转 移 酶 抑 制 剂 诸 如 氯 那 法 尼 (lonafarnib)(SCH 6636， 和以上任一种的药用盐、 酸或衍生物 ； 以及以上两种以上的组合， 诸如 CHOP， SARASAR ) ； 即 环 磷 酰 胺、 多 柔 比 星、 长 春 新 碱、 和 泼 尼 松 龙 (prednisolone) 的 组 合 疗 法 的 缩 写 ； 和 FOLFOX， 即 关 于 与 5-FU 和 亚 叶 酸 (leucovorin) 组 合 的 奥 沙 利 铂 (oxaliplatin) (ELOXATINTM) 的治疗方案的缩写。
     本文定义的化疗剂包括 “抗激素剂”或 “内分泌治疗剂” ， 其作用为调节、 降低、 阻断或抑制可促进癌生长的激素效果。它们自身可以是激素。包括， 但不限于具有混合 的 激 动 剂 / 拮 抗 剂 模 式 的 抗 雌 激 素 类， 包 括 他 莫 昔 芬 (tamoxifen) 4- 羟基他莫西芬， 托瑞米芬 (toremifene) 洛 昔 芬 (droloxifene)， 雷 洛 昔 芬 (raloxifene) 激素类， 如氟维司群 (fulvestrant) 艾多昔芬 (idoxifene)， 屈 曲 沃 昔 芬 (trioxifene)， 和 EM800( 所述药剂可以阻断雌激素TMkeoxifene， 和选择性雌激素受体调控物类 (SERM) 如 SERM3， 不具有激动剂性质的纯的抗雌 受体 (ER) 二聚化， 抑制 DNA 结合， 增加 ER 更新和 / 或抑制 ER 水平 ) ； 芳香酶抑制剂包括类 固醇芳香酶抑制剂如福美坦 (formestane) 和益西美坦 (exemestane) 和 非 类 固 醇 芳 香 酶 抑 制 剂 如 阿 那 曲 唑 (anastrazole) (letrozole) 伏氯唑 (vorozole) 德 (leuprolide) 和 醋酸甲地孕酮 (megestrol acetate) 戈 舍 瑞 林 (goserelin)，布 舍 瑞 林 来曲唑 和氨鲁米特 (aminoglutethimide)， 和其它芳香酶抑制剂包括法 倔 唑 (fadrozole)， 和 4(5)- 咪 唑 ； 促 性 腺 激 素 释 放 激 素 激 动 剂， 包括亮丙立 (buserelin)， 和曲普瑞林 (tripterelin) ； 性类固醇， 包括黄体酮 (progestines) 如醋酸 甲 地 孕 酮 (megestrol acetate) 和 醋 酸 甲 羟 孕 酮 (medroxyprogesterone acetate)， 雌 激素如己烯雌酚 (diethylstilbestrol) 和普罗马林 (premarin)， 和雄激素 / 类视黄醇 如氟甲睾酮 (fluoxymesterone)， 所有的反式视黄酸 (transretionic acid) 和芬维 A 胺 (fenretinide) ； 奥 那 司 酮 (onapristone) ； 抗 黄 体 酮 (anti-progesterones) ； 雌激素受 体下调剂 (ERDs) ； 抗雄激素如氟他胺 (flutamide)， 尼鲁米特 (nilutamide) 和比卡鲁胺 (bicalutamide) ； 上述任一种的药用盐、 酸或衍生物， 以及上述两种以上的组合。
     “受试者” 是脊椎动物， 优选哺乳动物， 更优选为人。哺乳动物包括但不限于人、 非 人高等灵长类动物、 灵长类动物、 家畜 ( 如牛 )、 竞技动物、 宠物 ( 如猫、 狗和马 ) 和实验室动 物 ( 如小鼠和大鼠 )。
     II. 详细描述
     本发明提供抗体和功能性抗体片段， 其包含至少一个抗原结合结构域， 所述抗原 结合结构域对至少两种不同 HER 受体， 特别是 EGFR 和 HER2， EGFR 和 HER3， 或 EGFR 和 HER4具有结合特异性。这些多特异性抗体不同于传统多特异性抗体， 后者具有带有不同结合特 异性的抗原结合结构域 ( 通常两个 )。在某些实施方案中， 本文描述的多特异性抗体具有 IgG( 或 Fab) 的分子结构， 因此保留了 IgG 对于治疗开发有利的属性， 诸如可预测的药物代 谢动力学性质， 充分确立的制备方案， Fc 介导的效应子功能的选择， 和二价或单价。在通过 组装两个不同抗体片段成一个分子获得的传统多特异性抗体中， 这些有利属性常常是缺失 的。
     在本文中描述的多特异性抗体及其功能性抗体片段有效用于治疗与 HER 受体途 径相关的疾病或病症， 诸如癌症。 在一个具体的实施方案中， 多特异性抗体的抗原结合结构 域特异性结合 EGFR 和 HER3 两者。在另一个实施方案中， 抗原结合结构域特异性结合 EGFR 和 HER2 两者。在另一个实施方案中， 抗原结合结构域特异性结合 EGFR 和 HER4 两者。
     本发明的一个特别方面提供包含两个 ( 或多个 ) 抗原结合结构域的抗体， 其中每 个具有相同的结合特异性。
     一个实施方案提供包含两个抗原结合结构域的多特异性抗体， 其中每个抗原结合 结构域具有相同的特异性， 并且特异性结合两个不同 HER 受体。在一个具体的实施方案中， 每个抗原结合结构域特异性结合 EGFR 和 HER3 两者。 在另一个实施方案中， 每个抗原结合结 构域特异性结合 EGFR 和 HER2 两者。在另一个实施方案中， 每个抗原结合结构域特异性结 合 EGFR 和 HER4 两者。在又一个实施方案中， 每个抗原结合结构域特异性结合 EGFR 的结构 域 III。在另一个实施方案中， 每个抗原结合结构域特异性结合 HER3 的结构域 III。在又 一个实施方案中， 每个抗原结合结构域能够结合 EGFR 的结构域 III 和 HER3 的结构域 III。
     在具体的实施方案中， 多特异性抗体特异性结合其一个靶标 HER 受体或多个 HER 受体， 并且不特异性结合非靶标 HER 受体。因此， 在一个实施方案中， 多特异性抗体特异性 结合 EGFR 和 HER3 但是不特异性结合 HER2 或 HER4。在另一个实施方案中， 多特异性抗体特 异性结合 EGFR 和 HER2 但是不特异性结合 HER3 或 HER4。在另一个实施方案中， 多特异性抗 体特异性结合 EGFR 和 HER4 但是不特异性结合 HER2 或 HER3。
     在某些实施方案中， 每个抗原结合结构域包含重链可变结构域 (VH) 和轻链可变结 构域 (VL)。在一个实施方案中， 所述 VHVL 单元特异性结合两种不同 HER 受体。在一个具体 的实施方案中， 所述 VHVL 单元特异性结合 EGFR 和 HER3。在另一个实施方案中， 所述 VHVL 单 元特异性结合 EGFR 和 HER2。 在另一个实施方案中， 所述 VHVL 单元特异性结合 EGFR 和 HER4。
     在具体的实施方案中， 多特异性抗体对于其一个靶标 HER 受体或多个受体的亲和 力通过下述 Kd 表示， 所述 Kd 低于 10-5M， 低于 10-6M， 低于 10-7M， 低于 10-8M， 低于 10-9M， 低于 -10 -11 -12 10 M， 低于 10 M， 或低于 10 M。在一个实施方案中， 抗体对于其靶标受体之一的 Kd 低于 -7 -8 -9 -10 -11 10 M， 低于 10 M， 低于 10 M， 低于 10 M， 低于 10 M， 或低于 10-12M。在另一个实施方案中， 多特异性抗体对于其所有靶标受体的 Kd 低于 10-7M， 低于 10-8M， 低于 10-9M， 低于 10-10M， 低于 -11 -12 10 M， 或低于 10 M。
     在一些实施方案中， 多特异性抗体对于其靶标 HER 受体之一的亲和力大于对于其 另外一个靶标 HER 受体或多个受体的亲和力。在一个实施方案中， 多特异性抗体对于一 个靶标 HER 受体的亲和力比其对于另一个靶标 HER 受体的亲和力高至少 2， 3， 4， 5， 8， 10， 12， 15， 18， 20， 22， 25， 30， 35， 40， 50， 100- 倍。在一个实施方案中， 多特异性抗体特异性结合 EGFR 和另一个 HER 受体， 并且其对于另一个 HER 受体的结合亲和力比其对于 EGFR 的亲和力高至少 2， 3， 4， 5， 8， 10， 12， 15， 18， 20， 22， 25， 30， 35， 40， 50， 或 100- 倍。在一个实施方案中， 多特异性抗体特异性结合 EGFR 和 HER3， 并且其对于 HER3 的结合亲和力比其对于 EGFR 的结 合亲和力高至少 2， 3， 4， 5， 8， 10， 12， 15， 18， 20， 22， 25， 30， 35， 40， 50， 或 100- 倍。 在另一个实 施方案中， 多特异性抗体特异性结合 EGFR 和 HER2， 并且其对于 HER2 的结合亲和力比其对 于 EGFR 的结合亲和力高至少 2， 3， 4， 5， 8， 10， 12， 15， 18， 20， 22， 25， 30， 35， 40， 50， 或 100- 倍。 在另一个实施方案中， 多特异性抗体特异性结合 EGFR 和 HER4， 并且其对于 HER4 的结合亲 和力比其对于 EGFR 的亲和力高至少 2， 3， 4， 5， 8， 10， 12， 15， 18， 20， 22， 25， 30， 35， 40， 50， 或 100- 倍。
     在一些实施方案中， 本发明的多特异性抗体抑制它们特异性结合的 HER 受体中的 至少一个的生物学活性。在一些实施方案中， 本发明的多特异性抗体抑制它们特异性结合 的两个 HER 受体的生物学活性。因此， 例如， 本发明的多特异性抗体抑制 EGFR 和 / 或 HER2 和 / 或 HER3 和 / 或 HER4 受体的生物学活性。
     在一个实施方案中， 多特异性抗体特异性结合人 EGFR 和人 HER3， 并且抑制至少 EGFR 的生物学活性。在另一个实施方案中， 多特异性抗体特异性结合人 EGFR 和人 HER3， 并 且抑制至少 HER3 的生物学活性。在另一个实施方案中， 多特异性抗体特异性结合人 EGFR 和人 HER3， 并且抑制 EGFR 和 HER3 两者的生物学活性。
     在另一个实施方案中， 多特异性抗体特异性结合人 EGFR 和人 HER2， 并且抑制至少 EGFR 的生物学活性。在又一个实施方案中， 抗体特异性结合人 EGFR 和人 HER2， 并且抑制至 少 HER2 的生物学活性。 在又一个实施方案中， 抗体特异性结合人 EGFR 和人 HER2， 并且抑制 EGFR 和 HER2 两者的生物学活性。
     在另一个实施方案中， 抗体特异性结合人 EGFR 和人 HER4， 并且抑制至少 EGFR 的 生物学活性。在另一个实施方案中， 抗体特异性结合人 EGFR 和人 HER4， 并且抑制至少 HER4 的生物学活性。 在另一个实施方案中， 抗体特异性结合人 EGFR 和人 HER4， 并且抑制 EGFR 和 HER4 两者的生物学活性。
     在某些实施方案中， 本文的抗体抑制至少部分地由它们不结合的 HER 受体驱动的 生物学活性。例如， 结合 EGFR 和 HER3 的抗体可能仍然能够抑制 HER2 驱动的生物学活性。
     生物学活性的抑制可在本领域熟知的测定法中测量。 因此， 例如， 本文的抗体可抑 制一个或多个 HER 受体的磷酸化， 和 / 或可抑制 HER 配体结合其受体， 和 / 或可抑制配体诱 导的 HER 受体表达细胞的增殖和 / 或可抑制通过 HER 受体活化的下游信号传导途径。
     应答 EGFR 磷酸化活化的两个主要下游信号传导途径是 Ras/MAPK 和磷脂酰肌醇 3- 激酶 (PI3K)/Akt 途径。因此， 本文的抗体抑制 HER 受体的生物学活性的能力可通过， 例 如在 NR6 细胞中， 评估其是否能够阻断这些途径的活化来测量。因此， 可测量抗体阻断配体 诱导的 p44/42MAPK， pAKT 或其它下游信号传导分子的磷酸化的能力。HER3 信号传导也参 与数个其它途径， 包括 c-met 和 FGFR。本文的抗体抑制 HER 受体的生物学活性的能力可通 过评估其是否能够阻断这些途径的活化来测量。
     本发明一方面提供多特异性抗体， 其如下产生， 即使对一个 HER 受体具有特异性 的抗体多样化， 从而该抗体对第二个 HER 受体产生特异性， 同时保留对所述第一个 HER 受体 的特异性。总体而言， 这种方法包括步骤 (1) 使抗体的轻链可变结构域 (VL) 的氨基酸序列 多样化， 其中在所述多样化之前， 所述抗体包含 VL 和能够结合第一 HER 受体上的表位的重链可变结构域 (VH)， 和 (2) 选择能够结合第一 HER 受体上的表位和第二 HER 受体上的表位 的多样化的抗体。 这些步骤可重复， 以便产生多特异性抗体。 在美国专利申请 20080069820 中提供了这种方法的详细描述， 其全文通过引用明确并入本文。这种方法在实施例中进一 步说明。在实施例中描述的方法中， 抗 EGFR 抗体用作进行多样化的模板， 并且因此用于制 备多特异性抗 HER 抗体， 然而， 其它抗 HER 抗体， 诸如抗 HER2， 抗 HER3 或抗 HER4 抗体也可用 作模板。
     本发明还提供单特异性抗体， 其能够特异性结合一个 HER 受体但不特异性结合其 它 HER 受体。在一个实施方案中， 所述抗体特异性结合 EGFR。在一个实施方案中， 所述抗 体特异性结合 EGFR 的结构域 III。在一些实施方案中， 所述抗体特异性结合 EGFR 并且抑 制 EGFR 的生物学活性。在另一个实施方案中， 所述抗体特异性结合 HER3。在一个实施方 案中， 所述抗体特异性结合 HER3 的结构域 III。在一些实施方案中， 所述抗体特异性结合 HER3 并且抑制 HER3 的生物学活性。
     所述单特异性抗体可用作模板抗体， 用于进一步多样化， 以便添加对其它 HER 受 体或对其它靶抗原的结合特异性。
     毒性
     EGFR 拮 抗 剂 的 毒 性 在 临 床 前 和 临 床 研 究 中 均 有 许 多 文 件 记 载。 例 如， 在治 疗 有 效 水 平， 抗 EGFR 抗 体 西 妥 昔 单 抗 显 示 多 种 形 式 的 毒 性。 西 妥 昔 单 抗 ( 爱 必 妥 Imclone) 最常见的副反应 ( 发病率≥ 25 ％ ) 是皮肤的副反应 ( 包 括疹， 瘙痒和指甲改变 )， 头痛， 腹泻和感染。西妥昔单抗治疗相关的最严重有害反应 是 输 液 反 应 (infusion reactions)， 心 肺 功 能 停 止 (cardiopulmonary arrest)， 皮肤 病 学 毒 性 (dermatologic toxicity) 和 放 射 性 皮 炎 (radiation dermatitis)， 脓毒症 (sepsis)， 肾衰竭 (renal failure)， 间质性肺炎 (interstitial lung disease) 和肺栓子 (pulmonary embolus)。参见， 对于西妥昔单抗的生物制品许可协议 (Biologics License Agreement(BLA))( 申请号 ： 125084)( 通过引用并入本文 )。对于帕尼单抗 Amgen) 观察到类似的毒性问题， 其中在 89％的施用这种抗体的患者中发生皮肤病学毒性。 这些毒性是严重的， CTC 3 级以及更高。
     FDA 标签。)已 经 报 道 在 一 些 例 子 中 抗 EGFR 化 疗 剂 厄 洛 替 尼 (erlotinib) 导 致 急 性 肾 衰 竭 (acute renal failure) 或 肾 机 能 不 全 (renal insufficiency)， 肝 衰 竭 (hepatic failure) 和 / 或 肝 肾 综 合 征 (hepatorenal syndrome)， 胃 肠 穿 孔 (gastrointestinal perforations)， 大疱 (bullous) 和表皮脱落皮肤病症 (exfoliative skin disorders) 和 角膜溃疡形成和穿孔 (corneal ulceration and perforation)。参见， FDA 关于厄洛替尼 Genentech， OSI Pharmaceuticals) 的警告和预防 (Warnings and Precautions) 安全标签 (2009)。“毒性的” 或 “毒性” 是指施用给受试者的药剂导致的任何副作用。毒性的测量 包括但不限于死亡率 (mortality)、 体重减轻 (loss of body weight)、 器官衰竭 (organ failure)、 改 变 器 官 功 能 (altered organ function)、 中 枢 神 经 系 统 毒 性 (central nervous system toxicity)、 胃肠毒性 (gastrointestinal toxicity)( 例如， 表现为腹 泻 (diarrhea))、 皮肤病学毒性 (dermatologic toxicity)( 例如， 表现为出现疹 (rash)、 心脏毒性 (cardiac 皮肤损害 (skin lesion)、 脱屑 (desquamation) 或瘙痒 (pruritus))，
     toxicity)、 感染 (infection)、 脓毒症 (sepsis) 和细胞毒性 (cytotoxicity)。
     毒 性 可 通 过 本 领 域 已 知 的 方 法 确 定， 诸 如 监 测 临 床 护 架 旁 观 察 (clinical cageside observation)、 体重、 食物消耗、 呼吸率、 脉搏血氧定量法测量、 体格检查、 眼评 价、 神经病学评价、 代谢参数、 心血管参数、 临床病理学 ( 包括临床化学、 血液学、 尿分析和 凝固参数 ) 和肉眼检查病理学和显微镜病理学。
     国家癌症研究所 (National Cancer Institute) 制作的不良事件常用术语标准 (The Common Terminology Criteria for Adverse Events)v3.0(CTCAE)( 其全文通过引 用并入本文 ) 提供了关于在人受试者中具体可接受的毒性指标的信息。图 31 提供了关于 EGFR 拮抗剂疗法观察到的非临床和临床毒性的信息。
     毒性可根据总毒性事件或一个毒性事件 / 多个毒性事件的严重性进行测量。事件 的严重性可使用 CTCAE 中建立的分级系统来描述。对每个不良事件使用唯一的严重性临床 描述进行分级， 这是基于下述一般准则 ： 1 级是指轻度事件。2 级是指中度事件， 3 级是指严 重事件， 4 级是指威胁生命或致残事件， 5 级是指死亡相关的事件。CTCAE 提供了对于毒性 事件的具体临床描述。对皮肤病学毒性的描述词从 CTCAE， v.3 第 14 页开始提供。作为实 例， 图 32 显示对于疹 / 脱屑和痤疮 / 痤疮样疹的分级。(CTCAE， v.3)。存在本领域已知的 许多模型用于监测毒性的可能指标， 包括但不限于体外基于细胞的模型和体内非人动物模 型。毒性也在人受试者在临床试验研究中进行监测。
     在一个具体实施方案中， 毒性在食蟹猴 (cynomolgus monkeys) 中进行测量。EGFR 拮抗剂在食蟹猴中的毒性效应有许多文件记载。如在关于西妥昔单抗的生物制品许可协 议 (Biologics License Agreement)(BLA)( 申请号 ： 125084)( 通过引用并入本文 ) 中所 记载， 所有接受西妥昔单抗的猴子显示在皮肤上的轻度至严重损害， 由鳞屑形成 (scale formation)、 变红 (reddening)、 红斑 (erythema)、 皮炎 (dermatitis)、 裂隙 (fissures)、 伤 口 (wounds) 和疹病 (exanthema) 和 / 或毛发稀疏或脱失 (hair thinning or loss) 组成。 皮肤病学毒性在严重性和发生事件中均是剂量依赖的， 其中对于高、 中和低剂量的严重性 分别为严重、 中度和轻度， 以及发病时间分别在研究的第 15， 22 和 64 天。严重皮肤损伤的 继发并发症是细菌感染或脓毒症， 在高剂量组中 50％的动物随后死亡或进行安乐死。其它 剂量相关毒性包括在某些临床病理学参数中的改变， 所述参数与肝、 骨髓、 脾和淋巴样器官 中的细胞和组织损伤的肉眼检查和显微镜证据相关。
     如实施例中所描述的， 与用同样量的 EGFR 拮抗剂西妥昔单抗给药食蟹猴相比较， 用特异性结合 EGFR 和 HER3 的双特异性抗体给药的食蟹猴显示更少的毒性发生率， 如通过 皮肤损害所显示的。用 25mg/kg 的双特异性抗体给药的三只食蟹猴中的一只发生皮肤损 害， 而用 25mg/kg 的西妥昔单抗给药的 3 只食蟹猴中的 3 只发生皮肤损害。在双特异性抗 体给药的猴子中发生的损害比西妥昔单抗给药的猴子中的损害严重性更低， 并且延缓了损 害的发病。 与其中在所有动物中皮肤损害的发病发生在第三次给药之后的用西妥昔单抗给 药的猴子相比较， 用双特异性抗体给药的动物在最后一次 ( 第六次 ) 给药之后的一周发生 皮肤损害。
     在西妥昔单抗的临床研究中， 观察到了皮肤病学毒性， 包括痤疮样疹、 皮肤干燥和 裂隙和炎症和感染性后遗症 (infectious sequelae)。报道的皮肤病学毒性的发生率高达 89％ ( 对于患有晚期结肠直肠癌的那些患者 )。皮肤毒性的模型是已知的并且可用于确定抗体的皮肤病学毒性。此类模型 的 实 例 包 括 人 表 皮 角 质 化 细 胞 (NHEK(Clonetics， San Diego， CA ； Lonza Bioscience， Walkersville， MD) ； HEKa(Cascade Biologics， Portland， OR ； Invitrogen， Carlsbad， TM CA) 和重建人表皮 (EpiDerm cultures(MatTek， Ashland， MA)。这些模型可用于检查抗 体对细胞增殖、 基因表达、 蛋白表达、 受体磷酸化、 细胞活力和组织病理学中改变的效应。 Lacouture， M.E.， Nature Rev.Cancer( 自然综述 ： 癌症 )， 6： 803-812(2006)。
     希望提供靶向 EGFR 途径的更低毒性的抗体。EGFR 拮抗剂诸如西妥昔单抗的剂量 被毒性 ( 主要是皮肤病学毒性和输液反应 ) 所限制。更低毒性的抗体可以比更高毒性的 EGFR 拮抗剂更高的剂量施用， 这可产生增加的抗肿瘤效应。 因此， 本发明一方面提供多特异 性抗体， 其特异性结合 EGFR 和至少一个其它 HER 受体， (HER2， HER3， 和 / 或 HER4)， 其中当 所述抗体和 EGFR 拮抗剂以同等剂量施用时， 所述抗体比 EGFR 拮抗剂毒性更低。在一个实 施方案中， 所述抗体特异性结合 EGFR 和 HER3。在另一个实施方案中， 所述抗体特异性结合 EGFR 和 HER2。在又一个实施方案中， 所述抗体特异性结合 EGFR 和 HER4。
     在一些实施方案中， 在体内模型中与 EGFR 拮抗剂相比较， 所述多特异性抗体诱导 更低的毒性发生率， 更低严重性的毒性或延缓毒性的发病。本发明一方面提供多特异性抗 体， 其特异性结合 EGFR 和至少一个其它 HER 受体 (HER2， HER3， 和 / 或 HER4)， 其中与在施 用 EGFR 拮抗剂的受试者中的毒性事件相比较， 在施用所述抗体的受试者中所述抗体诱发 更少的毒性事件。在具体实施方案中， 在施用所述抗体的受试者中毒性事件的数目比施 用 EGFR 拮抗剂的受试者中的毒性事件的数目低至少 10 ％， 20 ％， 30 ％， 40 ％， 50 ％， 60 ％， 70％， 80％， 或 90％。
     在其它实施方案中， 使用所述抗体的受试者中毒性事件的比率低于 80 ％， 70 ％， 60％， 50％， 40％， 30％， 20％， 10％， 5％， 2％， 或 1％。
     在具体实施方案中， 与 EGFR 拮抗剂相比较， 所述多特异性抗体在体内模型中诱发 更低发生率的皮肤病学毒性、 更低严重性的皮肤病学毒性或延缓皮肤病学毒性的发病。本 发明一方面提供多特异性抗体， 其特异性结合 EGFR 和至少一个其它 HER 受体 (HER2， HER3， 和 / 或 HER4)， 其中与施用 EGFR 拮抗剂的受试者中的总皮肤病学毒性事件相比较， 在施用所 述抗体的受试者中所述抗体诱发更少的总皮肤病学毒性事件。在具体实施方案中， 施用所 述抗体的受试者中总皮肤病学毒性事件的数目比施用 EGFR 拮抗剂的受试者中总皮肤病学 毒性事件的数目低至少 10％， 20％， 30％， 40％， 50％， 60％， 70％， 80％， 或 90％。
     在其它实施方案中， 施用所述抗体的受试者中总皮肤病学毒性事件的比率低于 80％， 70％， 60％， 50％， 40％， 30％， 20％， 10％， 5％， 2％， 或 1％。
     本发明另一方面提供多特异性抗体， 其特异性结合 EGFR 和至少一个其它 HER 受体 (HER2， HER3， 和 / 或 HER4)， 其中与施用 EGFR 拮抗剂的受试者中的 3 级或更高等级的毒性事 件相比较， 施用所述抗体的受试者中所述抗体诱发更少的 3 级或更等级的毒性事件。在具 体实施方案中， 与施用 EGFR 拮抗剂的受试者中的 3 级或更高等级的毒性事件相比， 施用所 述抗体的受试者中 3 级或更高等级的毒性事件的数目低至少 10％， 20％， 30％， 40％， 50％， 60％， 70％， 80％， 或 90％。
     在其它实施方案中， 在施用所述多特异性抗体的受试者中 3 级或更高等级的毒性 事件的比率低于 70％， 60％， 50％， 40％， 30％， 20％， 15％， 12％， 11％， 10％， 9％， 8％， 7％，6％， 5％， 4％， 3％， 2％， 或 1％。
     在具体实施方案中， 与施用 EGFR 拮抗剂的受试者中的 3 级或更高等级的皮肤病学 毒性事件相比较， 施用双特异性抗体的受试者中所述多特异性抗体诱发更少的 3 级或更高 等级的皮肤病学毒性事件。在具体实施方案中， 与施用 EGFR 拮抗剂的受试者中的 3 级或 更高等级的皮肤病学毒性事件的数目相比， 施用所述多特异性抗体的受试者中 3 级或更高 等级的皮肤病学毒性事件的数目低至少 10％， 20％， 30％， 40％， 50％， 60％， 70％， 80％， 或 90％。
     在其它实施方案中， 施用所述多特异性抗体的受试者中 3 级或更高等级的皮肤 病学毒性事件的比率低于 70％， 60％， 50％， 40％， 30％， 20％， 15％， 12％， 11％， 10％， 9％， 8％， 7％， 6％， 5％， 4％， 3％， 2％， 或 1％。
     在其它实施方案中， 与 EGFR 拮抗剂相比较， 所述抗体在体内模型中诱发更少发病 率的改变的器官功能。在其它实施方案中， 与 EGFR 拮抗剂相比较， 所述抗体在体内模型中 诱发更少或更低严重性的胃肠毒性。
     在一些实施方案中， 所述 EGFR 拮抗剂是抗 EGFR 抗体。在一个实施方案中， 所述 EGFR 拮抗剂是西妥昔单抗。在另一个实施方案中， 所述 EGFR 拮抗剂是帕尼单抗。在另一 个实施方案中， 所述 EGFR 拮抗剂是小分子。在一个实施方案中， 所述 EGFR 拮抗剂是厄洛替 尼。在一个实施方案中， 所述体内模型是猴， 诸如食蟹猴。在另一个实施方案中， 所述体内 模型是人。 抗体和抗体变体
     在一些实施方案中， 本发明提供包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域 的多特异性抗体。 在一些实施方案中， 所述抗原结合结构域不特异性结合其它靶标， 包括其 它 HER 受体。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH( 重链可变结构域 )， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25。在 一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中 所述抗体包含 VL( 轻链可变结构域 )， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 40。在一个实施方 案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包 含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 40。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的一个、 两个和 / 或三 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 40 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 40 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。在一个 实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述 抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸
     序列 SEQ ID NO ： 40 的所有三个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 64。 在一个实施方案中， 所 述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 26。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 64， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 26。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 64 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 26 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 64 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 26 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。在一个 实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述 抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 64 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸 序列 SEQ ID NO ： 26 的所有三个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 28。 在一个实施方案中， 所 述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 27。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 28， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 27。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 28 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 27 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 28 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 27 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。 在一个实 施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗 体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 28 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序 列 SEQ ID NO ： 27 的所有三个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。在一个 具体的实施方案中， HVR-H1 包含氨基酸序列 LSGDWIH(SEQ ID NO ： 48)， HVR-H2 包含氨基酸 序列 LGEISAAGGYTD(SEQ ID NO ： 50)， HVR-H3 包含氨基酸序列 ARESRVSFEAAMDY(SEQ ID NO ： 53)， HVR-L1 包含氨基酸序列 DLATDVA(SEQ ID NO ： 54)， HVR-L2 包含氨基酸序列 SASF(SEQ ID NO ： 56) 和 HVR-L3 包含氨基酸序列 SEPEPYT(SEQ ID NO ： 57)。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29。 在一个实施方案中， 所 述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 28， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 28 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。 在一个实 施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗 体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 28 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序 列 SEQ ID NO ： 29 的所有三个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。在一个 具体的实施方案中， HVR-H1 包含氨基酸序列 LSGDWIH(SEQ ID NO ： 48)， HVR-H2 包含氨基酸 序列 LGEISAAGGYTD(SEQ ID NO ： 50)， HVR-H3 包含氨基酸序列 ARESRVSFEAAMDY(SEQ ID NO ： 53)， HVR-L1 包含氨基酸序列 NIATDVA(SEQ ID NO ： 55)， HVR-L2 包含氨基酸序列 SASF(SEQ ID NO ： 56)， 和 HVR-L3 包含氨基酸序列 SEPEPYT(SEQ ID NO ： 57)。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 30。 在一个实施方案中， 所 述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 30， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 30 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 30 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。 在一个实 施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗 体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 30 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序 列 SEQ ID NO ： 29 的所有三个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。在一个 具体的实施方案中， HVR-H1 包含氨基酸序列 LSGDWIH(SEQ ID NO ： 48)， HVR-H2 包含氨基酸 序列 VGEISAAGGYTD(SEQ ID NO ： 51)， HVR-H3 包含氨基酸序列 ARESRVSFEAAMDY(SEQ ID NO ： 53)， HVR-L1 包含氨基酸序列 NIATDVA(SEQ ID NO ： 55)， HVR-L2 包含氨基酸序列 SASF(SEQ ID NO ： 56)， 和 HVR-L3 包含氨基酸序列 SEPEPYT(SEQ ID NO ： 57)。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 40， 41， 42， 43， 44， 45 或 46。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构 域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 40， 41， 42， 43， 44， 45 或 46。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 40， 41， 42， 43， 44， 45 或 46 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。 在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ IDNOs ： 40， 41， 42， 43， 44， 45 或 46 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 40， 41， 42， 43， 44， 45 或 46 的所 有三个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含轻链可变结构域， 该轻链可变结构域包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 36， 37 或 38。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的 抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链可变结构域和轻链可变结构域， 该重链可变结构 域包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 该轻链可变结构域包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 36， 37 或 38。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 36， 37 或 38 的一个、 两个 和 / 或三个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的 抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 36， 37 或 38 的一个、 两个和 / 或 三个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQID NO ： 25 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 36， 37 或 38 的所有三个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25。 在一个实施方案中， 所 述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 39。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链可变结构域和轻链可变结构域， 该 重链可变结构域包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 该轻链可变结构域包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 39。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 39 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 39 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。在一个 实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合结构域， 其中所述 抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸 序列 SEQ ID NO ： 39 的所有三个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。
     在一个实施方案中， 本发明提供单特异性抗体， 其包含特异性结合 EGFR 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25。 在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 EGFR 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包 含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 58 或 SEQ ID NO ： 24。在一个实施方案中， 单特异性抗体包含特异性结合 EGFR 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 58 或 SEQ ID NO ： 24。
     在一个实施方案中， 本发明提供单特异性抗体， 其包含特异性结合 EGFR 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 EGFR 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 24 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。 在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 EGFR 的抗原结合结构域， 其中所述 抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 24 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。在一个实施方案中， 所述单 特异性抗体包含特异性结合 EGFR 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含 氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 24 的所有三 个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。在一个具体的实施方案中， HVR-H1 包含氨基酸序列 FTGNWIH(SEQ ID NO ： 47)， HVR-H2 包含氨基酸序列 VGEISPSGGYTD(SEQ ID NO ： 49)， HVR-H3 包含氨基酸序列 ARESRVSYEAAMDY(SEQ ID NO ： 52)， HVR-L1 包含氨基酸序列 DVSTAVA(SEQ ID NO ： 78)， HVR-L2 包含氨基酸序列 SASF(SEQ ID NO ： 56)， 和 HVR-L3 包含氨 基酸序列 SYPTPYT(SEQ ID NO ： 79)。
     在一个实施方案中， 本发明提供单特异性抗体， 其包含特异性结合 HER3 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29。 在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包 含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 33， 34 或 35。在一个实施方案中， 单特异性抗体包含特异性结 合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 33， 34 或 35。
     在一个实施方案中， 本发明提供单特异性抗体， 其包含特异性结合 HER3 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 33， 34 或 35 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 33， 34 或 35 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。在一 个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体 包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 33， 34 或 35 的所有三个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。 在一个具体的实施方案中， HVR-H1 包含氨基酸序列 FTGDWIH(SEQ ID NO ： 62)， HVR-H2 包含 氨基酸序列 VGEISPAGAYTD(SEQ ID NO ： 60)， HVR-H3 包含氨基酸序列 AREAKVSFEAAMDY(SEQ ID NO ： 61)， HVR-L1 包含氨基酸序列 NIATDVA(SEQ ID NO ： 55)， HVR-L2 包含氨基酸序列 SASF(SEQ ID NO ： 56)， 和 HVR-L3 包含氨基酸序列 SEPEPYT(SEQ ID NO ： 57)。
     在一个实施方案中， 本发明提供单特异性抗体， 其包含特异性结合 HER3 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 32。 在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 31。在一个实施方案中， 单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的 抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 32， 该 VL 包 含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 31。
     在一个实施方案中， 本发明提供单特异性抗体， 其包含特异性结合 HER3 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 32 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 31 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。 在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述 抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 32 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 31 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。在一个实施方案中， 所述单 特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含 氨基酸序列 SEQ ID NO ： 32 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 31 的所有三 个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。在一个具体的实施方案中， HVR-H1 包含氨基酸序列 FSGDWIH(SEQ ID NO ： 59)， HVR-H2 包含氨基酸序列 VGEISPAGAYTD(SEQ ID NO ： 60)， HVR-H3 包含氨基酸序列 AREAKVSFEAAMDY(SEQ ID NO ： 61)， HVR-L1 包含氨基酸序列 DLATDVA(SEQ ID NO ： 54)， HVR-L2 包含氨基酸序列 SASF(SEQ ID NO ： 56) 和 HVR-L3 包含氨 基酸序列 SEPEPYT(SEQ ID NO ： 57)。 在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含重链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 2， 12 或 14。在一 个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所 述抗体包含轻链， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 4， 5， 6， 7， 8， 9， 10， 11 或 13。在一 个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所 述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 2， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 4。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原 结合结构域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 12， 所述 轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 11。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结 合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序 列 SEQ ID NO ： 12， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 13。在一个实施方案中， 所述多特 异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 14， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 13。
     在一些实施方案中， 本发明提供多特异性抗体， 其包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的 抗原结合结构域。 在一些实施方案中， 所述抗原结合结构域不特异性结合其它靶标， 包括其 它 HER 受体。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原 结合结构域， 其中所述抗体包含重链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 2。在一个实施 方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合结构域， 其中所述抗体 包含轻链， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 21， 22 或 23。
     在一些实施方案中， 本发明提供多特异性抗体， 其包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的 抗原结合结构域。 在一些实施方案中， 所述抗原结合结构域不特异性结合其它靶标， 包括其 它 HER 受体。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原
     结合结构域， 其中所述抗体包含重链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 2。在一个实施 方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合结构域， 其中所述抗体 包含轻链， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 18。
     在一个实施方案中， 本发明提供特异性结合 EGFR 的单特异性抗体。在一些实施方 案中， 所述抗原结合结构域不特异性结合其它靶标， 包括其它 HER 受体。在一个实施方案 中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 EGFR 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 2。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异 性结合 EGFR 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含轻链， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 1 或 3。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 EGFR 的抗原结合结构 域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 2， 所述轻链包含 氨基酸序列 SEQ ID NO ： 1。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 EGFR 的 抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 2， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 3。
     在一个实施方案中， 本发明提供特异性结合 HER3 的单特异性抗体。在一些实施方 案中， 所述抗原结合结构域不特异性结合其它靶标， 包括其它 HER 受体。在一个实施方案 中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 16， 17， 19 或 20。在一个实施方案中， 所述单特异性 抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含轻链， 所述轻链包含氨基 酸序列 SEQ ID NOs ： 13 或 15。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 16， 17， 19 或 20， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 13 或 15。
     在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 16， 所述轻链包含氨 基酸序列 SEQ ID NO ： 15。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的 抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 17， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 13。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异 性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 19， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 13。在一个实施方案中， 所述单特异 性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 20， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 13。
     在一些实施方案中， 考虑了本文所述的抗体的氨基酸序列修饰。 例如， 可能需要提 高抗体的结合亲和力和 / 或其它生物学性质。可以通过将适合的变化引入编码抗体的核苷 酸序列或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。所述修饰包括， 例如在抗体的氨基酸 序列中缺失残基和 / 或插入残基， 和 / 或置换残基。可以进行缺失、 插入和置换的任何组合 从而得到最终的构建体， 条件是最终的构建体具有需要的特征。氨基酸改变可以在制备序 列的时候引入主题抗体氨基酸序列。
     在一些实施方案中， 相对于参照序列具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性的氨基酸序列含有置换、 插入或缺失， 但 是包含所述氨基酸序列的抗体保留了结合所述参照序列的最初一个靶标或多个靶标的能力。 在一些实施方案中， 相对于参照序列具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性的氨基酸序列含有置换、 插入或缺失， 但是包含 所述氨基酸序列的抗体保留了结合所述参照序列的最初一个靶标或多个靶标的能力， 并且 不特异性结合任何其它靶标， 包括其它 HER 受体。在一些实施方案中， 参照序列的氨基酸序 列中总计 1 至 10 个氨基酸被置换、 插入或缺失。在一些实施方案中， 所述置换、 插入或缺失 发生在 HVRs 外部的区 ( 即， 在 FRs 中 )。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 40 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案 中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 40 具 有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一 性。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 64 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案 中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 26 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特 异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 64 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 26 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所述 VL 具有与 SEQ ID NO ： 29 至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性的氨基酸序列。在一个实施 方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体 包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 28 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列 同一性。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 30 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案 中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 30 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 具 有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一 性。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 40， 41， 42， 43， 44， 45 或 46 中的任意一条具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的 抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 40， 41， 42， 43， 44， 45 或 46 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案 中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 36 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含 特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸 序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80 ％， 85 ％， 90 ％， 91 ％， 92 ％， 93 ％， 94 ％， 95 ％， 96 ％， 97 ％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 36 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案中， 所 述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所 述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 37 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性 结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 结构域和 VL， 所述 VH 结构域与 氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 具有氨基酸序列 SEQ ID NO ： 37。在一个实施方案 中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所述 VL 具有氨基酸序列 SEQ ID NO ： 38。 在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异 性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 38 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案 中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 39 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％，95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特 异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 39 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。
     在一个实施方案中， 本发明提供单特异性抗体， 其包含特异性结合 EGFR 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。在一个实施方 案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 EGFR 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所 述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 24 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性 结合 EGFR 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列 同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 24 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。
     在一个实施方案中， 本发明提供单特异性抗体， 其包含特异性结合 HER3 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 32 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。在一个实施方 案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所 述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 31 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性 结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 32 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列 同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 31 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。
     在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 33 具有至少 80 ％， 85 ％， 90 ％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案中， 所 述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所述 VL 与 氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 33 具 有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一 性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特 异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 34 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列 同一性。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 34 具有至少 80％， 85％， 90％，91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 35 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。在一个实施方 案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 35 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。
     图 33 中显示了示例性比对， 该比对显示数个抗 HER 抗体的重链可变结构域和轻链 可变结构域的 Kabat 编号。
     本发明的另一方面提供多特异性抗体， 其包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 其中 SEQ ID NO ： 25 的 VH 包含在 F29(VH)， T30(VH)， N32(VH)， V48(VH)， P52a(VH)， S53(VH)， T57(VH)， S96(VH) 或 Y100(VH) 的氨基酸置换， 根据 Kabat 编号系统进行编号。在一个实施方案中， 所述抗体包含 多于一个这些置换。在一个实施方案中， 所述抗体包含所有这些置换。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 其中 SEQ ID NO ： 25 的 VH 包含一个或多个选自由下述 各项组成的组的氨基酸置换 ： F29(VH)L ； T30(VH)S ； N32(VH)D， V48(VH)L， P52a(VH)A， S53(VH) A， T57(VH)S， S96(VH)A 和 Y100(VH)F， 根据 Kabat 编号系统进行编号。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 其中 SEQ ID NO ： 25 的 VH 包含氨基酸置换 F29(VH)L， T30(VH)S， N32(VH)D， P52a(VH)A 和 S53(VH)A 和 Y100(VH)F， 根据 Kabat 编号系统进行编号。
     本发明的另一方面提供多特异性抗体， 其包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结 合结构域。其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 58， 其中 SEQ ID NO ： 58 的 VL 包含在 D28(VL)， V29(VL)， S30(VL)， T31(VL)， A32(VL)， V33(VL)， S50(VL)， A51(VL)， F53(VL)， S91(VL)， Y92(VL)， T93(VL)， T94(VL) 或 P96(VL) 的氨基酸置换， 根据 Kabat 编号系 统进行编号。在一个实施方案中， 所述抗体包含多于一个这些置换。在一个实施方案中， 所 述抗体包含所有这些置换。在一个实施方案中， 所述抗体包含在氨基酸 31 和氨基酸 32 之 间的氨基酸插入。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 58， 其中 SEQ ID NO ： 58 的 VL 包含一个或多个选自由下述各项组成的组的氨基酸置换 ： D28(VL)N， V29(VL)I， V29(VL)L， S30(VL)A， A32(VL)D， Y92(VL)E， T93(VL)P， T94(VL)E 和 P96(VL)Y， 根据 Kabat 编号系统进行 编号。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结 构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 58， 其中 SEQ ID NO ： 58 的 VL 包含氨基酸置换 D28(VL)N， V29(VL)I， S30(VL)A， A32(VL)D， Y92(VL)E， T93(VL)P， T94(VL)E 和 P96(VL)Y， 根据 Kabat 编号系统进行编号。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 该 VL 包含氨基酸 序列 SEQ ID NO ： 58， 其中 SEQ ID NO ： 25 的 VH 包含在 F29(VH)， T30(VH)， N32(VH)， V48(VH)， P52a(VH)， S53(VH)， T57(VH)， S96(VH) 或 Y100(VH) 的氨基酸置换， 并且其中 SEQ ID NO ： 58 的 VL 包含在 D28(VL)， V29(VL)， S30(VL)， T31(VL)， A32(VL)， V33(VL)， S50(VL)， A51(VL)， F53(VL)， S91(VL)， Y92(VL)， T93(VL)， T94(VL) 或 P96(VL) 的氨基酸置换， 根据 Kabat 编号系统进行编 号。在一个实施方案中， 所述抗体包含多于一个这些置换。在一个实施方案中， 所述抗体包 含所有这些置换。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 该 VL 包含氨基酸 序列 SEQ ID NO ： 58， 其中 SEQ ID NO ： 25 的 VH 包含一个或多个选自由下述各项组成的组 的氨基酸置换 ： F29(VH)L ； T30(VH)S ； N32(VH)D， V48(VH)L， P52a(VH)A， S53(VH)A， T57(VH)S， S96(VH)A 和 Y100(VH)F， SEQ ID NO ： 58 的 VL 包含一个或多个选自由下述各项组成的组的氨 基酸置换 ： D28(VL)N， V29(VL)I， V29(VL)L， S30(VL)A， A32(VL)D， Y92(VL)E， T93(VL)P， T94(VL) E 和 P96(VL)Y， 根据 Kabat 编号系统进行编号。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 其中 SEQ ID NO ： 25 的 VH 包含氨基酸置换 F29(VH)L， T30(VH)S， N32(VH)D， P52a(VH)A 和 S53(VH)A 和 Y100(VH) F， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 58， 其中 SEQ ID NO ： 58 的 VL 包含氨基酸置换 D28(VL) N， V29(VL)I， S30(VL)A， A32(VL)D， Y92(VL)E， T93(VL)P， T94(VL)E 和 P96(VL)Y， 根据 Kabat 编 号系统进行编号。
     用于鉴定对于突变发生是优选位置的抗体的某些残基或区域的有用方法被称为 “丙氨酸分区诱变法” ， 如 Cunningham 和 Wells 在科学 (1989)(Science)， 244 ： 1081-1085 中 所述。 在此处， 鉴定了一种或一组靶残基 ( 例如带电荷的残基如 arg， asp， his， lys 和 glu)， 并且用中性或带负电荷氨基酸 ( 例如， 丙氨酸或聚丙氨酸 ) 置换从而影响氨基酸与抗原的 相互作用。然后， 通过在或关于置换位点引入另外的或其它变体来精选显示对置换的功能 敏感性的那些氨基酸位置。 因此， 当预先确定引入氨基酸序列变化的位点时， 突变本身的性 质不需要被预先确定。 例如， 为了分析突变在给定位点的性能， 在靶密码子或靶区进行丙氨 酸分区诱变或随机诱变并且关于需要的活性筛选表达的免疫球蛋白。
     氨基酸序列插入包括氨基和 / 或羧基端融合， 长度范围在 1 个残基到包含一百以 上残基的多肽， 以及单一氨基酸残基或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包 括具有 N- 端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的 N 端或 C 端与增 加抗体的血清半衰期的酶 ( 例如关于 ADEPT) 或多肽的融合。
     糖基化变体
     在某些实施方案中， 改变本发明的抗体从而增加或减少抗体被糖基化的程度。多 肽的糖基化典型地是 N- 连接或 O- 连接的。N- 连接指碳水化合物结构部分与天冬酰胺残 基的侧链的连接。其中 X 是除了脯氨酸之外的任何氨基酸的三肽序列天冬酰胺 -X- 丝氨酸 和天冬酰胺 -X- 苏氨酸， 是关于将碳水化合物结构部分酶促连接于天冬酰胺侧链的识别序 列。因此， 在多肽中这些三肽序列的存在产生可能的糖基化位点。O- 连接的糖基化指将糖 N- 乙酰基半乳糖胺、 半乳糖或木糖之一连接于羟基氨基酸， 最常见连接于丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用 5- 羟基脯氨酸或 5- 羟基赖氨酸。
     常规情况下， 在抗体上加入或缺失糖基化位点通过改变氨基酸序列完成， 从而产 生或去除一个或多个上述三肽序列 ( 对于 N- 连接的糖基化位点 )。 还可以通过将一个或多 个丝氨酸或苏氨酸残基在起始抗体序列加入、 缺失或置换进行改变 ( 对于 O- 连接的糖基化 位点 )。
     如果抗体包含 Fc 区， 那么可以改变其连接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的 天然抗体典型地包含支化的， 双触角寡糖， 其通常通过 N- 连接连接于 Fc 区的 CH2 结构域的 Asn297。见， 例如， Wright 等 (1997)TIBTECH 15 ： 26-32。寡糖可以包括各种碳水化合物， 例 如甘露糖、 N- 乙酰基葡糖胺 (GlcNAc)、 半乳糖和唾液酸， 以及在双触角的寡糖结构的 “茎” 中连接于 GlcNAc 的岩藻糖。在一些实施方案中， 可以在本发明的抗体中修饰寡糖从而产生 具有一定提高性质的抗体变体。
     在一个实施方案中， 提供具有这样的碳水化合物结构的抗体变体， 所述碳水化 合物结构缺乏连接 ( 直接或间接 ) 于 Fc 区的岩藻糖。例如， 在此类抗体中岩藻糖的量 可以是从 1 ％至 80 ％， 从 1 ％至 65 ％， 从 5 ％至 65 ％或从 20 ％至 40 ％。岩藻糖的量通过 MALDI-TOF 质谱测定法如下确定 ： 计算在 Asn297 的糖链内的岩藻糖相对于附着到 Asn 297 的所有糖结构 ( 例如， 复合的， 杂合的和高甘露糖结构 ) 的总和的平均量， 例如， 如在 WO 2008/077546 中所描述的。Asn297 是指 Fc 区中位于大约位置 297 的天冬酰胺残基 (Fc 区 残基的 Eu 编号 ) ； 然而， 由于抗体中小的序列变异， Asn297 也可位于大约位置 297 的上游或 下游 ±3 个氨基酸， 即在位置 294 和 300 之间。所述岩藻糖基化变体可以具有提高的 ADCC 功能。见例如， 美国专利公开号 US 2003/0157108(Presta， L.) ； US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.， Ltd)。 与 “去 岩 藻 糖 基 化 (defucosylated)”或 “岩 藻 糖 缺 陷 的”抗 体变体相关的出版物的实例包括 ： US 2003/0157108 ； WO 2000/61739 ； WO 2001/29246 ； US 2003/0115614 ； US 2002/0164328 ； US 2004/0093621 ； US 2004/0132140 ； US 2004/0110704 ； US 2004/0110282 ； US 2004/0109865 ； WO 2003/085119 ； WO 2003/084570 ； WO 2005/035586 ； WO 2005/035778 ； WO2005/053742 ； WO2002/031140 ； Okazaki 等， 分子生 物 学 杂 志 (J.Mol.Biol.)336 ： 1239-1249(2004) ； Yamane-Ohnuki 等， 生物技术生物工程 (Biotech.Bioeng.)87 ： 614(2004)。能够产生去岩藻糖基化的抗体的细胞系的实例包括缺 乏蛋白岩藻糖基化的 Lec13 CHO 细胞 (Ripka 等生物化学生物物理进展 (Arch.Biochem. Biophys.)249 ： 533-545(1986) ； 美 国 专 利 申 请 号 US 2003/0157108A1， Presta， L； 和 WO 2004/056312A1， Adams 等， 尤其在实施例 11 中 )， 和敲除细胞系， 如 α-1， 6- 岩藻糖基转移 酶基因， FUT8， 敲除 CHO 细胞 ( 见， 例如， Yamane-Ohnuki 等生物技术生物工程 (Biotech. Bioeng).87 ： 614(2004) ； Kanda， Y. 等， 生物技术生物工程 (Biotechnol.Bioeng.)， 94(4) ： 680-688(2006) ； 和 WO2003/085107)。
     还提供具有等分寡糖的抗体变体， 例如其中连接于抗体的 Fc 区的双触角寡糖 被 GlcNAc 等分。所述抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和 / 或可以具有提高的 ADCC 功 能。 所 述 抗 体 变 体 的 实 例 例 如 在 WO 2003/011878(Jean-Mairet 等 ) ； 美国专利号 6,602,684(Umana 等 ) ； 和 US 2005/0123546(Umana 等 ) 中进行描述。 还提供在连接于 Fc 区 的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。所述抗体变体可以具有提高的 CDC 功能。 例如在 WO 1997/30087(Patel 等 ) ； WO 1998/58964(Raju， S.) ； 和 WO 1999/22764(Raju，S.) 中描述所述抗体变体。
     Fc 区变体
     在某些实施方案中， 一个或多个氨基酸修饰可引入本文提供的抗体的 Fc 区中， 由 此产生 Fc 区变体。Fc 区变体可包含人 Fc 区序列 ( 例如， 人 IgG1， IgG2， IgG3 或 IgG4Fc 区 )， 所述人 Fc 区序列包含在一个或多个氨基酸位置的氨基酸修饰 ( 例如， 置换 )。
     在某些实施方案中， 本发明涵盖具有一些但不是全部的效应子功能的抗体变体， 所述效应子功能使所述抗体变体成为对于下述应用是理想的候选物， 在所述应用中抗体 在体内的半衰期是重要的， 而某些效应子功能 ( 如补体和 ADCC) 是不必要的或有害的。可 以进行体外和 / 或体内细胞毒性测定法从而证实 CDC 和 / 或 ADCC 活性的减少 / 消耗。 例如， 可以进行 Fc 受体 (FcR) 结合测定法从而确保抗体缺乏 FcγR 结合 ( 因此可能缺 乏 ADCC 活性 )， 但是维持 FcRn 结合能力。用于介导 ADCC 的主要细胞， 即 NK 细胞仅表达 FcγRIII， 而单核细胞表达 FcγRI， FcγRII 和 FcγRIII。在 Ravetch 和 Kinet， 免疫学 年度综述 (Annu.Rev.Immunol.)9 ： 457-492(1991) 的第 464 页上的表 3 中总结在造血细 胞上的 FcR 表达。评估目的分子的 ADCC 活性的体外测定法的非限制性实例描述在美国专 利号 5,500,362 中 ( 见例如 Hellstrom， I.， 等美国国家科学院学报 (Proc.Nat’ l Acad. Sci.USA)83 ： 7059-7063(1986)) 和 Hellstrom， I 等， 美 国 国 家 科 学 院 学 报 (Proc.Nat’ l Acad.Sci.USA)82 ： 1499-1502(1985) ； 5,821,337( 见 Bruggemann， M. 等， 实验医学杂志 (J.Exp.Med.)166 ： 1351-1361(1987)) 中。备选地， 可以使用非放射性测定法 ( 见， 例如用 TM 于流式细胞术的 ACTI 非放射性细胞毒性测定法 (CellTechnology， Inc.Mountain View， CA ； 和 CytoTox 非放射性细胞毒性测定法 (Promega， Madison， WI)。用于所述测定法 的有用效应细胞包括外周血单核细胞 (PBMC) 和天然杀伤 (NK) 细胞。备选地或另外地， 目的分子的 ADCC 活性可以在体内评估， 例如如在 Clynes 等美国国家科学院学报 (Proc. Nat’ l Acad.Sci.USA)95 ： 652-656(1998) 中公开的动物模型中评估。还可以进行 C1q 结合 测定法从而证实抗体不能结合 C1q 并且因此缺乏 CDC 活性。参见例如在 WO 2006/029879 和 WO 2005/100402 中的 C1q 和 C3c 结合 ELISA。为了评估补体激活， 可以进行 CDC 测定 ( 见， 例如， Gazzano-Santoro 等， 免疫学方法杂志 (J.Immunol.Methods)202 ： 163(1996) ； 血 Cragg， M.S. 等， 血 液 (Blood)101 ： 1045-1052(2003) ； 和 Cragg， M.S. 和 M.J.Glennie， 液 (Blood)103 ： 2738-2743(2004))。还可以使用本领域已知的方法进行 FcRn 结合和体内 清除 / 半衰期测定 ( 见， 例如， Petkova， S.B. 等， 国际免疫学 (Int’ l.Immunol.)18(12) ： 1759-1769(2006))。 具有降低的效应子功能的抗体包括具有 Fc 区残基 238， 265， 269， 270， 297， 327 和 329 的一个或多个置换的那些 ( 美国专利 6,737,056)。此类 Fc 突变体包括在氨基酸位置 265， 269， 270， 297 和 327 中的两个或多个具有置换的 Fc 突变体， 包括所谓的 “DANA” Fc 突 变体， 其具有残基 265 和 297 变为丙氨酸的置换 ( 美国专利 7,332,581)。
     描 述 了 某 些 具 有 提 高 或 减 少 结 合 FcRs 的 抗 体 变 体。( 参 见， 例 如， 美国专 利 6,737,056 ； WO 2004/056312 和 Shields 等， J.Biol.Chem.( 生 物 化 学 杂 志 )9(2) ： 6591-6604(2001)。)
     在某些实施方案中， 抗体变体包含提高 ADCC 的具有一个或多个氨基酸置换的 Fc 区， 例如， 在 Fc 区的位置 298， 333 和 / 或 334( 残基的 EU 编号 ) 的置换。
     在一些实施方案中， 在 Fc 区进行改变， 其导致改变的 ( 即， 提高的或减少的 )C1q 结合和 / 或补体依赖性细胞毒性 (CDC)， 例如如在美国专利 6,194,551， WO 99/51642 和 Idusogie 等， 免疫学杂志 (J.Immunol.)164 ： 4178-4184(2000) 中所描述的。
     在 US2005/0014934A1(Hinton 等 ) 中描述了具有增加的半衰期并且对于新生儿 Fc 受体 (FcRn) 具有提高的结合的抗体， 所述 FcRn 负责将母体 IgGs 转移给胎儿 (Guyer 等， 免 疫 学 杂 志 (J.Immunol.)117 ： 587(1976) 和 Kim 等， 免 疫 学 杂 志 (J.Immunol.)24 ： 249(1994))。那些抗体其中包含具有一个或多个置换的 Fc 区， 所述置换提高 Fc 区与 FcRn 的结合。 此类 Fc 变体包括在下述一个或多个 Fc 区残基具有置换的那些 ： 238， 256， 265， 272， 286， 303， 305， 307， 311， 312， 317， 340， 356， 360， 362， 376， 378， 380， 382， 413， 424 或 434，例 如 Fc 区残基 434 的置换 ( 美国专利 7,371,826)。
     涉 及 Fc 区 变 体 的 其 它 实 例 也 参 见 Duncan & Winter， Nature( 自 然 )322 ： 738-40(1988) ； 美国专利 5,648,260 ； 美国专利 5,624,821 ； 和 WO 94/29351。
     半胱氨酸改造的抗体变体
     在某些实施方案中， 可能需要产生半胱氨酸改造的抗体， 例如 “thioMAbs” ， 其中抗 体的一个或多个残基被半胱氨酸残基置换。在具体的实施方案中， 在抗体可及的位点存在 置换的残基。通过用半胱氨酸置换那些残基， 反应性硫醇基由此定位在抗体的可及位点， 并且可以用于将抗体缀合于其它结构部分， 如药物结构部分或接头 - 药物结构部分， 从而 产生免疫缀合物， 如本文进一步所述。在某些实施方案中， 下面的残基的任何一个或多个 可以用半胱氨酸置换 ： 轻链的 V205(Kabat 编号 ) ； 重链的 A118(EU 编号 ) ； 和重链 Fc 区的 S400(EU 编号 )。 半胱氨酸改造的抗体可以如， 例如在美国专利 7,521,541 中所描述的产生。
     抗体衍生物
     在某些实施方案中， 可以对本文提供的抗体进一步修饰以包含本领域已知并且容 易获得的另外的非蛋白质性的结构部分。 适合抗体的衍生作用的结构部分包括但不限于水 溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括， 但不限于 ： 聚乙二醇 (PEG)， 乙二醇 / 丙 二醇的共聚物， 羧甲基纤维素， 葡聚糖， 聚乙烯醇， 聚乙烯吡咯烷酮， 聚 -1， 3- 二噁烷， 聚 -1， 3， 6- 三噁烷， 乙烯 / 马来酸酐共聚物， 聚氨基酸 ( 同聚物或随机共聚物 ) 和葡聚糖或聚 ( 正 乙烯基吡咯烷酮 ) 聚乙二醇， 聚丙二醇同聚物 (propropylene glycol homopolymers)， 聚环 氧丙烷 / 氧化乙烯共聚物， 聚氧乙烯化的多元醇 ( 例如甘油 )， 聚乙烯醇及其混合物。由于 其在水中的稳定性， 聚乙二醇丙醛可以在生产中具有优势。 聚合物可以具有任何分子量， 并 且可以是分支或不分支的。与抗体连接的聚合物的数目可以变化， 并且如果连接多于一个 聚合物， 它们可以是相同或不同的分子。一般地， 用于衍生化的聚合物的数目和 / 或类型可 以基于这样的考虑来确定， 包括， 但不限于， 待提高的抗体的具体性质或功能， 抗体衍生物 是否将在限定的条件下用于治疗中， 等。
     在 另 一 个 实 施 方 案 中， 提供可以通过暴露于辐射而被选择性加热的抗体和 非 蛋 白 质 性 结 构 部 分 的 缀 合 物。 在 一 个 实 施 方 案 中， 非蛋白质性的结构部分是碳 纳 米 管 (nanotube)(Kam 等， 美 国 国 家 科 学 院 学 报 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA)102 ： 11600-11605(2005))。辐射可以以任何波长进行， 并且包括， 但不限于这样的波长， 所述波 长不伤害正常细胞， 但是其将非蛋白质性结构部分加热到杀死接近抗体 - 非蛋白质性结构 部分的细胞的温度。参见， 例如 Petkova， S.B. 等， 国际免疫学 (Int’ l.Immunol.)18(12) ：1759-1769(2006)).
     提供具有一个或多个氨基酸置换的其它抗体变体。 用于置换突变发生的目的位点 包括高变区， 但是也预期 FR 改变。保守性置换在 “优选的置换” 的标题下在表 1 中显示。更 多实质性的改变， 显示在表 4 中的 “示例性置换” 中， 或在下面参照氨基酸类别进一步描述。 可以将氨基酸置换引入目的抗体和例如关于需要的活性 ( 如提高的抗原结合， 减少的免疫 原性， 提高的 ADCC 或 CDC 等 ) 筛选的产物中。
     表1
     在抗体的生物学性质中的修饰可以通过选择这样的置换来进行， 所述置换影 响 (a) 在置换区域中的多肽主链的结构， 例如， 作为折叠或螺旋构象， (b) 在靶位点的分 子的电荷或疏水性， 或 (c) 侧链的体积。可以根据它们的侧链性质中的类似性对氨基酸 进 行 分 组 ( 在 A.L.Lehninger， 在 生 物 化 学 (Biochemistry)， 第 二 版 .， 73-75 页， Worth Publishers， 纽约 (1975) 中 ) ：
     (1) 非极性 ： Ala(A)， Val(V)， Leu(L)， Ile(I)， Pro(P)， Phe(F)， Trp(W)， Met(M)
     (2) 不带电荷的极性 ： Gly(G)， Ser(S)， Thr(T)， Cys(C)， Tyr(Y)， Asn(N)， Gln(Q)
     (3) 酸性 ： Asp(D)， Glu(E)
     (4) 碱性 ： Lys(K)， Arg(R)， His(H)
     备选地， 可以将天然存在的残基基于常见的侧链性质分为数组 ：
     (1) 疏水 ： 正亮氨酸， Met， Ala， Val， Leu， Ile ；
     (2) 中性亲水性 ： Cys， Ser， Thr， Asn， Gln ；
     (3) 酸性 ： Asp， Glu ；
     (4) 碱性 ： His， Lys， Arg ；
     (5) 影响链取向的残基 ： Gly， Pro ；
     (6) 芳香 ： Trp， Tyr， Phe。
     非保守性置换需要将这些类别中的之一的成员与另一类交换。 所述置换的残基还 可以被引入保守性置换位点， 或引入保留 ( 非保守 ) 位点。
     一种类型的置换变体包括置换母体抗体 ( 例如人源化或人抗体 ) 的一个或多个高 变区残基。一般地， 关于进一步开发所选择的得到的变体相对于它们产生自其中的母体抗 体具有修饰的 ( 例如提高的 ) 生物学性质。 示例性置换变体是亲和力成熟的抗体， 其可以使 用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地产生。简言之， 对一些高变区位点 ( 例如， 6-7 个位点 ) 突变从而在每个位点产生所有可能的氨基酸置换。从丝状噬菌体颗粒展示由此产 生的抗体， 所述抗体作为与在每个颗粒中包装的噬菌体外壳蛋白 ( 例如， M13 的基因 III 产 物 ) 的至少一部分的融合物展示。接着关于噬菌体展示变体的生物学活性 ( 例如结合亲和 力 ) 对其进行筛选。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点， 可以进行分区诱变法 ( 例如， 丙氨酸分区 ) 从而鉴定对抗原结合有显著贡献的高变区残基。备选地， 或另外地， 分析抗 原 - 抗体复合物的晶体结构从而鉴定抗体和抗原之间的接触点可以是有益的。根据本领域 已知的技术， 所述接触残基和邻近残基是置换的候选物， 包括在本文中阐释的那些。 一旦产 生了所述变体， 变体组使用本领域中已知的技术进行筛选， 包括在本文中所述的那些， 并且 可以对在一个或多个相关测定法中具有优越性质的变体进行选择以用于进一步开发。
     编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子通过本领域已知的多种方法进行制备。 这 些方法包括， 但不限于 ： 从自然来源分离 ( 在天然存在的氨基酸变体的情形中 ) 或通过早期 制备的抗体的变体或非变体形式的寡核苷酸 - 介导 ( 或位点定向 ) 诱变， PCR 诱变和盒诱 变进行制备。
     免疫缀合物
     本发明还提供免疫缀合物 ( 可互换地称为 “抗体 - 药物缀合物” 或 “ADCs” )， 其包 含缀合至一种或多种细胞毒性剂的抗体， 所述细胞毒性剂诸如化疗剂、 药物、 生长抑制剂、 毒素 ( 例如蛋白质毒素， 细菌、 真菌、 植物或动物起源的酶活性毒素或其片段 ) 或放射性同 211 131 125 90 186 位素， 诸如 At ， I ， I ， Y ， Re ， Re188， Sm153， Bi212， P32， pb212 和 Lu 的放射性同位素 ( 即 放射缀合物 )。
     在癌症治疗中， 免疫缀合物已经用于局部投递细胞毒性剂， 即杀死或抑制细胞生 长或增殖的药物 (Lambert， J.(2005)Curr.Opinion in Pharmacology ( 药学新观点 )5 ： 543-549 ； Wu 等， (2005)Nature Biotechnology( 自 然 ： 生 物 技 术 )23(9) ： 1137-1146 ； Payne， G.(2003)i 3 ： 207-212 ； Syrigos 和 Epenetos(1999)Anticancer Research( 抗 癌 研 究 )19 ： 605-614 ； Niculescu-Duvaz and Springer(1997)Adv.Drug Deliv.Rev.26 ： 151-172 ； 美国专利 4,975,278)。免疫缀合物允许将药物部分靶向投递至肿瘤， 并在那儿 进行细胞内积累， 而系统施用未经缀合的药物可对正常细胞以及试图消除的肿瘤细胞导 致 不 可 接 受 的 毒 性 水 平 (Baldwin 等， Lancet( 柳 叶 刀 )(1986 年 3 月 15 日 ) 第 603-05 页； Thorpe， (1985)“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy ： A Review( 肿 瘤 治 疗 中 细 胞 毒 性 剂 的 抗 体 载 体 ： 综 述 )， ”在 Monoclonal Antibodies ′ 84 ： Biological And Clinical Applications( 单克隆抗体 84 ： 生物学和临床应用 ) 中， (A.Pinchera 等 编 辑 )， 第 475-506 页 )。 多 克 隆 抗 体 和 单 克 隆 抗 体 皆 有 报 道 可 用 于 这 些 策 略 (Rowland 等， (1986)Cancer Immunol.Immunother.( 癌 症 免 疫 学 和 免 疫 疗 法 )， 21 ： 183-87)。 这 些 方 法 中 所 使 用 的 药 物 包 括 道 诺 霉 素 (daunomycin)、 多柔比星(doxorubicin)、 甲 氨 蝶 呤 (methotrexate) 和 长 春 地 辛 (vindesine)(Rowland 等， 1986， 见上文 )。抗体 - 毒素缀合物中所使用的毒素包括细菌毒素诸如白喉毒素、 植物毒素诸 如蓖麻毒蛋白、 小分子毒素诸如格尔德霉素 (geldanamycin)(Mandler 等 (2000)J.Nat. Cancer Inst.( 国家肿瘤研究所杂志 )92(19) ： 1573-1581 ； Mandler 等， (2000)Bioorganic & Med.Chem.Letters( 生 物 有 机 和 医 学 化 学 通 讯 )10 ： 1025-1028 ； Mandler 等， (2002) Bioconjugate Chem.( 生物缀合化学 )13 ： 786-791)， 美登木素生物碱类 (maytansinoids) (EP 1391213 ； Liu 等， (1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美国科学院学报 )93 ： 8618-8623)， 和加利车霉素 (calicheamicin)(Lode 等， (1998)Cancer Res.( 癌症研究 )58 ： 2928 ； Hinman 等， (1993)Cancer Res.( 癌症研究 )53 ： 3336-3342)。毒素可通过包括微管蛋白结合、 DNA 结合或拓扑异构酶抑制在内的机制发挥其细胞毒性效果。 有些细胞毒性药物在与大的抗体 或蛋白质受体配体缀合时趋于失活或活性降低。
     已经显示曲妥珠单抗 -DM1( 或 T-DM1) 在曲妥珠单抗 - 敏感的和曲妥珠单抗 - 不 敏 感 的 HER2- 过 表 达 癌 症 模 型 中 有 效。(US 7097840)。 ( 替伊莫单抗 (ibritumomab tiuxetan)， Biogen/Idec) 是由针对在正常和恶性 B 淋巴细胞表面上发现的 CD20 抗原的鼠 IgG1κ 单克隆抗体与通过硫脲接头 - 螯合剂所结合的 111In 或 90Y 放射性 同位素构成的抗体 - 放射性同位素缀合物 (Wiseman 等， (2000)Eur.Jour.Nucl.Med.27(7) ： 766-77 ； Wiseman 等， (2002)Blood( 血 液 )99(12) ： 4336-42 ； Witzig 等， (2002)J.Clin. Oncol.( 临床肿瘤学杂志 )20(10) ： 2453-63 ； Witzig 等， (2002)J.Clin.Oncol.( 临床肿瘤 学杂志 )20(15) ： 3262-69)。尽管 ZEVALIN 具有针对 B 细胞非霍奇金氏 (non-Hodgkin’ s) 淋 巴 瘤 (NHL) 的 活 性， 然 而 施 药 在 大 多 数 患 者 中 导 致 严 重 且 长 时 间 的 血 细 胞 减 少。 TM MYLOTARG ( 吉姆单抗奥佐米星 (gemtuzumab ozogamicin)， Wyeth Pharmaceuticals)， 即 由 huCD33 抗体与加利车霉素连接而构成的抗体 - 药物缀合物， 在 2000 年批准用于经注射 治疗急性骨髓性白血病 (Drugs of the Future( 未来药物 )(2000)25(7) ： 686 ； 美国专利 4970198 ； 5079233 ； 5585089 ； 5606040 ； 5693762 ； 5739116 ； 5767285 ； 5773001)。Cantuzumab mertansine(Immunogen， Inc.)， 即由 huC242 抗体经二硫化物接头 SPP 与美登木素生物碱类 药物部分 DM1 连接而构成的抗体 - 药物缀合物， 正在进行用于治疗表达 CanAg 的癌症诸如 结肠癌、 胰腺癌、 胃癌和其它癌的 II 期试验。 MLN-2704(Millennium Pharm.， BZLBiologics， Immunogen Inc.)， 即由抗前列腺特异膜抗原 (PSMA) 单克隆抗体与美登木素生物碱类药 物部分 DM1 连接而构成的抗体 - 药物缀合物， 正在进行用于前列腺肿瘤潜在治疗的开发。 将多拉司他汀 (dolastatin) 的合成类似物 auristatin 肽、 auristatin E(AE) 和单甲基 auristatin(MMAE) 与嵌合单克隆抗体 cBR96( 对癌上的 Lewis Y 特异 ) 和 cAC10( 对恶性 血液肿瘤上的 CD30 特异 ) 缀合 (Doronina 等， (2003)Nature Biotechnol.( 自然 ： 生物技 术 )21(7) ： 778-784)， 且正在进行治疗性开发。
     在某些实施方案中， 免疫缀合物包含抗体和化疗剂或其它毒素。本文 ( 例如上 文 ) 描述了可用于生成此类免疫缀合物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括白 喉毒素 A 链、 白喉毒素的非结合活性片段、 外毒素 A 链 ( 来自铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa))、 蓖 麻 毒 蛋 白 (ricin)A 链、 相 思 豆 毒 蛋 白 (abrin)A 链、 蒴莲根毒蛋白 (modeccin)A 链、 α- 帚曲霉素 (sarcin)、 油桐 (Aleurites fordii) 蛋白、 香石竹毒蛋白 (dianthin proteins)、 美洲商陆 (Phytolaca americana) 蛋白 (PAPI、 PAPII 和 PAP-S)、 苦瓜 (Momordica charantia) 抑制剂、 麻疯树毒蛋白 (curcin)、 巴豆毒蛋白 (crotin)、 肥皂 草 (sapaonaria officinalis) 抑制剂、 白树毒蛋白 (gelonin)、 丝林霉素 (mitogellin)、 局限曲菌素 (restrictocin)、 酚霉素 (phenomycin)、 依诺霉素 (enomycin) 和单端孢菌素 (trichothecenes)。 参见例如 1993 年 10 月 28 日公开的 WO 93/21232。 多种放射性核素可用 212 131 131 90 186 于生成放射缀合抗体。 实例包括 Bi、 I、 In、 y、 和 Re。 抗体和细胞毒性剂的缀合物可 使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备， 诸如 N- 琥珀酰亚胺基 -3-(2- 吡啶基二硫代 ) 丙酸 酯 (SPDP)、 亚氨基硫烷 (IT)、 亚氨酸酯 ( 诸如己二亚氨盐酸二甲酯 (dimethyl adipimidate HCl))、 活性酯类 ( 诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯 )、 醛类 ( 诸如戊二醛 )、 双叠氮化合物 ( 诸 如双 ( 对 - 叠氮苯甲酰基 ) 己二胺 )、 双重氮衍生物 ( 诸如双 ( 对 - 重氮苯甲酰基 ) 乙二 胺 )、 二异氰酸酯 ( 诸如甲苯 2， 6- 二异氰酸酯 )、 和双活性氟化合物 ( 诸如 1， 5- 二氟 -2， 4- 二硝基苯 ) 的双功能衍生物。例如， 可如 Vitetta 等， Science( 科学 )238 ： 1098(1987) 中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。 碳 -14 标记的 1- 异硫氰酸苯甲基 -3- 甲基二亚乙基三胺 五乙酸 (MX-DTPA) 是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的例示性螯合剂。 参见 WO 94/11026。
     本文还意欲抗体与一种或多种小分子毒素诸如加利车霉素 (calicheamicin)、 美 登木素生物碱类 (maytansinoids)、 多拉司他汀 (dolastatins)、 aurostatins、 单端孢霉素 (trichothecene) 和 CC1065 及这些毒素具有毒素活性的衍生物的缀合物。
     美登表 (Maytansine) 和美登木素生物碱类
     在一些实施方案中， 免疫缀合物包含缀合至一个或多个美登木素生物碱类分子的 抗体 ( 全长或片段 )。
     美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝分裂抑制剂。 美 登素最初从东非灌木齿叶美登木 (Maytenus serrata) 分离得到 ( 美国专利 3,896,111)。 随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类， 诸如美登醇和 C-3 美登醇酯 ( 美国专 利 4,151,042)。例如下列美国专利公开了合成美登醇及其衍生物和类似物 ： 4,137,230 ； 4,248,870 ； 4,256,746 ； 4,260,608 ； 4,265,814 ； 4,294,757 ； 4,307,016 ； 4,308,268 ； 4,308,269 ； 4,309,428 ； 4,313,946 ； 4,315,929 ； 4,317,821 ； 4,322,348 ； 4,331,598 ； 4,361,650 ； 4,364,866 ； 4,424,219 ； 4,450,254 ； 4,362,663 ； 和 4,371,533。
     在抗体药物缀合物中美登木素生物碱类药物部分是有吸引力的药物部分， 因为它 们： (i) 相对易于通过发酵或化学修饰、 从发酵产物衍生而制备， (ii) 易于用适于通过非二 硫化物接头缀合至抗体的功能基团衍生化， (iii) 在血浆中稳定， 和 (iv) 针对多种肿瘤细 胞系有效。
     已经公开了含有美登木素生物碱类的免疫缀合物、 其制备方法及其治疗用途， 例 如美国专利 5,208,020， 5,416,064 及欧洲专利 EP 0 425 235B1， 明确将其公开内容通过引 用并入本文。Liu 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美国科学院学报 )93 ： 8618-8623(1996) 记 载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体 C242 连接的称为 DM1 的美登木素生物碱类的 免疫缀合物。发现该缀合物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性， 而且在体内肿瘤 生长测定法中显示抗肿瘤活性。 Chari 等， Cancer Research( 癌症研究 )52 ： 127-131(1992) 记载了其中美登木素生物碱类经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体 A7 或结合 HER-2/neu 癌基因的另一种鼠单克隆抗体 TA.1 缀合的免疫缀合物。在体外在人乳 癌细胞系 SK-BR-3 上测试了 TA.1- 美登木素生物碱类缀合物的细胞毒性， 该细胞系每个细胞表达 3x105 个 HER-2 表面抗原。药物缀合物达到了与游离美登木素生物碱类药物相似的 一定程度的细胞毒性， 这可通过增加每个抗体分子缀合的美登木素生物碱类分子数目来提 高。A7- 美登木素生物碱类缀合物在小鼠中显示低系统性细胞毒性。
     抗体 - 美登木素生物碱类缀合物通过将抗体与美登木素生物碱类分子化学连接 且不显著削弱抗体或美登木素生物碱类分子的生物学活性来制备。参见例如， 美国专利 5,208,020( 其公开内容通过引用明确并入本文 )。每个抗体分子缀合平均 3-4 个美登木素 生物碱类分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示功效， 且对抗体的功能或溶解度没有负 面影响， 尽管预计甚至一个分子的毒素 / 抗体也将较之裸抗体的使用增强细胞毒性。美登 木素生物碱类在本领域是众所周知的， 而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如 美国专利 5,208,020 和上文提及的其它专利及非专利发表物中公开了合适的美登木素生 物碱类。 优选的美登木素生物碱类是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的 美登醇类似物， 诸如各种美登醇酯。
     本领域知道许多连接基团可用于制备抗体 - 美登木素生物碱类缀合物， 包括例如 美国专利 5,208,020 或欧洲专利 0425235B1， Chari 等， Cancer Research( 癌症研究 )52 ： 127-131(1992)， 和 2004 年 10 月 8 日提交的美国专利申请 No.10/960,602 中所公开的， 其公 开内容通过引用明确并入本文。 可如 2004 年 10 月 8 日提交的美国专利申请 No.10/960,602 所公开的制备包含接头成分 SMCC 的抗体 - 美登木素生物碱类缀合物。连接基团包括二硫 化物基团、 硫醚基团、 酸不稳定基团、 光不稳定基团、 肽酶不稳定基团、 或酯酶不稳定基团， 正如上文所述专利中所公开的， 二硫化物和硫醚基团是优选的。另外的连接基团在本文进 行了描述和例示。
     可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱类的缀合物， 诸如 N- 琥珀酰亚胺基 -3-(2- 吡啶基二硫代 ) 丙酸酯 (SPDP)、 琥珀酰亚胺基 -4-(N- 马来酰亚氨 基甲基 ) 环己烷 -1- 羧酸酯 (SMCC)、 亚氨基硫烷 (IT)、 亚氨酸酯 ( 诸如己二亚氨盐酸二甲 酯 )、 活性酯类 ( 诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯 )、 醛类 ( 诸如戊二醛 )、 双叠氮化合物 ( 诸 如双 ( 对 - 叠氮苯甲酰基 ) 己二胺 )、 双重氮衍生物 ( 诸如双 ( 对 - 重氮苯甲酰基 )- 乙二 胺 )、 二异氰酸酯 ( 诸如甲苯 2， 6- 二异氰酸酯 )、 和双活性氟化合物 ( 诸如 1， 5- 二氟 -2， 4- 二硝基苯 ) 的双功能衍生物。特别优选的偶联剂包括 N- 琥珀酰亚胺基 -3-(2- 吡啶基二 硫代 ) 丙酸酯 (SPDP)(Carlsson 等， Biochem.J.( 生物化学杂志 )173 ： 723-737(1978)) 和 N- 琥珀酰亚氨基 -4-(2- 吡啶基硫代 ) 戊酸酯 (SPP)， 由此提供二硫键连接。
     根据连接的类型， 可将接头附着于美登木素生物碱类分子的多个位置。 例如， 可使 用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在具有羟基的 C-3 位置、 经羟 甲基修饰的 C-14 位置、 经羟基修饰的 C-15 位置、 和具有羟基的 C-20 位置。在一个优选实 施方案中， 在美登醇或美登醇类似物的 C-3 位置形成键连接。
     Auristatin 和多拉司他汀
     在有些实施方案中， 免疫缀合物包含与多拉司他汀 (dolastatin) 或多拉司他汀 肽类似物和衍生物， auristatin 缀合的抗体 ( 美国专利 5635483 ； 5780588)。多拉司他汀类 和 auristatin 类已经显示出干扰微管动力学、 GTP 水解、 及核和细胞分裂 (Woyke 等 (2001) Antimicrob.Agents and Chemother.45(12) ： 3580-3584) 且具有抗癌 (US 5663149) 和抗 真菌活性 (Pettit 等， (1998)Antimicrob.Agents Chemother.42 ： 2961-2965)。 多拉司他汀或 auristatin 药物结构部分可经由肽药物结构部分的 N( 氨基 ) 末端或 C( 羧基 ) 末端附 着于抗体 (WO 02/088172)。
     例示性的 auristatin 实施方案包括 N- 末端连接的单甲基 auristatin 药物结构 部分 DE 和 DF， 披露于 2004 年 11 月 5 日提交的 “Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands( 能 缀 合 至 配 体 的 单 甲 基 缬 氨 酸 化 合 物 )” ， 美国序列号 No.10/983,340， 明确将其公开内容完整收入本文。
     典型的是， 基于肽的药物结构部分可通过在两个或多个氨基酸和 / 或肽片段 之间形成肽键来制备。此类肽键可依照例如肽化学领域众所周知的液相合成法来制备 ( 参 见 E. 和 K.Lübke， “The Peptides( 肽 )， ” volume 1， 第 .76-136 页， 1965， Academic Press)。Auristatin/ 多拉司他汀药物结构部分可依照以下文献中的方法来制 备： US 5635483 ； US 5780588 ； Pettit 等， (1989)J.Am.Chem.Soc.111 ： 5463-5465 ； Pettit 等， (1998)Anti-Cancer Drug Design( 抗 癌 药 物 设 计 )13 ： 243-277 ； Pettit， G.R.， 等， Synthesis( 合 成 )， 1996， 719-725 ； 和 Pettit 等， (1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.15 ： 859-863 ； 也 见 Doronina(2003)Nat.Biotechnol.( 自 然 ： 生 物 技 术 )21(7) ： 778-784 ； “Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands( 能缀合至配体的单 甲基缬氨酸化合物 )” ， 美国序列号 No.10/983,340， 2004 年 11 月 5 日提交， 将其完整收入本 文作为参考 ( 披露了例如制备缀合至接头的诸如 MMAE 和 MMAF 的单甲基缬氨酸化合物的接 头和方法 )。
     加利车霉素
     在其它实施方案中， 免疫缀合物包含与一个或多个加利车霉素分子缀合的抗体。 加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链 DNA 断裂。关于加利车霉素家族 缀 合 物 的 制 备 参 见 美 国 专 利 5,712,374， 5,714,586， 5,739,116， 5,767,285， 5,770,701， 5,770,710， 5,773,001， 5,877,296( 都授予 American Cyanamid Company)。 可用的加利车霉 素结构类似物包括但不限于 γ1I， α2I， α3I， N- 乙酰基 -γ1I， PSAG 和 θI1(Hinman 等， Cancer Research( 癌症研究 )53 ： 3336-3342(1993)， Lode 等， Cancer Research( 癌症研 究 )58 ： 2925-2928(1998) ； 及上述授予 American Cyanamid 的美国专利 )。 可与抗体缀合的 另一种抗肿瘤药物是 QFA， 它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和 QFA 都具有胞内作用位点， 且不易穿过质膜。因此， 这些试剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细 胞毒性效果。
     其它细胞毒性剂
     可与抗体缀合的其它抗肿瘤剂包括 BCNU、 链佐星 (streptozoicin)、 长春新碱 (vincristine)、 5- 氟尿嘧啶、 美国专利 5,053,394、 5,770,710 记载的统称为 LL-E33288 复 合物的试剂家族、 及埃斯波霉素类 (esperamicins)( 美国专利 5,877,296)。
     可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素 A 链、 白喉毒素的非结合活性片段、 外 毒素 A 链 ( 来自铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa))、 蓖麻毒蛋白 (ricin)A 链、 相思豆毒蛋白 (abrin)A 链、 蒴莲根毒蛋白 (modeccin)A 链、 α- 帚曲霉素 (sarcin)、 油 桐 (Aleurites fordii) 蛋白、 香石竹毒蛋白 (dianthin protein)、 美洲商陆 (Phytolaca americana) 蛋 白 (PAPI、 PAPII 和 PAP-S)、 苦 瓜 (Momordica charantia) 抑 制 剂、 麻疯 树毒蛋白 (curcin)、 巴豆毒蛋白 (crotin)、 肥皂草 (sapaonaria officinalis) 抑制剂、白 树 毒 蛋 白 (gelonin)、 丝 林 霉 素 (mitogellin)、 局 限 曲 菌 素 (restrictocin)、 酚霉素 (phenomycin)、 依诺霉素 (enomycin) 和单端孢菌素 (tricothecenes)。参见例如 1993 年 10 月 28 日公开的 WO 93/21232。
     本发明还考虑了以下免疫缀合物， 其在抗体和具有核酸降解活性的化合物 ( 如核 糖核酸酶或 DNA 内切核酸酶， 诸如脱氧核糖核酸酶 ； DNA 酶 ) 之间形成。
     为了选择性破坏肿瘤， 抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生 成放射缀合的抗体。实例包括 At211， I131， I125， y90， Re186， Re188， Sm153， Bi212， p32， pb212 和 Lu 的 放射性同位素。在将缀合物用于检测时， 可包含放射性原子用于闪烁照相研究， 例如 tc99m 或 I123， 或是包含自旋标记物用于核磁共振 (NMR) 成像 ( 也称为磁共振成像， mri)， 诸如再次 碘 -123、 碘 -131、 铟 -111、 氟 -19、 碳 -13、 氮 -15、 氧 -17、 钆、 锰或铁。
     可以已知方式将放射性或其它标记物掺入缀合物。 例如， 可生物合成肽， 或是通过 化学氨基酸合成法合成肽， 其中使用牵涉例如氟 -19 代替氢的合适氨基酸前体。可经肽中 的半胱氨酸残基来附着标记物， 诸如 Tc99m 或 I123， Re186， Re188 和 In111。可以经赖氨酸残基来 附着钇 -90。IODOGEN 法 (Fraker 等 (1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80 ： 49-57) 可用 于掺入碘 123。 “Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy( 免疫闪烁成像中的单 克隆抗体 )” (Chatal， CRC Press 1989) 详细记载了其它方法。
     抗体和细胞毒性剂的缀合物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备， 诸如 N- 琥 珀酰亚胺基 -3-(2- 吡啶基二硫代 ) 丙酸酯 (SPDP)、 琥珀酰亚胺基 -4-(N- 马来酰亚氨甲 基 ) 环己烷 -1- 羧酸酯 (SMCC)、 亚氨基硫烷 (IT)、 亚氨酸酯 ( 诸如己二亚氨盐酸二甲酯 )、 活性酯类 ( 诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯 )、 醛类 ( 诸如戊二醛 )、 双叠氮化合物 ( 诸如双 ( 对 - 叠氮苯甲酰基 ) 己二胺 )、 双重氮衍生物 ( 诸如双 ( 对 - 重氮苯甲酰基 ) 乙二胺 )、 二 异氰酸酯 ( 诸如甲苯 2， 6- 二异氰酸酯 )、 和双活性氟化合物 ( 诸如 1， 5- 二氟 -2， 4- 二硝基 苯 ) 的双功能衍生物。例如， 可如 Vitetta 等， Science( 科学 )238 ： 1098(1987) 中所述制 备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳 -14 标记的 1- 异硫氰酸苯甲基 -3- 甲基二亚乙基三胺五乙酸 (MX-DTPA) 是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见 WO 94/11026。接头 可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的 “可切割接头” 。 例如， 可使用酸不稳定接头、 肽酶 敏感接头、 光不稳定接头、 二甲基接头、 或含二硫化物接头 (Chari 等， Cancer Research( 癌 症研究 )52 ： 127-131(1992) ； 美国专利 5,208,020)。
     化合物明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的 ADC ： 商品化 ( 如购自 Pierce Biotechnology， Inc.， Rockford， IL.， 美 国 ) 的 BMPS、 EMCS、 GMBS、 HBVS、 LC-SMCC、 MBS、 MPBH、 SBAP、 SIA、 SIAB、 SMCC、 SMPB、 SMPH、 硫代 -EMCS、 硫代 -GMBS、 硫代 -KMUS、 硫代 -MBS、 硫 代 -SIAB、 硫代 -SMCC、 和硫代 -SMPB、 和 SVSB( 琥珀酰亚氨基 -(4- 乙烯基砜 ) 苯甲酸酯 )。 见 2003-2004 年度应用手册和产品目录 (Applications Handbook and Catalog) 第 467-498 页。
     抗体药物缀合物的制备
     在抗体 - 药物缀合物 (ADC) 中， 将抗体 (Ab) 经接头 (L) 与一个或多个药物结构部 分 (D) 缀合， 例如每个抗体缀合约 1 个至约 20 个药物结构部分。可采用本领域技术人员知 道的有机化学反应、 条件和试剂通过数种路径来制备通式 I 的 ADC， 包括 ： (1) 抗体的亲核基 团经共价键与二价接头试剂反应， 形成 Ab-L， 随后与药物结构部分 D 反应 ； 和 (2) 药物结构部分的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应， 形成 D-L， 随后与抗体的亲核基团反应。本 发明描述了制备 ADC 的另外的方法。
     Ab-(L-D)p I
     接头可由一个或多个接头构件构成。示例性接头构件包括 6- 马来酰亚胺己酰 基 (6-maleimidocaproyl， “MC” )、 马 来 酰 亚 胺 基 丙 酰 基 (maleimidopropanoyl， “MP” )、 缬氨酸 - 瓜氨酸 (“val-cit” )、 丙氨酸 - 苯丙氨酸 (“ala-phe” )、 对 - 氨基苯甲氧基羰 基 (p-aminobenzyloxycarbonyl， “PAB” )、 N- 琥珀酰亚胺基 -4-(2- 吡啶基硫代 ) 戊酸酯 (“SPP” )、 N- 琥珀酰亚胺基 -4-(N- 马来酰亚氨甲基 ) 环己烷 -1- 羧酸酯 (“SMCC’ )、 和 N- 琥珀酰亚胺基 (4- 碘 - 乙酰基 ) 氨基苯甲酸酯 ( “SLAB” )。 另外的接头构件是本领域已知 的， 有些在本文进行了描述。 也见 “Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands( 能缀合至配体的单甲基缬氨酸化合物 )， ” 2004 年 11 月 5 日提交， 美国序列号 No.10/983,340， 其全文内容通过引用并入本文。
     在一些实施方案中， 接头可包含氨基酸残基。 示例性氨基酸接头构件包括二肽、 三 肽、 四肽、 或五肽。示例性二肽包括 ： 缬氨酸 - 瓜氨酸 (vc 或 val-cit)、 丙氨酸 - 苯丙氨酸 (af 或 ala-phe)。 示例性三肽包括 ： 甘氨酸 - 缬氨酸 - 瓜氨酸 (gly-val-cit) 和甘氨酸 - 甘 氨酸 - 甘氨酸 (gly-gly-gly)。包含氨基酸接头构件的氨基酸残基包括天然存在的那些， 以及稀有氨基酸 (minor amino acid) 和非天然存在的氨基酸类似物， 如瓜氨酸。可设计和 优化氨基酸接头构件的选择性以用于通过特定的酶 ( 如肿瘤相关的蛋白酶、 组织蛋白酶 B、 C 和 D、 或纤溶酶蛋白酶 ) 进行酶切割。
     抗体的亲核基团包括但不限于 ： (i)N 末端氨基 ； (ii) 侧链氨基， 如赖氨酸 ； (iii) 侧链巯基， 如半胱氨酸 ； 和 (iv) 糖基化抗体中糖的羟基或氨基。氨基、 巯基、 和羟基是亲核 的， 能够与接头部分上的亲电子基团反应而形成共价键， 而接头试剂包括 ： (i) 活性酯类， 诸如 NHS 酯、 HOBt 酯、 卤代甲酸酯、 和酸性卤化物 ； (ii) 烷基和苯甲基卤化物， 诸如卤代乙酰 胺； (iii) 醛类、 酮类、 羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键， 即半胱 氨酸桥。可通过还原剂诸如 DTT( 二硫苏糖醇 ) 处理使抗体具有与接头试剂缀合的反应活 性。由此每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性硫醇亲核体。可经由赖氨酸与 2- 亚氨 基硫烷 (Traut 氏试剂 ) 的反应， 导致胺转变为硫醇， 从而将额外亲核基团引入抗体。通过 引入一个、 两个、 三个、 四个、 或更多半胱氨酸残基 ( 例如制备包含一个或多个非天然半胱 氨酸氨基酸残基的突变抗体 ) 可将反应性硫醇基引入抗体 ( 或其片段 )。
     还可通过修饰抗体引入可与接头试剂或药物上的亲核取代基反应的亲电子结构 部分来生成抗体 - 药物缀合物。可用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖， 从而形成 可与接头试剂或药物结构部分的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺 Schiff 碱基可形成 稳定的键， 或者可用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连接。 在一个实施方案中， 糖基 化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可在蛋白质中生成羰 ( 醛 和酮 ) 基团， 它可与药物上的适当基团反应 (Hermanson， Bioconjugate Techniques)。在 另一个实施方案中， 包含 N 末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可与偏高碘酸钠反应， 导致 代替第一个氨基酸而生成醛 (Geoghegan & Stroh， (1992)Bioconjugate Chem.( 生物缀合 物化学 )3 ： 138-146 ； US 5362852)。此类醛可与药物结构部分或接头亲核体反应。
     同样， 药物结构部分上的亲核基团包括但不限于 ： 胺、 硫醇、 羟基、 酰肼、 肟、 肼、 缩氨基硫脲、 肼羧酸酯、 和芳基酰肼基团， 它们能够与接头部分上的亲电子基团反应而形成共 价键， 而接头试剂包括 ： (i) 活性酯类， 诸如 NHS 酯、 HOBt 酯、 卤代甲酸酯、 和酸性卤化物 ； (ii) 烷基和苯甲基卤化物， 诸如卤代乙酰胺 ； (iii) 醛类、 酮类、 羧基、 和马来酰亚胺基团。
     或者， 可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒性剂的融合蛋白。 DNA 的长度可包含各自编码缀合物两个部分的区域， 或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区 域分开， 该接头肽不破坏缀合物的期望特性。
     在又一个实施方案中， 可将抗体与 “受体” ( 诸如链霉亲和素 ) 缀合从而用于肿瘤 预先靶向， 其中对患者施用抗体 - 受体缀合物， 接着使用清除剂由循环中清除未结合的缀 合物， 然后施用与细胞毒性剂 ( 如放射性核苷酸 ) 缀合的 “配体” ( 如亲合素 )。
     重组方法和组合物
     抗体可以使用例如在美国专利 4,816,567 中描述的重组方法和组合物产生。在一 个实施方案中， 提供了编码本文描述的抗 HER 抗体的分离的核酸。此类核酸可编码包含抗 体 VL 的氨基酸序列和 / 或包含其 VH 的氨基酸序列 ( 例如抗体的轻链和 / 或重链 )。在又 一个实施方案中， 提供了包含此类核酸的一个或多个载体 ( 例如表达载体 )。 在又一个实施 方案中， 提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中， 宿主细胞包含 ( 例如， 用下述各项转化 ) ： (1) 包含核酸的载体， 所述核酸编码包含抗体的 VL 的氨基酸序列和包含 抗体的 VH 的氨基酸序列， 或 (2) 包含核酸的第一载体， 所述核酸编码包含抗体的 VL 的氨基 酸序列， 和包含核酸的第二载体， 所述核酸编码包含抗体的 VH 的氨基酸序列。在一个实施 方案中， 宿主细胞是真核的， 例如中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞或淋巴样细胞 ( 例如， Y0， NS0， Sp20 细胞 )。在一个实施方案中， 提供了制备抗 HER 抗体的方法， 其中所述方法包括， 在适 合抗体表达的条件下， 培养包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞， 如上文所提供的， 和任选 地从所述宿主细胞 ( 或宿主细胞培养基 ) 回收所述抗体。
     为了重组生产抗 -HER 抗体， 分离编码抗体 ( 例如上文所描述的抗体 ) 的核酸， 并 插入一个或多个载体， 用于在宿主细胞中进一步克隆和 / 或表达。此类核酸易于使用常规 规程分离和测序 ( 例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷 酸探针进行 )。
     用于克隆或表达编码抗体的载体的适当宿主细胞包括本文描述的原核或真核细 胞。例如， 抗体可在细菌中产生， 特别当不需要糖基化和 Fc 效应子功能时。对于抗体片段 和多肽在细菌中的表达， 见， 例如， 美国专利 5,648,237， 5,789,199 和 5,840,523。( 还见 Charlton， 分子生物学中的方法 (Methods in Molecular Biology)， 卷 248(B.K.C.Lo， 编 辑， Humana 出版社， Totowa， NJ， 2003)， 第 245-254 页， 描述抗体片段在大肠杆菌中的表达 )。 在表达后， 抗体可以从可溶级分中的细菌细胞糊状物分离， 并且可以进一步纯化。
     除了原核生物以外， 真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是关于编码抗体的载体的 合适克隆或表达宿主， 包括真菌和酵母菌株， 其糖基化途径已经进行 “人源化” ， 导致生产具 有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见 Gerngross， Nat.Biotech.( 自然生物技术 )22 ： 1409-1414(2004) 和 Li 等， Nat.Biotech.( 自然生物技术 )24 ： 210-215(2006)。
     适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体 ( 无脊椎动物和脊椎动 物 )。 无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。 已经鉴定了许多杆状病毒株， 其可与昆 虫细胞联合使用， 特别是用于转染草地夜蛾 (Spodoptera frugiperda) 细胞。还可利用植物细胞培养物作为宿主。见， 例如， 美国专利 5,959,177， 6,040,498， 6,420,548， 7,125,978 和 6,417,429( 描述在转基因植物中生产抗体的 PLANTIBODIESTM 技 术 )。
     也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如， 可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺 乳动物细胞系。 有用哺乳动物宿主细胞系的其它实例是用 SV40 转化的猴肾 CV1 系 (COS-7) ； 人 胚 肾 系 (293 或 293 细 胞， 如 例 如 Graham 等， 遗 传 病 毒 学 杂 志 (J.Gen Virol.)36 ： 59(1977) 中所描述的 ) ； 幼仓鼠肾细胞 (BHK) ； 小鼠塞托利 (sertoli) 细胞 (TM4 细胞， 如例 如在 Mather， 生物繁殖 (Biol.Reprod.)23 ： 243-251(1980) 中描述的 ) ； 猴肾细胞 (CV1) ； 非 洲绿猴肾细胞 (VERO-76) ； 人宫颈癌细胞 (HELA) ； 犬肾细胞 (MDCK) ； 布法罗大鼠 (buffalo rat) 肝细胞 (BRL 3A) ； 人肺细胞 (W138) ； 人肝细胞 (Hep G2) ； 小鼠乳瘤 (MMT 060562) ； TRI 细胞， 如例如 Mather 等， Annals N.Y.Acad.Sci.383 ： 44-68(1982) 中所描述的 ； MRC5 细胞 ； 和 FS4 细胞。 其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞， 包括 DHFR-CHO 细胞 (Urlaub 等， 美国国家科学院学报 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA)77 ： 4216(1980)) ； 和骨 髓瘤细胞系如 Y0， NS0 和 Sp2/0。关于适合生产抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述见 例如 Yazaki 和 Wu， 在分子生物学中的方法 (Methods in Molecular Biology)， 卷 248(B. K.C.Lo， ed.， Humana Press， Totowa， NJ)， 第 255-268 页 (2003)。
     治疗用途
     本文描述的抗体和抗体片段可用于治疗癌症， 包括癌前的、 非转移性的、 转移性的 和癌性肿瘤 ( 例如， 早期癌症 )， 或用于治疗有发生癌症 ( 例如乳腺癌 ) 风险的受试者。抗 体和抗体片段也可用于治疗或预防非恶性疾病， 诸如神经变性病症、 精神病学病症或自身 免疫性疾病。
     术语癌症包括一组增殖性病症， 包括但不限于癌前生长、 良性肿瘤、 和恶性肿瘤。 良性肿瘤维持局限在原始位点并且没有浸润、 侵袭或转移至远方位点的能力。恶性肿瘤将 侵袭并破坏其周围的其它组织。 它们也获得了从其起始处剥离并扩散至身体其它部分的能 力 ( 转移 )， 通常通过血流或通过淋巴结所在的淋巴系统转移。 原发肿瘤通过它们所发生的 组织类型进行分类 ； 转移瘤通过衍生癌细胞的组织类型进行分类。 经过一段时间， 恶性肿瘤 的细胞变得更加异常并显得更不像正常细胞。这种癌细胞的外观变化称为肿瘤分级， 并且 癌细胞被描述为良好分化的、 中度分化的、 较差分化的或未分化的。 良好分化的细胞显得非 常正常并且类似于它们所来源的正常细胞。 未分化的细胞是变得如此异常的细胞以至于不 能确定该细胞的来源。
     肿瘤可以是实体瘤或非实体瘤或软组织肿瘤。软组织肿瘤的实例包括白血病 ( 例 如， 慢性髓细胞性白血病 (chronic myelogenous leukemia)、 急性髓细胞性白血病 (acute myelogenous leukemia)、 成 人 急 性 淋 巴 细 胞 性 白 血 病 (adult acute lymphoblastic leukemia)、 急性骨髓性白血病 (acute myelogenous leukemia)、 成熟急性 B 细胞型淋巴细 胞性白血病 (mature B-cell acute lymphoblastic leukemia)、 慢性淋巴细胞性白血病 (chronic lymphocytic leukemia)、 前淋巴细胞性白血病 (polymphocytic leukemia)、 或 毛细胞性白血病 (hairy cell leukemia))、 或淋巴瘤 (lymphoma)( 例如， 非霍奇金淋巴瘤 (non-Hodgkin′ s lymphoma)、 皮肤 T 细胞淋巴瘤 (cutaneous T-cell lymphoma)、 或霍奇森 病 (Hodgkin′ s disease)。实体瘤包括血液、 骨髓、 或淋巴系统之外的任何身体组织的癌症。实体瘤可进一步分为上皮细胞来源的那些和非上皮细胞来源的那些。上皮细胞实体瘤 的实例包括胃肠道、 结肠、 乳房、 前列腺、 肺、 肾、 肝、 胰、 卵巢、 头和颈、 口腔、 胃、 十二指肠、 小 肠、 大肠、 肛门、 胆囊、 阴唇、 鼻咽、 皮肤、 子宫、 男性生殖器、 泌尿器官、 膀胱的肿瘤及皮肤的 肿瘤 ( 包括黑素瘤 )。 非上皮来源的实体瘤包括肉瘤 (sarcomas)、 脑肿瘤 (brain tumors)、 和骨肿瘤 (bone tumors)。
     上皮癌 (epithelial cancers) 通常从良性肿瘤发展为前侵袭期 ( 例如， 原位癌 )， 至恶性癌症， 其已经渗透基底膜并侵入上皮下基质。
     在一个实施方案中， 多特异性抗体特异性结合 EGFR 和至少一个其它 HER 受体， 诸 如 HER2 或 HER3 或 HER4， 并且在预防和 / 或治疗实体瘤， 特别是结肠直肠肿瘤， 肺肿瘤 ( 诸 如非小细胞肺癌和鳞状细胞癌 )， 头和颈肿瘤， 卵巢肿瘤， 皮肤肿瘤， 胰肿瘤和 / 或乳房肿瘤 中有用。
     多特异性抗体也可用于减少或预防对靶向 HER 途径的治疗的抗性。在使用靶向 HER 途径的治疗中的显著限制是许多癌症患者显示的对所述治疗的治疗效果的抗性。一 些癌症患者对靶向 HER 途径的治疗显示无反应。其他癌症患者可能显示初始反应， 但是然 后对所述治疗变成抗性的。癌症对治疗是抗性的， 如果在接受治疗时癌症有进展 ( 难治性 的 )， 或如果在完成治疗方案的 12 个月内癌症有进展 ( 复发 )。
     在一个实施方案中， 靶向 HER 途径的治疗包括用靶向 HER 途径的抗体 ( 例如， EGFR 抗体， HER2 抗体， HER3 抗体和 / 或 HER4 抗体 ) 进行治疗。在另一个实施方案中， 靶向 HER 途径的治疗包括用化疗剂进行治疗。
     剂量和制剂
     可以与优良医学实践一致的方式配制、 剂量给药和施用本文的抗体或抗体片段组 合物。 在此内容中考虑的因素包括所治疗的具体病症、 所治疗的具体哺乳动物、 患者个体的 临床状态、 病症的起因、 投递药剂的部位、 施药的方法、 施药的日程安排、 和医学从业人员知 道的其它因素。确定待施用的抗体或抗体片段的 “治疗有效量” 需要考虑以上因素， 这是预 防、 缓解或治疗癌症所需的最小量。抗体或抗体片段不是必需而是任选与目前用于预防或 治疗癌症或发生癌症的风险的一种或多种药剂一起配制。 此类其它药剂的有效量取决于制 剂中存在的抗体或抗体片段的量、 病症或治疗的类型、 和上文讨论的其它因素。 这些通常是 以与上文所用相同剂量和施用途径使用， 或是迄今所用剂量的大约 1-99％。一般而言， 对 癌症的减轻或治疗涉及减少与癌症相关的一种或多种症状或医学问题。 药物的治疗有效量 可通过下述各项之一或其组合获得 ： 减少 ( 至少 10％、 20％、 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％、 100％或更多 ) 癌细胞数量 ； 减小或抑制肿瘤大小或肿瘤负荷 ； 抑制 ( 即减慢到 一定程度和 / 或停止 ) 癌细胞浸润到周围器官中 ； 在腺瘤的情况下减少激素的分泌 ； 减小 血管密度 ； 抑制肿瘤转移 ； 降低或抑制肿瘤生长 ； 和 / 或在一定程度上缓解一或多种与癌症 相关的症状。在一些实施方案中， 抗体或抗体片段用于预防受试者中癌症的发生或复发。
     一个实施方案中， 本发明可用于延长易患或被诊断患有癌症的人类患者的生存 期。生存期定义为首次给予药物到死亡的时间。生存期可通过治疗组相对于对照组的分段 危险率 (stratified hazard ratio)(HR) 来测定， 其代表治疗过程中患者死亡的危险性。
     另一实施方案中， 本发明的治疗显著增加易患或被诊断患有癌症的人类患者组中 的反应率， 所述患者用多种抗癌疗法治疗。反应率定义为对所述治疗有反应的被治疗患者的百分比。 一方面， 与单独的手术、 放疗、 或化疗治疗的组相比， 本发明利用抗体或抗体片段 和手术、 放疗、 或一或多种化疗剂的联合治疗显著增加被治疗患者组中的反应率， 该增加具 有低于 0.005 的 χ2(Chi-square)p- 值。
     在美国专利申请公开 20050186208 中描述了癌症治疗中疗效的另外的测量。
     治疗制剂通过混合具有需要纯度的活性成分和任选的生理可接受的载体、 赋 形剂或稳定剂使用本领域已知的标准方法进行制备 ( 雷明顿药物科学 (Remington ′ s Pharmaceutical Sciences)(20.sup.th edition)， A.Gennaro 编 辑， 2000， Lippincott， Williams & Wilkins， Philadelphia， Pa.)。可接受的载体包括盐水或缓冲剂如磷酸盐、 柠 檬酸盐和其它有机酸 ； 抗氧化剂包括抗坏血酸 ； 低分子量 ( 少于约 10 个残基 ) 多肽 ； 蛋白 质， 如血清白蛋白、 明胶或免疫球蛋白 ； 亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮， 氨基酸如甘氨酸、 谷氨酰胺、 天冬酰胺、 精氨酸或赖氨酸 ； 单糖、 二糖和其它碳水化合物包括葡萄糖、 甘露糖或 糊精 ； 螯合剂如 EDTA ； 糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇 ； 形成盐的平衡离子如钠 ； 和 / 或非离子 TM TM 表面活性剂如 TWEEN ， PLURONICS 或 PEG。
     任选地， 但优选地， 所述制剂包含药用盐、 优选地氯化钠并且优选地在约生理浓度 包含药用盐。任选地， 本发明的制剂可以包含药用防腐剂。在一些实施方案中， 防腐剂的浓 度范围是 0.1 到 2.0％， 典型地以 v/v 计。适合的防腐剂包括在药物领域中已知的那些。苄 醇、 苯酚、 间甲苯酚、 羟苯甲酯和羟苯丙酯是优选的防腐剂。 任选地， 本发明的制剂可以包含 浓度为 0.005 到 0.02％的药用表面活性剂。
     本文制剂也可以包含超过一种活性化合物， 如被治疗的特定适应症所需要， 优选 地是对彼此没有不良影响具有补充活性的那些。 所述分子适当地以对于意欲目的有效的量 组合存在。
     活性成分也可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊剂中， 例如 分别在胶状药物递送系统 ( 例如， 脂质体， 白蛋白微球体， 微乳， 纳米颗粒和纳米胶囊 ) 或在 粗乳状液中的羟甲基纤维素或明胶 - 微囊剂和聚 -( 甲基丙烯酸甲酯 ) 微囊剂。所述技术 在雷明顿药物科学 (Remington′ s Pharmaceutical Sciences) 见上文中公开。
     可以制备缓释制剂。 缓释制剂的适合的实例包括包含抗体的固体疏水性聚合物的 半透性基质， 所述基质以成形的制品的形式存在， 例如薄膜或微囊剂。 缓释基质的实例包括 聚酯、 水凝胶 ( 例如， 聚 (2- 羟乙基 - 甲基丙烯酸酯 ) 或聚 ( 乙烯醇 ))， 聚丙交酯 ( 美国专 利号 3,773,919)， L- 谷氨酸和 .γ. 乙基 -L- 谷氨酸酯的共聚物， 不可降解的乙烯 - 乙酸 TM 乙烯酯， 可降解的乳酸 - 羟基乙酸共聚物如 LUPRON DEPOT ( 由乳酸 - 羟基乙酸共聚物和醋 酸亮丙瑞林组成的可注射的微球体 ) 和聚 -D-(-)-3- 羟丁酸。聚合物如乙烯 - 乙酸乙烯酯 和乳酸 - 羟基乙酸能够释放分子超过 100 天， 而某些水凝胶则在更短的时间阶段释放蛋白。 当包封的抗体仍旧在体内较长时间时， 它们可能由于在 37℃暴露于水分而变性或聚集， 导 致生物学活性的损失和免疫原性的可能变化。根据涉及的机制， 可以设计合理的策略来进 行稳定。例如， 如果发现聚集机制是通过硫 - 二硫化物交换的分子间 S--S 键形成， 那么稳 定可以通过修饰巯基残基、 从酸性溶液冷冻干燥、 控制水分含量、 使用适合的添加剂并且开 发特定的聚合物基质组合物来实现。
     本文描述的抗体和抗体片段依照已知的方法施用给人类受试者， 诸如， 作为推注 或通过一段时间的连续输注的静脉内施用， 通过肌肉内的、 腹膜内的、 脑脊内的、 皮下的、 关节内的、 滑膜内的、 鞘内的、 口服的、 局部的、 或吸入途径。如果 HER( 例如 EGFR， HER2， HER3， HER4 等 ) 的拮抗作用与广泛的副作用或毒性相关， 局部施用可以是特别期望的。先体外后 体内 (ex vivo) 策略也可在治疗性应用中使用。先体外后体内策略涉及通过编码抗体或抗 体片段的多核苷酸转染或转导从受试者获得的细胞。 该转染或转导的细胞然后回输至受试 者。该细胞可以是许多类型， 包括但不限于造血细胞 ( 例如骨髓细胞、 巨噬细胞、 单核细胞、 树突细胞、 T 细胞或 B 细胞 )、 成纤维细胞、 上皮细胞、 内皮细胞、 角质细胞或肌细胞。
     在一个实例中， 当病症或肿瘤的位置允许时， 抗体或抗体片段局部施用， 例如通过 直接注射， 并且该注射可周期性地重复。抗体或抗体片段也可全身投递给受试者或直接投 递至肿瘤细胞， 例如投递至肿瘤或手术切除肿瘤后的瘤床， 以预防或降低局部复发或转移。
     为了预防或治疗疾病， 本发明的抗体的适合剂量 ( 当单独使用或与一种或多种其 它另外的治疗剂组合 ) 将取决于待治疗的疾病类型， 抗体的类型， 疾病的严重性和进程， 而 不管施用抗体是用于预防还是治疗目的、 以前的疗法、 患者的临床病史和对抗体的响应， 以 及主治医师的判断。将抗体以一次或以一系列治疗适当地施用于患者。根据疾病的类型和 严重性， 约 1μg/kg 到 20mg/kg( 例如 0.1mg/kg-15mg/kg) 的抗体可以是施用于患者的起始 候选剂量， 而不管例如是通过一次或多次单独施用还是通过持续输注进行施用。一种典型 的每日剂量范围可以在约 1μg/kg 到 100mg/kg 或更多， 这取决于上述因素。对于在数日或 更长时间内的重复施用， 取决于病况， 治疗通常将持续直到对疾病症状需要的抑制发生。 抗 体的一个示例性剂量是在约 0.05mg/kg 到约 20mg/kg 的范围内。 因此， 可以将约 0.5mg/kg， 2.0mg/kg， 4.0mg/kg， 10mg/kg， 12mg/kg， 15mg/kg 或 20mg/kg 的一个或多个剂量 ( 或其任何 组合 ) 施用于患者。可以将所述剂量间歇性地施用， 例如每周、 每两周、 或每三周 ( 例如， 从 而使所述患者接受约 2 到约 20 或例如约 6 个剂量的抗体 ) 施用。可以开始施用更高的负 载剂量， 随后施用一剂或多剂更低的剂量。示例性的给药方案包括施用约 4mg/kg 的起始负 载剂量， 随后每周一次施用约 2mg/kg 抗体的维持剂量。然而， 其它剂量方案可以是有用的。 该疗法的进程容易通过常规技术和测定法进行监测。
     组合疗法
     本发明的抗体可以与具有抗癌性质的第二化合物组合在药物组合制剂中， 或组合 在给药方案中， 作为组合疗法。药物组合制剂或给药方案的第二化合物可以对组合中的抗 体具有补充活性从而使它们不会对彼此存在不利的影响。在一个实施方案中， 多特异性抗 体与另一个抗 HER 抗体 ( 诸如 培妥珠单抗和 / 或西妥昔单抗 ) 组合使用。 本发明的抗体也可与放射疗法组合使用。
     第二化合物可以是化疗剂、 细胞毒性剂、 细胞因子、 生长抑制剂、 抗激素剂、 和/或 保心药。所述分子以对于意欲的目的是有效的量适当地组合存在。包含本发明抗体的药物 组合物也可以含有治疗有效量的化疗剂如微管蛋白 - 形成抑制剂、 拓扑异构酶抑制剂、 DNA 嵌入剂或 DNA 结合剂。
     其它的治疗方案可以与根据本发明鉴定的抗癌剂的施用组合。 所述组合疗法可以 作为同时或顺序方案进行施用。当顺序施用时， 组合可以以两次或更多次施用进行施用。 所述组合的施用包括使用单独的制剂或单一药物制剂的共同施用， 和以任意顺序的连续施 用， 其中存在两种 ( 或全部 ) 活性剂同时发挥它们的生物学活性时的时期。
     此 类 组 合 疗 法 的 实 例 包 括 与 化 疗 剂 的 组 合， 所述化疗剂如厄洛替61102356092 A CN 102356102说赛 瓦明书59/79 页尼 (erlotinib)( 它 ( f u l v e s t r an t) 来 曲 唑 (letrozole) mesylate) (oxaliplatin)Genentech/OSI Pharm.)、 Millenium Pharm.)、 氟 维 斯 群 Ast raZe neca) 、s ut ent(S U1 1248 ，P fiz e r) 、 Novartis)、甲 磺 酸 伊 马 替 尼 (imatinib硼 替 佐 米 (bortezomib)Novartis)、 PTK787/ZK 222584(Novartis)、 奥 沙 利 铂 Sanofi)、 5-FU(5- 氟 尿 嘧 啶 (5-fluorouracil))、亚 叶 GSK572016， GlaxoSmithKline)、 氯那法 AstraZeneca)、 AG1478、 AG1571(SU 5271 ； Sugen)，酸 (leucovorin)、 雷 帕 霉 素 (Rapamycin)( 西 罗 莫 司 (Sirolimus)、 Wyeth)、 拉 帕 替 尼 (lapatinib) 非 替 尼 (gefitinib) 尼 (lonafarnib)(SCH 66336)、 索 拉 非 尼 (sorafenib)(BAY43-9006， Bayer Labs.) 和 吉 烷 化 剂 类 (alkylating agents)， 诸 如 塞 替 哌 (thiotepa) 和 环磷酰 胺 (cyclophosphamide) ； 烷 基 磺 酸 酯 (alkyl sulfonates)， 诸 如 白 消 安 (busulfan)、 英 丙 舒 凡 (improsulfan) 和 哌 泊 舒 凡 (piposulfan) ； 抗 叶 酸 剂 (antifolate) 抗 肿 瘤 诸 如 培 美 曲 塞 (pemetrexed) Eli Lilly)， 吖 丙 啶 类 (aziridines)，诸 如 苯 佐 替 派 (benzodopa)、 卡 波 醌 (carboquone)、 美 妥 替 哌 (meturedopa) 和 乌 瑞 替 哌 (uredopa) ； 乙 撑 亚 胺 类 (ethylenimines) 和 甲 基 蜜 胺 类 (methylamelamines)， 包 括 六 甲 蜜 胺 (altretamine)、 曲 他 胺 (triethylenemelamine)、 三乙烯硫代磷酸胺 (triethylenephosphoramide)、 三 乙 撑 硫 代 磷 酰 胺 (triethylenethiophosphoramide) 和 三 羟 甲 蜜 胺 (trimethylomelamine) ； 聚 乙 酸 类 (acetogenins)( 尤 其 是 布 拉 他 辛 (bullatacin) 和布拉他辛酮 (bullatacinone)) ； 喜树碱 (camptothecin)( 包括合成类似 物托泊替康 (topotecan) ； 苔藓抑素 (bryostatin) ； callystatin ； CC-1065( 包括其阿多 来新 (adozelesin)、 卡折来新 (carzelesin) 和比折来新 (bizelesin) 合成类似物 ) ； 隐 藻素类 (cryptophycins)( 特别是隐藻素 1 和隐藻素 8) ； 多拉司他汀 (dolastatin) ； 倍癌 霉素 (duocarmycin)( 包括合成类似物， KW-2189 和 CB1-TM1) ； 艾榴素 (eleutherobin) ； pancratistatin ； 匍 枝 珊 瑚 醇 (sarcodictyin) ； 海 绵 素 (spongistatin) ； 氮芥类 (nitrogen mustards)， 诸 如 苯 丁 酸 氮 芥 (chlorambucil)、 萘 氮 芥 (chlornaphazine)、 胆 磷 酰 胺 (cholophosphamide)、 雌 莫 司 汀 (estramustine)、 异 环 磷 酰 胺 (ifosfamide)、 氮 芥 (mechlorethamine)、盐 酸 氧 氮 芥 (mechlorethamine oxide hydrochloride)、 美 法 仑 (melphalan)、 新 氮 芥 (novembichin)、 苯 芥 胆 甾 醇 (phenesterine)、 泼尼莫司 汀 (prednimustine)、 曲 磷 胺 (trofosfamide)、 尿 嘧 啶 氮 芥 (uracil mustard) ； 亚硝 脲 类 (nitrosoureas)， 诸 如 卡 莫 司 汀 (carmustine)、 氯 脲 菌 素 (chlorozotocin)、 福 莫 司 汀 (fotemustine)、 洛 莫 司 汀 (lomustine)、 尼 莫 司 汀 (nimustine) 和 雷 莫 司 汀 (ranimnustine) ； 抗生素类， 诸如烯二炔类抗生素类， 加利车霉素 (calicheamicin)， 加利 车霉素 γ1I 和加利车霉素 ωI1 ； 烯二炔蒽环类抗生素 (dynemicin)， 包括烯二炔蒽环类 抗生素 A(dynemicinA) ； 二膦酸盐类 (bisphosphonates)， 诸如氯膦酸盐 (clodronate) ； 埃斯波霉素 (esperamicin) ； 以及新制癌菌素 (neocarzinostatin) 发色团和相关色蛋 白 烯 二 炔 类 抗 生 素 发 色 团、 阿 克 拉 霉 素 (aclacinomysins)、 放 线 菌 素 (actinomycin)、 氨茴霉素 (anthramycin)、 偶氮丝氨酸 (azaserine)、 博来霉素 (bleomycins)、 放线菌素C(cactinomycin)、 carabicin、 洋 红 霉 素 (carminomycin)、 嗜 癌 霉 素 (carzinophilin)、 色 霉 素 (chromomycinis)、 放 线 菌 素 D(dactinomycin)、 柔 红 霉 素 (daunorubicin)、 地 托 比 星 (detorubicin)、 6- 重 氮 基 -5- 氧 -L- 正 亮 氨 酸、 多柔比星 (doxorubicin)( 包括吗啉代多柔比星 (morpholino-doxorubicin)、 氰基吗啉代 - 多柔比星 (cyanomorpholino-doxorubicin)、 2- 吡 咯 啉 代 - 多 柔 比 星 (2-pyrrolino-doxorubicin) 和脱氧多柔比星 (deoxydoxorubicin))、 表柔比星 (epirubicin)、 依索比星 (esorubicin)、 伊 达 比 星 (idarubicin)、 马 塞 罗 霉 素 (marcellomycin)、 丝 裂 霉 素 类 (mitomycins) 诸 如 丝 裂 霉 素 C、 麦 考 酚 酸 (mycophenolic acid)、 诺 拉 霉 素 (nogalamycin)、 橄榄 霉 素 (olivomycins)、培 洛 霉 素 (peplomycin)、紫 菜 霉 素 (porfiromycin)、嘌 呤 霉 素 (puromycin)、三 铁 阿 霉 素 (quelamycin)、罗 多 比 星 (rodorubicin)、链 黑 霉 素 (streptonigrin)、 链 佐 星 (streptozocin)、 杀 结 核 菌 素 (tubercidin)、 乌苯美司 (ubenimex)、 净司他丁 (zinostatin)、 佐柔比星 (zorubicin) ； 抗代谢物类， 诸如甲氨喋呤 (methotrexate) 和 5- 氟尿嘧啶 (5-FU) ； 叶酸类似物， 诸如二甲叶酸 (denopterin)、 甲氨喋 呤 (methotrexate)、 蝶罗呤 (pteropterin)、 三甲曲沙 (trimetrexate) ； 嘌呤类似物， 诸如 氟达拉滨 (fludarabine)、 6- 巯基嘌呤 (mercaptopurine)、 硫咪嘌呤 (thiamiprine)、 硫鸟 嘌呤 (thioguanine) ； 嘧啶类似物， 诸如安西他滨 (ancitabine)、 阿扎胞苷 (azacitidine)、 6- 氮 尿 苷 (azauridine)、 卡 莫 氟 (carmofur)、 阿 糖 胞 苷 (cytarabine)、 双脱氧尿苷 (dideoxyuridine)、 去 氧 氟 尿 苷 (doxifluridine)、 依 诺 他 滨 (enocitabine)、 氟尿苷 (floxuridine) ； 雄激素类， 诸如卡鲁睾酮 (calusterone)、 丙酸屈他雄酮 (dromostanolone propionate)、 环 硫 雄 醇 (epitiostanol)、 美 雄 烷 (mepitiostane)、 睾 内 酯 (testolactone) ； 抗肾上腺类， 诸如氨鲁米特 (aminoglutethimide)、 米托坦 (mitotane)、 曲 洛 司 坦 (trilostane) ； 叶 酸 补 充 剂， 诸 如 亚 叶 酸 (frolinic acid) ； 醋葡醛内酯 (aceglatone) ； aldophosphamide glycoside ； 5- 氨 基 酮 戊 酸 (aminolevulinic acid) ； 恩 尿 嘧 啶 (eniluracil) ； 安 吖 啶 (amsacrine) ； bestrabucil ； 比 生 群 (bisantrene) ； 依 达 曲 沙 (edatraxate) ； defofamine ； 秋 水 仙 胺 (demecolcine) ； 地 吖 醌 (diaziquone) ； elfornithine ； 依利醋铵 (elliptinium acetate) ； epothilone ； 依托格鲁 (etoglucid) ； 硝 酸 镓 (gallium nitrate) ； 羟 脲 (hydroxyurea) ； 香 菇 多 糖 (lentinan) ； 氯尼达明 (lonidainine) ； 美登木素生物碱类 (maytansinoids)， 诸如美登素 (maytansine) 和安丝 菌 素 (ansamitocins) ； 米 托 胍 腙 (mitoguazone) ； 米 托 蒽 醌 (mitoxantrone) ； 莫哌达醇 (mopidanmol) ； 尼曲吖啶 (nitraerine) ； 喷司他丁 (pentostatin) ； 异丙嗪 (phenamet) ； 吡 柔比星 (pirarubicin) ； 洛索蒽醌 (losoxantrone) ； 鬼臼酸 (podophyllinic acid) ； 2- 乙 基 酰 肼 (2-ethylhydrazide) ； 丙 卡 巴 肼 (procarbazine) ； 多 糖 复 合 物 (JHS 天 然 产物， Eugene， OR) ； 雷佐生 (razoxane) ； 利索新 (rhizoxin) ； 西佐喃 (sizofiran) ； 锗螺 胺 (spirogermanium) ； 细交链孢菌酮酸 (tenuazonic acid) ； 三亚胺醌 (triaziquone) ； 2， 2’ ， 2” - 三 氯 三 乙 胺 (2， 2’ ， 2” -trichlorotriethylamine) ； 单端孢霉烯族化合物 (trichothecenes)( 尤其是 T-2 毒素、 verracurin A、 杆孢菌素 (roridin)A 和蛇形菌素 (anguidine)) ； 乌拉坦 (urethan) ； 长春地辛 (vindesine) ； 达卡巴嗪 (dacarbazine) ； 甘 露莫司汀 (mannomustine) ； 二溴甘露醇 (mitobronitol) ； 二溴卫矛醇 (mitolactol) ； 哌 泊溴烷 (pipobroman) ； gacytosine ； 阿糖胞苷 (arabinoside)(“Ara-C” )； 环磷酰胺 ； 塞替 派 (thiotepa) ； 紫 杉 烷 类 化 合 物 (taxoid)， 例 如 紫 杉 醇 (paclitaxel) Bristol-Myers Squibb Oncology， Princeton， N.J.)、无 克 列 莫 佛 (Cremophor) 的 TM ABRAXANE 、 紫杉醇的白蛋白改造的纳米颗粒制剂 (American Pharmaceutical Partners， Schaumberg， Illinois)、和 多 西 他 塞 (doxetaxel) Rorer， Antony， France) ；苯 丁 酸 氮 芥 (chloranbucil) ； 吉 西 他 滨 (gemcitabine) ； 6- 硫 鸟 嘌 呤 (thioguanine) ； 巯 嘌 呤 (mercaptopurine) ； 甲 氨 蝶 呤 (methotrexate) ； 铂 类 似 物 如 顺 铂 (cisplatin) 和 卡 铂 (carboplatin) ； 长春 碱 (vinblastine) ；铂 (platinum) ；依 托 泊 苷 (etoposide)(VP-16) ；异 环 磷 酰 胺 (ifosfamide) ； 米 托 蒽 醌 (mitoxantrone) ； 长 春 新 碱 (vincristine) ； 长 春 瑞 滨 (vinorelbine) ； 诺 安 托 (novantrone) ； 替 尼 泊 苷 (teniposide) ； 依达曲沙 (edatrexate) ； 道 诺 霉 素 (daunomycin) ； 氨 基 蝶 呤 (aminopterin) ； 希 罗 达 (xeloda) ； 伊 本 膦 酸 盐 (ibandronate) ； CPT-11 ； 拓 扑 异 构 酶 抑 制 剂 RFS 2000 ； 二氟甲基鸟氨酸 (difluoromethylornithine)(DMFO) ； 类 视 黄 酸 类 (retinoids) 如 视 黄 酸 (retinoic acid) ； 卡培他滨 (capecitabine) ； 和上述任一种的药用盐， 酸或衍生物。
     所述组合疗法还包括 ： (i) 抗激素剂， 其作用于调节或抑制激素对肿瘤的作用如 抗 - 雌激素和选择性雌激素受体调节剂 (SERMs)， 包括， 例如他莫昔芬 (tamoxifen)( 包 括 他莫昔芬 )、 雷洛昔芬 (raloxifene)、 屈洛昔芬 (droloxifene)、 4- 羟 基 他 莫 昔 芬、 曲 沃 昔 芬 (trioxifene)、 keoxifene、 LY117018、 奥 那 司 酮 (onapristone) 和 FARESTON· 托瑞米芬 (toremifene) ； (ii) 抑制芳香酶的芳香酶抑制剂， 其调节肾上 腺中的雌激素产生， 如例如， 4(5)- 咪唑、 氨鲁米特 (aminoglutethimide)、 醋 酸 甲地 孕酮 (megestrol acetate)、 益西美 坦 (exemestane)、 福美坦 (formestanie)、 法倔唑 (fadrozole)、 伏氯唑 (vorozole)、 来曲 唑 (letrozole) 和 阿那曲唑 (anastrozole) ； (iii) 抗 - 雄激素如氟他胺 (flutamide)、 尼鲁米特 (nilutamide)、 比卡鲁胺 (bicalutamide)、 亮丙立德 (leuprolide) 和戈舍瑞林 (goserelin) ； 以及曲沙他滨 (troxacitabine)(1， 3- 二氧戊环核苷胞嘧啶类似 物)； (iv) 蛋白激酶抑制剂 ； (v) 脂质激酶抑制剂 ； (vi) 反义寡核苷酸， 特别是抑制在涉及 异常细胞增殖的信号传导途径中基因的表达的那些， 如例如 PKC-α， Ralf 和 H-Ras ； (vii) 核酶如 VEGF 表达抑制剂 ( 例如， 核酶 ) 和 HER2 表达抑制剂 ； (viii) 疫 苗如基因治疗疫苗， 例如 疫苗， 疫苗和 疫苗 ； rIL-2 ； 拓扑异构酶 1 抑制剂 ； rmRH ； (ix) 抗生血管药剂如贝伐珠单抗 Genentech) ； 和 (x) 上述任一种的药用盐、 酸或衍生物。
     关于所述化疗剂的制备和给药时间表可以根据生产商的说明书使用或由熟练的 从业者根据经验确定。关于所述化疗法的制备和给药时间表也在 Chemotherapy Service， (1992)Ed.， M.C.Perry， Williams & Wilkins， Baltimore， Md 中进行描述。
     组合疗法可以提供 “协同性” 并证实 “协同作用” ， 即一起使用活性成分时获得的作 用大于由单独使用化合物获得的作用的总和。当活性成分 (1) 共同配制和施用或在组合的 单位剂量制剂中同时递送 ； (2) 交替地或平行地作为单独的制剂递送 ； 或 (3) 通过一些其他 方案时， 获得协同作用。当在交替疗法中递送时， 当顺序施用或递送所述化合物 ( 例如通过在单独的注射器中不同的注射 ) 时， 获得协同作用。一般地， 在交替疗法过程中， 每种活性 成分的有效剂量顺序地， 即连续地进行施用， 而在组合疗法中， 将两种以上的活性成分的有 效剂量一起施用。
     制品和试剂盒
     本发明另一个实施方案是制品， 其含有在治疗癌症中有用的材料。该制品包括容 器和在容器上或与容器一起的标签或包装说明书 (package insert)。适合的容器包括， 例 如， 瓶子、 小瓶、 注射器等。所述容器可以由各种材料诸如玻璃或塑料制成。容器装有对于 所述疾患的治疗有效的组合物， 并且可以具有无菌的存取口 ( 例如， 所述容器可以是具有 可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶 )。组合物中至少一种活性试剂是本发 明的多特异性抗体或抗体片段。标签或包装说明书标明该组合物是用于治疗特定的病症。 标签或包装说明书还包括向患者施用抗体组合物的说明书。 也考虑了包含本文描述的联合 治疗的制品和试剂盒。
     包装说明书是指常规地在治疗产品的商业化包装中包含的说明书， 其含有关于适 应症、 用法、 剂量、 施用、 禁忌症和 / 或关于使用此类治疗产品的警告的信息。在一个实施方 案中， 包装说明书标明该组合物是用于治疗实体瘤， 如例如， 结肠直肠癌、 肺癌、 和 / 或乳腺 癌。
     另外， 制品可以进一步包括第二容器， 其中装有制药学可接受的缓冲液， 例如抑菌 性注射用水 (BWFI)、 磷酸盐缓冲盐水、 林格氏溶液和右旋糖溶液。 它可以进一步包括从商业 和用户立场出发所需的其它材料， 包括其它的缓冲剂、 稀释剂、 滤器、 针和注射器。
     还提供多种目的中有用的试剂盒， 例如从细胞中纯化或免疫沉淀 HER 受体。为分 离和纯化 EGFR 和 / 或 HER2 和 / 或 HER3 和 / 或 HER4， 该试剂盒可含有偶联至珠子 ( 例如 珠子 ) 的 EGFR/HER2 和 / 或 EGFR/HER3 和 / 或 EGFR/HER4 抗体。可提供试 剂盒， 其含有用于体外 ( 例如在 ELISA 或蛋白质印迹中 ) 检测和定量所需 HER 受体的抗体。 如同制品中一样， 该试剂盒包含容器和伴随该容器或在容器上的标签或说明书。该容器装 有包含至少一种本发明的多特异性抗体或抗体片段的组合物。可包括另外的容器， 该容器 含有， 例如， 稀释剂和缓冲剂或对照抗体。 标签或说明书可提供对组合物的描述以及对预期 的体外或诊断用途的说明。 认为前文的书面描述足以使本领域技术人员实施本发明。 提供下述实施例仅为了 举例说明目的， 无意以任何方式限制本发明的范围。事实上， 根据前文描述， 对本文显示和 描述的发明以外的多种修改对本领域技术人员来说是明显的并落入所附权利要求的范围。
     除非另有说明， 实施例中提及的商业上可获得的试剂根据生产商的说明书使用。 在以下实施例中及在整个说明书中以 ATCC 登记号鉴定的那些细胞的来源是美国典型培养 物保藏中心 (American Type CuIture Collection， Manassas， VA)。除非另有说明， 本发 明使用重组 DNA 技术的标准程序， 如上文描述的和下述教科书中的那些 ： Sambrook 等人， 见上文 ； Ausubel 等人， Current Protocols in Molecular Biology( 现代分子生物学实验 方案 )(Green Publishing Associates and Wiley Interscience， N.Y.， 1989) ； Innis 等 人， PCR Protocols ： A Guide to Methods and Applications(PCR 实验方案 ： 方法和应用 指南 )(Academic Press ( 学术出版社 )， Inc. ： N.Y， 1990) ； Harlow 等人， Antibodies ： A Laboratory Manual ( 抗体 ： 实验室手册 )( 冷泉港出版社 (Cold Spring Harbor Press)) ：
     冷泉港， 1988) ； Gait， Oligonucleotide Synthesis ( 寡核苷酸合成 )(IRL Press ： Oxford， 1984) ； Freshney， Animal Cell Culture ( 动物细胞培养 )， 1987 ； Coligan 等人， Current Protocols in Immunology( 现代免疫学学实验方案 )， 1991。 实施例 实施例 1
     分离和表征结合人 EGFR 的抗体
     材料
     酶和 M13-KO7 辅助噬菌体购自 New England Biolabs( 新英格兰生物实验室 )。 大 肠杆菌 (E.coli)XL1-Blue 来自 Stratagene。牛血清清蛋白 (BSA)、 卵清蛋白、 和吐温 20 购 自 Sigma( 西格玛 )。Neutravidin、 酪蛋白、 和 Superblock 购自 Pierce。抗 M13 缀合的辣 根过氧化物酶 (HR) 购自 Amersham Pharmacia。Maxisorp 免疫板购自 NUNC(Roskilde， 丹 麦 )。四甲基联苯胺 (TMB) 底物购自 Kirkegaard 和 Perry 实验室 (Gaithersburg， MD)。
     文库构建
     噬菌体展示抗体文库基于来自人源化的 4D5(h4D5， 曲妥珠单抗 ) 的人抗体构架产 生， 其中侧链和长度多样性在第一文库 ( 文库 1) 中引入到重链互补决定区 (CDR1， CDR2， CDR3)， 在第二文库 ( 文库 2) 中引入到重链 CDRs 和轻链 CDR3 中， 仍然集中于重链中的多样 化， 如所描述的 (Lee 等， J.Mol.Biol( 分子生物学杂志 )， 340 ： 1073-1093(2004))。文库如 所描述的进行构建 (Lee 等， J.Mol.Biol( 分子生物学杂志 )， 340 ： 1073-1093(2004))， 除了 所使用的简并寡核苷酸进行了适当修饰。
     两个文库的分选
     文库 1 和文库 2 直接进行靶标 (hEGFR-ECD-Fc( 人 EGFR 胞外结构域融合到人 IgG1 的 Fc 区 ) 和 EGFRvIII-Fc) 结 合 选 择。EGFRvIII-Fc 蛋 白 是 EGFR 的 变 体， 缺失大 部分结构域 II(E1-P353( 不包括信号肽 ))， 融合到 hIgG1 的 Fc 区。参见 Kuan， C-T， 等， Endocrine-Related Canc.8 ： 83-96(2001) ； Bigner， S H， 等， Cancer Research( 癌症研究 )， 50 ： 8017-8022(1990)。96 孔 Nunc Maxisorp 板用 PBS(0.05M Sodium Carbonate buffer， pH9.6) 中 100μl/ 孔 的 靶 抗 原 (hEGFR-ECD-Fc， EGFRvIII-Fc)(5μg/ml) 在 4 ℃ 包 被 过 夜或在室温包被 2 小时。该板用交替封闭试剂进行封闭。在第一轮选择中， 1013 噬菌体 / ml(3-5OD/ml) 的噬菌体溶液与包被的抗原温育 18h。在每轮选择中噬菌体输入如下降低 ： 第一轮 3-5O.D/ml， 第二轮 3O.D/ml， 第三轮 0.5 ～ 1O.D/ml 和第四轮输入 0.1 ～ 0.5O.D/ ml。 稀释的噬菌体在冰上温育 30 分钟。 1μM 的 Fc- 融合蛋白添加到来自第三轮的封闭的噬 菌体中以去除 Fc 结合物。噬菌体溶液 (100μl/ 孔至 8 个靶抗原包被的孔和 2 个未包被的 孔 ) 在免疫板上温育以允许结合固定的抗原 ( 对于第一轮过夜， 对于剩余的轮次进行 2 小 时 ) 之后， 用 PBS 和 0.05％ Tween 20 连续洗涤免疫板至少 10 次。结合的噬菌体用 100ul/ 孔的 100mM HCl 室温洗脱 20 分钟。洗脱的噬菌体 ( 来自包被的孔 ) 和背景噬菌体 ( 来自 未包被的孔 ) 通过添加 1/10 体积的 1M Tris pH 11.0 和 BSA 至最终 0.1％进行中和。计算 噬菌体回收 / 抗原包被免疫板孔， 并与无包被抗原的封闭孔进行比较， 以研究展示特异性 结合靶抗原的 Fabs 的噬菌体克隆的富集。洗脱的噬菌体在大肠杆菌中扩增并用于下轮选 择。
     高通量表征 hFGFR 结合克隆
     来自第 4 轮的随机克隆被选择以进行筛选， 并利用噬菌体 ELISA 来测定， 其中将与 靶标和抗 gD 的结合与无关蛋白 (BSA， HER2， 抗 EGFR 抗体， 曲妥珠单抗 ) 的结合进行比较。
     384 孔形式的免疫板包被以 1μg/ml 的靶标， 抗 gD 和无关蛋白质， 4℃过夜或室温 2 小时， 并用 PBS 中 1％ BSA 封闭 1h。大肠杆菌 XL1-Blue 中的噬菌粒克隆在增补了羧苄西 林 (carbenicillin) 和 M13-KO7 辅助噬菌体的 150μl 的 2YT 肉汤中生长 ； 该培养物在 96 孔形式中在 37℃摇动生长过夜。包含噬菌体的培养物上清在 PBST( 具有 0.05％吐温 20 和 0.5％ (w/v)BSA 的 PBS) 中稀释 5 倍。30μl 的混合物添加到 384- 孔包被板的每个象限并 在室温下温育 1 小时。该板用 PBT( 具有 0.05％吐温 20 的 PBS) 洗涤并与在 PBST 中稀释 5000 倍达到 1nM 的抗 M13 抗体辣根过氧化物酶缀合物一起温育 30 分钟。将该板洗涤， 用 TMB 底物显色约 5 分钟， 用 1.0M H3PO4 猝灭， 并在 450nm 处通过分光光度法读数。
     结合抗 gD 抗体和靶标但是不结合非特异性蛋白质的克隆被认为是特异性阳性。 VH 文库允许分离对于 EGFR-ECD-Fc 和 EGFRvIII-Fc 两者的特异性结合物。
     溶液结合竞争 ELISA
     选择的结合克隆的结合亲和力通过溶液结合竞争 ELISA 确定。
     在 大 肠 杆 菌 XL1-Blue 中 选 择 的 噬 菌 粒 克 隆 在 补 充 了 羧 苄 青 霉 素 (carbenicillin)、 卡那霉素 (kanamycin) 和 M13-KO7 辅助噬菌体的 20ml 2YT 肉汤中生长 ； 培养物在 30℃振荡过夜生长。噬菌体的上清液在 20％ PEG/2.5M NaCl 中两次沉淀进行纯 化， 在 PBS 中重新悬浮， 在 268nM 分光光度计读数用于浓度确定 ( 以 OD/ml)。
     纯化的噬菌体在用 1μg/ml 的 hEGFR-ECD-Fc 包被的免疫板上滴定， 以确定溶液竞 争 ELISA 的最优浓度。
     提供在 450nM 处 1OD/ml 信号的稀释物用于溶液结合测定中， 其中噬菌体首先与渐 增浓度的抗原 (hEGFR-ECD) 一起温育一小时并然后转移至抗原包被的免疫板 15 分钟， 以捕 获未结合的噬菌体。 IC50 计算为抑制 50％噬菌体结合固定抗原的溶液结合阶段中抗原的浓 度。溶液结合竞争 ELISA 在室温进行。选择的克隆的 IC50 值范围为 36.2nM 至＞ 1000nM。
     噬菌体展示 F(ab)zip 转变为人 IgG
     为精确确定亲和力、 特异性和其它性质， 选择的克隆作为游离 hIgG 表达。
     轻链和重链的可变结构域克隆到以前设计的用于在哺乳动物细胞中瞬时人 IgG 表达的载体中。(Leet 等， J.Mol.Biol.( 分子生物学 )23 ： 340 ： 1073-1093(2004))。
     噬 菌 粒 DNA 的 VL 区 用 限 制 酶 消 化， 所 述 限 制 酶 切 割 编 码 CDR L1 的 区 的 上 游 (EcoRV) 和编码 CDR L3 的区的下游 (KpnI) 的 DNA。
     噬菌粒 DNA 的 VH 区用限制酶消化， 所述限制酶切割编码 CDR H1 的区的上游 (ApaI) 和编码 CDR H3 的区的下游 (BsiwI) 的 DNA。
     分泌的游离 IgG 用蛋白质 A 亲和色谱纯化并在直接结合 ELISA 中在 hEGFR 包被的 免疫板上测试。
     抗 hEGFR 表位的比较
     为了确定被抗 hEGFR 抗体识别的表位， 研究了分离的抗 EGFR 抗体与另一个已知结 合 EGFR 的结构域 III 的抗 hEGFR 抗体竞争的能力。
     测 定 以 竞 争 ELISA 形 式 进 行。 对 于 竞 争 ELISA， EGFR-ECD-Fc 以 2μg/ml 固定于 Maxisorp 免疫板上。固定浓度的抗 EGFR 抗体 ( 或非特异性抗体对照 ) 被包被的 EGFR-ECD-Fc 捕获， 添加纯化的选择的抗 EGFR 噬菌体 -Fabs， 用 α-M13- 缀合的 HRP 检测。 被阻断结合 EGFR-ECD-Fc 包被的板的抗体可能共享重叠的表位。
     对于 TGF-α 竞争 ELISA， EGFR-ECD-Fc 首先被包被的抗人 Fc 抗体捕获， 然后固定 浓度的 TGF-α 被 EGFR-ECD-Fc 捕获。添加纯化的噬菌体 -Fabs， 用 α-M13- 缀合的 HRP 检 测。
     最后， 评估选择的克隆与具有 EGFR 暴露和缺失的结构域的构建体的结合， 以确认 以前的竞争 ELISA。 指定为 D1 的克隆与抗 EGFR 抗体竞争， 并且可能在结构域 III 结合 EGFR。
     实施例 2
     表征针对人表皮生长因子受体的抗体
     抑制配体结合
     为了确定选择的抗 EGFR 抗体 D1 是否抑制 125I-EGF 与 H1666 细胞 (ATCC CRL-5885， Manassas， Va.) 的结合， 纯化的 IgGs 形式的 D1 在如下的配体结合测定中测试。H1666 细胞 在 12 孔板中铺板。次日去除生长培养基， 用 200nM 抗体在室内 RT 预处理细胞 2 小时。添 加 20μl/ 孔放射性标记的 EGF( 使用浓度低于细胞系的 Kd)， 细胞在室温处理另外 2 小时。 细胞用结合缓冲液洗涤并溶解、 转移， 样品使用 iso Data γ- 计数器计数。未标记的 EGF 用作冷竞争剂 (cold competitor)。结果证明 D1 抑制 125I-EGF 配体结合 H1666 细胞。
     在稳定转染的 EGFR-NR6 细胞中抑制 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化
     为了确定抗 EGFR 抗体 D1 是否选择性阻断 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化， 对稳定转染 的 EGFR-NR6 细胞血清饥饿 2-3 小时， 并与多种浓度的 D1 预温育 2 小时。 细胞用 1nM TGF-α 刺激。全细胞溶胞产物进行 SDS-PAGE 分析， 免疫印迹用抗磷酸酪氨酸探测， 抗 EGFR 作为装 载对照。商购的抗 EGFR 抗体用作阳性对照。数据证明在基于细胞的测定中 D1 抑制 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化。
     实施例 3
     D1 的亲和力成熟
     文库构建
     使用寡核苷酸定向诱变产生两个噬菌体展示文库 (L3/H3 和 L3/H1H2 文库 )， 如所 描述的 (Lee 等， Blood( 血液 )， 108， 3103-3111， 2006)。 文库模板载体含有植入 CDR-L3 中的 终止密码子 (TAA)， 其在诱变反应中使用与编码 CDR-L3( 所有文库 )， CDR-H3(L3/H3 文库 )， CDR-H2 和 CDR H1(L3/H1H2 文库 ) 的序列退火的简并寡核苷酸修复。文库诱变反应根据 Kunkel 等， (Methods Enzymol.( 酶学方法 )1987 ； 154 ： 367-82) 的方法进行。 寡核苷酸以不 同比例组合以便精细调节多样性从而反应在所选择的位置天然库 (natural repertoire) 中氨基酸的频率。汇合诱变产物成一个反应 / 文库， 电穿孔至大肠杆菌 SS320 细胞中， 在补 充了 KO7 辅助噬菌体中生长， 如所描述的 (Lee 等， 2004， 见上文 )。
     文库分选和筛选
     对于亲和力改善选择， 噬菌体文库第一轮针对 hEGFR-ECD-Fc 进行板分选， 随后进 行三轮溶液分选。
     进行三轮增加选择严格性的溶液分选。 免疫板用 5ug/ml 的 Neutravidin 在 4℃包 被过夜， 并用 Superblock(Pierce) 和 PBST 封闭。3-5OD/ml 繁殖的噬菌体与 100nM 的生物素化的 EGFR-ECD 在 Superblock 中预温育， 然后稀释 10x 并添加到封闭的免疫板中 5-10 分 钟。洗涤板 8 次， 洗脱噬菌体并繁殖， 用于次轮溶液分选， 降低噬菌体输入 (0.5OD/ml) 和生 物素化的 EGFR-ECD 的浓度至 1nM。
     高通量亲和力筛选 ELISA( 单点竞争 )
     挑选来自溶液分选最后一轮的随机克隆用于筛选并使用噬菌体单点竞争 ELISA 测定， 其中比较与 hEGFR-ECD 预温育 ( 或不预温育 ) 的噬菌体上清液和靶标的结合。
     大肠杆菌 XL1-Blue 中的噬菌粒克隆在 150ul 补充了羧苄青霉素和 M13-KO7 辅助 噬菌体的 2YT 肉汤中生长 ； 培养物在 96 孔格式中在 37℃振荡生长过夜。含有噬菌体的培 养物上清液在 PBST( 具有 0.05％ Tween 20 和 0.5％ (w/v)BSA 的 PBS)， 伴有或不伴有 5nM EGFR-EC 中稀释五倍。通过下述方程计算 OD 降低 (％ ) ：
     OD450nm 降 低 ( ％ ) ＝ ( 具 有 竞 争 剂 的 孔 的 OD450nm)/( 不 具 有 竞 争 剂 的 孔 的 OD450nm)*100
     OD 降低大于 25％的克隆选择用于溶液结合竞争 ELISA。
     溶液结合竞争 ELISA
     通过单点 ELISA 选择的结合克隆的结合亲和力通过溶液结合竞争 ELISA 确定， 如 上所述。
     从 D1 母体克隆亲和力成熟 (D1.5) 选择的一个克隆的噬菌体 ICS0s 如上所述进行 确定。D1.5 的 IC50 是 0.39nM。D1.5 重新格式化 (reformatted) 成 mIgG2A 用于进一个表 征， 使用上文描述的相同限制位点和设计用于哺乳动物中瞬时鼠 IgG 表达的载体。
     实施例 4
     表征作为游离 mIgG 的抗 EGFR 改善抗体
     BIAcore 测量
     在 BIAcoreTM-2000 上的表面等离子共振测定用于确定抗 EGFRmIgG2A 的亲和力。 在 BIAcore 测定中使用在 CM5 芯片上～ 150 反应单位 (RU) 的固定的 mIgG D1.5。从 12.5nM 至 200nM 增加浓度的 EGFR-ECD 以 30μl/min 在 25℃注射。结合反应通过从空白流动细胞 中减去 RU 来校正。对于动力学分析， 使用 kon 和 koff 同时拟合的 1 ∶ 1 Languir 模型。通 过这种方法确定的 D1.5 的 KD 是 1.2nM。
     表位定位
     评估选择的克隆对具有 EGFR 暴露和缺失的结构域的构建体的结合， 以确认从母 体克隆继承的结合表位。从 D1 分选中选择的亲和力改善克隆， D1.5， 在结构域 III 结合 EGFR。
     在 EGFR-NR6 细胞中抑制 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化
     测试 D1.5 以确定其是否以与母体克隆相比更高的效力抑制 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化。所述抗体在 EGFR-NR6 细胞上测试， 该测定如上文实施例 2 中的描述进行。商购的 抗 EGFR 抗体用作阳性对照。
     结果证明， 当与母体克隆 D1 相比时， D1.5 显示对配体诱导的 EGFR 磷酸化更大的 抑制。
     在 H1666 细胞中抑制细胞增殖
     进行测定以确定 D1.5 是否抑制 NSCLC 癌细胞系 H1666 的细胞增殖， 该细胞系以中等水平表达 EGFR、 HER2 和 HER3。H1666 细胞 (ATCC CRL-5885， Manassas， Va.) 以 5000 细胞 的密度接种于 96 孔板中。次日， 细胞用含 1％血清培养基中不同浓度的抗体 ( 多至 50ug/ ml) 同时处理。3 天后， 添加 Alamar Blue 并使用荧光计检测荧光。结果以 RFUs 表达。
     结果证明 D1.5 显示比 D1 更大的细胞生长抑制。
     A431 异种移植研究
     A431 异种移植模型用于验证亲和力成熟的抗 EGFR 抗体 D1.5 的体内功效。A431 细胞是 EGFR 扩增的， 对抗 EGFR 试剂反应非常好。研究在 nu/nu 小鼠中进行， 商购的抗 EGFR 抗体用作参照。
     在 第 一 步 中， D1.5 与 鼠 EGFR 的 交 叉 反 应 性 在 竞 争 ELISA 中 评 估。 免 疫 板 用 hEGFR-ECD-Fc 包被。连续稀释的 mEGFR-ECD-Fc 与固定浓度的 D1.5 温育。结果显示 D1.5 与鼠 EGFR 交叉反应。为了评估体内功效研究所需的剂量， D1.5 首先以单剂量 (50mg/kg) 注射， 并且通过 ELISA 测量血清 IgG 浓度。D1.5 被更快清除， 注射七天后见到降低的浓度。 功效研究 (A431 异种移植模型 ) 揭示 D1.5 完全抑制肿瘤生长。在 50mg/kg D1.5 与抗 EGFR 抗体一样有效。在更低剂量组 (25mg/kg) 其降低的效力是由于抗体的更快清除。( 图 1)
     实施例 5
     轻链文库设计和筛选双特异性抗体
     文库设计和构建
     设计基于 D1.5 模板的文库用于多样化抗体轻链的氨基酸组成和 CDR 长度。定制 一个亚组的随机化位置， 用于代表这些位点天然库一部分的氨基酸， 而剩余位点进行随机 化以包括所有 20 种天然存在的氨基酸。此外， 定制 CDR L3 中的随机化位置， 并且使其偏向 模板的天然序列， 因为这一 CDR 被认为对于 D1.5 的结合是重要的。对于 CDR L1， 每个长度 对于位置 28-33 是含三个寡核苷酸的密码子的混合物。对于更长的 L1， NNK 插入在位置 30 和 31 之间。
     对于 CDR L2， 1 ∶ 1 ∶ 2 ∶ 10 混合四种寡核苷酸。
     N ＝ A/C/G/T， D ＝ A/G/T， V ＝ A/C/G， B ＝ C/G/T， H ＝ A/C/T， K ＝ G/T， M ＝ A/C，R ＝ A/G， S ＝ G/C，
     W ＝ A/T， Y ＝ C/T.
     *G70A70C70 允许 70％的指定核苷酸和 10％的其它三种中的每种， 以编码大约 50％ Glu 和 50％的其它氨基酸。参见美国专利公开 20080069820 和 Bostrom， J. 等， Science( 科 学 )323 ： 1610-1614(2009)。
     CDR L3 的多样性源自下述寡核苷酸的混合物。D1.5CDR_L3 寡核苷酸
     F693 ACTTATTAC TGT CAG CAA 878 NNK 776 RST CCT TAC ACG TTC GGA(SEQ ID ： 70)
     F694 ACTTATTAC TGT CAG CAA 878 TAC 776 RST CCT TAC ACG TTC GGA(SEQ ID ： 71)
     F695 ACTTATTAC TGT CAG CAA DGG NNK 776 577 CCT TAC ACG TTC GGA(SEQ ID ： 72)
     F696 ACTTATTAC TGT CAG CAA KMT NNK 776 577 CCT TAC ACG TTC GGA(SEQ ID ： 73)
     F697 ACTTATTAC TGT CAG CAA 878 NNK 776 NNK CCT TAC ACG TTC GGA(SEQ ID ： 74)
     F698 ACTTATTAC TGT CAG CAA DGG NNK NNK RST CCT TAC ACG TTC GGA(SEQ ID ： 75)
     F699 ACTTATTAC TGT CAG CAA KMT NNK NNK RST CCT TAC ACG TTC GGA(SEQ ID ： 76)
     5 ＝ 70％ A， 6 ＝ 70％ G， 7 ＝ 70％ C， 8 ＝ 70％ T(10％为剩余三种核苷酸 )
     在所有文库中， 重链与母体克隆序列保持恒定。所有文库模板含有植入 CDR L1 的 终止密码子， 防止在噬菌体展示抗体文库成员中存在模板轻链。
     文库通过诱变法 (Kunkel 诱变 ) 构建， 使用含有终止密码子的单链 DNA 模板， 用于 同时与三个 CDR L1， L2 和 L3 的寡核苷酸组退火。来自诱变的文库 DNA 通过电穿孔转化至 细菌细胞株 SS320 并且与辅助噬菌体 KO7 一起生长。通过检测轻链 C 末端的 gD 标签评价 来自构建文库的单集落关于展示水平和关于在单点 ELISA 形式中对初级抗原 (EGFR) 结合 的保留。 平均 35％的来自 D1.5 文库的评价的单集落显示高水平的展示并保留 EGFR 结合性 质。
     文库分选和对双重特异性克隆分离的筛选
     文库进行与作为捕获靶标的抗 gD 抗体的初轮结合选择， 以去除其中 Fab 基因已 经缺失或未表达的克隆， 以及与 hEGFR-ECD-Fc 的结合选择， 随后是 4 轮铺板抗原的选择 (HER2-ECD， HER2-ECD-Fc， HER2-I-III-Fc， HER3-ECD-Fc， HER4-ECD-Fc( 每种情况中融合构 建体中的 Fc 是来自 hIgG1 的补体结合片段 )。 备选地， 它们直接进行靶标结合选择， 而不进 行与抗 gD 和 hEGFR-ECD-Fc 的预选择。
     每轮板选择如以前实施例 3 中描述的进行。选择来自第 3 轮和第 4 轮的随机克隆 用于筛选并使用噬菌体 ELISA 测定， 其中将对靶标和抗 gD 的结合与对不相关蛋白质 (BSA) 的结合进行比较用于检查非特异性结合。认为结合抗 gD 抗体和靶标但是不结合非靶标蛋 白对照 ( 诸如牛血清白蛋白， 其它 IgGs) 的克隆是特异性阳性的。
     阳性克隆的轻链可变结构域区通过 PCR 扩增并测序。阳性特异性结合物的 DNA 序列分析揭示对 EGFR 和 HER2 两者的 1 个独特结合物 (D1.5-201(SEQ ID NO ： 36))， 对 EGFR 和 HER3 两者的 7 个独特结合物， (D1.5-100(SEQ ID NO ： 40)， D1.5-103(SEQ ID NO ： 41)， D1.5-113(SEQ ID NO ： 42)， D1.5-115(SEQ ID NO ： 43)， D1.5-116(SEQ ID NO ： 44)， D1.5-121(SEQ ID NO ： 45)， D1.5-122(SEQ ID NO ： 46))， 对 EGFR 和 HER4 两者的 1 个独特结 合物 (D1.5-400， (SEQ ID NO ： 39))。
     九个双特异性克隆中的八个保留了 HVR L3 中位置 93 的脯氨酸， 由于这一位置采用脯氨酸 ( 与位置 96 的酪氨酸 ) 与其母体克隆 D1 相比显著增加 D1.5 对 EGFR 的亲和力， 可能它在保留对 EGFR 的结合中有贡献。
     评价双特异性 hEGFR/HER2， hEGFR/HER3， hEGFR/HER4 噬菌体克隆的特异性
     为了确定具有双重活性的九个克隆是否特异于它们的同族靶标， 评价了它们在直 接板 ELISA 形式中对一组抗原的结合。
     2μg/ml 的数种蛋白在 4℃过夜包被于免疫板上。板用 PBST 中 1％ BSA 封闭， 如在 实施例 1 中的描述所生长的噬菌体 -Fab 上清液的稀释物施加到板上 30 分钟。
     洗涤板， 记录结合信号并分析， 如实施例 1 所述。结果显示所有具有双重特异性的 克隆特异于它们的同族靶标。克隆 D1.5-4 和母体克隆 D1.5 用作对照。( 图 2)
     实施例 6
     表征作为游离 mIgG 的具有双重特异性的抗体
     所有具有双重特异性的克隆重新格式化成 mIgG 2A 用于进一步表征， 使用如上描 述的相同限制位点， 以及以前设计用于在哺乳动物细胞中瞬时鼠 IgG 表达的载体。
     抑制 EGFR-NR6 细胞中 TGF-αl 诱导的 EGFR 磷酸化
     为确定七个选择的具有双重特异性的抗体是否阻断 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化， 稳定转染的 EGFR-NR6 细胞如实施例 2 所述进行处理。 图 3 中的数据证明 EGFR/HER3 和 EGFR/ HER2 抗体在高浓度抑制 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化。商购的抗 EGFR 抗体用作阳性对照。
     对克隆 D1.5-100 和 D1.5-103 的剂量反应显示克隆 D1.5-100 丧失了其母体克隆 (D1.5) 抑制 EGFR 磷酸化的高效力。然而， D1.5-103 在这个测定中具有与 D1.5 相似的效 力。
     通过抗 EGFR/HER3 抗体抑制调蛋白结合 HER3
     为确定选择的抗 EGFR/HER3 抗体是否能够抑制调蛋白结合 HER3-ECD-Fc 蛋白， 纯 化的 IgGs 在放射性标记的配体结合测定中进行测试。
     结合测定在 Nunc 可拆条 (break-apart strip) 的孔中进行。 板子在 4℃用 100μl 的 5mg/mL 山羊抗人 Ab 在 50mM 碳酸盐缓冲液 (pH 9.6) 中包被过夜。板子用洗涤缓冲液 (PBS/0.005％ Tween20) 冲洗两次并用 100μl 1％ BSA/PBS 封闭 30min。去除缓冲液， 每孔 与 200ng 的 HER3-ECD-Fc 在 1％ BSA/PBS 中温育 1.5h。用洗涤缓冲液冲洗板子三次， 在 1％ 125 BSA/PBS 中的抗体在 4℃预结合 HER3-IgG 过夜。添加 I-HRG， 板子在室温温育 2 小时。冲 洗板子三次， 单个孔用 100 系列 Iso Dataγ- 计数器计数。( 图 4)。结果证明所有七个对 EGFR 和 HER3 具有双重特异性的抗体能够抑制调蛋白结合 HER3-ECD-Fc。
     通过抗 EGFR/HER4 抗体抑制调蛋白结合 HER4
     为 了 确 定 选 择 的 抗 EGFR/HER4 抗 体 D1.5-400 是 否 能 够 抑 制 调 蛋 白 结 合 HER4-ECD-Fc， 进 行 如 上 所 述 的 配 体 结 合 测 定。 使 用 25ngHER4-ECD-Fc， 而不使用 HER3-ECD-Fc。结果证明 D1.5-400 抑制调蛋白结合 HER4。
     抑制 MCF7 细胞中调蛋白诱导的 HER2/HER3 磷酸化
     为了确定选择的七个对 EGFR 和 HER3 具有双重特异性的抗体是否能够抑制 MCF7 细胞中调蛋白诱导的 HER2/HER3 磷酸化， 在受体磷酸化测定中对它们进行测试 ： MCF-7 细胞 (ATCC HTB 22， Manassas， Va.) 在 12 孔板中铺板。血清饥饿之后， 细胞与所示抗体 (75ug/ ml 或 150ug/ml) 温育 2 小时。细胞用 0.5nM HRG 刺激 8 分钟， 总细胞溶胞产物在 SDS-PAGE上运行， 蛋白质印迹用抗磷酸 -HER3、 抗 pTyr 或作为装载对照的抗微管蛋白探测。( 图 5)。 结果证明所有抗 EGFR/HER3 抗体在高浓度抑制调蛋白诱导的 HER2/HER3 磷酸化。培妥珠单 抗 (Pmab) 用作阳性对照。
     抑制 MDA-175 细胞增殖
     为了确定抗 EGFR/HER3 抗体对 HRG 驱动的细胞生长的生长抑制潜力， MDA-175 细胞 (ATCC HTB 25， Manassas， Va.)(20000 细胞 / 孔 ) 在 96 孔板中铺板。次日， 细胞用含 1％血 清的培养基中不同浓度的抗体 ( 多至 50ug/ml) 同时处理。 4 天或 5 天后， 添加 Alamar Blue， 使用荧光计检测荧光。结果以 RFUs 表示。选择 MDA-175 细胞是因为它们的生长是 HRG 自 分泌刺激的结果。抗 EGFR/HER3 抗体 D1.5-100 和克隆 D1.5-122 显示抑制 MDA-175 细胞生 长。培妥珠单抗 (Pmab) 用作阳性对照。( 图 6)。
     实施例 7
     D1.5-100 和 D1.5-103， 抗 hEGFR/HER3 双特异性抗体的诱变定位研究
     使用组合的噬菌体展示文库进行丙氨酸和同系物鸟枪法扫描分析 (Vajdos 等， J.Biol.Biol.320 ： 415-28(2002))， 以研究每种抗体与其两个抗原 (EGFR 和 HER3) 之间的相 互作用。
     对抗原 (hEGFR 和 HER3) 的结合选择用于分离功能性克隆， 随后进行 DNA 测序， 允 许计算在每个改变的位置的野生型 / 突变比率。然后用这些比率确定每个扫描的侧链对 EGFR 和 HER3 结合的贡献。
     该结果允许定位结合 EGFR 和 HER3 的功能性互补位。
     D1.5-100 和 D1.5-103 鸟枪文库设计
     CDR 中的溶剂暴露残基利用噬菌体 - 展示文库来筛选， 其中允许野生型残基作为 丙氨酸或野生型 ( 丙氨酸扫描 ) 或作为同系物残基或野生型 ( 同系物扫描 ) 变化。遗传密 码的性质还需要使除 Wt/ 丙氨酸或 Wt/ 同系物残基以外一些其他置换包括在该文库中。构 建单独的重链和轻链丙氨酸和同系物扫描文库。简并性范围为 1.3x105 至 7.5x107。
     构建鸟枪扫描文库
     文库如前所述进行构建， 除了单个 Fab 在细菌噬菌体表面上表达， 该 Fab 融合到 M13 基因 -3 小外壳蛋白的 C 末端结构域， 所述外壳蛋白通过 kunkel 诱变 ( 寡聚 F220 ： TCT TGT GAC AAA ACT CAC AGT GGC GGT GGC TCT GGT)(SEQ ID NO ： 77) 去除来自原始质粒的 亮氨酸拉链。
     轻链丙氨酸和同系物扫描文库在 HVR-L1， HVR-L2 和 HVR-L3 中具有终止密码子， 并且重链丙氨酸和同系物文库在各重链 HVRs 含有终止密码子。文库通过前述方法 (Sidhu 等， J.Mol.Biol.( 分子生物学杂志 )338 ： 299-310(2004))， 利用 Kunkel 诱变 (Kunkel 等， 1987， 见上文 )， 在各自终止模板上构建。丙氨酸扫描文库是允许选择的侧链改变为野生型 或丙氨酸的噬菌体展示文库。 同系物扫描意指允许选择的侧链改变为野生型或类似氨基酸 的噬菌体展示文库。
     文库选择
     NUNC 96 孔 Maxisorp 免疫板用 5μg/ml 捕获靶标 (EGFR-ECD-Fc， HER3-ECD-Fc 或 蛋白质 -L) 来包被并用处于 PBS 中的 1％ BSA(w/v) 来封闭。如所述， 来自上述文库的噬菌 体与 KO7 辅助噬菌体 (NEB) 一起繁殖 (Lee 等， 2004， 见上文 )。加入文库噬菌体溶液， 从而以浓度 1013 个噬菌体颗粒 /ml 包被板并在 RT 温育 1-2 小时。该板用 PBST 洗涤 8 次， 并随 后用 0.1MHCl 洗脱结合的噬菌体 30 分钟。如前所述确定各轮选择后的富集。2 轮靶标选择 后， 选择来自各文库的许多随机克隆来测序， 如 (Sidhu 等， 2004， 见上文 ) 所描述的。
     结合克隆的 DNA 序列用于确定在各改变的位置的野生型 / 突变比率。该比率用于 评估各选择的侧链对抗原的结合贡献。来自抗原选择的 wt/mut 比率除以来自展示选择的 wt/mut 比率提供了对于各突变对抗原结合亲和力效应的定量估计 ( 功能比率 Fwt/mut)。 如果 该比率大于 1， 突变是有害的。如果该比率小于 1， 突变是有益的。测序了 2500 个克隆。
     基于丙氨酸和同系物扫描的结果， 抗体 D1.5-100 用于结合 EGFR 和 HER3 的热点在 已知抗 HER2 抗体 4D5-Fv 的结构上定位。如图 7 所示， 定位表明对于 EGFR 结合， 重链占优 势， 对于 HER3 的结合， 重链和轻链一起作用。酸性 (E， D) 残基在结合 EGFR 和 HER3 两者中 均起重要作用， 尤其是结合 HER3 中。
     亲和力成熟
     图 8 图示了使用上述鸟枪文库的 D1.5-100 的亲和力成熟。在这种亲和力成熟策 略中， D1.5-100 重链同系物文库如前所述进行分选。在 HER3-ECD-Fc 包被的板上进行两轮 板分选后， 三轮溶液交替靶标在增加严格性下进行分选 (EGFR-ECD 和 HER3-ECD-Fc)。挑选 单克隆并在单点 ELISA 中评估， 以便分离保留双重结合活性的克隆。 在评估的克隆中， 94 个 中的 79 个显示对 EGFR/HER3 两者的结合， 而 11 个丧失 EGFR 结合并且显示对 HER3 的特异 性结合。
     通过单点竞争分离克隆
     挑选来自最后一轮分选的单集落， 噬菌体如实施例 1 中所述进行生长。384 个孔 用 1μl/ml EGFR-ECD-Fc 包被。对于各集落生长， 25μl 的噬菌体上清液或 ELISA 缓冲 液与 25μl 的 EGFR-ECD(50nM) 和 HER3-ECD-Fc(10nM) 一起温育。4μl 的温育物添加至 EGFR-ECD-Fc 包被的板中， 所述板洗涤八次。添加 60μl 的 1/5000 抗 M13-HR 缀合抗体， 洗 涤板八次， 用 TMB+H3PO4 显影。
     使用下述单点竞争方案， 选择八个独特克隆， 其对于 EGFR 和 HER3 显示比 D1.5-100 更大的抑制 ：
     1. 挑选来自最后一轮分选的单集落， 噬菌体如前所述进行生长 ；
     2.384 孔板用 1μg/ml EGFR-ECD-Fc 包被 ；
     3. 对 于 各 集 落 生 长， 25μl 的 噬 菌 体 上 清 液 或 ELISA 缓 冲 液 与 25μl 的 EGFR-ECD(50nM) 和 HER3-ECD-Fc(10nM) 一起温育 ；
     4.4μl 的温育物添加至 EGFR-ECD-Fc 包被的板 ；
     5. 洗涤板 8 次 ；
     6. 添加 60μl 的 1/5000 抗 M13-HRP 缀合抗体 ；
     7. 洗涤板 8 次 ；
     8. 板用 TMB+H3PO4 显影。
     选择 8 个独特克隆， 其对于 EGFR 和 HER3 两者显示比 D1.5-100 更大的抑制 (DL6， SEQ ID NO ： 63 ； DL7， SEQ ID NO ： 64 ； DL8， SEQ ID NO ： 65 ； DL9， SEQ ID NO ： 66 ； DL10， SEQ ID NO ： 67 ； DL11， SEQ ID NO ： 28 ； DL12， SEQ ID NO ： 68 ； DL13， SEQ ID NO ： 69)。对于抗 HER3 抗 体， 选择 7 个独特克隆， 其对于 HER3 显示比 D1.5-100 更大的抑制。表征亲和力成熟的双特异性和抗 HER3 抗体
     选择的亲和力成熟的双特异性抗体的结合特异性通过直接结合一组不同蛋白进 行评估， 如实施例 5 中所述。如图 9 中所示， 选择的抗体显示对 EGFR 和 HER3 两者的结合特 异性。
     对于两个选择的双特异性抗体 (DL7 和 DL11) 如实施例 1 所述计算 IC50 值， 并且 与 D1.5-100 母体克隆相比较。两个选择的双特异性抗体显示对于 HER3-ECD-Fc 相似的亲 和力， 以及对于 EGFR 增加的亲和力。DL1.5-100 具有对于 EGFR-ECD 44nM 的 IC50， 对于 HER3-FC 为 0.1nM 的 IC50 ； DL7 具有对于 EGFR-ECD 6.1nM 的 IC50， 对于 HER3-FC 为 0.25nM 的 IC50 ； DL11 具有对于 EGFR-ECD 5.7nM 的 IC50， 对于 HER3-FC 为 0.43nM 的 IC50。
     选择的抗 HER3 抗体的结合特异性通过直接结合一组不同蛋白进行评估， 如前所 述。选择的抗体 (DL3.5， DL3.6， DL3.7) 仅对 HER3 显示结合特异性。
     对于选择的抗体的噬菌体 IC50 值如上所述进行计算并且与 D1.5-100 母体克隆进 行比较。所有抗体 (DL3.1-3.7) 显示对于 HER3-ECD-Fc 增加的亲和力， 具有 1 和 3.8nM 之 间的 IC50s。母体 DL1.5-100 具有 4.6nM 的 IC50。
     使用上文描述的竞争 ELISA 将选择的双特异性抗体和抗 HER3 抗体的结合与 HER3 结构域 III 蛋白 (N- 末端 His 标签 ) 的结合进行比较。EGFR/HER3 和单特异性抗 HER3 抗体 对于 HER3ECD-Fc 和 HER3 结构域 III 构建体具有相似的亲和力 ( 噬菌体 IC50)。
     选择的亲和力成熟的双特异性抗体和抗 HER3 抗体重新格式化成 mIgG2A 并在竞争 ELISA 中验证， 如上所述。mIgG2A 双特异性抗体显示对于 EGFR-ECD 和 HER3 结构域 III 两 者与 D1.5-100 母体克隆相比增加的亲和力。
     使用 BIAcore 300 对亲和力成熟的 EGFR/HER3 抗体 DL7 和 DL11 和抗 HER3 特异性 抗体 DL3.6 和 DL3.7 进行动力学分析， 各抗体 (DL1.5-100， DL7， DL11， DL3.6， DL3.7) 纯化 的 mIgG2A 偶联到 CM5 芯片上， 数种抗原 (EGFR-ECD， HER3 结构域 III， HER3-ECD) 的稀释液 在实施例 4 所述的条件下流过包被的芯片。CM5 芯片在抗原的每次注射之间进行再生。最 后， 使用 1 ∶ 1 结合分析用质量转移确定 KD。亲和力成熟的 EGFR/HER3 抗体 DL7 和 DL11 对 于两种靶标均具有改善的 KD(M)。
     为了评估亲和力成熟的抗体 DL7、 DL11 和母体抗体 D1.5 对 EGFR 的抑制功能， 仅 表达 EGFR 的 EGFR-NR6 细胞用不同量的抗体 ( 多至 20ug/ml) 预处理一小时， 随后， 通过 TGFα(5nM) 诱导 EGFR 的磷酸化。 抗体对受体的磷酸化的抑制使用抗磷酸酪氨酸抗体检测。 也看到剂量依赖性方式的 MAPK 活化的抑制。抗体 DL11 在抑制 EGFR 和 ERK1/2 磷酸化中比 DL7 效力更大。( 图 10A)。
     比较了 DL7、 DL11 和单特异性抗 HER3 抗体 DL3.6 对 HER3 反式激活的抑制功能。 ( 图 10B)。表达 HER2、 HER3 和 EGFR 的 MCF-7 细胞用标示量的抗体 ( 多至 50ug/ml) 预处理 一小时， HER3 的活化和 HER3 的磷酸根转移通过 HRG 诱导。HER3 磷酸化的抑制使用抗磷酸 HER3 抗体检测。看到剂量依赖性方式的下游信号传导分子 ERK1/2 以及 Akt 的抑制。DL11 再次比 DL7 效力更大。
     DL11 的生长抑制功能与商购的抗 EGFR 抗体 ( 培妥珠单抗 ) 和抗 HER3 抗体的生 长抑制功能相比较， 或与 DL3.6， D1.5 或 D1.5+DL3.6 的组合的生长抑制功能相比较。H1666 细胞 (ATCC CRL-5885， Manassas， Va.)(NSCLC 细胞系， 其表达 HER2， HER3， EGFR 和 EGFR 配体 )(6000 细胞 / 孔 ) 用 HRG(3nM) 刺激生长。抗体以剂量依赖性方式检测， 生长抑制特性 与所有其它单特异性抗体相比较。如图 11A 所示， DL11 以比单特异性抗体或其组合更大的 程度抑制细胞生长。
     当用 HRG(3nM)+TGFα(6nM) 刺激 H1666 细胞生长重复所述测定时， 获得了相似的 结果。( 图 11B)。
     DL11 的生长抑制功能与培妥珠单抗 ( 一种抗 EGFR 抗体 ) 和抗 HER3 抗体， 或 DL3.6， D1.5 或 D1.5+DL3.6 的组合在 HCA-7 细胞中进行比较。HCA-7 是表达 HER2， HER3 和 EGFR 的结肠直肠细胞系。细胞生长用 HRG(3nM) 在 1％血清的存在下进行刺激。抗体以剂 量依赖性方式测试， 在 3 天后使用 Alamar Blue 试剂检测细胞活力。如图 12A 所示， 与所有 其它处理相比， DL11 显示优异的生长抑制特性。
     HCA-7 细 胞 生 长 的 抑 制 如 图 12A 相 关 描 述 进 行 研 究，除 了 生 长 用 HRG(3nM)+TGFα(5nM) 刺激。如图 12B 所示， 与所有其它处理相比， DL11 显示优异的生长抑 制特性。
     研究了 DL11 对 Calu-3 生长的抑制与抗 EGFR 抗体培妥珠单抗和抗 HER3 抗体比 较。NSCLC 细胞系 Calu-3(ATCC HTB-55， Manassas， Va.) 过表达 HER2， 并且具有正常水平 的 HER3 和 EGFR。细胞生长 (10,000 细胞 / 孔 ) 用 HRG(3nM) 在 1％血清存在下进行刺激， 抗体以剂量依赖性方式测试。如图 13 所示， 与单特异性抗体相比， DL11 显示优异的活性。
     实施例 8
     D1.5-201 和 D1.5-201-2， 抗 hEGFR/HER2 双特异性抗体的诱变定位研究
     对于 D1.5-201 的亲和力成熟， 对选择的氨基酸设计轻链软 / 同系物文库。一些软 残基 (soft residues) 进行软随机化 (soft randomized)， 其中野生型残基频率为 50％。 一 些残基使用编码野生型残基或同系物残基的密码子进行随机化。 一些同系物随机化允许野 生型和同系物残基以外 1 或 2 个额外残基。最后， 一些残基未改变。
     图 14 图示了对于 D1.5-201 的亲和力成熟的另一种分选策略。在这种策略中， D1.5-201 轻链软 / 同系物文库如前所述进行分选。在 HER2/ECD 上进行增加的严格性的三 轮交替板 / 溶液分选之后， 挑选单克隆并且在单点 ELISA 中评估， 以便分离保留对 EGFR 和 HER2 双重结合活性的克隆。在所评估的克隆中， 77/192 显示对 EGFR 和 HER2 两者的结合。
     确 定 了 选 择 的 亲 和 力 成 熟 的 EGFR/HER2 双 特 异 性 抗 体 的 轻 链 可 变 区 序 列 (D1.5-201(SEQ ID NO ： 36)， D1.5-201-2(SEQ ID NO ： 37)， D1.5-201-3(SEQ ID NO ： 38))。 对于两个选择的亲和力成熟的双特异性抗体 (D1.5-201-2， D1.5-201-3) 如前所述计算噬 菌体 IC50 并且与 D1.5-201 母体克隆进行比较。两种亲和力成熟的双特异性抗体均显示对 于 HER2-ECD 和 EGFR-ECD 增加的亲和力。
     实施例 9
     DL11 亲和力成熟
     DL11 如上所述进一步亲和力成熟， 产生对于 EGFR 和 HER3 具有特异性的两种另 外的双特异性抗体 (DL11b 和 DL11f) 和特异于 HER3 的两种抗体 (DL3-11fb 和 DL3-11f)。 DL11b 的重链和轻链氨基酸序列分别显示于 SEQ ID NOs ： 12 和 13 中。DL11f 的重链和轻链 氨基酸序列分别显示于 SEQ ID NOs ： 14 和 13 中。 DL3-11b 的重链和轻链氨基酸序列分别显 示于 SEQ ID NOs ： 19 和 13 中， DL3-11f 的重链和轻链氨基酸序列分别显示于 SEQ ID NOs ：20 和 13 中。
     Biacore 亲和力测定
     DL11b 和 DL11f 对于它们的 EGFR 和 HER3 靶标的结合亲和力在下述 Biocore 测定 中确定。DL11b 和 DL11f 两者均显示与 DL11 相比对于它们的靶标改善的亲和力。
     测量使用表面等离子共振在 BIAcoreTM 2000 仪器 (GE Healthcare， BIAcore Life Sciences， Piscataway， NJ) 上进行。编码人 EGFR 的胞外结构域 (ECD)( 氨基酸 1-637) 和 人 HER3 的胞外结构域 (ECD)( 氨基酸 1-640) 的 cDNAs 克隆到含有编码人 IgG1 的 Fc 区的 序列的哺乳动物表达载体中， 从而产生人 Fc 融合蛋白。重组的人 EGFR-IgG1(2.65mg/ml)， 人 HER3-IgG1(3.35mg/ml) 通过瞬时转染中国仓鼠卵巢细胞产生， 并且通过蛋白质 A 亲和色 谱法纯化。编码人 EGFR 胞外结构域 ( 氨基酸 1-637) 的 cDNA 克隆到含有 N 末端标志序列 的哺乳动物表达载体中。
     确定作为 Fab 和 IgG 抗体的 DL11f 的结合亲和力。对于 Fab 测定， DL11f Fab 是分 析物， 使其流过 CM5 芯片， 其中不同配体 - 人 EGFR-Fc 和人 HER3-Fc- 首先使用 BIAcore 人抗 体捕获试剂盒 (BR-1008-39， Lot 10020611) 捕获。 2 倍稀释系列的 DL11f Fab 以 PBS、 0.05％ Tween20 中 0.244-250nM 的范围以 30μl/ 分的流速于 25℃注射。 Fc 融合配体和分析物的各 次注射之间， 使用 3M 氯化镁再生传感器芯片 (5μl， 以 10μl/min 的流速 )。 为了确定 DL11f Fab 对人 EGFR 和人 HER3Fc 融合蛋白的亲和力常数， 从观察的测试传感图 (sensorgram) 中 减去来自参照细胞的信号。 通过数据的非线性回归拟合根据 1 ∶ 1 Langmuir 结合模型使用 BIAcore 评价软件 (GE Healthcare)4.1 版 ( 由制造商提供 ) 计算动力学常数。DL11f Fab 代表性浓度 (125nM) 的两个重复给出对于所有 Fc 融合蛋白的非常相似的拟合和动力学常 数。DL11fFab 以 1.92nM 的 KD 值结合人 EGFR-Fc， 以 0.39nM 的 KD 值结合人 HER3-Fc。
     探索了第二个实验条件以获得作为 IgG 的来自 DL11f 的结合动力学。在此， DL11f 人 IgG1 固定于传感器芯片 CM5 上， 单体的人 EGFR-ecd 和人 HER3-ecd 用作分析物。 2 倍稀释 系列的人 EGFR-ecd 和人 HER3-ecd 以 PBS、 0.05％ Tween20 中 0.244-250nM 的范围以 30μl/ 分的流速于 25℃注射。确定对于 Fab 的结合动力学。DL11f 分别以 19.9nM 和 2.63nM 的 KD 值结合人 EGFR-ecd 和人 HER3-Fc。在两个实验中， 我们观察到 DL11f 抗体对于 HER3 比对于 EGFR 具有一致性地 5-8 倍更高的亲和力。与实验 1 相比时， 在实验 2 中发现对于两种受体 更低的亲和力， 可能由于将 EGFRecd 或 HER3ecd 作为溶液中的分析物和将受体作为 Fc 融合 物固定于流动细胞芯片上之间的差别。可能作为游离的 ECD 的这些多 - 结构域受体在溶液 中时可能遇到更多结合能的熵罚分 (entropic penalty)， 由此导致更弱的亲和力。
     在相似条件下在单独的 Biacore 分析中， DL11b 显示与 DL11f 相似的对 EGFR 和 HER3 的结合亲和力。
     DL3-11b 和 DL3-11f 丧失特异性结合 EGFR 的能力， 而保留特异性结合 HER3 的能 力。
     抑制 MDA-175 细胞增殖
     通过 DL11b 和 DL11f 抑制 MDA-175 细胞增殖如上所述进行研究。DL11b 和 DL11f 两者均以与 DL11 抗体相似的程度抑制 MDA-175 细胞的增殖。图 15。DL11， DL11f 和 DL11b 的 IC50s 都是大约 0.8-1.0ug/ml。
     抑制 MCF7 细胞中调蛋白诱导的 HER3 磷酸化为了确定 DL11f 是否能够抑制 MCF7 细胞中调蛋白诱导的 HER3 磷酸化， 如实施例 6 所述进行受体磷酸化测定。结果证明 DL11f 以剂量依赖性方式抑制调蛋白诱导的 HER3 磷 酸化。图 16。
     抑制稳定转染的 EGFR-NR6 细胞中 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化
     为了确定 DL11f 是否选择性阻断 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化， 如实施例 2 所述进 行受体磷酸化测定。图 16 中的数据证明在这种基于细胞的测定中， DL11f 以剂量依赖性方 式抑制 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化。
     DL11 和 DL11f 在体内模型中抑制肿瘤生长
     HCA-7 肿瘤移植模型测定用于确定 DL11 和 DL11f 对体内肿瘤生长的效应。 测定如 下进行。
     SCID beige 小鼠 (Charles River Laboratories， San Diego， CA) 皮下移植 HCA-7 肿瘤块。当肿瘤达到平均体积 100 至 250mm3， 具有相似大小肿瘤的小鼠随机分到如下处理 组群 (n ＝ 9/ 组 ) ： 赋形剂 (PBS)， 培妥珠单抗 (10mg/kg)， D1.5(25mg/kg)， D1.5+DL3.6( 各 25mg/kg)， DL11(25mg/kg)， 或 DL11f(25mg/kg)。处理通过腹膜内施用， 在随机化当天以 2x 负荷剂量 (20 或 50mg/kg) 开始， 每周继续， 进行总计三次处理。 在研究期间每周两次用测径 器测量肿瘤。小鼠居住于标准啮齿动物微隔离笼 (microisolator cages) 中。动物室的环 境控制设定为维持温度大约 70° F， 相对湿度大约 40％ -60％， 大约 14- 小时光 /10- 小时暗 周期。小鼠根据实验室动物护理和使用 (Care and Use of Laboratory Animals) 的 ILAR 指南维持， 研究经在 Genentech 的研究所动物护理和使用委员会 (Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)) 考查和批准。
     在这种异种移植模型中， DL11 和 DL11f 在降低平均肿瘤体积中同样有效。图 17。
     DL11f 在非小肺细胞癌模型中有活性
     在具有源自人 NSCLC 系 H358(ATCC CRL-5807， Manassas， Va.) 建立肿瘤的小鼠中 6 测试抗体。5x10 H358 细胞与基质胶皮下接种于 CB17 SCID 小鼠中。具有相似大小肿瘤的 动物随机分到如下处理组群 (n ＝ 9/ 组 ) ： 赋形剂 (DL11f 制剂缓冲液 )， D1.5(25mg/kg)， DL3.11b(25mg/kg)， DL11f(30mg/kg)， 或 D1.5+DL3.11b( 各 25mg/kg)。处理通过腹膜内施 用， 在随机化当天以 2x 负荷剂量 (50 或 60mg/kg) 开始， 每周继续， 进行总计四次处理。在 研究期间每周两次用测径器测量肿瘤。
     如图 18 所示， 双特异性抗体 DL11f 在这种 NSCLC 模型中有活性， 并且比抗 EGFR 特 异性和抗 HER3 特异性抗体的组合 (D1.5+DL3.11b) 在抑制肿瘤生长中更有效。
     实施例 10
     DL3.6 亲和力成熟
     DL3.6 如上所述进一步亲和力成熟， 产生另外的抗 HER3 抗体。DL3.6b 显示与母体 抗体 DL3.6 相比对于其靶标的亲和力的增加。 DL3.6b 的重链和轻链氨基酸序列分别显示于 SEQ ID NOs ： 17 和 13。
     如图 19 和 20 所示， DL3-11b， DL3.6 和 DL3.6b 抑制 HRG 诱导的 HER3 磷酸化和 MDA-175 细胞增殖。测定如上所述进行。
     实施例 11
     在 Fadu 异 种 移 植 模 型， 头 和 颈 鳞 状 细 胞 癌 (head and neck sauamous cellcarcinoma) 模型中的体内活性
     在具有源自 Fadu 细胞 (ATCC HTB-43， Manassas， Va.) 建立肿瘤的小鼠中测试 6 DL11f， 商购抗 EGFR 抗体和抗 HER3 抗体。5x10 FaDu 细胞皮下接种于 CB17SCID 小鼠中。具 有相似大小肿瘤的动物随机分到如下处理组群 (n ＝ 9/ 组 ) ： 赋形剂 (DL11f 制剂缓冲液 )， 抗 EGFR 抗体 (25mg/kg)， 抗 HER3 抗体 (50mg/kg) 和 DL11f(25mg/kg)。处理通过腹膜内施 用， 在随机化当天以 2x 负荷剂量 ( 分别为 50 或 100mg/kg) 开始， 每周继续， 进行总计四次 处理。在研究期间每周两次用测径器测量肿瘤。
     如图 21 所示， DL11f 在 FaDu 头和颈癌模型中有活性， 并且比抗 EGFR 特异性或抗 HER3 特异性抗体在抑制肿瘤生长中更有效。
     实施例 12
     在 BxPC3 异种移植模型， HER3 驱动的胰腺模型 (pancreatic model) 中的体内活 性
     在具有源自胰腺细胞系 BxPC3(ATCC CRL-1687， Manassas， Va.) 建立肿瘤的小鼠 6 中测试 DL11f， 抗 EGFR 抗体， 培妥珠单抗， 和抗 HER3 抗体。10x10 BxPC3 细胞皮下接种于 CB17SCID 小鼠中。具有相似大小肿瘤的动物随机分到如下处理组群 (n ＝ 8/ 组 ) ： 赋形剂 (DL11f 制剂缓冲液 )， 抗 EGFR 抗体 (25mg/kg)， 培妥珠单抗 (25mg/kg)， 抗 HER3 抗体 (50mg/ kg)， 和 DL11f(25mg/kg)。 处理通过腹膜内施用， 在随机化当天以 2x 负荷剂量 (50 或 100mg/ kg) 开始， 每周继续， 进行总计四次处理。在研究期间每周两次用测径器测量肿瘤。
     DL11f 在 BxPC3 胰腺癌模型中有活性， 并且比抗 EGFR 特异性或抗 HER3 特异性抗体 在延缓肿瘤生长中更有效。( 图 22)。
     实施例 13
     在 NSCLC Calu-3 异种移植模型中的体内活性
     在具有源自 NSCLC 系 Calu-3(ATCC HTB-55， Manassas， Va.) 建立肿瘤的小鼠中测 6 试 DL11f， 商购抗 EGFR 抗体， 和抗 HER3 抗体。5x10 Calu-3 细胞皮下接种于 SCID Beige 小 鼠中。具有相似大小肿瘤的动物随机分到如下处理组群 (n ＝ 9/ 组 ) ： 赋形剂 (DL11f 制剂 缓冲液 )， 抗 EGFR 抗体 (25mg/kg)， 抗 HER3 抗体 (25mg/kg)， 和 DL11f(25mg/kg)。处理通过 腹膜内施用， 在随机化当天以 2x 负荷剂量 (50) 开始， 每周 ( 抗 HER3 每两周 ) 继续， 进行总 计四 ( 八 ) 次处理。在研究期间每周两次用测径器测量肿瘤。
     DL11f 在 Calu-3 非小细胞肺癌模型中有活性， 并且比抗 EGFR 特异性或抗 HER3 特 异性抗体在延缓肿瘤生长中更有效。( 图 23)。
     实施例 14
     在表皮 A431 异种移植模型中的体内活性
     在具有源自表皮样细胞系 A431(ATCC CRL-2592， Manassas， Va.) 建立肿瘤的小鼠 6 中测试 DL11f， 商购抗 EGFR 抗体， 和抗 HER3 抗体。5x10 A431 细胞皮下接种于 SCID Beige 小鼠中。具有相似大小肿瘤的动物随机分到如下处理组群 (n ＝ 8/ 组 ) ： 赋形剂 (DL11f 制 剂缓冲液 )， 抗 EGFR 抗体 (12.5mg/kg)， 抗 HER3(50mg/kg) 和 DL11f(12.5 和 25mg/kg)。处 理在随机化当天通过腹膜内施用一次。在研究期间每周两次用测径器测量肿瘤。
     由于在小鼠中与抗 EGFR 抗体相比 DL11f 更快的清除， DL11f 以与抗 EGFR 抗体相 比 2x 浓度给药， 以便获得可比的暴露水平。总之， DL11f 与抗 EGFR 抗体同样好地抑制 A431表皮癌模型中的肿瘤生长。( 图 24)。
     实施例 15
     在携带患者来源的乳腺癌 MAXF449 的异种移植物的裸鼠中的体内活性
     DL11f， 商购抗 EGFR 抗体和抗 HER3 抗体在 Oncotest GmbH， Freiburg， Germany 进 行测试。在直接移植来自供体患者的肿瘤后， Oncotest 在裸鼠中作为皮下异种移植物传代 患者肿瘤， 像乳腺癌 MAXF 449。根据 Oncotest 的方案， 具有相似大小肿瘤的动物随机分到 如下处理组群 (n ＝ 10/ 组 ) ： DL11f(30mg)， 抗 EGFR 抗体 (30mg/kg)， 抗 HER3(60mg/kg) 和 赋形剂 (DL11f 制剂缓冲液 )。处理通过腹膜内施用， 在随机化当天以 2x 负荷剂量 ( 分别为 60 或 120mg/kg) 开始， 每周继续， 进行总计四次处理。
     DL11f 和抗 HER3 抑制 MAXF44 乳腺癌模型中的肿瘤生长， 而抗 EGFR 抗体无效应 ( 图 25)。
     实施例 16
     在前列腺 DU145 异种移植模型中的体内活性
     DL11f，商 购 抗 EGFR 抗 体 和 抗 HER3 抗 体 在 Piedmont Research Center， Morrisville 根据 Piedmont 的方案进行测试。具有相似大小肿瘤的动物随机分到如下处 理组群 (n ＝ 10/ 组 ) ： DL11f(25mg)， 抗 EGFR 抗体 (25mg/kg)， 抗 HER3(50mg/kg) 和赋形剂 (DL11f 制剂缓冲液 )。处理通过腹膜内施用， 在随机化当天以 2x 负荷剂量 ( 分别为 50 或 100mg/kg) 开始， 每周继续， 进行总计四次处理。DL11f 在 DU145 前列腺癌模型中有活性， 并 且比抗 EGFR 特异性或抗 HER3 特异性抗体在抑制肿瘤生长中更有效。( 图 26)。
     实施例 17
     在携带患者来源的卵巢癌 OVXF550 异种移植物的裸鼠中的体内活性
     DL11f， 商购抗 EGFR 抗体和抗 HER3 抗体在 Oncotest GmbH， Freiburg， Germany 进 行测试。在直接移植来自供体患者的肿瘤后， Oncotest 在裸鼠中作为皮下异种移植物传代 患者肿瘤， 像卵巢癌 OVXF550。 根据 Oncotest 的方案， 具有相似大小肿瘤的动物随机分到如 下处理组群 (n ＝ 10/ 组 ) ： DL11f(30mg)， 抗 EGFR 抗体 (30mg/kg)， 抗 HER3 抗体 (60mg/kg) 和赋形剂 (DL11f 制剂缓冲液 )。处理通过腹膜内施用， 在随机化当天以 2x 负荷剂量 ( 分别 为 60 或 120mg/kg) 开始， 每周继续， 进行总计五次处理。
     DL11f 在 OVFX550 卵巢癌模型中有活性。( 图 27)。
     实施例 18
     DL11f 在体外和体内介导抗体依赖性细胞的细胞毒性 (ADCC)
     DL11f 在体外介导 ADCC。A431， H292(ATCC CRL-1848， Manassas， Va.)， FaDu， BxPC3 和 MDA468(ATCC HTB-132， Manassas， Va.) 细胞 ( 均来自 ATCC) 在存在标示浓度的抗体时在 96 孔板中铺板。在 37℃预温育 30 分钟后， 添加分离的外周血单核细胞 (PBMC)， 在 37℃继 续温育另外 4 小时。4 小时后， 离心板并且收获上清液。上清液中的 LDH 活性根据 Promega CytoTox-One 同质膜完整性测定程序确定。 为了确定百分数细胞介导的细胞毒性， 计算平均 吸光度并且减去背景。如图 28 所示， DL11f 以剂量依赖性方式减轻在 EGFR 表达细胞系中 的 ADCC。
     向 DL11f 引入氨基酸置换 N297A 以缺失效应子功能。N297 是 FcRγ 和 / 或补体结 合必需的。DL11f-N297A 在体外显示丧失 ADCC。如所预期的， DL11f 体外生长抑制功能未受该突变的影响。( 图 29)。
     在具有源自 NSCLC 细胞系 H292(ATCC CRL-1848， Manassas， Va.) 建立肿瘤的小 6 鼠中测试 DL11f 和 DL11f-N297A。5x10 A431 细胞皮下接种于 C.B17-SCID 小鼠中。具有 相似大小肿瘤的动物随机分到如下处理组群 (n ＝ 10/ 组 ) ： 赋形剂 (DL11f 制剂缓冲液 )， DL11f(6mg/kg) 和 DL11f-N297A(6mg/kg)。处理在随机化当天通过腹膜内施用一次。在研 究期间每周两次用测径器测量肿瘤。最初， DL11f 和 DL11f N297A 通过抑制 HER 途径信号 传导等价地抑制肿瘤生长。但当剂量减少时， 与 DL11f N297A 相比， DL11f 由于其 ADCC 能 力显示延长的抗肿瘤活性。( 图 30)。
     实施例 19
     在食蟹猴中 DL11f 比西妥昔单抗毒性更低
     进行研究以确定 DL11f 和西妥昔单抗的相对毒性。食蟹猴分为三组并且给药 DL11f 或西妥昔单抗 (Capital Wholesale Drug， Columbus， OH)， 每周一次进行六周， 如下所 述：
     组1： 西妥昔单抗 25mg/kg ；
     组2： DL11f25mg/kg ；
     组3： DL11f 12.5mg/kg。
     所有 3 组西妥昔单抗给药的动物在第 3 和第 4 次给药之间发生皮肤损害， 表明毒 性。这种结果基于以前 FDA 批准西妥昔单抗过程中所做的食蟹猴研究是预料到的。在所述 研究中在这一点没有 DL11f 给药的动物显示毒性体征。
     接受 25mg/kg 剂量 DL11f 的动物中的一个在第 6 次给药后一周发生皮肤损害。这 一损害测量为大约 4cm x 7cm， 当与西妥昔单抗处理的动物中观察到的损害相比时， 是非常 轻度的并且限制在更小的区域。
     基于在这种毒理学研究中的毒性动力学参数分析， 在以 25mg/kg 给药各测试化合 物的动物中， 西妥昔单抗和 DL11f 的暴露是相似的。
     在下述条件下进行第二个、 更大规模的研究。
     食蟹猴分为六组， 通过静脉内施用 DL11f 或赋形剂对照来给药， 每周一次进行 十二周， 如下所述 ：
     组1： 10 只猴 (5 雄性 /5 雌性 )- 赋形剂对照
     组2： 10 只猴 (5 雄性 /5 雌性 )DL11f5mg/kg
     组3： 10 只猴 (5 雄性 /5 雌性 )DL11f 15mg/kg
     组4： 10 只猴 (5 雄性 /5 雌性 )DL11f30mg/kg
     组5： 4 只猴 (2 雄性 /2 雌性 ) 赋形剂对照
     组6： 4 只猴 (2 雄性 /2 雌性 )DL11f30mg/kg
     在研究过程中或在 DL11f 最后一次给药之后的恢复期间， 没有动物显示任何明显 的皮肤毒性。
     也在食蟹猴中进行了单次剂量、 IV 施用 PK 研究。在这种研究中， 每组 3 只猴用 1、 10 或 30mg/kg 的 DL11f 静脉内给药。所探索的剂量范围中的 PK 是非线性的， 与已经在其它 靶向 EGFR 的抗体中看到的可饱和的清除一致。
     本 申 请 根 据 35USC 119(e) 要 求 2009 年 3 月 20 日 提 交 的 美 国 临 时 申 请 号 61/210562 的优先权的权益， 其公开的全文通过引用并入本文。
    【发明领域】
     本发明涉及抗 HER 抗体， 包括多特异性抗 HER 抗体， 其具有对于至少两种不同 HER 受体的结合特异性， 以及所述抗体治疗疾病或病症的用途。
     发明背景
     受体酪氨酸激酶的 HER 家族是细胞生长、 分化和存活的重要介质。该受体家族包 括四个独特的成员， 包括表皮生长因子受体 (EGFR、 ErbB1 或 HER1)、 HER2(ErbB2 或 p185neu)、 HER3(ErbB3) 和 HER4(ErbB4 或 tyro2)。
     由 erbB1 基因编码的 EGFR 已被认为是人类恶性肿瘤的病因。 具体而言， 在乳腺癌、 膀胱癌、 肺癌、 头癌、 颈癌和胃癌以及成胶质细胞瘤中已经观察到 EGFR 表达的升高。 EGFR 受 体表达的升高常常与由同样的肿瘤细胞的 EGFR 配体， 转化生长因子 α(TGF-α) 的产量增 加有关， 其通过自分泌刺激途径导致受体活化。 Baselga 和 Mendelsohn Pharmac.Ther.( 药 学理论 )64 ： 127-154(1994)。针对 EGFR 或其配体 TGF-α 和 EGF 的单克隆抗体已经作为治 疗此类恶性肿瘤的治疗剂进行了评估。 参见例如 Baselga 和 Mendelsohn， 见上文 ； Masui 等， Cancer Research( 癌症研究 )44 ： 1002-1007(1984) ； 和 Wu 等， J.Clin.Invest.( 临床研究 杂志 )95 ： 1897-1905(1995)。
     HER 家族的第二个成员 HER2(p185neu) 最初被鉴定成转化基因的产物， 来自经化 学处理的大鼠的成神经细胞瘤。neu 原癌基因的活化形式产生自所编码蛋白质跨膜区中 的点突变 ( 缬氨酸变成谷氨酸 )。在乳腺癌和卵巢癌中观察到 neu 的人同系物的扩增， 而 且 这 与 预 后 不 良 有 关 (Slamon 等， Science( 科 学 )， 235 ： 177-182(1987) ； Slamon 等， Science( 科学 )， 244 ： 707-712(1989) ； 和美国专利 4,968,603)。在其它癌瘤中也已观察 到 HER2 的过表达 ( 频繁但不均一， 原因在于基因扩增 )， 所述癌瘤包括胃、 子宫内膜、 唾液 腺、 肺、 肾、 结肠、 甲状腺、 胰和膀胱的癌瘤。参见 King 等， Science( 科学 )， 229 ： 974(1985) ； Yokota 等， Lancet( 柳叶刀 ) ： 1： 765-767(1986) ； Fukushige 等， Mol Cell Biol.( 分子细 胞生物学 )， 6： 955-958(1986) ； Guerin 等， Oncogene Res.( 癌基因研究 )， 3： 21-31(1988) ； Cohen 等， Oncogene( 癌基因 )， 4： 81-88(1989) ； Yonemura 等， Cancer Res.( 癌症研究 )， 51 ： 1034(1991) ； Borst 等， Gynecol.Oncol.， 38 ： 364(1990) ； Weiner 等， Cancer Res.( 癌 症 研 究 )， 50 ： 421-425(1990) ； Kern 等， Cancer Res.( 癌 症 研 究 )， 50 ： 5184(1990) ； Park 等， Cancer Res.( 癌 症 研 究 )， 49 ： 6605(1989) ； Zhau 等， Mol.Carcinog.( 分 子 致 癌 作 用 )， 3： 254-257(1990) ； Aasland 等， Br.J.Cancer( 英 国 癌 症 杂 志 )57 ： 358-363(1988) ； Williams 等， Pathobiology( 病 理 学 )59 ： 46-52(1991) ； 和 McCann 等， Cancer( 癌 症 )， 65 ： 88-92(1990) 等。HER2 可在前列腺癌中过表达 (Gu 等， Cancer Lett.( 癌症通讯 )99 ： 185-9(1996) ； Ross 等， Hum.Pathol.( 人类病理学 )28 ： 827-33(1997) ； Ross 等， Cancer( 癌症 )79 ： 2162-70(1997) ； 和 Sadasivan 等， J.Urol.( 泌尿学杂志 )150 ： 126-31(1993))。 neu
     已经描述了针对大鼠 p185 和人 HER2 蛋白质产物的抗体。Drebin 及其同事 制备了针对大鼠 neu 基因产物， p185neu 的抗体。参见例如 Drebin 等， Cell( 细胞 )41 ： 695-706(1985) ； Myers 等， Meth.Enzym.( 酶学方法 )198 ： 277-290(1991) ； 和 WO94/22478。 neu Drebin 等， Oncogene( 癌基因 )2 ： 273-277(1988) 报道了与 p185 的两个独特区域有反应 性的抗体混合物对植入裸鼠的 neu 转化 NIH-3T3 细胞产生协同的抗肿瘤作用。还可参见 1998 年 10 月 20 日颁发的美国专利 5,824,311。
     Hudziak 等， Mol.Cell.Biol.( 分 子 细 胞 生 物 学 )9(3) ： 1165-1172(1989) 描 述 了一组 HER2 抗体的生成， 并利用人乳房肿瘤细胞系 SK-BR-3 鉴定。通过 72 小时后单 层细胞的结晶紫染色测定了暴露于抗体后 SK-BR-3 细胞的相对细胞增殖。利用此测定 法， 用称作 4D5 的抗体获得了最大抑制， 它抑制细胞增殖达 56 ％。该组其它抗体在此测 定法中将细胞增殖降低至较低程度。还发现抗体 4D5 使过表达 HER2 的乳房肿瘤细胞 系对 TNF-α 的细胞毒性作用变得敏感。还可参见 1997 年 10 月 14 日颁发的美国专利 5,677,171。Hudziak 等人的文章中讨论的 HER2 抗体还在以下文献中进行了表征 ： Fendly 等， Cancer Research( 癌症研究 )50 ： 1550-1558(1990) ； Kotts 等， In Vitro( 体外 )26(3) ： 59A(1990) ； Sarup 等， Growth Regulation( 生 长 调 节 )1 ： 72-82(1991) ； Shepard 等， J.Clin.Immunol.( 临床免疫学 )11(3) ： 117-127(1991) ； Kumar 等， Mol.Cell.Biol.( 分子 细胞生物学 )11(2) ： 979-986(1991) ； Lewis 等， Cancer Immunol.Immunother.( 癌症免疫 学和免疫疗法 )37 ： 255-263(1993) ； Pietras 等， Oncogene( 癌基因 )9 ： 1829-1838(1994) ； Vitetta 等， Cancer Research( 癌症研究 )54 ： 5301-5309(1994) ； Sliwkowski 等， J.Biol. Chem.( 生 物 化 学 杂 志 )269(20) ： 14661-14665(1994) ； Scott 等， J.Biol.Chem.( 生 物 化 学 杂 志 )266 ： 14300-5(1991) ； D ′ souza 等， Proc.Natl.Acad.Sci.( 美 国 国 家 科 学 院 学 报 )91 ： 7202-7206(1994) ； Lewis 等， Cancer Research( 癌症研究 )56 ： 1457-1465(1996) ； 和 Schaefer 等， Oncogene( 癌基因 )15 ： 1385-1394(1997)。
     鼠 HER2 抗体 4D5 的重组人源化型式 ((huMAb4D5-8， rhuMAb HER2， 曲妥珠单抗 (trastuzumab) 或 美国专利 5,821,337) 在临床上对患有 HER2 过表达的转 移性乳腺癌并已接受广泛的早期抗癌疗法的患者起作用 (Baselga 等， J.Clin.Oncol.( 临 床肿瘤学杂志 )14 ： 737-744(1996))。曲妥珠单抗在 1998 年 9 月 25 日得到了食品和药品 管理局的销售许可， 可用于治疗所患肿瘤过表达 HER2 蛋白质的转移性乳腺癌患者。
     以 下 文 献 中 描 述 了 具 有 各 种 特 性 的 其 它 HER2 抗 体 ： Tagliabue 等， Int. J.Cancer( 国 际 癌 症 杂 志 )47 ： 933-937(1991) ； McKenzie 等， Oncogene( 癌 基 因 )4 ： 543-548(1989) ； Maier 等， Cancer Res.( 癌 症 研 究 )51 ： 5361-5369(1991) ； Bacus 等， Molecular Carcinogenesis( 分 子 致 癌 作 用 )3 ： 350-362(1990) ； Stancovski 等， PNAS(USA)88 ： 8691-8695(1991) ； Bacus 等， Cancer Research( 癌 症 研 究 )52 ： 2580-2589(1992) ； Xu 等， Int.J.Cancer( 国际癌症杂志 )53 ： 401-408(1993) ； WO94/00136 ； Kasprzyk 等， Cancer Research( 癌 症 研 究 )52 ： 2771-2776(1992) ； Hancock 等， Cancer Res.( 癌 症 研 究 )51 ： 4575-4580(1991) ； Shawver 等， Cancer Res.( 癌 症 研 究 )54 ： 1367-1373(1994) ； Arteaga 等， Cancer Res.( 癌症研究 )54 ： 3758-3765(1994) ； Harwerth 等， J.Biol.Chem.( 生 物 化 学 杂 志 )267 ： 15160-15167(1992) ； 美 国 专 利 5,783,186 ； 和Klapper 等， Oncogene( 癌基因 )14 ： 2099-2109(1997)。
     同 源 性 筛 选 使 得 HER 受 体 家 族 的 两 个 其 它 成 员 得 以 鉴 定 ： HER3( 美 国 专 利 5,968,511， 5,183,884 和 5,480,968 以 及 Kraus 等， PNAS(USA)86 ： 9193-9197(1989)) 和 HER4( 欧洲专利申请 599,274 ； Plowman 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， ( 美国国家科学院学 报 )， 90 ： 1746-1750(1993) ； 和 Plowman 等， Nature( 自然 )， 366 ： 473-475(1993))。这两种 受体均在至少有些乳腺癌细胞系中展示出表达升高。
     通常发现 HER 受体在细胞中有多种组合， 而且认为它的异二聚化增加了对各种 HER 配体的细胞应答的多样性 (Earp 等， Breast Cancer Research and Treatment( 乳腺癌 研究和治疗 )35 ： 115-132(1995))。EGFR 受到 6 种不同配体的结合 ： 表皮生长因子 (EGF)、 转化生长因子 α(TGF-α)、 双调蛋白、 肝素结合表皮生长因子 (HB-EGF)、 β 动物纤维素和 epiregulin(Groenen 等， Growth Factors( 生长因子 )11 ： 235-257(1994))。由单一基因 的可变剪接产生的一个调蛋白蛋白质家族是 HER3 和 HER4 的配体。调蛋白 (heregulin) 家 族 包 括 α、 β 和 γ 调 蛋 白 (Holmes 等， Science( 科 学 )， 256 ： 1205-1210(1992) ； 美 国 专 利 5,641,869 ； 和 Schaefer 等， Oncogene( 癌 基 因 )15 ： 1385-1394(1997)) ； neu 分 化因子 (NDFs) ； 神经胶质生长因子 (GGFs) ： 乙酰胆碱受体诱导活性 (ARIA) ； 及感觉和 运 动 神 经 元 衍 生 因 子 (SMDF)。 有 关 综 述 参 见 Groenen 等， Growth Factors( 生 长 因 子 )11 ： 235-257(1994) ； Lemke， G.Molec.& Cell.Neurosci.( 分 子 和 细 胞 神 经 科 学 )7 ： 247-262(1996) 和 Lee 等， Pharm.Rev.( 药 学 综 述 )47 ： 51-85(1995)。 还 鉴 定 了 另 外 三 种 HER 配体 ： 神经调节蛋白 -2(NRG-2)， 据报道它结合 HER3 或 HER4(Chang 等， Nature( 自 然 )387509-512(1997) ； 和 Carraway 等， Nature( 自然 )387 ： 512-516(1997)) ； 神经调节蛋 白 -3， 它结合 HER4(Zhang 等， PNAS(USA)94(18) ： 9562-7(1997)) ； 和神经调节蛋白 -4， 它 结合 HER4(Harari 等， Oncogene( 癌基因 )18 ： 2681-89(1999))。HB-EGF、 β 动物纤维素和 epiregulin 也结合 HER4。
     尽管 EGF 和 TGFα 不结合 HER2， 但是 EGF 刺激 EGFR 和 HER2 形成异二聚体， 它活化 EGFR 并导致异二聚体中 HER2 的转磷酸作用。二聚化作用和 / 或转磷酸作用似乎活化 HER2 酪氨酸激酶。 参见 Earp 等， 见上文。 同样， 当 HER3 与 HER2 共表达时， 形成有活性的信号复合 物， 而针对 HER2 的抗体能破坏此复合物 (Sliwkowski 等， J.Biol.Chem.( 生物化学杂志 )， 269(20) ： 14661-14665(1994))。此外， 在与 HER2 共表达时， HER3 对调蛋白 (HRG) 的亲和力 提高到了更高的亲和力状态。关于 HER2-HER3 蛋白质复合物还可参见 Levi 等， Journal of Neuroscience( 神经科学杂志 )15 ： 1329-1340(1995) ； Morrissey 等， Proc.Natl.Acad.Sci. USA( 美国国家科学院学报 )92 ： 1431-1435(1995) ； 和 Lewis 等， Cancer Res.( 癌症研究 )， 56 ： 1457-1465(1996)。HER4， 与 HER3 类似， 与 HER2 形成有活性的信号复合物 (Carraway 和 Cantley， Cell( 细胞 )78 ： 5-8(1994))。
     目前靶向 HER 途径的治疗剂用于治疗疾病诸如乳腺癌、 非小细胞肺癌、 结肠直 肠癌、 头和颈癌和胰腺癌。尽管这些治疗剂具有一些成功， 存在涉及天然和诱导抗性 和 毒 性 的 问 题。Arteaga CL.J Clin Oncol ( 临 床 肿 瘤 学 杂 志 )21 ： 289-91s(2003) ； Hoshi S， 等， Gan To Kagaku Ryoho 31 ： 1209-13(2004) ； Viloria-Petit AM， 和 Kerbel RS.Int J Radiat Oncol Biol Phys 58 ： 914-26(2004) ； Bianco R， 等， Endocr Relat Cancer 12 ： S159-71(2005) ； Engelman JA， 和 Janne PA.， Clin Cancer Res( 临 床 癌 症研 究 )14 ： 2895-9(2008) ； Davoli A， 等， Cancer Chemother Pharmacol.( 癌 症 化 疗 药 学 )65(4) ： 611-23(2010) ； Pohlmann PR， 等， Clin Cancer Res( 临床癌症研究 ).15(24) ： 7479-7491(2009)。具体地， 靶向 HER1(EGFR) 的治疗剂常常与不希望的副作用相关， 诸如显 著水平的皮肤毒性。Robert， 等， Lancet Oncology( 柳叶刀肿瘤学 )6 ： 491-500(2005).
     因此， 存在开发靶向 HER 途径的改善的治疗剂的需要。
     发明概述
     本发明提供多特异性抗体， 其包含特异性结合至少两个 HER 受体的抗原结合结构 域， 所述 HER 受体选自由 (a)EGFR 和 HER2， (b)EGFR 和 HER3， 和 (c)EGFR 和 HER4 组成的组。 所述抗体抑制至少一个所述 HER 受体的生物学活性。在具体的实施方案中， 所述多特异性 抗体特异性结合其靶标 HER 受体并且不特异性结合非靶标 HER 受体。因此， 在一个实施方 案中， 所述抗体特异性结合 EGFR 和 HER3 但是不特异性结合 HER2 或 HER4。在另一个实施方 案中， 所述抗体特异性结合 EGFR 和 HER2 但是不特异性结合 HER3 或 HER4。在另一个实施方 案中， 所述抗体特异性结合 EGFR 和 HER4 但是不特异性结合 HER2 或 HER3。本发明也提供特 异性结合靶标 HER 受体的单特异性抗体。
     本发明一方面提供能够特异性结合 EGFR 和另一个 HER 受体的多特异性抗体， 其比 传统 EGFR 拮抗剂， 诸如西妥昔单抗 (cetuximab) 毒性更低。在一个实施方案中， 所述毒性 是皮肤病学毒性。在一个实施方案中， 多特异性 HER 抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的 抗原结合结构域。 一方面， 本发明提供多特异性抗体， 其包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结 构域。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体比 EGFR 拮抗剂毒性更低。在一个实施方案 中， 所述多特异性抗体抑制 EGFR 和 HER3 中至少一个的生物学活性。在一个实施方案中， 所 述抗体抑制 EGF 结合 EGFR。在另一个实施方案中， 所述抗体抑制 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸 化。在一些实施方案中， 所述抗体抑制肿瘤细胞生长。在一个实施方案中， 所述多特异性抗 体特异性结合 EGFR 和 HER3 但是不特异性结合 HER2 或 HER4。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含以低于 10-6M 的 Kd 特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含以低于 10-6M 的 Kd 特 异性结合 EGFR 并且以低于 10-7M 的 Kd 特异性结合 HER3 的抗原结合结构域。
     在一个实施方案中， 包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域的多特 异 性 抗 体 包 含 (a)HVR-H1， 其 包 含 氨 基 酸 序 列 LSGDWIH(SEQ ID NO ： 48) ； (b)HVR-H2， 其 包 含 氨 基 酸 序 列 VGEISAAGGYTD(SEQ ID NO ： 51) ； 和 (c)HVR-H3， 其包含氨基酸序列 ARESRVSFEAAMDY(SEQ ID NO ： 53) ； 和 (d)HVR-L1， 其包含氨基酸序列 NIATDVA(SEQ ID NO ： 55) ； (e)HVR-L2， 其包含氨基酸序列 SASF(SEQ ID NO ： 56) ； 和 (f)HVR-L3， 其包含氨基酸序 列 SEPEPYT(SEQ ID NO ： 57)。
     在一个实施方案中， 包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域的多特异性 抗体包含 (a) 重链可变结构域， 其与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 30 具有至少 95％的序列同一 性； (b) 轻链可变结构域， 其与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 具有至少 95％的序列同一性 ； 或 (c) 如 (a) 中的重链可变结构域序列和如 (b) 中的轻链可变结构域序列。在一个实施方案 中， 包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域的多特异性抗体包含 SEQ ID NO ： 30 的 重链可变结构域序列。在一个实施方案中， 包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含以低于 10-6M 的 Kd 特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含以低于 10-6M 的 Kd 特 异性结合 EGFR 并且以低于 10-7M 的 Kd 特异性结合 HER3 的抗原结合结构域。
     在一个实施方案中， 包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域的多特 异 性 抗 体 包 含 (a)HVR-H1， 其 包 含 氨 基 酸 序 列 LSGDWIH(SEQ ID NO ： 48) ； (b)HVR-H2， 其 包 含 氨 基 酸 序 列 VGEISAAGGYTD(SEQ ID NO ： 51) ； 和 (c)HVR-H3， 其包含氨基酸序列 ARESRVSFEAAMDY(SEQ ID NO ： 53) ； 和 (d)HVR-L1， 其包含氨基酸序列 NIATDVA(SEQ ID NO ： 55) ； (e)HVR-L2， 其包含氨基酸序列 SASF(SEQ ID NO ： 56) ； 和 (f)HVR-L3， 其包含氨基酸序 列 SEPEPYT(SEQ ID NO ： 57)。
     在一个实施方案中， 包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域的多特异性 抗体包含 (a) 重链可变结构域， 其与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 30 具有至少 95％的序列同一 性； (b) 轻链可变结构域， 其与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 具有至少 95％的序列同一性 ； 或 (c) 如 (a) 中的重链可变结构域序列和如 (b) 中的轻链可变结构域序列。在一个实施方案 中， 包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域的多特异性抗体包含 SEQ ID NO ： 30 的 重链可变结构域序列。在一个实施方案中， 包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构
     域的多特异性抗体包含 SEQ ID NO ： 29 的轻链可变结构域序列。 在另一个实施方案中， 包含 特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域的多特异性抗体包含 SEQ ID NO ： 30 的重链可 变结构域序列和 SEQ ID NO ： 29 的轻链可变结构域序列。
     在一些实施方案中， 包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域的多特异性 抗体是全长 IgG1 抗体。
     本发明的一方面提供编码所述多特异性 HER 抗体的分离的核酸。另一方面提供包 含编码所述多特异性 HER 抗体的核酸的宿主细胞。还一方面提供产生多特异性 HER 抗体的 方法， 包括培养包含编码所述多特异性 HER 抗体的核酸的宿主细胞， 从而产生所述的抗体。
     本发明一方面提供包含多特异性 HER 抗体和细胞毒性剂的免疫缀合物。另一方面 提供包含多特异性 HER 抗体和药用载体的药物制剂。
     本发明一方面提供治疗患有癌症的个体的方法， 包括向所述个体施用有效量的多 特异性 HER 抗体。在一个实施方案中， 所述多特异性 HER 抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域。在一个实施方案中， 通过所述多特异性 HER 抗体治疗的癌症包含表达 EGFR 和 HER3 的细胞。在一个实施方案中， 通过所述多特异性 HER 抗体治疗的癌症是乳腺 癌 (breast cancer)、 结肠直肠癌 (colorectal cancer)、 胰腺癌 (pancreatic cancer)、 头 和颈癌 (head and neck cancer)、 黑素瘤 (melanoma)、 卵巢癌 (ovarian cancer)、 前列腺癌 (prostate cancer) 或非小细胞肺癌 (non-small lung cell cancer)。 本发明另一方面提供抑制个体中 HER 受体生物学活性的方法， 包括向所述个体施 用有效量的多特异性 HER 抗体。在一个实施方案中， 所述多特异性 HER 抗体包含特异性结 合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域。
     本发明一方面提供用作药物的多特异性 HER 抗体。另一方面提供用于治疗癌症， 诸如乳腺癌、 结肠直肠癌、 胰腺癌、 头和颈癌、 黑素瘤、 卵巢癌、 前列腺癌或非小细胞肺癌的 多特异性 HER 抗体。另一方面提供用于抑制 HER 受体的生物学活性的多特异性 HER 抗体。 在一个实施方案中， 所述多特异性 HER 抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构 域。
     本发明另一方面提供用于制备药物的多特异性 HER 抗体。在一个实施方案中， 所 述药物可用于治疗癌症， 诸如乳腺癌、 结肠直肠癌、 胰腺癌、 头和颈癌、 黑素瘤、 卵巢癌、 前列 腺癌或非小细胞肺癌。在一个实施方案中， 所述药物用于抑制 HER 受体的生物学活性。在 一个实施方案中， 所述多特异性 HER 抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域。 在一个实施方案中， 所述多特异性 HER 抗体比传统 EGFR 拮抗剂， 诸如西妥昔单抗毒性更低。
     附图简述
     图 1 显示在 A431 异种移植模型中通过抗 EGFR 抗体 D1.5 抑制肿瘤生长。
     图 2 显示具有双重特异性的克隆的结合特异性。
     图 3 显示使用选择的具有双重特异性 ( 抗 EGFR/HER3 和抗 EGFR/HER2 抗体 ) 的抗 体抑制 TGF-α- 诱导的 EGFR 磷酸化。
     图 4 显示抗 -EGFR/HER3 抗体阻断调蛋白结合 HER3-ECD-Fc。
     图 5 显示在 MCF7 细胞中通过抗 EGFR/HER3 双特异性抗体抑制 HRG 诱导的受体磷 酸化。
     图 6 显示通过抗 EGFR/HER3 抗体抑制 MDA-175 细胞的细胞增殖。
     本发明一方面提供用作药物的多特异性 HER 抗体。另一方面提供用于治疗癌症， 诸如乳腺癌、 结肠直肠癌、 胰腺癌、 头和颈癌、 黑素瘤、 卵巢癌、 前列腺癌或非小细胞肺癌的 多特异性 HER 抗体。另一方面提供用于抑制 HER 受体的生物学活性的多特异性 HER 抗体。 在一个实施方案中， 所述多特异性 HER 抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构 域。
     本发明另一方面提供用于制备药物的多特异性 HER 抗体。在一个实施方案中， 所 述药物可用于治疗癌症， 诸如乳腺癌、 结肠直肠癌、 胰腺癌、 头和颈癌、 黑素瘤、 卵巢癌、 前列 腺癌或非小细胞肺癌。在一个实施方案中， 所述药物用于抑制 HER 受体的生物学活性。在 一个实施方案中， 所述多特异性 HER 抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域。 在一个实施方案中， 所述多特异性 HER 抗体比传统 EGFR 拮抗剂， 诸如西妥昔单抗毒性更低。
     附图简述
     图 1 显示在 A431 异种移植模型中通过抗 EGFR 抗体 D1.5 抑制肿瘤生长。
     图 2 显示具有双重特异性的克隆的结合特异性。
     图 3 显示使用选择的具有双重特异性 ( 抗 EGFR/HER3 和抗 EGFR/HER2 抗体 ) 的抗 体抑制 TGF-α- 诱导的 EGFR 磷酸化。
     图 4 显示抗 -EGFR/HER3 抗体阻断调蛋白结合 HER3-ECD-Fc。
     图 5 显示在 MCF7 细胞中通过抗 EGFR/HER3 双特异性抗体抑制 HRG 诱导的受体磷 酸化。
     图 6 显示通过抗 EGFR/HER3 抗体抑制 MDA-175 细胞的细胞增殖。
     图 7 是显示在 4D5-Fv 结构上定位的 D1.5-100 热点的图。
     图 8 概述了使用鸟枪文库对于 D1.5-100EGFR-HER3 抗体亲和力成熟的策略。
     图 9 显示两个选择的亲和力成熟的抗体 (DL7 和 DL11) 对于 EGFR 和 HER3 两者是 特异性的。
     图 10 ： A) 显示亲和力成熟的抗体 DL7 和 DL11 与母体抗体 D1.5 对于 EGFR 的抑制 功能的比较。B) 显示亲和力成熟的抗体 DL7 和 DL11 与单特异性抗 HER3 抗体 DL3.6 对于 HER3 反式激活的抑制功能的比较。
     图 11A) 提供图显示 DL11 与培妥珠单抗 (pertuzumab)， 抗 EGFR 抗体， 和抗 HER3 抗 体， 或 DL3.6， D1.5， 或 D1.5+DL3.6 的组合相比对于 H1666 细胞生长抑制功能的比较， 所述 细胞是 NSCLC 细胞系， 表达 HER2， HER3， EGFR 和 EGFR 配体， 生长用 HRG 刺激。B) 提供图显 示 DL11 与培妥珠单抗， 抗 EGFR 抗体和抗 HER3 抗体， 或 DL3.6， D1.5 或 D1.5+DL3.6 的组合 相比对于 H1666HSCLC 系生长抑制功能的比较， 生长用 HRG 和 TGFα 刺激。
     图 12A) 提供图显示通过 DL11 与 pMab， 抗 EGFR 抗体， 和抗 HER3 抗体相比较抑制 HCA-7 细胞的增殖， 该细胞是结肠直肠癌细胞系， 表达 HER2， HER3 和 EGFR。细胞生长用 HRG 刺激。B) 提供图显示如图 12A 中的 HCA-7 细胞生长的抑制， 除了细胞生长用 HRG+TGFα 刺 激。
     图 13 显示 Calu-3 细胞增殖的抑制， 所述细胞是 NSCLC 系， 过表达 HER2 并且具有 正常水平的 HER3 和 EGFR。细胞生长用 HRG 刺激， 抗体以剂量依赖方式测试。
     图 14 概述了对于 D1.5-201 亲和力成熟的分选策略。
     图 15 显示通过 DL11， DL11b 和 DL11f 抑制 MDA-175 细胞增殖。
     图 16 显示 DL11f 抑制调蛋白诱导的 HER3 磷酸化和 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化。
     图 17 是显示在 HCA-7 肿瘤移植模型中通过 DL11 和 DL11f 抑制肿瘤生长的图。
     图 18 是显示在 H358NSCLC 异种移植模型中通过 DL11f 抑制肿瘤生长的图。
     图 19 显示通过 DL3-11b， DL3.6b 和 DL3.6 抑制 HRG 诱导的 HER3 磷酸化。
     图 20 ： 通过 DL3-11b， DL3.6b 和 DL3.6 抑制 MDA-175 细胞增殖。
     图 21 是显示在 FaDu 癌症模型中通过 DL11f 抑制肿瘤生长的图。
     图 22 是显示在 BxPC3 胰腺癌模型中通过 DL11f 抑制肿瘤生长的图。
     图 23 是显示在 Calu-3 非小细胞肺癌模型中通过 DL11f 抑制肿瘤生长的图。
     图 24 是显示在 A431 上皮癌模型中通过 DL11f 抑制肿瘤生长的图。
     图 25 是显示在 MAXF44 乳腺癌模型中通过 DL11f 抑制肿瘤生长的图。
     图 26 是显示在 DU145 前列腺癌模型中通过 DL11f 抑制肿瘤生长的图。
     图 27 是显示在 OVXF550 卵巢癌模型中通过 DL11f 抑制肿瘤生长的图。
     图 28 显示在数个细胞系中 DL11f 诱导 ADCC。
     图 29 显示 DL11f-N297A 缺少 ADCC 活性。
     图 30 显示在 H292NSCLC 癌症模型中通过 DL11f 和 DL11f-N297A 抑制肿瘤生长。
     图 31A-C 是提供关于 EGFR 拮抗剂疗法观察到的非临床和临床毒性信息的表。
     图 32 是提供关于疹 / 脱屑和痤疮 / 痤疮样疹分级信息的表。
     图 33 提供具有 Kabat 编号的数个抗 HER 抗体的重链可变结构域和轻链可变结构 域的氨基酸比对。图 33A 显示下述抗体的轻链可变结构域 ： D1(SEQ ID NO ： 58) ； D1.5(SEQID NO ： 24) ； D1.5-100(SEQ ID NO ： 40) ； DL11(SEQ ID NO ： 27) ； DL11b(SEQ ID NO ： 29) ； DL11f(SEQ ID NO ： 29)。图 33B 显示下述抗体的重链可变结构域 ： D1(SEQ ID NO ： 25) ； D1.5(SEQ ID NO ： 25) ； D1.5-100(SEQ ID NO ： 25) ； DL11(SEQ ID NO ： 28) ； DL11b(SEQ ID NO ： 28) ； DL11f(SEQ ID NO ： 30)。
     发明详述
     I. 定义
     除非另有定义， 本文使用的所有专门术语、 符号和其它科学术语意图具有本发明 所属领域技术人员普遍理解的含义。在一些情况下， 为了清楚和 / 或易于引用， 本文定义了 具有普遍理解含义的术语， 并且本文包含此类定义没有必要解释为其代表了与本领域通常 理解的实质上的差异。 本文中描述或提到的技术和程序一般得到了本领域技术人员的充分 理解， 而且利用常规方法得以普遍采用， 诸如例如下列文献中记载的广泛应用的分子克隆 的方法 ： Sambrook 等人， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual( 分子克隆 ： 实验室指 南 ) 第二版 (1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， N.Y.。 如果合适， 涉及使用市售的试剂盒和试剂的程序一般根据制造商规定的方案和 / 或参数进 行， 除非另有说明。 在描述本发明的方法、 试剂盒及其用途之前， 应当理解本发明不限于所述具体方 法、 方案、 细胞系、 动物种或属、 构建物和试剂， 因为它们当然可以变化。还应当理解本文所 用术语只是为了描述具体实施方案， 并非意图限制本发明的范围， 只有所附权利要求才对 本发明范围进行了限制。
     必须注意的是， 在用于本文及所附权利要求时， 除非上下文另有明确规定， 单数形 式 “一个” 、 “一种” 和 “所述″包括复数所指物。
     在本说明书和权利要求书全文中， 词语 “包括” 或变体诸如 “包含” 或 “含有” ， 应当 理解为意指包括所述的整数 ( 整体 ) 或整数 ( 整体 ) 的组， 但是不排除任何其它整数 ( 整 体 ) 或整数 ( 整体 ) 的组。
     本文中术语 “抗体” 以其最广义使用， 特别是涵盖单克隆抗体、 多克隆抗体、 多特异 性抗体和抗体片段， 只要它们表现出所希望的生物学活性。术语 “多特异性抗体” 以最广义 使用， 具体涵盖包含这样的抗原结合结构域的抗体， 所述抗原结合结构域具有多表位特异 性 ( 即， 能够特异性结合一种生物分子上的两个或多个不同表位或能够特异性结合在两种 或多种不同生物分子上的表位 )。 抗原结合结构域的一个具体实例是 VHVL 单元， 其由重链可 变结构域 (VH) 和轻链可变结构域 (VL) 构成。此类多特异性抗体包括但不限于全长抗体、 具 有两个或多个 VL 和 VH 结构域的抗体、 抗体片段如 Fab、 Fv、 dsFv、 scFv、 双抗体 (diabodies)、 双特异性双抗体和三链抗体 (triabodies)、 已被共价或非共价连接的抗体片段。 “双特异性 抗体” 是包含这样的抗原结合结构域的多特异性抗体， 所述抗原结合结构域能够特异性结 合一个生物分子上的两个不同表位， 或能够特异性结合两个不同生物分子上的表位。双特 异性抗体在本文中也称为具有 “双特异性” 或是 “双特异性的” 。
     在 某 些 实 施 方 案 中， 本 发 明 的 抗 体 对 于 其 靶 标 HER 或 HERs 具 有 的 解 离 常 数 (Kd) ≤ 1μM， ≤ 100nM， ≤ 10nM， ≤ 1nM， ≤ 0.1nM， ≤ 0.01nM， 或≤ 0.001nM( 例如 10-8M 以 下， 例如 10-8M 至 10-13M， 例如， 10-9M 至 10-13M)。
     基本的 4 链抗体单元是由两条相同的轻链 (L) 和两条相同的重链 (H) 构成的异四
     聚体糖蛋白 (IgM 抗体由 5 个基本的异四聚体单元及称作 J 链的另外多肽组成， 因此包含 10 个抗原结合位点 ； 而分泌型 IgA 抗体可聚合形成包含 2-5 个基本的 4 链单元及 J 链的多价 装配物 )。在 IgG 的情况中， 4 链单元通常约 150,000 道尔顿。每条轻链通过一个共价二硫 键与重链相连， 而取决于重链的同种型， 通过一个或多个二硫键彼此连接两条重链。 每条重 链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在 N- 末端具有一个可变结构域 (VH)， 接 着是三个 ( 对于每种 α 和 γ 链 ) 和四个 ( 对于 μ 和 ε 同种型 ) 恒定结构域 (CH)。每条 轻链在 N- 末端具有一个可变结构域 (VL)， 接着是其另一端的一个恒定结构域 (CL)。VL 与 VH 排列在一起， 而 CL 与重链的第一恒定结构域 (CH1) 排列在一起。特定的氨基酸残基被认为 在轻链和重链可变结构域之间形成界面。成对的 VH 和 VL 一起形成一个抗原结合位点。关 于不同类别抗体的结构和性质， 参见如 Basic and Clinical Immunology ( 基本和临床酶 学 )， 第八版， Daniel P.Stites， Abba I.Terr 和 Tristram G.Parslow( 编辑 )， Appleton & Lange， Norwalk， CT， 1994， 第 71 页和第 6 章。
     来自任何脊椎动物物种的轻链， 根据其恒定结构域氨基酸序列， 可归入两种称作 κ 和 λ 的截然不同型中的一种。根据其重链恒定结构域 (CH) 氨基酸序列， 免疫球蛋白可 归入不同的类或同种型。有五类免疫球蛋白 ： IgA、 IgD、 IgE、 IgG 和 IgM， 分别具有称作 α、 δ、 γ、 ε 和 μ 的重链。根据 CH 序列和功能的相对较小差异， γ 和 α 类可进一步分为亚 类， 例如人表达下列亚类 ： IgG1、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA1 和 IgA2。
     术语 “可变的” 指可变结构域中的某些区段在抗体序列中差异广泛的情况。V 结 构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而， 变异性并非均匀分布于 可变结构域跨越的 110 个氨基酸。而 V 区由 15-30 个氨基酸， 称作构架区 (FR) 的相对不 变异的区段及将构架区分开的称作 “高变区” 或 HVR 的极度变异的较短区域组成。天然重 链和轻链的可变结构域各自包含四个 FRs， 它们大多采取 β- 折叠构象， 通过形成环状连接 且在有些情况中形成 β- 折叠结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过 FR 非常接近的保持在一起， 并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成 ( 参 见 Kabat 等， Sequences of Proteins of Immunological Interest ( 免疫学感兴趣的蛋 白质的序列 )， 第五版 .Public Health Service( 公共卫生署 )， National Institutes of Health( 国立卫生研究所 )， Bethesda， MD.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的 结合， 但展现出多种效应子功能， 如在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC) 中抗体的参 与。
     术语 “高变区” 、 “HVR” 或 “HV” 在用于本文时指抗体可变结构域中序列上高度可 变和 / 或形成结构上定义的环的区域。通常， 抗体包含六个 HVR ： 三个在 VH 中 (HVR-H1、 HVR-H2、 HVR-H3)， 三个在 VL 中 (HVR-L1、 HVR-L2、 HVR-L3)。在天然抗体中， H3 和 L3 展示这 六个 HVR 的最大多样性， 而且认为特别是 H3 在赋予抗体以精细特异性中发挥独特作用。参 见例如 Xu 等， 免疫性 (Immunity)13 ： 37-45(2000) ； Johnson 和 Wu 于 ： 分子生物学中的方法 (Methods in Molecular Biology)248 ： 1-25(Lo， 编辑， Human 出版社， Totowa， NJ， 2003)。 事实上， 仅由重链组成的天然存在骆驼科动物 (camelid) 抗体在缺乏轻链时是有功能的且 稳定的。参见例如 Hamers-Casterman 等， 自然 (Nature)363 ： 446-448(1993) ； Sheriff 等， 自然结构生物学 (Nature Struct.Biol.)3 ： 733-736(1996)。
     HVRs 一般包含来自高变环和 / 或 “互补决定区” (CDRs) 的氨基酸残基， 后者具有最高的序列变异性和 / 或参与抗原识别。本文中使用且涵盖许多 HVR 的叙述。Kabat 互 补性决定区 (CDR) 是以序列变异性为基础的， 而且是最常用的 (Kabat 等， 免疫学感兴趣的 蛋白质的序列 (Sequences of Proteins of Immunological Interest)， 第 5 版 . 公共卫 生署 (Public Health Service)， 国立卫生研究所 (National Institutes of Health)， Bethesda， MD.(1991))。Chothia 改为指结构环的位置 (Chothia 和 Lesk 分子生物学杂志 (J.Mol.Biol.)196 ： 901-917(1987))。AbM HVR 代表 Kabat HVR 与 Chothia 结构环之间的 折衷， 而且由 Oxford Molecular 的 AbM 抗体建模软件使用。 “contact” HVR 是以对可获得 的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些 HVR 中每一个的残基。
    HVR 可包括如下 “延伸的 HVR” ： VL 中的 24-36 或 24-34(L1)、 46-56 或 50-56(L2) 和 89-97 或 89-96(L3) 及 VH 中 的 26-35(H1)、 50-65 或 47-65(H2) 和 93-102、 94-102 或 95-102(H3)。对于这些定义中的每一个， 可变结构域残基是依照 Kabat 等， 见上文编号的。
     “构架” 或 “FR” 残基指除本文中所定义的 HVR 残基之外的那些可变结构域残基。
     术语 “依照 Kabat 的可变结构域残基编号方式” 或 “依照 Kabat 的氨基酸位置编号 方式” 及其变化形式指 Kabat 等， 见上文中的用于抗体编制的重链可变结构域或轻链可变 结构域编辑的编号系统。使用此编号系统， 实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨 基酸， 对应于可变结构域 FR 或 HVR 的缩短或插入。例如， 重链可变结构域可包含 H2 的残基 52 后的单一氨基酸插入 ( 依照 Kabat 为残基 52a) 及重链 FR 残基 82 后的插入残基 ( 例如 依照 Kabat 为残基 82a、 82b 和 82c 等 )。给定抗体的残基 Kabat 编号方式可通过将抗体序 列与 “标准” Kabat 编号序列对比同源区来确定。
     Kabat 编号系统一般在提及可变结构域中的残基 ( 大约是轻链的残基 1-107 和 重 链 的 残 基 1-113) 时 使 用 ( 例 如 Kabat 等， 免 疫 学 感 兴 趣 的 序 列 (Sequences of Immunological Interest). 第 5 版 . 公共卫生署 (Public Health Service)， 国立卫生研 究所 (National Institutes of Health)， Bethesda， Md.(1991))。 “EU 编号系统” 或 “EU 索 引” 一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用 ( 例如在 Kabat 等中报道的 EU 索引， 见上文 )。 “如在 Kabat 中所述的 EU 索引” 指人 IgG1EU 抗体的残基编号。除非本文中另有
     说明， 提及抗体可变结构域中的残基编号指根据 Kabat 编号系统的残基编号方式。除非本 文中另有说明， 提及抗体恒定结构域中的残基编号指根据 EU 编号系统的残基编号方式 ( 例 如参见 WO 2006/073941)。
     “亲和力” 是指分子 ( 例如抗体 ) 的单一结合位点与其结合配偶体 ( 例如抗原 ) 之 间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明， 在用于本文时， “结合亲和力” 指反映结 合对的成员 ( 例如抗体与抗原 ) 之间 1 ∶ 1 相互作用的内在结合亲和力。分子 X 对其配偶 体 Y 的亲和力通常可用解离常数 (Kd) 来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测 量， 包括本文中所描述的。
     “亲和力成熟的” 抗体指这样的抗体， 在该抗体的一个或多个 HVRs 或构架区中具 有一处或多处改变、 导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的母体抗体相比有所提 高。在一个实施方案中， 亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的 亲和力。亲和力成熟的抗体可使用本领域已知的某些方法来生成。例如， Marks 等， 生物 / 技术 (Bio/Technology)10 ： 779-783(1992) 记载了通过 VH 和 VL 结构域改组进行的亲和 力成熟。以下文献记载了 HVR 和 / 或构架残基的随机诱变 ： 例如 ： Barbas 等， 美国国家科 学 院 学 报 (Proc.Nat.Acad.Sci.USA)91 ： 3809-3813(1994) ； Schier 等， 基 因 (Gene)169 ： 147-155(1995) ； Yelton 等， 免疫学杂志 (J.Immunol.)155 ： 1994-2004(1995) ； Jackson 等， 免疫学杂志 (J.Immunol.)154(7) ： 3310-9(1995) ； 及 Hawkins 等， 分子生物学杂志 (J.Mol. Biol.)226 ： 889-896(1992)。
     抗体的 “种类” 是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种主要种 类的抗体 ： IgA， IgD， IgE， IgG， 和 IgM， 并且这些中的一些可以进一步分为亚类 ( 同种型 )， 例如 IgG1， IgG2， IgG3， IgG4， IgA1， 和 IgA2。对应于不同种类的免疫球蛋白的重链恒定结构域 分别被称为 α， δ， ε， γ 和 μ。
     术语 “单克隆抗体” 在用于本文时指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体， 即除 了可能的变体 ( 该变体可在产生单克隆抗体的过程中出现， 此类变体通常少量存在 ) 之外， 构成群体的各个抗体基本上相似并结合相同的表位。此类单克隆抗体典型的包括包含结 合靶标的可变区的抗体， 其中该抗体是通过包括从众多抗体中选择该抗体在内的过程得到 的。例如， 选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、 噬菌体克隆或重组 DNA 克隆的集合 中选择独特克隆。应当理解， 所选择的抗体可进一步改变， 例如为了提高对靶标的亲和力、 将抗体人源化、 提高其在细胞培养物中的产量、 降低其在体内的免疫原性、 创建多特异性抗 体等， 而且包含改变后的可变区序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。 除它们的特异性外， 单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语 “单克隆” 表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征， 不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗 体。例如， 将根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成， 包括杂交瘤法 ( 例如， Kohler 等， Nature( 自 然 )， 256 ： 495(1975) ； Harlow 等， 抗体 ： A Laboratory Manual( 抗 体： 实验室指南 )， (Cold Spring Harbor Laboratory Press， 第二版 .1988) ； Hammerling 等， 在： Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas( 单 克 隆 抗 体 和 T 细 胞 杂 交 瘤 )563-681， (Elsevier， N.Y.， 1981) 中、 重组 DNA 法 ( 参见例如， 美国专利 4,816,567)、 噬 菌 体 展 示 技 术 ( 参 见 例 如， Clackson 等， Nature( 自 然 )， 352 ： 624-628(1991) ； Marks 等， J.Mol.Biol.( 分子生物学杂志 )， 222 ： 581-597(1991) ； Sidhu 等， J.Mol.Biol.( 分子生 物 学 杂 志 )338(2) ： 299-310(2004) ； Lee 等， J.Mol.Biol.( 分 子 生 物 学 杂 志 )340(5) ： 1073-1093(2004) ； Fellouse， Proc.Nat.Acad.Sci.USA( 美 国 科 学 院 学 报 )101(34) ： 12467-12472(2004) ；和 Lee 等 J.Immunol.Methods( 免 疫 学 方 法 杂 志 )284(1-2) ： 119-132(2004)、 及用于从具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列 的基因的动物生成人或人样抗体的技术 ( 参见例如， WO98/24893， WO/9634096， WO/9633735 和 WO/9110741， Jakobovits 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美 国 科 学 院 学 报 )， 90 ： 2551(1993) ； Jakobovits 等， Nature( 自 然 )， 362 ： 255-258(1993) ； Bruggemann 等， Year in Immuno.( 免疫学年鉴 )， 7： 33(1993) ； 美国专利 5,545,806、 5,569,825、 5,591,669( 均 为 GenPharm 的 ) ； 5,545,807 ； WO 97/17852、 美国专利 5,545,807 ； 5,545,806 ； 5,569,825 ； 5,625,126 ； 5,633,425 ； 和 5,661,016， 和 Marks 等， Bio/Technology( 生 物 / 技 术 )， 10 ： 779-783(1992) ； Lonberg 等， Nature( 自 然 )， 368 ： 856-859(1994) ； Morrison， Nature( 自 然 )， 368 ： 812-813(1994) ； Fishwild 等， Nature Biotechnology( 自 然 ： 生 物 技 术 )， 14 ： 845-851(1996) ； Neuberger， Nature Biotechnology( 自然 ： 生物技术 )， 14 ： 826(1996) ； 和 Lonberg 和 Huszar， Intern.Rev.Immunol.( 国际免疫学综述 )， 13 ： 65-93(1995)。
     “完整” 抗体是包含抗原结合位点和 CL 以及至少重链恒定结构域 CH1、 CH2 和 CH3 的 抗体。该恒定结构域可以是天然序列恒定结构域 ( 例如人天然序列恒定结构域 ) 或其氨基 酸序列变体。优选地， 该完整抗体具有一种或多种效应子功能。
     “抗体片段” 包含完整抗体的一部分， 优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体 片段的例子包括 Fv、 Fab、 Fab′、 F(ab′ )2、 Fab’ -SH ； 双抗体 ； 线性抗体 ( 参见美国专利 5,641,870， 实施例 2 ； Zapata 等， Protein Eng.( 蛋白质工程 )8(10) ： 1057-1062(1995)) ； 单链抗体分子 ( 例如 scFv)。 在本说明书中以及在说明书全文中， 提及抗体和抗体的多种性 质， 同样的内容也适用于功能性抗体片段， 例如双重作用 Fab 片段。
     “线性抗体” 的表述通常是指 Zapata 等， Protein Eng.( 蛋白质工程 )， 8(10) ： 1057-1062(1995) 描述的抗体。这些抗体包含一对串联的 Fd 片段 (VH-CH1-VH-CH1)， 其与互 补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。 在优选实施方案中， 所述片段是 “功能性的” ， 即在 性质上保留相应完整抗体结合靶标 HER 受体的能力， 并且如果完整抗体还抑制 HER 的活化 或功能， 在性质上也保留此类抑制特性。 在性质上保留意指以同样的方法活性被保留， 但是 结合亲和力和 / 或活性的程度可能不同。
     用木瓜蛋白酶消化抗体产生称作 “Fab” 片段的两个相同的抗原结合片段， 和一个 残余 “Fc” 片段， 其名称反映了它易于结晶的能力。Fab 片段由完整轻链及重链可变结构域 (VH) 和一条重链第一恒定结构域 (CH1) 组成。胃蛋白酶处理抗体产生一个较大 F(ab’ )2 片 段， 它粗略相当于两个通过二硫键相连的 Fab 片段， 具有二价抗原结合活性且仍能够交联 抗原。Fab’ 片段因在 CH1 结构域的羧基末端增加了少数残基 ( 包括来自抗体铰链区的一个 或多个半胱氨酸 ) 而与 Fab 片段有所不同。Fab’ -SH 是本文中对其中恒定结构域的半胱氨 酸残基携带一个游离硫醇基的 Fab’ 的称谓。F(ab’ )2 抗体片段最初是作为成对 Fab’ 片段 生成的， 在 Fab’ 片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
     Fc 片段包含通过二硫键保持在一起的两条重链的羧基末端部分。 抗体的效应子功 能是由 Fc 区中的序列决定的， 该区还是由在某些类型细胞上发现的 Fc 受体 (FcR) 所识别 的部分。“Fv” 由紧密、 非共价结合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二 聚体组成。 从这两个结构域的折叠中突出了六个高变环 ( 重链和轻链各 3 个环 )， 贡献出抗 原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而， 即使是单个可变结构域 ( 或只 包含对抗原特异的三个 HVRs 的半个 Fv) 也具有识别和结合抗原的能力， 尽管亲和力通常低 于完整结合位点。
     “单链 Fv” 也可缩写为 “sFv”或 “scFv” ， 是包含连接成一条多肽链的抗体 VH 和 VL 结构域的抗体片段。优选的是， sFv 多肽在 VH 和 VL 结构域之间还包含多肽接头， 使得 sFv 形成期望的抗原结合结构。关于 sFv 的综述参见 Pluckthun 于 .The Pharmacology of Monoclonal Antibodies( 单克隆抗体药理学 )， vol.113， Rosenburg 和 Moore 编辑， Springer-Verlag， New York， pp.269-315(1994) ； Borrebaeck 1995。
     术语 “双抗体 (diabodies)” 是指如下制备的小抗体片段， 通过使用短接头 ( 大 约 5-10 个残基 ) 在 VH 和 VL 结构域之间构建 sFv 片段 ( 见前段 ) 从而获得该 V 结构域的 链间而非链内配对而产生二价片段， 即具有两种抗原结合位点的片段。双抗体在例如 EP 404,097 ； WO 93/11161 ； 和 Hollinger 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美国科学院学报 )， 90 ： 6444-6448(1993) 中有更充分的描述。 与参照抗体 “结合相同表位的抗体” 是指这样的抗体， 其在竞争测定中阻断 50％以 上的所述参照抗体与其抗原的结合， 反之， 参照抗体在竞争测定中阻断 50％以上的该抗体 与其抗原的结合。
     术语 “嵌合” 抗体是指这样的抗体， 其中一部分重链和 / 或轻链来源于特定来源或 物种， 而剩余的重链和 / 或轻链来源于不同来源或物种。
     “人抗体” 指具有这样的氨基酸序列的抗体， 所述氨基酸序列对应于这样抗体的氨 基酸序列， 所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源， 其利用人抗体库或其它人抗体 编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
     “人共有构架” 是指这样的构架， 即在选择人免疫球蛋白 VL 或 VH 构架序列中， 其 代表最常出现的氨基酸残基。一般而言， 对人免疫球蛋白 VL 或 VH 序列的选择是从可变结 构域序列的亚型中选择。一般而言， 该序列的亚型是如 Kabat 等， Sequences of Proteins of Immunological Interest( 免疫学感兴趣的蛋白质的序列 )， 第五版， NIH Publication 91-3242， Bethesda MD(1991)， 1-3 卷中的亚型。在一个实施方案中， 对于 VL， 该亚型是如 Kabat 等 ( 见上文 ) 中的亚型 κI。在一个实施方案中， 对于 VH， 该亚型是如 Kabat 等 ( 见 上文 ) 中的亚型 III。
     非人 ( 例如啮齿动物 ) 抗体的 “人源化” 形式指最低限度包含衍生自非人抗体的 序列的嵌合抗体。在极大程度上， 人源化抗体指人免疫球蛋白 ( 受体抗体 ) 中的受体的 高变区残基用具有期望抗体特异性、 亲和力和能力的非人物种 ( 供体抗体 ) 诸如小鼠、 大 鼠、 兔或非人灵长类动物的高变区残基替换的人免疫球蛋白。在有些情况中， 将人免疫球 蛋白的构架区 (FR) 残基用相应的非人残基替换。此外， 人源化抗体可包含在受体抗体或 供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言， 人 源化抗体将包含基本上全部的至少一个、 通常两个如下可变结构域， 其中所有或基本上所 有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环， 且所有或基本上所有 FRs 是人免疫球蛋白序列 的 FRs。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区 (Fc)， 通常是人免疫球蛋白
     的恒定区。更多细节参见 Jones 等， Nature( 自然 )321 ： 522-525(1986) ； Riechmann 等， Nature( 自然 )332 ： 323-329(1988) ； 和 Presta， Curr.Op.Struct.Biol.( 结构生物学新观 点 )2 ： 593-596(1992)。
     “结合” 目的抗原的本发明的抗体是这样的抗体， 其与抗原以足够的亲和力结合， 从而该抗体可用作靶向蛋白质或表达该抗原的细胞或组织的诊断和 / 或治疗剂。关于抗体 与靶标分子的结合， 术语 “特异性结合” 或 “特异性结合至” 或 “特异于” 特定多肽或特定多 肽靶标上的表位指可测量出不同于非特异性相互作用的结合。 特异性结合可通过例如测定 分子的结合并与对照分子的结合比较来确定。例如， 特异性结合可通过与对照分子的竞争 来测定， 所述对照分子与靶标相似， 例如与过量的未标记靶标竞争。在这种情况中， 若经标 记靶标与探针的结合受到过量未标记靶标的竞争性抑制， 则指示特异性结合。在一个具体 实施方案中， “特异性” 结合是指抗体与其特定的靶标 HER 受体的结合， 并且不与其它特定 的非 - 靶标 HER 受体结合。例如， 抗体特异性结合 EGFR 和 HER3 但是不特异性结合 HER2 或 HER4， 或抗体特异性结合 EGFR 和 HER2 但是不特异性结合 HER3 或 HER4， 或抗体特异性结合 EGFR 和 HER4 但是不特异性结合 HER2 或 HER3。
     “HER 受体” 是属于 HER 受体家族的受体蛋白酪氨酸激酶， 包括 EGFR(ErbB1， HER1)， HER2(ErbB2)， HER3(ErbB3) 和 HER4(ErbB4) 受体。HER 受体通常将包含胞外结构域， 它可结 合 HER 配体和 / 或与另一个 HER 受体分子二聚化 ； 亲脂性跨膜结构域 ； 保守的胞内酪氨酸激 酶结构域 ； 和含有几个可被磷酸化的酪氨酸残基的羧基末端信号传导结构域。HER 受体可 以是 “天然序列” HER 受体或其 “氨基酸序列变体” 。优选的， HER 受体是天然序列人 HER 受 体。 “HER 途径” 是指由 HER 受体家族介导的信号传导网络。
     术语 “ErbB1” 、 “HER1” 、 “表皮生长因子受体” 和 “EGFR” 在本文中可互换使用， 指例 如 Carpenter 等， Ann.Rev.Biochem.56 ： 881-914(1987) 公开的 EGFR， 包括其天然存在的突 变体形式 ( 如 Ullrich 等， Nature( 自然 )(1984)309 ： 418425 和 Humphrey 等， PNAS(USA)87 ： 4207-4211(1990) 中的缺失突变体 EGFR) 及其变体， 诸如 EGFRvIII。EGFR 的变体也包括缺 失的、 置换的和插入的变体， 例如在 Lynch 等， (New England Journal of Medicine( 新英 格兰医学杂志 )2004， 350 ： 2129)， Paez 等， (Science( 科学 )2004， 304 ： 1497)， 和 Pao 等， (PNAS 2004， 101 ： 13306) 中描述的那些。
     在本文中， “EGFR 胞外结构域” 或 “EGFR ECD” 是指 EGFR 在细胞外的结构域， 锚定 到细胞膜或在循环中， 包括其片段。在一个实施方案中， EGFR 的胞外结构域可包括四个结 构域 ： “结构域 I” ( 氨基酸残基从约 1-158)， “结构域 II” ( 氨基酸残基 159-336)， “结构域 III” ( 氨基酸残基 337-470)， 和 “结构域 IV” ( 氨基酸残基 471-645)， 其中边界是近似的， 可有大约 1-3 个氨基酸的变化。
     表述 “ErbB2”和 “HER2”在本文中可互换使用， 指例如 Semba 等， PNAS(USA)82 ： 6497-6501(1985) 和 Yamamoto 等， Nature( 自然 )319 ： 230-234(1986) 中描述的人 HER2 蛋 白 (GenBank 编号 X03363)。术语 “erbB2” 指编码人 HER2 的基因， “neu” 指编码大鼠 p185neu 的基因。优选的 HER2 是天然序列人 HER2。
     在本文中， “HER2 胞外结构域” 或 “HER2ECD” 是指 HER2 在细胞外的结构域， 锚定 到细胞膜或在循环中， 包括其片段。在一个实施方案中， HER2 的胞外结构域可包含四个
     结构域 ： “结构域 I” ( 氨基酸残基从约 1-195， “结构域 II” ( 氨基酸残基从约 196-319)， “结构域 III” ( 氨基酸残基从约 320-488)， 和 “结构域 IV” ( 氨基酸残基从约 489-630) ( 残基编号不含信号肽 )。参见 Garrett 等， Mol.Cell.( 分子细胞 ).11 ： 495-505(2003)， Cho 等， Nature( 自 然 )421 ： 756-760(2003)， Franklin 等， Cancer Cell( 癌 细 胞 )5 ： 317-328(2004)，和 Plowman 等， Proc.Natl.Acad.Sci.( 美 国 国 家 科 学 院 学 报 )90 ： 1746-1750(1993)。
     “ErbB3”和 “HER3”指 例 如 美 国 专 利 5,183,884 和 5,480,968 以 及 Kraus 等， PNAS(USA)86 ： 9193-9197(1989) 中公开的受体多肽。
     在本文中， “HER3 胞外结构域” 或 “HER3ECD” 是指 HER3 在细胞外的结构域， 锚定到 细胞膜或在循环中， 包括其片段。在一个实施方案中， HER3 的胞外结构域可包含四个结构 域： 结构域 I， 结构域 II， 结构域 III， 和结构域 IV。 在一个实施方案中， HER3ECD 包含氨基酸 1-636( 编号包括信号肽 )。在一个实施方案中， HER3 结构域 III 包含氨基酸 328-532( 编 号包括信号肽 )。
     术语 “ErbB4″和 “HER4” 在本文中是指例如在欧洲专利申请 599,274 ； Plowman 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美国国家科学院学报 )， 90 ： 1746-1750(1993) ； 和 Plowman 等， Nature( 自然 )， 366 ： 473-475(1993) 中公开的受体多肽， 包括其同种型， 例如在 1999 年 4 月 22 日公布的 WO99/19488 中所公开的。
     “HER 配体”指结合和 / 或活化 HER 受体的多肽。本文中特别感兴趣的 HER 配 体是天然序列人 HER 配体， 诸如表皮生长因子 (EGF)(Savage 等， J.Biol.Chem.( 生物化 学杂志 )247 ： 7612-7621(1972)) ； 转化生长因子 α(TGF-α)(Marquardt 等， Science( 科 学 )223 ： 1079-1082(1984)) ； 双 调 蛋 白， 又 称 为 神 经 鞘 瘤 (schwanoma) 或 角 质 形 成 细 胞 自 分 泌 生 长 因 子 (Shoyab 等， Science( 科 学 )243 ： 1074-1076(1989) ； Kimura 等， Nature( 自然 )348 ： 257-260(1990) ； 和 Cook 等， Mol.Cell.Biol.( 分子细胞生物学 )11 ： 2547-2557(1991)) ； β 动 物 纤 维 素 (Shing 等， Science( 科 学 )259 ： 1604-1607(1993) ； 和 Sasada 等， Biochem.Biophys.Res.Commun.190 ： 1173(1993)) ； 肝素结合表皮生长因子 (HB-EGF)(Higashiyama 等， Science( 科学 )251 ： 936-939(1991)) ； epiregulin(Toyoda 等， J.Biol.Chem.( 生 物 化 学 杂 志 )270 ： 7495-7500(1995) ； 和 Komurasaki 等， Oncogene( 癌 基因 )15 ： 2841-2848(1997)) ； 调蛋白 ( 见下文 ) ； 神经调节蛋白 -2(NRG-2)(Carraway 等， Nature( 自 然 )387 ： 512-516(1997)) ； 神 经 调 节 蛋 白 -3(NRG-3)(Zhang 等， Proc.Natl. Acad.Sci.( 美 国 国 家 科 学 院 学 报 )94 ： 9562-9567(1997)) ； 神 经 调 节 蛋 白 -4(NRG-4) (Harari 等， Oncogene( 癌基因 )18 ： 2681-89(1999)) ； 和 cripto(CR-1)(Kannan 等， J.Biol. Chem.( 生物化学杂志 )272(6) ： 3330-3335(1997))。 结合 EGFR 的 HER 配体包括 EGF， TGF-α， 双调蛋白， β 动物纤维素， HB-EGF 和 epiregulin。结合 HER3 的 HER 配体包括调蛋白和 NRG-2。能够结合 HER4 的 HER 配体包括 β 动物纤维素， epiregulin， HB-EGF， NRG-2， NRG-3， NRG-4， 和调蛋白。
     “调蛋白” (HRG) 在用于本文时指由调蛋白基因产物编码的多肽， 如美国专利 5,641,869， 或 Marchionni 等， Nature( 自然 )， 362 ： 312-318(1993) 所公开的。调蛋白的 例子包括调蛋白 -α、 调蛋白 -β1、 调蛋白 -β2 和调蛋白 -β3(Holmes 等， Science( 科 学 )， 256 ： 1205-1210(1992) ； 及 美 国 专 利 5,641,869) ； neu 分 化 因 子 (NDF)(Peles 等，Cell( 细 胞 )69 ： 205-216(1992)) ； 乙 酰 胆 碱 受 体 诱 导 活 性 (ARIA)(Falls 等， Cell( 细 胞 )72 ： 801-815(1993)) ； 神 经 胶 质 生 长 因 子 (GGFs)(Marchionni 等， Nature( 自 然 )， 362 ： 312-318(1993)) ； 感 觉 和 运 动 神 经 元 衍 生 因 子 (SMDF)(Ho 等， J.Biol.Chem.( 生 物 化学杂志 )270 ： 14523-14532(1995)) ； γ- 调蛋白 (Schaefer 等， Oncogene( 癌基因 )15 ： 1385-1394(1997))。
     “HER 二聚体” 在本文中指包含至少两个 HER 受体的非共价结合二聚体。当表达 两种或多种 HER 受体的细胞暴露于 HER 配体时可形成此类复合物， 可通过免疫沉淀进行 分离并通过 SDS-PAGE 进行分析， 如例如 Sliwkowski 等， J.Biol.Chem.( 生物化学杂志 )， 269(20) ： 14661-14665(1994) 所述。其它蛋白质， 诸如细胞因子受体亚基 ( 如 gp130) 可与 所述二聚体结合。
     “HER 异二聚体” 在本文中是指包含至少两个不同 HER 受体的非共价结合异二聚 体， 诸如 EGFR-HER2， EGFR-HER3， EGFR-HER4， HER2-HER3 或 HER2-HER4 异二聚体。
     “HER 抑制剂” 是干扰 HER 活化或功能的试剂。 HER 抑制剂的实例包括 HER 抗体 ( 例 如 EGFR， HER2， HER3， 或 HER4 抗体 ) ； EGFR- 靶向药物 ； 小分子 HER 拮抗剂 ； HER 酪氨酸激酶 抑制剂 ； HER2 和 EGFR 双重酪氨酸激酶抑制剂诸如拉帕替尼 (lapatinib)/GW572016 ； 反义 分子 ( 参见例如 WO2004/87207) ； 和 / 或结合下游信号传导分子诸如 MAPK 或 AKt 或干扰它 们的功能的试剂。优选地， HER 抑制剂是结合 HER 受体的抗体。
     “HER 二聚化抑制剂” 或 “HDI” 是抑制 HER 同二聚体或 HER 异二聚体形成的试剂。 优选地， HER 二聚化抑制剂是抗体。然而， HER 二聚化抑制剂也包括肽和非肽小分子， 和抑制 HER 同二聚体或异二聚体形成的其它化学实体。
     “抑制 HER 二聚化” 的抗体是这样的抗体， 其抑制或干扰 HER 二聚体的形成， 而不论 其根本机制。在一个实施方案中， 此类抗体在 HER2 的异二聚化结合位点结合 HER2。二聚 化抑制抗体的一个特别实例是培妥珠单抗 (Pmab) 或 MAb 2C4。HER 二聚化抑制剂的其它实 例包括结合 EGFR 并抑制其与一个或多个其它 HER 受体二聚化的抗体 ( 例如 EGFR 单克隆抗 体 806， MAb 806， 其结合活化的或 “未束缚的” EGFR， 参见 Johns 等， J.Biol.Chem.( 生物化 学杂志 )279(29) ： 30375-30384(2004)) ； 结合 HER3 并抑制其与一个或多个其它 HER 受体二 聚化的抗体 ； 结合 HER4 并抑制其与一个或多个其它 HER 受体二聚化的抗体 ； 肽二聚化抑制 剂 ( 美国专利 6,417,168) ； 反义二聚化抑制剂等。
     用于本文中时， “EGFR 拮抗剂” 或 “EGFR 抑制剂” 是指特异性结合 EGFR 并阻止或 降低其信号传导活性， 并且不特异性结合 HER2， HER3， 或 HER4 的那些化合物。这类试剂的 实例包括结合 EGFR 的抗体和小分子。结合 EGFR 的抗体的实例包括 MAb 579(ATCC CRL HB 8506)， MAb 455(ATCC CRL HB8507)， MAb 225(ATCC CRL 8508)， MAb 528(ATCC CRL 8509) ( 参见， 美国专利 4,943,533， Mendelsohn 等 ) 及其变体， 如嵌合化 225(C225 或西妥昔单 抗 (Cetuximab) ； ) 和改型的人 225(H225)( 参见， WO 96/40210， Imclone Systems Inc.) ； IMC-11F8， 一种全长人的 EGFR 靶向抗体 (Imclone) ； 结合 II 型 突变体 EGFR 的抗体 ( 美国专利 5,212,290) ； 结合 EGFR 的人源化和嵌合抗体， 如美国专 利 5,891,996 中所描述的 ； 及结合 EGFR 的人抗体， 如 ABX-EGF 或帕尼单抗 (Panitumumab) ( 参 见 WO98/50433， Abgenix/Amgen) ； EMD 55900(Stragliotto 等 Eur.J.Cancer( 欧 洲 癌 症 杂 志 )32A ： 636-640(1996)) ； EMD7200( 马 妥 珠 单 抗 (matuzumab))， 一 种 针 对 EGFR 的人源化 EGFR 抗体， 其与 EGF 和 TGF-α 二者竞争 EGFR 结合 ； (EMD/Merck) ； 人 EGFR 抗体， HuMax-EGFR(GenMab) ； 已知为 E1.1， E2.4， E2.5， E6.2， E6.4， E2.11， E6.3 和 E7.6.3 并且 在 US 6,235,883 中描述的完整人抗体 ； MDX-447(Medarex Inc) ； 和 mAb 806 或人源化 mAb 806(Johns 等， 生 物 化 学 杂 志 (J.Biol.Chem.)279(29) ： 30375-30384(2004))。 抗 -EGFR 抗体可缀合细胞毒性剂， 从而产生免疫缀合物 ( 参见， 例如 EP659,439A2， Merck Patent GmbH)。EGFR 拮抗剂包括小分子， 诸如在下述各项中描述的化合物 ： 美国专利 5,616,582， 5,457,105 ， 5,475,001 ， 5,654,307 ， 5,679,683 ， 6,084,095 ， 6,265,410 ， 6,455,534 ， 6,521,620 ， 6,596,726 ， 6,713,484 ， 5,770,599 ， 6,140,332 ， 5,866,572 ， 6,399,602 ， 6,344,459， 6,602,863， 6,391,874， 6,344,455， 5,760,041， 6,002,008， 和 5,747,498， 以 及下述 PCT 公布 ： WO98/14451， WO98/50038， WO99/09016， 和 WO99/24037。具体的小分子 EGFR 拮抗剂包括 OSI-774(CP-358774， 厄洛替尼 (erlotinib)， Genentech/OSI 制 药 公 司 (OSI Pharmaceuticals)) ； PD 183805(CI 1033， 2- 丙 烯 酰 胺， N-[4-[(3- 氯 -4- 氟 苯 基 ) 氨 基 ]-7-[3-(4- 吗 啉 基 ) 丙 氧 基 ]-6- 喹 唑 啉 基 ]-， 二 盐酸盐， 辉瑞公司 (Pfizer Inc.)) ； ZD1839， 吉非替尼 (gefitinib) 易瑞沙 4-(3’ - 氯 -4’ - 氟 苯 胺 基 )-7- 甲 氧 基 -6-(3- 吗 啉 代 丙 氧 基 ) 喹 唑 啉， 阿斯利康 (AstraZeneca)) ； ZM105180((6- 氨 基 -4-(3- 甲 基 苯 基 - 氨 基 )- 喹 唑 啉， Zeneca) ； BIBX-1382(N8-(3- 氯 -4- 氟 - 苯基 )-N2-(1- 甲基 - 哌啶 -4- 基 )- 嘧啶并 [5， 4-d] 嘧啶 -2， 8- 二胺， Boehringer Ingelheim) ； PKI-166((R)-4-[4-[(1- 苯基乙基 ) 氨基 ]-1H- 吡咯并 [2， 3-d] 嘧啶 -6- 基 ]- 苯酚 ) ； (R)-6-(4- 羟基苯基 )-4-[(1- 苯基乙基 ) 氨基 ]-7H- 吡 咯并 [2， 3-d] 嘧啶 ) ； CL-387785(N-[4-[(3- 溴苯基 ) 氨基 ]-6- 喹唑啉基 ]-2- 丁炔酰胺 (butynamide)) ； EKB-569(N-[4-[(3- 氯 -4- 氟 苯 基 ) 氨 基 ]-3- 氰 基 -7- 乙 氧 基 -6- 喹 啉 基 ]-4-( 二 甲 基 氨 基 )-2- 丁 烯 酰 胺 )(Wyeth) ； AG1478(Sugen) ； 和 AG1571(SU 5271 ； Sugen).
     “HER 抗体” 是结合 HER 受体的抗体。任选地， HER 抗体还干扰 HER 活化或功能。 具体的 HER2 抗体包括培妥珠单抗和曲妥珠单抗。具体 EGFR 抗体的实例包括西妥昔单抗 (cetuximab) 和帕尼单抗 (panitumumab)。
     涉及 HER 抗体的专利公开包括 ： US 5,677,171， US 5,720,937， US 5,720,954， US 5,725,856， US 5,770,195， US 5,772,997， US 6,165,464， US 6,387,371， US 6,399,063， US2002/0192211A1 ， US 6,015,567 ， US 6,333,169 ， US 4,968,603 ， US 5,821,337 ， US 6,054,297， US 6,407,213， US 6,719,971， US 6,800,738， US2004/0236078A1， US 5,648,237， US 6,267,958， US 6,685,940， US 6,821,515， WO98/17797， US 6,333,398， US 6,797,814， US 6,339,142， US 6,417,335， US 6,489,447， WO99/31140， US2003/0147884A1， US2003/0170234A1 ，US2005/0002928A1 ，US 6,573,043 ，US2003/0152987A1 ， WO99/48527 ， US2002/0141993A1 ， WO01/00245 ， US2003/0086924 ， US2004/0013667A1 ， WO00/69460， WO01/00238， WO01/15730， US 6,627,196B1， US 6,632,979B1， WO01/00244， US2002/0090662A1 ， WO01/89566 ， US2002/0064785 ， US2003/0134344 ， WO 04/24866 ， US2004/0082047， US2003/0175845A1， WO03/087131， US2003/0228663， WO2004/008099A2， US2004/0106161， WO2004/048525， US2004/0258685A1， US 5,985,553， US 5,747,261， US 4,935,341， US 5,401,638,US 5,604,107， WO 87/07646， WO 89/10412， WO 91/05264，EP 412,116 B1， EP 494,135 B1， US 5,824,311， EP 444,181 B1， EP 1,006,194 A2， US 2002/0155527A1， WO 91/02062， US 5,571,894， US 5,939,531， EP 502,812 B1， WO 93/03741 ， EP 554,441 B1 ， EP 656,367 A1 ， US 5,288,477 ， US 5,514,554 ， US 5,587,458， WO 93/12220， WO 93/16185， US 5,877,305， WO 93/21319， WO 93/21232， US 5,856,089， WO 94/22478， US 5,910,486， US 6,028,059， WO 96/07321， US 5,804,396， US 5,846,749， EP 711,565， WO 96/16673， US 5,783,404， US 5,977,322， US 6,512,097， WO 97/00271， US 6,270,765， US 6,395,272， US 5,837,243， WO 96/40789， US 5,783,186， US 6,458,356， WO 97/20858， WO 97/38731， US 6,214,388， US 5,925,519， WO 98/02463， US 5,922,845， WO 98/18489， WO 98/33914， US 5,994,071， WO 98/45479， US 6,358,682 B1， US 2003/0059790， WO 99/55367， WO 01/20033， US 2002/0076695A1， WO 00/78347， WO 01/09187， WO01/21192， WO01/32155， WO01/53354， WO01/56604， WO 01/76630， WO02/05791， WO 02/11677， US 6,582,919， US2002/0192652A1， US 2003/0211530A1， WO 02/44413， US 2002/0142328， US 6,602,670 B2， WO 02/45653， WO 02/055106， US 2003/0152572， US 2003/0165840 ，WO02/087619 ，WO03/006509 ，WO03/012072 ，WO 03/028638 ，US 2003/0068318， WO 03/041736， EP1,357,132， US 2003/0202973， US 2004/0138160， US 5,705,157， US 6,123,939， EP 616,812 B1， US 2003/0103973， US 2003/0108545， US 6,403,630 B1， WO 00/61145， WO 00/61185， US 6,333,348B1， WO 01/05425， WO 01/64246， US 2003/0022918， US 2002/0051785A1， US 6,767,541， WO 01/76586， US 2003/0144252， WO 01/87336 ， US 2002/0031515A1 ， WO 01/87334 ， WO 02/05791 ， WO 02/09754 ， US 2003/0157097， US 2002/0076408， WO 02/055106， WO 02/070008， WO 02/089842 和 WO 03/86467。
     “HER 活化” 是指任一种或多种 HER 受体的活化或磷酸化。一般而言， HER 活化导 致信号转导 ( 例如由 HER 受体胞内激酶结构域磷酸化 HER 受体或底物多肽中的酪氨酸残基 所导致 )。HER 活化可由 HER 配体结合包含目的 HER 受体的 HER 二聚体介导。结合 HER 二 聚体的 HER 配体可活化二聚体中一种或多种 HER 受体的激酶结构域， 从而导致一种或多种 HER 受体中酪氨酸残基的磷酸化和 / 或另外的底物多肽 ( 诸如 Akt 或 MAPK 胞内激酶 ) 中酪 氨酸残基的磷酸化。
     “磷酸化” 是指向蛋白质 ( 诸如 HER 受体或其底物 ) 添加一个或多个磷酸基。
     HER2 上的 “异二聚化结合位点” 是指 HER2 的胞外结构域中的区， 其在与 EGFR， HER3 或 HER4 形成二聚体时接触 EGFR， HER3 或 HER4 的胞外结构域中的区或与其相互作用。发现 所述区在 HER2 的结构域 II 中。Franklin 等， Cancer Cell( 癌细胞 )5 ： 317-328(2004)。
     “结合 HER2 的异二聚化结合位点” 的 HER2 抗体与结构域 II 中的残基结合 ( 并且 任选地也结合 HER2 胞外结构域的其它结构域如结构域 I 和 III 中的残基 )， 能够至少在一 定程度上在空间上阻碍 HER2-EGFR， HER2-HER3， 或 HER2-HER4 异二聚体的形成。Franklin 等， Cancer Cell( 癌细胞 )5 ： 317-328(2004) 表征了 HER2- 培妥珠单抗晶体结构， 其存放在 RCSB 蛋白质数据库 (RCSB Protein Data Bank)(ID 编号 IS78) 中， 描述了结合 HER2 的异二 聚化结合位点的示例性抗体。
     “结合 HER2 的结构域 II” 的抗体结合结构域 II 中的残基， 并且任选地结合 HER2 的其它结构域如结构域 I 和 III 中的残基。在用于描述本文中所公开的各种抗体时， “分离的” 指已经鉴定且从其表达所在的 细胞或细胞培养物中分开和 / 或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指通常会干扰该多 肽的诊断或治疗用途的物质， 可包括酶、 激素、 和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。 在优选的实施方案中， 将该抗体纯化至 (1) 足以通过使用转杯式测序仪获得至少 15 个残基 的 N- 末端或内部氨基酸序列的程度， 或 (2) 根据使用考马斯蓝 ( 或优选银染 ) 非还原性或 还原性条件下的 SDS-PAGE 达到同质。由于多肽天然环境的至少一种成分不会存在， 因此分 离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而， 分离的多肽通常通过至少一个纯化步骤来制 备。在一些实施方案中， 多特异性抗 HER 抗体是分离的抗体。
     术语 “控制序列” 指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的 DNA 序列。例如， 适于原核生物的控制序列包括启动子、 任选的操纵基因序列、 和核糖体结合位 点。已知真核细胞能利用启动子、 多腺苷酸化信号、 和增强子。
     若核酸与另一核酸序列处于功能性关系中， 则该核酸是 “可操作连接” 的。例如， 若前序列或分泌前导序列的 DNA 表达成参与多肽分泌的前蛋白， 则它与该多肽的 DNA 可操 作连接 ； 若启动子或增强子影响编码序列的转录， 则它与该序列可操作连接 ； 或者， 若核糖 体结合位点的位置促进翻译， 则它与编码序列可操作连接。通常， “可操作连接″指相连的 DNA 序列是邻接的， 而且在分泌前导序列的情况中指邻接且处于阅读框中。然而， 增强子不 必邻接。连接可通过在方便的限制性位点处的连接反应来实现。如果没有此类位点， 那么 可依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
     关于参照多肽序列的 “百分比 (％ ) 氨基酸序列同一性” ， 定义为将候选序列与参 照多肽序列在进行序列比对 ( 并在必要时导入空隙 ) 以获取最大百分比序列同一性， 且不 将任何保守置换视为序列同一性的部分之后， 候选序列中的氨基酸残基与参照多肽序列中 的氨基酸残基相同的百分数。可使用本领域技术内的各种方法进行序列比对以便测定氨 基酸序列同一性百分比， 例如， 使用公众可得到的计算机软件如 BLAST、 BLAST-2、 ALIGN 或 Megalign(DNASTAR) 软件。 本领域技术人员可以决定比对序列的适宜参数， 包括对所比较的 序列全长获得最大比对所需的任何算法。 然而， 为此目的， 氨基酸序列同一性％值使用序列 比较计算机程序 ALIGN-2 产生。ALIGN-2 序列比对计算机程序的作者是 Genentech， Inc.， 该源代码已经随用户文档提交至美国版权局 (Washington D.C.， 20559)， 其美国版权注册 登记号为 TXU510087。公众可通过 Genentech， Inc.(South San Francisco， 加利福尼亚 ) 得到 ALIGN-2 程序， 或者可以从该源代码进行编译。 ALIGN-2 程序应当为在 UNIX 操作系统， 包括在数字 UNIXV4.0D 上使用而进行编译。ALIGN-2 程序设定了所有序列比对参数并且不 变。
     在 ALIGN-2 应用于氨基酸序列比较的情况中， 给定氨基酸序列 A 相对于 (to)、 与 (with)、 或针对 (against) 给定氨基酸序列 B 的氨基酸序列同一性％ ( 或者这样说 ： 给定氨 基酸序列 A 具有或含有相对于、 与或针对给定氨基酸序列 B 的某一％氨基酸序列同一性 ) 如下计算 ：
     X/Y 比值乘以 100，
     其中 X 是用序列比对程序 ALIGN-2 在该程序的 A 和 B 比对中评分为相同匹配的氨 基酸残基数， 且其中 Y 是 B 中的氨基酸残基总数。可以理解， 当氨基酸序列 A 与氨基酸序列 B 的长度不相等时， A 相对于 B 的氨基酸序列同一性％将不等于 B 相对于 A 的氨基酸序列同一性％。除非另外特别指出， 如在紧前面的段落中所述， 使用 ALIGN-2 计算机程序获得在本 文中所用的所有的％氨基酸序列同一性的值。
     杂交反应的 “严格性” 可以容易地由本领域普通技术人员确定， 而且通常凭经验根 据探针长度、 洗涤温度、 和盐浓度来计算。 通常， 较长的探针要求较高的温度以正确退火， 而 较短的探针需要较低的温度。 杂交通常依赖于互补链存在于低于其解链温度的环境中时变 性 DNA 重新退火的能力。探针和可杂交序列之间所期望的同源性程度越高， 可使用的相对 温度也越高。 因此可以认为， 较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格， 而较低温度也就 较不严格。关于杂交反应严格性的其它细节和解释， 参见 Ausubel 等， Current Protocols in Molecular Biology ( 现代分子生物学实验方案 )， Wiley Interscience Publishers， (1995)。
     本文中所定义的 “严格条件”或 “高严格性条件”可如下确定 ： (1) 采用低离子 强度和高温进行洗涤， 例如 0.015M 氯化钠 /0.0015M 柠檬酸钠 /0.1 ％十二烷基硫酸钠， 50℃ ； (2) 在杂交过程中采用变性剂， 诸如甲酰胺， 例如 50％ (v/v) 甲酰胺及 0.1％牛血清 白蛋白 /0.1％ Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮 /50mM 磷酸钠缓冲液 pH 6.5， 其含 750mM 氯 化钠、 75mM 柠檬酸钠， 42℃ ； 或 (3) 在采用 50％甲酰胺、 5XSSC(0.75M NaCl， 0.075M 柠檬酸 钠 )、 50mM 磷酸钠 (pH 6.8)、 0.1 ％焦磷酸钠、 5X Denhardt 氏溶液、 超声波处理的鲑鱼精 DNA(50μg/ml)、 0.1 ％ SDS、 和 10 ％硫酸右旋糖苷的溶液中于 42 ℃杂交过夜， 并在 42 ℃于 0.2XSSC( 氯化钠 / 柠檬酸钠 ) 中洗涤 10 分钟， 接着在含 EDTA 的 0.1XSSC 中于 55℃进行 10 分钟高严格性洗涤。 “中等严格条件″可以如 Sambrook 等， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual ( 分子克隆 ： 实验室指南 )， New York ： Cold Spring Harbor Press， 1989 所述来鉴定， 包括 使用比上文所述较不严格的洗涤溶液和杂交条件 ( 例如温度、 离子强度和％ SDS)。中等严 格条件的一个例子是于 37℃在含 20％甲酰胺、 5XSSC(150mM NaCl， 15mM 柠檬酸三钠 )、 50mM 磷酸钠 (pH 7.6)、 5X Denhardt 氏溶液、 10％硫酸右旋糖苷、 和 20mg/ml 变性剪切的鲑鱼精 DNA 的溶液中温育过夜， 接着在 1XSSC 中于约 37-50℃洗涤滤膜。技术人员将认识到如何根 据需要来调整温度、 离子强度等以适应诸如探针长度等因素。
     抗体 “效应子功能” 指那些可归于抗体 Fc 区 ( 天然序列 Fc 区或氨基酸序列变体 Fc 区 ) 的生物学活性， 且其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的例子包括 ： C1q 结合 和补体依赖性细胞毒性 ； Fc 受体结合 ； 抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC) ； 吞噬作用 ； 细胞表面受体 ( 例如 B 细胞受体 ) 的下调 ； 和 B 细胞活化。
     “抗体依赖性细胞介导的细胞毒性” 或 “ADCC” 指如下细胞毒性形式， 其中某些细胞 毒性细胞 ( 例如天然杀伤 (NK) 细胞、 嗜中性粒细胞和巨噬细胞 ) 上存在的 Fc 受体 (FcRs) 所结合的分泌型 Ig 使这些细胞毒性效应细胞特异性结合携带抗原的靶细胞， 随后用细胞 毒素杀死该靶细胞。所述抗体 “武装” 细胞毒性细胞， 而且绝对是这类杀伤所必需的。介 导 ADCC 的 主 要 细 胞 (NK 细 胞 ) 只 表 达 FcγRIII， 而 单 核 细 胞 表 达 FcγRI、 FcγRII 和 FcγRIII。Ravetch 和 Kinet， Annu.Rev.Immunol.( 免疫学年度评论 )9 ： 457-92(1991) 的 464 页表 3 总结了造血细胞上的 FcR 表达。 为了评估目的分子的 ADCC 活性， 可进行体外 ADCC 测定法， 诸如美国专利 5,500,362 或 5,821,337 中所记载的。可用于此类测定法的效应细 胞包括外周血单核细胞 (PBMC) 和天然杀伤 (NK) 细胞。备选地或额外地， 可在体内评估目
     的分子的 ADCC 活性， 例如在动物模型中， 诸如 Clynes 等 (Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.( 美 国科学院学报 ))95 ： 652-656(1998) 所披露的。
     “Fc 受体” 或 “FcR” 描述与抗体 Fc 区结合的受体。优选的 FcR 是天然序列的人 FcR。此外， 优选的 FcR 是与 IgG 抗体结合的 FcR(γ 受体 )， 而且其包括 FcγRI， FcγRII 和 FcγRIII 亚类的受体， 包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII 受体包括 FcγRIIA(“活化受体” ) 和 FcγRIIB(“抑制受体” )， 它们具有相似的氨基酸序列， 区别 主要在于其胞质结构域。活化受体 FcγRIIA 在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨 酸的活化基序 (ITAM)。抑制受体 FcγRIIB 在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸 的抑制基序 (ITIM)( 参见综述 M.in Annu.Rev.Immunol.( 免疫学年度评论 )15 ： 203-234(1997))。FcR 的综述参见 Ravetch 和 Kinet， Annu.Rev.Immunol.( 免疫学年度评 论 )9 ： 457-492(1991) ； Capel 等， Immunomethods( 免疫方法 )4 ： 25-34(1994) ； 和 de Haas 等， J.Lab.Clin.Med.( 实验室临床医学杂志 )126 ： 330-41(1995)。术语 “FcR” 在本文中涵 盖其它 FcR， 包括未来将会鉴定的 FcR。该术语还包括新生儿受体 (FcRn)， 它负责将母体的 IgG 转移给胎儿 (Guyer 等， J.Immunol.( 免疫学杂志 )117 ： 587(1976) 和 Kim 等， J.Immunol. ( 免疫学杂志 )24 ： 249(1994))。
     “人效应细胞” 指表达一种或多种 FcR 并执行效应子功能的白细胞。优选的是， 该 细胞至少表达 FcγRIII 并执行 ADCC 效应子功能。介导 ADCC 的人白细胞的例子包括外周 血单核细胞 (PBMc)、 天然杀伤 (NK) 细胞、 单核细胞、 细胞毒性 T 细胞和嗜中性粒细胞 ； 其中 优选 PBMC 和 NK 细胞。效应细胞可以从天然来源， 例如从血液分离。
     “补体依赖性细胞毒性” 或 “CDC”指存在补体时靶细胞的溶解作用。经典补体 途径的激活是由补体系统第一组分 (C1q) 结合与其同族抗原结合的 ( 适当子类的 ) 抗体 起始的。为了评估补体激活， 可进行 CDC 测定法， 例如 Gazzano-Santoro 等， J.Immunol. Methods( 免疫学方法杂志 )202 ： 163(1996) 所记载的。
     用于本文时， “治疗 (treatment)” ( 及其语法变体， 诸如 “treat” 或 “treating” ) 指在尝试改变待治疗的个体的天然进程中的临床介入， 并且可以为了预防或在临床病理学 的进程中进行。 治疗的理想效果包括但不限于防止疾病发生或复发， 缓和症状， 消除疾病的 任何直接或间接病理学后果， 预防转移， 减少疾病进展速率， 改善或减轻疾病状态和症状缓 解或改善的预后。在一些实施方案中， 本发明的抗体用于延迟疾病的发生或延缓疾病的进 展。 术语 “治疗有效量” 指治疗受试者中疾病或病症的抗体或抗体片段的量。对于肿 瘤 ( 例如癌性肿瘤 )， 抗体或抗体片段的治疗有效量可减少癌细胞数量 ； 减小原发性肿瘤大 小； 抑制 ( 即减慢到一定程度并优选停止 ) 癌细胞浸润到周围器官中 ； 抑制 ( 即减慢到一定 程度并优选停止 ) 肿瘤转移 ； 在一定程度抑制肿瘤生长 ； 和 / 或在一定程度上缓解一或多 种与病症相关的症状。抗体或抗体片段在达到可以预防现存癌细胞生长和 / 或杀死现存癌 细胞的程度时， 其可为细胞生长抑制性和 / 或细胞毒性的。对于癌症治疗， 体内效力可以通 过， 例如评价存活期、 疾病进展时间 (TTP)、 应答率 (RR)、 应答期、 和 / 或生活质量来测量。
     “减小或抑制” 的意思是导致优选地 20％或更高、 更优选地 50％或更高、 并且最优 选地 75％、 85％、 90％、 95％、 或更高的总体降低。减小或抑制可以涉及在治疗的病症的症 状、 转移灶的存在或大小、 原发性肿瘤的大小、 或血管源性病症中血管的大小或数目。
     术语 “癌症” 和 “癌性” 是指或者描述哺乳动物中一般特征在于细胞生长不受调控 的生理学状态。这种定义包含良性和恶性癌症。 “癌症早期” 的意思是无侵袭性或转移性的 癌症， 或分类为 0、 I、 或 II 期的癌症。
     术语 “癌前” 是指一般在癌症之前或发展成癌症的状态或生长。
     “非转移性” 是指癌症是良性的， 或保持在原发位点并且未侵入淋巴或血管系统或 原发位点以外的其它组织。一般而言， 非转移性癌症是 0、 I、 或 II 期癌症中的任何癌症， 并 且有时是 III 期癌症。
     “药用载体” 是指药物制剂中不同于活性成分的成分， 其对受试者是无毒的。药用 载体包括但不限于缓冲剂、 赋形剂、 稳定剂或防腐剂。
     术语 “抗癌治疗” 是指有效用于治疗癌症的治疗。抗癌治疗剂的实例包括， 但不限 于， 例如， 化疗剂、 生长抑制剂、 细胞毒性剂、 放射性治疗中所用的试剂、 抗血管发生剂、 细胞 凋亡剂、 抗微管蛋白剂和其它治疗癌症的试剂， 抗 -CD20 抗体， 血小板来源的生长因子抑制 TM 剂 ( 例如， Gleevec ( 甲磺酸伊马替尼 (Imatinib Mesylate)))， COX-2 抑制剂 ( 例如， 塞来 考昔 (celecoxib))， 干扰素， 细胞因子， 结合下述一种或多种靶标的拮抗剂 ( 例如， 中和抗 体)： EGFR， ErbB2， ErbB3， ErbB4， PDGFR-beta， BlyS， APRIL， BCMA 或 VEGF 受体， TRAIL/Apo2， 和其它生物活性和有机化学剂等。它们的组合也包含在本发明中。
     “化 疗 剂”是 有 效 用 于 治 疗 癌 症 的 化 合 物。 化 疗 剂 的 实 例 包 括 烷 基 化 试 剂，如 塞 替 哌 (thiotepa) 和 环 磷 酰 胺 (cyclosphosphamide) 烷 基 磺 酸 酯 (alkyl sulfonates) 如 白 消 安 (busulfan)， 英 丙 舒 凡 (improsulfan) 和 哌 泊 舒 凡 (piposulfan) ； 吖 丙 啶 类 (aziridines) 如 苯 佐 替 派 (benzodopa)、 卡波 醌 (carboquone)、美 妥 替 哌 (meturedopa) 和 乌 瑞 替 哌 (uredopa) ； 乙撑亚胺类 (ethylenimines) 和甲基蜜胺类 (methylamelamines)， 包括六甲蜜胺 (altretamine)、 曲 他 胺 (triethylenemelamine)、 三 亚 乙 基 磷 酰 胺 (triethylenephosphoramide)、 三乙烯 硫 代 磷 酸 胺 (triethylenethiophosphoramide) 和 三 羟 甲 蜜 胺 (trimethylomelamine) ； 聚 乙 酸 类 (acetogenins)( 特 别 是 布 拉 他 辛 (bullatacin) 和 布 拉 他 辛 酮 (bullatacinone)) ； Δ-9- 四 氢 大 麻 酚 (delta-9-tetrahydrocannabinol)( 屈 大 麻 酚 (dronabinol)、 )； β- 拉 帕 醌 (beta-lapachone) ； 拉 帕 醇 (lapachol) ； 秋 水 仙 碱 (colchicines) ； 桦 木 酸 (betulinic acid) ； 喜 树 碱 (camptothecin)( 包 括 合 成 的 类 似 物 托 泊 替 康 (topotecan) (irinotecan) CPT-11( 伊 立 替 康 乙 酰 喜 树 碱 (acetylcamptothecin)、 scopolectin和 9- 氨 基 喜 树 碱 (9-aminocamptothecin)) ； 苔 藓 抑 素 (bryostatin) ； callystatin ； CC-1065( 包括其阿多来新 (adozelesin)、 卡折来新 (carzelesin) 和比折来新 (bizelesin) 合成类似物 )； 鬼 臼 毒 素 (podophyllotoxin) ； 鬼 臼 酸 (podophyllinic acid) ； 替尼 泊 苷 (teniposide) ； 隐 藻 素 类 (cryptophycins)( 特 别 是 隐 藻 素 1 和 隐 藻 素 8) ； 多 拉 司 他 汀 (dolastatin) ； 倍 癌 霉 素 (duocarmycin)( 包 括 合 成 的 类 似 物、 KW-2189 和 CB1-TM1) ； 艾 榴 素 (eleutherobin) ； pancratistatin ； 匍 枝 珊 瑚 醇 (sarcodictyin) ； 海 绵 素 (spongistatin) ； 氮 芥 (nitrogen mustards) 如 苯 丁 酸 氮 芥 (chlorambucil)、 萘 氮 芥 (chlornaphazine)、 胆 磷 酰 胺 (chlorophosphamide)、 雌 莫 司 汀 (estramustine)、 异 环 磷 酰 胺 (ifosfamide)、 氮 芥 (mechlorethamine)、 盐 酸 氧 氮 芥 (mechlorethamineoxide hydrochloride)、美 法 仑 (melphalan)、新 氮 芥 (novembichin)、苯 芥 胆 甾 醇 (phenesterine)、 泼 尼 莫 司 汀 (prednimustine)、 曲 磷 胺 (trofosfamide)、 尿嘧啶氮 芥 (uracil mustard) ； 亚 硝 基 脲 类 (nitrosoureas) 如 卡 莫 司 汀 (carmustine)、氯 脲 菌 素 (chlorozotocin)、 福 莫 司 汀 (fotemustine)、 洛 莫 司 汀 (lomustine)、 尼莫司 汀 (nimustine) 和 雷 莫 司 汀 (ranimnustine) ； 抗 生 素 如 烯 二 炔 类 (enediyne) 抗 生 素 ( 例 如 加 利 车 霉 素 (calicheamicin)， 尤 其 是 加 利 车 霉 素 γ1I 和 加 利 车 霉 素 ωIl( 参 见 例 如 Nicolaou 等， Angew， Chem.Intl.Ed.Engl.33 ： 183-186(1994)) ； CDP323( 一 种 口 服 α-4 整 合 素 抑 制 剂 ) ； 烯 二 炔 蒽 环 类 抗 生 素 (dynemicin)， 包括烯二炔蒽环 类抗生素 A； 埃 斯 波 霉 素 (esperamicin) ； 以 及 新 制 癌 菌 素 (neocarzinostatin) 生 色 团 和 相 关 色 素 蛋 白 烯 二 炔 类 抗 生 素 生 色 团 )、 阿 克 拉 霉 素 (aclacinomysins)、 放 线 菌 素 (actinomycin)、 蒽 霉 素 (authramycin)、 偶 氮 丝 氨 酸 (azaserine)、 博来霉素 (bleomycins)、放 线 菌 素 C(cactinomycin)、 carabicin、洋 红 霉 素 (carminomycin)、 嗜 癌 霉 素 (carzinophilin)、 色 霉 素 (chromomycins)、 放 线 菌 素 D(dactinomycin)、 柔 红 霉 素 (daunorubicin)、 地 托 比 星 (detorubicin)、 6- 重 氮 -5- 氧 代 -L- 正 亮 氨 酸 (6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、 多 柔 比 星 (doxorubicin)( 包 括 吗 啉 代 - 多 柔 比 星 (morpholino-doxorubicin)、氰 基 吗 啉 代 - 多 柔 比 星 (cyanomorpholino-doxorubicin)、 2- 吡 咯 啉 - 多 柔 比 星 (2-pyrrolino-doxorubicin)、 盐酸多柔比星脂质体注射剂 聚乙二醇化脂质体多柔比星 脂 质 体 多 柔 比 星 TLC D-99 和 脱 氧 多 柔 比 星 (deoxydoxorubicin))、 表柔 比 星 (epirubicin)、 依 索 比 星 (esorubicin)、 伊 达 比 星 (idarubicin)、 马塞罗霉素 (marcellomycin)、 丝 裂 霉 素 类 (mitomycins) 如 丝 裂 霉 素 C、 麦 考 酚 酸 (mycophenolic acid)、 诺 拉 霉 素 (nogalamycin)、 橄 榄 霉 素 (olivomycins)、 培 洛 霉 素 (peplomycin)、 紫 菜 霉 素 (porfiromycin)、 嘌 呤 霉 素 (puromycin)、 三 铁 阿 霉 素 (quelamycin)、 罗多比 星 (rodorubicin)、 链 黑 霉 素 (streptonigrin)、 链 佐 星 (streptozocin)、 杀结核菌素 (tubercidin)、 乌 苯 美 司 (ubenimex)、 净 司 他 丁 (zinostatin)、 佐 柔 比 星 (zorubicin) ； 抗 代 谢 物 如 甲 氨 喋 呤 (methotrexate)、 吉 西 他 滨 (gemcitabine) 氟 (tegafur) 卡 培 他 滨 (capecitabine) 替加 epothilone和 5- 氟 尿 嘧 啶 (5-fluorouracil)(5-FU) ； 叶 酸 类 似 物 如 二 甲 叶 酸 (denopterin)、 甲 氨 喋 呤、 喋 罗 呤 (pteropterin)、 三 甲 曲 沙 (trimetrexate) ； 嘌呤类似物如氟达拉 滨 (fludarabine)、 6- 巯 嘌 呤 (6-mercaptopurine)、 硫 咪 嘌 呤 (thiamiprine)、 硫鸟嘌 呤 (thioguanine) ； 嘧 啶 类 似 物 如 安 西 他 滨 (ancitabine)、 阿 扎 胞 苷 (azacitidine)、 6- 氮 尿 苷 (6-azauridine)、卡 莫 氟 (carmofur)、阿 糖 胞 苷 (cytarabine)、双 脱 氧 尿 苷 (dideoxyuridine)、去 氧 氟 尿 苷 (doxifluridine)、依 诺 他 滨 (enocitabine)、 氟 尿 苷 (floxuridine) ； 雄 激 素 类， 诸 如 卡 鲁 睾 酮 (calusterone)、 丙酸屈他雄酮 (dromostanolone propionate)、 环 硫 雄 醇 (epitiostanol)、 美 雄 烷 (mepitiostane)、 睾 内酯 (testolactone) ； 抗肾上腺药 (anti-adrenals) 如氨鲁米特 (aminoglutethimide)、 米 托 坦 (mitotane)、 曲 洛 司 坦 (trilostane) ； 叶 酸 补 偿 剂 如 亚 叶 酸 (frolinic acid) ； 醋 葡 醛 内 酯 (aceglatone) ； 羟 醛 磷 酰 胺 配 糖 (aldophosphamide glycoside) ； 5- 氨 基 酮 戊 酸 (aminolevulinic acid) ； 恩 尿 嘧 啶 (eniluracil) ； 安 吖 啶 (amsacrine) ；bestrabucil ； 比 生 群 (bisantrene) ； 依 达 曲 沙 (edatraxate) ； defofamine ； 秋水仙 胺 (demecolcine) ；地 吖 醌 (diaziquone) ； elfornithine ；依 利 醋 铵 (elliptinium acetate ； 埃坡霉素 (epothilone) ； 依托格鲁 (etoglucid) ； 硝酸镓 (gallium nitrate) ； 羟 基 脲 (hydroxyurea) ； 香 菇 多 糖 (lentinan) ； 氯 尼 达 明 (lonidainine) ； 美登木素生 物 碱 类 (maytansinoids) 如 美 登 素 (maytansine) 和 安 丝 菌 素 (ansamitocins) ； 米托 胍 腙 (mitoguazone) ； 米 托 蒽 醌 (mitoxantrone) ； 莫 哌 达 醇 (mopidanmol) ； 尼曲吖啶 (nitraerine) ； 喷司他丁 (pentostatin) ； 异丙嗪 (phenamet) ； 吡柔比星 (pirarubicin) ； 洛索蒽醌 (losoxantrone) ； 2- 乙基酰肼 (2-ethylhydrazide) ； 丙卡巴肼 (procarbazine) ； 多 糖 复 合 物 (JHS Natural Products(JHS 天 然 产 品 )， Eugene， OR) ； 雷佐生 (razoxane) ； 利索新 (rhizoxin) ； 西佐喃 (sizofiran) ； 锗螺胺 (spirogermanium) ； 细交 链孢菌酮酸 (tenuazonic acid) ； 三亚胺醌 (triaziquone) ； 2， 2’ ， 2’ - 三氯三乙胺 (2， 2’ ， 2” -trichlorotriethylamine) ； 单端孢霉烯族化合物 (trichothecenes)( 特别是 T-2 毒 素、 verracurin A、 杆孢菌素 A(roridin A) 和蛇形菌素 (anguidine)) ； 乌拉坦 (urethan) ； 长 春 地 辛 (vindesine) 达 卡 巴 嗪 (dacarbazine) ； 甘 露 莫 司 汀 (mannomustine) ； 二 溴 甘 露 醇 (mitobronitol) ； 二 溴 卫 矛 醇 (mitolactol) ； 哌 泊 溴 烷 (pipobroman) ； gacytosine ； 阿 糖 胞 苷 (arabinoside)(“Ara-C” )； 塞替哌 (thiotepa) ； 紫杉烷类化合物 (taxoid)， 例如紫杉醇 (paclitaxel) 的白蛋白改造的纳米颗粒制剂 (ABRAXANETM) 和多西他塞 (docetaxel) 苯丁酸氮芥 (chloranbucil) ； 6- 硫鸟嘌呤 (6-thioguanine) ； 巯嘌呤 (mercaptopurine) ； 甲 氨 喋 呤 ；铂 药 剂 如 顺 铂 (cisplatin)，奥 沙 利 铂 (oxaliplatin)( 例 如， 和 卡 铂 (carboplatin) ； 防 止 微 管 蛋 白 聚 合 形 成 微 管 的 vincas， 包括 长 春 碱 (vinblastine) vindesine 长 春 新 碱 (vincristine) 和长春瑞滨 (vinorelbine) 紫杉醇依托泊苷 (etoposide)(VP-16) ； 异环磷酰胺 (ifosfamide) ； 米托蒽醌 (mitoxantrone) ； leucovorin ； 诺 安 托 (novantrone) ； 依 达 曲 沙 (edatrexate) ； 道 诺 霉 素 (daunomycin) ； 氨 基 喋 呤 (aminopterin) ； 伊 班 膦 酸 盐 (ibandronate) ； 拓 扑 异 构 酶 抑 制 剂 RFS 2000 ； 二 氟 甲 基 鸟 氨 酸 (difluoromethylornithine)(DMFO) ； 类 视 黄 酸 类 (retinoids)， 诸如 视 黄 酸 (retinoic acid)， 包 括 贝 沙 罗 汀 (bexarotene) (bisphosphonates) 如 氯 膦 酸 盐 (clodronate)( 例 如， 替膦酸盐 (etidronate) 来 膦 酸 盐 (zoledronate) 帕米膦酸盐 (pamidronate) 或 二膦酸盐类 )、 依NE-58095、 唑来膦酸 (zoledronic acid)/ 唑 阿 仑 膦 酸 盐 (alendronate) 替鲁膦酸盐 (tiludronate) 或利塞膦酸盐 (risedronate) 曲沙他滨 (troxacitabine)(1， 3- 二氧戊环核 苷胞嘧啶类似物 ) ； 反义寡核苷酸， 特别是抑制在涉及异常细胞增殖的信号传导途径中基 因的表达的那些， 诸如例如， PKC-α、 Raf、 H-Ras 和表皮生长因子受体 (EGF-R) ； 疫苗诸如 疫苗和基因治疗疫苗、 例如， 疫苗、 疫苗和 如， 疫苗 ； 拓扑异构酶 1 抑制剂 ( 例如 rmRH ( 例 BAY439006( 索 拉 非 尼 (sorafenib) ； Bayer) ； SU-11248( 舒 尼 替 尼(sunitinib)， (bortezomib)Pfizer) ； 哌立福辛 (perifosine)， COX-2 抑制剂 ( 例如塞来 CCI-779 ； 替 匹 法 尼 (tipifarnib)(R11577) ； orafenib， 匹考昔 (celecoxib) 或艾托考昔 (etoricoxib))， 蛋白体抑制剂 ( 例如 PS341) ； 硼替佐米 ABT510 ； Bcl-2 抑 制 剂 诸 如 奥 利 美 生 钠 (oblimersensodium)蒽 醌 (pixantrone) ； EGFR 抑 制 剂 ( 参 见 下 文 定 义 ) ； 酪氨酸激酶抑制剂 ( 参见下文定 义)； 丝氨酸 - 苏氨酸激酶抑制剂诸如雷帕霉素 (rapamycin)( 西罗莫司 (sirolimus)， 法 尼 基 转 移 酶 抑 制 剂 诸 如 氯 那 法 尼 (lonafarnib)(SCH 6636， 和以上任一种的药用盐、 酸或衍生物 ； 以及以上两种以上的组合， 诸如 CHOP， SARASAR ) ； 即 环 磷 酰 胺、 多 柔 比 星、 长 春 新 碱、 和 泼 尼 松 龙 (prednisolone) 的 组 合 疗 法 的 缩 写 ； 和 FOLFOX， 即 关 于 与 5-FU 和 亚 叶 酸 (leucovorin) 组 合 的 奥 沙 利 铂 (oxaliplatin) (ELOXATINTM) 的治疗方案的缩写。
     本文定义的化疗剂包括 “抗激素剂”或 “内分泌治疗剂” ， 其作用为调节、 降低、 阻断或抑制可促进癌生长的激素效果。它们自身可以是激素。包括， 但不限于具有混合 的 激 动 剂 / 拮 抗 剂 模 式 的 抗 雌 激 素 类， 包 括 他 莫 昔 芬 (tamoxifen) 4- 羟基他莫西芬， 托瑞米芬 (toremifene) 洛 昔 芬 (droloxifene)， 雷 洛 昔 芬 (raloxifene) 激素类， 如氟维司群 (fulvestrant) 艾多昔芬 (idoxifene)， 屈 曲 沃 昔 芬 (trioxifene)， 和 EM800( 所述药剂可以阻断雌激素TMkeoxifene， 和选择性雌激素受体调控物类 (SERM) 如 SERM3， 不具有激动剂性质的纯的抗雌 受体 (ER) 二聚化， 抑制 DNA 结合， 增加 ER 更新和 / 或抑制 ER 水平 ) ； 芳香酶抑制剂包括类 固醇芳香酶抑制剂如福美坦 (formestane) 和益西美坦 (exemestane) 和 非 类 固 醇 芳 香 酶 抑 制 剂 如 阿 那 曲 唑 (anastrazole) (letrozole) 伏氯唑 (vorozole) 德 (leuprolide) 和 醋酸甲地孕酮 (megestrol acetate) 戈 舍 瑞 林 (goserelin)，布 舍 瑞 林 来曲唑 和氨鲁米特 (aminoglutethimide)， 和其它芳香酶抑制剂包括法 倔 唑 (fadrozole)， 和 4(5)- 咪 唑 ； 促 性 腺 激 素 释 放 激 素 激 动 剂， 包括亮丙立 (buserelin)， 和曲普瑞林 (tripterelin) ； 性类固醇， 包括黄体酮 (progestines) 如醋酸 甲 地 孕 酮 (megestrol acetate) 和 醋 酸 甲 羟 孕 酮 (medroxyprogesterone acetate)， 雌 激素如己烯雌酚 (diethylstilbestrol) 和普罗马林 (premarin)， 和雄激素 / 类视黄醇 如氟甲睾酮 (fluoxymesterone)， 所有的反式视黄酸 (transretionic acid) 和芬维 A 胺 (fenretinide) ； 奥 那 司 酮 (onapristone) ； 抗 黄 体 酮 (anti-progesterones) ； 雌激素受 体下调剂 (ERDs) ； 抗雄激素如氟他胺 (flutamide)， 尼鲁米特 (nilutamide) 和比卡鲁胺 (bicalutamide) ； 上述任一种的药用盐、 酸或衍生物， 以及上述两种以上的组合。
     “受试者” 是脊椎动物， 优选哺乳动物， 更优选为人。哺乳动物包括但不限于人、 非 人高等灵长类动物、 灵长类动物、 家畜 ( 如牛 )、 竞技动物、 宠物 ( 如猫、 狗和马 ) 和实验室动 物 ( 如小鼠和大鼠 )。
     II. 详细描述
     本发明提供抗体和功能性抗体片段， 其包含至少一个抗原结合结构域， 所述抗原 结合结构域对至少两种不同 HER 受体， 特别是 EGFR 和 HER2， EGFR 和 HER3， 或 EGFR 和 HER4具有结合特异性。这些多特异性抗体不同于传统多特异性抗体， 后者具有带有不同结合特 异性的抗原结合结构域 ( 通常两个 )。在某些实施方案中， 本文描述的多特异性抗体具有 IgG( 或 Fab) 的分子结构， 因此保留了 IgG 对于治疗开发有利的属性， 诸如可预测的药物代 谢动力学性质， 充分确立的制备方案， Fc 介导的效应子功能的选择， 和二价或单价。在通过 组装两个不同抗体片段成一个分子获得的传统多特异性抗体中， 这些有利属性常常是缺失 的。
     在本文中描述的多特异性抗体及其功能性抗体片段有效用于治疗与 HER 受体途 径相关的疾病或病症， 诸如癌症。 在一个具体的实施方案中， 多特异性抗体的抗原结合结构 域特异性结合 EGFR 和 HER3 两者。在另一个实施方案中， 抗原结合结构域特异性结合 EGFR 和 HER2 两者。在另一个实施方案中， 抗原结合结构域特异性结合 EGFR 和 HER4 两者。
     本发明的一个特别方面提供包含两个 ( 或多个 ) 抗原结合结构域的抗体， 其中每 个具有相同的结合特异性。
     一个实施方案提供包含两个抗原结合结构域的多特异性抗体， 其中每个抗原结合 结构域具有相同的特异性， 并且特异性结合两个不同 HER 受体。在一个具体的实施方案中， 每个抗原结合结构域特异性结合 EGFR 和 HER3 两者。 在另一个实施方案中， 每个抗原结合结 构域特异性结合 EGFR 和 HER2 两者。在另一个实施方案中， 每个抗原结合结构域特异性结 合 EGFR 和 HER4 两者。在又一个实施方案中， 每个抗原结合结构域特异性结合 EGFR 的结构 域 III。在另一个实施方案中， 每个抗原结合结构域特异性结合 HER3 的结构域 III。在又 一个实施方案中， 每个抗原结合结构域能够结合 EGFR 的结构域 III 和 HER3 的结构域 III。
     在具体的实施方案中， 多特异性抗体特异性结合其一个靶标 HER 受体或多个 HER 受体， 并且不特异性结合非靶标 HER 受体。因此， 在一个实施方案中， 多特异性抗体特异性 结合 EGFR 和 HER3 但是不特异性结合 HER2 或 HER4。在另一个实施方案中， 多特异性抗体特 异性结合 EGFR 和 HER2 但是不特异性结合 HER3 或 HER4。在另一个实施方案中， 多特异性抗 体特异性结合 EGFR 和 HER4 但是不特异性结合 HER2 或 HER3。
     在某些实施方案中， 每个抗原结合结构域包含重链可变结构域 (VH) 和轻链可变结 构域 (VL)。在一个实施方案中， 所述 VHVL 单元特异性结合两种不同 HER 受体。在一个具体 的实施方案中， 所述 VHVL 单元特异性结合 EGFR 和 HER3。在另一个实施方案中， 所述 VHVL 单 元特异性结合 EGFR 和 HER2。 在另一个实施方案中， 所述 VHVL 单元特异性结合 EGFR 和 HER4。
     在具体的实施方案中， 多特异性抗体对于其一个靶标 HER 受体或多个受体的亲和 力通过下述 Kd 表示， 所述 Kd 低于 10-5M， 低于 10-6M， 低于 10-7M， 低于 10-8M， 低于 10-9M， 低于 -10 -11 -12 10 M， 低于 10 M， 或低于 10 M。在一个实施方案中， 抗体对于其靶标受体之一的 Kd 低于 -7 -8 -9 -10 -11 10 M， 低于 10 M， 低于 10 M， 低于 10 M， 低于 10 M， 或低于 10-12M。在另一个实施方案中， 多特异性抗体对于其所有靶标受体的 Kd 低于 10-7M， 低于 10-8M， 低于 10-9M， 低于 10-10M， 低于 -11 -12 10 M， 或低于 10 M。
     在一些实施方案中， 多特异性抗体对于其靶标 HER 受体之一的亲和力大于对于其 另外一个靶标 HER 受体或多个受体的亲和力。在一个实施方案中， 多特异性抗体对于一 个靶标 HER 受体的亲和力比其对于另一个靶标 HER 受体的亲和力高至少 2， 3， 4， 5， 8， 10， 12， 15， 18， 20， 22， 25， 30， 35， 40， 50， 100- 倍。在一个实施方案中， 多特异性抗体特异性结合 EGFR 和另一个 HER 受体， 并且其对于另一个 HER 受体的结合亲和力比其对于 EGFR 的亲和力高至少 2， 3， 4， 5， 8， 10， 12， 15， 18， 20， 22， 25， 30， 35， 40， 50， 或 100- 倍。在一个实施方案中， 多特异性抗体特异性结合 EGFR 和 HER3， 并且其对于 HER3 的结合亲和力比其对于 EGFR 的结 合亲和力高至少 2， 3， 4， 5， 8， 10， 12， 15， 18， 20， 22， 25， 30， 35， 40， 50， 或 100- 倍。 在另一个实 施方案中， 多特异性抗体特异性结合 EGFR 和 HER2， 并且其对于 HER2 的结合亲和力比其对 于 EGFR 的结合亲和力高至少 2， 3， 4， 5， 8， 10， 12， 15， 18， 20， 22， 25， 30， 35， 40， 50， 或 100- 倍。 在另一个实施方案中， 多特异性抗体特异性结合 EGFR 和 HER4， 并且其对于 HER4 的结合亲 和力比其对于 EGFR 的亲和力高至少 2， 3， 4， 5， 8， 10， 12， 15， 18， 20， 22， 25， 30， 35， 40， 50， 或 100- 倍。
     在一些实施方案中， 本发明的多特异性抗体抑制它们特异性结合的 HER 受体中的 至少一个的生物学活性。在一些实施方案中， 本发明的多特异性抗体抑制它们特异性结合 的两个 HER 受体的生物学活性。因此， 例如， 本发明的多特异性抗体抑制 EGFR 和 / 或 HER2 和 / 或 HER3 和 / 或 HER4 受体的生物学活性。
     在一个实施方案中， 多特异性抗体特异性结合人 EGFR 和人 HER3， 并且抑制至少 EGFR 的生物学活性。在另一个实施方案中， 多特异性抗体特异性结合人 EGFR 和人 HER3， 并 且抑制至少 HER3 的生物学活性。在另一个实施方案中， 多特异性抗体特异性结合人 EGFR 和人 HER3， 并且抑制 EGFR 和 HER3 两者的生物学活性。
     在另一个实施方案中， 多特异性抗体特异性结合人 EGFR 和人 HER2， 并且抑制至少 EGFR 的生物学活性。在又一个实施方案中， 抗体特异性结合人 EGFR 和人 HER2， 并且抑制至 少 HER2 的生物学活性。 在又一个实施方案中， 抗体特异性结合人 EGFR 和人 HER2， 并且抑制 EGFR 和 HER2 两者的生物学活性。
     在另一个实施方案中， 抗体特异性结合人 EGFR 和人 HER4， 并且抑制至少 EGFR 的 生物学活性。在另一个实施方案中， 抗体特异性结合人 EGFR 和人 HER4， 并且抑制至少 HER4 的生物学活性。 在另一个实施方案中， 抗体特异性结合人 EGFR 和人 HER4， 并且抑制 EGFR 和 HER4 两者的生物学活性。
     在某些实施方案中， 本文的抗体抑制至少部分地由它们不结合的 HER 受体驱动的 生物学活性。例如， 结合 EGFR 和 HER3 的抗体可能仍然能够抑制 HER2 驱动的生物学活性。
     生物学活性的抑制可在本领域熟知的测定法中测量。 因此， 例如， 本文的抗体可抑 制一个或多个 HER 受体的磷酸化， 和 / 或可抑制 HER 配体结合其受体， 和 / 或可抑制配体诱 导的 HER 受体表达细胞的增殖和 / 或可抑制通过 HER 受体活化的下游信号传导途径。
     应答 EGFR 磷酸化活化的两个主要下游信号传导途径是 Ras/MAPK 和磷脂酰肌醇 3- 激酶 (PI3K)/Akt 途径。因此， 本文的抗体抑制 HER 受体的生物学活性的能力可通过， 例 如在 NR6 细胞中， 评估其是否能够阻断这些途径的活化来测量。因此， 可测量抗体阻断配体 诱导的 p44/42MAPK， pAKT 或其它下游信号传导分子的磷酸化的能力。HER3 信号传导也参 与数个其它途径， 包括 c-met 和 FGFR。本文的抗体抑制 HER 受体的生物学活性的能力可通 过评估其是否能够阻断这些途径的活化来测量。
     本发明一方面提供多特异性抗体， 其如下产生， 即使对一个 HER 受体具有特异性 的抗体多样化， 从而该抗体对第二个 HER 受体产生特异性， 同时保留对所述第一个 HER 受体 的特异性。总体而言， 这种方法包括步骤 (1) 使抗体的轻链可变结构域 (VL) 的氨基酸序列 多样化， 其中在所述多样化之前， 所述抗体包含 VL 和能够结合第一 HER 受体上的表位的重链可变结构域 (VH)， 和 (2) 选择能够结合第一 HER 受体上的表位和第二 HER 受体上的表位 的多样化的抗体。 这些步骤可重复， 以便产生多特异性抗体。 在美国专利申请 20080069820 中提供了这种方法的详细描述， 其全文通过引用明确并入本文。这种方法在实施例中进一 步说明。在实施例中描述的方法中， 抗 EGFR 抗体用作进行多样化的模板， 并且因此用于制 备多特异性抗 HER 抗体， 然而， 其它抗 HER 抗体， 诸如抗 HER2， 抗 HER3 或抗 HER4 抗体也可用 作模板。
     本发明还提供单特异性抗体， 其能够特异性结合一个 HER 受体但不特异性结合其 它 HER 受体。在一个实施方案中， 所述抗体特异性结合 EGFR。在一个实施方案中， 所述抗 体特异性结合 EGFR 的结构域 III。在一些实施方案中， 所述抗体特异性结合 EGFR 并且抑 制 EGFR 的生物学活性。在另一个实施方案中， 所述抗体特异性结合 HER3。在一个实施方 案中， 所述抗体特异性结合 HER3 的结构域 III。在一些实施方案中， 所述抗体特异性结合 HER3 并且抑制 HER3 的生物学活性。
     所述单特异性抗体可用作模板抗体， 用于进一步多样化， 以便添加对其它 HER 受 体或对其它靶抗原的结合特异性。
     毒性
     EGFR 拮 抗 剂 的 毒 性 在 临 床 前 和 临 床 研 究 中 均 有 许 多 文 件 记 载。 例 如， 在治 疗 有 效 水 平， 抗 EGFR 抗 体 西 妥 昔 单 抗 显 示 多 种 形 式 的 毒 性。 西 妥 昔 单 抗 ( 爱 必 妥 Imclone) 最常见的副反应 ( 发病率≥ 25 ％ ) 是皮肤的副反应 ( 包 括疹， 瘙痒和指甲改变 )， 头痛， 腹泻和感染。西妥昔单抗治疗相关的最严重有害反应 是 输 液 反 应 (infusion reactions)， 心 肺 功 能 停 止 (cardiopulmonary arrest)， 皮肤 病 学 毒 性 (dermatologic toxicity) 和 放 射 性 皮 炎 (radiation dermatitis)， 脓毒症 (sepsis)， 肾衰竭 (renal failure)， 间质性肺炎 (interstitial lung disease) 和肺栓子 (pulmonary embolus)。参见， 对于西妥昔单抗的生物制品许可协议 (Biologics License Agreement(BLA))( 申请号 ： 125084)( 通过引用并入本文 )。对于帕尼单抗 Amgen) 观察到类似的毒性问题， 其中在 89％的施用这种抗体的患者中发生皮肤病学毒性。 这些毒性是严重的， CTC 3 级以及更高。
    FDA 标签。)已 经 报 道 在 一 些 例 子 中 抗 EGFR 化 疗 剂 厄 洛 替 尼 (erlotinib) 导 致 急 性 肾 衰 竭 (acute renal failure) 或 肾 机 能 不 全 (renal insufficiency)， 肝 衰 竭 (hepatic failure) 和 / 或 肝 肾 综 合 征 (hepatorenal syndrome)， 胃 肠 穿 孔 (gastrointestinal perforations)， 大疱 (bullous) 和表皮脱落皮肤病症 (exfoliative skin disorders) 和 角膜溃疡形成和穿孔 (corneal ulceration and perforation)。参见， FDA 关于厄洛替尼 Genentech， OSI Pharmaceuticals) 的警告和预防 (Warnings and Precautions) 安全标签 (2009)。“毒性的” 或 “毒性” 是指施用给受试者的药剂导致的任何副作用。毒性的测量 包括但不限于死亡率 (mortality)、 体重减轻 (loss of body weight)、 器官衰竭 (organ failure)、 改 变 器 官 功 能 (altered organ function)、 中 枢 神 经 系 统 毒 性 (central nervous system toxicity)、 胃肠毒性 (gastrointestinal toxicity)( 例如， 表现为腹 泻 (diarrhea))、 皮肤病学毒性 (dermatologic toxicity)( 例如， 表现为出现疹 (rash)、 心脏毒性 (cardiac 皮肤损害 (skin lesion)、 脱屑 (desquamation) 或瘙痒 (pruritus))，
     toxicity)、 感染 (infection)、 脓毒症 (sepsis) 和细胞毒性 (cytotoxicity)。
     毒 性 可 通 过 本 领 域 已 知 的 方 法 确 定， 诸 如 监 测 临 床 护 架 旁 观 察 (clinical cageside observation)、 体重、 食物消耗、 呼吸率、 脉搏血氧定量法测量、 体格检查、 眼评 价、 神经病学评价、 代谢参数、 心血管参数、 临床病理学 ( 包括临床化学、 血液学、 尿分析和 凝固参数 ) 和肉眼检查病理学和显微镜病理学。
     国家癌症研究所 (National Cancer Institute) 制作的不良事件常用术语标准 (The Common Terminology Criteria for Adverse Events)v3.0(CTCAE)( 其全文通过引 用并入本文 ) 提供了关于在人受试者中具体可接受的毒性指标的信息。图 31 提供了关于 EGFR 拮抗剂疗法观察到的非临床和临床毒性的信息。
     毒性可根据总毒性事件或一个毒性事件 / 多个毒性事件的严重性进行测量。事件 的严重性可使用 CTCAE 中建立的分级系统来描述。对每个不良事件使用唯一的严重性临床 描述进行分级， 这是基于下述一般准则 ： 1 级是指轻度事件。2 级是指中度事件， 3 级是指严 重事件， 4 级是指威胁生命或致残事件， 5 级是指死亡相关的事件。CTCAE 提供了对于毒性 事件的具体临床描述。对皮肤病学毒性的描述词从 CTCAE， v.3 第 14 页开始提供。作为实 例， 图 32 显示对于疹 / 脱屑和痤疮 / 痤疮样疹的分级。(CTCAE， v.3)。存在本领域已知的 许多模型用于监测毒性的可能指标， 包括但不限于体外基于细胞的模型和体内非人动物模 型。毒性也在人受试者在临床试验研究中进行监测。
     在一个具体实施方案中， 毒性在食蟹猴 (cynomolgus monkeys) 中进行测量。EGFR 拮抗剂在食蟹猴中的毒性效应有许多文件记载。如在关于西妥昔单抗的生物制品许可协 议 (Biologics License Agreement)(BLA)( 申请号 ： 125084)( 通过引用并入本文 ) 中所 记载， 所有接受西妥昔单抗的猴子显示在皮肤上的轻度至严重损害， 由鳞屑形成 (scale formation)、 变红 (reddening)、 红斑 (erythema)、 皮炎 (dermatitis)、 裂隙 (fissures)、 伤 口 (wounds) 和疹病 (exanthema) 和 / 或毛发稀疏或脱失 (hair thinning or loss) 组成。 皮肤病学毒性在严重性和发生事件中均是剂量依赖的， 其中对于高、 中和低剂量的严重性 分别为严重、 中度和轻度， 以及发病时间分别在研究的第 15， 22 和 64 天。严重皮肤损伤的 继发并发症是细菌感染或脓毒症， 在高剂量组中 50％的动物随后死亡或进行安乐死。其它 剂量相关毒性包括在某些临床病理学参数中的改变， 所述参数与肝、 骨髓、 脾和淋巴样器官 中的细胞和组织损伤的肉眼检查和显微镜证据相关。
     如实施例中所描述的， 与用同样量的 EGFR 拮抗剂西妥昔单抗给药食蟹猴相比较， 用特异性结合 EGFR 和 HER3 的双特异性抗体给药的食蟹猴显示更少的毒性发生率， 如通过 皮肤损害所显示的。用 25mg/kg 的双特异性抗体给药的三只食蟹猴中的一只发生皮肤损 害， 而用 25mg/kg 的西妥昔单抗给药的 3 只食蟹猴中的 3 只发生皮肤损害。在双特异性抗 体给药的猴子中发生的损害比西妥昔单抗给药的猴子中的损害严重性更低， 并且延缓了损 害的发病。 与其中在所有动物中皮肤损害的发病发生在第三次给药之后的用西妥昔单抗给 药的猴子相比较， 用双特异性抗体给药的动物在最后一次 ( 第六次 ) 给药之后的一周发生 皮肤损害。
     在西妥昔单抗的临床研究中， 观察到了皮肤病学毒性， 包括痤疮样疹、 皮肤干燥和 裂隙和炎症和感染性后遗症 (infectious sequelae)。报道的皮肤病学毒性的发生率高达 89％ ( 对于患有晚期结肠直肠癌的那些患者 )。皮肤毒性的模型是已知的并且可用于确定抗体的皮肤病学毒性。此类模型 的 实 例 包 括 人 表 皮 角 质 化 细 胞 (NHEK(Clonetics， San Diego， CA ； Lonza Bioscience， Walkersville， MD) ； HEKa(Cascade Biologics， Portland， OR ； Invitrogen， Carlsbad， TM CA) 和重建人表皮 (EpiDerm cultures(MatTek， Ashland， MA)。这些模型可用于检查抗 体对细胞增殖、 基因表达、 蛋白表达、 受体磷酸化、 细胞活力和组织病理学中改变的效应。 Lacouture， M.E.， Nature Rev.Cancer( 自然综述 ： 癌症 )， 6： 803-812(2006)。
     希望提供靶向 EGFR 途径的更低毒性的抗体。EGFR 拮抗剂诸如西妥昔单抗的剂量 被毒性 ( 主要是皮肤病学毒性和输液反应 ) 所限制。更低毒性的抗体可以比更高毒性的 EGFR 拮抗剂更高的剂量施用， 这可产生增加的抗肿瘤效应。 因此， 本发明一方面提供多特异 性抗体， 其特异性结合 EGFR 和至少一个其它 HER 受体， (HER2， HER3， 和 / 或 HER4)， 其中当 所述抗体和 EGFR 拮抗剂以同等剂量施用时， 所述抗体比 EGFR 拮抗剂毒性更低。在一个实 施方案中， 所述抗体特异性结合 EGFR 和 HER3。在另一个实施方案中， 所述抗体特异性结合 EGFR 和 HER2。在又一个实施方案中， 所述抗体特异性结合 EGFR 和 HER4。
     在一些实施方案中， 在体内模型中与 EGFR 拮抗剂相比较， 所述多特异性抗体诱导 更低的毒性发生率， 更低严重性的毒性或延缓毒性的发病。本发明一方面提供多特异性抗 体， 其特异性结合 EGFR 和至少一个其它 HER 受体 (HER2， HER3， 和 / 或 HER4)， 其中与在施 用 EGFR 拮抗剂的受试者中的毒性事件相比较， 在施用所述抗体的受试者中所述抗体诱发 更少的毒性事件。在具体实施方案中， 在施用所述抗体的受试者中毒性事件的数目比施 用 EGFR 拮抗剂的受试者中的毒性事件的数目低至少 10 ％， 20 ％， 30 ％， 40 ％， 50 ％， 60 ％， 70％， 80％， 或 90％。
     在其它实施方案中， 使用所述抗体的受试者中毒性事件的比率低于 80 ％， 70 ％， 60％， 50％， 40％， 30％， 20％， 10％， 5％， 2％， 或 1％。
     在具体实施方案中， 与 EGFR 拮抗剂相比较， 所述多特异性抗体在体内模型中诱发 更低发生率的皮肤病学毒性、 更低严重性的皮肤病学毒性或延缓皮肤病学毒性的发病。本 发明一方面提供多特异性抗体， 其特异性结合 EGFR 和至少一个其它 HER 受体 (HER2， HER3， 和 / 或 HER4)， 其中与施用 EGFR 拮抗剂的受试者中的总皮肤病学毒性事件相比较， 在施用所 述抗体的受试者中所述抗体诱发更少的总皮肤病学毒性事件。在具体实施方案中， 施用所 述抗体的受试者中总皮肤病学毒性事件的数目比施用 EGFR 拮抗剂的受试者中总皮肤病学 毒性事件的数目低至少 10％， 20％， 30％， 40％， 50％， 60％， 70％， 80％， 或 90％。
     在其它实施方案中， 施用所述抗体的受试者中总皮肤病学毒性事件的比率低于 80％， 70％， 60％， 50％， 40％， 30％， 20％， 10％， 5％， 2％， 或 1％。
     本发明另一方面提供多特异性抗体， 其特异性结合 EGFR 和至少一个其它 HER 受体 (HER2， HER3， 和 / 或 HER4)， 其中与施用 EGFR 拮抗剂的受试者中的 3 级或更高等级的毒性事 件相比较， 施用所述抗体的受试者中所述抗体诱发更少的 3 级或更等级的毒性事件。在具 体实施方案中， 与施用 EGFR 拮抗剂的受试者中的 3 级或更高等级的毒性事件相比， 施用所 述抗体的受试者中 3 级或更高等级的毒性事件的数目低至少 10％， 20％， 30％， 40％， 50％， 60％， 70％， 80％， 或 90％。
     在其它实施方案中， 在施用所述多特异性抗体的受试者中 3 级或更高等级的毒性 事件的比率低于 70％， 60％， 50％， 40％， 30％， 20％， 15％， 12％， 11％， 10％， 9％， 8％， 7％，6％， 5％， 4％， 3％， 2％， 或 1％。
     在具体实施方案中， 与施用 EGFR 拮抗剂的受试者中的 3 级或更高等级的皮肤病学 毒性事件相比较， 施用双特异性抗体的受试者中所述多特异性抗体诱发更少的 3 级或更高 等级的皮肤病学毒性事件。在具体实施方案中， 与施用 EGFR 拮抗剂的受试者中的 3 级或 更高等级的皮肤病学毒性事件的数目相比， 施用所述多特异性抗体的受试者中 3 级或更高 等级的皮肤病学毒性事件的数目低至少 10％， 20％， 30％， 40％， 50％， 60％， 70％， 80％， 或 90％。
     在其它实施方案中， 施用所述多特异性抗体的受试者中 3 级或更高等级的皮肤 病学毒性事件的比率低于 70％， 60％， 50％， 40％， 30％， 20％， 15％， 12％， 11％， 10％， 9％， 8％， 7％， 6％， 5％， 4％， 3％， 2％， 或 1％。
     在其它实施方案中， 与 EGFR 拮抗剂相比较， 所述抗体在体内模型中诱发更少发病 率的改变的器官功能。在其它实施方案中， 与 EGFR 拮抗剂相比较， 所述抗体在体内模型中 诱发更少或更低严重性的胃肠毒性。
     在一些实施方案中， 所述 EGFR 拮抗剂是抗 EGFR 抗体。在一个实施方案中， 所述 EGFR 拮抗剂是西妥昔单抗。在另一个实施方案中， 所述 EGFR 拮抗剂是帕尼单抗。在另一 个实施方案中， 所述 EGFR 拮抗剂是小分子。在一个实施方案中， 所述 EGFR 拮抗剂是厄洛替 尼。在一个实施方案中， 所述体内模型是猴， 诸如食蟹猴。在另一个实施方案中， 所述体内 模型是人。 抗体和抗体变体
     在一些实施方案中， 本发明提供包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域 的多特异性抗体。 在一些实施方案中， 所述抗原结合结构域不特异性结合其它靶标， 包括其 它 HER 受体。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH( 重链可变结构域 )， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25。在 一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中 所述抗体包含 VL( 轻链可变结构域 )， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 40。在一个实施方 案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包 含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 40。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的一个、 两个和 / 或三 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 40 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 40 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。在一个 实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述 抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸
    序列 SEQ ID NO ： 40 的所有三个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 64。 在一个实施方案中， 所 述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 26。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 64， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 26。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 64 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 26 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 64 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 26 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。在一个 实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述 抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 64 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸 序列 SEQ ID NO ： 26 的所有三个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 28。 在一个实施方案中， 所 述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 27。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 28， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 27。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 28 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 27 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 28 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 27 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。 在一个实 施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗 体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 28 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序 列 SEQ ID NO ： 27 的所有三个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。在一个 具体的实施方案中， HVR-H1 包含氨基酸序列 LSGDWIH(SEQ ID NO ： 48)， HVR-H2 包含氨基酸 序列 LGEISAAGGYTD(SEQ ID NO ： 50)， HVR-H3 包含氨基酸序列 ARESRVSFEAAMDY(SEQ ID NO ： 53)， HVR-L1 包含氨基酸序列 DLATDVA(SEQ ID NO ： 54)， HVR-L2 包含氨基酸序列 SASF(SEQ ID NO ： 56) 和 HVR-L3 包含氨基酸序列 SEPEPYT(SEQ ID NO ： 57)。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29。 在一个实施方案中， 所 述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 28， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 28 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。 在一个实 施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗 体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 28 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序 列 SEQ ID NO ： 29 的所有三个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。在一个 具体的实施方案中， HVR-H1 包含氨基酸序列 LSGDWIH(SEQ ID NO ： 48)， HVR-H2 包含氨基酸 序列 LGEISAAGGYTD(SEQ ID NO ： 50)， HVR-H3 包含氨基酸序列 ARESRVSFEAAMDY(SEQ ID NO ： 53)， HVR-L1 包含氨基酸序列 NIATDVA(SEQ ID NO ： 55)， HVR-L2 包含氨基酸序列 SASF(SEQ ID NO ： 56)， 和 HVR-L3 包含氨基酸序列 SEPEPYT(SEQ ID NO ： 57)。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 30。 在一个实施方案中， 所 述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 30， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 30 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 30 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。 在一个实 施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗 体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 30 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序 列 SEQ ID NO ： 29 的所有三个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。在一个 具体的实施方案中， HVR-H1 包含氨基酸序列 LSGDWIH(SEQ ID NO ： 48)， HVR-H2 包含氨基酸 序列 VGEISAAGGYTD(SEQ ID NO ： 51)， HVR-H3 包含氨基酸序列 ARESRVSFEAAMDY(SEQ ID NO ： 53)， HVR-L1 包含氨基酸序列 NIATDVA(SEQ ID NO ： 55)， HVR-L2 包含氨基酸序列 SASF(SEQ ID NO ： 56)， 和 HVR-L3 包含氨基酸序列 SEPEPYT(SEQ ID NO ： 57)。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 40， 41， 42， 43， 44， 45 或 46。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构 域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 40， 41， 42， 43， 44， 45 或 46。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 40， 41， 42， 43， 44， 45 或 46 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。 在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ IDNOs ： 40， 41， 42， 43， 44， 45 或 46 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 40， 41， 42， 43， 44， 45 或 46 的所 有三个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含轻链可变结构域， 该轻链可变结构域包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 36， 37 或 38。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的 抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链可变结构域和轻链可变结构域， 该重链可变结构 域包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 该轻链可变结构域包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 36， 37 或 38。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 36， 37 或 38 的一个、 两个 和 / 或三个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的 抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 36， 37 或 38 的一个、 两个和 / 或 三个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQID NO ： 25 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 36， 37 或 38 的所有三个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25。 在一个实施方案中， 所 述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 39。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链可变结构域和轻链可变结构域， 该 重链可变结构域包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 该轻链可变结构域包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 39。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 39 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 39 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。在一个 实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合结构域， 其中所述 抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸 序列 SEQ ID NO ： 39 的所有三个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。
     在一个实施方案中， 本发明提供单特异性抗体， 其包含特异性结合 EGFR 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25。 在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 EGFR 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包 含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 58 或 SEQ ID NO ： 24。在一个实施方案中， 单特异性抗体包含特异性结合 EGFR 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 58 或 SEQ ID NO ： 24。
     在一个实施方案中， 本发明提供单特异性抗体， 其包含特异性结合 EGFR 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 EGFR 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 24 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。 在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 EGFR 的抗原结合结构域， 其中所述 抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 24 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。在一个实施方案中， 所述单 特异性抗体包含特异性结合 EGFR 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含 氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 24 的所有三 个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。在一个具体的实施方案中， HVR-H1 包含氨基酸序列 FTGNWIH(SEQ ID NO ： 47)， HVR-H2 包含氨基酸序列 VGEISPSGGYTD(SEQ ID NO ： 49)， HVR-H3 包含氨基酸序列 ARESRVSYEAAMDY(SEQ ID NO ： 52)， HVR-L1 包含氨基酸序列 DVSTAVA(SEQ ID NO ： 78)， HVR-L2 包含氨基酸序列 SASF(SEQ ID NO ： 56)， 和 HVR-L3 包含氨 基酸序列 SYPTPYT(SEQ ID NO ： 79)。
     在一个实施方案中， 本发明提供单特异性抗体， 其包含特异性结合 HER3 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29。 在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包 含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 33， 34 或 35。在一个实施方案中， 单特异性抗体包含特异性结 合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 33， 34 或 35。
     在一个实施方案中， 本发明提供单特异性抗体， 其包含特异性结合 HER3 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 33， 34 或 35 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 33， 34 或 35 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。在一 个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体 包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 33， 34 或 35 的所有三个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。 在一个具体的实施方案中， HVR-H1 包含氨基酸序列 FTGDWIH(SEQ ID NO ： 62)， HVR-H2 包含 氨基酸序列 VGEISPAGAYTD(SEQ ID NO ： 60)， HVR-H3 包含氨基酸序列 AREAKVSFEAAMDY(SEQ ID NO ： 61)， HVR-L1 包含氨基酸序列 NIATDVA(SEQ ID NO ： 55)， HVR-L2 包含氨基酸序列 SASF(SEQ ID NO ： 56)， 和 HVR-L3 包含氨基酸序列 SEPEPYT(SEQ ID NO ： 57)。
     在一个实施方案中， 本发明提供单特异性抗体， 其包含特异性结合 HER3 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 32。 在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 31。在一个实施方案中， 单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的 抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 32， 该 VL 包 含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 31。
     在一个实施方案中， 本发明提供单特异性抗体， 其包含特异性结合 HER3 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 32 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 31 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。 在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述 抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 32 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 31 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。在一个实施方案中， 所述单 特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含 氨基酸序列 SEQ ID NO ： 32 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 31 的所有三 个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。在一个具体的实施方案中， HVR-H1 包含氨基酸序列 FSGDWIH(SEQ ID NO ： 59)， HVR-H2 包含氨基酸序列 VGEISPAGAYTD(SEQ ID NO ： 60)， HVR-H3 包含氨基酸序列 AREAKVSFEAAMDY(SEQ ID NO ： 61)， HVR-L1 包含氨基酸序列 DLATDVA(SEQ ID NO ： 54)， HVR-L2 包含氨基酸序列 SASF(SEQ ID NO ： 56) 和 HVR-L3 包含氨 基酸序列 SEPEPYT(SEQ ID NO ： 57)。 在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含重链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 2， 12 或 14。在一 个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所 述抗体包含轻链， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 4， 5， 6， 7， 8， 9， 10， 11 或 13。在一 个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所 述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 2， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 4。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原 结合结构域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 12， 所述 轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 11。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结 合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序 列 SEQ ID NO ： 12， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 13。在一个实施方案中， 所述多特 异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 14， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 13。
     在一些实施方案中， 本发明提供多特异性抗体， 其包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的 抗原结合结构域。 在一些实施方案中， 所述抗原结合结构域不特异性结合其它靶标， 包括其 它 HER 受体。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原 结合结构域， 其中所述抗体包含重链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 2。在一个实施 方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合结构域， 其中所述抗体 包含轻链， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 21， 22 或 23。
    在一些实施方案中， 本发明提供多特异性抗体， 其包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的 抗原结合结构域。 在一些实施方案中， 所述抗原结合结构域不特异性结合其它靶标， 包括其 它 HER 受体。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原
     结合结构域， 其中所述抗体包含重链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 2。在一个实施 方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合结构域， 其中所述抗体 包含轻链， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 18。
     在一个实施方案中， 本发明提供特异性结合 EGFR 的单特异性抗体。在一些实施方 案中， 所述抗原结合结构域不特异性结合其它靶标， 包括其它 HER 受体。在一个实施方案 中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 EGFR 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 2。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异 性结合 EGFR 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含轻链， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 1 或 3。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 EGFR 的抗原结合结构 域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 2， 所述轻链包含 氨基酸序列 SEQ ID NO ： 1。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 EGFR 的 抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 2， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 3。
     在一个实施方案中， 本发明提供特异性结合 HER3 的单特异性抗体。在一些实施方 案中， 所述抗原结合结构域不特异性结合其它靶标， 包括其它 HER 受体。在一个实施方案 中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 16， 17， 19 或 20。在一个实施方案中， 所述单特异性 抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含轻链， 所述轻链包含氨基 酸序列 SEQ ID NOs ： 13 或 15。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 16， 17， 19 或 20， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 13 或 15。
     在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 16， 所述轻链包含氨 基酸序列 SEQ ID NO ： 15。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的 抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 17， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 13。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异 性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 19， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 13。在一个实施方案中， 所述单特异 性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 20， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 13。
     在一些实施方案中， 考虑了本文所述的抗体的氨基酸序列修饰。 例如， 可能需要提 高抗体的结合亲和力和 / 或其它生物学性质。可以通过将适合的变化引入编码抗体的核苷 酸序列或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。所述修饰包括， 例如在抗体的氨基酸 序列中缺失残基和 / 或插入残基， 和 / 或置换残基。可以进行缺失、 插入和置换的任何组合 从而得到最终的构建体， 条件是最终的构建体具有需要的特征。氨基酸改变可以在制备序 列的时候引入主题抗体氨基酸序列。
     在一些实施方案中， 相对于参照序列具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性的氨基酸序列含有置换、 插入或缺失， 但 是包含所述氨基酸序列的抗体保留了结合所述参照序列的最初一个靶标或多个靶标的能力。 在一些实施方案中， 相对于参照序列具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性的氨基酸序列含有置换、 插入或缺失， 但是包含 所述氨基酸序列的抗体保留了结合所述参照序列的最初一个靶标或多个靶标的能力， 并且 不特异性结合任何其它靶标， 包括其它 HER 受体。在一些实施方案中， 参照序列的氨基酸序 列中总计 1 至 10 个氨基酸被置换、 插入或缺失。在一些实施方案中， 所述置换、 插入或缺失 发生在 HVRs 外部的区 ( 即， 在 FRs 中 )。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 40 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案 中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 40 具 有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一 性。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 64 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案 中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 26 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特 异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 64 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 26 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所述 VL 具有与 SEQ ID NO ： 29 至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性的氨基酸序列。在一个实施 方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体 包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 28 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列 同一性。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 30 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案 中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 30 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 具 有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一 性。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 40， 41， 42， 43， 44， 45 或 46 中的任意一条具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的 抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 40， 41， 42， 43， 44， 45 或 46 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案 中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 36 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含 特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸 序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80 ％， 85 ％， 90 ％， 91 ％， 92 ％， 93 ％， 94 ％， 95 ％， 96 ％， 97 ％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 36 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案中， 所 述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所 述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 37 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性 结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 结构域和 VL， 所述 VH 结构域与 氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 具有氨基酸序列 SEQ ID NO ： 37。在一个实施方案 中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所述 VL 具有氨基酸序列 SEQ ID NO ： 38。 在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异 性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 38 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案 中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 39 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％，95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特 异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 39 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。
     在一个实施方案中， 本发明提供单特异性抗体， 其包含特异性结合 EGFR 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。在一个实施方 案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 EGFR 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所 述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 24 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性 结合 EGFR 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列 同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 24 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。
     在一个实施方案中， 本发明提供单特异性抗体， 其包含特异性结合 HER3 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 32 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。在一个实施方 案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所 述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 31 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性 结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 32 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列 同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 31 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。
     在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 33 具有至少 80 ％， 85 ％， 90 ％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案中， 所 述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所述 VL 与 氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 33 具 有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一 性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特 异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 34 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列 同一性。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 34 具有至少 80％， 85％， 90％，91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 35 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。在一个实施方 案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 35 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。
     图 33 中显示了示例性比对， 该比对显示数个抗 HER 抗体的重链可变结构域和轻链 可变结构域的 Kabat 编号。
     本发明的另一方面提供多特异性抗体， 其包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 其中 SEQ ID NO ： 25 的 VH 包含在 F29(VH)， T30(VH)， N32(VH)， V48(VH)， P52a(VH)， S53(VH)， T57(VH)， S96(VH) 或 Y100(VH) 的氨基酸置换， 根据 Kabat 编号系统进行编号。在一个实施方案中， 所述抗体包含 多于一个这些置换。在一个实施方案中， 所述抗体包含所有这些置换。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 其中 SEQ ID NO ： 25 的 VH 包含一个或多个选自由下述 各项组成的组的氨基酸置换 ： F29(VH)L ； T30(VH)S ； N32(VH)D， V48(VH)L， P52a(VH)A， S53(VH) A， T57(VH)S， S96(VH)A 和 Y100(VH)F， 根据 Kabat 编号系统进行编号。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 其中 SEQ ID NO ： 25 的 VH 包含氨基酸置换 F29(VH)L， T30(VH)S， N32(VH)D， P52a(VH)A 和 S53(VH)A 和 Y100(VH)F， 根据 Kabat 编号系统进行编号。
     本发明的另一方面提供多特异性抗体， 其包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结 合结构域。其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 58， 其中 SEQ ID NO ： 58 的 VL 包含在 D28(VL)， V29(VL)， S30(VL)， T31(VL)， A32(VL)， V33(VL)， S50(VL)， A51(VL)， F53(VL)， S91(VL)， Y92(VL)， T93(VL)， T94(VL) 或 P96(VL) 的氨基酸置换， 根据 Kabat 编号系 统进行编号。在一个实施方案中， 所述抗体包含多于一个这些置换。在一个实施方案中， 所 述抗体包含所有这些置换。在一个实施方案中， 所述抗体包含在氨基酸 31 和氨基酸 32 之 间的氨基酸插入。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 58， 其中 SEQ ID NO ： 58 的 VL 包含一个或多个选自由下述各项组成的组的氨基酸置换 ： D28(VL)N， V29(VL)I， V29(VL)L， S30(VL)A， A32(VL)D， Y92(VL)E， T93(VL)P， T94(VL)E 和 P96(VL)Y， 根据 Kabat 编号系统进行 编号。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结 构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 58， 其中 SEQ ID NO ： 58 的 VL 包含氨基酸置换 D28(VL)N， V29(VL)I， S30(VL)A， A32(VL)D， Y92(VL)E， T93(VL)P， T94(VL)E 和 P96(VL)Y， 根据 Kabat 编号系统进行编号。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 该 VL 包含氨基酸 序列 SEQ ID NO ： 58， 其中 SEQ ID NO ： 25 的 VH 包含在 F29(VH)， T30(VH)， N32(VH)， V48(VH)， P52a(VH)， S53(VH)， T57(VH)， S96(VH) 或 Y100(VH) 的氨基酸置换， 并且其中 SEQ ID NO ： 58 的 VL 包含在 D28(VL)， V29(VL)， S30(VL)， T31(VL)， A32(VL)， V33(VL)， S50(VL)， A51(VL)， F53(VL)， S91(VL)， Y92(VL)， T93(VL)， T94(VL) 或 P96(VL) 的氨基酸置换， 根据 Kabat 编号系统进行编 号。在一个实施方案中， 所述抗体包含多于一个这些置换。在一个实施方案中， 所述抗体包 含所有这些置换。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 该 VL 包含氨基酸 序列 SEQ ID NO ： 58， 其中 SEQ ID NO ： 25 的 VH 包含一个或多个选自由下述各项组成的组 的氨基酸置换 ： F29(VH)L ； T30(VH)S ； N32(VH)D， V48(VH)L， P52a(VH)A， S53(VH)A， T57(VH)S， S96(VH)A 和 Y100(VH)F， SEQ ID NO ： 58 的 VL 包含一个或多个选自由下述各项组成的组的氨 基酸置换 ： D28(VL)N， V29(VL)I， V29(VL)L， S30(VL)A， A32(VL)D， Y92(VL)E， T93(VL)P， T94(VL) E 和 P96(VL)Y， 根据 Kabat 编号系统进行编号。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 其中 SEQ ID NO ： 25 的 VH 包含氨基酸置换 F29(VH)L， T30(VH)S， N32(VH)D， P52a(VH)A 和 S53(VH)A 和 Y100(VH) F， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 58， 其中 SEQ ID NO ： 58 的 VL 包含氨基酸置换 D28(VL) N， V29(VL)I， S30(VL)A， A32(VL)D， Y92(VL)E， T93(VL)P， T94(VL)E 和 P96(VL)Y， 根据 Kabat 编 号系统进行编号。
     用于鉴定对于突变发生是优选位置的抗体的某些残基或区域的有用方法被称为 “丙氨酸分区诱变法” ， 如 Cunningham 和 Wells 在科学 (1989)(Science)， 244 ： 1081-1085 中 所述。 在此处， 鉴定了一种或一组靶残基 ( 例如带电荷的残基如 arg， asp， his， lys 和 glu)， 并且用中性或带负电荷氨基酸 ( 例如， 丙氨酸或聚丙氨酸 ) 置换从而影响氨基酸与抗原的 相互作用。然后， 通过在或关于置换位点引入另外的或其它变体来精选显示对置换的功能 敏感性的那些氨基酸位置。 因此， 当预先确定引入氨基酸序列变化的位点时， 突变本身的性 质不需要被预先确定。 例如， 为了分析突变在给定位点的性能， 在靶密码子或靶区进行丙氨 酸分区诱变或随机诱变并且关于需要的活性筛选表达的免疫球蛋白。
     氨基酸序列插入包括氨基和 / 或羧基端融合， 长度范围在 1 个残基到包含一百以 上残基的多肽， 以及单一氨基酸残基或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包 括具有 N- 端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的 N 端或 C 端与增 加抗体的血清半衰期的酶 ( 例如关于 ADEPT) 或多肽的融合。
     糖基化变体
     在某些实施方案中， 改变本发明的抗体从而增加或减少抗体被糖基化的程度。多 肽的糖基化典型地是 N- 连接或 O- 连接的。N- 连接指碳水化合物结构部分与天冬酰胺残 基的侧链的连接。其中 X 是除了脯氨酸之外的任何氨基酸的三肽序列天冬酰胺 -X- 丝氨酸 和天冬酰胺 -X- 苏氨酸， 是关于将碳水化合物结构部分酶促连接于天冬酰胺侧链的识别序 列。因此， 在多肽中这些三肽序列的存在产生可能的糖基化位点。O- 连接的糖基化指将糖 N- 乙酰基半乳糖胺、 半乳糖或木糖之一连接于羟基氨基酸， 最常见连接于丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用 5- 羟基脯氨酸或 5- 羟基赖氨酸。
     常规情况下， 在抗体上加入或缺失糖基化位点通过改变氨基酸序列完成， 从而产 生或去除一个或多个上述三肽序列 ( 对于 N- 连接的糖基化位点 )。 还可以通过将一个或多 个丝氨酸或苏氨酸残基在起始抗体序列加入、 缺失或置换进行改变 ( 对于 O- 连接的糖基化 位点 )。
     如果抗体包含 Fc 区， 那么可以改变其连接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的 天然抗体典型地包含支化的， 双触角寡糖， 其通常通过 N- 连接连接于 Fc 区的 CH2 结构域的 Asn297。见， 例如， Wright 等 (1997)TIBTECH 15 ： 26-32。寡糖可以包括各种碳水化合物， 例 如甘露糖、 N- 乙酰基葡糖胺 (GlcNAc)、 半乳糖和唾液酸， 以及在双触角的寡糖结构的 “茎” 中连接于 GlcNAc 的岩藻糖。在一些实施方案中， 可以在本发明的抗体中修饰寡糖从而产生 具有一定提高性质的抗体变体。
     在一个实施方案中， 提供具有这样的碳水化合物结构的抗体变体， 所述碳水化 合物结构缺乏连接 ( 直接或间接 ) 于 Fc 区的岩藻糖。例如， 在此类抗体中岩藻糖的量 可以是从 1 ％至 80 ％， 从 1 ％至 65 ％， 从 5 ％至 65 ％或从 20 ％至 40 ％。岩藻糖的量通过 MALDI-TOF 质谱测定法如下确定 ： 计算在 Asn297 的糖链内的岩藻糖相对于附着到 Asn 297 的所有糖结构 ( 例如， 复合的， 杂合的和高甘露糖结构 ) 的总和的平均量， 例如， 如在 WO 2008/077546 中所描述的。Asn297 是指 Fc 区中位于大约位置 297 的天冬酰胺残基 (Fc 区 残基的 Eu 编号 ) ； 然而， 由于抗体中小的序列变异， Asn297 也可位于大约位置 297 的上游或 下游 ±3 个氨基酸， 即在位置 294 和 300 之间。所述岩藻糖基化变体可以具有提高的 ADCC 功能。见例如， 美国专利公开号 US 2003/0157108(Presta， L.) ； US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.， Ltd)。 与 “去 岩 藻 糖 基 化 (defucosylated)”或 “岩 藻 糖 缺 陷 的”抗 体变体相关的出版物的实例包括 ： US 2003/0157108 ； WO 2000/61739 ； WO 2001/29246 ； US 2003/0115614 ； US 2002/0164328 ； US 2004/0093621 ； US 2004/0132140 ； US 2004/0110704 ； US 2004/0110282 ； US 2004/0109865 ； WO 2003/085119 ； WO 2003/084570 ； WO 2005/035586 ； WO 2005/035778 ； WO2005/053742 ； WO2002/031140 ； Okazaki 等， 分子生 物 学 杂 志 (J.Mol.Biol.)336 ： 1239-1249(2004) ； Yamane-Ohnuki 等， 生物技术生物工程 (Biotech.Bioeng.)87 ： 614(2004)。能够产生去岩藻糖基化的抗体的细胞系的实例包括缺 乏蛋白岩藻糖基化的 Lec13 CHO 细胞 (Ripka 等生物化学生物物理进展 (Arch.Biochem. Biophys.)249 ： 533-545(1986) ； 美 国 专 利 申 请 号 US 2003/0157108A1， Presta， L； 和 WO 2004/056312A1， Adams 等， 尤其在实施例 11 中 )， 和敲除细胞系， 如 α-1， 6- 岩藻糖基转移 酶基因， FUT8， 敲除 CHO 细胞 ( 见， 例如， Yamane-Ohnuki 等生物技术生物工程 (Biotech. Bioeng).87 ： 614(2004) ； Kanda， Y. 等， 生物技术生物工程 (Biotechnol.Bioeng.)， 94(4) ： 680-688(2006) ； 和 WO2003/085107)。
     还提供具有等分寡糖的抗体变体， 例如其中连接于抗体的 Fc 区的双触角寡糖 被 GlcNAc 等分。所述抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和 / 或可以具有提高的 ADCC 功 能。 所 述 抗 体 变 体 的 实 例 例 如 在 WO 2003/011878(Jean-Mairet 等 ) ； 美国专利号 6,602,684(Umana 等 ) ； 和 US 2005/0123546(Umana 等 ) 中进行描述。 还提供在连接于 Fc 区 的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。所述抗体变体可以具有提高的 CDC 功能。 例如在 WO 1997/30087(Patel 等 ) ； WO 1998/58964(Raju， S.) ； 和 WO 1999/22764(Raju，S.) 中描述所述抗体变体。
     Fc 区变体
     在某些实施方案中， 一个或多个氨基酸修饰可引入本文提供的抗体的 Fc 区中， 由 此产生 Fc 区变体。Fc 区变体可包含人 Fc 区序列 ( 例如， 人 IgG1， IgG2， IgG3 或 IgG4Fc 区 )， 所述人 Fc 区序列包含在一个或多个氨基酸位置的氨基酸修饰 ( 例如， 置换 )。
     在某些实施方案中， 本发明涵盖具有一些但不是全部的效应子功能的抗体变体， 所述效应子功能使所述抗体变体成为对于下述应用是理想的候选物， 在所述应用中抗体 在体内的半衰期是重要的， 而某些效应子功能 ( 如补体和 ADCC) 是不必要的或有害的。可 以进行体外和 / 或体内细胞毒性测定法从而证实 CDC 和 / 或 ADCC 活性的减少 / 消耗。 例如， 可以进行 Fc 受体 (FcR) 结合测定法从而确保抗体缺乏 FcγR 结合 ( 因此可能缺 乏 ADCC 活性 )， 但是维持 FcRn 结合能力。用于介导 ADCC 的主要细胞， 即 NK 细胞仅表达 FcγRIII， 而单核细胞表达 FcγRI， FcγRII 和 FcγRIII。在 Ravetch 和 Kinet， 免疫学 年度综述 (Annu.Rev.Immunol.)9 ： 457-492(1991) 的第 464 页上的表 3 中总结在造血细 胞上的 FcR 表达。评估目的分子的 ADCC 活性的体外测定法的非限制性实例描述在美国专 利号 5,500,362 中 ( 见例如 Hellstrom， I.， 等美国国家科学院学报 (Proc.Nat’ l Acad. Sci.USA)83 ： 7059-7063(1986)) 和 Hellstrom， I 等， 美 国 国 家 科 学 院 学 报 (Proc.Nat’ l Acad.Sci.USA)82 ： 1499-1502(1985) ； 5,821,337( 见 Bruggemann， M. 等， 实验医学杂志 (J.Exp.Med.)166 ： 1351-1361(1987)) 中。备选地， 可以使用非放射性测定法 ( 见， 例如用 TM 于流式细胞术的 ACTI 非放射性细胞毒性测定法 (CellTechnology， Inc.Mountain View， CA ； 和 CytoTox 非放射性细胞毒性测定法 (Promega， Madison， WI)。用于所述测定法 的有用效应细胞包括外周血单核细胞 (PBMC) 和天然杀伤 (NK) 细胞。备选地或另外地， 目的分子的 ADCC 活性可以在体内评估， 例如如在 Clynes 等美国国家科学院学报 (Proc. Nat’ l Acad.Sci.USA)95 ： 652-656(1998) 中公开的动物模型中评估。还可以进行 C1q 结合 测定法从而证实抗体不能结合 C1q 并且因此缺乏 CDC 活性。参见例如在 WO 2006/029879 和 WO 2005/100402 中的 C1q 和 C3c 结合 ELISA。为了评估补体激活， 可以进行 CDC 测定 ( 见， 例如， Gazzano-Santoro 等， 免疫学方法杂志 (J.Immunol.Methods)202 ： 163(1996) ； 血 Cragg， M.S. 等， 血 液 (Blood)101 ： 1045-1052(2003) ； 和 Cragg， M.S. 和 M.J.Glennie， 液 (Blood)103 ： 2738-2743(2004))。还可以使用本领域已知的方法进行 FcRn 结合和体内 清除 / 半衰期测定 ( 见， 例如， Petkova， S.B. 等， 国际免疫学 (Int’ l.Immunol.)18(12) ： 1759-1769(2006))。 具有降低的效应子功能的抗体包括具有 Fc 区残基 238， 265， 269， 270， 297， 327 和 329 的一个或多个置换的那些 ( 美国专利 6,737,056)。此类 Fc 突变体包括在氨基酸位置 265， 269， 270， 297 和 327 中的两个或多个具有置换的 Fc 突变体， 包括所谓的 “DANA” Fc 突 变体， 其具有残基 265 和 297 变为丙氨酸的置换 ( 美国专利 7,332,581)。
     描 述 了 某 些 具 有 提 高 或 减 少 结 合 FcRs 的 抗 体 变 体。( 参 见， 例 如， 美国专 利 6,737,056 ； WO 2004/056312 和 Shields 等， J.Biol.Chem.( 生 物 化 学 杂 志 )9(2) ： 6591-6604(2001)。)
     在某些实施方案中， 抗体变体包含提高 ADCC 的具有一个或多个氨基酸置换的 Fc 区， 例如， 在 Fc 区的位置 298， 333 和 / 或 334( 残基的 EU 编号 ) 的置换。
     在一些实施方案中， 在 Fc 区进行改变， 其导致改变的 ( 即， 提高的或减少的 )C1q 结合和 / 或补体依赖性细胞毒性 (CDC)， 例如如在美国专利 6,194,551， WO 99/51642 和 Idusogie 等， 免疫学杂志 (J.Immunol.)164 ： 4178-4184(2000) 中所描述的。
     在 US2005/0014934A1(Hinton 等 ) 中描述了具有增加的半衰期并且对于新生儿 Fc 受体 (FcRn) 具有提高的结合的抗体， 所述 FcRn 负责将母体 IgGs 转移给胎儿 (Guyer 等， 免 疫 学 杂 志 (J.Immunol.)117 ： 587(1976) 和 Kim 等， 免 疫 学 杂 志 (J.Immunol.)24 ： 249(1994))。那些抗体其中包含具有一个或多个置换的 Fc 区， 所述置换提高 Fc 区与 FcRn 的结合。 此类 Fc 变体包括在下述一个或多个 Fc 区残基具有置换的那些 ： 238， 256， 265， 272， 286， 303， 305， 307， 311， 312， 317， 340， 356， 360， 362， 376， 378， 380， 382， 413， 424 或 434，例 如 Fc 区残基 434 的置换 ( 美国专利 7,371,826)。
     涉 及 Fc 区 变 体 的 其 它 实 例 也 参 见 Duncan & Winter， Nature( 自 然 )322 ： 738-40(1988) ； 美国专利 5,648,260 ； 美国专利 5,624,821 ； 和 WO 94/29351。
     半胱氨酸改造的抗体变体
     在某些实施方案中， 可能需要产生半胱氨酸改造的抗体， 例如 “thioMAbs” ， 其中抗 体的一个或多个残基被半胱氨酸残基置换。在具体的实施方案中， 在抗体可及的位点存在 置换的残基。通过用半胱氨酸置换那些残基， 反应性硫醇基由此定位在抗体的可及位点， 并且可以用于将抗体缀合于其它结构部分， 如药物结构部分或接头 - 药物结构部分， 从而 产生免疫缀合物， 如本文进一步所述。在某些实施方案中， 下面的残基的任何一个或多个 可以用半胱氨酸置换 ： 轻链的 V205(Kabat 编号 ) ； 重链的 A118(EU 编号 ) ； 和重链 Fc 区的 S400(EU 编号 )。 半胱氨酸改造的抗体可以如， 例如在美国专利 7,521,541 中所描述的产生。
     抗体衍生物
     在某些实施方案中， 可以对本文提供的抗体进一步修饰以包含本领域已知并且容 易获得的另外的非蛋白质性的结构部分。 适合抗体的衍生作用的结构部分包括但不限于水 溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括， 但不限于 ： 聚乙二醇 (PEG)， 乙二醇 / 丙 二醇的共聚物， 羧甲基纤维素， 葡聚糖， 聚乙烯醇， 聚乙烯吡咯烷酮， 聚 -1， 3- 二噁烷， 聚 -1， 3， 6- 三噁烷， 乙烯 / 马来酸酐共聚物， 聚氨基酸 ( 同聚物或随机共聚物 ) 和葡聚糖或聚 ( 正 乙烯基吡咯烷酮 ) 聚乙二醇， 聚丙二醇同聚物 (propropylene glycol homopolymers)， 聚环 氧丙烷 / 氧化乙烯共聚物， 聚氧乙烯化的多元醇 ( 例如甘油 )， 聚乙烯醇及其混合物。由于 其在水中的稳定性， 聚乙二醇丙醛可以在生产中具有优势。 聚合物可以具有任何分子量， 并 且可以是分支或不分支的。与抗体连接的聚合物的数目可以变化， 并且如果连接多于一个 聚合物， 它们可以是相同或不同的分子。一般地， 用于衍生化的聚合物的数目和 / 或类型可 以基于这样的考虑来确定， 包括， 但不限于， 待提高的抗体的具体性质或功能， 抗体衍生物 是否将在限定的条件下用于治疗中， 等。
     在 另 一 个 实 施 方 案 中， 提供可以通过暴露于辐射而被选择性加热的抗体和 非 蛋 白 质 性 结 构 部 分 的 缀 合 物。 在 一 个 实 施 方 案 中， 非蛋白质性的结构部分是碳 纳 米 管 (nanotube)(Kam 等， 美 国 国 家 科 学 院 学 报 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA)102 ： 11600-11605(2005))。辐射可以以任何波长进行， 并且包括， 但不限于这样的波长， 所述波 长不伤害正常细胞， 但是其将非蛋白质性结构部分加热到杀死接近抗体 - 非蛋白质性结构 部分的细胞的温度。参见， 例如 Petkova， S.B. 等， 国际免疫学 (Int’ l.Immunol.)18(12) ：1759-1769(2006)).
     提供具有一个或多个氨基酸置换的其它抗体变体。 用于置换突变发生的目的位点 包括高变区， 但是也预期 FR 改变。保守性置换在 “优选的置换” 的标题下在表 1 中显示。更 多实质性的改变， 显示在表 4 中的 “示例性置换” 中， 或在下面参照氨基酸类别进一步描述。 可以将氨基酸置换引入目的抗体和例如关于需要的活性 ( 如提高的抗原结合， 减少的免疫 原性， 提高的 ADCC 或 CDC 等 ) 筛选的产物中。
     表1
    在抗体的生物学性质中的修饰可以通过选择这样的置换来进行， 所述置换影 响 (a) 在置换区域中的多肽主链的结构， 例如， 作为折叠或螺旋构象， (b) 在靶位点的分 子的电荷或疏水性， 或 (c) 侧链的体积。可以根据它们的侧链性质中的类似性对氨基酸 进 行 分 组 ( 在 A.L.Lehninger， 在 生 物 化 学 (Biochemistry)， 第 二 版 .， 73-75 页， Worth Publishers， 纽约 (1975) 中 ) ：
     (1) 非极性 ： Ala(A)， Val(V)， Leu(L)， Ile(I)， Pro(P)， Phe(F)， Trp(W)， Met(M)
     (2) 不带电荷的极性 ： Gly(G)， Ser(S)， Thr(T)， Cys(C)， Tyr(Y)， Asn(N)， Gln(Q)
     (3) 酸性 ： Asp(D)， Glu(E)
     (4) 碱性 ： Lys(K)， Arg(R)， His(H)
     备选地， 可以将天然存在的残基基于常见的侧链性质分为数组 ：
     (1) 疏水 ： 正亮氨酸， Met， Ala， Val， Leu， Ile ；
     (2) 中性亲水性 ： Cys， Ser， Thr， Asn， Gln ；
     (3) 酸性 ： Asp， Glu ；
     (4) 碱性 ： His， Lys， Arg ；
     (5) 影响链取向的残基 ： Gly， Pro ；
     (6) 芳香 ： Trp， Tyr， Phe。
     非保守性置换需要将这些类别中的之一的成员与另一类交换。 所述置换的残基还 可以被引入保守性置换位点， 或引入保留 ( 非保守 ) 位点。
     一种类型的置换变体包括置换母体抗体 ( 例如人源化或人抗体 ) 的一个或多个高 变区残基。一般地， 关于进一步开发所选择的得到的变体相对于它们产生自其中的母体抗 体具有修饰的 ( 例如提高的 ) 生物学性质。 示例性置换变体是亲和力成熟的抗体， 其可以使 用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地产生。简言之， 对一些高变区位点 ( 例如， 6-7 个位点 ) 突变从而在每个位点产生所有可能的氨基酸置换。从丝状噬菌体颗粒展示由此产 生的抗体， 所述抗体作为与在每个颗粒中包装的噬菌体外壳蛋白 ( 例如， M13 的基因 III 产 物 ) 的至少一部分的融合物展示。接着关于噬菌体展示变体的生物学活性 ( 例如结合亲和 力 ) 对其进行筛选。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点， 可以进行分区诱变法 ( 例如， 丙氨酸分区 ) 从而鉴定对抗原结合有显著贡献的高变区残基。备选地， 或另外地， 分析抗 原 - 抗体复合物的晶体结构从而鉴定抗体和抗原之间的接触点可以是有益的。根据本领域 已知的技术， 所述接触残基和邻近残基是置换的候选物， 包括在本文中阐释的那些。 一旦产 生了所述变体， 变体组使用本领域中已知的技术进行筛选， 包括在本文中所述的那些， 并且 可以对在一个或多个相关测定法中具有优越性质的变体进行选择以用于进一步开发。
     编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子通过本领域已知的多种方法进行制备。 这 些方法包括， 但不限于 ： 从自然来源分离 ( 在天然存在的氨基酸变体的情形中 ) 或通过早期 制备的抗体的变体或非变体形式的寡核苷酸 - 介导 ( 或位点定向 ) 诱变， PCR 诱变和盒诱 变进行制备。
     免疫缀合物
     本发明还提供免疫缀合物 ( 可互换地称为 “抗体 - 药物缀合物” 或 “ADCs” )， 其包 含缀合至一种或多种细胞毒性剂的抗体， 所述细胞毒性剂诸如化疗剂、 药物、 生长抑制剂、 毒素 ( 例如蛋白质毒素， 细菌、 真菌、 植物或动物起源的酶活性毒素或其片段 ) 或放射性同 211 131 125 90 186 位素， 诸如 At ， I ， I ， Y ， Re ， Re188， Sm153， Bi212， P32， pb212 和 Lu 的放射性同位素 ( 即 放射缀合物 )。
     在癌症治疗中， 免疫缀合物已经用于局部投递细胞毒性剂， 即杀死或抑制细胞生 长或增殖的药物 (Lambert， J.(2005)Curr.Opinion in Pharmacology ( 药学新观点 )5 ： 543-549 ； Wu 等， (2005)Nature Biotechnology( 自 然 ： 生 物 技 术 )23(9) ： 1137-1146 ； Payne， G.(2003)i 3 ： 207-212 ； Syrigos 和 Epenetos(1999)Anticancer Research( 抗 癌 研 究 )19 ： 605-614 ； Niculescu-Duvaz and Springer(1997)Adv.Drug Deliv.Rev.26 ： 151-172 ； 美国专利 4,975,278)。免疫缀合物允许将药物部分靶向投递至肿瘤， 并在那儿 进行细胞内积累， 而系统施用未经缀合的药物可对正常细胞以及试图消除的肿瘤细胞导 致 不 可 接 受 的 毒 性 水 平 (Baldwin 等， Lancet( 柳 叶 刀 )(1986 年 3 月 15 日 ) 第 603-05 页； Thorpe， (1985)“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy ： A Review( 肿 瘤 治 疗 中 细 胞 毒 性 剂 的 抗 体 载 体 ： 综 述 )， ”在 Monoclonal Antibodies ′ 84 ： Biological And Clinical Applications( 单克隆抗体 84 ： 生物学和临床应用 ) 中， (A.Pinchera 等 编 辑 )， 第 475-506 页 )。 多 克 隆 抗 体 和 单 克 隆 抗 体 皆 有 报 道 可 用 于 这 些 策 略 (Rowland 等， (1986)Cancer Immunol.Immunother.( 癌 症 免 疫 学 和 免 疫 疗 法 )， 21 ： 183-87)。 这 些 方 法 中 所 使 用 的 药 物 包 括 道 诺 霉 素 (daunomycin)、 多柔比星(doxorubicin)、 甲 氨 蝶 呤 (methotrexate) 和 长 春 地 辛 (vindesine)(Rowland 等， 1986， 见上文 )。抗体 - 毒素缀合物中所使用的毒素包括细菌毒素诸如白喉毒素、 植物毒素诸 如蓖麻毒蛋白、 小分子毒素诸如格尔德霉素 (geldanamycin)(Mandler 等 (2000)J.Nat. Cancer Inst.( 国家肿瘤研究所杂志 )92(19) ： 1573-1581 ； Mandler 等， (2000)Bioorganic & Med.Chem.Letters( 生 物 有 机 和 医 学 化 学 通 讯 )10 ： 1025-1028 ； Mandler 等， (2002) Bioconjugate Chem.( 生物缀合化学 )13 ： 786-791)， 美登木素生物碱类 (maytansinoids) (EP 1391213 ； Liu 等， (1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美国科学院学报 )93 ： 8618-8623)， 和加利车霉素 (calicheamicin)(Lode 等， (1998)Cancer Res.( 癌症研究 )58 ： 2928 ； Hinman 等， (1993)Cancer Res.( 癌症研究 )53 ： 3336-3342)。毒素可通过包括微管蛋白结合、 DNA 结合或拓扑异构酶抑制在内的机制发挥其细胞毒性效果。 有些细胞毒性药物在与大的抗体 或蛋白质受体配体缀合时趋于失活或活性降低。
     已经显示曲妥珠单抗 -DM1( 或 T-DM1) 在曲妥珠单抗 - 敏感的和曲妥珠单抗 - 不 敏 感 的 HER2- 过 表 达 癌 症 模 型 中 有 效。(US 7097840)。 ( 替伊莫单抗 (ibritumomab tiuxetan)， Biogen/Idec) 是由针对在正常和恶性 B 淋巴细胞表面上发现的 CD20 抗原的鼠 IgG1κ 单克隆抗体与通过硫脲接头 - 螯合剂所结合的 111In 或 90Y 放射性 同位素构成的抗体 - 放射性同位素缀合物 (Wiseman 等， (2000)Eur.Jour.Nucl.Med.27(7) ： 766-77 ； Wiseman 等， (2002)Blood( 血 液 )99(12) ： 4336-42 ； Witzig 等， (2002)J.Clin. Oncol.( 临床肿瘤学杂志 )20(10) ： 2453-63 ； Witzig 等， (2002)J.Clin.Oncol.( 临床肿瘤 学杂志 )20(15) ： 3262-69)。尽管 ZEVALIN 具有针对 B 细胞非霍奇金氏 (non-Hodgkin’ s) 淋 巴 瘤 (NHL) 的 活 性， 然 而 施 药 在 大 多 数 患 者 中 导 致 严 重 且 长 时 间 的 血 细 胞 减 少。 TM MYLOTARG ( 吉姆单抗奥佐米星 (gemtuzumab ozogamicin)， Wyeth Pharmaceuticals)， 即 由 huCD33 抗体与加利车霉素连接而构成的抗体 - 药物缀合物， 在 2000 年批准用于经注射 治疗急性骨髓性白血病 (Drugs of the Future( 未来药物 )(2000)25(7) ： 686 ； 美国专利 4970198 ； 5079233 ； 5585089 ； 5606040 ； 5693762 ； 5739116 ； 5767285 ； 5773001)。Cantuzumab mertansine(Immunogen， Inc.)， 即由 huC242 抗体经二硫化物接头 SPP 与美登木素生物碱类 药物部分 DM1 连接而构成的抗体 - 药物缀合物， 正在进行用于治疗表达 CanAg 的癌症诸如 结肠癌、 胰腺癌、 胃癌和其它癌的 II 期试验。 MLN-2704(Millennium Pharm.， BZLBiologics， Immunogen Inc.)， 即由抗前列腺特异膜抗原 (PSMA) 单克隆抗体与美登木素生物碱类药 物部分 DM1 连接而构成的抗体 - 药物缀合物， 正在进行用于前列腺肿瘤潜在治疗的开发。 将多拉司他汀 (dolastatin) 的合成类似物 auristatin 肽、 auristatin E(AE) 和单甲基 auristatin(MMAE) 与嵌合单克隆抗体 cBR96( 对癌上的 Lewis Y 特异 ) 和 cAC10( 对恶性 血液肿瘤上的 CD30 特异 ) 缀合 (Doronina 等， (2003)Nature Biotechnol.( 自然 ： 生物技 术 )21(7) ： 778-784)， 且正在进行治疗性开发。
     在某些实施方案中， 免疫缀合物包含抗体和化疗剂或其它毒素。本文 ( 例如上 文 ) 描述了可用于生成此类免疫缀合物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括白 喉毒素 A 链、 白喉毒素的非结合活性片段、 外毒素 A 链 ( 来自铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa))、 蓖 麻 毒 蛋 白 (ricin)A 链、 相 思 豆 毒 蛋 白 (abrin)A 链、 蒴莲根毒蛋白 (modeccin)A 链、 α- 帚曲霉素 (sarcin)、 油桐 (Aleurites fordii) 蛋白、 香石竹毒蛋白 (dianthin proteins)、 美洲商陆 (Phytolaca americana) 蛋白 (PAPI、 PAPII 和 PAP-S)、 苦瓜 (Momordica charantia) 抑制剂、 麻疯树毒蛋白 (curcin)、 巴豆毒蛋白 (crotin)、 肥皂 草 (sapaonaria officinalis) 抑制剂、 白树毒蛋白 (gelonin)、 丝林霉素 (mitogellin)、 局限曲菌素 (restrictocin)、 酚霉素 (phenomycin)、 依诺霉素 (enomycin) 和单端孢菌素 (trichothecenes)。 参见例如 1993 年 10 月 28 日公开的 WO 93/21232。 多种放射性核素可用 212 131 131 90 186 于生成放射缀合抗体。 实例包括 Bi、 I、 In、 y、 和 Re。 抗体和细胞毒性剂的缀合物可 使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备， 诸如 N- 琥珀酰亚胺基 -3-(2- 吡啶基二硫代 ) 丙酸 酯 (SPDP)、 亚氨基硫烷 (IT)、 亚氨酸酯 ( 诸如己二亚氨盐酸二甲酯 (dimethyl adipimidate HCl))、 活性酯类 ( 诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯 )、 醛类 ( 诸如戊二醛 )、 双叠氮化合物 ( 诸 如双 ( 对 - 叠氮苯甲酰基 ) 己二胺 )、 双重氮衍生物 ( 诸如双 ( 对 - 重氮苯甲酰基 ) 乙二 胺 )、 二异氰酸酯 ( 诸如甲苯 2， 6- 二异氰酸酯 )、 和双活性氟化合物 ( 诸如 1， 5- 二氟 -2， 4- 二硝基苯 ) 的双功能衍生物。例如， 可如 Vitetta 等， Science( 科学 )238 ： 1098(1987) 中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。 碳 -14 标记的 1- 异硫氰酸苯甲基 -3- 甲基二亚乙基三胺 五乙酸 (MX-DTPA) 是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的例示性螯合剂。 参见 WO 94/11026。
     本文还意欲抗体与一种或多种小分子毒素诸如加利车霉素 (calicheamicin)、 美 登木素生物碱类 (maytansinoids)、 多拉司他汀 (dolastatins)、 aurostatins、 单端孢霉素 (trichothecene) 和 CC1065 及这些毒素具有毒素活性的衍生物的缀合物。
     美登表 (Maytansine) 和美登木素生物碱类
     在一些实施方案中， 免疫缀合物包含缀合至一个或多个美登木素生物碱类分子的 抗体 ( 全长或片段 )。
     美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝分裂抑制剂。 美 登素最初从东非灌木齿叶美登木 (Maytenus serrata) 分离得到 ( 美国专利 3,896,111)。 随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类， 诸如美登醇和 C-3 美登醇酯 ( 美国专 利 4,151,042)。例如下列美国专利公开了合成美登醇及其衍生物和类似物 ： 4,137,230 ； 4,248,870 ； 4,256,746 ； 4,260,608 ； 4,265,814 ； 4,294,757 ； 4,307,016 ； 4,308,268 ； 4,308,269 ； 4,309,428 ； 4,313,946 ； 4,315,929 ； 4,317,821 ； 4,322,348 ； 4,331,598 ； 4,361,650 ； 4,364,866 ； 4,424,219 ； 4,450,254 ； 4,362,663 ； 和 4,371,533。
     在抗体药物缀合物中美登木素生物碱类药物部分是有吸引力的药物部分， 因为它 们： (i) 相对易于通过发酵或化学修饰、 从发酵产物衍生而制备， (ii) 易于用适于通过非二 硫化物接头缀合至抗体的功能基团衍生化， (iii) 在血浆中稳定， 和 (iv) 针对多种肿瘤细 胞系有效。
     已经公开了含有美登木素生物碱类的免疫缀合物、 其制备方法及其治疗用途， 例 如美国专利 5,208,020， 5,416,064 及欧洲专利 EP 0 425 235B1， 明确将其公开内容通过引 用并入本文。Liu 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美国科学院学报 )93 ： 8618-8623(1996) 记 载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体 C242 连接的称为 DM1 的美登木素生物碱类的 免疫缀合物。发现该缀合物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性， 而且在体内肿瘤 生长测定法中显示抗肿瘤活性。 Chari 等， Cancer Research( 癌症研究 )52 ： 127-131(1992) 记载了其中美登木素生物碱类经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体 A7 或结合 HER-2/neu 癌基因的另一种鼠单克隆抗体 TA.1 缀合的免疫缀合物。在体外在人乳 癌细胞系 SK-BR-3 上测试了 TA.1- 美登木素生物碱类缀合物的细胞毒性， 该细胞系每个细胞表达 3x105 个 HER-2 表面抗原。药物缀合物达到了与游离美登木素生物碱类药物相似的 一定程度的细胞毒性， 这可通过增加每个抗体分子缀合的美登木素生物碱类分子数目来提 高。A7- 美登木素生物碱类缀合物在小鼠中显示低系统性细胞毒性。
     抗体 - 美登木素生物碱类缀合物通过将抗体与美登木素生物碱类分子化学连接 且不显著削弱抗体或美登木素生物碱类分子的生物学活性来制备。参见例如， 美国专利 5,208,020( 其公开内容通过引用明确并入本文 )。每个抗体分子缀合平均 3-4 个美登木素 生物碱类分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示功效， 且对抗体的功能或溶解度没有负 面影响， 尽管预计甚至一个分子的毒素 / 抗体也将较之裸抗体的使用增强细胞毒性。美登 木素生物碱类在本领域是众所周知的， 而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如 美国专利 5,208,020 和上文提及的其它专利及非专利发表物中公开了合适的美登木素生 物碱类。 优选的美登木素生物碱类是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的 美登醇类似物， 诸如各种美登醇酯。
     本领域知道许多连接基团可用于制备抗体 - 美登木素生物碱类缀合物， 包括例如 美国专利 5,208,020 或欧洲专利 0425235B1， Chari 等， Cancer Research( 癌症研究 )52 ： 127-131(1992)， 和 2004 年 10 月 8 日提交的美国专利申请 No.10/960,602 中所公开的， 其公 开内容通过引用明确并入本文。 可如 2004 年 10 月 8 日提交的美国专利申请 No.10/960,602 所公开的制备包含接头成分 SMCC 的抗体 - 美登木素生物碱类缀合物。连接基团包括二硫 化物基团、 硫醚基团、 酸不稳定基团、 光不稳定基团、 肽酶不稳定基团、 或酯酶不稳定基团， 正如上文所述专利中所公开的， 二硫化物和硫醚基团是优选的。另外的连接基团在本文进 行了描述和例示。
     可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱类的缀合物， 诸如 N- 琥珀酰亚胺基 -3-(2- 吡啶基二硫代 ) 丙酸酯 (SPDP)、 琥珀酰亚胺基 -4-(N- 马来酰亚氨 基甲基 ) 环己烷 -1- 羧酸酯 (SMCC)、 亚氨基硫烷 (IT)、 亚氨酸酯 ( 诸如己二亚氨盐酸二甲 酯 )、 活性酯类 ( 诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯 )、 醛类 ( 诸如戊二醛 )、 双叠氮化合物 ( 诸 如双 ( 对 - 叠氮苯甲酰基 ) 己二胺 )、 双重氮衍生物 ( 诸如双 ( 对 - 重氮苯甲酰基 )- 乙二 胺 )、 二异氰酸酯 ( 诸如甲苯 2， 6- 二异氰酸酯 )、 和双活性氟化合物 ( 诸如 1， 5- 二氟 -2， 4- 二硝基苯 ) 的双功能衍生物。特别优选的偶联剂包括 N- 琥珀酰亚胺基 -3-(2- 吡啶基二 硫代 ) 丙酸酯 (SPDP)(Carlsson 等， Biochem.J.( 生物化学杂志 )173 ： 723-737(1978)) 和 N- 琥珀酰亚氨基 -4-(2- 吡啶基硫代 ) 戊酸酯 (SPP)， 由此提供二硫键连接。
     根据连接的类型， 可将接头附着于美登木素生物碱类分子的多个位置。 例如， 可使 用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在具有羟基的 C-3 位置、 经羟 甲基修饰的 C-14 位置、 经羟基修饰的 C-15 位置、 和具有羟基的 C-20 位置。在一个优选实 施方案中， 在美登醇或美登醇类似物的 C-3 位置形成键连接。
     Auristatin 和多拉司他汀
     在有些实施方案中， 免疫缀合物包含与多拉司他汀 (dolastatin) 或多拉司他汀 肽类似物和衍生物， auristatin 缀合的抗体 ( 美国专利 5635483 ； 5780588)。多拉司他汀类 和 auristatin 类已经显示出干扰微管动力学、 GTP 水解、 及核和细胞分裂 (Woyke 等 (2001) Antimicrob.Agents and Chemother.45(12) ： 3580-3584) 且具有抗癌 (US 5663149) 和抗 真菌活性 (Pettit 等， (1998)Antimicrob.Agents Chemother.42 ： 2961-2965)。 多拉司他汀或 auristatin 药物结构部分可经由肽药物结构部分的 N( 氨基 ) 末端或 C( 羧基 ) 末端附 着于抗体 (WO 02/088172)。
     例示性的 auristatin 实施方案包括 N- 末端连接的单甲基 auristatin 药物结构 部分 DE 和 DF， 披露于 2004 年 11 月 5 日提交的 “Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands( 能 缀 合 至 配 体 的 单 甲 基 缬 氨 酸 化 合 物 )” ， 美国序列号 No.10/983,340， 明确将其公开内容完整收入本文。
     典型的是， 基于肽的药物结构部分可通过在两个或多个氨基酸和 / 或肽片段 之间形成肽键来制备。此类肽键可依照例如肽化学领域众所周知的液相合成法来制备 ( 参 见 E. 和 K.Lübke， “The Peptides( 肽 )， ” volume 1， 第 .76-136 页， 1965， Academic Press)。Auristatin/ 多拉司他汀药物结构部分可依照以下文献中的方法来制 备： US 5635483 ； US 5780588 ； Pettit 等， (1989)J.Am.Chem.Soc.111 ： 5463-5465 ； Pettit 等， (1998)Anti-Cancer Drug Design( 抗 癌 药 物 设 计 )13 ： 243-277 ； Pettit， G.R.， 等， Synthesis( 合 成 )， 1996， 719-725 ； 和 Pettit 等， (1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.15 ： 859-863 ； 也 见 Doronina(2003)Nat.Biotechnol.( 自 然 ： 生 物 技 术 )21(7) ： 778-784 ； “Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands( 能缀合至配体的单 甲基缬氨酸化合物 )” ， 美国序列号 No.10/983,340， 2004 年 11 月 5 日提交， 将其完整收入本 文作为参考 ( 披露了例如制备缀合至接头的诸如 MMAE 和 MMAF 的单甲基缬氨酸化合物的接 头和方法 )。
     加利车霉素
     在其它实施方案中， 免疫缀合物包含与一个或多个加利车霉素分子缀合的抗体。 加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链 DNA 断裂。关于加利车霉素家族 缀 合 物 的 制 备 参 见 美 国 专 利 5,712,374， 5,714,586， 5,739,116， 5,767,285， 5,770,701， 5,770,710， 5,773,001， 5,877,296( 都授予 American Cyanamid Company)。 可用的加利车霉 素结构类似物包括但不限于 γ1I， α2I， α3I， N- 乙酰基 -γ1I， PSAG 和 θI1(Hinman 等， Cancer Research( 癌症研究 )53 ： 3336-3342(1993)， Lode 等， Cancer Research( 癌症研 究 )58 ： 2925-2928(1998) ； 及上述授予 American Cyanamid 的美国专利 )。 可与抗体缀合的 另一种抗肿瘤药物是 QFA， 它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和 QFA 都具有胞内作用位点， 且不易穿过质膜。因此， 这些试剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细 胞毒性效果。
     其它细胞毒性剂
     可与抗体缀合的其它抗肿瘤剂包括 BCNU、 链佐星 (streptozoicin)、 长春新碱 (vincristine)、 5- 氟尿嘧啶、 美国专利 5,053,394、 5,770,710 记载的统称为 LL-E33288 复 合物的试剂家族、 及埃斯波霉素类 (esperamicins)( 美国专利 5,877,296)。
     可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素 A 链、 白喉毒素的非结合活性片段、 外 毒素 A 链 ( 来自铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa))、 蓖麻毒蛋白 (ricin)A 链、 相思豆毒蛋白 (abrin)A 链、 蒴莲根毒蛋白 (modeccin)A 链、 α- 帚曲霉素 (sarcin)、 油 桐 (Aleurites fordii) 蛋白、 香石竹毒蛋白 (dianthin protein)、 美洲商陆 (Phytolaca americana) 蛋 白 (PAPI、 PAPII 和 PAP-S)、 苦 瓜 (Momordica charantia) 抑 制 剂、 麻疯 树毒蛋白 (curcin)、 巴豆毒蛋白 (crotin)、 肥皂草 (sapaonaria officinalis) 抑制剂、白 树 毒 蛋 白 (gelonin)、 丝 林 霉 素 (mitogellin)、 局 限 曲 菌 素 (restrictocin)、 酚霉素 (phenomycin)、 依诺霉素 (enomycin) 和单端孢菌素 (tricothecenes)。参见例如 1993 年 10 月 28 日公开的 WO 93/21232。
     本发明还考虑了以下免疫缀合物， 其在抗体和具有核酸降解活性的化合物 ( 如核 糖核酸酶或 DNA 内切核酸酶， 诸如脱氧核糖核酸酶 ； DNA 酶 ) 之间形成。
     为了选择性破坏肿瘤， 抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生 成放射缀合的抗体。实例包括 At211， I131， I125， y90， Re186， Re188， Sm153， Bi212， p32， pb212 和 Lu 的 放射性同位素。在将缀合物用于检测时， 可包含放射性原子用于闪烁照相研究， 例如 tc99m 或 I123， 或是包含自旋标记物用于核磁共振 (NMR) 成像 ( 也称为磁共振成像， mri)， 诸如再次 碘 -123、 碘 -131、 铟 -111、 氟 -19、 碳 -13、 氮 -15、 氧 -17、 钆、 锰或铁。
     可以已知方式将放射性或其它标记物掺入缀合物。 例如， 可生物合成肽， 或是通过 化学氨基酸合成法合成肽， 其中使用牵涉例如氟 -19 代替氢的合适氨基酸前体。可经肽中 的半胱氨酸残基来附着标记物， 诸如 Tc99m 或 I123， Re186， Re188 和 In111。可以经赖氨酸残基来 附着钇 -90。IODOGEN 法 (Fraker 等 (1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80 ： 49-57) 可用 于掺入碘 123。 “Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy( 免疫闪烁成像中的单 克隆抗体 )” (Chatal， CRC Press 1989) 详细记载了其它方法。
     抗体和细胞毒性剂的缀合物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备， 诸如 N- 琥 珀酰亚胺基 -3-(2- 吡啶基二硫代 ) 丙酸酯 (SPDP)、 琥珀酰亚胺基 -4-(N- 马来酰亚氨甲 基 ) 环己烷 -1- 羧酸酯 (SMCC)、 亚氨基硫烷 (IT)、 亚氨酸酯 ( 诸如己二亚氨盐酸二甲酯 )、 活性酯类 ( 诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯 )、 醛类 ( 诸如戊二醛 )、 双叠氮化合物 ( 诸如双 ( 对 - 叠氮苯甲酰基 ) 己二胺 )、 双重氮衍生物 ( 诸如双 ( 对 - 重氮苯甲酰基 ) 乙二胺 )、 二 异氰酸酯 ( 诸如甲苯 2， 6- 二异氰酸酯 )、 和双活性氟化合物 ( 诸如 1， 5- 二氟 -2， 4- 二硝基 苯 ) 的双功能衍生物。例如， 可如 Vitetta 等， Science( 科学 )238 ： 1098(1987) 中所述制 备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳 -14 标记的 1- 异硫氰酸苯甲基 -3- 甲基二亚乙基三胺五乙酸 (MX-DTPA) 是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见 WO 94/11026。接头 可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的 “可切割接头” 。 例如， 可使用酸不稳定接头、 肽酶 敏感接头、 光不稳定接头、 二甲基接头、 或含二硫化物接头 (Chari 等， Cancer Research( 癌 症研究 )52 ： 127-131(1992) ； 美国专利 5,208,020)。
     化合物明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的 ADC ： 商品化 ( 如购自 Pierce Biotechnology， Inc.， Rockford， IL.， 美 国 ) 的 BMPS、 EMCS、 GMBS、 HBVS、 LC-SMCC、 MBS、 MPBH、 SBAP、 SIA、 SIAB、 SMCC、 SMPB、 SMPH、 硫代 -EMCS、 硫代 -GMBS、 硫代 -KMUS、 硫代 -MBS、 硫 代 -SIAB、 硫代 -SMCC、 和硫代 -SMPB、 和 SVSB( 琥珀酰亚氨基 -(4- 乙烯基砜 ) 苯甲酸酯 )。 见 2003-2004 年度应用手册和产品目录 (Applications Handbook and Catalog) 第 467-498 页。
     抗体药物缀合物的制备
     在抗体 - 药物缀合物 (ADC) 中， 将抗体 (Ab) 经接头 (L) 与一个或多个药物结构部 分 (D) 缀合， 例如每个抗体缀合约 1 个至约 20 个药物结构部分。可采用本领域技术人员知 道的有机化学反应、 条件和试剂通过数种路径来制备通式 I 的 ADC， 包括 ： (1) 抗体的亲核基 团经共价键与二价接头试剂反应， 形成 Ab-L， 随后与药物结构部分 D 反应 ； 和 (2) 药物结构部分的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应， 形成 D-L， 随后与抗体的亲核基团反应。本 发明描述了制备 ADC 的另外的方法。
     Ab-(L-D)p I
     接头可由一个或多个接头构件构成。示例性接头构件包括 6- 马来酰亚胺己酰 基 (6-maleimidocaproyl， “MC” )、 马 来 酰 亚 胺 基 丙 酰 基 (maleimidopropanoyl， “MP” )、 缬氨酸 - 瓜氨酸 (“val-cit” )、 丙氨酸 - 苯丙氨酸 (“ala-phe” )、 对 - 氨基苯甲氧基羰 基 (p-aminobenzyloxycarbonyl， “PAB” )、 N- 琥珀酰亚胺基 -4-(2- 吡啶基硫代 ) 戊酸酯 (“SPP” )、 N- 琥珀酰亚胺基 -4-(N- 马来酰亚氨甲基 ) 环己烷 -1- 羧酸酯 (“SMCC’ )、 和 N- 琥珀酰亚胺基 (4- 碘 - 乙酰基 ) 氨基苯甲酸酯 ( “SLAB” )。 另外的接头构件是本领域已知 的， 有些在本文进行了描述。 也见 “Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands( 能缀合至配体的单甲基缬氨酸化合物 )， ” 2004 年 11 月 5 日提交， 美国序列号 No.10/983,340， 其全文内容通过引用并入本文。
     在一些实施方案中， 接头可包含氨基酸残基。 示例性氨基酸接头构件包括二肽、 三 肽、 四肽、 或五肽。示例性二肽包括 ： 缬氨酸 - 瓜氨酸 (vc 或 val-cit)、 丙氨酸 - 苯丙氨酸 (af 或 ala-phe)。 示例性三肽包括 ： 甘氨酸 - 缬氨酸 - 瓜氨酸 (gly-val-cit) 和甘氨酸 - 甘 氨酸 - 甘氨酸 (gly-gly-gly)。包含氨基酸接头构件的氨基酸残基包括天然存在的那些， 以及稀有氨基酸 (minor amino acid) 和非天然存在的氨基酸类似物， 如瓜氨酸。可设计和 优化氨基酸接头构件的选择性以用于通过特定的酶 ( 如肿瘤相关的蛋白酶、 组织蛋白酶 B、 C 和 D、 或纤溶酶蛋白酶 ) 进行酶切割。
     抗体的亲核基团包括但不限于 ： (i)N 末端氨基 ； (ii) 侧链氨基， 如赖氨酸 ； (iii) 侧链巯基， 如半胱氨酸 ； 和 (iv) 糖基化抗体中糖的羟基或氨基。氨基、 巯基、 和羟基是亲核 的， 能够与接头部分上的亲电子基团反应而形成共价键， 而接头试剂包括 ： (i) 活性酯类， 诸如 NHS 酯、 HOBt 酯、 卤代甲酸酯、 和酸性卤化物 ； (ii) 烷基和苯甲基卤化物， 诸如卤代乙酰 胺； (iii) 醛类、 酮类、 羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键， 即半胱 氨酸桥。可通过还原剂诸如 DTT( 二硫苏糖醇 ) 处理使抗体具有与接头试剂缀合的反应活 性。由此每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性硫醇亲核体。可经由赖氨酸与 2- 亚氨 基硫烷 (Traut 氏试剂 ) 的反应， 导致胺转变为硫醇， 从而将额外亲核基团引入抗体。通过 引入一个、 两个、 三个、 四个、 或更多半胱氨酸残基 ( 例如制备包含一个或多个非天然半胱 氨酸氨基酸残基的突变抗体 ) 可将反应性硫醇基引入抗体 ( 或其片段 )。
     还可通过修饰抗体引入可与接头试剂或药物上的亲核取代基反应的亲电子结构 部分来生成抗体 - 药物缀合物。可用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖， 从而形成 可与接头试剂或药物结构部分的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺 Schiff 碱基可形成 稳定的键， 或者可用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连接。 在一个实施方案中， 糖基 化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可在蛋白质中生成羰 ( 醛 和酮 ) 基团， 它可与药物上的适当基团反应 (Hermanson， Bioconjugate Techniques)。在 另一个实施方案中， 包含 N 末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可与偏高碘酸钠反应， 导致 代替第一个氨基酸而生成醛 (Geoghegan & Stroh， (1992)Bioconjugate Chem.( 生物缀合 物化学 )3 ： 138-146 ； US 5362852)。此类醛可与药物结构部分或接头亲核体反应。
     同样， 药物结构部分上的亲核基团包括但不限于 ： 胺、 硫醇、 羟基、 酰肼、 肟、 肼、 缩氨基硫脲、 肼羧酸酯、 和芳基酰肼基团， 它们能够与接头部分上的亲电子基团反应而形成共 价键， 而接头试剂包括 ： (i) 活性酯类， 诸如 NHS 酯、 HOBt 酯、 卤代甲酸酯、 和酸性卤化物 ； (ii) 烷基和苯甲基卤化物， 诸如卤代乙酰胺 ； (iii) 醛类、 酮类、 羧基、 和马来酰亚胺基团。
     或者， 可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒性剂的融合蛋白。 DNA 的长度可包含各自编码缀合物两个部分的区域， 或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区 域分开， 该接头肽不破坏缀合物的期望特性。
     在又一个实施方案中， 可将抗体与 “受体” ( 诸如链霉亲和素 ) 缀合从而用于肿瘤 预先靶向， 其中对患者施用抗体 - 受体缀合物， 接着使用清除剂由循环中清除未结合的缀 合物， 然后施用与细胞毒性剂 ( 如放射性核苷酸 ) 缀合的 “配体” ( 如亲合素 )。
     重组方法和组合物
     抗体可以使用例如在美国专利 4,816,567 中描述的重组方法和组合物产生。在一 个实施方案中， 提供了编码本文描述的抗 HER 抗体的分离的核酸。此类核酸可编码包含抗 体 VL 的氨基酸序列和 / 或包含其 VH 的氨基酸序列 ( 例如抗体的轻链和 / 或重链 )。在又 一个实施方案中， 提供了包含此类核酸的一个或多个载体 ( 例如表达载体 )。 在又一个实施 方案中， 提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中， 宿主细胞包含 ( 例如， 用下述各项转化 ) ： (1) 包含核酸的载体， 所述核酸编码包含抗体的 VL 的氨基酸序列和包含 抗体的 VH 的氨基酸序列， 或 (2) 包含核酸的第一载体， 所述核酸编码包含抗体的 VL 的氨基 酸序列， 和包含核酸的第二载体， 所述核酸编码包含抗体的 VH 的氨基酸序列。在一个实施 方案中， 宿主细胞是真核的， 例如中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞或淋巴样细胞 ( 例如， Y0， NS0， Sp20 细胞 )。在一个实施方案中， 提供了制备抗 HER 抗体的方法， 其中所述方法包括， 在适 合抗体表达的条件下， 培养包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞， 如上文所提供的， 和任选 地从所述宿主细胞 ( 或宿主细胞培养基 ) 回收所述抗体。
     为了重组生产抗 -HER 抗体， 分离编码抗体 ( 例如上文所描述的抗体 ) 的核酸， 并 插入一个或多个载体， 用于在宿主细胞中进一步克隆和 / 或表达。此类核酸易于使用常规 规程分离和测序 ( 例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷 酸探针进行 )。
     用于克隆或表达编码抗体的载体的适当宿主细胞包括本文描述的原核或真核细 胞。例如， 抗体可在细菌中产生， 特别当不需要糖基化和 Fc 效应子功能时。对于抗体片段 和多肽在细菌中的表达， 见， 例如， 美国专利 5,648,237， 5,789,199 和 5,840,523。( 还见 Charlton， 分子生物学中的方法 (Methods in Molecular Biology)， 卷 248(B.K.C.Lo， 编 辑， Humana 出版社， Totowa， NJ， 2003)， 第 245-254 页， 描述抗体片段在大肠杆菌中的表达 )。 在表达后， 抗体可以从可溶级分中的细菌细胞糊状物分离， 并且可以进一步纯化。
     除了原核生物以外， 真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是关于编码抗体的载体的 合适克隆或表达宿主， 包括真菌和酵母菌株， 其糖基化途径已经进行 “人源化” ， 导致生产具 有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见 Gerngross， Nat.Biotech.( 自然生物技术 )22 ： 1409-1414(2004) 和 Li 等， Nat.Biotech.( 自然生物技术 )24 ： 210-215(2006)。
     适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体 ( 无脊椎动物和脊椎动 物 )。 无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。 已经鉴定了许多杆状病毒株， 其可与昆 虫细胞联合使用， 特别是用于转染草地夜蛾 (Spodoptera frugiperda) 细胞。还可利用植物细胞培养物作为宿主。见， 例如， 美国专利 5,959,177， 6,040,498， 6,420,548， 7,125,978 和 6,417,429( 描述在转基因植物中生产抗体的 PLANTIBODIESTM 技 术 )。
     也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如， 可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺 乳动物细胞系。 有用哺乳动物宿主细胞系的其它实例是用 SV40 转化的猴肾 CV1 系 (COS-7) ； 人 胚 肾 系 (293 或 293 细 胞， 如 例 如 Graham 等， 遗 传 病 毒 学 杂 志 (J.Gen Virol.)36 ： 59(1977) 中所描述的 ) ； 幼仓鼠肾细胞 (BHK) ； 小鼠塞托利 (sertoli) 细胞 (TM4 细胞， 如例 如在 Mather， 生物繁殖 (Biol.Reprod.)23 ： 243-251(1980) 中描述的 ) ； 猴肾细胞 (CV1) ； 非 洲绿猴肾细胞 (VERO-76) ； 人宫颈癌细胞 (HELA) ； 犬肾细胞 (MDCK) ； 布法罗大鼠 (buffalo rat) 肝细胞 (BRL 3A) ； 人肺细胞 (W138) ； 人肝细胞 (Hep G2) ； 小鼠乳瘤 (MMT 060562) ； TRI 细胞， 如例如 Mather 等， Annals N.Y.Acad.Sci.383 ： 44-68(1982) 中所描述的 ； MRC5 细胞 ； 和 FS4 细胞。 其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞， 包括 DHFR-CHO 细胞 (Urlaub 等， 美国国家科学院学报 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA)77 ： 4216(1980)) ； 和骨 髓瘤细胞系如 Y0， NS0 和 Sp2/0。关于适合生产抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述见 例如 Yazaki 和 Wu， 在分子生物学中的方法 (Methods in Molecular Biology)， 卷 248(B. K.C.Lo， ed.， Humana Press， Totowa， NJ)， 第 255-268 页 (2003)。
     治疗用途
     本文描述的抗体和抗体片段可用于治疗癌症， 包括癌前的、 非转移性的、 转移性的 和癌性肿瘤 ( 例如， 早期癌症 )， 或用于治疗有发生癌症 ( 例如乳腺癌 ) 风险的受试者。抗 体和抗体片段也可用于治疗或预防非恶性疾病， 诸如神经变性病症、 精神病学病症或自身 免疫性疾病。
     术语癌症包括一组增殖性病症， 包括但不限于癌前生长、 良性肿瘤、 和恶性肿瘤。 良性肿瘤维持局限在原始位点并且没有浸润、 侵袭或转移至远方位点的能力。恶性肿瘤将 侵袭并破坏其周围的其它组织。 它们也获得了从其起始处剥离并扩散至身体其它部分的能 力 ( 转移 )， 通常通过血流或通过淋巴结所在的淋巴系统转移。 原发肿瘤通过它们所发生的 组织类型进行分类 ； 转移瘤通过衍生癌细胞的组织类型进行分类。 经过一段时间， 恶性肿瘤 的细胞变得更加异常并显得更不像正常细胞。这种癌细胞的外观变化称为肿瘤分级， 并且 癌细胞被描述为良好分化的、 中度分化的、 较差分化的或未分化的。 良好分化的细胞显得非 常正常并且类似于它们所来源的正常细胞。 未分化的细胞是变得如此异常的细胞以至于不 能确定该细胞的来源。
     肿瘤可以是实体瘤或非实体瘤或软组织肿瘤。软组织肿瘤的实例包括白血病 ( 例 如， 慢性髓细胞性白血病 (chronic myelogenous leukemia)、 急性髓细胞性白血病 (acute myelogenous leukemia)、 成 人 急 性 淋 巴 细 胞 性 白 血 病 (adult acute lymphoblastic leukemia)、 急性骨髓性白血病 (acute myelogenous leukemia)、 成熟急性 B 细胞型淋巴细 胞性白血病 (mature B-cell acute lymphoblastic leukemia)、 慢性淋巴细胞性白血病 (chronic lymphocytic leukemia)、 前淋巴细胞性白血病 (polymphocytic leukemia)、 或 毛细胞性白血病 (hairy cell leukemia))、 或淋巴瘤 (lymphoma)( 例如， 非霍奇金淋巴瘤 (non-Hodgkin′ s lymphoma)、 皮肤 T 细胞淋巴瘤 (cutaneous T-cell lymphoma)、 或霍奇森 病 (Hodgkin′ s disease)。实体瘤包括血液、 骨髓、 或淋巴系统之外的任何身体组织的癌症。实体瘤可进一步分为上皮细胞来源的那些和非上皮细胞来源的那些。上皮细胞实体瘤 的实例包括胃肠道、 结肠、 乳房、 前列腺、 肺、 肾、 肝、 胰、 卵巢、 头和颈、 口腔、 胃、 十二指肠、 小 肠、 大肠、 肛门、 胆囊、 阴唇、 鼻咽、 皮肤、 子宫、 男性生殖器、 泌尿器官、 膀胱的肿瘤及皮肤的 肿瘤 ( 包括黑素瘤 )。 非上皮来源的实体瘤包括肉瘤 (sarcomas)、 脑肿瘤 (brain tumors)、 和骨肿瘤 (bone tumors)。
     上皮癌 (epithelial cancers) 通常从良性肿瘤发展为前侵袭期 ( 例如， 原位癌 )， 至恶性癌症， 其已经渗透基底膜并侵入上皮下基质。
     在一个实施方案中， 多特异性抗体特异性结合 EGFR 和至少一个其它 HER 受体， 诸 如 HER2 或 HER3 或 HER4， 并且在预防和 / 或治疗实体瘤， 特别是结肠直肠肿瘤， 肺肿瘤 ( 诸 如非小细胞肺癌和鳞状细胞癌 )， 头和颈肿瘤， 卵巢肿瘤， 皮肤肿瘤， 胰肿瘤和 / 或乳房肿瘤 中有用。
     多特异性抗体也可用于减少或预防对靶向 HER 途径的治疗的抗性。在使用靶向 HER 途径的治疗中的显著限制是许多癌症患者显示的对所述治疗的治疗效果的抗性。一 些癌症患者对靶向 HER 途径的治疗显示无反应。其他癌症患者可能显示初始反应， 但是然 后对所述治疗变成抗性的。癌症对治疗是抗性的， 如果在接受治疗时癌症有进展 ( 难治性 的 )， 或如果在完成治疗方案的 12 个月内癌症有进展 ( 复发 )。
     在一个实施方案中， 靶向 HER 途径的治疗包括用靶向 HER 途径的抗体 ( 例如， EGFR 抗体， HER2 抗体， HER3 抗体和 / 或 HER4 抗体 ) 进行治疗。在另一个实施方案中， 靶向 HER 途径的治疗包括用化疗剂进行治疗。
     剂量和制剂
     可以与优良医学实践一致的方式配制、 剂量给药和施用本文的抗体或抗体片段组 合物。 在此内容中考虑的因素包括所治疗的具体病症、 所治疗的具体哺乳动物、 患者个体的 临床状态、 病症的起因、 投递药剂的部位、 施药的方法、 施药的日程安排、 和医学从业人员知 道的其它因素。确定待施用的抗体或抗体片段的 “治疗有效量” 需要考虑以上因素， 这是预 防、 缓解或治疗癌症所需的最小量。抗体或抗体片段不是必需而是任选与目前用于预防或 治疗癌症或发生癌症的风险的一种或多种药剂一起配制。 此类其它药剂的有效量取决于制 剂中存在的抗体或抗体片段的量、 病症或治疗的类型、 和上文讨论的其它因素。 这些通常是 以与上文所用相同剂量和施用途径使用， 或是迄今所用剂量的大约 1-99％。一般而言， 对 癌症的减轻或治疗涉及减少与癌症相关的一种或多种症状或医学问题。 药物的治疗有效量 可通过下述各项之一或其组合获得 ： 减少 ( 至少 10％、 20％、 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％、 100％或更多 ) 癌细胞数量 ； 减小或抑制肿瘤大小或肿瘤负荷 ； 抑制 ( 即减慢到 一定程度和 / 或停止 ) 癌细胞浸润到周围器官中 ； 在腺瘤的情况下减少激素的分泌 ； 减小 血管密度 ； 抑制肿瘤转移 ； 降低或抑制肿瘤生长 ； 和 / 或在一定程度上缓解一或多种与癌症 相关的症状。在一些实施方案中， 抗体或抗体片段用于预防受试者中癌症的发生或复发。
     一个实施方案中， 本发明可用于延长易患或被诊断患有癌症的人类患者的生存 期。生存期定义为首次给予药物到死亡的时间。生存期可通过治疗组相对于对照组的分段 危险率 (stratified hazard ratio)(HR) 来测定， 其代表治疗过程中患者死亡的危险性。
     另一实施方案中， 本发明的治疗显著增加易患或被诊断患有癌症的人类患者组中 的反应率， 所述患者用多种抗癌疗法治疗。反应率定义为对所述治疗有反应的被治疗患者的百分比。 一方面， 与单独的手术、 放疗、 或化疗治疗的组相比， 本发明利用抗体或抗体片段 和手术、 放疗、 或一或多种化疗剂的联合治疗显著增加被治疗患者组中的反应率， 该增加具 有低于 0.005 的 χ2(Chi-square)p- 值。
     在美国专利申请公开 20050186208 中描述了癌症治疗中疗效的另外的测量。
     治疗制剂通过混合具有需要纯度的活性成分和任选的生理可接受的载体、 赋 形剂或稳定剂使用本领域已知的标准方法进行制备 ( 雷明顿药物科学 (Remington ′ s Pharmaceutical Sciences)(20.sup.th edition)， A.Gennaro 编 辑， 2000， Lippincott， Williams & Wilkins， Philadelphia， Pa.)。可接受的载体包括盐水或缓冲剂如磷酸盐、 柠 檬酸盐和其它有机酸 ； 抗氧化剂包括抗坏血酸 ； 低分子量 ( 少于约 10 个残基 ) 多肽 ； 蛋白 质， 如血清白蛋白、 明胶或免疫球蛋白 ； 亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮， 氨基酸如甘氨酸、 谷氨酰胺、 天冬酰胺、 精氨酸或赖氨酸 ； 单糖、 二糖和其它碳水化合物包括葡萄糖、 甘露糖或 糊精 ； 螯合剂如 EDTA ； 糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇 ； 形成盐的平衡离子如钠 ； 和 / 或非离子 TM TM 表面活性剂如 TWEEN ， PLURONICS 或 PEG。
     任选地， 但优选地， 所述制剂包含药用盐、 优选地氯化钠并且优选地在约生理浓度 包含药用盐。任选地， 本发明的制剂可以包含药用防腐剂。在一些实施方案中， 防腐剂的浓 度范围是 0.1 到 2.0％， 典型地以 v/v 计。适合的防腐剂包括在药物领域中已知的那些。苄 醇、 苯酚、 间甲苯酚、 羟苯甲酯和羟苯丙酯是优选的防腐剂。 任选地， 本发明的制剂可以包含 浓度为 0.005 到 0.02％的药用表面活性剂。
     本文制剂也可以包含超过一种活性化合物， 如被治疗的特定适应症所需要， 优选 地是对彼此没有不良影响具有补充活性的那些。 所述分子适当地以对于意欲目的有效的量 组合存在。
     活性成分也可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊剂中， 例如 分别在胶状药物递送系统 ( 例如， 脂质体， 白蛋白微球体， 微乳， 纳米颗粒和纳米胶囊 ) 或在 粗乳状液中的羟甲基纤维素或明胶 - 微囊剂和聚 -( 甲基丙烯酸甲酯 ) 微囊剂。所述技术 在雷明顿药物科学 (Remington′ s Pharmaceutical Sciences) 见上文中公开。
     可以制备缓释制剂。 缓释制剂的适合的实例包括包含抗体的固体疏水性聚合物的 半透性基质， 所述基质以成形的制品的形式存在， 例如薄膜或微囊剂。 缓释基质的实例包括 聚酯、 水凝胶 ( 例如， 聚 (2- 羟乙基 - 甲基丙烯酸酯 ) 或聚 ( 乙烯醇 ))， 聚丙交酯 ( 美国专 利号 3,773,919)， L- 谷氨酸和 .γ. 乙基 -L- 谷氨酸酯的共聚物， 不可降解的乙烯 - 乙酸 TM 乙烯酯， 可降解的乳酸 - 羟基乙酸共聚物如 LUPRON DEPOT ( 由乳酸 - 羟基乙酸共聚物和醋 酸亮丙瑞林组成的可注射的微球体 ) 和聚 -D-(-)-3- 羟丁酸。聚合物如乙烯 - 乙酸乙烯酯 和乳酸 - 羟基乙酸能够释放分子超过 100 天， 而某些水凝胶则在更短的时间阶段释放蛋白。 当包封的抗体仍旧在体内较长时间时， 它们可能由于在 37℃暴露于水分而变性或聚集， 导 致生物学活性的损失和免疫原性的可能变化。根据涉及的机制， 可以设计合理的策略来进 行稳定。例如， 如果发现聚集机制是通过硫 - 二硫化物交换的分子间 S--S 键形成， 那么稳 定可以通过修饰巯基残基、 从酸性溶液冷冻干燥、 控制水分含量、 使用适合的添加剂并且开 发特定的聚合物基质组合物来实现。
     本文描述的抗体和抗体片段依照已知的方法施用给人类受试者， 诸如， 作为推注 或通过一段时间的连续输注的静脉内施用， 通过肌肉内的、 腹膜内的、 脑脊内的、 皮下的、 关节内的、 滑膜内的、 鞘内的、 口服的、 局部的、 或吸入途径。如果 HER( 例如 EGFR， HER2， HER3， HER4 等 ) 的拮抗作用与广泛的副作用或毒性相关， 局部施用可以是特别期望的。先体外后 体内 (ex vivo) 策略也可在治疗性应用中使用。先体外后体内策略涉及通过编码抗体或抗 体片段的多核苷酸转染或转导从受试者获得的细胞。 该转染或转导的细胞然后回输至受试 者。该细胞可以是许多类型， 包括但不限于造血细胞 ( 例如骨髓细胞、 巨噬细胞、 单核细胞、 树突细胞、 T 细胞或 B 细胞 )、 成纤维细胞、 上皮细胞、 内皮细胞、 角质细胞或肌细胞。
     在一个实例中， 当病症或肿瘤的位置允许时， 抗体或抗体片段局部施用， 例如通过 直接注射， 并且该注射可周期性地重复。抗体或抗体片段也可全身投递给受试者或直接投 递至肿瘤细胞， 例如投递至肿瘤或手术切除肿瘤后的瘤床， 以预防或降低局部复发或转移。
     为了预防或治疗疾病， 本发明的抗体的适合剂量 ( 当单独使用或与一种或多种其 它另外的治疗剂组合 ) 将取决于待治疗的疾病类型， 抗体的类型， 疾病的严重性和进程， 而 不管施用抗体是用于预防还是治疗目的、 以前的疗法、 患者的临床病史和对抗体的响应， 以 及主治医师的判断。将抗体以一次或以一系列治疗适当地施用于患者。根据疾病的类型和 严重性， 约 1μg/kg 到 20mg/kg( 例如 0.1mg/kg-15mg/kg) 的抗体可以是施用于患者的起始 候选剂量， 而不管例如是通过一次或多次单独施用还是通过持续输注进行施用。一种典型 的每日剂量范围可以在约 1μg/kg 到 100mg/kg 或更多， 这取决于上述因素。对于在数日或 更长时间内的重复施用， 取决于病况， 治疗通常将持续直到对疾病症状需要的抑制发生。 抗 体的一个示例性剂量是在约 0.05mg/kg 到约 20mg/kg 的范围内。 因此， 可以将约 0.5mg/kg， 2.0mg/kg， 4.0mg/kg， 10mg/kg， 12mg/kg， 15mg/kg 或 20mg/kg 的一个或多个剂量 ( 或其任何 组合 ) 施用于患者。可以将所述剂量间歇性地施用， 例如每周、 每两周、 或每三周 ( 例如， 从 而使所述患者接受约 2 到约 20 或例如约 6 个剂量的抗体 ) 施用。可以开始施用更高的负 载剂量， 随后施用一剂或多剂更低的剂量。示例性的给药方案包括施用约 4mg/kg 的起始负 载剂量， 随后每周一次施用约 2mg/kg 抗体的维持剂量。然而， 其它剂量方案可以是有用的。 该疗法的进程容易通过常规技术和测定法进行监测。
     组合疗法
     本发明的抗体可以与具有抗癌性质的第二化合物组合在药物组合制剂中， 或组合 在给药方案中， 作为组合疗法。药物组合制剂或给药方案的第二化合物可以对组合中的抗 体具有补充活性从而使它们不会对彼此存在不利的影响。在一个实施方案中， 多特异性抗 体与另一个抗 HER 抗体 ( 诸如 培妥珠单抗和 / 或西妥昔单抗 ) 组合使用。 本发明的抗体也可与放射疗法组合使用。
     第二化合物可以是化疗剂、 细胞毒性剂、 细胞因子、 生长抑制剂、 抗激素剂、 和/或 保心药。所述分子以对于意欲的目的是有效的量适当地组合存在。包含本发明抗体的药物 组合物也可以含有治疗有效量的化疗剂如微管蛋白 - 形成抑制剂、 拓扑异构酶抑制剂、 DNA 嵌入剂或 DNA 结合剂。
     其它的治疗方案可以与根据本发明鉴定的抗癌剂的施用组合。 所述组合疗法可以 作为同时或顺序方案进行施用。当顺序施用时， 组合可以以两次或更多次施用进行施用。 所述组合的施用包括使用单独的制剂或单一药物制剂的共同施用， 和以任意顺序的连续施 用， 其中存在两种 ( 或全部 ) 活性剂同时发挥它们的生物学活性时的时期。
     此 类 组 合 疗 法 的 实 例 包 括 与 化 疗 剂 的 组 合， 所述化疗剂如厄洛替61102356092 A CN 102356102说赛 瓦明书59/79 页尼 (erlotinib)( 它 ( f u l v e s t r an t) 来 曲 唑 (letrozole) mesylate) (oxaliplatin)Genentech/OSI Pharm.)、 Millenium Pharm.)、 氟 维 斯 群 Ast raZe neca) 、s ut ent(S U1 1248 ，P fiz e r) 、 Novartis)、甲 磺 酸 伊 马 替 尼 (imatinib硼 替 佐 米 (bortezomib)Novartis)、 PTK787/ZK 222584(Novartis)、 奥 沙 利 铂 Sanofi)、 5-FU(5- 氟 尿 嘧 啶 (5-fluorouracil))、亚 叶 GSK572016， GlaxoSmithKline)、 氯那法 AstraZeneca)、 AG1478、 AG1571(SU 5271 ； Sugen)，酸 (leucovorin)、 雷 帕 霉 素 (Rapamycin)( 西 罗 莫 司 (Sirolimus)、 Wyeth)、 拉 帕 替 尼 (lapatinib) 非 替 尼 (gefitinib) 尼 (lonafarnib)(SCH 66336)、 索 拉 非 尼 (sorafenib)(BAY43-9006， Bayer Labs.) 和 吉 烷 化 剂 类 (alkylating agents)， 诸 如 塞 替 哌 (thiotepa) 和 环磷酰 胺 (cyclophosphamide) ； 烷 基 磺 酸 酯 (alkyl sulfonates)， 诸 如 白 消 安 (busulfan)、 英 丙 舒 凡 (improsulfan) 和 哌 泊 舒 凡 (piposulfan) ； 抗 叶 酸 剂 (antifolate) 抗 肿 瘤 诸 如 培 美 曲 塞 (pemetrexed) Eli Lilly)， 吖 丙 啶 类 (aziridines)，诸 如 苯 佐 替 派 (benzodopa)、 卡 波 醌 (carboquone)、 美 妥 替 哌 (meturedopa) 和 乌 瑞 替 哌 (uredopa) ； 乙 撑 亚 胺 类 (ethylenimines) 和 甲 基 蜜 胺 类 (methylamelamines)， 包 括 六 甲 蜜 胺 (altretamine)、 曲 他 胺 (triethylenemelamine)、 三乙烯硫代磷酸胺 (triethylenephosphoramide)、 三 乙 撑 硫 代 磷 酰 胺 (triethylenethiophosphoramide) 和 三 羟 甲 蜜 胺 (trimethylomelamine) ； 聚 乙 酸 类 (acetogenins)( 尤 其 是 布 拉 他 辛 (bullatacin) 和布拉他辛酮 (bullatacinone)) ； 喜树碱 (camptothecin)( 包括合成类似 物托泊替康 (topotecan) ； 苔藓抑素 (bryostatin) ； callystatin ； CC-1065( 包括其阿多 来新 (adozelesin)、 卡折来新 (carzelesin) 和比折来新 (bizelesin) 合成类似物 ) ； 隐 藻素类 (cryptophycins)( 特别是隐藻素 1 和隐藻素 8) ； 多拉司他汀 (dolastatin) ； 倍癌 霉素 (duocarmycin)( 包括合成类似物， KW-2189 和 CB1-TM1) ； 艾榴素 (eleutherobin) ； pancratistatin ； 匍 枝 珊 瑚 醇 (sarcodictyin) ； 海 绵 素 (spongistatin) ； 氮芥类 (nitrogen mustards)， 诸 如 苯 丁 酸 氮 芥 (chlorambucil)、 萘 氮 芥 (chlornaphazine)、 胆 磷 酰 胺 (cholophosphamide)、 雌 莫 司 汀 (estramustine)、 异 环 磷 酰 胺 (ifosfamide)、 氮 芥 (mechlorethamine)、盐 酸 氧 氮 芥 (mechlorethamine oxide hydrochloride)、 美 法 仑 (melphalan)、 新 氮 芥 (novembichin)、 苯 芥 胆 甾 醇 (phenesterine)、 泼尼莫司 汀 (prednimustine)、 曲 磷 胺 (trofosfamide)、 尿 嘧 啶 氮 芥 (uracil mustard) ； 亚硝 脲 类 (nitrosoureas)， 诸 如 卡 莫 司 汀 (carmustine)、 氯 脲 菌 素 (chlorozotocin)、 福 莫 司 汀 (fotemustine)、 洛 莫 司 汀 (lomustine)、 尼 莫 司 汀 (nimustine) 和 雷 莫 司 汀 (ranimnustine) ； 抗生素类， 诸如烯二炔类抗生素类， 加利车霉素 (calicheamicin)， 加利 车霉素 γ1I 和加利车霉素 ωI1 ； 烯二炔蒽环类抗生素 (dynemicin)， 包括烯二炔蒽环类 抗生素 A(dynemicinA) ； 二膦酸盐类 (bisphosphonates)， 诸如氯膦酸盐 (clodronate) ； 埃斯波霉素 (esperamicin) ； 以及新制癌菌素 (neocarzinostatin) 发色团和相关色蛋 白 烯 二 炔 类 抗 生 素 发 色 团、 阿 克 拉 霉 素 (aclacinomysins)、 放 线 菌 素 (actinomycin)、 氨茴霉素 (anthramycin)、 偶氮丝氨酸 (azaserine)、 博来霉素 (bleomycins)、 放线菌素C(cactinomycin)、 carabicin、 洋 红 霉 素 (carminomycin)、 嗜 癌 霉 素 (carzinophilin)、 色 霉 素 (chromomycinis)、 放 线 菌 素 D(dactinomycin)、 柔 红 霉 素 (daunorubicin)、 地 托 比 星 (detorubicin)、 6- 重 氮 基 -5- 氧 -L- 正 亮 氨 酸、 多柔比星 (doxorubicin)( 包括吗啉代多柔比星 (morpholino-doxorubicin)、 氰基吗啉代 - 多柔比星 (cyanomorpholino-doxorubicin)、 2- 吡 咯 啉 代 - 多 柔 比 星 (2-pyrrolino-doxorubicin) 和脱氧多柔比星 (deoxydoxorubicin))、 表柔比星 (epirubicin)、 依索比星 (esorubicin)、 伊 达 比 星 (idarubicin)、 马 塞 罗 霉 素 (marcellomycin)、 丝 裂 霉 素 类 (mitomycins) 诸 如 丝 裂 霉 素 C、 麦 考 酚 酸 (mycophenolic acid)、 诺 拉 霉 素 (nogalamycin)、 橄榄 霉 素 (olivomycins)、培 洛 霉 素 (peplomycin)、紫 菜 霉 素 (porfiromycin)、嘌 呤 霉 素 (puromycin)、三 铁 阿 霉 素 (quelamycin)、罗 多 比 星 (rodorubicin)、链 黑 霉 素 (streptonigrin)、 链 佐 星 (streptozocin)、 杀 结 核 菌 素 (tubercidin)、 乌苯美司 (ubenimex)、 净司他丁 (zinostatin)、 佐柔比星 (zorubicin) ； 抗代谢物类， 诸如甲氨喋呤 (methotrexate) 和 5- 氟尿嘧啶 (5-FU) ； 叶酸类似物， 诸如二甲叶酸 (denopterin)、 甲氨喋 呤 (methotrexate)、 蝶罗呤 (pteropterin)、 三甲曲沙 (trimetrexate) ； 嘌呤类似物， 诸如 氟达拉滨 (fludarabine)、 6- 巯基嘌呤 (mercaptopurine)、 硫咪嘌呤 (thiamiprine)、 硫鸟 嘌呤 (thioguanine) ； 嘧啶类似物， 诸如安西他滨 (ancitabine)、 阿扎胞苷 (azacitidine)、 6- 氮 尿 苷 (azauridine)、 卡 莫 氟 (carmofur)、 阿 糖 胞 苷 (cytarabine)、 双脱氧尿苷 (dideoxyuridine)、 去 氧 氟 尿 苷 (doxifluridine)、 依 诺 他 滨 (enocitabine)、 氟尿苷 (floxuridine) ； 雄激素类， 诸如卡鲁睾酮 (calusterone)、 丙酸屈他雄酮 (dromostanolone propionate)、 环 硫 雄 醇 (epitiostanol)、 美 雄 烷 (mepitiostane)、 睾 内 酯 (testolactone) ； 抗肾上腺类， 诸如氨鲁米特 (aminoglutethimide)、 米托坦 (mitotane)、 曲 洛 司 坦 (trilostane) ； 叶 酸 补 充 剂， 诸 如 亚 叶 酸 (frolinic acid) ； 醋葡醛内酯 (aceglatone) ； aldophosphamide glycoside ； 5- 氨 基 酮 戊 酸 (aminolevulinic acid) ； 恩 尿 嘧 啶 (eniluracil) ； 安 吖 啶 (amsacrine) ； bestrabucil ； 比 生 群 (bisantrene) ； 依 达 曲 沙 (edatraxate) ； defofamine ； 秋 水 仙 胺 (demecolcine) ； 地 吖 醌 (diaziquone) ； elfornithine ； 依利醋铵 (elliptinium acetate) ； epothilone ； 依托格鲁 (etoglucid) ； 硝 酸 镓 (gallium nitrate) ； 羟 脲 (hydroxyurea) ； 香 菇 多 糖 (lentinan) ； 氯尼达明 (lonidainine) ； 美登木素生物碱类 (maytansinoids)， 诸如美登素 (maytansine) 和安丝 菌 素 (ansamitocins) ； 米 托 胍 腙 (mitoguazone) ； 米 托 蒽 醌 (mitoxantrone) ； 莫哌达醇 (mopidanmol) ； 尼曲吖啶 (nitraerine) ； 喷司他丁 (pentostatin) ； 异丙嗪 (phenamet) ； 吡 柔比星 (pirarubicin) ； 洛索蒽醌 (losoxantrone) ； 鬼臼酸 (podophyllinic acid) ； 2- 乙 基 酰 肼 (2-ethylhydrazide) ； 丙 卡 巴 肼 (procarbazine) ； 多 糖 复 合 物 (JHS 天 然 产物， Eugene， OR) ； 雷佐生 (razoxane) ； 利索新 (rhizoxin) ； 西佐喃 (sizofiran) ； 锗螺 胺 (spirogermanium) ； 细交链孢菌酮酸 (tenuazonic acid) ； 三亚胺醌 (triaziquone) ； 2， 2’ ， 2” - 三 氯 三 乙 胺 (2， 2’ ， 2” -trichlorotriethylamine) ； 单端孢霉烯族化合物 (trichothecenes)( 尤其是 T-2 毒素、 verracurin A、 杆孢菌素 (roridin)A 和蛇形菌素 (anguidine)) ； 乌拉坦 (urethan) ； 长春地辛 (vindesine) ； 达卡巴嗪 (dacarbazine) ； 甘 露莫司汀 (mannomustine) ； 二溴甘露醇 (mitobronitol) ； 二溴卫矛醇 (mitolactol) ； 哌 泊溴烷 (pipobroman) ； gacytosine ； 阿糖胞苷 (arabinoside)(“Ara-C” )； 环磷酰胺 ； 塞替 派 (thiotepa) ； 紫 杉 烷 类 化 合 物 (taxoid)， 例 如 紫 杉 醇 (paclitaxel) Bristol-Myers Squibb Oncology， Princeton， N.J.)、无 克 列 莫 佛 (Cremophor) 的 TM ABRAXANE 、 紫杉醇的白蛋白改造的纳米颗粒制剂 (American Pharmaceutical Partners， Schaumberg， Illinois)、和 多 西 他 塞 (doxetaxel) Rorer， Antony， France) ；苯 丁 酸 氮 芥 (chloranbucil) ； 吉 西 他 滨 (gemcitabine) ； 6- 硫 鸟 嘌 呤 (thioguanine) ； 巯 嘌 呤 (mercaptopurine) ； 甲 氨 蝶 呤 (methotrexate) ； 铂 类 似 物 如 顺 铂 (cisplatin) 和 卡 铂 (carboplatin) ； 长春 碱 (vinblastine) ；铂 (platinum) ；依 托 泊 苷 (etoposide)(VP-16) ；异 环 磷 酰 胺 (ifosfamide) ； 米 托 蒽 醌 (mitoxantrone) ； 长 春 新 碱 (vincristine) ； 长 春 瑞 滨 (vinorelbine) ； 诺 安 托 (novantrone) ； 替 尼 泊 苷 (teniposide) ； 依达曲沙 (edatrexate) ； 道 诺 霉 素 (daunomycin) ； 氨 基 蝶 呤 (aminopterin) ； 希 罗 达 (xeloda) ； 伊 本 膦 酸 盐 (ibandronate) ； CPT-11 ； 拓 扑 异 构 酶 抑 制 剂 RFS 2000 ； 二氟甲基鸟氨酸 (difluoromethylornithine)(DMFO) ； 类 视 黄 酸 类 (retinoids) 如 视 黄 酸 (retinoic acid) ； 卡培他滨 (capecitabine) ； 和上述任一种的药用盐， 酸或衍生物。
     所述组合疗法还包括 ： (i) 抗激素剂， 其作用于调节或抑制激素对肿瘤的作用如 抗 - 雌激素和选择性雌激素受体调节剂 (SERMs)， 包括， 例如他莫昔芬 (tamoxifen)( 包 括 他莫昔芬 )、 雷洛昔芬 (raloxifene)、 屈洛昔芬 (droloxifene)、 4- 羟 基 他 莫 昔 芬、 曲 沃 昔 芬 (trioxifene)、 keoxifene、 LY117018、 奥 那 司 酮 (onapristone) 和 FARESTON· 托瑞米芬 (toremifene) ； (ii) 抑制芳香酶的芳香酶抑制剂， 其调节肾上 腺中的雌激素产生， 如例如， 4(5)- 咪唑、 氨鲁米特 (aminoglutethimide)、 醋 酸 甲地 孕酮 (megestrol acetate)、 益西美 坦 (exemestane)、 福美坦 (formestanie)、 法倔唑 (fadrozole)、 伏氯唑 (vorozole)、 来曲 唑 (letrozole) 和 阿那曲唑 (anastrozole) ； (iii) 抗 - 雄激素如氟他胺 (flutamide)、 尼鲁米特 (nilutamide)、 比卡鲁胺 (bicalutamide)、 亮丙立德 (leuprolide) 和戈舍瑞林 (goserelin) ； 以及曲沙他滨 (troxacitabine)(1， 3- 二氧戊环核苷胞嘧啶类似 物)； (iv) 蛋白激酶抑制剂 ； (v) 脂质激酶抑制剂 ； (vi) 反义寡核苷酸， 特别是抑制在涉及 异常细胞增殖的信号传导途径中基因的表达的那些， 如例如 PKC-α， Ralf 和 H-Ras ； (vii) 核酶如 VEGF 表达抑制剂 ( 例如， 核酶 ) 和 HER2 表达抑制剂 ； (viii) 疫 苗如基因治疗疫苗， 例如 疫苗， 疫苗和 疫苗 ； rIL-2 ； 拓扑异构酶 1 抑制剂 ； rmRH ； (ix) 抗生血管药剂如贝伐珠单抗 Genentech) ； 和 (x) 上述任一种的药用盐、 酸或衍生物。
     关于所述化疗剂的制备和给药时间表可以根据生产商的说明书使用或由熟练的 从业者根据经验确定。关于所述化疗法的制备和给药时间表也在 Chemotherapy Service， (1992)Ed.， M.C.Perry， Williams & Wilkins， Baltimore， Md 中进行描述。
     组合疗法可以提供 “协同性” 并证实 “协同作用” ， 即一起使用活性成分时获得的作 用大于由单独使用化合物获得的作用的总和。当活性成分 (1) 共同配制和施用或在组合的 单位剂量制剂中同时递送 ； (2) 交替地或平行地作为单独的制剂递送 ； 或 (3) 通过一些其他 方案时， 获得协同作用。当在交替疗法中递送时， 当顺序施用或递送所述化合物 ( 例如通过在单独的注射器中不同的注射 ) 时， 获得协同作用。一般地， 在交替疗法过程中， 每种活性 成分的有效剂量顺序地， 即连续地进行施用， 而在组合疗法中， 将两种以上的活性成分的有 效剂量一起施用。
     制品和试剂盒
     本发明另一个实施方案是制品， 其含有在治疗癌症中有用的材料。该制品包括容 器和在容器上或与容器一起的标签或包装说明书 (package insert)。适合的容器包括， 例 如， 瓶子、 小瓶、 注射器等。所述容器可以由各种材料诸如玻璃或塑料制成。容器装有对于 所述疾患的治疗有效的组合物， 并且可以具有无菌的存取口 ( 例如， 所述容器可以是具有 可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶 )。组合物中至少一种活性试剂是本发 明的多特异性抗体或抗体片段。标签或包装说明书标明该组合物是用于治疗特定的病症。 标签或包装说明书还包括向患者施用抗体组合物的说明书。 也考虑了包含本文描述的联合 治疗的制品和试剂盒。
     包装说明书是指常规地在治疗产品的商业化包装中包含的说明书， 其含有关于适 应症、 用法、 剂量、 施用、 禁忌症和 / 或关于使用此类治疗产品的警告的信息。在一个实施方 案中， 包装说明书标明该组合物是用于治疗实体瘤， 如例如， 结肠直肠癌、 肺癌、 和 / 或乳腺 癌。
     另外， 制品可以进一步包括第二容器， 其中装有制药学可接受的缓冲液， 例如抑菌 性注射用水 (BWFI)、 磷酸盐缓冲盐水、 林格氏溶液和右旋糖溶液。 它可以进一步包括从商业 和用户立场出发所需的其它材料， 包括其它的缓冲剂、 稀释剂、 滤器、 针和注射器。
     还提供多种目的中有用的试剂盒， 例如从细胞中纯化或免疫沉淀 HER 受体。为分 离和纯化 EGFR 和 / 或 HER2 和 / 或 HER3 和 / 或 HER4， 该试剂盒可含有偶联至珠子 ( 例如 珠子 ) 的 EGFR/HER2 和 / 或 EGFR/HER3 和 / 或 EGFR/HER4 抗体。可提供试 剂盒， 其含有用于体外 ( 例如在 ELISA 或蛋白质印迹中 ) 检测和定量所需 HER 受体的抗体。 如同制品中一样， 该试剂盒包含容器和伴随该容器或在容器上的标签或说明书。该容器装 有包含至少一种本发明的多特异性抗体或抗体片段的组合物。可包括另外的容器， 该容器 含有， 例如， 稀释剂和缓冲剂或对照抗体。 标签或说明书可提供对组合物的描述以及对预期 的体外或诊断用途的说明。 认为前文的书面描述足以使本领域技术人员实施本发明。 提供下述实施例仅为了 举例说明目的， 无意以任何方式限制本发明的范围。事实上， 根据前文描述， 对本文显示和 描述的发明以外的多种修改对本领域技术人员来说是明显的并落入所附权利要求的范围。
     除非另有说明， 实施例中提及的商业上可获得的试剂根据生产商的说明书使用。 在以下实施例中及在整个说明书中以 ATCC 登记号鉴定的那些细胞的来源是美国典型培养 物保藏中心 (American Type CuIture Collection， Manassas， VA)。除非另有说明， 本发 明使用重组 DNA 技术的标准程序， 如上文描述的和下述教科书中的那些 ： Sambrook 等人， 见上文 ； Ausubel 等人， Current Protocols in Molecular Biology( 现代分子生物学实验 方案 )(Green Publishing Associates and Wiley Interscience， N.Y.， 1989) ； Innis 等 人， PCR Protocols ： A Guide to Methods and Applications(PCR 实验方案 ： 方法和应用 指南 )(Academic Press ( 学术出版社 )， Inc. ： N.Y， 1990) ； Harlow 等人， Antibodies ： A Laboratory Manual ( 抗体 ： 实验室手册 )( 冷泉港出版社 (Cold Spring Harbor Press)) ：
     冷泉港， 1988) ； Gait， Oligonucleotide Synthesis ( 寡核苷酸合成 )(IRL Press ： Oxford， 1984) ； Freshney， Animal Cell Culture ( 动物细胞培养 )， 1987 ； Coligan 等人， Current Protocols in Immunology( 现代免疫学学实验方案 )， 1991。 实施例 实施例 1
     分离和表征结合人 EGFR 的抗体
     材料
     酶和 M13-KO7 辅助噬菌体购自 New England Biolabs( 新英格兰生物实验室 )。 大 肠杆菌 (E.coli)XL1-Blue 来自 Stratagene。牛血清清蛋白 (BSA)、 卵清蛋白、 和吐温 20 购 自 Sigma( 西格玛 )。Neutravidin、 酪蛋白、 和 Superblock 购自 Pierce。抗 M13 缀合的辣 根过氧化物酶 (HR) 购自 Amersham Pharmacia。Maxisorp 免疫板购自 NUNC(Roskilde， 丹 麦 )。四甲基联苯胺 (TMB) 底物购自 Kirkegaard 和 Perry 实验室 (Gaithersburg， MD)。
     文库构建
     噬菌体展示抗体文库基于来自人源化的 4D5(h4D5， 曲妥珠单抗 ) 的人抗体构架产 生， 其中侧链和长度多样性在第一文库 ( 文库 1) 中引入到重链互补决定区 (CDR1， CDR2， CDR3)， 在第二文库 ( 文库 2) 中引入到重链 CDRs 和轻链 CDR3 中， 仍然集中于重链中的多样 化， 如所描述的 (Lee 等， J.Mol.Biol( 分子生物学杂志 )， 340 ： 1073-1093(2004))。文库如 所描述的进行构建 (Lee 等， J.Mol.Biol( 分子生物学杂志 )， 340 ： 1073-1093(2004))， 除了 所使用的简并寡核苷酸进行了适当修饰。
     两个文库的分选
     文库 1 和文库 2 直接进行靶标 (hEGFR-ECD-Fc( 人 EGFR 胞外结构域融合到人 IgG1 的 Fc 区 ) 和 EGFRvIII-Fc) 结 合 选 择。EGFRvIII-Fc 蛋 白 是 EGFR 的 变 体， 缺失大 部分结构域 II(E1-P353( 不包括信号肽 ))， 融合到 hIgG1 的 Fc 区。参见 Kuan， C-T， 等， Endocrine-Related Canc.8 ： 83-96(2001) ； Bigner， S H， 等， Cancer Research( 癌症研究 )， 50 ： 8017-8022(1990)。96 孔 Nunc Maxisorp 板用 PBS(0.05M Sodium Carbonate buffer， pH9.6) 中 100μl/ 孔 的 靶 抗 原 (hEGFR-ECD-Fc， EGFRvIII-Fc)(5μg/ml) 在 4 ℃ 包 被 过 夜或在室温包被 2 小时。该板用交替封闭试剂进行封闭。在第一轮选择中， 1013 噬菌体 / ml(3-5OD/ml) 的噬菌体溶液与包被的抗原温育 18h。在每轮选择中噬菌体输入如下降低 ： 第一轮 3-5O.D/ml， 第二轮 3O.D/ml， 第三轮 0.5 ～ 1O.D/ml 和第四轮输入 0.1 ～ 0.5O.D/ ml。 稀释的噬菌体在冰上温育 30 分钟。 1μM 的 Fc- 融合蛋白添加到来自第三轮的封闭的噬 菌体中以去除 Fc 结合物。噬菌体溶液 (100μl/ 孔至 8 个靶抗原包被的孔和 2 个未包被的 孔 ) 在免疫板上温育以允许结合固定的抗原 ( 对于第一轮过夜， 对于剩余的轮次进行 2 小 时 ) 之后， 用 PBS 和 0.05％ Tween 20 连续洗涤免疫板至少 10 次。结合的噬菌体用 100ul/ 孔的 100mM HCl 室温洗脱 20 分钟。洗脱的噬菌体 ( 来自包被的孔 ) 和背景噬菌体 ( 来自 未包被的孔 ) 通过添加 1/10 体积的 1M Tris pH 11.0 和 BSA 至最终 0.1％进行中和。计算 噬菌体回收 / 抗原包被免疫板孔， 并与无包被抗原的封闭孔进行比较， 以研究展示特异性 结合靶抗原的 Fabs 的噬菌体克隆的富集。洗脱的噬菌体在大肠杆菌中扩增并用于下轮选 择。
     高通量表征 hFGFR 结合克隆
     来自第 4 轮的随机克隆被选择以进行筛选， 并利用噬菌体 ELISA 来测定， 其中将与 靶标和抗 gD 的结合与无关蛋白 (BSA， HER2， 抗 EGFR 抗体， 曲妥珠单抗 ) 的结合进行比较。
     384 孔形式的免疫板包被以 1μg/ml 的靶标， 抗 gD 和无关蛋白质， 4℃过夜或室温 2 小时， 并用 PBS 中 1％ BSA 封闭 1h。大肠杆菌 XL1-Blue 中的噬菌粒克隆在增补了羧苄西 林 (carbenicillin) 和 M13-KO7 辅助噬菌体的 150μl 的 2YT 肉汤中生长 ； 该培养物在 96 孔形式中在 37℃摇动生长过夜。包含噬菌体的培养物上清在 PBST( 具有 0.05％吐温 20 和 0.5％ (w/v)BSA 的 PBS) 中稀释 5 倍。30μl 的混合物添加到 384- 孔包被板的每个象限并 在室温下温育 1 小时。该板用 PBT( 具有 0.05％吐温 20 的 PBS) 洗涤并与在 PBST 中稀释 5000 倍达到 1nM 的抗 M13 抗体辣根过氧化物酶缀合物一起温育 30 分钟。将该板洗涤， 用 TMB 底物显色约 5 分钟， 用 1.0M H3PO4 猝灭， 并在 450nm 处通过分光光度法读数。
     结合抗 gD 抗体和靶标但是不结合非特异性蛋白质的克隆被认为是特异性阳性。 VH 文库允许分离对于 EGFR-ECD-Fc 和 EGFRvIII-Fc 两者的特异性结合物。
     溶液结合竞争 ELISA
     选择的结合克隆的结合亲和力通过溶液结合竞争 ELISA 确定。
     在 大 肠 杆 菌 XL1-Blue 中 选 择 的 噬 菌 粒 克 隆 在 补 充 了 羧 苄 青 霉 素 (carbenicillin)、 卡那霉素 (kanamycin) 和 M13-KO7 辅助噬菌体的 20ml 2YT 肉汤中生长 ； 培养物在 30℃振荡过夜生长。噬菌体的上清液在 20％ PEG/2.5M NaCl 中两次沉淀进行纯 化， 在 PBS 中重新悬浮， 在 268nM 分光光度计读数用于浓度确定 ( 以 OD/ml)。
     纯化的噬菌体在用 1μg/ml 的 hEGFR-ECD-Fc 包被的免疫板上滴定， 以确定溶液竞 争 ELISA 的最优浓度。
     提供在 450nM 处 1OD/ml 信号的稀释物用于溶液结合测定中， 其中噬菌体首先与渐 增浓度的抗原 (hEGFR-ECD) 一起温育一小时并然后转移至抗原包被的免疫板 15 分钟， 以捕 获未结合的噬菌体。 IC50 计算为抑制 50％噬菌体结合固定抗原的溶液结合阶段中抗原的浓 度。溶液结合竞争 ELISA 在室温进行。选择的克隆的 IC50 值范围为 36.2nM 至＞ 1000nM。
     噬菌体展示 F(ab)zip 转变为人 IgG
     为精确确定亲和力、 特异性和其它性质， 选择的克隆作为游离 hIgG 表达。
     轻链和重链的可变结构域克隆到以前设计的用于在哺乳动物细胞中瞬时人 IgG 表达的载体中。(Leet 等， J.Mol.Biol.( 分子生物学 )23 ： 340 ： 1073-1093(2004))。
     噬 菌 粒 DNA 的 VL 区 用 限 制 酶 消 化， 所 述 限 制 酶 切 割 编 码 CDR L1 的 区 的 上 游 (EcoRV) 和编码 CDR L3 的区的下游 (KpnI) 的 DNA。
     噬菌粒 DNA 的 VH 区用限制酶消化， 所述限制酶切割编码 CDR H1 的区的上游 (ApaI) 和编码 CDR H3 的区的下游 (BsiwI) 的 DNA。
     分泌的游离 IgG 用蛋白质 A 亲和色谱纯化并在直接结合 ELISA 中在 hEGFR 包被的 免疫板上测试。
     抗 hEGFR 表位的比较
     为了确定被抗 hEGFR 抗体识别的表位， 研究了分离的抗 EGFR 抗体与另一个已知结 合 EGFR 的结构域 III 的抗 hEGFR 抗体竞争的能力。
     测 定 以 竞 争 ELISA 形 式 进 行。 对 于 竞 争 ELISA， EGFR-ECD-Fc 以 2μg/ml 固定于 Maxisorp 免疫板上。固定浓度的抗 EGFR 抗体 ( 或非特异性抗体对照 ) 被包被的 EGFR-ECD-Fc 捕获， 添加纯化的选择的抗 EGFR 噬菌体 -Fabs， 用 α-M13- 缀合的 HRP 检测。 被阻断结合 EGFR-ECD-Fc 包被的板的抗体可能共享重叠的表位。
     对于 TGF-α 竞争 ELISA， EGFR-ECD-Fc 首先被包被的抗人 Fc 抗体捕获， 然后固定 浓度的 TGF-α 被 EGFR-ECD-Fc 捕获。添加纯化的噬菌体 -Fabs， 用 α-M13- 缀合的 HRP 检 测。
     最后， 评估选择的克隆与具有 EGFR 暴露和缺失的结构域的构建体的结合， 以确认 以前的竞争 ELISA。 指定为 D1 的克隆与抗 EGFR 抗体竞争， 并且可能在结构域 III 结合 EGFR。
     实施例 2
     表征针对人表皮生长因子受体的抗体
     抑制配体结合
     为了确定选择的抗 EGFR 抗体 D1 是否抑制 125I-EGF 与 H1666 细胞 (ATCC CRL-5885， Manassas， Va.) 的结合， 纯化的 IgGs 形式的 D1 在如下的配体结合测定中测试。H1666 细胞 在 12 孔板中铺板。次日去除生长培养基， 用 200nM 抗体在室内 RT 预处理细胞 2 小时。添 加 20μl/ 孔放射性标记的 EGF( 使用浓度低于细胞系的 Kd)， 细胞在室温处理另外 2 小时。 细胞用结合缓冲液洗涤并溶解、 转移， 样品使用 iso Data γ- 计数器计数。未标记的 EGF 用作冷竞争剂 (cold competitor)。结果证明 D1 抑制 125I-EGF 配体结合 H1666 细胞。
     在稳定转染的 EGFR-NR6 细胞中抑制 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化
     为了确定抗 EGFR 抗体 D1 是否选择性阻断 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化， 对稳定转染 的 EGFR-NR6 细胞血清饥饿 2-3 小时， 并与多种浓度的 D1 预温育 2 小时。 细胞用 1nM TGF-α 刺激。全细胞溶胞产物进行 SDS-PAGE 分析， 免疫印迹用抗磷酸酪氨酸探测， 抗 EGFR 作为装 载对照。商购的抗 EGFR 抗体用作阳性对照。数据证明在基于细胞的测定中 D1 抑制 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化。
     实施例 3
     D1 的亲和力成熟
     文库构建
     使用寡核苷酸定向诱变产生两个噬菌体展示文库 (L3/H3 和 L3/H1H2 文库 )， 如所 描述的 (Lee 等， Blood( 血液 )， 108， 3103-3111， 2006)。 文库模板载体含有植入 CDR-L3 中的 终止密码子 (TAA)， 其在诱变反应中使用与编码 CDR-L3( 所有文库 )， CDR-H3(L3/H3 文库 )， CDR-H2 和 CDR H1(L3/H1H2 文库 ) 的序列退火的简并寡核苷酸修复。文库诱变反应根据 Kunkel 等， (Methods Enzymol.( 酶学方法 )1987 ； 154 ： 367-82) 的方法进行。 寡核苷酸以不 同比例组合以便精细调节多样性从而反应在所选择的位置天然库 (natural repertoire) 中氨基酸的频率。汇合诱变产物成一个反应 / 文库， 电穿孔至大肠杆菌 SS320 细胞中， 在补 充了 KO7 辅助噬菌体中生长， 如所描述的 (Lee 等， 2004， 见上文 )。
     文库分选和筛选
     对于亲和力改善选择， 噬菌体文库第一轮针对 hEGFR-ECD-Fc 进行板分选， 随后进 行三轮溶液分选。
     进行三轮增加选择严格性的溶液分选。 免疫板用 5ug/ml 的 Neutravidin 在 4℃包 被过夜， 并用 Superblock(Pierce) 和 PBST 封闭。3-5OD/ml 繁殖的噬菌体与 100nM 的生物素化的 EGFR-ECD 在 Superblock 中预温育， 然后稀释 10x 并添加到封闭的免疫板中 5-10 分 钟。洗涤板 8 次， 洗脱噬菌体并繁殖， 用于次轮溶液分选， 降低噬菌体输入 (0.5OD/ml) 和生 物素化的 EGFR-ECD 的浓度至 1nM。
     高通量亲和力筛选 ELISA( 单点竞争 )
     挑选来自溶液分选最后一轮的随机克隆用于筛选并使用噬菌体单点竞争 ELISA 测定， 其中比较与 hEGFR-ECD 预温育 ( 或不预温育 ) 的噬菌体上清液和靶标的结合。
     大肠杆菌 XL1-Blue 中的噬菌粒克隆在 150ul 补充了羧苄青霉素和 M13-KO7 辅助 噬菌体的 2YT 肉汤中生长 ； 培养物在 96 孔格式中在 37℃振荡生长过夜。含有噬菌体的培 养物上清液在 PBST( 具有 0.05％ Tween 20 和 0.5％ (w/v)BSA 的 PBS)， 伴有或不伴有 5nM EGFR-EC 中稀释五倍。通过下述方程计算 OD 降低 (％ ) ：
     OD450nm 降 低 ( ％ ) ＝ ( 具 有 竞 争 剂 的 孔 的 OD450nm)/( 不 具 有 竞 争 剂 的 孔 的 OD450nm)*100
     OD 降低大于 25％的克隆选择用于溶液结合竞争 ELISA。
     溶液结合竞争 ELISA
     通过单点 ELISA 选择的结合克隆的结合亲和力通过溶液结合竞争 ELISA 确定， 如 上所述。
     从 D1 母体克隆亲和力成熟 (D1.5) 选择的一个克隆的噬菌体 ICS0s 如上所述进行 确定。D1.5 的 IC50 是 0.39nM。D1.5 重新格式化 (reformatted) 成 mIgG2A 用于进一个表 征， 使用上文描述的相同限制位点和设计用于哺乳动物中瞬时鼠 IgG 表达的载体。
     实施例 4
     表征作为游离 mIgG 的抗 EGFR 改善抗体
     BIAcore 测量
     在 BIAcoreTM-2000 上的表面等离子共振测定用于确定抗 EGFRmIgG2A 的亲和力。 在 BIAcore 测定中使用在 CM5 芯片上～ 150 反应单位 (RU) 的固定的 mIgG D1.5。从 12.5nM 至 200nM 增加浓度的 EGFR-ECD 以 30μl/min 在 25℃注射。结合反应通过从空白流动细胞 中减去 RU 来校正。对于动力学分析， 使用 kon 和 koff 同时拟合的 1 ∶ 1 Languir 模型。通 过这种方法确定的 D1.5 的 KD 是 1.2nM。
     表位定位
     评估选择的克隆对具有 EGFR 暴露和缺失的结构域的构建体的结合， 以确认从母 体克隆继承的结合表位。从 D1 分选中选择的亲和力改善克隆， D1.5， 在结构域 III 结合 EGFR。
     在 EGFR-NR6 细胞中抑制 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化
     测试 D1.5 以确定其是否以与母体克隆相比更高的效力抑制 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化。所述抗体在 EGFR-NR6 细胞上测试， 该测定如上文实施例 2 中的描述进行。商购的 抗 EGFR 抗体用作阳性对照。
     结果证明， 当与母体克隆 D1 相比时， D1.5 显示对配体诱导的 EGFR 磷酸化更大的 抑制。
     在 H1666 细胞中抑制细胞增殖
     进行测定以确定 D1.5 是否抑制 NSCLC 癌细胞系 H1666 的细胞增殖， 该细胞系以中等水平表达 EGFR、 HER2 和 HER3。H1666 细胞 (ATCC CRL-5885， Manassas， Va.) 以 5000 细胞 的密度接种于 96 孔板中。次日， 细胞用含 1％血清培养基中不同浓度的抗体 ( 多至 50ug/ ml) 同时处理。3 天后， 添加 Alamar Blue 并使用荧光计检测荧光。结果以 RFUs 表达。
     结果证明 D1.5 显示比 D1 更大的细胞生长抑制。
     A431 异种移植研究
     A431 异种移植模型用于验证亲和力成熟的抗 EGFR 抗体 D1.5 的体内功效。A431 细胞是 EGFR 扩增的， 对抗 EGFR 试剂反应非常好。研究在 nu/nu 小鼠中进行， 商购的抗 EGFR 抗体用作参照。
     在 第 一 步 中， D1.5 与 鼠 EGFR 的 交 叉 反 应 性 在 竞 争 ELISA 中 评 估。 免 疫 板 用 hEGFR-ECD-Fc 包被。连续稀释的 mEGFR-ECD-Fc 与固定浓度的 D1.5 温育。结果显示 D1.5 与鼠 EGFR 交叉反应。为了评估体内功效研究所需的剂量， D1.5 首先以单剂量 (50mg/kg) 注射， 并且通过 ELISA 测量血清 IgG 浓度。D1.5 被更快清除， 注射七天后见到降低的浓度。 功效研究 (A431 异种移植模型 ) 揭示 D1.5 完全抑制肿瘤生长。在 50mg/kg D1.5 与抗 EGFR 抗体一样有效。在更低剂量组 (25mg/kg) 其降低的效力是由于抗体的更快清除。( 图 1)
     实施例 5
     轻链文库设计和筛选双特异性抗体
     文库设计和构建
     设计基于 D1.5 模板的文库用于多样化抗体轻链的氨基酸组成和 CDR 长度。定制 一个亚组的随机化位置， 用于代表这些位点天然库一部分的氨基酸， 而剩余位点进行随机 化以包括所有 20 种天然存在的氨基酸。此外， 定制 CDR L3 中的随机化位置， 并且使其偏向 模板的天然序列， 因为这一 CDR 被认为对于 D1.5 的结合是重要的。对于 CDR L1， 每个长度 对于位置 28-33 是含三个寡核苷酸的密码子的混合物。对于更长的 L1， NNK 插入在位置 30 和 31 之间。
    
    对于 CDR L2， 1 ∶ 1 ∶ 2 ∶ 10 混合四种寡核苷酸。
    N ＝ A/C/G/T， D ＝ A/G/T， V ＝ A/C/G， B ＝ C/G/T， H ＝ A/C/T， K ＝ G/T， M ＝ A/C，R ＝ A/G， S ＝ G/C，
     W ＝ A/T， Y ＝ C/T.
     *G70A70C70 允许 70％的指定核苷酸和 10％的其它三种中的每种， 以编码大约 50％ Glu 和 50％的其它氨基酸。参见美国专利公开 20080069820 和 Bostrom， J. 等， Science( 科 学 )323 ： 1610-1614(2009)。
     CDR L3 的多样性源自下述寡核苷酸的混合物。D1.5CDR_L3 寡核苷酸
     F693 ACTTATTAC TGT CAG CAA 878 NNK 776 RST CCT TAC ACG TTC GGA(SEQ ID ： 70)
     F694 ACTTATTAC TGT CAG CAA 878 TAC 776 RST CCT TAC ACG TTC GGA(SEQ ID ： 71)
     F695 ACTTATTAC TGT CAG CAA DGG NNK 776 577 CCT TAC ACG TTC GGA(SEQ ID ： 72)
     F696 ACTTATTAC TGT CAG CAA KMT NNK 776 577 CCT TAC ACG TTC GGA(SEQ ID ： 73)
     F697 ACTTATTAC TGT CAG CAA 878 NNK 776 NNK CCT TAC ACG TTC GGA(SEQ ID ： 74)
     F698 ACTTATTAC TGT CAG CAA DGG NNK NNK RST CCT TAC ACG TTC GGA(SEQ ID ： 75)
     F699 ACTTATTAC TGT CAG CAA KMT NNK NNK RST CCT TAC ACG TTC GGA(SEQ ID ： 76)
     5 ＝ 70％ A， 6 ＝ 70％ G， 7 ＝ 70％ C， 8 ＝ 70％ T(10％为剩余三种核苷酸 )
     在所有文库中， 重链与母体克隆序列保持恒定。所有文库模板含有植入 CDR L1 的 终止密码子， 防止在噬菌体展示抗体文库成员中存在模板轻链。
     文库通过诱变法 (Kunkel 诱变 ) 构建， 使用含有终止密码子的单链 DNA 模板， 用于 同时与三个 CDR L1， L2 和 L3 的寡核苷酸组退火。来自诱变的文库 DNA 通过电穿孔转化至 细菌细胞株 SS320 并且与辅助噬菌体 KO7 一起生长。通过检测轻链 C 末端的 gD 标签评价 来自构建文库的单集落关于展示水平和关于在单点 ELISA 形式中对初级抗原 (EGFR) 结合 的保留。 平均 35％的来自 D1.5 文库的评价的单集落显示高水平的展示并保留 EGFR 结合性 质。
     文库分选和对双重特异性克隆分离的筛选
     文库进行与作为捕获靶标的抗 gD 抗体的初轮结合选择， 以去除其中 Fab 基因已 经缺失或未表达的克隆， 以及与 hEGFR-ECD-Fc 的结合选择， 随后是 4 轮铺板抗原的选择 (HER2-ECD， HER2-ECD-Fc， HER2-I-III-Fc， HER3-ECD-Fc， HER4-ECD-Fc( 每种情况中融合构 建体中的 Fc 是来自 hIgG1 的补体结合片段 )。 备选地， 它们直接进行靶标结合选择， 而不进 行与抗 gD 和 hEGFR-ECD-Fc 的预选择。
     每轮板选择如以前实施例 3 中描述的进行。选择来自第 3 轮和第 4 轮的随机克隆 用于筛选并使用噬菌体 ELISA 测定， 其中将对靶标和抗 gD 的结合与对不相关蛋白质 (BSA) 的结合进行比较用于检查非特异性结合。认为结合抗 gD 抗体和靶标但是不结合非靶标蛋 白对照 ( 诸如牛血清白蛋白， 其它 IgGs) 的克隆是特异性阳性的。
     阳性克隆的轻链可变结构域区通过 PCR 扩增并测序。阳性特异性结合物的 DNA 序列分析揭示对 EGFR 和 HER2 两者的 1 个独特结合物 (D1.5-201(SEQ ID NO ： 36))， 对 EGFR 和 HER3 两者的 7 个独特结合物， (D1.5-100(SEQ ID NO ： 40)， D1.5-103(SEQ ID NO ： 41)， D1.5-113(SEQ ID NO ： 42)， D1.5-115(SEQ ID NO ： 43)， D1.5-116(SEQ ID NO ： 44)， D1.5-121(SEQ ID NO ： 45)， D1.5-122(SEQ ID NO ： 46))， 对 EGFR 和 HER4 两者的 1 个独特结 合物 (D1.5-400， (SEQ ID NO ： 39))。
     九个双特异性克隆中的八个保留了 HVR L3 中位置 93 的脯氨酸， 由于这一位置采用脯氨酸 ( 与位置 96 的酪氨酸 ) 与其母体克隆 D1 相比显著增加 D1.5 对 EGFR 的亲和力， 可能它在保留对 EGFR 的结合中有贡献。
     评价双特异性 hEGFR/HER2， hEGFR/HER3， hEGFR/HER4 噬菌体克隆的特异性
     为了确定具有双重活性的九个克隆是否特异于它们的同族靶标， 评价了它们在直 接板 ELISA 形式中对一组抗原的结合。
     2μg/ml 的数种蛋白在 4℃过夜包被于免疫板上。板用 PBST 中 1％ BSA 封闭， 如在 实施例 1 中的描述所生长的噬菌体 -Fab 上清液的稀释物施加到板上 30 分钟。
     洗涤板， 记录结合信号并分析， 如实施例 1 所述。结果显示所有具有双重特异性的 克隆特异于它们的同族靶标。克隆 D1.5-4 和母体克隆 D1.5 用作对照。( 图 2)
     实施例 6
     表征作为游离 mIgG 的具有双重特异性的抗体
     所有具有双重特异性的克隆重新格式化成 mIgG 2A 用于进一步表征， 使用如上描 述的相同限制位点， 以及以前设计用于在哺乳动物细胞中瞬时鼠 IgG 表达的载体。
     抑制 EGFR-NR6 细胞中 TGF-αl 诱导的 EGFR 磷酸化
     为确定七个选择的具有双重特异性的抗体是否阻断 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化， 稳定转染的 EGFR-NR6 细胞如实施例 2 所述进行处理。 图 3 中的数据证明 EGFR/HER3 和 EGFR/ HER2 抗体在高浓度抑制 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化。商购的抗 EGFR 抗体用作阳性对照。
     对克隆 D1.5-100 和 D1.5-103 的剂量反应显示克隆 D1.5-100 丧失了其母体克隆 (D1.5) 抑制 EGFR 磷酸化的高效力。然而， D1.5-103 在这个测定中具有与 D1.5 相似的效 力。
     通过抗 EGFR/HER3 抗体抑制调蛋白结合 HER3
     为确定选择的抗 EGFR/HER3 抗体是否能够抑制调蛋白结合 HER3-ECD-Fc 蛋白， 纯 化的 IgGs 在放射性标记的配体结合测定中进行测试。
     结合测定在 Nunc 可拆条 (break-apart strip) 的孔中进行。 板子在 4℃用 100μl 的 5mg/mL 山羊抗人 Ab 在 50mM 碳酸盐缓冲液 (pH 9.6) 中包被过夜。板子用洗涤缓冲液 (PBS/0.005％ Tween20) 冲洗两次并用 100μl 1％ BSA/PBS 封闭 30min。去除缓冲液， 每孔 与 200ng 的 HER3-ECD-Fc 在 1％ BSA/PBS 中温育 1.5h。用洗涤缓冲液冲洗板子三次， 在 1％ 125 BSA/PBS 中的抗体在 4℃预结合 HER3-IgG 过夜。添加 I-HRG， 板子在室温温育 2 小时。冲 洗板子三次， 单个孔用 100 系列 Iso Dataγ- 计数器计数。( 图 4)。结果证明所有七个对 EGFR 和 HER3 具有双重特异性的抗体能够抑制调蛋白结合 HER3-ECD-Fc。
     通过抗 EGFR/HER4 抗体抑制调蛋白结合 HER4
     为 了 确 定 选 择 的 抗 EGFR/HER4 抗 体 D1.5-400 是 否 能 够 抑 制 调 蛋 白 结 合 HER4-ECD-Fc， 进 行 如 上 所 述 的 配 体 结 合 测 定。 使 用 25ngHER4-ECD-Fc， 而不使用 HER3-ECD-Fc。结果证明 D1.5-400 抑制调蛋白结合 HER4。
     抑制 MCF7 细胞中调蛋白诱导的 HER2/HER3 磷酸化
     为了确定选择的七个对 EGFR 和 HER3 具有双重特异性的抗体是否能够抑制 MCF7 细胞中调蛋白诱导的 HER2/HER3 磷酸化， 在受体磷酸化测定中对它们进行测试 ： MCF-7 细胞 (ATCC HTB 22， Manassas， Va.) 在 12 孔板中铺板。血清饥饿之后， 细胞与所示抗体 (75ug/ ml 或 150ug/ml) 温育 2 小时。细胞用 0.5nM HRG 刺激 8 分钟， 总细胞溶胞产物在 SDS-PAGE上运行， 蛋白质印迹用抗磷酸 -HER3、 抗 pTyr 或作为装载对照的抗微管蛋白探测。( 图 5)。 结果证明所有抗 EGFR/HER3 抗体在高浓度抑制调蛋白诱导的 HER2/HER3 磷酸化。培妥珠单 抗 (Pmab) 用作阳性对照。
     抑制 MDA-175 细胞增殖
     为了确定抗 EGFR/HER3 抗体对 HRG 驱动的细胞生长的生长抑制潜力， MDA-175 细胞 (ATCC HTB 25， Manassas， Va.)(20000 细胞 / 孔 ) 在 96 孔板中铺板。次日， 细胞用含 1％血 清的培养基中不同浓度的抗体 ( 多至 50ug/ml) 同时处理。 4 天或 5 天后， 添加 Alamar Blue， 使用荧光计检测荧光。结果以 RFUs 表示。选择 MDA-175 细胞是因为它们的生长是 HRG 自 分泌刺激的结果。抗 EGFR/HER3 抗体 D1.5-100 和克隆 D1.5-122 显示抑制 MDA-175 细胞生 长。培妥珠单抗 (Pmab) 用作阳性对照。( 图 6)。
     实施例 7
     D1.5-100 和 D1.5-103， 抗 hEGFR/HER3 双特异性抗体的诱变定位研究
     使用组合的噬菌体展示文库进行丙氨酸和同系物鸟枪法扫描分析 (Vajdos 等， J.Biol.Biol.320 ： 415-28(2002))， 以研究每种抗体与其两个抗原 (EGFR 和 HER3) 之间的相 互作用。
     对抗原 (hEGFR 和 HER3) 的结合选择用于分离功能性克隆， 随后进行 DNA 测序， 允 许计算在每个改变的位置的野生型 / 突变比率。然后用这些比率确定每个扫描的侧链对 EGFR 和 HER3 结合的贡献。
     该结果允许定位结合 EGFR 和 HER3 的功能性互补位。
     D1.5-100 和 D1.5-103 鸟枪文库设计
     CDR 中的溶剂暴露残基利用噬菌体 - 展示文库来筛选， 其中允许野生型残基作为 丙氨酸或野生型 ( 丙氨酸扫描 ) 或作为同系物残基或野生型 ( 同系物扫描 ) 变化。遗传密 码的性质还需要使除 Wt/ 丙氨酸或 Wt/ 同系物残基以外一些其他置换包括在该文库中。构 建单独的重链和轻链丙氨酸和同系物扫描文库。简并性范围为 1.3x105 至 7.5x107。
     构建鸟枪扫描文库
     文库如前所述进行构建， 除了单个 Fab 在细菌噬菌体表面上表达， 该 Fab 融合到 M13 基因 -3 小外壳蛋白的 C 末端结构域， 所述外壳蛋白通过 kunkel 诱变 ( 寡聚 F220 ： TCT TGT GAC AAA ACT CAC AGT GGC GGT GGC TCT GGT)(SEQ ID NO ： 77) 去除来自原始质粒的 亮氨酸拉链。
     轻链丙氨酸和同系物扫描文库在 HVR-L1， HVR-L2 和 HVR-L3 中具有终止密码子， 并且重链丙氨酸和同系物文库在各重链 HVRs 含有终止密码子。文库通过前述方法 (Sidhu 等， J.Mol.Biol.( 分子生物学杂志 )338 ： 299-310(2004))， 利用 Kunkel 诱变 (Kunkel 等， 1987， 见上文 )， 在各自终止模板上构建。丙氨酸扫描文库是允许选择的侧链改变为野生型 或丙氨酸的噬菌体展示文库。 同系物扫描意指允许选择的侧链改变为野生型或类似氨基酸 的噬菌体展示文库。
     文库选择
     NUNC 96 孔 Maxisorp 免疫板用 5μg/ml 捕获靶标 (EGFR-ECD-Fc， HER3-ECD-Fc 或 蛋白质 -L) 来包被并用处于 PBS 中的 1％ BSA(w/v) 来封闭。如所述， 来自上述文库的噬菌 体与 KO7 辅助噬菌体 (NEB) 一起繁殖 (Lee 等， 2004， 见上文 )。加入文库噬菌体溶液， 从而以浓度 1013 个噬菌体颗粒 /ml 包被板并在 RT 温育 1-2 小时。该板用 PBST 洗涤 8 次， 并随 后用 0.1MHCl 洗脱结合的噬菌体 30 分钟。如前所述确定各轮选择后的富集。2 轮靶标选择 后， 选择来自各文库的许多随机克隆来测序， 如 (Sidhu 等， 2004， 见上文 ) 所描述的。
     结合克隆的 DNA 序列用于确定在各改变的位置的野生型 / 突变比率。该比率用于 评估各选择的侧链对抗原的结合贡献。来自抗原选择的 wt/mut 比率除以来自展示选择的 wt/mut 比率提供了对于各突变对抗原结合亲和力效应的定量估计 ( 功能比率 Fwt/mut)。 如果 该比率大于 1， 突变是有害的。如果该比率小于 1， 突变是有益的。测序了 2500 个克隆。
     基于丙氨酸和同系物扫描的结果， 抗体 D1.5-100 用于结合 EGFR 和 HER3 的热点在 已知抗 HER2 抗体 4D5-Fv 的结构上定位。如图 7 所示， 定位表明对于 EGFR 结合， 重链占优 势， 对于 HER3 的结合， 重链和轻链一起作用。酸性 (E， D) 残基在结合 EGFR 和 HER3 两者中 均起重要作用， 尤其是结合 HER3 中。
     亲和力成熟
     图 8 图示了使用上述鸟枪文库的 D1.5-100 的亲和力成熟。在这种亲和力成熟策 略中， D1.5-100 重链同系物文库如前所述进行分选。在 HER3-ECD-Fc 包被的板上进行两轮 板分选后， 三轮溶液交替靶标在增加严格性下进行分选 (EGFR-ECD 和 HER3-ECD-Fc)。挑选 单克隆并在单点 ELISA 中评估， 以便分离保留双重结合活性的克隆。 在评估的克隆中， 94 个 中的 79 个显示对 EGFR/HER3 两者的结合， 而 11 个丧失 EGFR 结合并且显示对 HER3 的特异 性结合。
     通过单点竞争分离克隆
     挑选来自最后一轮分选的单集落， 噬菌体如实施例 1 中所述进行生长。384 个孔 用 1μl/ml EGFR-ECD-Fc 包被。对于各集落生长， 25μl 的噬菌体上清液或 ELISA 缓冲 液与 25μl 的 EGFR-ECD(50nM) 和 HER3-ECD-Fc(10nM) 一起温育。4μl 的温育物添加至 EGFR-ECD-Fc 包被的板中， 所述板洗涤八次。添加 60μl 的 1/5000 抗 M13-HR 缀合抗体， 洗 涤板八次， 用 TMB+H3PO4 显影。
     使用下述单点竞争方案， 选择八个独特克隆， 其对于 EGFR 和 HER3 显示比 D1.5-100 更大的抑制 ：
     1. 挑选来自最后一轮分选的单集落， 噬菌体如前所述进行生长 ；
     2.384 孔板用 1μg/ml EGFR-ECD-Fc 包被 ；
     3. 对 于 各 集 落 生 长， 25μl 的 噬 菌 体 上 清 液 或 ELISA 缓 冲 液 与 25μl 的 EGFR-ECD(50nM) 和 HER3-ECD-Fc(10nM) 一起温育 ；
     4.4μl 的温育物添加至 EGFR-ECD-Fc 包被的板 ；
     5. 洗涤板 8 次 ；
     6. 添加 60μl 的 1/5000 抗 M13-HRP 缀合抗体 ；
     7. 洗涤板 8 次 ；
     8. 板用 TMB+H3PO4 显影。
     选择 8 个独特克隆， 其对于 EGFR 和 HER3 两者显示比 D1.5-100 更大的抑制 (DL6， SEQ ID NO ： 63 ； DL7， SEQ ID NO ： 64 ； DL8， SEQ ID NO ： 65 ； DL9， SEQ ID NO ： 66 ； DL10， SEQ ID NO ： 67 ； DL11， SEQ ID NO ： 28 ； DL12， SEQ ID NO ： 68 ； DL13， SEQ ID NO ： 69)。对于抗 HER3 抗 体， 选择 7 个独特克隆， 其对于 HER3 显示比 D1.5-100 更大的抑制。表征亲和力成熟的双特异性和抗 HER3 抗体
     选择的亲和力成熟的双特异性抗体的结合特异性通过直接结合一组不同蛋白进 行评估， 如实施例 5 中所述。如图 9 中所示， 选择的抗体显示对 EGFR 和 HER3 两者的结合特 异性。
     对于两个选择的双特异性抗体 (DL7 和 DL11) 如实施例 1 所述计算 IC50 值， 并且 与 D1.5-100 母体克隆相比较。两个选择的双特异性抗体显示对于 HER3-ECD-Fc 相似的亲 和力， 以及对于 EGFR 增加的亲和力。DL1.5-100 具有对于 EGFR-ECD 44nM 的 IC50， 对于 HER3-FC 为 0.1nM 的 IC50 ； DL7 具有对于 EGFR-ECD 6.1nM 的 IC50， 对于 HER3-FC 为 0.25nM 的 IC50 ； DL11 具有对于 EGFR-ECD 5.7nM 的 IC50， 对于 HER3-FC 为 0.43nM 的 IC50。
     选择的抗 HER3 抗体的结合特异性通过直接结合一组不同蛋白进行评估， 如前所 述。选择的抗体 (DL3.5， DL3.6， DL3.7) 仅对 HER3 显示结合特异性。
     对于选择的抗体的噬菌体 IC50 值如上所述进行计算并且与 D1.5-100 母体克隆进 行比较。所有抗体 (DL3.1-3.7) 显示对于 HER3-ECD-Fc 增加的亲和力， 具有 1 和 3.8nM 之 间的 IC50s。母体 DL1.5-100 具有 4.6nM 的 IC50。
     使用上文描述的竞争 ELISA 将选择的双特异性抗体和抗 HER3 抗体的结合与 HER3 结构域 III 蛋白 (N- 末端 His 标签 ) 的结合进行比较。EGFR/HER3 和单特异性抗 HER3 抗体 对于 HER3ECD-Fc 和 HER3 结构域 III 构建体具有相似的亲和力 ( 噬菌体 IC50)。
     选择的亲和力成熟的双特异性抗体和抗 HER3 抗体重新格式化成 mIgG2A 并在竞争 ELISA 中验证， 如上所述。mIgG2A 双特异性抗体显示对于 EGFR-ECD 和 HER3 结构域 III 两 者与 D1.5-100 母体克隆相比增加的亲和力。
     使用 BIAcore 300 对亲和力成熟的 EGFR/HER3 抗体 DL7 和 DL11 和抗 HER3 特异性 抗体 DL3.6 和 DL3.7 进行动力学分析， 各抗体 (DL1.5-100， DL7， DL11， DL3.6， DL3.7) 纯化 的 mIgG2A 偶联到 CM5 芯片上， 数种抗原 (EGFR-ECD， HER3 结构域 III， HER3-ECD) 的稀释液 在实施例 4 所述的条件下流过包被的芯片。CM5 芯片在抗原的每次注射之间进行再生。最 后， 使用 1 ∶ 1 结合分析用质量转移确定 KD。亲和力成熟的 EGFR/HER3 抗体 DL7 和 DL11 对 于两种靶标均具有改善的 KD(M)。
     为了评估亲和力成熟的抗体 DL7、 DL11 和母体抗体 D1.5 对 EGFR 的抑制功能， 仅 表达 EGFR 的 EGFR-NR6 细胞用不同量的抗体 ( 多至 20ug/ml) 预处理一小时， 随后， 通过 TGFα(5nM) 诱导 EGFR 的磷酸化。 抗体对受体的磷酸化的抑制使用抗磷酸酪氨酸抗体检测。 也看到剂量依赖性方式的 MAPK 活化的抑制。抗体 DL11 在抑制 EGFR 和 ERK1/2 磷酸化中比 DL7 效力更大。( 图 10A)。
     比较了 DL7、 DL11 和单特异性抗 HER3 抗体 DL3.6 对 HER3 反式激活的抑制功能。 ( 图 10B)。表达 HER2、 HER3 和 EGFR 的 MCF-7 细胞用标示量的抗体 ( 多至 50ug/ml) 预处理 一小时， HER3 的活化和 HER3 的磷酸根转移通过 HRG 诱导。HER3 磷酸化的抑制使用抗磷酸 HER3 抗体检测。看到剂量依赖性方式的下游信号传导分子 ERK1/2 以及 Akt 的抑制。DL11 再次比 DL7 效力更大。
     DL11 的生长抑制功能与商购的抗 EGFR 抗体 ( 培妥珠单抗 ) 和抗 HER3 抗体的生 长抑制功能相比较， 或与 DL3.6， D1.5 或 D1.5+DL3.6 的组合的生长抑制功能相比较。H1666 细胞 (ATCC CRL-5885， Manassas， Va.)(NSCLC 细胞系， 其表达 HER2， HER3， EGFR 和 EGFR 配体 )(6000 细胞 / 孔 ) 用 HRG(3nM) 刺激生长。抗体以剂量依赖性方式检测， 生长抑制特性 与所有其它单特异性抗体相比较。如图 11A 所示， DL11 以比单特异性抗体或其组合更大的 程度抑制细胞生长。
     当用 HRG(3nM)+TGFα(6nM) 刺激 H1666 细胞生长重复所述测定时， 获得了相似的 结果。( 图 11B)。
     DL11 的生长抑制功能与培妥珠单抗 ( 一种抗 EGFR 抗体 ) 和抗 HER3 抗体， 或 DL3.6， D1.5 或 D1.5+DL3.6 的组合在 HCA-7 细胞中进行比较。HCA-7 是表达 HER2， HER3 和 EGFR 的结肠直肠细胞系。细胞生长用 HRG(3nM) 在 1％血清的存在下进行刺激。抗体以剂 量依赖性方式测试， 在 3 天后使用 Alamar Blue 试剂检测细胞活力。如图 12A 所示， 与所有 其它处理相比， DL11 显示优异的生长抑制特性。
     HCA-7 细 胞 生 长 的 抑 制 如 图 12A 相 关 描 述 进 行 研 究，除 了 生 长 用 HRG(3nM)+TGFα(5nM) 刺激。如图 12B 所示， 与所有其它处理相比， DL11 显示优异的生长抑 制特性。
     研究了 DL11 对 Calu-3 生长的抑制与抗 EGFR 抗体培妥珠单抗和抗 HER3 抗体比 较。NSCLC 细胞系 Calu-3(ATCC HTB-55， Manassas， Va.) 过表达 HER2， 并且具有正常水平 的 HER3 和 EGFR。细胞生长 (10,000 细胞 / 孔 ) 用 HRG(3nM) 在 1％血清存在下进行刺激， 抗体以剂量依赖性方式测试。如图 13 所示， 与单特异性抗体相比， DL11 显示优异的活性。
     实施例 8
     D1.5-201 和 D1.5-201-2， 抗 hEGFR/HER2 双特异性抗体的诱变定位研究
     对于 D1.5-201 的亲和力成熟， 对选择的氨基酸设计轻链软 / 同系物文库。一些软 残基 (soft residues) 进行软随机化 (soft randomized)， 其中野生型残基频率为 50％。 一 些残基使用编码野生型残基或同系物残基的密码子进行随机化。 一些同系物随机化允许野 生型和同系物残基以外 1 或 2 个额外残基。最后， 一些残基未改变。
     图 14 图示了对于 D1.5-201 的亲和力成熟的另一种分选策略。在这种策略中， D1.5-201 轻链软 / 同系物文库如前所述进行分选。在 HER2/ECD 上进行增加的严格性的三 轮交替板 / 溶液分选之后， 挑选单克隆并且在单点 ELISA 中评估， 以便分离保留对 EGFR 和 HER2 双重结合活性的克隆。在所评估的克隆中， 77/192 显示对 EGFR 和 HER2 两者的结合。
     确 定 了 选 择 的 亲 和 力 成 熟 的 EGFR/HER2 双 特 异 性 抗 体 的 轻 链 可 变 区 序 列 (D1.5-201(SEQ ID NO ： 36)， D1.5-201-2(SEQ ID NO ： 37)， D1.5-201-3(SEQ ID NO ： 38))。 对于两个选择的亲和力成熟的双特异性抗体 (D1.5-201-2， D1.5-201-3) 如前所述计算噬 菌体 IC50 并且与 D1.5-201 母体克隆进行比较。两种亲和力成熟的双特异性抗体均显示对 于 HER2-ECD 和 EGFR-ECD 增加的亲和力。
     实施例 9
     DL11 亲和力成熟
     DL11 如上所述进一步亲和力成熟， 产生对于 EGFR 和 HER3 具有特异性的两种另 外的双特异性抗体 (DL11b 和 DL11f) 和特异于 HER3 的两种抗体 (DL3-11fb 和 DL3-11f)。 DL11b 的重链和轻链氨基酸序列分别显示于 SEQ ID NOs ： 12 和 13 中。DL11f 的重链和轻链 氨基酸序列分别显示于 SEQ ID NOs ： 14 和 13 中。 DL3-11b 的重链和轻链氨基酸序列分别显 示于 SEQ ID NOs ： 19 和 13 中， DL3-11f 的重链和轻链氨基酸序列分别显示于 SEQ ID NOs ：20 和 13 中。
     Biacore 亲和力测定
     DL11b 和 DL11f 对于它们的 EGFR 和 HER3 靶标的结合亲和力在下述 Biocore 测定 中确定。DL11b 和 DL11f 两者均显示与 DL11 相比对于它们的靶标改善的亲和力。
     测量使用表面等离子共振在 BIAcoreTM 2000 仪器 (GE Healthcare， BIAcore Life Sciences， Piscataway， NJ) 上进行。编码人 EGFR 的胞外结构域 (ECD)( 氨基酸 1-637) 和 人 HER3 的胞外结构域 (ECD)( 氨基酸 1-640) 的 cDNAs 克隆到含有编码人 IgG1 的 Fc 区的 序列的哺乳动物表达载体中， 从而产生人 Fc 融合蛋白。重组的人 EGFR-IgG1(2.65mg/ml)， 人 HER3-IgG1(3.35mg/ml) 通过瞬时转染中国仓鼠卵巢细胞产生， 并且通过蛋白质 A 亲和色 谱法纯化。编码人 EGFR 胞外结构域 ( 氨基酸 1-637) 的 cDNA 克隆到含有 N 末端标志序列 的哺乳动物表达载体中。
     确定作为 Fab 和 IgG 抗体的 DL11f 的结合亲和力。对于 Fab 测定， DL11f Fab 是分 析物， 使其流过 CM5 芯片， 其中不同配体 - 人 EGFR-Fc 和人 HER3-Fc- 首先使用 BIAcore 人抗 体捕获试剂盒 (BR-1008-39， Lot 10020611) 捕获。 2 倍稀释系列的 DL11f Fab 以 PBS、 0.05％ Tween20 中 0.244-250nM 的范围以 30μl/ 分的流速于 25℃注射。 Fc 融合配体和分析物的各 次注射之间， 使用 3M 氯化镁再生传感器芯片 (5μl， 以 10μl/min 的流速 )。 为了确定 DL11f Fab 对人 EGFR 和人 HER3Fc 融合蛋白的亲和力常数， 从观察的测试传感图 (sensorgram) 中 减去来自参照细胞的信号。 通过数据的非线性回归拟合根据 1 ∶ 1 Langmuir 结合模型使用 BIAcore 评价软件 (GE Healthcare)4.1 版 ( 由制造商提供 ) 计算动力学常数。DL11f Fab 代表性浓度 (125nM) 的两个重复给出对于所有 Fc 融合蛋白的非常相似的拟合和动力学常 数。DL11fFab 以 1.92nM 的 KD 值结合人 EGFR-Fc， 以 0.39nM 的 KD 值结合人 HER3-Fc。
     探索了第二个实验条件以获得作为 IgG 的来自 DL11f 的结合动力学。在此， DL11f 人 IgG1 固定于传感器芯片 CM5 上， 单体的人 EGFR-ecd 和人 HER3-ecd 用作分析物。 2 倍稀释 系列的人 EGFR-ecd 和人 HER3-ecd 以 PBS、 0.05％ Tween20 中 0.244-250nM 的范围以 30μl/ 分的流速于 25℃注射。确定对于 Fab 的结合动力学。DL11f 分别以 19.9nM 和 2.63nM 的 KD 值结合人 EGFR-ecd 和人 HER3-Fc。在两个实验中， 我们观察到 DL11f 抗体对于 HER3 比对于 EGFR 具有一致性地 5-8 倍更高的亲和力。与实验 1 相比时， 在实验 2 中发现对于两种受体 更低的亲和力， 可能由于将 EGFRecd 或 HER3ecd 作为溶液中的分析物和将受体作为 Fc 融合 物固定于流动细胞芯片上之间的差别。可能作为游离的 ECD 的这些多 - 结构域受体在溶液 中时可能遇到更多结合能的熵罚分 (entropic penalty)， 由此导致更弱的亲和力。
     在相似条件下在单独的 Biacore 分析中， DL11b 显示与 DL11f 相似的对 EGFR 和 HER3 的结合亲和力。
     DL3-11b 和 DL3-11f 丧失特异性结合 EGFR 的能力， 而保留特异性结合 HER3 的能 力。
     抑制 MDA-175 细胞增殖
     通过 DL11b 和 DL11f 抑制 MDA-175 细胞增殖如上所述进行研究。DL11b 和 DL11f 两者均以与 DL11 抗体相似的程度抑制 MDA-175 细胞的增殖。图 15。DL11， DL11f 和 DL11b 的 IC50s 都是大约 0.8-1.0ug/ml。
     抑制 MCF7 细胞中调蛋白诱导的 HER3 磷酸化为了确定 DL11f 是否能够抑制 MCF7 细胞中调蛋白诱导的 HER3 磷酸化， 如实施例 6 所述进行受体磷酸化测定。结果证明 DL11f 以剂量依赖性方式抑制调蛋白诱导的 HER3 磷 酸化。图 16。
     抑制稳定转染的 EGFR-NR6 细胞中 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化
     为了确定 DL11f 是否选择性阻断 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化， 如实施例 2 所述进 行受体磷酸化测定。图 16 中的数据证明在这种基于细胞的测定中， DL11f 以剂量依赖性方 式抑制 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化。
     DL11 和 DL11f 在体内模型中抑制肿瘤生长
     HCA-7 肿瘤移植模型测定用于确定 DL11 和 DL11f 对体内肿瘤生长的效应。 测定如 下进行。
     SCID beige 小鼠 (Charles River Laboratories， San Diego， CA) 皮下移植 HCA-7 肿瘤块。当肿瘤达到平均体积 100 至 250mm3， 具有相似大小肿瘤的小鼠随机分到如下处理 组群 (n ＝ 9/ 组 ) ： 赋形剂 (PBS)， 培妥珠单抗 (10mg/kg)， D1.5(25mg/kg)， D1.5+DL3.6( 各 25mg/kg)， DL11(25mg/kg)， 或 DL11f(25mg/kg)。处理通过腹膜内施用， 在随机化当天以 2x 负荷剂量 (20 或 50mg/kg) 开始， 每周继续， 进行总计三次处理。 在研究期间每周两次用测径 器测量肿瘤。小鼠居住于标准啮齿动物微隔离笼 (microisolator cages) 中。动物室的环 境控制设定为维持温度大约 70° F， 相对湿度大约 40％ -60％， 大约 14- 小时光 /10- 小时暗 周期。小鼠根据实验室动物护理和使用 (Care and Use of Laboratory Animals) 的 ILAR 指南维持， 研究经在 Genentech 的研究所动物护理和使用委员会 (Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)) 考查和批准。
     在这种异种移植模型中， DL11 和 DL11f 在降低平均肿瘤体积中同样有效。图 17。
     DL11f 在非小肺细胞癌模型中有活性
     在具有源自人 NSCLC 系 H358(ATCC CRL-5807， Manassas， Va.) 建立肿瘤的小鼠中 6 测试抗体。5x10 H358 细胞与基质胶皮下接种于 CB17 SCID 小鼠中。具有相似大小肿瘤的 动物随机分到如下处理组群 (n ＝ 9/ 组 ) ： 赋形剂 (DL11f 制剂缓冲液 )， D1.5(25mg/kg)， DL3.11b(25mg/kg)， DL11f(30mg/kg)， 或 D1.5+DL3.11b( 各 25mg/kg)。处理通过腹膜内施 用， 在随机化当天以 2x 负荷剂量 (50 或 60mg/kg) 开始， 每周继续， 进行总计四次处理。在 研究期间每周两次用测径器测量肿瘤。
     如图 18 所示， 双特异性抗体 DL11f 在这种 NSCLC 模型中有活性， 并且比抗 EGFR 特 异性和抗 HER3 特异性抗体的组合 (D1.5+DL3.11b) 在抑制肿瘤生长中更有效。
     实施例 10
     DL3.6 亲和力成熟
     DL3.6 如上所述进一步亲和力成熟， 产生另外的抗 HER3 抗体。DL3.6b 显示与母体 抗体 DL3.6 相比对于其靶标的亲和力的增加。 DL3.6b 的重链和轻链氨基酸序列分别显示于 SEQ ID NOs ： 17 和 13。
     如图 19 和 20 所示， DL3-11b， DL3.6 和 DL3.6b 抑制 HRG 诱导的 HER3 磷酸化和 MDA-175 细胞增殖。测定如上所述进行。
     实施例 11
     在 Fadu 异 种 移 植 模 型， 头 和 颈 鳞 状 细 胞 癌 (head and neck sauamous cellcarcinoma) 模型中的体内活性
     在具有源自 Fadu 细胞 (ATCC HTB-43， Manassas， Va.) 建立肿瘤的小鼠中测试 6 DL11f， 商购抗 EGFR 抗体和抗 HER3 抗体。5x10 FaDu 细胞皮下接种于 CB17SCID 小鼠中。具 有相似大小肿瘤的动物随机分到如下处理组群 (n ＝ 9/ 组 ) ： 赋形剂 (DL11f 制剂缓冲液 )， 抗 EGFR 抗体 (25mg/kg)， 抗 HER3 抗体 (50mg/kg) 和 DL11f(25mg/kg)。处理通过腹膜内施 用， 在随机化当天以 2x 负荷剂量 ( 分别为 50 或 100mg/kg) 开始， 每周继续， 进行总计四次 处理。在研究期间每周两次用测径器测量肿瘤。
     如图 21 所示， DL11f 在 FaDu 头和颈癌模型中有活性， 并且比抗 EGFR 特异性或抗 HER3 特异性抗体在抑制肿瘤生长中更有效。
     实施例 12
     在 BxPC3 异种移植模型， HER3 驱动的胰腺模型 (pancreatic model) 中的体内活 性
     在具有源自胰腺细胞系 BxPC3(ATCC CRL-1687， Manassas， Va.) 建立肿瘤的小鼠 6 中测试 DL11f， 抗 EGFR 抗体， 培妥珠单抗， 和抗 HER3 抗体。10x10 BxPC3 细胞皮下接种于 CB17SCID 小鼠中。具有相似大小肿瘤的动物随机分到如下处理组群 (n ＝ 8/ 组 ) ： 赋形剂 (DL11f 制剂缓冲液 )， 抗 EGFR 抗体 (25mg/kg)， 培妥珠单抗 (25mg/kg)， 抗 HER3 抗体 (50mg/ kg)， 和 DL11f(25mg/kg)。 处理通过腹膜内施用， 在随机化当天以 2x 负荷剂量 (50 或 100mg/ kg) 开始， 每周继续， 进行总计四次处理。在研究期间每周两次用测径器测量肿瘤。
     DL11f 在 BxPC3 胰腺癌模型中有活性， 并且比抗 EGFR 特异性或抗 HER3 特异性抗体 在延缓肿瘤生长中更有效。( 图 22)。
     实施例 13
     在 NSCLC Calu-3 异种移植模型中的体内活性
     在具有源自 NSCLC 系 Calu-3(ATCC HTB-55， Manassas， Va.) 建立肿瘤的小鼠中测 6 试 DL11f， 商购抗 EGFR 抗体， 和抗 HER3 抗体。5x10 Calu-3 细胞皮下接种于 SCID Beige 小 鼠中。具有相似大小肿瘤的动物随机分到如下处理组群 (n ＝ 9/ 组 ) ： 赋形剂 (DL11f 制剂 缓冲液 )， 抗 EGFR 抗体 (25mg/kg)， 抗 HER3 抗体 (25mg/kg)， 和 DL11f(25mg/kg)。处理通过 腹膜内施用， 在随机化当天以 2x 负荷剂量 (50) 开始， 每周 ( 抗 HER3 每两周 ) 继续， 进行总 计四 ( 八 ) 次处理。在研究期间每周两次用测径器测量肿瘤。
     DL11f 在 Calu-3 非小细胞肺癌模型中有活性， 并且比抗 EGFR 特异性或抗 HER3 特 异性抗体在延缓肿瘤生长中更有效。( 图 23)。
     实施例 14
     在表皮 A431 异种移植模型中的体内活性
     在具有源自表皮样细胞系 A431(ATCC CRL-2592， Manassas， Va.) 建立肿瘤的小鼠 6 中测试 DL11f， 商购抗 EGFR 抗体， 和抗 HER3 抗体。5x10 A431 细胞皮下接种于 SCID Beige 小鼠中。具有相似大小肿瘤的动物随机分到如下处理组群 (n ＝ 8/ 组 ) ： 赋形剂 (DL11f 制 剂缓冲液 )， 抗 EGFR 抗体 (12.5mg/kg)， 抗 HER3(50mg/kg) 和 DL11f(12.5 和 25mg/kg)。处 理在随机化当天通过腹膜内施用一次。在研究期间每周两次用测径器测量肿瘤。
     由于在小鼠中与抗 EGFR 抗体相比 DL11f 更快的清除， DL11f 以与抗 EGFR 抗体相 比 2x 浓度给药， 以便获得可比的暴露水平。总之， DL11f 与抗 EGFR 抗体同样好地抑制 A431表皮癌模型中的肿瘤生长。( 图 24)。
     实施例 15
     在携带患者来源的乳腺癌 MAXF449 的异种移植物的裸鼠中的体内活性
     DL11f， 商购抗 EGFR 抗体和抗 HER3 抗体在 Oncotest GmbH， Freiburg， Germany 进 行测试。在直接移植来自供体患者的肿瘤后， Oncotest 在裸鼠中作为皮下异种移植物传代 患者肿瘤， 像乳腺癌 MAXF 449。根据 Oncotest 的方案， 具有相似大小肿瘤的动物随机分到 如下处理组群 (n ＝ 10/ 组 ) ： DL11f(30mg)， 抗 EGFR 抗体 (30mg/kg)， 抗 HER3(60mg/kg) 和 赋形剂 (DL11f 制剂缓冲液 )。处理通过腹膜内施用， 在随机化当天以 2x 负荷剂量 ( 分别为 60 或 120mg/kg) 开始， 每周继续， 进行总计四次处理。
     DL11f 和抗 HER3 抑制 MAXF44 乳腺癌模型中的肿瘤生长， 而抗 EGFR 抗体无效应 ( 图 25)。
     实施例 16
     在前列腺 DU145 异种移植模型中的体内活性
     DL11f，商 购 抗 EGFR 抗 体 和 抗 HER3 抗 体 在 Piedmont Research Center， Morrisville 根据 Piedmont 的方案进行测试。具有相似大小肿瘤的动物随机分到如下处 理组群 (n ＝ 10/ 组 ) ： DL11f(25mg)， 抗 EGFR 抗体 (25mg/kg)， 抗 HER3(50mg/kg) 和赋形剂 (DL11f 制剂缓冲液 )。处理通过腹膜内施用， 在随机化当天以 2x 负荷剂量 ( 分别为 50 或 100mg/kg) 开始， 每周继续， 进行总计四次处理。DL11f 在 DU145 前列腺癌模型中有活性， 并 且比抗 EGFR 特异性或抗 HER3 特异性抗体在抑制肿瘤生长中更有效。( 图 26)。
     实施例 17
     在携带患者来源的卵巢癌 OVXF550 异种移植物的裸鼠中的体内活性
     DL11f， 商购抗 EGFR 抗体和抗 HER3 抗体在 Oncotest GmbH， Freiburg， Germany 进 行测试。在直接移植来自供体患者的肿瘤后， Oncotest 在裸鼠中作为皮下异种移植物传代 患者肿瘤， 像卵巢癌 OVXF550。 根据 Oncotest 的方案， 具有相似大小肿瘤的动物随机分到如 下处理组群 (n ＝ 10/ 组 ) ： DL11f(30mg)， 抗 EGFR 抗体 (30mg/kg)， 抗 HER3 抗体 (60mg/kg) 和赋形剂 (DL11f 制剂缓冲液 )。处理通过腹膜内施用， 在随机化当天以 2x 负荷剂量 ( 分别 为 60 或 120mg/kg) 开始， 每周继续， 进行总计五次处理。
     DL11f 在 OVFX550 卵巢癌模型中有活性。( 图 27)。
     实施例 18
     DL11f 在体外和体内介导抗体依赖性细胞的细胞毒性 (ADCC)
     DL11f 在体外介导 ADCC。A431， H292(ATCC CRL-1848， Manassas， Va.)， FaDu， BxPC3 和 MDA468(ATCC HTB-132， Manassas， Va.) 细胞 ( 均来自 ATCC) 在存在标示浓度的抗体时在 96 孔板中铺板。在 37℃预温育 30 分钟后， 添加分离的外周血单核细胞 (PBMC)， 在 37℃继 续温育另外 4 小时。4 小时后， 离心板并且收获上清液。上清液中的 LDH 活性根据 Promega CytoTox-One 同质膜完整性测定程序确定。 为了确定百分数细胞介导的细胞毒性， 计算平均 吸光度并且减去背景。如图 28 所示， DL11f 以剂量依赖性方式减轻在 EGFR 表达细胞系中 的 ADCC。
     向 DL11f 引入氨基酸置换 N297A 以缺失效应子功能。N297 是 FcRγ 和 / 或补体结 合必需的。DL11f-N297A 在体外显示丧失 ADCC。如所预期的， DL11f 体外生长抑制功能未受该突变的影响。( 图 29)。
     在具有源自 NSCLC 细胞系 H292(ATCC CRL-1848， Manassas， Va.) 建立肿瘤的小 6 鼠中测试 DL11f 和 DL11f-N297A。5x10 A431 细胞皮下接种于 C.B17-SCID 小鼠中。具有 相似大小肿瘤的动物随机分到如下处理组群 (n ＝ 10/ 组 ) ： 赋形剂 (DL11f 制剂缓冲液 )， DL11f(6mg/kg) 和 DL11f-N297A(6mg/kg)。处理在随机化当天通过腹膜内施用一次。在研 究期间每周两次用测径器测量肿瘤。最初， DL11f 和 DL11f N297A 通过抑制 HER 途径信号 传导等价地抑制肿瘤生长。但当剂量减少时， 与 DL11f N297A 相比， DL11f 由于其 ADCC 能 力显示延长的抗肿瘤活性。( 图 30)。
     实施例 19
     在食蟹猴中 DL11f 比西妥昔单抗毒性更低
     进行研究以确定 DL11f 和西妥昔单抗的相对毒性。食蟹猴分为三组并且给药 DL11f 或西妥昔单抗 (Capital Wholesale Drug， Columbus， OH)， 每周一次进行六周， 如下所 述：
     组1： 西妥昔单抗 25mg/kg ；
     组2： DL11f25mg/kg ；
     组3： DL11f 12.5mg/kg。
     所有 3 组西妥昔单抗给药的动物在第 3 和第 4 次给药之间发生皮肤损害， 表明毒 性。这种结果基于以前 FDA 批准西妥昔单抗过程中所做的食蟹猴研究是预料到的。在所述 研究中在这一点没有 DL11f 给药的动物显示毒性体征。
     接受 25mg/kg 剂量 DL11f 的动物中的一个在第 6 次给药后一周发生皮肤损害。这 一损害测量为大约 4cm x 7cm， 当与西妥昔单抗处理的动物中观察到的损害相比时， 是非常 轻度的并且限制在更小的区域。
     基于在这种毒理学研究中的毒性动力学参数分析， 在以 25mg/kg 给药各测试化合 物的动物中， 西妥昔单抗和 DL11f 的暴露是相似的。
     在下述条件下进行第二个、 更大规模的研究。
     食蟹猴分为六组， 通过静脉内施用 DL11f 或赋形剂对照来给药， 每周一次进行 十二周， 如下所述 ：
     组1： 10 只猴 (5 雄性 /5 雌性 )- 赋形剂对照
     组2： 10 只猴 (5 雄性 /5 雌性 )DL11f5mg/kg
     组3： 10 只猴 (5 雄性 /5 雌性 )DL11f 15mg/kg
     组4： 10 只猴 (5 雄性 /5 雌性 )DL11f30mg/kg
     组5： 4 只猴 (2 雄性 /2 雌性 ) 赋形剂对照
     组6： 4 只猴 (2 雄性 /2 雌性 )DL11f30mg/kg
     在研究过程中或在 DL11f 最后一次给药之后的恢复期间， 没有动物显示任何明显 的皮肤毒性。
     也在食蟹猴中进行了单次剂量、 IV 施用 PK 研究。在这种研究中， 每组 3 只猴用 1、 10 或 30mg/kg 的 DL11f 静脉内给药。所探索的剂量范围中的 PK 是非线性的， 与已经在其它 靶向 EGFR 的抗体中看到的可饱和的清除一致。
     将在本说明书中引用或提及的所有的专利、 专利申请、 专利申请公开物和其它公开物的全文通过引用并入本文， 其程度如同将每个独立专利、 专利申请、 专利申请公开物或 公开物特别地和单独地指定通过引用并入本文中的程度一样。82102356092 A CN 102356102
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     图 8 概述了使用鸟枪文库对于 D1.5-100EGFR-HER3 抗体亲和力成熟的策略。
     图 9 显示两个选择的亲和力成熟的抗体 (DL7 和 DL11) 对于 EGFR 和 HER3 两者是 特异性的。
     图 10 ： A) 显示亲和力成熟的抗体 DL7 和 DL11 与母体抗体 D1.5 对于 EGFR 的抑制 功能的比较。B) 显示亲和力成熟的抗体 DL7 和 DL11 与单特异性抗 HER3 抗体 DL3.6 对于 HER3 反式激活的抑制功能的比较。
     图 11A) 提供图显示 DL11 与培妥珠单抗 (pertuzumab)， 抗 EGFR 抗体， 和抗 HER3 抗 体， 或 DL3.6， D1.5， 或 D1.5+DL3.6 的组合相比对于 H1666 细胞生长抑制功能的比较， 所述 细胞是 NSCLC 细胞系， 表达 HER2， HER3， EGFR 和 EGFR 配体， 生长用 HRG 刺激。B) 提供图显 示 DL11 与培妥珠单抗， 抗 EGFR 抗体和抗 HER3 抗体， 或 DL3.6， D1.5 或 D1.5+DL3.6 的组合 相比对于 H1666HSCLC 系生长抑制功能的比较， 生长用 HRG 和 TGFα 刺激。
     图 12A) 提供图显示通过 DL11 与 pMab， 抗 EGFR 抗体， 和抗 HER3 抗体相比较抑制 HCA-7 细胞的增殖， 该细胞是结肠直肠癌细胞系， 表达 HER2， HER3 和 EGFR。细胞生长用 HRG 刺激。B) 提供图显示如图 12A 中的 HCA-7 细胞生长的抑制， 除了细胞生长用 HRG+TGFα 刺 激。
     图 13 显示 Calu-3 细胞增殖的抑制， 所述细胞是 NSCLC 系， 过表达 HER2 并且具有 正常水平的 HER3 和 EGFR。细胞生长用 HRG 刺激， 抗体以剂量依赖方式测试。
     图 14 概述了对于 D1.5-201 亲和力成熟的分选策略。
     图 15 显示通过 DL11， DL11b 和 DL11f 抑制 MDA-175 细胞增殖。
     图 16 显示 DL11f 抑制调蛋白诱导的 HER3 磷酸化和 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化。
     图 17 是显示在 HCA-7 肿瘤移植模型中通过 DL11 和 DL11f 抑制肿瘤生长的图。
     图 18 是显示在 H358NSCLC 异种移植模型中通过 DL11f 抑制肿瘤生长的图。
     图 19 显示通过 DL3-11b， DL3.6b 和 DL3.6 抑制 HRG 诱导的 HER3 磷酸化。
     图 20 ： 通过 DL3-11b， DL3.6b 和 DL3.6 抑制 MDA-175 细胞增殖。
     图 21 是显示在 FaDu 癌症模型中通过 DL11f 抑制肿瘤生长的图。
     图 22 是显示在 BxPC3 胰腺癌模型中通过 DL11f 抑制肿瘤生长的图。
     图 23 是显示在 Calu-3 非小细胞肺癌模型中通过 DL11f 抑制肿瘤生长的图。
     图 24 是显示在 A431 上皮癌模型中通过 DL11f 抑制肿瘤生长的图。
     图 25 是显示在 MAXF44 乳腺癌模型中通过 DL11f 抑制肿瘤生长的图。
     图 26 是显示在 DU145 前列腺癌模型中通过 DL11f 抑制肿瘤生长的图。
     图 27 是显示在 OVXF550 卵巢癌模型中通过 DL11f 抑制肿瘤生长的图。
     图 28 显示在数个细胞系中 DL11f 诱导 ADCC。
     图 29 显示 DL11f-N297A 缺少 ADCC 活性。
     图 30 显示在 H292NSCLC 癌症模型中通过 DL11f 和 DL11f-N297A 抑制肿瘤生长。
     图 31A-C 是提供关于 EGFR 拮抗剂疗法观察到的非临床和临床毒性信息的表。
     图 32 是提供关于疹 / 脱屑和痤疮 / 痤疮样疹分级信息的表。
     图 33 提供具有 Kabat 编号的数个抗 HER 抗体的重链可变结构域和轻链可变结构 域的氨基酸比对。图 33A 显示下述抗体的轻链可变结构域 ： D1(SEQ ID NO ： 58) ； D1.5(SEQID NO ： 24) ； D1.5-100(SEQ ID NO ： 40) ； DL11(SEQ ID NO ： 27) ； DL11b(SEQ ID NO ： 29) ； DL11f(SEQ ID NO ： 29)。图 33B 显示下述抗体的重链可变结构域 ： D1(SEQ ID NO ： 25) ； D1.5(SEQ ID NO ： 25) ； D1.5-100(SEQ ID NO ： 25) ； DL11(SEQ ID NO ： 28) ； DL11b(SEQ ID NO ： 28) ； DL11f(SEQ ID NO ： 30)。
     发明详述
     I. 定义
     除非另有定义， 本文使用的所有专门术语、 符号和其它科学术语意图具有本发明 所属领域技术人员普遍理解的含义。在一些情况下， 为了清楚和 / 或易于引用， 本文定义了 具有普遍理解含义的术语， 并且本文包含此类定义没有必要解释为其代表了与本领域通常 理解的实质上的差异。 本文中描述或提到的技术和程序一般得到了本领域技术人员的充分 理解， 而且利用常规方法得以普遍采用， 诸如例如下列文献中记载的广泛应用的分子克隆 的方法 ： Sambrook 等人， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual( 分子克隆 ： 实验室指 南 ) 第二版 (1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， N.Y.。 如果合适， 涉及使用市售的试剂盒和试剂的程序一般根据制造商规定的方案和 / 或参数进 行， 除非另有说明。 在描述本发明的方法、 试剂盒及其用途之前， 应当理解本发明不限于所述具体方 法、 方案、 细胞系、 动物种或属、 构建物和试剂， 因为它们当然可以变化。还应当理解本文所 用术语只是为了描述具体实施方案， 并非意图限制本发明的范围， 只有所附权利要求才对 本发明范围进行了限制。
     必须注意的是， 在用于本文及所附权利要求时， 除非上下文另有明确规定， 单数形 式 “一个” 、 “一种” 和 “所述″包括复数所指物。
     在本说明书和权利要求书全文中， 词语 “包括” 或变体诸如 “包含” 或 “含有” ， 应当 理解为意指包括所述的整数 ( 整体 ) 或整数 ( 整体 ) 的组， 但是不排除任何其它整数 ( 整 体 ) 或整数 ( 整体 ) 的组。
     本文中术语 “抗体” 以其最广义使用， 特别是涵盖单克隆抗体、 多克隆抗体、 多特异 性抗体和抗体片段， 只要它们表现出所希望的生物学活性。术语 “多特异性抗体” 以最广义 使用， 具体涵盖包含这样的抗原结合结构域的抗体， 所述抗原结合结构域具有多表位特异 性 ( 即， 能够特异性结合一种生物分子上的两个或多个不同表位或能够特异性结合在两种 或多种不同生物分子上的表位 )。 抗原结合结构域的一个具体实例是 VHVL 单元， 其由重链可 变结构域 (VH) 和轻链可变结构域 (VL) 构成。此类多特异性抗体包括但不限于全长抗体、 具 有两个或多个 VL 和 VH 结构域的抗体、 抗体片段如 Fab、 Fv、 dsFv、 scFv、 双抗体 (diabodies)、 双特异性双抗体和三链抗体 (triabodies)、 已被共价或非共价连接的抗体片段。 “双特异性 抗体” 是包含这样的抗原结合结构域的多特异性抗体， 所述抗原结合结构域能够特异性结 合一个生物分子上的两个不同表位， 或能够特异性结合两个不同生物分子上的表位。双特 异性抗体在本文中也称为具有 “双特异性” 或是 “双特异性的” 。
     在 某 些 实 施 方 案 中， 本 发 明 的 抗 体 对 于 其 靶 标 HER 或 HERs 具 有 的 解 离 常 数 (Kd) ≤ 1μM， ≤ 100nM， ≤ 10nM， ≤ 1nM， ≤ 0.1nM， ≤ 0.01nM， 或≤ 0.001nM( 例如 10-8M 以 下， 例如 10-8M 至 10-13M， 例如， 10-9M 至 10-13M)。
     基本的 4 链抗体单元是由两条相同的轻链 (L) 和两条相同的重链 (H) 构成的异四
     聚体糖蛋白 (IgM 抗体由 5 个基本的异四聚体单元及称作 J 链的另外多肽组成， 因此包含 10 个抗原结合位点 ； 而分泌型 IgA 抗体可聚合形成包含 2-5 个基本的 4 链单元及 J 链的多价 装配物 )。在 IgG 的情况中， 4 链单元通常约 150,000 道尔顿。每条轻链通过一个共价二硫 键与重链相连， 而取决于重链的同种型， 通过一个或多个二硫键彼此连接两条重链。 每条重 链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在 N- 末端具有一个可变结构域 (VH)， 接 着是三个 ( 对于每种 α 和 γ 链 ) 和四个 ( 对于 μ 和 ε 同种型 ) 恒定结构域 (CH)。每条 轻链在 N- 末端具有一个可变结构域 (VL)， 接着是其另一端的一个恒定结构域 (CL)。VL 与 VH 排列在一起， 而 CL 与重链的第一恒定结构域 (CH1) 排列在一起。特定的氨基酸残基被认为 在轻链和重链可变结构域之间形成界面。成对的 VH 和 VL 一起形成一个抗原结合位点。关 于不同类别抗体的结构和性质， 参见如 Basic and Clinical Immunology ( 基本和临床酶 学 )， 第八版， Daniel P.Stites， Abba I.Terr 和 Tristram G.Parslow( 编辑 )， Appleton & Lange， Norwalk， CT， 1994， 第 71 页和第 6 章。
     来自任何脊椎动物物种的轻链， 根据其恒定结构域氨基酸序列， 可归入两种称作 κ 和 λ 的截然不同型中的一种。根据其重链恒定结构域 (CH) 氨基酸序列， 免疫球蛋白可 归入不同的类或同种型。有五类免疫球蛋白 ： IgA、 IgD、 IgE、 IgG 和 IgM， 分别具有称作 α、 δ、 γ、 ε 和 μ 的重链。根据 CH 序列和功能的相对较小差异， γ 和 α 类可进一步分为亚 类， 例如人表达下列亚类 ： IgG1、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA1 和 IgA2。
     术语 “可变的” 指可变结构域中的某些区段在抗体序列中差异广泛的情况。V 结 构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而， 变异性并非均匀分布于 可变结构域跨越的 110 个氨基酸。而 V 区由 15-30 个氨基酸， 称作构架区 (FR) 的相对不 变异的区段及将构架区分开的称作 “高变区” 或 HVR 的极度变异的较短区域组成。天然重 链和轻链的可变结构域各自包含四个 FRs， 它们大多采取 β- 折叠构象， 通过形成环状连接 且在有些情况中形成 β- 折叠结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过 FR 非常接近的保持在一起， 并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成 ( 参 见 Kabat 等， Sequences of Proteins of Immunological Interest ( 免疫学感兴趣的蛋 白质的序列 )， 第五版 .Public Health Service( 公共卫生署 )， National Institutes of Health( 国立卫生研究所 )， Bethesda， MD.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的 结合， 但展现出多种效应子功能， 如在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC) 中抗体的参 与。
     术语 “高变区” 、 “HVR” 或 “HV” 在用于本文时指抗体可变结构域中序列上高度可 变和 / 或形成结构上定义的环的区域。通常， 抗体包含六个 HVR ： 三个在 VH 中 (HVR-H1、 HVR-H2、 HVR-H3)， 三个在 VL 中 (HVR-L1、 HVR-L2、 HVR-L3)。在天然抗体中， H3 和 L3 展示这 六个 HVR 的最大多样性， 而且认为特别是 H3 在赋予抗体以精细特异性中发挥独特作用。参 见例如 Xu 等， 免疫性 (Immunity)13 ： 37-45(2000) ； Johnson 和 Wu 于 ： 分子生物学中的方法 (Methods in Molecular Biology)248 ： 1-25(Lo， 编辑， Human 出版社， Totowa， NJ， 2003)。 事实上， 仅由重链组成的天然存在骆驼科动物 (camelid) 抗体在缺乏轻链时是有功能的且 稳定的。参见例如 Hamers-Casterman 等， 自然 (Nature)363 ： 446-448(1993) ； Sheriff 等， 自然结构生物学 (Nature Struct.Biol.)3 ： 733-736(1996)。
     HVRs 一般包含来自高变环和 / 或 “互补决定区” (CDRs) 的氨基酸残基， 后者具有最高的序列变异性和 / 或参与抗原识别。本文中使用且涵盖许多 HVR 的叙述。Kabat 互 补性决定区 (CDR) 是以序列变异性为基础的， 而且是最常用的 (Kabat 等， 免疫学感兴趣的 蛋白质的序列 (Sequences of Proteins of Immunological Interest)， 第 5 版 . 公共卫 生署 (Public Health Service)， 国立卫生研究所 (National Institutes of Health)， Bethesda， MD.(1991))。Chothia 改为指结构环的位置 (Chothia 和 Lesk 分子生物学杂志 (J.Mol.Biol.)196 ： 901-917(1987))。AbM HVR 代表 Kabat HVR 与 Chothia 结构环之间的 折衷， 而且由 Oxford Molecular 的 AbM 抗体建模软件使用。 “contact” HVR 是以对可获得 的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些 HVR 中每一个的残基。
    HVR 可包括如下 “延伸的 HVR” ： VL 中的 24-36 或 24-34(L1)、 46-56 或 50-56(L2) 和 89-97 或 89-96(L3) 及 VH 中 的 26-35(H1)、 50-65 或 47-65(H2) 和 93-102、 94-102 或 95-102(H3)。对于这些定义中的每一个， 可变结构域残基是依照 Kabat 等， 见上文编号的。
     “构架” 或 “FR” 残基指除本文中所定义的 HVR 残基之外的那些可变结构域残基。
     术语 “依照 Kabat 的可变结构域残基编号方式” 或 “依照 Kabat 的氨基酸位置编号 方式” 及其变化形式指 Kabat 等， 见上文中的用于抗体编制的重链可变结构域或轻链可变 结构域编辑的编号系统。使用此编号系统， 实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨 基酸， 对应于可变结构域 FR 或 HVR 的缩短或插入。例如， 重链可变结构域可包含 H2 的残基 52 后的单一氨基酸插入 ( 依照 Kabat 为残基 52a) 及重链 FR 残基 82 后的插入残基 ( 例如 依照 Kabat 为残基 82a、 82b 和 82c 等 )。给定抗体的残基 Kabat 编号方式可通过将抗体序 列与 “标准” Kabat 编号序列对比同源区来确定。
     Kabat 编号系统一般在提及可变结构域中的残基 ( 大约是轻链的残基 1-107 和 重 链 的 残 基 1-113) 时 使 用 ( 例 如 Kabat 等， 免 疫 学 感 兴 趣 的 序 列 (Sequences of Immunological Interest). 第 5 版 . 公共卫生署 (Public Health Service)， 国立卫生研 究所 (National Institutes of Health)， Bethesda， Md.(1991))。 “EU 编号系统” 或 “EU 索 引” 一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用 ( 例如在 Kabat 等中报道的 EU 索引， 见上文 )。 “如在 Kabat 中所述的 EU 索引” 指人 IgG1EU 抗体的残基编号。除非本文中另有
     说明， 提及抗体可变结构域中的残基编号指根据 Kabat 编号系统的残基编号方式。除非本 文中另有说明， 提及抗体恒定结构域中的残基编号指根据 EU 编号系统的残基编号方式 ( 例 如参见 WO 2006/073941)。
     “亲和力” 是指分子 ( 例如抗体 ) 的单一结合位点与其结合配偶体 ( 例如抗原 ) 之 间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明， 在用于本文时， “结合亲和力” 指反映结 合对的成员 ( 例如抗体与抗原 ) 之间 1 ∶ 1 相互作用的内在结合亲和力。分子 X 对其配偶 体 Y 的亲和力通常可用解离常数 (Kd) 来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测 量， 包括本文中所描述的。
     “亲和力成熟的” 抗体指这样的抗体， 在该抗体的一个或多个 HVRs 或构架区中具 有一处或多处改变、 导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的母体抗体相比有所提 高。在一个实施方案中， 亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的 亲和力。亲和力成熟的抗体可使用本领域已知的某些方法来生成。例如， Marks 等， 生物 / 技术 (Bio/Technology)10 ： 779-783(1992) 记载了通过 VH 和 VL 结构域改组进行的亲和 力成熟。以下文献记载了 HVR 和 / 或构架残基的随机诱变 ： 例如 ： Barbas 等， 美国国家科 学 院 学 报 (Proc.Nat.Acad.Sci.USA)91 ： 3809-3813(1994) ； Schier 等， 基 因 (Gene)169 ： 147-155(1995) ； Yelton 等， 免疫学杂志 (J.Immunol.)155 ： 1994-2004(1995) ； Jackson 等， 免疫学杂志 (J.Immunol.)154(7) ： 3310-9(1995) ； 及 Hawkins 等， 分子生物学杂志 (J.Mol. Biol.)226 ： 889-896(1992)。
     抗体的 “种类” 是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种主要种 类的抗体 ： IgA， IgD， IgE， IgG， 和 IgM， 并且这些中的一些可以进一步分为亚类 ( 同种型 )， 例如 IgG1， IgG2， IgG3， IgG4， IgA1， 和 IgA2。对应于不同种类的免疫球蛋白的重链恒定结构域 分别被称为 α， δ， ε， γ 和 μ。
     术语 “单克隆抗体” 在用于本文时指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体， 即除 了可能的变体 ( 该变体可在产生单克隆抗体的过程中出现， 此类变体通常少量存在 ) 之外， 构成群体的各个抗体基本上相似并结合相同的表位。此类单克隆抗体典型的包括包含结 合靶标的可变区的抗体， 其中该抗体是通过包括从众多抗体中选择该抗体在内的过程得到 的。例如， 选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、 噬菌体克隆或重组 DNA 克隆的集合 中选择独特克隆。应当理解， 所选择的抗体可进一步改变， 例如为了提高对靶标的亲和力、 将抗体人源化、 提高其在细胞培养物中的产量、 降低其在体内的免疫原性、 创建多特异性抗 体等， 而且包含改变后的可变区序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。 除它们的特异性外， 单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语 “单克隆” 表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征， 不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗 体。例如， 将根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成， 包括杂交瘤法 ( 例如， Kohler 等， Nature( 自 然 )， 256 ： 495(1975) ； Harlow 等， 抗体 ： A Laboratory Manual( 抗 体： 实验室指南 )， (Cold Spring Harbor Laboratory Press， 第二版 .1988) ； Hammerling 等， 在： Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas( 单 克 隆 抗 体 和 T 细 胞 杂 交 瘤 )563-681， (Elsevier， N.Y.， 1981) 中、 重组 DNA 法 ( 参见例如， 美国专利 4,816,567)、 噬 菌 体 展 示 技 术 ( 参 见 例 如， Clackson 等， Nature( 自 然 )， 352 ： 624-628(1991) ； Marks 等， J.Mol.Biol.( 分子生物学杂志 )， 222 ： 581-597(1991) ； Sidhu 等， J.Mol.Biol.( 分子生 物 学 杂 志 )338(2) ： 299-310(2004) ； Lee 等， J.Mol.Biol.( 分 子 生 物 学 杂 志 )340(5) ： 1073-1093(2004) ； Fellouse， Proc.Nat.Acad.Sci.USA( 美 国 科 学 院 学 报 )101(34) ： 12467-12472(2004) ；和 Lee 等 J.Immunol.Methods( 免 疫 学 方 法 杂 志 )284(1-2) ： 119-132(2004)、 及用于从具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列 的基因的动物生成人或人样抗体的技术 ( 参见例如， WO98/24893， WO/9634096， WO/9633735 和 WO/9110741， Jakobovits 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美 国 科 学 院 学 报 )， 90 ： 2551(1993) ； Jakobovits 等， Nature( 自 然 )， 362 ： 255-258(1993) ； Bruggemann 等， Year in Immuno.( 免疫学年鉴 )， 7： 33(1993) ； 美国专利 5,545,806、 5,569,825、 5,591,669( 均 为 GenPharm 的 ) ； 5,545,807 ； WO 97/17852、 美国专利 5,545,807 ； 5,545,806 ； 5,569,825 ； 5,625,126 ； 5,633,425 ； 和 5,661,016， 和 Marks 等， Bio/Technology( 生 物 / 技 术 )， 10 ： 779-783(1992) ； Lonberg 等， Nature( 自 然 )， 368 ： 856-859(1994) ； Morrison， Nature( 自 然 )， 368 ： 812-813(1994) ； Fishwild 等， Nature Biotechnology( 自 然 ： 生 物 技 术 )， 14 ： 845-851(1996) ； Neuberger， Nature Biotechnology( 自然 ： 生物技术 )， 14 ： 826(1996) ； 和 Lonberg 和 Huszar， Intern.Rev.Immunol.( 国际免疫学综述 )， 13 ： 65-93(1995)。
     “完整” 抗体是包含抗原结合位点和 CL 以及至少重链恒定结构域 CH1、 CH2 和 CH3 的 抗体。该恒定结构域可以是天然序列恒定结构域 ( 例如人天然序列恒定结构域 ) 或其氨基 酸序列变体。优选地， 该完整抗体具有一种或多种效应子功能。
     “抗体片段” 包含完整抗体的一部分， 优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体 片段的例子包括 Fv、 Fab、 Fab′、 F(ab′ )2、 Fab’ -SH ； 双抗体 ； 线性抗体 ( 参见美国专利 5,641,870， 实施例 2 ； Zapata 等， Protein Eng.( 蛋白质工程 )8(10) ： 1057-1062(1995)) ； 单链抗体分子 ( 例如 scFv)。 在本说明书中以及在说明书全文中， 提及抗体和抗体的多种性 质， 同样的内容也适用于功能性抗体片段， 例如双重作用 Fab 片段。
     “线性抗体” 的表述通常是指 Zapata 等， Protein Eng.( 蛋白质工程 )， 8(10) ： 1057-1062(1995) 描述的抗体。这些抗体包含一对串联的 Fd 片段 (VH-CH1-VH-CH1)， 其与互 补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。 在优选实施方案中， 所述片段是 “功能性的” ， 即在 性质上保留相应完整抗体结合靶标 HER 受体的能力， 并且如果完整抗体还抑制 HER 的活化 或功能， 在性质上也保留此类抑制特性。 在性质上保留意指以同样的方法活性被保留， 但是 结合亲和力和 / 或活性的程度可能不同。
     用木瓜蛋白酶消化抗体产生称作 “Fab” 片段的两个相同的抗原结合片段， 和一个 残余 “Fc” 片段， 其名称反映了它易于结晶的能力。Fab 片段由完整轻链及重链可变结构域 (VH) 和一条重链第一恒定结构域 (CH1) 组成。胃蛋白酶处理抗体产生一个较大 F(ab’ )2 片 段， 它粗略相当于两个通过二硫键相连的 Fab 片段， 具有二价抗原结合活性且仍能够交联 抗原。Fab’ 片段因在 CH1 结构域的羧基末端增加了少数残基 ( 包括来自抗体铰链区的一个 或多个半胱氨酸 ) 而与 Fab 片段有所不同。Fab’ -SH 是本文中对其中恒定结构域的半胱氨 酸残基携带一个游离硫醇基的 Fab’ 的称谓。F(ab’ )2 抗体片段最初是作为成对 Fab’ 片段 生成的， 在 Fab’ 片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
     Fc 片段包含通过二硫键保持在一起的两条重链的羧基末端部分。 抗体的效应子功 能是由 Fc 区中的序列决定的， 该区还是由在某些类型细胞上发现的 Fc 受体 (FcR) 所识别 的部分。“Fv” 由紧密、 非共价结合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二 聚体组成。 从这两个结构域的折叠中突出了六个高变环 ( 重链和轻链各 3 个环 )， 贡献出抗 原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而， 即使是单个可变结构域 ( 或只 包含对抗原特异的三个 HVRs 的半个 Fv) 也具有识别和结合抗原的能力， 尽管亲和力通常低 于完整结合位点。
     “单链 Fv” 也可缩写为 “sFv”或 “scFv” ， 是包含连接成一条多肽链的抗体 VH 和 VL 结构域的抗体片段。优选的是， sFv 多肽在 VH 和 VL 结构域之间还包含多肽接头， 使得 sFv 形成期望的抗原结合结构。关于 sFv 的综述参见 Pluckthun 于 .The Pharmacology of Monoclonal Antibodies( 单克隆抗体药理学 )， vol.113， Rosenburg 和 Moore 编辑， Springer-Verlag， New York， pp.269-315(1994) ； Borrebaeck 1995。
     术语 “双抗体 (diabodies)” 是指如下制备的小抗体片段， 通过使用短接头 ( 大 约 5-10 个残基 ) 在 VH 和 VL 结构域之间构建 sFv 片段 ( 见前段 ) 从而获得该 V 结构域的 链间而非链内配对而产生二价片段， 即具有两种抗原结合位点的片段。双抗体在例如 EP 404,097 ； WO 93/11161 ； 和 Hollinger 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美国科学院学报 )， 90 ： 6444-6448(1993) 中有更充分的描述。 与参照抗体 “结合相同表位的抗体” 是指这样的抗体， 其在竞争测定中阻断 50％以 上的所述参照抗体与其抗原的结合， 反之， 参照抗体在竞争测定中阻断 50％以上的该抗体 与其抗原的结合。
     术语 “嵌合” 抗体是指这样的抗体， 其中一部分重链和 / 或轻链来源于特定来源或 物种， 而剩余的重链和 / 或轻链来源于不同来源或物种。
     “人抗体” 指具有这样的氨基酸序列的抗体， 所述氨基酸序列对应于这样抗体的氨 基酸序列， 所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源， 其利用人抗体库或其它人抗体 编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
     “人共有构架” 是指这样的构架， 即在选择人免疫球蛋白 VL 或 VH 构架序列中， 其 代表最常出现的氨基酸残基。一般而言， 对人免疫球蛋白 VL 或 VH 序列的选择是从可变结 构域序列的亚型中选择。一般而言， 该序列的亚型是如 Kabat 等， Sequences of Proteins of Immunological Interest( 免疫学感兴趣的蛋白质的序列 )， 第五版， NIH Publication 91-3242， Bethesda MD(1991)， 1-3 卷中的亚型。在一个实施方案中， 对于 VL， 该亚型是如 Kabat 等 ( 见上文 ) 中的亚型 κI。在一个实施方案中， 对于 VH， 该亚型是如 Kabat 等 ( 见 上文 ) 中的亚型 III。
     非人 ( 例如啮齿动物 ) 抗体的 “人源化” 形式指最低限度包含衍生自非人抗体的 序列的嵌合抗体。在极大程度上， 人源化抗体指人免疫球蛋白 ( 受体抗体 ) 中的受体的 高变区残基用具有期望抗体特异性、 亲和力和能力的非人物种 ( 供体抗体 ) 诸如小鼠、 大 鼠、 兔或非人灵长类动物的高变区残基替换的人免疫球蛋白。在有些情况中， 将人免疫球 蛋白的构架区 (FR) 残基用相应的非人残基替换。此外， 人源化抗体可包含在受体抗体或 供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言， 人 源化抗体将包含基本上全部的至少一个、 通常两个如下可变结构域， 其中所有或基本上所 有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环， 且所有或基本上所有 FRs 是人免疫球蛋白序列 的 FRs。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区 (Fc)， 通常是人免疫球蛋白
     的恒定区。更多细节参见 Jones 等， Nature( 自然 )321 ： 522-525(1986) ； Riechmann 等， Nature( 自然 )332 ： 323-329(1988) ； 和 Presta， Curr.Op.Struct.Biol.( 结构生物学新观 点 )2 ： 593-596(1992)。
     “结合” 目的抗原的本发明的抗体是这样的抗体， 其与抗原以足够的亲和力结合， 从而该抗体可用作靶向蛋白质或表达该抗原的细胞或组织的诊断和 / 或治疗剂。关于抗体 与靶标分子的结合， 术语 “特异性结合” 或 “特异性结合至” 或 “特异于” 特定多肽或特定多 肽靶标上的表位指可测量出不同于非特异性相互作用的结合。 特异性结合可通过例如测定 分子的结合并与对照分子的结合比较来确定。例如， 特异性结合可通过与对照分子的竞争 来测定， 所述对照分子与靶标相似， 例如与过量的未标记靶标竞争。在这种情况中， 若经标 记靶标与探针的结合受到过量未标记靶标的竞争性抑制， 则指示特异性结合。在一个具体 实施方案中， “特异性” 结合是指抗体与其特定的靶标 HER 受体的结合， 并且不与其它特定 的非 - 靶标 HER 受体结合。例如， 抗体特异性结合 EGFR 和 HER3 但是不特异性结合 HER2 或 HER4， 或抗体特异性结合 EGFR 和 HER2 但是不特异性结合 HER3 或 HER4， 或抗体特异性结合 EGFR 和 HER4 但是不特异性结合 HER2 或 HER3。
     “HER 受体” 是属于 HER 受体家族的受体蛋白酪氨酸激酶， 包括 EGFR(ErbB1， HER1)， HER2(ErbB2)， HER3(ErbB3) 和 HER4(ErbB4) 受体。HER 受体通常将包含胞外结构域， 它可结 合 HER 配体和 / 或与另一个 HER 受体分子二聚化 ； 亲脂性跨膜结构域 ； 保守的胞内酪氨酸激 酶结构域 ； 和含有几个可被磷酸化的酪氨酸残基的羧基末端信号传导结构域。HER 受体可 以是 “天然序列” HER 受体或其 “氨基酸序列变体” 。优选的， HER 受体是天然序列人 HER 受 体。 “HER 途径” 是指由 HER 受体家族介导的信号传导网络。
     术语 “ErbB1” 、 “HER1” 、 “表皮生长因子受体” 和 “EGFR” 在本文中可互换使用， 指例 如 Carpenter 等， Ann.Rev.Biochem.56 ： 881-914(1987) 公开的 EGFR， 包括其天然存在的突 变体形式 ( 如 Ullrich 等， Nature( 自然 )(1984)309 ： 418425 和 Humphrey 等， PNAS(USA)87 ： 4207-4211(1990) 中的缺失突变体 EGFR) 及其变体， 诸如 EGFRvIII。EGFR 的变体也包括缺 失的、 置换的和插入的变体， 例如在 Lynch 等， (New England Journal of Medicine( 新英 格兰医学杂志 )2004， 350 ： 2129)， Paez 等， (Science( 科学 )2004， 304 ： 1497)， 和 Pao 等， (PNAS 2004， 101 ： 13306) 中描述的那些。
     在本文中， “EGFR 胞外结构域” 或 “EGFR ECD” 是指 EGFR 在细胞外的结构域， 锚定 到细胞膜或在循环中， 包括其片段。在一个实施方案中， EGFR 的胞外结构域可包括四个结 构域 ： “结构域 I” ( 氨基酸残基从约 1-158)， “结构域 II” ( 氨基酸残基 159-336)， “结构域 III” ( 氨基酸残基 337-470)， 和 “结构域 IV” ( 氨基酸残基 471-645)， 其中边界是近似的， 可有大约 1-3 个氨基酸的变化。
     表述 “ErbB2”和 “HER2”在本文中可互换使用， 指例如 Semba 等， PNAS(USA)82 ： 6497-6501(1985) 和 Yamamoto 等， Nature( 自然 )319 ： 230-234(1986) 中描述的人 HER2 蛋 白 (GenBank 编号 X03363)。术语 “erbB2” 指编码人 HER2 的基因， “neu” 指编码大鼠 p185neu 的基因。优选的 HER2 是天然序列人 HER2。
     在本文中， “HER2 胞外结构域” 或 “HER2ECD” 是指 HER2 在细胞外的结构域， 锚定 到细胞膜或在循环中， 包括其片段。在一个实施方案中， HER2 的胞外结构域可包含四个
     结构域 ： “结构域 I” ( 氨基酸残基从约 1-195， “结构域 II” ( 氨基酸残基从约 196-319)， “结构域 III” ( 氨基酸残基从约 320-488)， 和 “结构域 IV” ( 氨基酸残基从约 489-630) ( 残基编号不含信号肽 )。参见 Garrett 等， Mol.Cell.( 分子细胞 ).11 ： 495-505(2003)， Cho 等， Nature( 自 然 )421 ： 756-760(2003)， Franklin 等， Cancer Cell( 癌 细 胞 )5 ： 317-328(2004)，和 Plowman 等， Proc.Natl.Acad.Sci.( 美 国 国 家 科 学 院 学 报 )90 ： 1746-1750(1993)。
     “ErbB3”和 “HER3”指 例 如 美 国 专 利 5,183,884 和 5,480,968 以 及 Kraus 等， PNAS(USA)86 ： 9193-9197(1989) 中公开的受体多肽。
     在本文中， “HER3 胞外结构域” 或 “HER3ECD” 是指 HER3 在细胞外的结构域， 锚定到 细胞膜或在循环中， 包括其片段。在一个实施方案中， HER3 的胞外结构域可包含四个结构 域： 结构域 I， 结构域 II， 结构域 III， 和结构域 IV。 在一个实施方案中， HER3ECD 包含氨基酸 1-636( 编号包括信号肽 )。在一个实施方案中， HER3 结构域 III 包含氨基酸 328-532( 编 号包括信号肽 )。
     术语 “ErbB4″和 “HER4” 在本文中是指例如在欧洲专利申请 599,274 ； Plowman 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美国国家科学院学报 )， 90 ： 1746-1750(1993) ； 和 Plowman 等， Nature( 自然 )， 366 ： 473-475(1993) 中公开的受体多肽， 包括其同种型， 例如在 1999 年 4 月 22 日公布的 WO99/19488 中所公开的。
     “HER 配体”指结合和 / 或活化 HER 受体的多肽。本文中特别感兴趣的 HER 配 体是天然序列人 HER 配体， 诸如表皮生长因子 (EGF)(Savage 等， J.Biol.Chem.( 生物化 学杂志 )247 ： 7612-7621(1972)) ； 转化生长因子 α(TGF-α)(Marquardt 等， Science( 科 学 )223 ： 1079-1082(1984)) ； 双 调 蛋 白， 又 称 为 神 经 鞘 瘤 (schwanoma) 或 角 质 形 成 细 胞 自 分 泌 生 长 因 子 (Shoyab 等， Science( 科 学 )243 ： 1074-1076(1989) ； Kimura 等， Nature( 自然 )348 ： 257-260(1990) ； 和 Cook 等， Mol.Cell.Biol.( 分子细胞生物学 )11 ： 2547-2557(1991)) ； β 动 物 纤 维 素 (Shing 等， Science( 科 学 )259 ： 1604-1607(1993) ； 和 Sasada 等， Biochem.Biophys.Res.Commun.190 ： 1173(1993)) ； 肝素结合表皮生长因子 (HB-EGF)(Higashiyama 等， Science( 科学 )251 ： 936-939(1991)) ； epiregulin(Toyoda 等， J.Biol.Chem.( 生 物 化 学 杂 志 )270 ： 7495-7500(1995) ； 和 Komurasaki 等， Oncogene( 癌 基因 )15 ： 2841-2848(1997)) ； 调蛋白 ( 见下文 ) ； 神经调节蛋白 -2(NRG-2)(Carraway 等， Nature( 自 然 )387 ： 512-516(1997)) ； 神 经 调 节 蛋 白 -3(NRG-3)(Zhang 等， Proc.Natl. Acad.Sci.( 美 国 国 家 科 学 院 学 报 )94 ： 9562-9567(1997)) ； 神 经 调 节 蛋 白 -4(NRG-4) (Harari 等， Oncogene( 癌基因 )18 ： 2681-89(1999)) ； 和 cripto(CR-1)(Kannan 等， J.Biol. Chem.( 生物化学杂志 )272(6) ： 3330-3335(1997))。 结合 EGFR 的 HER 配体包括 EGF， TGF-α， 双调蛋白， β 动物纤维素， HB-EGF 和 epiregulin。结合 HER3 的 HER 配体包括调蛋白和 NRG-2。能够结合 HER4 的 HER 配体包括 β 动物纤维素， epiregulin， HB-EGF， NRG-2， NRG-3， NRG-4， 和调蛋白。
     “调蛋白” (HRG) 在用于本文时指由调蛋白基因产物编码的多肽， 如美国专利 5,641,869， 或 Marchionni 等， Nature( 自然 )， 362 ： 312-318(1993) 所公开的。调蛋白的 例子包括调蛋白 -α、 调蛋白 -β1、 调蛋白 -β2 和调蛋白 -β3(Holmes 等， Science( 科 学 )， 256 ： 1205-1210(1992) ； 及 美 国 专 利 5,641,869) ； neu 分 化 因 子 (NDF)(Peles 等，Cell( 细 胞 )69 ： 205-216(1992)) ； 乙 酰 胆 碱 受 体 诱 导 活 性 (ARIA)(Falls 等， Cell( 细 胞 )72 ： 801-815(1993)) ； 神 经 胶 质 生 长 因 子 (GGFs)(Marchionni 等， Nature( 自 然 )， 362 ： 312-318(1993)) ； 感 觉 和 运 动 神 经 元 衍 生 因 子 (SMDF)(Ho 等， J.Biol.Chem.( 生 物 化学杂志 )270 ： 14523-14532(1995)) ； γ- 调蛋白 (Schaefer 等， Oncogene( 癌基因 )15 ： 1385-1394(1997))。
     “HER 二聚体” 在本文中指包含至少两个 HER 受体的非共价结合二聚体。当表达 两种或多种 HER 受体的细胞暴露于 HER 配体时可形成此类复合物， 可通过免疫沉淀进行 分离并通过 SDS-PAGE 进行分析， 如例如 Sliwkowski 等， J.Biol.Chem.( 生物化学杂志 )， 269(20) ： 14661-14665(1994) 所述。其它蛋白质， 诸如细胞因子受体亚基 ( 如 gp130) 可与 所述二聚体结合。
     “HER 异二聚体” 在本文中是指包含至少两个不同 HER 受体的非共价结合异二聚 体， 诸如 EGFR-HER2， EGFR-HER3， EGFR-HER4， HER2-HER3 或 HER2-HER4 异二聚体。
     “HER 抑制剂” 是干扰 HER 活化或功能的试剂。 HER 抑制剂的实例包括 HER 抗体 ( 例 如 EGFR， HER2， HER3， 或 HER4 抗体 ) ； EGFR- 靶向药物 ； 小分子 HER 拮抗剂 ； HER 酪氨酸激酶 抑制剂 ； HER2 和 EGFR 双重酪氨酸激酶抑制剂诸如拉帕替尼 (lapatinib)/GW572016 ； 反义 分子 ( 参见例如 WO2004/87207) ； 和 / 或结合下游信号传导分子诸如 MAPK 或 AKt 或干扰它 们的功能的试剂。优选地， HER 抑制剂是结合 HER 受体的抗体。
     “HER 二聚化抑制剂” 或 “HDI” 是抑制 HER 同二聚体或 HER 异二聚体形成的试剂。 优选地， HER 二聚化抑制剂是抗体。然而， HER 二聚化抑制剂也包括肽和非肽小分子， 和抑制 HER 同二聚体或异二聚体形成的其它化学实体。
     “抑制 HER 二聚化” 的抗体是这样的抗体， 其抑制或干扰 HER 二聚体的形成， 而不论 其根本机制。在一个实施方案中， 此类抗体在 HER2 的异二聚化结合位点结合 HER2。二聚 化抑制抗体的一个特别实例是培妥珠单抗 (Pmab) 或 MAb 2C4。HER 二聚化抑制剂的其它实 例包括结合 EGFR 并抑制其与一个或多个其它 HER 受体二聚化的抗体 ( 例如 EGFR 单克隆抗 体 806， MAb 806， 其结合活化的或 “未束缚的” EGFR， 参见 Johns 等， J.Biol.Chem.( 生物化 学杂志 )279(29) ： 30375-30384(2004)) ； 结合 HER3 并抑制其与一个或多个其它 HER 受体二 聚化的抗体 ； 结合 HER4 并抑制其与一个或多个其它 HER 受体二聚化的抗体 ； 肽二聚化抑制 剂 ( 美国专利 6,417,168) ； 反义二聚化抑制剂等。
     用于本文中时， “EGFR 拮抗剂” 或 “EGFR 抑制剂” 是指特异性结合 EGFR 并阻止或 降低其信号传导活性， 并且不特异性结合 HER2， HER3， 或 HER4 的那些化合物。这类试剂的 实例包括结合 EGFR 的抗体和小分子。结合 EGFR 的抗体的实例包括 MAb 579(ATCC CRL HB 8506)， MAb 455(ATCC CRL HB8507)， MAb 225(ATCC CRL 8508)， MAb 528(ATCC CRL 8509) ( 参见， 美国专利 4,943,533， Mendelsohn 等 ) 及其变体， 如嵌合化 225(C225 或西妥昔单 抗 (Cetuximab) ； ) 和改型的人 225(H225)( 参见， WO 96/40210， Imclone Systems Inc.) ； IMC-11F8， 一种全长人的 EGFR 靶向抗体 (Imclone) ； 结合 II 型 突变体 EGFR 的抗体 ( 美国专利 5,212,290) ； 结合 EGFR 的人源化和嵌合抗体， 如美国专 利 5,891,996 中所描述的 ； 及结合 EGFR 的人抗体， 如 ABX-EGF 或帕尼单抗 (Panitumumab) ( 参 见 WO98/50433， Abgenix/Amgen) ； EMD 55900(Stragliotto 等 Eur.J.Cancer( 欧 洲 癌 症 杂 志 )32A ： 636-640(1996)) ； EMD7200( 马 妥 珠 单 抗 (matuzumab))， 一 种 针 对 EGFR 的人源化 EGFR 抗体， 其与 EGF 和 TGF-α 二者竞争 EGFR 结合 ； (EMD/Merck) ； 人 EGFR 抗体， HuMax-EGFR(GenMab) ； 已知为 E1.1， E2.4， E2.5， E6.2， E6.4， E2.11， E6.3 和 E7.6.3 并且 在 US 6,235,883 中描述的完整人抗体 ； MDX-447(Medarex Inc) ； 和 mAb 806 或人源化 mAb 806(Johns 等， 生 物 化 学 杂 志 (J.Biol.Chem.)279(29) ： 30375-30384(2004))。 抗 -EGFR 抗体可缀合细胞毒性剂， 从而产生免疫缀合物 ( 参见， 例如 EP659,439A2， Merck Patent GmbH)。EGFR 拮抗剂包括小分子， 诸如在下述各项中描述的化合物 ： 美国专利 5,616,582， 5,457,105 ， 5,475,001 ， 5,654,307 ， 5,679,683 ， 6,084,095 ， 6,265,410 ， 6,455,534 ， 6,521,620 ， 6,596,726 ， 6,713,484 ， 5,770,599 ， 6,140,332 ， 5,866,572 ， 6,399,602 ， 6,344,459， 6,602,863， 6,391,874， 6,344,455， 5,760,041， 6,002,008， 和 5,747,498， 以 及下述 PCT 公布 ： WO98/14451， WO98/50038， WO99/09016， 和 WO99/24037。具体的小分子 EGFR 拮抗剂包括 OSI-774(CP-358774， 厄洛替尼 (erlotinib)， Genentech/OSI 制 药 公 司 (OSI Pharmaceuticals)) ； PD 183805(CI 1033， 2- 丙 烯 酰 胺， N-[4-[(3- 氯 -4- 氟 苯 基 ) 氨 基 ]-7-[3-(4- 吗 啉 基 ) 丙 氧 基 ]-6- 喹 唑 啉 基 ]-， 二 盐酸盐， 辉瑞公司 (Pfizer Inc.)) ； ZD1839， 吉非替尼 (gefitinib) 易瑞沙 4-(3’ - 氯 -4’ - 氟 苯 胺 基 )-7- 甲 氧 基 -6-(3- 吗 啉 代 丙 氧 基 ) 喹 唑 啉， 阿斯利康 (AstraZeneca)) ； ZM105180((6- 氨 基 -4-(3- 甲 基 苯 基 - 氨 基 )- 喹 唑 啉， Zeneca) ； BIBX-1382(N8-(3- 氯 -4- 氟 - 苯基 )-N2-(1- 甲基 - 哌啶 -4- 基 )- 嘧啶并 [5， 4-d] 嘧啶 -2， 8- 二胺， Boehringer Ingelheim) ； PKI-166((R)-4-[4-[(1- 苯基乙基 ) 氨基 ]-1H- 吡咯并 [2， 3-d] 嘧啶 -6- 基 ]- 苯酚 ) ； (R)-6-(4- 羟基苯基 )-4-[(1- 苯基乙基 ) 氨基 ]-7H- 吡 咯并 [2， 3-d] 嘧啶 ) ； CL-387785(N-[4-[(3- 溴苯基 ) 氨基 ]-6- 喹唑啉基 ]-2- 丁炔酰胺 (butynamide)) ； EKB-569(N-[4-[(3- 氯 -4- 氟 苯 基 ) 氨 基 ]-3- 氰 基 -7- 乙 氧 基 -6- 喹 啉 基 ]-4-( 二 甲 基 氨 基 )-2- 丁 烯 酰 胺 )(Wyeth) ； AG1478(Sugen) ； 和 AG1571(SU 5271 ； Sugen).
     “HER 抗体” 是结合 HER 受体的抗体。任选地， HER 抗体还干扰 HER 活化或功能。 具体的 HER2 抗体包括培妥珠单抗和曲妥珠单抗。具体 EGFR 抗体的实例包括西妥昔单抗 (cetuximab) 和帕尼单抗 (panitumumab)。
     涉及 HER 抗体的专利公开包括 ： US 5,677,171， US 5,720,937， US 5,720,954， US 5,725,856， US 5,770,195， US 5,772,997， US 6,165,464， US 6,387,371， US 6,399,063， US2002/0192211A1 ， US 6,015,567 ， US 6,333,169 ， US 4,968,603 ， US 5,821,337 ， US 6,054,297， US 6,407,213， US 6,719,971， US 6,800,738， US2004/0236078A1， US 5,648,237， US 6,267,958， US 6,685,940， US 6,821,515， WO98/17797， US 6,333,398， US 6,797,814， US 6,339,142， US 6,417,335， US 6,489,447， WO99/31140， US2003/0147884A1， US2003/0170234A1 ，US2005/0002928A1 ，US 6,573,043 ，US2003/0152987A1 ， WO99/48527 ， US2002/0141993A1 ， WO01/00245 ， US2003/0086924 ， US2004/0013667A1 ， WO00/69460， WO01/00238， WO01/15730， US 6,627,196B1， US 6,632,979B1， WO01/00244， US2002/0090662A1 ， WO01/89566 ， US2002/0064785 ， US2003/0134344 ， WO 04/24866 ， US2004/0082047， US2003/0175845A1， WO03/087131， US2003/0228663， WO2004/008099A2， US2004/0106161， WO2004/048525， US2004/0258685A1， US 5,985,553， US 5,747,261， US 4,935,341， US 5,401,638,US 5,604,107， WO 87/07646， WO 89/10412， WO 91/05264，EP 412,116 B1， EP 494,135 B1， US 5,824,311， EP 444,181 B1， EP 1,006,194 A2， US 2002/0155527A1， WO 91/02062， US 5,571,894， US 5,939,531， EP 502,812 B1， WO 93/03741 ， EP 554,441 B1 ， EP 656,367 A1 ， US 5,288,477 ， US 5,514,554 ， US 5,587,458， WO 93/12220， WO 93/16185， US 5,877,305， WO 93/21319， WO 93/21232， US 5,856,089， WO 94/22478， US 5,910,486， US 6,028,059， WO 96/07321， US 5,804,396， US 5,846,749， EP 711,565， WO 96/16673， US 5,783,404， US 5,977,322， US 6,512,097， WO 97/00271， US 6,270,765， US 6,395,272， US 5,837,243， WO 96/40789， US 5,783,186， US 6,458,356， WO 97/20858， WO 97/38731， US 6,214,388， US 5,925,519， WO 98/02463， US 5,922,845， WO 98/18489， WO 98/33914， US 5,994,071， WO 98/45479， US 6,358,682 B1， US 2003/0059790， WO 99/55367， WO 01/20033， US 2002/0076695A1， WO 00/78347， WO 01/09187， WO01/21192， WO01/32155， WO01/53354， WO01/56604， WO 01/76630， WO02/05791， WO 02/11677， US 6,582,919， US2002/0192652A1， US 2003/0211530A1， WO 02/44413， US 2002/0142328， US 6,602,670 B2， WO 02/45653， WO 02/055106， US 2003/0152572， US 2003/0165840 ，WO02/087619 ，WO03/006509 ，WO03/012072 ，WO 03/028638 ，US 2003/0068318， WO 03/041736， EP1,357,132， US 2003/0202973， US 2004/0138160， US 5,705,157， US 6,123,939， EP 616,812 B1， US 2003/0103973， US 2003/0108545， US 6,403,630 B1， WO 00/61145， WO 00/61185， US 6,333,348B1， WO 01/05425， WO 01/64246， US 2003/0022918， US 2002/0051785A1， US 6,767,541， WO 01/76586， US 2003/0144252， WO 01/87336 ， US 2002/0031515A1 ， WO 01/87334 ， WO 02/05791 ， WO 02/09754 ， US 2003/0157097， US 2002/0076408， WO 02/055106， WO 02/070008， WO 02/089842 和 WO 03/86467。
     “HER 活化” 是指任一种或多种 HER 受体的活化或磷酸化。一般而言， HER 活化导 致信号转导 ( 例如由 HER 受体胞内激酶结构域磷酸化 HER 受体或底物多肽中的酪氨酸残基 所导致 )。HER 活化可由 HER 配体结合包含目的 HER 受体的 HER 二聚体介导。结合 HER 二 聚体的 HER 配体可活化二聚体中一种或多种 HER 受体的激酶结构域， 从而导致一种或多种 HER 受体中酪氨酸残基的磷酸化和 / 或另外的底物多肽 ( 诸如 Akt 或 MAPK 胞内激酶 ) 中酪 氨酸残基的磷酸化。
     “磷酸化” 是指向蛋白质 ( 诸如 HER 受体或其底物 ) 添加一个或多个磷酸基。
     HER2 上的 “异二聚化结合位点” 是指 HER2 的胞外结构域中的区， 其在与 EGFR， HER3 或 HER4 形成二聚体时接触 EGFR， HER3 或 HER4 的胞外结构域中的区或与其相互作用。发现 所述区在 HER2 的结构域 II 中。Franklin 等， Cancer Cell( 癌细胞 )5 ： 317-328(2004)。
     “结合 HER2 的异二聚化结合位点” 的 HER2 抗体与结构域 II 中的残基结合 ( 并且 任选地也结合 HER2 胞外结构域的其它结构域如结构域 I 和 III 中的残基 )， 能够至少在一 定程度上在空间上阻碍 HER2-EGFR， HER2-HER3， 或 HER2-HER4 异二聚体的形成。Franklin 等， Cancer Cell( 癌细胞 )5 ： 317-328(2004) 表征了 HER2- 培妥珠单抗晶体结构， 其存放在 RCSB 蛋白质数据库 (RCSB Protein Data Bank)(ID 编号 IS78) 中， 描述了结合 HER2 的异二 聚化结合位点的示例性抗体。
     “结合 HER2 的结构域 II” 的抗体结合结构域 II 中的残基， 并且任选地结合 HER2 的其它结构域如结构域 I 和 III 中的残基。在用于描述本文中所公开的各种抗体时， “分离的” 指已经鉴定且从其表达所在的 细胞或细胞培养物中分开和 / 或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指通常会干扰该多 肽的诊断或治疗用途的物质， 可包括酶、 激素、 和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。 在优选的实施方案中， 将该抗体纯化至 (1) 足以通过使用转杯式测序仪获得至少 15 个残基 的 N- 末端或内部氨基酸序列的程度， 或 (2) 根据使用考马斯蓝 ( 或优选银染 ) 非还原性或 还原性条件下的 SDS-PAGE 达到同质。由于多肽天然环境的至少一种成分不会存在， 因此分 离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而， 分离的多肽通常通过至少一个纯化步骤来制 备。在一些实施方案中， 多特异性抗 HER 抗体是分离的抗体。
     术语 “控制序列” 指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的 DNA 序列。例如， 适于原核生物的控制序列包括启动子、 任选的操纵基因序列、 和核糖体结合位 点。已知真核细胞能利用启动子、 多腺苷酸化信号、 和增强子。
     若核酸与另一核酸序列处于功能性关系中， 则该核酸是 “可操作连接” 的。例如， 若前序列或分泌前导序列的 DNA 表达成参与多肽分泌的前蛋白， 则它与该多肽的 DNA 可操 作连接 ； 若启动子或增强子影响编码序列的转录， 则它与该序列可操作连接 ； 或者， 若核糖 体结合位点的位置促进翻译， 则它与编码序列可操作连接。通常， “可操作连接″指相连的 DNA 序列是邻接的， 而且在分泌前导序列的情况中指邻接且处于阅读框中。然而， 增强子不 必邻接。连接可通过在方便的限制性位点处的连接反应来实现。如果没有此类位点， 那么 可依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
     关于参照多肽序列的 “百分比 (％ ) 氨基酸序列同一性” ， 定义为将候选序列与参 照多肽序列在进行序列比对 ( 并在必要时导入空隙 ) 以获取最大百分比序列同一性， 且不 将任何保守置换视为序列同一性的部分之后， 候选序列中的氨基酸残基与参照多肽序列中 的氨基酸残基相同的百分数。可使用本领域技术内的各种方法进行序列比对以便测定氨 基酸序列同一性百分比， 例如， 使用公众可得到的计算机软件如 BLAST、 BLAST-2、 ALIGN 或 Megalign(DNASTAR) 软件。 本领域技术人员可以决定比对序列的适宜参数， 包括对所比较的 序列全长获得最大比对所需的任何算法。 然而， 为此目的， 氨基酸序列同一性％值使用序列 比较计算机程序 ALIGN-2 产生。ALIGN-2 序列比对计算机程序的作者是 Genentech， Inc.， 该源代码已经随用户文档提交至美国版权局 (Washington D.C.， 20559)， 其美国版权注册 登记号为 TXU510087。公众可通过 Genentech， Inc.(South San Francisco， 加利福尼亚 ) 得到 ALIGN-2 程序， 或者可以从该源代码进行编译。 ALIGN-2 程序应当为在 UNIX 操作系统， 包括在数字 UNIXV4.0D 上使用而进行编译。ALIGN-2 程序设定了所有序列比对参数并且不 变。
     在 ALIGN-2 应用于氨基酸序列比较的情况中， 给定氨基酸序列 A 相对于 (to)、 与 (with)、 或针对 (against) 给定氨基酸序列 B 的氨基酸序列同一性％ ( 或者这样说 ： 给定氨 基酸序列 A 具有或含有相对于、 与或针对给定氨基酸序列 B 的某一％氨基酸序列同一性 ) 如下计算 ：
     X/Y 比值乘以 100，
     其中 X 是用序列比对程序 ALIGN-2 在该程序的 A 和 B 比对中评分为相同匹配的氨 基酸残基数， 且其中 Y 是 B 中的氨基酸残基总数。可以理解， 当氨基酸序列 A 与氨基酸序列 B 的长度不相等时， A 相对于 B 的氨基酸序列同一性％将不等于 B 相对于 A 的氨基酸序列同一性％。除非另外特别指出， 如在紧前面的段落中所述， 使用 ALIGN-2 计算机程序获得在本 文中所用的所有的％氨基酸序列同一性的值。
     杂交反应的 “严格性” 可以容易地由本领域普通技术人员确定， 而且通常凭经验根 据探针长度、 洗涤温度、 和盐浓度来计算。 通常， 较长的探针要求较高的温度以正确退火， 而 较短的探针需要较低的温度。 杂交通常依赖于互补链存在于低于其解链温度的环境中时变 性 DNA 重新退火的能力。探针和可杂交序列之间所期望的同源性程度越高， 可使用的相对 温度也越高。 因此可以认为， 较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格， 而较低温度也就 较不严格。关于杂交反应严格性的其它细节和解释， 参见 Ausubel 等， Current Protocols in Molecular Biology ( 现代分子生物学实验方案 )， Wiley Interscience Publishers， (1995)。
     本文中所定义的 “严格条件”或 “高严格性条件”可如下确定 ： (1) 采用低离子 强度和高温进行洗涤， 例如 0.015M 氯化钠 /0.0015M 柠檬酸钠 /0.1 ％十二烷基硫酸钠， 50℃ ； (2) 在杂交过程中采用变性剂， 诸如甲酰胺， 例如 50％ (v/v) 甲酰胺及 0.1％牛血清 白蛋白 /0.1％ Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮 /50mM 磷酸钠缓冲液 pH 6.5， 其含 750mM 氯 化钠、 75mM 柠檬酸钠， 42℃ ； 或 (3) 在采用 50％甲酰胺、 5XSSC(0.75M NaCl， 0.075M 柠檬酸 钠 )、 50mM 磷酸钠 (pH 6.8)、 0.1 ％焦磷酸钠、 5X Denhardt 氏溶液、 超声波处理的鲑鱼精 DNA(50μg/ml)、 0.1 ％ SDS、 和 10 ％硫酸右旋糖苷的溶液中于 42 ℃杂交过夜， 并在 42 ℃于 0.2XSSC( 氯化钠 / 柠檬酸钠 ) 中洗涤 10 分钟， 接着在含 EDTA 的 0.1XSSC 中于 55℃进行 10 分钟高严格性洗涤。 “中等严格条件″可以如 Sambrook 等， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual ( 分子克隆 ： 实验室指南 )， New York ： Cold Spring Harbor Press， 1989 所述来鉴定， 包括 使用比上文所述较不严格的洗涤溶液和杂交条件 ( 例如温度、 离子强度和％ SDS)。中等严 格条件的一个例子是于 37℃在含 20％甲酰胺、 5XSSC(150mM NaCl， 15mM 柠檬酸三钠 )、 50mM 磷酸钠 (pH 7.6)、 5X Denhardt 氏溶液、 10％硫酸右旋糖苷、 和 20mg/ml 变性剪切的鲑鱼精 DNA 的溶液中温育过夜， 接着在 1XSSC 中于约 37-50℃洗涤滤膜。技术人员将认识到如何根 据需要来调整温度、 离子强度等以适应诸如探针长度等因素。
     抗体 “效应子功能” 指那些可归于抗体 Fc 区 ( 天然序列 Fc 区或氨基酸序列变体 Fc 区 ) 的生物学活性， 且其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的例子包括 ： C1q 结合 和补体依赖性细胞毒性 ； Fc 受体结合 ； 抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC) ； 吞噬作用 ； 细胞表面受体 ( 例如 B 细胞受体 ) 的下调 ； 和 B 细胞活化。
     “抗体依赖性细胞介导的细胞毒性” 或 “ADCC” 指如下细胞毒性形式， 其中某些细胞 毒性细胞 ( 例如天然杀伤 (NK) 细胞、 嗜中性粒细胞和巨噬细胞 ) 上存在的 Fc 受体 (FcRs) 所结合的分泌型 Ig 使这些细胞毒性效应细胞特异性结合携带抗原的靶细胞， 随后用细胞 毒素杀死该靶细胞。所述抗体 “武装” 细胞毒性细胞， 而且绝对是这类杀伤所必需的。介 导 ADCC 的 主 要 细 胞 (NK 细 胞 ) 只 表 达 FcγRIII， 而 单 核 细 胞 表 达 FcγRI、 FcγRII 和 FcγRIII。Ravetch 和 Kinet， Annu.Rev.Immunol.( 免疫学年度评论 )9 ： 457-92(1991) 的 464 页表 3 总结了造血细胞上的 FcR 表达。 为了评估目的分子的 ADCC 活性， 可进行体外 ADCC 测定法， 诸如美国专利 5,500,362 或 5,821,337 中所记载的。可用于此类测定法的效应细 胞包括外周血单核细胞 (PBMC) 和天然杀伤 (NK) 细胞。备选地或额外地， 可在体内评估目
     的分子的 ADCC 活性， 例如在动物模型中， 诸如 Clynes 等 (Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.( 美 国科学院学报 ))95 ： 652-656(1998) 所披露的。
     “Fc 受体” 或 “FcR” 描述与抗体 Fc 区结合的受体。优选的 FcR 是天然序列的人 FcR。此外， 优选的 FcR 是与 IgG 抗体结合的 FcR(γ 受体 )， 而且其包括 FcγRI， FcγRII 和 FcγRIII 亚类的受体， 包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII 受体包括 FcγRIIA(“活化受体” ) 和 FcγRIIB(“抑制受体” )， 它们具有相似的氨基酸序列， 区别 主要在于其胞质结构域。活化受体 FcγRIIA 在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨 酸的活化基序 (ITAM)。抑制受体 FcγRIIB 在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸 的抑制基序 (ITIM)( 参见综述 M.in Annu.Rev.Immunol.( 免疫学年度评论 )15 ： 203-234(1997))。FcR 的综述参见 Ravetch 和 Kinet， Annu.Rev.Immunol.( 免疫学年度评 论 )9 ： 457-492(1991) ； Capel 等， Immunomethods( 免疫方法 )4 ： 25-34(1994) ； 和 de Haas 等， J.Lab.Clin.Med.( 实验室临床医学杂志 )126 ： 330-41(1995)。术语 “FcR” 在本文中涵 盖其它 FcR， 包括未来将会鉴定的 FcR。该术语还包括新生儿受体 (FcRn)， 它负责将母体的 IgG 转移给胎儿 (Guyer 等， J.Immunol.( 免疫学杂志 )117 ： 587(1976) 和 Kim 等， J.Immunol. ( 免疫学杂志 )24 ： 249(1994))。
     “人效应细胞” 指表达一种或多种 FcR 并执行效应子功能的白细胞。优选的是， 该 细胞至少表达 FcγRIII 并执行 ADCC 效应子功能。介导 ADCC 的人白细胞的例子包括外周 血单核细胞 (PBMc)、 天然杀伤 (NK) 细胞、 单核细胞、 细胞毒性 T 细胞和嗜中性粒细胞 ； 其中 优选 PBMC 和 NK 细胞。效应细胞可以从天然来源， 例如从血液分离。
     “补体依赖性细胞毒性” 或 “CDC”指存在补体时靶细胞的溶解作用。经典补体 途径的激活是由补体系统第一组分 (C1q) 结合与其同族抗原结合的 ( 适当子类的 ) 抗体 起始的。为了评估补体激活， 可进行 CDC 测定法， 例如 Gazzano-Santoro 等， J.Immunol. Methods( 免疫学方法杂志 )202 ： 163(1996) 所记载的。
     用于本文时， “治疗 (treatment)” ( 及其语法变体， 诸如 “treat” 或 “treating” ) 指在尝试改变待治疗的个体的天然进程中的临床介入， 并且可以为了预防或在临床病理学 的进程中进行。 治疗的理想效果包括但不限于防止疾病发生或复发， 缓和症状， 消除疾病的 任何直接或间接病理学后果， 预防转移， 减少疾病进展速率， 改善或减轻疾病状态和症状缓 解或改善的预后。在一些实施方案中， 本发明的抗体用于延迟疾病的发生或延缓疾病的进 展。 术语 “治疗有效量” 指治疗受试者中疾病或病症的抗体或抗体片段的量。对于肿 瘤 ( 例如癌性肿瘤 )， 抗体或抗体片段的治疗有效量可减少癌细胞数量 ； 减小原发性肿瘤大 小； 抑制 ( 即减慢到一定程度并优选停止 ) 癌细胞浸润到周围器官中 ； 抑制 ( 即减慢到一定 程度并优选停止 ) 肿瘤转移 ； 在一定程度抑制肿瘤生长 ； 和 / 或在一定程度上缓解一或多 种与病症相关的症状。抗体或抗体片段在达到可以预防现存癌细胞生长和 / 或杀死现存癌 细胞的程度时， 其可为细胞生长抑制性和 / 或细胞毒性的。对于癌症治疗， 体内效力可以通 过， 例如评价存活期、 疾病进展时间 (TTP)、 应答率 (RR)、 应答期、 和 / 或生活质量来测量。
     “减小或抑制” 的意思是导致优选地 20％或更高、 更优选地 50％或更高、 并且最优 选地 75％、 85％、 90％、 95％、 或更高的总体降低。减小或抑制可以涉及在治疗的病症的症 状、 转移灶的存在或大小、 原发性肿瘤的大小、 或血管源性病症中血管的大小或数目。
     术语 “癌症” 和 “癌性” 是指或者描述哺乳动物中一般特征在于细胞生长不受调控 的生理学状态。这种定义包含良性和恶性癌症。 “癌症早期” 的意思是无侵袭性或转移性的 癌症， 或分类为 0、 I、 或 II 期的癌症。
     术语 “癌前” 是指一般在癌症之前或发展成癌症的状态或生长。
     “非转移性” 是指癌症是良性的， 或保持在原发位点并且未侵入淋巴或血管系统或 原发位点以外的其它组织。一般而言， 非转移性癌症是 0、 I、 或 II 期癌症中的任何癌症， 并 且有时是 III 期癌症。
     “药用载体” 是指药物制剂中不同于活性成分的成分， 其对受试者是无毒的。药用 载体包括但不限于缓冲剂、 赋形剂、 稳定剂或防腐剂。
     术语 “抗癌治疗” 是指有效用于治疗癌症的治疗。抗癌治疗剂的实例包括， 但不限 于， 例如， 化疗剂、 生长抑制剂、 细胞毒性剂、 放射性治疗中所用的试剂、 抗血管发生剂、 细胞 凋亡剂、 抗微管蛋白剂和其它治疗癌症的试剂， 抗 -CD20 抗体， 血小板来源的生长因子抑制 TM 剂 ( 例如， Gleevec ( 甲磺酸伊马替尼 (Imatinib Mesylate)))， COX-2 抑制剂 ( 例如， 塞来 考昔 (celecoxib))， 干扰素， 细胞因子， 结合下述一种或多种靶标的拮抗剂 ( 例如， 中和抗 体)： EGFR， ErbB2， ErbB3， ErbB4， PDGFR-beta， BlyS， APRIL， BCMA 或 VEGF 受体， TRAIL/Apo2， 和其它生物活性和有机化学剂等。它们的组合也包含在本发明中。
     “化 疗 剂”是 有 效 用 于 治 疗 癌 症 的 化 合 物。 化 疗 剂 的 实 例 包 括 烷 基 化 试 剂，如 塞 替 哌 (thiotepa) 和 环 磷 酰 胺 (cyclosphosphamide) 烷 基 磺 酸 酯 (alkyl sulfonates) 如 白 消 安 (busulfan)， 英 丙 舒 凡 (improsulfan) 和 哌 泊 舒 凡 (piposulfan) ； 吖 丙 啶 类 (aziridines) 如 苯 佐 替 派 (benzodopa)、 卡波 醌 (carboquone)、美 妥 替 哌 (meturedopa) 和 乌 瑞 替 哌 (uredopa) ； 乙撑亚胺类 (ethylenimines) 和甲基蜜胺类 (methylamelamines)， 包括六甲蜜胺 (altretamine)、 曲 他 胺 (triethylenemelamine)、 三 亚 乙 基 磷 酰 胺 (triethylenephosphoramide)、 三乙烯 硫 代 磷 酸 胺 (triethylenethiophosphoramide) 和 三 羟 甲 蜜 胺 (trimethylomelamine) ； 聚 乙 酸 类 (acetogenins)( 特 别 是 布 拉 他 辛 (bullatacin) 和 布 拉 他 辛 酮 (bullatacinone)) ； Δ-9- 四 氢 大 麻 酚 (delta-9-tetrahydrocannabinol)( 屈 大 麻 酚 (dronabinol)、 )； β- 拉 帕 醌 (beta-lapachone) ； 拉 帕 醇 (lapachol) ； 秋 水 仙 碱 (colchicines) ； 桦 木 酸 (betulinic acid) ； 喜 树 碱 (camptothecin)( 包 括 合 成 的 类 似 物 托 泊 替 康 (topotecan) (irinotecan) CPT-11( 伊 立 替 康 乙 酰 喜 树 碱 (acetylcamptothecin)、 scopolectin和 9- 氨 基 喜 树 碱 (9-aminocamptothecin)) ； 苔 藓 抑 素 (bryostatin) ； callystatin ； CC-1065( 包括其阿多来新 (adozelesin)、 卡折来新 (carzelesin) 和比折来新 (bizelesin) 合成类似物 )； 鬼 臼 毒 素 (podophyllotoxin) ； 鬼 臼 酸 (podophyllinic acid) ； 替尼 泊 苷 (teniposide) ； 隐 藻 素 类 (cryptophycins)( 特 别 是 隐 藻 素 1 和 隐 藻 素 8) ； 多 拉 司 他 汀 (dolastatin) ； 倍 癌 霉 素 (duocarmycin)( 包 括 合 成 的 类 似 物、 KW-2189 和 CB1-TM1) ； 艾 榴 素 (eleutherobin) ； pancratistatin ； 匍 枝 珊 瑚 醇 (sarcodictyin) ； 海 绵 素 (spongistatin) ； 氮 芥 (nitrogen mustards) 如 苯 丁 酸 氮 芥 (chlorambucil)、 萘 氮 芥 (chlornaphazine)、 胆 磷 酰 胺 (chlorophosphamide)、 雌 莫 司 汀 (estramustine)、 异 环 磷 酰 胺 (ifosfamide)、 氮 芥 (mechlorethamine)、 盐 酸 氧 氮 芥 (mechlorethamineoxide hydrochloride)、美 法 仑 (melphalan)、新 氮 芥 (novembichin)、苯 芥 胆 甾 醇 (phenesterine)、 泼 尼 莫 司 汀 (prednimustine)、 曲 磷 胺 (trofosfamide)、 尿嘧啶氮 芥 (uracil mustard) ； 亚 硝 基 脲 类 (nitrosoureas) 如 卡 莫 司 汀 (carmustine)、氯 脲 菌 素 (chlorozotocin)、 福 莫 司 汀 (fotemustine)、 洛 莫 司 汀 (lomustine)、 尼莫司 汀 (nimustine) 和 雷 莫 司 汀 (ranimnustine) ； 抗 生 素 如 烯 二 炔 类 (enediyne) 抗 生 素 ( 例 如 加 利 车 霉 素 (calicheamicin)， 尤 其 是 加 利 车 霉 素 γ1I 和 加 利 车 霉 素 ωIl( 参 见 例 如 Nicolaou 等， Angew， Chem.Intl.Ed.Engl.33 ： 183-186(1994)) ； CDP323( 一 种 口 服 α-4 整 合 素 抑 制 剂 ) ； 烯 二 炔 蒽 环 类 抗 生 素 (dynemicin)， 包括烯二炔蒽环 类抗生素 A； 埃 斯 波 霉 素 (esperamicin) ； 以 及 新 制 癌 菌 素 (neocarzinostatin) 生 色 团 和 相 关 色 素 蛋 白 烯 二 炔 类 抗 生 素 生 色 团 )、 阿 克 拉 霉 素 (aclacinomysins)、 放 线 菌 素 (actinomycin)、 蒽 霉 素 (authramycin)、 偶 氮 丝 氨 酸 (azaserine)、 博来霉素 (bleomycins)、放 线 菌 素 C(cactinomycin)、 carabicin、洋 红 霉 素 (carminomycin)、 嗜 癌 霉 素 (carzinophilin)、 色 霉 素 (chromomycins)、 放 线 菌 素 D(dactinomycin)、 柔 红 霉 素 (daunorubicin)、 地 托 比 星 (detorubicin)、 6- 重 氮 -5- 氧 代 -L- 正 亮 氨 酸 (6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、 多 柔 比 星 (doxorubicin)( 包 括 吗 啉 代 - 多 柔 比 星 (morpholino-doxorubicin)、氰 基 吗 啉 代 - 多 柔 比 星 (cyanomorpholino-doxorubicin)、 2- 吡 咯 啉 - 多 柔 比 星 (2-pyrrolino-doxorubicin)、 盐酸多柔比星脂质体注射剂 聚乙二醇化脂质体多柔比星 脂 质 体 多 柔 比 星 TLC D-99 和 脱 氧 多 柔 比 星 (deoxydoxorubicin))、 表柔 比 星 (epirubicin)、 依 索 比 星 (esorubicin)、 伊 达 比 星 (idarubicin)、 马塞罗霉素 (marcellomycin)、 丝 裂 霉 素 类 (mitomycins) 如 丝 裂 霉 素 C、 麦 考 酚 酸 (mycophenolic acid)、 诺 拉 霉 素 (nogalamycin)、 橄 榄 霉 素 (olivomycins)、 培 洛 霉 素 (peplomycin)、 紫 菜 霉 素 (porfiromycin)、 嘌 呤 霉 素 (puromycin)、 三 铁 阿 霉 素 (quelamycin)、 罗多比 星 (rodorubicin)、 链 黑 霉 素 (streptonigrin)、 链 佐 星 (streptozocin)、 杀结核菌素 (tubercidin)、 乌 苯 美 司 (ubenimex)、 净 司 他 丁 (zinostatin)、 佐 柔 比 星 (zorubicin) ； 抗 代 谢 物 如 甲 氨 喋 呤 (methotrexate)、 吉 西 他 滨 (gemcitabine) 氟 (tegafur) 卡 培 他 滨 (capecitabine) 替加 epothilone和 5- 氟 尿 嘧 啶 (5-fluorouracil)(5-FU) ； 叶 酸 类 似 物 如 二 甲 叶 酸 (denopterin)、 甲 氨 喋 呤、 喋 罗 呤 (pteropterin)、 三 甲 曲 沙 (trimetrexate) ； 嘌呤类似物如氟达拉 滨 (fludarabine)、 6- 巯 嘌 呤 (6-mercaptopurine)、 硫 咪 嘌 呤 (thiamiprine)、 硫鸟嘌 呤 (thioguanine) ； 嘧 啶 类 似 物 如 安 西 他 滨 (ancitabine)、 阿 扎 胞 苷 (azacitidine)、 6- 氮 尿 苷 (6-azauridine)、卡 莫 氟 (carmofur)、阿 糖 胞 苷 (cytarabine)、双 脱 氧 尿 苷 (dideoxyuridine)、去 氧 氟 尿 苷 (doxifluridine)、依 诺 他 滨 (enocitabine)、 氟 尿 苷 (floxuridine) ； 雄 激 素 类， 诸 如 卡 鲁 睾 酮 (calusterone)、 丙酸屈他雄酮 (dromostanolone propionate)、 环 硫 雄 醇 (epitiostanol)、 美 雄 烷 (mepitiostane)、 睾 内酯 (testolactone) ； 抗肾上腺药 (anti-adrenals) 如氨鲁米特 (aminoglutethimide)、 米 托 坦 (mitotane)、 曲 洛 司 坦 (trilostane) ； 叶 酸 补 偿 剂 如 亚 叶 酸 (frolinic acid) ； 醋 葡 醛 内 酯 (aceglatone) ； 羟 醛 磷 酰 胺 配 糖 (aldophosphamide glycoside) ； 5- 氨 基 酮 戊 酸 (aminolevulinic acid) ； 恩 尿 嘧 啶 (eniluracil) ； 安 吖 啶 (amsacrine) ；bestrabucil ； 比 生 群 (bisantrene) ； 依 达 曲 沙 (edatraxate) ； defofamine ； 秋水仙 胺 (demecolcine) ；地 吖 醌 (diaziquone) ； elfornithine ；依 利 醋 铵 (elliptinium acetate ； 埃坡霉素 (epothilone) ； 依托格鲁 (etoglucid) ； 硝酸镓 (gallium nitrate) ； 羟 基 脲 (hydroxyurea) ； 香 菇 多 糖 (lentinan) ； 氯 尼 达 明 (lonidainine) ； 美登木素生 物 碱 类 (maytansinoids) 如 美 登 素 (maytansine) 和 安 丝 菌 素 (ansamitocins) ； 米托 胍 腙 (mitoguazone) ； 米 托 蒽 醌 (mitoxantrone) ； 莫 哌 达 醇 (mopidanmol) ； 尼曲吖啶 (nitraerine) ； 喷司他丁 (pentostatin) ； 异丙嗪 (phenamet) ； 吡柔比星 (pirarubicin) ； 洛索蒽醌 (losoxantrone) ； 2- 乙基酰肼 (2-ethylhydrazide) ； 丙卡巴肼 (procarbazine) ； 多 糖 复 合 物 (JHS Natural Products(JHS 天 然 产 品 )， Eugene， OR) ； 雷佐生 (razoxane) ； 利索新 (rhizoxin) ； 西佐喃 (sizofiran) ； 锗螺胺 (spirogermanium) ； 细交 链孢菌酮酸 (tenuazonic acid) ； 三亚胺醌 (triaziquone) ； 2， 2’ ， 2’ - 三氯三乙胺 (2， 2’ ， 2” -trichlorotriethylamine) ； 单端孢霉烯族化合物 (trichothecenes)( 特别是 T-2 毒 素、 verracurin A、 杆孢菌素 A(roridin A) 和蛇形菌素 (anguidine)) ； 乌拉坦 (urethan) ； 长 春 地 辛 (vindesine) 达 卡 巴 嗪 (dacarbazine) ； 甘 露 莫 司 汀 (mannomustine) ； 二 溴 甘 露 醇 (mitobronitol) ； 二 溴 卫 矛 醇 (mitolactol) ； 哌 泊 溴 烷 (pipobroman) ； gacytosine ； 阿 糖 胞 苷 (arabinoside)(“Ara-C” )； 塞替哌 (thiotepa) ； 紫杉烷类化合物 (taxoid)， 例如紫杉醇 (paclitaxel) 的白蛋白改造的纳米颗粒制剂 (ABRAXANETM) 和多西他塞 (docetaxel) 苯丁酸氮芥 (chloranbucil) ； 6- 硫鸟嘌呤 (6-thioguanine) ； 巯嘌呤 (mercaptopurine) ； 甲 氨 喋 呤 ；铂 药 剂 如 顺 铂 (cisplatin)，奥 沙 利 铂 (oxaliplatin)( 例 如， 和 卡 铂 (carboplatin) ； 防 止 微 管 蛋 白 聚 合 形 成 微 管 的 vincas， 包括 长 春 碱 (vinblastine) vindesine 长 春 新 碱 (vincristine) 和长春瑞滨 (vinorelbine) 紫杉醇依托泊苷 (etoposide)(VP-16) ； 异环磷酰胺 (ifosfamide) ； 米托蒽醌 (mitoxantrone) ； leucovorin ； 诺 安 托 (novantrone) ； 依 达 曲 沙 (edatrexate) ； 道 诺 霉 素 (daunomycin) ； 氨 基 喋 呤 (aminopterin) ； 伊 班 膦 酸 盐 (ibandronate) ； 拓 扑 异 构 酶 抑 制 剂 RFS 2000 ； 二 氟 甲 基 鸟 氨 酸 (difluoromethylornithine)(DMFO) ； 类 视 黄 酸 类 (retinoids)， 诸如 视 黄 酸 (retinoic acid)， 包 括 贝 沙 罗 汀 (bexarotene) (bisphosphonates) 如 氯 膦 酸 盐 (clodronate)( 例 如， 替膦酸盐 (etidronate) 来 膦 酸 盐 (zoledronate) 帕米膦酸盐 (pamidronate) 或 二膦酸盐类 )、 依NE-58095、 唑来膦酸 (zoledronic acid)/ 唑 阿 仑 膦 酸 盐 (alendronate) 替鲁膦酸盐 (tiludronate) 或利塞膦酸盐 (risedronate) 曲沙他滨 (troxacitabine)(1， 3- 二氧戊环核 苷胞嘧啶类似物 ) ； 反义寡核苷酸， 特别是抑制在涉及异常细胞增殖的信号传导途径中基 因的表达的那些， 诸如例如， PKC-α、 Raf、 H-Ras 和表皮生长因子受体 (EGF-R) ； 疫苗诸如 疫苗和基因治疗疫苗、 例如， 疫苗、 疫苗和 如， 疫苗 ； 拓扑异构酶 1 抑制剂 ( 例如 rmRH ( 例 BAY439006( 索 拉 非 尼 (sorafenib) ； Bayer) ； SU-11248( 舒 尼 替 尼(sunitinib)， (bortezomib)Pfizer) ； 哌立福辛 (perifosine)， COX-2 抑制剂 ( 例如塞来 CCI-779 ； 替 匹 法 尼 (tipifarnib)(R11577) ； orafenib， 匹考昔 (celecoxib) 或艾托考昔 (etoricoxib))， 蛋白体抑制剂 ( 例如 PS341) ； 硼替佐米 ABT510 ； Bcl-2 抑 制 剂 诸 如 奥 利 美 生 钠 (oblimersensodium)蒽 醌 (pixantrone) ； EGFR 抑 制 剂 ( 参 见 下 文 定 义 ) ； 酪氨酸激酶抑制剂 ( 参见下文定 义)； 丝氨酸 - 苏氨酸激酶抑制剂诸如雷帕霉素 (rapamycin)( 西罗莫司 (sirolimus)， 法 尼 基 转 移 酶 抑 制 剂 诸 如 氯 那 法 尼 (lonafarnib)(SCH 6636， 和以上任一种的药用盐、 酸或衍生物 ； 以及以上两种以上的组合， 诸如 CHOP， SARASAR ) ； 即 环 磷 酰 胺、 多 柔 比 星、 长 春 新 碱、 和 泼 尼 松 龙 (prednisolone) 的 组 合 疗 法 的 缩 写 ； 和 FOLFOX， 即 关 于 与 5-FU 和 亚 叶 酸 (leucovorin) 组 合 的 奥 沙 利 铂 (oxaliplatin) (ELOXATINTM) 的治疗方案的缩写。
     本文定义的化疗剂包括 “抗激素剂”或 “内分泌治疗剂” ， 其作用为调节、 降低、 阻断或抑制可促进癌生长的激素效果。它们自身可以是激素。包括， 但不限于具有混合 的 激 动 剂 / 拮 抗 剂 模 式 的 抗 雌 激 素 类， 包 括 他 莫 昔 芬 (tamoxifen) 4- 羟基他莫西芬， 托瑞米芬 (toremifene) 洛 昔 芬 (droloxifene)， 雷 洛 昔 芬 (raloxifene) 激素类， 如氟维司群 (fulvestrant) 艾多昔芬 (idoxifene)， 屈 曲 沃 昔 芬 (trioxifene)， 和 EM800( 所述药剂可以阻断雌激素TMkeoxifene， 和选择性雌激素受体调控物类 (SERM) 如 SERM3， 不具有激动剂性质的纯的抗雌 受体 (ER) 二聚化， 抑制 DNA 结合， 增加 ER 更新和 / 或抑制 ER 水平 ) ； 芳香酶抑制剂包括类 固醇芳香酶抑制剂如福美坦 (formestane) 和益西美坦 (exemestane) 和 非 类 固 醇 芳 香 酶 抑 制 剂 如 阿 那 曲 唑 (anastrazole) (letrozole) 伏氯唑 (vorozole) 德 (leuprolide) 和 醋酸甲地孕酮 (megestrol acetate) 戈 舍 瑞 林 (goserelin)，布 舍 瑞 林 来曲唑 和氨鲁米特 (aminoglutethimide)， 和其它芳香酶抑制剂包括法 倔 唑 (fadrozole)， 和 4(5)- 咪 唑 ； 促 性 腺 激 素 释 放 激 素 激 动 剂， 包括亮丙立 (buserelin)， 和曲普瑞林 (tripterelin) ； 性类固醇， 包括黄体酮 (progestines) 如醋酸 甲 地 孕 酮 (megestrol acetate) 和 醋 酸 甲 羟 孕 酮 (medroxyprogesterone acetate)， 雌 激素如己烯雌酚 (diethylstilbestrol) 和普罗马林 (premarin)， 和雄激素 / 类视黄醇 如氟甲睾酮 (fluoxymesterone)， 所有的反式视黄酸 (transretionic acid) 和芬维 A 胺 (fenretinide) ； 奥 那 司 酮 (onapristone) ； 抗 黄 体 酮 (anti-progesterones) ； 雌激素受 体下调剂 (ERDs) ； 抗雄激素如氟他胺 (flutamide)， 尼鲁米特 (nilutamide) 和比卡鲁胺 (bicalutamide) ； 上述任一种的药用盐、 酸或衍生物， 以及上述两种以上的组合。
     “受试者” 是脊椎动物， 优选哺乳动物， 更优选为人。哺乳动物包括但不限于人、 非 人高等灵长类动物、 灵长类动物、 家畜 ( 如牛 )、 竞技动物、 宠物 ( 如猫、 狗和马 ) 和实验室动 物 ( 如小鼠和大鼠 )。
     II. 详细描述
     本发明提供抗体和功能性抗体片段， 其包含至少一个抗原结合结构域， 所述抗原 结合结构域对至少两种不同 HER 受体， 特别是 EGFR 和 HER2， EGFR 和 HER3， 或 EGFR 和 HER4具有结合特异性。这些多特异性抗体不同于传统多特异性抗体， 后者具有带有不同结合特 异性的抗原结合结构域 ( 通常两个 )。在某些实施方案中， 本文描述的多特异性抗体具有 IgG( 或 Fab) 的分子结构， 因此保留了 IgG 对于治疗开发有利的属性， 诸如可预测的药物代 谢动力学性质， 充分确立的制备方案， Fc 介导的效应子功能的选择， 和二价或单价。在通过 组装两个不同抗体片段成一个分子获得的传统多特异性抗体中， 这些有利属性常常是缺失 的。
     在本文中描述的多特异性抗体及其功能性抗体片段有效用于治疗与 HER 受体途 径相关的疾病或病症， 诸如癌症。 在一个具体的实施方案中， 多特异性抗体的抗原结合结构 域特异性结合 EGFR 和 HER3 两者。在另一个实施方案中， 抗原结合结构域特异性结合 EGFR 和 HER2 两者。在另一个实施方案中， 抗原结合结构域特异性结合 EGFR 和 HER4 两者。
     本发明的一个特别方面提供包含两个 ( 或多个 ) 抗原结合结构域的抗体， 其中每 个具有相同的结合特异性。
     一个实施方案提供包含两个抗原结合结构域的多特异性抗体， 其中每个抗原结合 结构域具有相同的特异性， 并且特异性结合两个不同 HER 受体。在一个具体的实施方案中， 每个抗原结合结构域特异性结合 EGFR 和 HER3 两者。 在另一个实施方案中， 每个抗原结合结 构域特异性结合 EGFR 和 HER2 两者。在另一个实施方案中， 每个抗原结合结构域特异性结 合 EGFR 和 HER4 两者。在又一个实施方案中， 每个抗原结合结构域特异性结合 EGFR 的结构 域 III。在另一个实施方案中， 每个抗原结合结构域特异性结合 HER3 的结构域 III。在又 一个实施方案中， 每个抗原结合结构域能够结合 EGFR 的结构域 III 和 HER3 的结构域 III。
     在具体的实施方案中， 多特异性抗体特异性结合其一个靶标 HER 受体或多个 HER 受体， 并且不特异性结合非靶标 HER 受体。因此， 在一个实施方案中， 多特异性抗体特异性 结合 EGFR 和 HER3 但是不特异性结合 HER2 或 HER4。在另一个实施方案中， 多特异性抗体特 异性结合 EGFR 和 HER2 但是不特异性结合 HER3 或 HER4。在另一个实施方案中， 多特异性抗 体特异性结合 EGFR 和 HER4 但是不特异性结合 HER2 或 HER3。
     在某些实施方案中， 每个抗原结合结构域包含重链可变结构域 (VH) 和轻链可变结 构域 (VL)。在一个实施方案中， 所述 VHVL 单元特异性结合两种不同 HER 受体。在一个具体 的实施方案中， 所述 VHVL 单元特异性结合 EGFR 和 HER3。在另一个实施方案中， 所述 VHVL 单 元特异性结合 EGFR 和 HER2。 在另一个实施方案中， 所述 VHVL 单元特异性结合 EGFR 和 HER4。
     在具体的实施方案中， 多特异性抗体对于其一个靶标 HER 受体或多个受体的亲和 力通过下述 Kd 表示， 所述 Kd 低于 10-5M， 低于 10-6M， 低于 10-7M， 低于 10-8M， 低于 10-9M， 低于 -10 -11 -12 10 M， 低于 10 M， 或低于 10 M。在一个实施方案中， 抗体对于其靶标受体之一的 Kd 低于 -7 -8 -9 -10 -11 10 M， 低于 10 M， 低于 10 M， 低于 10 M， 低于 10 M， 或低于 10-12M。在另一个实施方案中， 多特异性抗体对于其所有靶标受体的 Kd 低于 10-7M， 低于 10-8M， 低于 10-9M， 低于 10-10M， 低于 -11 -12 10 M， 或低于 10 M。
     在一些实施方案中， 多特异性抗体对于其靶标 HER 受体之一的亲和力大于对于其 另外一个靶标 HER 受体或多个受体的亲和力。在一个实施方案中， 多特异性抗体对于一 个靶标 HER 受体的亲和力比其对于另一个靶标 HER 受体的亲和力高至少 2， 3， 4， 5， 8， 10， 12， 15， 18， 20， 22， 25， 30， 35， 40， 50， 100- 倍。在一个实施方案中， 多特异性抗体特异性结合 EGFR 和另一个 HER 受体， 并且其对于另一个 HER 受体的结合亲和力比其对于 EGFR 的亲和力高至少 2， 3， 4， 5， 8， 10， 12， 15， 18， 20， 22， 25， 30， 35， 40， 50， 或 100- 倍。在一个实施方案中， 多特异性抗体特异性结合 EGFR 和 HER3， 并且其对于 HER3 的结合亲和力比其对于 EGFR 的结 合亲和力高至少 2， 3， 4， 5， 8， 10， 12， 15， 18， 20， 22， 25， 30， 35， 40， 50， 或 100- 倍。 在另一个实 施方案中， 多特异性抗体特异性结合 EGFR 和 HER2， 并且其对于 HER2 的结合亲和力比其对 于 EGFR 的结合亲和力高至少 2， 3， 4， 5， 8， 10， 12， 15， 18， 20， 22， 25， 30， 35， 40， 50， 或 100- 倍。 在另一个实施方案中， 多特异性抗体特异性结合 EGFR 和 HER4， 并且其对于 HER4 的结合亲 和力比其对于 EGFR 的亲和力高至少 2， 3， 4， 5， 8， 10， 12， 15， 18， 20， 22， 25， 30， 35， 40， 50， 或 100- 倍。
     在一些实施方案中， 本发明的多特异性抗体抑制它们特异性结合的 HER 受体中的 至少一个的生物学活性。在一些实施方案中， 本发明的多特异性抗体抑制它们特异性结合 的两个 HER 受体的生物学活性。因此， 例如， 本发明的多特异性抗体抑制 EGFR 和 / 或 HER2 和 / 或 HER3 和 / 或 HER4 受体的生物学活性。
     在一个实施方案中， 多特异性抗体特异性结合人 EGFR 和人 HER3， 并且抑制至少 EGFR 的生物学活性。在另一个实施方案中， 多特异性抗体特异性结合人 EGFR 和人 HER3， 并 且抑制至少 HER3 的生物学活性。在另一个实施方案中， 多特异性抗体特异性结合人 EGFR 和人 HER3， 并且抑制 EGFR 和 HER3 两者的生物学活性。
     在另一个实施方案中， 多特异性抗体特异性结合人 EGFR 和人 HER2， 并且抑制至少 EGFR 的生物学活性。在又一个实施方案中， 抗体特异性结合人 EGFR 和人 HER2， 并且抑制至 少 HER2 的生物学活性。 在又一个实施方案中， 抗体特异性结合人 EGFR 和人 HER2， 并且抑制 EGFR 和 HER2 两者的生物学活性。
     在另一个实施方案中， 抗体特异性结合人 EGFR 和人 HER4， 并且抑制至少 EGFR 的 生物学活性。在另一个实施方案中， 抗体特异性结合人 EGFR 和人 HER4， 并且抑制至少 HER4 的生物学活性。 在另一个实施方案中， 抗体特异性结合人 EGFR 和人 HER4， 并且抑制 EGFR 和 HER4 两者的生物学活性。
     在某些实施方案中， 本文的抗体抑制至少部分地由它们不结合的 HER 受体驱动的 生物学活性。例如， 结合 EGFR 和 HER3 的抗体可能仍然能够抑制 HER2 驱动的生物学活性。
     生物学活性的抑制可在本领域熟知的测定法中测量。 因此， 例如， 本文的抗体可抑 制一个或多个 HER 受体的磷酸化， 和 / 或可抑制 HER 配体结合其受体， 和 / 或可抑制配体诱 导的 HER 受体表达细胞的增殖和 / 或可抑制通过 HER 受体活化的下游信号传导途径。
     应答 EGFR 磷酸化活化的两个主要下游信号传导途径是 Ras/MAPK 和磷脂酰肌醇 3- 激酶 (PI3K)/Akt 途径。因此， 本文的抗体抑制 HER 受体的生物学活性的能力可通过， 例 如在 NR6 细胞中， 评估其是否能够阻断这些途径的活化来测量。因此， 可测量抗体阻断配体 诱导的 p44/42MAPK， pAKT 或其它下游信号传导分子的磷酸化的能力。HER3 信号传导也参 与数个其它途径， 包括 c-met 和 FGFR。本文的抗体抑制 HER 受体的生物学活性的能力可通 过评估其是否能够阻断这些途径的活化来测量。
     本发明一方面提供多特异性抗体， 其如下产生， 即使对一个 HER 受体具有特异性 的抗体多样化， 从而该抗体对第二个 HER 受体产生特异性， 同时保留对所述第一个 HER 受体 的特异性。总体而言， 这种方法包括步骤 (1) 使抗体的轻链可变结构域 (VL) 的氨基酸序列 多样化， 其中在所述多样化之前， 所述抗体包含 VL 和能够结合第一 HER 受体上的表位的重链可变结构域 (VH)， 和 (2) 选择能够结合第一 HER 受体上的表位和第二 HER 受体上的表位 的多样化的抗体。 这些步骤可重复， 以便产生多特异性抗体。 在美国专利申请 20080069820 中提供了这种方法的详细描述， 其全文通过引用明确并入本文。这种方法在实施例中进一 步说明。在实施例中描述的方法中， 抗 EGFR 抗体用作进行多样化的模板， 并且因此用于制 备多特异性抗 HER 抗体， 然而， 其它抗 HER 抗体， 诸如抗 HER2， 抗 HER3 或抗 HER4 抗体也可用 作模板。
     本发明还提供单特异性抗体， 其能够特异性结合一个 HER 受体但不特异性结合其 它 HER 受体。在一个实施方案中， 所述抗体特异性结合 EGFR。在一个实施方案中， 所述抗 体特异性结合 EGFR 的结构域 III。在一些实施方案中， 所述抗体特异性结合 EGFR 并且抑 制 EGFR 的生物学活性。在另一个实施方案中， 所述抗体特异性结合 HER3。在一个实施方 案中， 所述抗体特异性结合 HER3 的结构域 III。在一些实施方案中， 所述抗体特异性结合 HER3 并且抑制 HER3 的生物学活性。
     所述单特异性抗体可用作模板抗体， 用于进一步多样化， 以便添加对其它 HER 受 体或对其它靶抗原的结合特异性。
     毒性
     EGFR 拮 抗 剂 的 毒 性 在 临 床 前 和 临 床 研 究 中 均 有 许 多 文 件 记 载。 例 如， 在治 疗 有 效 水 平， 抗 EGFR 抗 体 西 妥 昔 单 抗 显 示 多 种 形 式 的 毒 性。 西 妥 昔 单 抗 ( 爱 必 妥 Imclone) 最常见的副反应 ( 发病率≥ 25 ％ ) 是皮肤的副反应 ( 包 括疹， 瘙痒和指甲改变 )， 头痛， 腹泻和感染。西妥昔单抗治疗相关的最严重有害反应 是 输 液 反 应 (infusion reactions)， 心 肺 功 能 停 止 (cardiopulmonary arrest)， 皮肤 病 学 毒 性 (dermatologic toxicity) 和 放 射 性 皮 炎 (radiation dermatitis)， 脓毒症 (sepsis)， 肾衰竭 (renal failure)， 间质性肺炎 (interstitial lung disease) 和肺栓子 (pulmonary embolus)。参见， 对于西妥昔单抗的生物制品许可协议 (Biologics License Agreement(BLA))( 申请号 ： 125084)( 通过引用并入本文 )。对于帕尼单抗 Amgen) 观察到类似的毒性问题， 其中在 89％的施用这种抗体的患者中发生皮肤病学毒性。 这些毒性是严重的， CTC 3 级以及更高。
    FDA 标签。)已 经 报 道 在 一 些 例 子 中 抗 EGFR 化 疗 剂 厄 洛 替 尼 (erlotinib) 导 致 急 性 肾 衰 竭 (acute renal failure) 或 肾 机 能 不 全 (renal insufficiency)， 肝 衰 竭 (hepatic failure) 和 / 或 肝 肾 综 合 征 (hepatorenal syndrome)， 胃 肠 穿 孔 (gastrointestinal perforations)， 大疱 (bullous) 和表皮脱落皮肤病症 (exfoliative skin disorders) 和 角膜溃疡形成和穿孔 (corneal ulceration and perforation)。参见， FDA 关于厄洛替尼 Genentech， OSI Pharmaceuticals) 的警告和预防 (Warnings and Precautions) 安全标签 (2009)。“毒性的” 或 “毒性” 是指施用给受试者的药剂导致的任何副作用。毒性的测量 包括但不限于死亡率 (mortality)、 体重减轻 (loss of body weight)、 器官衰竭 (organ failure)、 改 变 器 官 功 能 (altered organ function)、 中 枢 神 经 系 统 毒 性 (central nervous system toxicity)、 胃肠毒性 (gastrointestinal toxicity)( 例如， 表现为腹 泻 (diarrhea))、 皮肤病学毒性 (dermatologic toxicity)( 例如， 表现为出现疹 (rash)、 心脏毒性 (cardiac 皮肤损害 (skin lesion)、 脱屑 (desquamation) 或瘙痒 (pruritus))，
     toxicity)、 感染 (infection)、 脓毒症 (sepsis) 和细胞毒性 (cytotoxicity)。
     毒 性 可 通 过 本 领 域 已 知 的 方 法 确 定， 诸 如 监 测 临 床 护 架 旁 观 察 (clinical cageside observation)、 体重、 食物消耗、 呼吸率、 脉搏血氧定量法测量、 体格检查、 眼评 价、 神经病学评价、 代谢参数、 心血管参数、 临床病理学 ( 包括临床化学、 血液学、 尿分析和 凝固参数 ) 和肉眼检查病理学和显微镜病理学。
     国家癌症研究所 (National Cancer Institute) 制作的不良事件常用术语标准 (The Common Terminology Criteria for Adverse Events)v3.0(CTCAE)( 其全文通过引 用并入本文 ) 提供了关于在人受试者中具体可接受的毒性指标的信息。图 31 提供了关于 EGFR 拮抗剂疗法观察到的非临床和临床毒性的信息。
     毒性可根据总毒性事件或一个毒性事件 / 多个毒性事件的严重性进行测量。事件 的严重性可使用 CTCAE 中建立的分级系统来描述。对每个不良事件使用唯一的严重性临床 描述进行分级， 这是基于下述一般准则 ： 1 级是指轻度事件。2 级是指中度事件， 3 级是指严 重事件， 4 级是指威胁生命或致残事件， 5 级是指死亡相关的事件。CTCAE 提供了对于毒性 事件的具体临床描述。对皮肤病学毒性的描述词从 CTCAE， v.3 第 14 页开始提供。作为实 例， 图 32 显示对于疹 / 脱屑和痤疮 / 痤疮样疹的分级。(CTCAE， v.3)。存在本领域已知的 许多模型用于监测毒性的可能指标， 包括但不限于体外基于细胞的模型和体内非人动物模 型。毒性也在人受试者在临床试验研究中进行监测。
     在一个具体实施方案中， 毒性在食蟹猴 (cynomolgus monkeys) 中进行测量。EGFR 拮抗剂在食蟹猴中的毒性效应有许多文件记载。如在关于西妥昔单抗的生物制品许可协 议 (Biologics License Agreement)(BLA)( 申请号 ： 125084)( 通过引用并入本文 ) 中所 记载， 所有接受西妥昔单抗的猴子显示在皮肤上的轻度至严重损害， 由鳞屑形成 (scale formation)、 变红 (reddening)、 红斑 (erythema)、 皮炎 (dermatitis)、 裂隙 (fissures)、 伤 口 (wounds) 和疹病 (exanthema) 和 / 或毛发稀疏或脱失 (hair thinning or loss) 组成。 皮肤病学毒性在严重性和发生事件中均是剂量依赖的， 其中对于高、 中和低剂量的严重性 分别为严重、 中度和轻度， 以及发病时间分别在研究的第 15， 22 和 64 天。严重皮肤损伤的 继发并发症是细菌感染或脓毒症， 在高剂量组中 50％的动物随后死亡或进行安乐死。其它 剂量相关毒性包括在某些临床病理学参数中的改变， 所述参数与肝、 骨髓、 脾和淋巴样器官 中的细胞和组织损伤的肉眼检查和显微镜证据相关。
     如实施例中所描述的， 与用同样量的 EGFR 拮抗剂西妥昔单抗给药食蟹猴相比较， 用特异性结合 EGFR 和 HER3 的双特异性抗体给药的食蟹猴显示更少的毒性发生率， 如通过 皮肤损害所显示的。用 25mg/kg 的双特异性抗体给药的三只食蟹猴中的一只发生皮肤损 害， 而用 25mg/kg 的西妥昔单抗给药的 3 只食蟹猴中的 3 只发生皮肤损害。在双特异性抗 体给药的猴子中发生的损害比西妥昔单抗给药的猴子中的损害严重性更低， 并且延缓了损 害的发病。 与其中在所有动物中皮肤损害的发病发生在第三次给药之后的用西妥昔单抗给 药的猴子相比较， 用双特异性抗体给药的动物在最后一次 ( 第六次 ) 给药之后的一周发生 皮肤损害。
     在西妥昔单抗的临床研究中， 观察到了皮肤病学毒性， 包括痤疮样疹、 皮肤干燥和 裂隙和炎症和感染性后遗症 (infectious sequelae)。报道的皮肤病学毒性的发生率高达 89％ ( 对于患有晚期结肠直肠癌的那些患者 )。皮肤毒性的模型是已知的并且可用于确定抗体的皮肤病学毒性。此类模型 的 实 例 包 括 人 表 皮 角 质 化 细 胞 (NHEK(Clonetics， San Diego， CA ； Lonza Bioscience， Walkersville， MD) ； HEKa(Cascade Biologics， Portland， OR ； Invitrogen， Carlsbad， TM CA) 和重建人表皮 (EpiDerm cultures(MatTek， Ashland， MA)。这些模型可用于检查抗 体对细胞增殖、 基因表达、 蛋白表达、 受体磷酸化、 细胞活力和组织病理学中改变的效应。 Lacouture， M.E.， Nature Rev.Cancer( 自然综述 ： 癌症 )， 6： 803-812(2006)。
     希望提供靶向 EGFR 途径的更低毒性的抗体。EGFR 拮抗剂诸如西妥昔单抗的剂量 被毒性 ( 主要是皮肤病学毒性和输液反应 ) 所限制。更低毒性的抗体可以比更高毒性的 EGFR 拮抗剂更高的剂量施用， 这可产生增加的抗肿瘤效应。 因此， 本发明一方面提供多特异 性抗体， 其特异性结合 EGFR 和至少一个其它 HER 受体， (HER2， HER3， 和 / 或 HER4)， 其中当 所述抗体和 EGFR 拮抗剂以同等剂量施用时， 所述抗体比 EGFR 拮抗剂毒性更低。在一个实 施方案中， 所述抗体特异性结合 EGFR 和 HER3。在另一个实施方案中， 所述抗体特异性结合 EGFR 和 HER2。在又一个实施方案中， 所述抗体特异性结合 EGFR 和 HER4。
     在一些实施方案中， 在体内模型中与 EGFR 拮抗剂相比较， 所述多特异性抗体诱导 更低的毒性发生率， 更低严重性的毒性或延缓毒性的发病。本发明一方面提供多特异性抗 体， 其特异性结合 EGFR 和至少一个其它 HER 受体 (HER2， HER3， 和 / 或 HER4)， 其中与在施 用 EGFR 拮抗剂的受试者中的毒性事件相比较， 在施用所述抗体的受试者中所述抗体诱发 更少的毒性事件。在具体实施方案中， 在施用所述抗体的受试者中毒性事件的数目比施 用 EGFR 拮抗剂的受试者中的毒性事件的数目低至少 10 ％， 20 ％， 30 ％， 40 ％， 50 ％， 60 ％， 70％， 80％， 或 90％。
     在其它实施方案中， 使用所述抗体的受试者中毒性事件的比率低于 80 ％， 70 ％， 60％， 50％， 40％， 30％， 20％， 10％， 5％， 2％， 或 1％。
     在具体实施方案中， 与 EGFR 拮抗剂相比较， 所述多特异性抗体在体内模型中诱发 更低发生率的皮肤病学毒性、 更低严重性的皮肤病学毒性或延缓皮肤病学毒性的发病。本 发明一方面提供多特异性抗体， 其特异性结合 EGFR 和至少一个其它 HER 受体 (HER2， HER3， 和 / 或 HER4)， 其中与施用 EGFR 拮抗剂的受试者中的总皮肤病学毒性事件相比较， 在施用所 述抗体的受试者中所述抗体诱发更少的总皮肤病学毒性事件。在具体实施方案中， 施用所 述抗体的受试者中总皮肤病学毒性事件的数目比施用 EGFR 拮抗剂的受试者中总皮肤病学 毒性事件的数目低至少 10％， 20％， 30％， 40％， 50％， 60％， 70％， 80％， 或 90％。
     在其它实施方案中， 施用所述抗体的受试者中总皮肤病学毒性事件的比率低于 80％， 70％， 60％， 50％， 40％， 30％， 20％， 10％， 5％， 2％， 或 1％。
     本发明另一方面提供多特异性抗体， 其特异性结合 EGFR 和至少一个其它 HER 受体 (HER2， HER3， 和 / 或 HER4)， 其中与施用 EGFR 拮抗剂的受试者中的 3 级或更高等级的毒性事 件相比较， 施用所述抗体的受试者中所述抗体诱发更少的 3 级或更等级的毒性事件。在具 体实施方案中， 与施用 EGFR 拮抗剂的受试者中的 3 级或更高等级的毒性事件相比， 施用所 述抗体的受试者中 3 级或更高等级的毒性事件的数目低至少 10％， 20％， 30％， 40％， 50％， 60％， 70％， 80％， 或 90％。
     在其它实施方案中， 在施用所述多特异性抗体的受试者中 3 级或更高等级的毒性 事件的比率低于 70％， 60％， 50％， 40％， 30％， 20％， 15％， 12％， 11％， 10％， 9％， 8％， 7％，6％， 5％， 4％， 3％， 2％， 或 1％。
     在具体实施方案中， 与施用 EGFR 拮抗剂的受试者中的 3 级或更高等级的皮肤病学 毒性事件相比较， 施用双特异性抗体的受试者中所述多特异性抗体诱发更少的 3 级或更高 等级的皮肤病学毒性事件。在具体实施方案中， 与施用 EGFR 拮抗剂的受试者中的 3 级或 更高等级的皮肤病学毒性事件的数目相比， 施用所述多特异性抗体的受试者中 3 级或更高 等级的皮肤病学毒性事件的数目低至少 10％， 20％， 30％， 40％， 50％， 60％， 70％， 80％， 或 90％。
     在其它实施方案中， 施用所述多特异性抗体的受试者中 3 级或更高等级的皮肤 病学毒性事件的比率低于 70％， 60％， 50％， 40％， 30％， 20％， 15％， 12％， 11％， 10％， 9％， 8％， 7％， 6％， 5％， 4％， 3％， 2％， 或 1％。
     在其它实施方案中， 与 EGFR 拮抗剂相比较， 所述抗体在体内模型中诱发更少发病 率的改变的器官功能。在其它实施方案中， 与 EGFR 拮抗剂相比较， 所述抗体在体内模型中 诱发更少或更低严重性的胃肠毒性。
     在一些实施方案中， 所述 EGFR 拮抗剂是抗 EGFR 抗体。在一个实施方案中， 所述 EGFR 拮抗剂是西妥昔单抗。在另一个实施方案中， 所述 EGFR 拮抗剂是帕尼单抗。在另一 个实施方案中， 所述 EGFR 拮抗剂是小分子。在一个实施方案中， 所述 EGFR 拮抗剂是厄洛替 尼。在一个实施方案中， 所述体内模型是猴， 诸如食蟹猴。在另一个实施方案中， 所述体内 模型是人。 抗体和抗体变体
     在一些实施方案中， 本发明提供包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域 的多特异性抗体。 在一些实施方案中， 所述抗原结合结构域不特异性结合其它靶标， 包括其 它 HER 受体。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH( 重链可变结构域 )， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25。在 一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中 所述抗体包含 VL( 轻链可变结构域 )， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 40。在一个实施方 案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包 含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 40。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的一个、 两个和 / 或三 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 40 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 40 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。在一个 实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述 抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸
    序列 SEQ ID NO ： 40 的所有三个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 64。 在一个实施方案中， 所 述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 26。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 64， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 26。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 64 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 26 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 64 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 26 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。在一个 实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述 抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 64 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸 序列 SEQ ID NO ： 26 的所有三个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 28。 在一个实施方案中， 所 述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 27。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 28， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 27。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 28 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 27 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 28 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 27 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。 在一个实 施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗 体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 28 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序 列 SEQ ID NO ： 27 的所有三个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。在一个 具体的实施方案中， HVR-H1 包含氨基酸序列 LSGDWIH(SEQ ID NO ： 48)， HVR-H2 包含氨基酸 序列 LGEISAAGGYTD(SEQ ID NO ： 50)， HVR-H3 包含氨基酸序列 ARESRVSFEAAMDY(SEQ ID NO ： 53)， HVR-L1 包含氨基酸序列 DLATDVA(SEQ ID NO ： 54)， HVR-L2 包含氨基酸序列 SASF(SEQ ID NO ： 56) 和 HVR-L3 包含氨基酸序列 SEPEPYT(SEQ ID NO ： 57)。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29。 在一个实施方案中， 所 述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 28， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 28 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。 在一个实 施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗 体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 28 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序 列 SEQ ID NO ： 29 的所有三个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。在一个 具体的实施方案中， HVR-H1 包含氨基酸序列 LSGDWIH(SEQ ID NO ： 48)， HVR-H2 包含氨基酸 序列 LGEISAAGGYTD(SEQ ID NO ： 50)， HVR-H3 包含氨基酸序列 ARESRVSFEAAMDY(SEQ ID NO ： 53)， HVR-L1 包含氨基酸序列 NIATDVA(SEQ ID NO ： 55)， HVR-L2 包含氨基酸序列 SASF(SEQ ID NO ： 56)， 和 HVR-L3 包含氨基酸序列 SEPEPYT(SEQ ID NO ： 57)。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 30。 在一个实施方案中， 所 述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 30， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 30 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 30 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。 在一个实 施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗 体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 30 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序 列 SEQ ID NO ： 29 的所有三个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。在一个 具体的实施方案中， HVR-H1 包含氨基酸序列 LSGDWIH(SEQ ID NO ： 48)， HVR-H2 包含氨基酸 序列 VGEISAAGGYTD(SEQ ID NO ： 51)， HVR-H3 包含氨基酸序列 ARESRVSFEAAMDY(SEQ ID NO ： 53)， HVR-L1 包含氨基酸序列 NIATDVA(SEQ ID NO ： 55)， HVR-L2 包含氨基酸序列 SASF(SEQ ID NO ： 56)， 和 HVR-L3 包含氨基酸序列 SEPEPYT(SEQ ID NO ： 57)。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 40， 41， 42， 43， 44， 45 或 46。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构 域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 40， 41， 42， 43， 44， 45 或 46。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 40， 41， 42， 43， 44， 45 或 46 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。 在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ IDNOs ： 40， 41， 42， 43， 44， 45 或 46 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 40， 41， 42， 43， 44， 45 或 46 的所 有三个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含轻链可变结构域， 该轻链可变结构域包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 36， 37 或 38。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的 抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链可变结构域和轻链可变结构域， 该重链可变结构 域包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 该轻链可变结构域包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 36， 37 或 38。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 36， 37 或 38 的一个、 两个 和 / 或三个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的 抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 36， 37 或 38 的一个、 两个和 / 或 三个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQID NO ： 25 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 36， 37 或 38 的所有三个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25。 在一个实施方案中， 所 述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 39。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链可变结构域和轻链可变结构域， 该 重链可变结构域包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 该轻链可变结构域包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 39。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 39 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 39 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。在一个 实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合结构域， 其中所述 抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸 序列 SEQ ID NO ： 39 的所有三个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。
     在一个实施方案中， 本发明提供单特异性抗体， 其包含特异性结合 EGFR 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25。 在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 EGFR 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包 含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 58 或 SEQ ID NO ： 24。在一个实施方案中， 单特异性抗体包含特异性结合 EGFR 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 58 或 SEQ ID NO ： 24。
     在一个实施方案中， 本发明提供单特异性抗体， 其包含特异性结合 EGFR 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 EGFR 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 24 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。 在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 EGFR 的抗原结合结构域， 其中所述 抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 24 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。在一个实施方案中， 所述单 特异性抗体包含特异性结合 EGFR 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含 氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 24 的所有三 个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。在一个具体的实施方案中， HVR-H1 包含氨基酸序列 FTGNWIH(SEQ ID NO ： 47)， HVR-H2 包含氨基酸序列 VGEISPSGGYTD(SEQ ID NO ： 49)， HVR-H3 包含氨基酸序列 ARESRVSYEAAMDY(SEQ ID NO ： 52)， HVR-L1 包含氨基酸序列 DVSTAVA(SEQ ID NO ： 78)， HVR-L2 包含氨基酸序列 SASF(SEQ ID NO ： 56)， 和 HVR-L3 包含氨 基酸序列 SYPTPYT(SEQ ID NO ： 79)。
     在一个实施方案中， 本发明提供单特异性抗体， 其包含特异性结合 HER3 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29。 在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包 含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 33， 34 或 35。在一个实施方案中， 单特异性抗体包含特异性结 合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 33， 34 或 35。
     在一个实施方案中， 本发明提供单特异性抗体， 其包含特异性结合 HER3 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 33， 34 或 35 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 33， 34 或 35 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。在一 个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体 包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 33， 34 或 35 的所有三个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。 在一个具体的实施方案中， HVR-H1 包含氨基酸序列 FTGDWIH(SEQ ID NO ： 62)， HVR-H2 包含 氨基酸序列 VGEISPAGAYTD(SEQ ID NO ： 60)， HVR-H3 包含氨基酸序列 AREAKVSFEAAMDY(SEQ ID NO ： 61)， HVR-L1 包含氨基酸序列 NIATDVA(SEQ ID NO ： 55)， HVR-L2 包含氨基酸序列 SASF(SEQ ID NO ： 56)， 和 HVR-L3 包含氨基酸序列 SEPEPYT(SEQ ID NO ： 57)。
     在一个实施方案中， 本发明提供单特异性抗体， 其包含特异性结合 HER3 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 32。 在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 31。在一个实施方案中， 单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的 抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 32， 该 VL 包 含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 31。
     在一个实施方案中， 本发明提供单特异性抗体， 其包含特异性结合 HER3 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 32 的一个、 两个和 / 或三 个 HVRs。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 31 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。 在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述 抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 32 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 31 的一个、 两个和 / 或三个 HVRs。在一个实施方案中， 所述单 特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含 氨基酸序列 SEQ ID NO ： 32 的所有三个 HVRs， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 31 的所有三 个 HVRs。在一些实施方案中， 所述 HVRs 是扩展的 HVRs。在一个具体的实施方案中， HVR-H1 包含氨基酸序列 FSGDWIH(SEQ ID NO ： 59)， HVR-H2 包含氨基酸序列 VGEISPAGAYTD(SEQ ID NO ： 60)， HVR-H3 包含氨基酸序列 AREAKVSFEAAMDY(SEQ ID NO ： 61)， HVR-L1 包含氨基酸序列 DLATDVA(SEQ ID NO ： 54)， HVR-L2 包含氨基酸序列 SASF(SEQ ID NO ： 56) 和 HVR-L3 包含氨 基酸序列 SEPEPYT(SEQ ID NO ： 57)。 在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含重链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 2， 12 或 14。在一 个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所 述抗体包含轻链， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 4， 5， 6， 7， 8， 9， 10， 11 或 13。在一 个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所 述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 2， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 4。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原 结合结构域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 12， 所述 轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 11。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结 合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序 列 SEQ ID NO ： 12， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 13。在一个实施方案中， 所述多特 异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 14， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 13。
     在一些实施方案中， 本发明提供多特异性抗体， 其包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的 抗原结合结构域。 在一些实施方案中， 所述抗原结合结构域不特异性结合其它靶标， 包括其 它 HER 受体。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原 结合结构域， 其中所述抗体包含重链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 2。在一个实施 方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合结构域， 其中所述抗体 包含轻链， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 21， 22 或 23。
    在一些实施方案中， 本发明提供多特异性抗体， 其包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的 抗原结合结构域。 在一些实施方案中， 所述抗原结合结构域不特异性结合其它靶标， 包括其 它 HER 受体。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原
     结合结构域， 其中所述抗体包含重链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 2。在一个实施 方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合结构域， 其中所述抗体 包含轻链， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 18。
     在一个实施方案中， 本发明提供特异性结合 EGFR 的单特异性抗体。在一些实施方 案中， 所述抗原结合结构域不特异性结合其它靶标， 包括其它 HER 受体。在一个实施方案 中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 EGFR 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 2。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异 性结合 EGFR 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含轻链， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 1 或 3。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 EGFR 的抗原结合结构 域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 2， 所述轻链包含 氨基酸序列 SEQ ID NO ： 1。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 EGFR 的 抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 2， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 3。
     在一个实施方案中， 本发明提供特异性结合 HER3 的单特异性抗体。在一些实施方 案中， 所述抗原结合结构域不特异性结合其它靶标， 包括其它 HER 受体。在一个实施方案 中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 16， 17， 19 或 20。在一个实施方案中， 所述单特异性 抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含轻链， 所述轻链包含氨基 酸序列 SEQ ID NOs ： 13 或 15。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 16， 17， 19 或 20， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 13 或 15。
     在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 16， 所述轻链包含氨 基酸序列 SEQ ID NO ： 15。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的 抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 17， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 13。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异 性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 19， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 13。在一个实施方案中， 所述单特异 性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含重链和轻链， 所述重链 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 20， 所述轻链包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 13。
     在一些实施方案中， 考虑了本文所述的抗体的氨基酸序列修饰。 例如， 可能需要提 高抗体的结合亲和力和 / 或其它生物学性质。可以通过将适合的变化引入编码抗体的核苷 酸序列或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。所述修饰包括， 例如在抗体的氨基酸 序列中缺失残基和 / 或插入残基， 和 / 或置换残基。可以进行缺失、 插入和置换的任何组合 从而得到最终的构建体， 条件是最终的构建体具有需要的特征。氨基酸改变可以在制备序 列的时候引入主题抗体氨基酸序列。
     在一些实施方案中， 相对于参照序列具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性的氨基酸序列含有置换、 插入或缺失， 但 是包含所述氨基酸序列的抗体保留了结合所述参照序列的最初一个靶标或多个靶标的能力。 在一些实施方案中， 相对于参照序列具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性的氨基酸序列含有置换、 插入或缺失， 但是包含 所述氨基酸序列的抗体保留了结合所述参照序列的最初一个靶标或多个靶标的能力， 并且 不特异性结合任何其它靶标， 包括其它 HER 受体。在一些实施方案中， 参照序列的氨基酸序 列中总计 1 至 10 个氨基酸被置换、 插入或缺失。在一些实施方案中， 所述置换、 插入或缺失 发生在 HVRs 外部的区 ( 即， 在 FRs 中 )。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 40 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案 中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 40 具 有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一 性。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 64 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案 中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 26 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特 异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 64 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 26 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所述 VL 具有与 SEQ ID NO ： 29 至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性的氨基酸序列。在一个实施 方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体 包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 28 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列 同一性。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 30 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案 中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 30 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 具 有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一 性。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 40， 41， 42， 43， 44， 45 或 46 中的任意一条具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的 抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NOs ： 40， 41， 42， 43， 44， 45 或 46 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案 中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 36 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含 特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸 序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80 ％， 85 ％， 90 ％， 91 ％， 92 ％， 93 ％， 94 ％， 95 ％， 96 ％， 97 ％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 36 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案中， 所 述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所 述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 37 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性 结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 结构域和 VL， 所述 VH 结构域与 氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 具有氨基酸序列 SEQ ID NO ： 37。在一个实施方案 中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所述 VL 具有氨基酸序列 SEQ ID NO ： 38。 在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异 性结合 EGFR 和 HER2 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 38 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案 中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 39 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％，95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特 异性结合 EGFR 和 HER4 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 39 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。
     在一个实施方案中， 本发明提供单特异性抗体， 其包含特异性结合 EGFR 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。在一个实施方 案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 EGFR 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所 述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 24 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性 结合 EGFR 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列 同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 24 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。
     在一个实施方案中， 本发明提供单特异性抗体， 其包含特异性结合 HER3 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 32 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。在一个实施方 案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所 述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 31 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性 结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 32 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列 同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 31 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。
     在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 33 具有至少 80 ％， 85 ％， 90 ％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案中， 所 述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VL， 所述 VL 与 氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 33 具 有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一 性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。 在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特 异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 34 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列 同一性。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 34 具有至少 80％， 85％， 90％，91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。在一个实施方案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 35 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。在一个实施方 案中， 所述单特异性抗体包含特异性结合 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 所述 VH 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 35 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性， 所述 VL 与氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 具有至少 80％， 85％， 90％， 91％， 92％， 93％， 94％， 95％， 96％， 97％， 98％或 99％的序列同一性。
     图 33 中显示了示例性比对， 该比对显示数个抗 HER 抗体的重链可变结构域和轻链 可变结构域的 Kabat 编号。
     本发明的另一方面提供多特异性抗体， 其包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结 合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 其中 SEQ ID NO ： 25 的 VH 包含在 F29(VH)， T30(VH)， N32(VH)， V48(VH)， P52a(VH)， S53(VH)， T57(VH)， S96(VH) 或 Y100(VH) 的氨基酸置换， 根据 Kabat 编号系统进行编号。在一个实施方案中， 所述抗体包含 多于一个这些置换。在一个实施方案中， 所述抗体包含所有这些置换。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 其中 SEQ ID NO ： 25 的 VH 包含一个或多个选自由下述 各项组成的组的氨基酸置换 ： F29(VH)L ； T30(VH)S ； N32(VH)D， V48(VH)L， P52a(VH)A， S53(VH) A， T57(VH)S， S96(VH)A 和 Y100(VH)F， 根据 Kabat 编号系统进行编号。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 其中 SEQ ID NO ： 25 的 VH 包含氨基酸置换 F29(VH)L， T30(VH)S， N32(VH)D， P52a(VH)A 和 S53(VH)A 和 Y100(VH)F， 根据 Kabat 编号系统进行编号。
     本发明的另一方面提供多特异性抗体， 其包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结 合结构域。其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 58， 其中 SEQ ID NO ： 58 的 VL 包含在 D28(VL)， V29(VL)， S30(VL)， T31(VL)， A32(VL)， V33(VL)， S50(VL)， A51(VL)， F53(VL)， S91(VL)， Y92(VL)， T93(VL)， T94(VL) 或 P96(VL) 的氨基酸置换， 根据 Kabat 编号系 统进行编号。在一个实施方案中， 所述抗体包含多于一个这些置换。在一个实施方案中， 所 述抗体包含所有这些置换。在一个实施方案中， 所述抗体包含在氨基酸 31 和氨基酸 32 之 间的氨基酸插入。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 58， 其中 SEQ ID NO ： 58 的 VL 包含一个或多个选自由下述各项组成的组的氨基酸置换 ： D28(VL)N， V29(VL)I， V29(VL)L， S30(VL)A， A32(VL)D， Y92(VL)E， T93(VL)P， T94(VL)E 和 P96(VL)Y， 根据 Kabat 编号系统进行 编号。在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结 构域， 其中所述抗体包含 VL， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 58， 其中 SEQ ID NO ： 58 的 VL 包含氨基酸置换 D28(VL)N， V29(VL)I， S30(VL)A， A32(VL)D， Y92(VL)E， T93(VL)P， T94(VL)E 和 P96(VL)Y， 根据 Kabat 编号系统进行编号。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 该 VL 包含氨基酸 序列 SEQ ID NO ： 58， 其中 SEQ ID NO ： 25 的 VH 包含在 F29(VH)， T30(VH)， N32(VH)， V48(VH)， P52a(VH)， S53(VH)， T57(VH)， S96(VH) 或 Y100(VH) 的氨基酸置换， 并且其中 SEQ ID NO ： 58 的 VL 包含在 D28(VL)， V29(VL)， S30(VL)， T31(VL)， A32(VL)， V33(VL)， S50(VL)， A51(VL)， F53(VL)， S91(VL)， Y92(VL)， T93(VL)， T94(VL) 或 P96(VL) 的氨基酸置换， 根据 Kabat 编号系统进行编 号。在一个实施方案中， 所述抗体包含多于一个这些置换。在一个实施方案中， 所述抗体包 含所有这些置换。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 该 VL 包含氨基酸 序列 SEQ ID NO ： 58， 其中 SEQ ID NO ： 25 的 VH 包含一个或多个选自由下述各项组成的组 的氨基酸置换 ： F29(VH)L ； T30(VH)S ； N32(VH)D， V48(VH)L， P52a(VH)A， S53(VH)A， T57(VH)S， S96(VH)A 和 Y100(VH)F， SEQ ID NO ： 58 的 VL 包含一个或多个选自由下述各项组成的组的氨 基酸置换 ： D28(VL)N， V29(VL)I， V29(VL)L， S30(VL)A， A32(VL)D， Y92(VL)E， T93(VL)P， T94(VL) E 和 P96(VL)Y， 根据 Kabat 编号系统进行编号。
     在一个实施方案中， 所述多特异性抗体包含特异性结合 EGFR 和 HER3 的抗原结合 结构域， 其中所述抗体包含 VH 和 VL， 该 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 25， 其中 SEQ ID NO ： 25 的 VH 包含氨基酸置换 F29(VH)L， T30(VH)S， N32(VH)D， P52a(VH)A 和 S53(VH)A 和 Y100(VH) F， 该 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 58， 其中 SEQ ID NO ： 58 的 VL 包含氨基酸置换 D28(VL) N， V29(VL)I， S30(VL)A， A32(VL)D， Y92(VL)E， T93(VL)P， T94(VL)E 和 P96(VL)Y， 根据 Kabat 编 号系统进行编号。
     用于鉴定对于突变发生是优选位置的抗体的某些残基或区域的有用方法被称为 “丙氨酸分区诱变法” ， 如 Cunningham 和 Wells 在科学 (1989)(Science)， 244 ： 1081-1085 中 所述。 在此处， 鉴定了一种或一组靶残基 ( 例如带电荷的残基如 arg， asp， his， lys 和 glu)， 并且用中性或带负电荷氨基酸 ( 例如， 丙氨酸或聚丙氨酸 ) 置换从而影响氨基酸与抗原的 相互作用。然后， 通过在或关于置换位点引入另外的或其它变体来精选显示对置换的功能 敏感性的那些氨基酸位置。 因此， 当预先确定引入氨基酸序列变化的位点时， 突变本身的性 质不需要被预先确定。 例如， 为了分析突变在给定位点的性能， 在靶密码子或靶区进行丙氨 酸分区诱变或随机诱变并且关于需要的活性筛选表达的免疫球蛋白。
     氨基酸序列插入包括氨基和 / 或羧基端融合， 长度范围在 1 个残基到包含一百以 上残基的多肽， 以及单一氨基酸残基或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包 括具有 N- 端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的 N 端或 C 端与增 加抗体的血清半衰期的酶 ( 例如关于 ADEPT) 或多肽的融合。
     糖基化变体
     在某些实施方案中， 改变本发明的抗体从而增加或减少抗体被糖基化的程度。多 肽的糖基化典型地是 N- 连接或 O- 连接的。N- 连接指碳水化合物结构部分与天冬酰胺残 基的侧链的连接。其中 X 是除了脯氨酸之外的任何氨基酸的三肽序列天冬酰胺 -X- 丝氨酸 和天冬酰胺 -X- 苏氨酸， 是关于将碳水化合物结构部分酶促连接于天冬酰胺侧链的识别序 列。因此， 在多肽中这些三肽序列的存在产生可能的糖基化位点。O- 连接的糖基化指将糖 N- 乙酰基半乳糖胺、 半乳糖或木糖之一连接于羟基氨基酸， 最常见连接于丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用 5- 羟基脯氨酸或 5- 羟基赖氨酸。
     常规情况下， 在抗体上加入或缺失糖基化位点通过改变氨基酸序列完成， 从而产 生或去除一个或多个上述三肽序列 ( 对于 N- 连接的糖基化位点 )。 还可以通过将一个或多 个丝氨酸或苏氨酸残基在起始抗体序列加入、 缺失或置换进行改变 ( 对于 O- 连接的糖基化 位点 )。
     如果抗体包含 Fc 区， 那么可以改变其连接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的 天然抗体典型地包含支化的， 双触角寡糖， 其通常通过 N- 连接连接于 Fc 区的 CH2 结构域的 Asn297。见， 例如， Wright 等 (1997)TIBTECH 15 ： 26-32。寡糖可以包括各种碳水化合物， 例 如甘露糖、 N- 乙酰基葡糖胺 (GlcNAc)、 半乳糖和唾液酸， 以及在双触角的寡糖结构的 “茎” 中连接于 GlcNAc 的岩藻糖。在一些实施方案中， 可以在本发明的抗体中修饰寡糖从而产生 具有一定提高性质的抗体变体。
     在一个实施方案中， 提供具有这样的碳水化合物结构的抗体变体， 所述碳水化 合物结构缺乏连接 ( 直接或间接 ) 于 Fc 区的岩藻糖。例如， 在此类抗体中岩藻糖的量 可以是从 1 ％至 80 ％， 从 1 ％至 65 ％， 从 5 ％至 65 ％或从 20 ％至 40 ％。岩藻糖的量通过 MALDI-TOF 质谱测定法如下确定 ： 计算在 Asn297 的糖链内的岩藻糖相对于附着到 Asn 297 的所有糖结构 ( 例如， 复合的， 杂合的和高甘露糖结构 ) 的总和的平均量， 例如， 如在 WO 2008/077546 中所描述的。Asn297 是指 Fc 区中位于大约位置 297 的天冬酰胺残基 (Fc 区 残基的 Eu 编号 ) ； 然而， 由于抗体中小的序列变异， Asn297 也可位于大约位置 297 的上游或 下游 ±3 个氨基酸， 即在位置 294 和 300 之间。所述岩藻糖基化变体可以具有提高的 ADCC 功能。见例如， 美国专利公开号 US 2003/0157108(Presta， L.) ； US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.， Ltd)。 与 “去 岩 藻 糖 基 化 (defucosylated)”或 “岩 藻 糖 缺 陷 的”抗 体变体相关的出版物的实例包括 ： US 2003/0157108 ； WO 2000/61739 ； WO 2001/29246 ； US 2003/0115614 ； US 2002/0164328 ； US 2004/0093621 ； US 2004/0132140 ； US 2004/0110704 ； US 2004/0110282 ； US 2004/0109865 ； WO 2003/085119 ； WO 2003/084570 ； WO 2005/035586 ； WO 2005/035778 ； WO2005/053742 ； WO2002/031140 ； Okazaki 等， 分子生 物 学 杂 志 (J.Mol.Biol.)336 ： 1239-1249(2004) ； Yamane-Ohnuki 等， 生物技术生物工程 (Biotech.Bioeng.)87 ： 614(2004)。能够产生去岩藻糖基化的抗体的细胞系的实例包括缺 乏蛋白岩藻糖基化的 Lec13 CHO 细胞 (Ripka 等生物化学生物物理进展 (Arch.Biochem. Biophys.)249 ： 533-545(1986) ； 美 国 专 利 申 请 号 US 2003/0157108A1， Presta， L； 和 WO 2004/056312A1， Adams 等， 尤其在实施例 11 中 )， 和敲除细胞系， 如 α-1， 6- 岩藻糖基转移 酶基因， FUT8， 敲除 CHO 细胞 ( 见， 例如， Yamane-Ohnuki 等生物技术生物工程 (Biotech. Bioeng).87 ： 614(2004) ； Kanda， Y. 等， 生物技术生物工程 (Biotechnol.Bioeng.)， 94(4) ： 680-688(2006) ； 和 WO2003/085107)。
     还提供具有等分寡糖的抗体变体， 例如其中连接于抗体的 Fc 区的双触角寡糖 被 GlcNAc 等分。所述抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和 / 或可以具有提高的 ADCC 功 能。 所 述 抗 体 变 体 的 实 例 例 如 在 WO 2003/011878(Jean-Mairet 等 ) ； 美国专利号 6,602,684(Umana 等 ) ； 和 US 2005/0123546(Umana 等 ) 中进行描述。 还提供在连接于 Fc 区 的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。所述抗体变体可以具有提高的 CDC 功能。 例如在 WO 1997/30087(Patel 等 ) ； WO 1998/58964(Raju， S.) ； 和 WO 1999/22764(Raju，S.) 中描述所述抗体变体。
     Fc 区变体
     在某些实施方案中， 一个或多个氨基酸修饰可引入本文提供的抗体的 Fc 区中， 由 此产生 Fc 区变体。Fc 区变体可包含人 Fc 区序列 ( 例如， 人 IgG1， IgG2， IgG3 或 IgG4Fc 区 )， 所述人 Fc 区序列包含在一个或多个氨基酸位置的氨基酸修饰 ( 例如， 置换 )。
     在某些实施方案中， 本发明涵盖具有一些但不是全部的效应子功能的抗体变体， 所述效应子功能使所述抗体变体成为对于下述应用是理想的候选物， 在所述应用中抗体 在体内的半衰期是重要的， 而某些效应子功能 ( 如补体和 ADCC) 是不必要的或有害的。可 以进行体外和 / 或体内细胞毒性测定法从而证实 CDC 和 / 或 ADCC 活性的减少 / 消耗。 例如， 可以进行 Fc 受体 (FcR) 结合测定法从而确保抗体缺乏 FcγR 结合 ( 因此可能缺 乏 ADCC 活性 )， 但是维持 FcRn 结合能力。用于介导 ADCC 的主要细胞， 即 NK 细胞仅表达 FcγRIII， 而单核细胞表达 FcγRI， FcγRII 和 FcγRIII。在 Ravetch 和 Kinet， 免疫学 年度综述 (Annu.Rev.Immunol.)9 ： 457-492(1991) 的第 464 页上的表 3 中总结在造血细 胞上的 FcR 表达。评估目的分子的 ADCC 活性的体外测定法的非限制性实例描述在美国专 利号 5,500,362 中 ( 见例如 Hellstrom， I.， 等美国国家科学院学报 (Proc.Nat’ l Acad. Sci.USA)83 ： 7059-7063(1986)) 和 Hellstrom， I 等， 美 国 国 家 科 学 院 学 报 (Proc.Nat’ l Acad.Sci.USA)82 ： 1499-1502(1985) ； 5,821,337( 见 Bruggemann， M. 等， 实验医学杂志 (J.Exp.Med.)166 ： 1351-1361(1987)) 中。备选地， 可以使用非放射性测定法 ( 见， 例如用 TM 于流式细胞术的 ACTI 非放射性细胞毒性测定法 (CellTechnology， Inc.Mountain View， CA ； 和 CytoTox 非放射性细胞毒性测定法 (Promega， Madison， WI)。用于所述测定法 的有用效应细胞包括外周血单核细胞 (PBMC) 和天然杀伤 (NK) 细胞。备选地或另外地， 目的分子的 ADCC 活性可以在体内评估， 例如如在 Clynes 等美国国家科学院学报 (Proc. Nat’ l Acad.Sci.USA)95 ： 652-656(1998) 中公开的动物模型中评估。还可以进行 C1q 结合 测定法从而证实抗体不能结合 C1q 并且因此缺乏 CDC 活性。参见例如在 WO 2006/029879 和 WO 2005/100402 中的 C1q 和 C3c 结合 ELISA。为了评估补体激活， 可以进行 CDC 测定 ( 见， 例如， Gazzano-Santoro 等， 免疫学方法杂志 (J.Immunol.Methods)202 ： 163(1996) ； 血 Cragg， M.S. 等， 血 液 (Blood)101 ： 1045-1052(2003) ； 和 Cragg， M.S. 和 M.J.Glennie， 液 (Blood)103 ： 2738-2743(2004))。还可以使用本领域已知的方法进行 FcRn 结合和体内 清除 / 半衰期测定 ( 见， 例如， Petkova， S.B. 等， 国际免疫学 (Int’ l.Immunol.)18(12) ： 1759-1769(2006))。 具有降低的效应子功能的抗体包括具有 Fc 区残基 238， 265， 269， 270， 297， 327 和 329 的一个或多个置换的那些 ( 美国专利 6,737,056)。此类 Fc 突变体包括在氨基酸位置 265， 269， 270， 297 和 327 中的两个或多个具有置换的 Fc 突变体， 包括所谓的 “DANA” Fc 突 变体， 其具有残基 265 和 297 变为丙氨酸的置换 ( 美国专利 7,332,581)。
     描 述 了 某 些 具 有 提 高 或 减 少 结 合 FcRs 的 抗 体 变 体。( 参 见， 例 如， 美国专 利 6,737,056 ； WO 2004/056312 和 Shields 等， J.Biol.Chem.( 生 物 化 学 杂 志 )9(2) ： 6591-6604(2001)。)
     在某些实施方案中， 抗体变体包含提高 ADCC 的具有一个或多个氨基酸置换的 Fc 区， 例如， 在 Fc 区的位置 298， 333 和 / 或 334( 残基的 EU 编号 ) 的置换。
     在一些实施方案中， 在 Fc 区进行改变， 其导致改变的 ( 即， 提高的或减少的 )C1q 结合和 / 或补体依赖性细胞毒性 (CDC)， 例如如在美国专利 6,194,551， WO 99/51642 和 Idusogie 等， 免疫学杂志 (J.Immunol.)164 ： 4178-4184(2000) 中所描述的。
     在 US2005/0014934A1(Hinton 等 ) 中描述了具有增加的半衰期并且对于新生儿 Fc 受体 (FcRn) 具有提高的结合的抗体， 所述 FcRn 负责将母体 IgGs 转移给胎儿 (Guyer 等， 免 疫 学 杂 志 (J.Immunol.)117 ： 587(1976) 和 Kim 等， 免 疫 学 杂 志 (J.Immunol.)24 ： 249(1994))。那些抗体其中包含具有一个或多个置换的 Fc 区， 所述置换提高 Fc 区与 FcRn 的结合。 此类 Fc 变体包括在下述一个或多个 Fc 区残基具有置换的那些 ： 238， 256， 265， 272， 286， 303， 305， 307， 311， 312， 317， 340， 356， 360， 362， 376， 378， 380， 382， 413， 424 或 434，例 如 Fc 区残基 434 的置换 ( 美国专利 7,371,826)。
     涉 及 Fc 区 变 体 的 其 它 实 例 也 参 见 Duncan & Winter， Nature( 自 然 )322 ： 738-40(1988) ； 美国专利 5,648,260 ； 美国专利 5,624,821 ； 和 WO 94/29351。
     半胱氨酸改造的抗体变体
     在某些实施方案中， 可能需要产生半胱氨酸改造的抗体， 例如 “thioMAbs” ， 其中抗 体的一个或多个残基被半胱氨酸残基置换。在具体的实施方案中， 在抗体可及的位点存在 置换的残基。通过用半胱氨酸置换那些残基， 反应性硫醇基由此定位在抗体的可及位点， 并且可以用于将抗体缀合于其它结构部分， 如药物结构部分或接头 - 药物结构部分， 从而 产生免疫缀合物， 如本文进一步所述。在某些实施方案中， 下面的残基的任何一个或多个 可以用半胱氨酸置换 ： 轻链的 V205(Kabat 编号 ) ； 重链的 A118(EU 编号 ) ； 和重链 Fc 区的 S400(EU 编号 )。 半胱氨酸改造的抗体可以如， 例如在美国专利 7,521,541 中所描述的产生。
     抗体衍生物
     在某些实施方案中， 可以对本文提供的抗体进一步修饰以包含本领域已知并且容 易获得的另外的非蛋白质性的结构部分。 适合抗体的衍生作用的结构部分包括但不限于水 溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括， 但不限于 ： 聚乙二醇 (PEG)， 乙二醇 / 丙 二醇的共聚物， 羧甲基纤维素， 葡聚糖， 聚乙烯醇， 聚乙烯吡咯烷酮， 聚 -1， 3- 二噁烷， 聚 -1， 3， 6- 三噁烷， 乙烯 / 马来酸酐共聚物， 聚氨基酸 ( 同聚物或随机共聚物 ) 和葡聚糖或聚 ( 正 乙烯基吡咯烷酮 ) 聚乙二醇， 聚丙二醇同聚物 (propropylene glycol homopolymers)， 聚环 氧丙烷 / 氧化乙烯共聚物， 聚氧乙烯化的多元醇 ( 例如甘油 )， 聚乙烯醇及其混合物。由于 其在水中的稳定性， 聚乙二醇丙醛可以在生产中具有优势。 聚合物可以具有任何分子量， 并 且可以是分支或不分支的。与抗体连接的聚合物的数目可以变化， 并且如果连接多于一个 聚合物， 它们可以是相同或不同的分子。一般地， 用于衍生化的聚合物的数目和 / 或类型可 以基于这样的考虑来确定， 包括， 但不限于， 待提高的抗体的具体性质或功能， 抗体衍生物 是否将在限定的条件下用于治疗中， 等。
     在 另 一 个 实 施 方 案 中， 提供可以通过暴露于辐射而被选择性加热的抗体和 非 蛋 白 质 性 结 构 部 分 的 缀 合 物。 在 一 个 实 施 方 案 中， 非蛋白质性的结构部分是碳 纳 米 管 (nanotube)(Kam 等， 美 国 国 家 科 学 院 学 报 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA)102 ： 11600-11605(2005))。辐射可以以任何波长进行， 并且包括， 但不限于这样的波长， 所述波 长不伤害正常细胞， 但是其将非蛋白质性结构部分加热到杀死接近抗体 - 非蛋白质性结构 部分的细胞的温度。参见， 例如 Petkova， S.B. 等， 国际免疫学 (Int’ l.Immunol.)18(12) ：1759-1769(2006)).
     提供具有一个或多个氨基酸置换的其它抗体变体。 用于置换突变发生的目的位点 包括高变区， 但是也预期 FR 改变。保守性置换在 “优选的置换” 的标题下在表 1 中显示。更 多实质性的改变， 显示在表 4 中的 “示例性置换” 中， 或在下面参照氨基酸类别进一步描述。 可以将氨基酸置换引入目的抗体和例如关于需要的活性 ( 如提高的抗原结合， 减少的免疫 原性， 提高的 ADCC 或 CDC 等 ) 筛选的产物中。
     表1
    在抗体的生物学性质中的修饰可以通过选择这样的置换来进行， 所述置换影 响 (a) 在置换区域中的多肽主链的结构， 例如， 作为折叠或螺旋构象， (b) 在靶位点的分 子的电荷或疏水性， 或 (c) 侧链的体积。可以根据它们的侧链性质中的类似性对氨基酸 进 行 分 组 ( 在 A.L.Lehninger， 在 生 物 化 学 (Biochemistry)， 第 二 版 .， 73-75 页， Worth Publishers， 纽约 (1975) 中 ) ：
     (1) 非极性 ： Ala(A)， Val(V)， Leu(L)， Ile(I)， Pro(P)， Phe(F)， Trp(W)， Met(M)
     (2) 不带电荷的极性 ： Gly(G)， Ser(S)， Thr(T)， Cys(C)， Tyr(Y)， Asn(N)， Gln(Q)
     (3) 酸性 ： Asp(D)， Glu(E)
     (4) 碱性 ： Lys(K)， Arg(R)， His(H)
     备选地， 可以将天然存在的残基基于常见的侧链性质分为数组 ：
     (1) 疏水 ： 正亮氨酸， Met， Ala， Val， Leu， Ile ；
     (2) 中性亲水性 ： Cys， Ser， Thr， Asn， Gln ；
     (3) 酸性 ： Asp， Glu ；
     (4) 碱性 ： His， Lys， Arg ；
     (5) 影响链取向的残基 ： Gly， Pro ；
     (6) 芳香 ： Trp， Tyr， Phe。
     非保守性置换需要将这些类别中的之一的成员与另一类交换。 所述置换的残基还 可以被引入保守性置换位点， 或引入保留 ( 非保守 ) 位点。
     一种类型的置换变体包括置换母体抗体 ( 例如人源化或人抗体 ) 的一个或多个高 变区残基。一般地， 关于进一步开发所选择的得到的变体相对于它们产生自其中的母体抗 体具有修饰的 ( 例如提高的 ) 生物学性质。 示例性置换变体是亲和力成熟的抗体， 其可以使 用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地产生。简言之， 对一些高变区位点 ( 例如， 6-7 个位点 ) 突变从而在每个位点产生所有可能的氨基酸置换。从丝状噬菌体颗粒展示由此产 生的抗体， 所述抗体作为与在每个颗粒中包装的噬菌体外壳蛋白 ( 例如， M13 的基因 III 产 物 ) 的至少一部分的融合物展示。接着关于噬菌体展示变体的生物学活性 ( 例如结合亲和 力 ) 对其进行筛选。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点， 可以进行分区诱变法 ( 例如， 丙氨酸分区 ) 从而鉴定对抗原结合有显著贡献的高变区残基。备选地， 或另外地， 分析抗 原 - 抗体复合物的晶体结构从而鉴定抗体和抗原之间的接触点可以是有益的。根据本领域 已知的技术， 所述接触残基和邻近残基是置换的候选物， 包括在本文中阐释的那些。 一旦产 生了所述变体， 变体组使用本领域中已知的技术进行筛选， 包括在本文中所述的那些， 并且 可以对在一个或多个相关测定法中具有优越性质的变体进行选择以用于进一步开发。
     编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子通过本领域已知的多种方法进行制备。 这 些方法包括， 但不限于 ： 从自然来源分离 ( 在天然存在的氨基酸变体的情形中 ) 或通过早期 制备的抗体的变体或非变体形式的寡核苷酸 - 介导 ( 或位点定向 ) 诱变， PCR 诱变和盒诱 变进行制备。
     免疫缀合物
     本发明还提供免疫缀合物 ( 可互换地称为 “抗体 - 药物缀合物” 或 “ADCs” )， 其包 含缀合至一种或多种细胞毒性剂的抗体， 所述细胞毒性剂诸如化疗剂、 药物、 生长抑制剂、 毒素 ( 例如蛋白质毒素， 细菌、 真菌、 植物或动物起源的酶活性毒素或其片段 ) 或放射性同 211 131 125 90 186 位素， 诸如 At ， I ， I ， Y ， Re ， Re188， Sm153， Bi212， P32， pb212 和 Lu 的放射性同位素 ( 即 放射缀合物 )。
     在癌症治疗中， 免疫缀合物已经用于局部投递细胞毒性剂， 即杀死或抑制细胞生 长或增殖的药物 (Lambert， J.(2005)Curr.Opinion in Pharmacology ( 药学新观点 )5 ： 543-549 ； Wu 等， (2005)Nature Biotechnology( 自 然 ： 生 物 技 术 )23(9) ： 1137-1146 ； Payne， G.(2003)i 3 ： 207-212 ； Syrigos 和 Epenetos(1999)Anticancer Research( 抗 癌 研 究 )19 ： 605-614 ； Niculescu-Duvaz and Springer(1997)Adv.Drug Deliv.Rev.26 ： 151-172 ； 美国专利 4,975,278)。免疫缀合物允许将药物部分靶向投递至肿瘤， 并在那儿 进行细胞内积累， 而系统施用未经缀合的药物可对正常细胞以及试图消除的肿瘤细胞导 致 不 可 接 受 的 毒 性 水 平 (Baldwin 等， Lancet( 柳 叶 刀 )(1986 年 3 月 15 日 ) 第 603-05 页； Thorpe， (1985)“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy ： A Review( 肿 瘤 治 疗 中 细 胞 毒 性 剂 的 抗 体 载 体 ： 综 述 )， ”在 Monoclonal Antibodies ′ 84 ： Biological And Clinical Applications( 单克隆抗体 84 ： 生物学和临床应用 ) 中， (A.Pinchera 等 编 辑 )， 第 475-506 页 )。 多 克 隆 抗 体 和 单 克 隆 抗 体 皆 有 报 道 可 用 于 这 些 策 略 (Rowland 等， (1986)Cancer Immunol.Immunother.( 癌 症 免 疫 学 和 免 疫 疗 法 )， 21 ： 183-87)。 这 些 方 法 中 所 使 用 的 药 物 包 括 道 诺 霉 素 (daunomycin)、 多柔比星(doxorubicin)、 甲 氨 蝶 呤 (methotrexate) 和 长 春 地 辛 (vindesine)(Rowland 等， 1986， 见上文 )。抗体 - 毒素缀合物中所使用的毒素包括细菌毒素诸如白喉毒素、 植物毒素诸 如蓖麻毒蛋白、 小分子毒素诸如格尔德霉素 (geldanamycin)(Mandler 等 (2000)J.Nat. Cancer Inst.( 国家肿瘤研究所杂志 )92(19) ： 1573-1581 ； Mandler 等， (2000)Bioorganic & Med.Chem.Letters( 生 物 有 机 和 医 学 化 学 通 讯 )10 ： 1025-1028 ； Mandler 等， (2002) Bioconjugate Chem.( 生物缀合化学 )13 ： 786-791)， 美登木素生物碱类 (maytansinoids) (EP 1391213 ； Liu 等， (1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美国科学院学报 )93 ： 8618-8623)， 和加利车霉素 (calicheamicin)(Lode 等， (1998)Cancer Res.( 癌症研究 )58 ： 2928 ； Hinman 等， (1993)Cancer Res.( 癌症研究 )53 ： 3336-3342)。毒素可通过包括微管蛋白结合、 DNA 结合或拓扑异构酶抑制在内的机制发挥其细胞毒性效果。 有些细胞毒性药物在与大的抗体 或蛋白质受体配体缀合时趋于失活或活性降低。
     已经显示曲妥珠单抗 -DM1( 或 T-DM1) 在曲妥珠单抗 - 敏感的和曲妥珠单抗 - 不 敏 感 的 HER2- 过 表 达 癌 症 模 型 中 有 效。(US 7097840)。 ( 替伊莫单抗 (ibritumomab tiuxetan)， Biogen/Idec) 是由针对在正常和恶性 B 淋巴细胞表面上发现的 CD20 抗原的鼠 IgG1κ 单克隆抗体与通过硫脲接头 - 螯合剂所结合的 111In 或 90Y 放射性 同位素构成的抗体 - 放射性同位素缀合物 (Wiseman 等， (2000)Eur.Jour.Nucl.Med.27(7) ： 766-77 ； Wiseman 等， (2002)Blood( 血 液 )99(12) ： 4336-42 ； Witzig 等， (2002)J.Clin. Oncol.( 临床肿瘤学杂志 )20(10) ： 2453-63 ； Witzig 等， (2002)J.Clin.Oncol.( 临床肿瘤 学杂志 )20(15) ： 3262-69)。尽管 ZEVALIN 具有针对 B 细胞非霍奇金氏 (non-Hodgkin’ s) 淋 巴 瘤 (NHL) 的 活 性， 然 而 施 药 在 大 多 数 患 者 中 导 致 严 重 且 长 时 间 的 血 细 胞 减 少。 TM MYLOTARG ( 吉姆单抗奥佐米星 (gemtuzumab ozogamicin)， Wyeth Pharmaceuticals)， 即 由 huCD33 抗体与加利车霉素连接而构成的抗体 - 药物缀合物， 在 2000 年批准用于经注射 治疗急性骨髓性白血病 (Drugs of the Future( 未来药物 )(2000)25(7) ： 686 ； 美国专利 4970198 ； 5079233 ； 5585089 ； 5606040 ； 5693762 ； 5739116 ； 5767285 ； 5773001)。Cantuzumab mertansine(Immunogen， Inc.)， 即由 huC242 抗体经二硫化物接头 SPP 与美登木素生物碱类 药物部分 DM1 连接而构成的抗体 - 药物缀合物， 正在进行用于治疗表达 CanAg 的癌症诸如 结肠癌、 胰腺癌、 胃癌和其它癌的 II 期试验。 MLN-2704(Millennium Pharm.， BZLBiologics， Immunogen Inc.)， 即由抗前列腺特异膜抗原 (PSMA) 单克隆抗体与美登木素生物碱类药 物部分 DM1 连接而构成的抗体 - 药物缀合物， 正在进行用于前列腺肿瘤潜在治疗的开发。 将多拉司他汀 (dolastatin) 的合成类似物 auristatin 肽、 auristatin E(AE) 和单甲基 auristatin(MMAE) 与嵌合单克隆抗体 cBR96( 对癌上的 Lewis Y 特异 ) 和 cAC10( 对恶性 血液肿瘤上的 CD30 特异 ) 缀合 (Doronina 等， (2003)Nature Biotechnol.( 自然 ： 生物技 术 )21(7) ： 778-784)， 且正在进行治疗性开发。
     在某些实施方案中， 免疫缀合物包含抗体和化疗剂或其它毒素。本文 ( 例如上 文 ) 描述了可用于生成此类免疫缀合物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括白 喉毒素 A 链、 白喉毒素的非结合活性片段、 外毒素 A 链 ( 来自铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa))、 蓖 麻 毒 蛋 白 (ricin)A 链、 相 思 豆 毒 蛋 白 (abrin)A 链、 蒴莲根毒蛋白 (modeccin)A 链、 α- 帚曲霉素 (sarcin)、 油桐 (Aleurites fordii) 蛋白、 香石竹毒蛋白 (dianthin proteins)、 美洲商陆 (Phytolaca americana) 蛋白 (PAPI、 PAPII 和 PAP-S)、 苦瓜 (Momordica charantia) 抑制剂、 麻疯树毒蛋白 (curcin)、 巴豆毒蛋白 (crotin)、 肥皂 草 (sapaonaria officinalis) 抑制剂、 白树毒蛋白 (gelonin)、 丝林霉素 (mitogellin)、 局限曲菌素 (restrictocin)、 酚霉素 (phenomycin)、 依诺霉素 (enomycin) 和单端孢菌素 (trichothecenes)。 参见例如 1993 年 10 月 28 日公开的 WO 93/21232。 多种放射性核素可用 212 131 131 90 186 于生成放射缀合抗体。 实例包括 Bi、 I、 In、 y、 和 Re。 抗体和细胞毒性剂的缀合物可 使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备， 诸如 N- 琥珀酰亚胺基 -3-(2- 吡啶基二硫代 ) 丙酸 酯 (SPDP)、 亚氨基硫烷 (IT)、 亚氨酸酯 ( 诸如己二亚氨盐酸二甲酯 (dimethyl adipimidate HCl))、 活性酯类 ( 诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯 )、 醛类 ( 诸如戊二醛 )、 双叠氮化合物 ( 诸 如双 ( 对 - 叠氮苯甲酰基 ) 己二胺 )、 双重氮衍生物 ( 诸如双 ( 对 - 重氮苯甲酰基 ) 乙二 胺 )、 二异氰酸酯 ( 诸如甲苯 2， 6- 二异氰酸酯 )、 和双活性氟化合物 ( 诸如 1， 5- 二氟 -2， 4- 二硝基苯 ) 的双功能衍生物。例如， 可如 Vitetta 等， Science( 科学 )238 ： 1098(1987) 中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。 碳 -14 标记的 1- 异硫氰酸苯甲基 -3- 甲基二亚乙基三胺 五乙酸 (MX-DTPA) 是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的例示性螯合剂。 参见 WO 94/11026。
     本文还意欲抗体与一种或多种小分子毒素诸如加利车霉素 (calicheamicin)、 美 登木素生物碱类 (maytansinoids)、 多拉司他汀 (dolastatins)、 aurostatins、 单端孢霉素 (trichothecene) 和 CC1065 及这些毒素具有毒素活性的衍生物的缀合物。
     美登表 (Maytansine) 和美登木素生物碱类
     在一些实施方案中， 免疫缀合物包含缀合至一个或多个美登木素生物碱类分子的 抗体 ( 全长或片段 )。
     美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝分裂抑制剂。 美 登素最初从东非灌木齿叶美登木 (Maytenus serrata) 分离得到 ( 美国专利 3,896,111)。 随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类， 诸如美登醇和 C-3 美登醇酯 ( 美国专 利 4,151,042)。例如下列美国专利公开了合成美登醇及其衍生物和类似物 ： 4,137,230 ； 4,248,870 ； 4,256,746 ； 4,260,608 ； 4,265,814 ； 4,294,757 ； 4,307,016 ； 4,308,268 ； 4,308,269 ； 4,309,428 ； 4,313,946 ； 4,315,929 ； 4,317,821 ； 4,322,348 ； 4,331,598 ； 4,361,650 ； 4,364,866 ； 4,424,219 ； 4,450,254 ； 4,362,663 ； 和 4,371,533。
     在抗体药物缀合物中美登木素生物碱类药物部分是有吸引力的药物部分， 因为它 们： (i) 相对易于通过发酵或化学修饰、 从发酵产物衍生而制备， (ii) 易于用适于通过非二 硫化物接头缀合至抗体的功能基团衍生化， (iii) 在血浆中稳定， 和 (iv) 针对多种肿瘤细 胞系有效。
     已经公开了含有美登木素生物碱类的免疫缀合物、 其制备方法及其治疗用途， 例 如美国专利 5,208,020， 5,416,064 及欧洲专利 EP 0 425 235B1， 明确将其公开内容通过引 用并入本文。Liu 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美国科学院学报 )93 ： 8618-8623(1996) 记 载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体 C242 连接的称为 DM1 的美登木素生物碱类的 免疫缀合物。发现该缀合物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性， 而且在体内肿瘤 生长测定法中显示抗肿瘤活性。 Chari 等， Cancer Research( 癌症研究 )52 ： 127-131(1992) 记载了其中美登木素生物碱类经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体 A7 或结合 HER-2/neu 癌基因的另一种鼠单克隆抗体 TA.1 缀合的免疫缀合物。在体外在人乳 癌细胞系 SK-BR-3 上测试了 TA.1- 美登木素生物碱类缀合物的细胞毒性， 该细胞系每个细胞表达 3x105 个 HER-2 表面抗原。药物缀合物达到了与游离美登木素生物碱类药物相似的 一定程度的细胞毒性， 这可通过增加每个抗体分子缀合的美登木素生物碱类分子数目来提 高。A7- 美登木素生物碱类缀合物在小鼠中显示低系统性细胞毒性。
     抗体 - 美登木素生物碱类缀合物通过将抗体与美登木素生物碱类分子化学连接 且不显著削弱抗体或美登木素生物碱类分子的生物学活性来制备。参见例如， 美国专利 5,208,020( 其公开内容通过引用明确并入本文 )。每个抗体分子缀合平均 3-4 个美登木素 生物碱类分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示功效， 且对抗体的功能或溶解度没有负 面影响， 尽管预计甚至一个分子的毒素 / 抗体也将较之裸抗体的使用增强细胞毒性。美登 木素生物碱类在本领域是众所周知的， 而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如 美国专利 5,208,020 和上文提及的其它专利及非专利发表物中公开了合适的美登木素生 物碱类。 优选的美登木素生物碱类是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的 美登醇类似物， 诸如各种美登醇酯。
     本领域知道许多连接基团可用于制备抗体 - 美登木素生物碱类缀合物， 包括例如 美国专利 5,208,020 或欧洲专利 0425235B1， Chari 等， Cancer Research( 癌症研究 )52 ： 127-131(1992)， 和 2004 年 10 月 8 日提交的美国专利申请 No.10/960,602 中所公开的， 其公 开内容通过引用明确并入本文。 可如 2004 年 10 月 8 日提交的美国专利申请 No.10/960,602 所公开的制备包含接头成分 SMCC 的抗体 - 美登木素生物碱类缀合物。连接基团包括二硫 化物基团、 硫醚基团、 酸不稳定基团、 光不稳定基团、 肽酶不稳定基团、 或酯酶不稳定基团， 正如上文所述专利中所公开的， 二硫化物和硫醚基团是优选的。另外的连接基团在本文进 行了描述和例示。
     可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱类的缀合物， 诸如 N- 琥珀酰亚胺基 -3-(2- 吡啶基二硫代 ) 丙酸酯 (SPDP)、 琥珀酰亚胺基 -4-(N- 马来酰亚氨 基甲基 ) 环己烷 -1- 羧酸酯 (SMCC)、 亚氨基硫烷 (IT)、 亚氨酸酯 ( 诸如己二亚氨盐酸二甲 酯 )、 活性酯类 ( 诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯 )、 醛类 ( 诸如戊二醛 )、 双叠氮化合物 ( 诸 如双 ( 对 - 叠氮苯甲酰基 ) 己二胺 )、 双重氮衍生物 ( 诸如双 ( 对 - 重氮苯甲酰基 )- 乙二 胺 )、 二异氰酸酯 ( 诸如甲苯 2， 6- 二异氰酸酯 )、 和双活性氟化合物 ( 诸如 1， 5- 二氟 -2， 4- 二硝基苯 ) 的双功能衍生物。特别优选的偶联剂包括 N- 琥珀酰亚胺基 -3-(2- 吡啶基二 硫代 ) 丙酸酯 (SPDP)(Carlsson 等， Biochem.J.( 生物化学杂志 )173 ： 723-737(1978)) 和 N- 琥珀酰亚氨基 -4-(2- 吡啶基硫代 ) 戊酸酯 (SPP)， 由此提供二硫键连接。
     根据连接的类型， 可将接头附着于美登木素生物碱类分子的多个位置。 例如， 可使 用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在具有羟基的 C-3 位置、 经羟 甲基修饰的 C-14 位置、 经羟基修饰的 C-15 位置、 和具有羟基的 C-20 位置。在一个优选实 施方案中， 在美登醇或美登醇类似物的 C-3 位置形成键连接。
     Auristatin 和多拉司他汀
     在有些实施方案中， 免疫缀合物包含与多拉司他汀 (dolastatin) 或多拉司他汀 肽类似物和衍生物， auristatin 缀合的抗体 ( 美国专利 5635483 ； 5780588)。多拉司他汀类 和 auristatin 类已经显示出干扰微管动力学、 GTP 水解、 及核和细胞分裂 (Woyke 等 (2001) Antimicrob.Agents and Chemother.45(12) ： 3580-3584) 且具有抗癌 (US 5663149) 和抗 真菌活性 (Pettit 等， (1998)Antimicrob.Agents Chemother.42 ： 2961-2965)。 多拉司他汀或 auristatin 药物结构部分可经由肽药物结构部分的 N( 氨基 ) 末端或 C( 羧基 ) 末端附 着于抗体 (WO 02/088172)。
     例示性的 auristatin 实施方案包括 N- 末端连接的单甲基 auristatin 药物结构 部分 DE 和 DF， 披露于 2004 年 11 月 5 日提交的 “Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands( 能 缀 合 至 配 体 的 单 甲 基 缬 氨 酸 化 合 物 )” ， 美国序列号 No.10/983,340， 明确将其公开内容完整收入本文。
     典型的是， 基于肽的药物结构部分可通过在两个或多个氨基酸和 / 或肽片段 之间形成肽键来制备。此类肽键可依照例如肽化学领域众所周知的液相合成法来制备 ( 参 见 E. 和 K.Lübke， “The Peptides( 肽 )， ” volume 1， 第 .76-136 页， 1965， Academic Press)。Auristatin/ 多拉司他汀药物结构部分可依照以下文献中的方法来制 备： US 5635483 ； US 5780588 ； Pettit 等， (1989)J.Am.Chem.Soc.111 ： 5463-5465 ； Pettit 等， (1998)Anti-Cancer Drug Design( 抗 癌 药 物 设 计 )13 ： 243-277 ； Pettit， G.R.， 等， Synthesis( 合 成 )， 1996， 719-725 ； 和 Pettit 等， (1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.15 ： 859-863 ； 也 见 Doronina(2003)Nat.Biotechnol.( 自 然 ： 生 物 技 术 )21(7) ： 778-784 ； “Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands( 能缀合至配体的单 甲基缬氨酸化合物 )” ， 美国序列号 No.10/983,340， 2004 年 11 月 5 日提交， 将其完整收入本 文作为参考 ( 披露了例如制备缀合至接头的诸如 MMAE 和 MMAF 的单甲基缬氨酸化合物的接 头和方法 )。
     加利车霉素
     在其它实施方案中， 免疫缀合物包含与一个或多个加利车霉素分子缀合的抗体。 加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链 DNA 断裂。关于加利车霉素家族 缀 合 物 的 制 备 参 见 美 国 专 利 5,712,374， 5,714,586， 5,739,116， 5,767,285， 5,770,701， 5,770,710， 5,773,001， 5,877,296( 都授予 American Cyanamid Company)。 可用的加利车霉 素结构类似物包括但不限于 γ1I， α2I， α3I， N- 乙酰基 -γ1I， PSAG 和 θI1(Hinman 等， Cancer Research( 癌症研究 )53 ： 3336-3342(1993)， Lode 等， Cancer Research( 癌症研 究 )58 ： 2925-2928(1998) ； 及上述授予 American Cyanamid 的美国专利 )。 可与抗体缀合的 另一种抗肿瘤药物是 QFA， 它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和 QFA 都具有胞内作用位点， 且不易穿过质膜。因此， 这些试剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细 胞毒性效果。
     其它细胞毒性剂
     可与抗体缀合的其它抗肿瘤剂包括 BCNU、 链佐星 (streptozoicin)、 长春新碱 (vincristine)、 5- 氟尿嘧啶、 美国专利 5,053,394、 5,770,710 记载的统称为 LL-E33288 复 合物的试剂家族、 及埃斯波霉素类 (esperamicins)( 美国专利 5,877,296)。
     可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素 A 链、 白喉毒素的非结合活性片段、 外 毒素 A 链 ( 来自铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa))、 蓖麻毒蛋白 (ricin)A 链、 相思豆毒蛋白 (abrin)A 链、 蒴莲根毒蛋白 (modeccin)A 链、 α- 帚曲霉素 (sarcin)、 油 桐 (Aleurites fordii) 蛋白、 香石竹毒蛋白 (dianthin protein)、 美洲商陆 (Phytolaca americana) 蛋 白 (PAPI、 PAPII 和 PAP-S)、 苦 瓜 (Momordica charantia) 抑 制 剂、 麻疯 树毒蛋白 (curcin)、 巴豆毒蛋白 (crotin)、 肥皂草 (sapaonaria officinalis) 抑制剂、白 树 毒 蛋 白 (gelonin)、 丝 林 霉 素 (mitogellin)、 局 限 曲 菌 素 (restrictocin)、 酚霉素 (phenomycin)、 依诺霉素 (enomycin) 和单端孢菌素 (tricothecenes)。参见例如 1993 年 10 月 28 日公开的 WO 93/21232。
     本发明还考虑了以下免疫缀合物， 其在抗体和具有核酸降解活性的化合物 ( 如核 糖核酸酶或 DNA 内切核酸酶， 诸如脱氧核糖核酸酶 ； DNA 酶 ) 之间形成。
     为了选择性破坏肿瘤， 抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生 成放射缀合的抗体。实例包括 At211， I131， I125， y90， Re186， Re188， Sm153， Bi212， p32， pb212 和 Lu 的 放射性同位素。在将缀合物用于检测时， 可包含放射性原子用于闪烁照相研究， 例如 tc99m 或 I123， 或是包含自旋标记物用于核磁共振 (NMR) 成像 ( 也称为磁共振成像， mri)， 诸如再次 碘 -123、 碘 -131、 铟 -111、 氟 -19、 碳 -13、 氮 -15、 氧 -17、 钆、 锰或铁。
     可以已知方式将放射性或其它标记物掺入缀合物。 例如， 可生物合成肽， 或是通过 化学氨基酸合成法合成肽， 其中使用牵涉例如氟 -19 代替氢的合适氨基酸前体。可经肽中 的半胱氨酸残基来附着标记物， 诸如 Tc99m 或 I123， Re186， Re188 和 In111。可以经赖氨酸残基来 附着钇 -90。IODOGEN 法 (Fraker 等 (1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80 ： 49-57) 可用 于掺入碘 123。 “Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy( 免疫闪烁成像中的单 克隆抗体 )” (Chatal， CRC Press 1989) 详细记载了其它方法。
     抗体和细胞毒性剂的缀合物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备， 诸如 N- 琥 珀酰亚胺基 -3-(2- 吡啶基二硫代 ) 丙酸酯 (SPDP)、 琥珀酰亚胺基 -4-(N- 马来酰亚氨甲 基 ) 环己烷 -1- 羧酸酯 (SMCC)、 亚氨基硫烷 (IT)、 亚氨酸酯 ( 诸如己二亚氨盐酸二甲酯 )、 活性酯类 ( 诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯 )、 醛类 ( 诸如戊二醛 )、 双叠氮化合物 ( 诸如双 ( 对 - 叠氮苯甲酰基 ) 己二胺 )、 双重氮衍生物 ( 诸如双 ( 对 - 重氮苯甲酰基 ) 乙二胺 )、 二 异氰酸酯 ( 诸如甲苯 2， 6- 二异氰酸酯 )、 和双活性氟化合物 ( 诸如 1， 5- 二氟 -2， 4- 二硝基 苯 ) 的双功能衍生物。例如， 可如 Vitetta 等， Science( 科学 )238 ： 1098(1987) 中所述制 备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳 -14 标记的 1- 异硫氰酸苯甲基 -3- 甲基二亚乙基三胺五乙酸 (MX-DTPA) 是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见 WO 94/11026。接头 可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的 “可切割接头” 。 例如， 可使用酸不稳定接头、 肽酶 敏感接头、 光不稳定接头、 二甲基接头、 或含二硫化物接头 (Chari 等， Cancer Research( 癌 症研究 )52 ： 127-131(1992) ； 美国专利 5,208,020)。
     化合物明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的 ADC ： 商品化 ( 如购自 Pierce Biotechnology， Inc.， Rockford， IL.， 美 国 ) 的 BMPS、 EMCS、 GMBS、 HBVS、 LC-SMCC、 MBS、 MPBH、 SBAP、 SIA、 SIAB、 SMCC、 SMPB、 SMPH、 硫代 -EMCS、 硫代 -GMBS、 硫代 -KMUS、 硫代 -MBS、 硫 代 -SIAB、 硫代 -SMCC、 和硫代 -SMPB、 和 SVSB( 琥珀酰亚氨基 -(4- 乙烯基砜 ) 苯甲酸酯 )。 见 2003-2004 年度应用手册和产品目录 (Applications Handbook and Catalog) 第 467-498 页。
     抗体药物缀合物的制备
     在抗体 - 药物缀合物 (ADC) 中， 将抗体 (Ab) 经接头 (L) 与一个或多个药物结构部 分 (D) 缀合， 例如每个抗体缀合约 1 个至约 20 个药物结构部分。可采用本领域技术人员知 道的有机化学反应、 条件和试剂通过数种路径来制备通式 I 的 ADC， 包括 ： (1) 抗体的亲核基 团经共价键与二价接头试剂反应， 形成 Ab-L， 随后与药物结构部分 D 反应 ； 和 (2) 药物结构部分的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应， 形成 D-L， 随后与抗体的亲核基团反应。本 发明描述了制备 ADC 的另外的方法。
     Ab-(L-D)p I
     接头可由一个或多个接头构件构成。示例性接头构件包括 6- 马来酰亚胺己酰 基 (6-maleimidocaproyl， “MC” )、 马 来 酰 亚 胺 基 丙 酰 基 (maleimidopropanoyl， “MP” )、 缬氨酸 - 瓜氨酸 (“val-cit” )、 丙氨酸 - 苯丙氨酸 (“ala-phe” )、 对 - 氨基苯甲氧基羰 基 (p-aminobenzyloxycarbonyl， “PAB” )、 N- 琥珀酰亚胺基 -4-(2- 吡啶基硫代 ) 戊酸酯 (“SPP” )、 N- 琥珀酰亚胺基 -4-(N- 马来酰亚氨甲基 ) 环己烷 -1- 羧酸酯 (“SMCC’ )、 和 N- 琥珀酰亚胺基 (4- 碘 - 乙酰基 ) 氨基苯甲酸酯 ( “SLAB” )。 另外的接头构件是本领域已知 的， 有些在本文进行了描述。 也见 “Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands( 能缀合至配体的单甲基缬氨酸化合物 )， ” 2004 年 11 月 5 日提交， 美国序列号 No.10/983,340， 其全文内容通过引用并入本文。
     在一些实施方案中， 接头可包含氨基酸残基。 示例性氨基酸接头构件包括二肽、 三 肽、 四肽、 或五肽。示例性二肽包括 ： 缬氨酸 - 瓜氨酸 (vc 或 val-cit)、 丙氨酸 - 苯丙氨酸 (af 或 ala-phe)。 示例性三肽包括 ： 甘氨酸 - 缬氨酸 - 瓜氨酸 (gly-val-cit) 和甘氨酸 - 甘 氨酸 - 甘氨酸 (gly-gly-gly)。包含氨基酸接头构件的氨基酸残基包括天然存在的那些， 以及稀有氨基酸 (minor amino acid) 和非天然存在的氨基酸类似物， 如瓜氨酸。可设计和 优化氨基酸接头构件的选择性以用于通过特定的酶 ( 如肿瘤相关的蛋白酶、 组织蛋白酶 B、 C 和 D、 或纤溶酶蛋白酶 ) 进行酶切割。
     抗体的亲核基团包括但不限于 ： (i)N 末端氨基 ； (ii) 侧链氨基， 如赖氨酸 ； (iii) 侧链巯基， 如半胱氨酸 ； 和 (iv) 糖基化抗体中糖的羟基或氨基。氨基、 巯基、 和羟基是亲核 的， 能够与接头部分上的亲电子基团反应而形成共价键， 而接头试剂包括 ： (i) 活性酯类， 诸如 NHS 酯、 HOBt 酯、 卤代甲酸酯、 和酸性卤化物 ； (ii) 烷基和苯甲基卤化物， 诸如卤代乙酰 胺； (iii) 醛类、 酮类、 羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键， 即半胱 氨酸桥。可通过还原剂诸如 DTT( 二硫苏糖醇 ) 处理使抗体具有与接头试剂缀合的反应活 性。由此每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性硫醇亲核体。可经由赖氨酸与 2- 亚氨 基硫烷 (Traut 氏试剂 ) 的反应， 导致胺转变为硫醇， 从而将额外亲核基团引入抗体。通过 引入一个、 两个、 三个、 四个、 或更多半胱氨酸残基 ( 例如制备包含一个或多个非天然半胱 氨酸氨基酸残基的突变抗体 ) 可将反应性硫醇基引入抗体 ( 或其片段 )。
     还可通过修饰抗体引入可与接头试剂或药物上的亲核取代基反应的亲电子结构 部分来生成抗体 - 药物缀合物。可用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖， 从而形成 可与接头试剂或药物结构部分的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺 Schiff 碱基可形成 稳定的键， 或者可用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连接。 在一个实施方案中， 糖基 化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可在蛋白质中生成羰 ( 醛 和酮 ) 基团， 它可与药物上的适当基团反应 (Hermanson， Bioconjugate Techniques)。在 另一个实施方案中， 包含 N 末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可与偏高碘酸钠反应， 导致 代替第一个氨基酸而生成醛 (Geoghegan & Stroh， (1992)Bioconjugate Chem.( 生物缀合 物化学 )3 ： 138-146 ； US 5362852)。此类醛可与药物结构部分或接头亲核体反应。
     同样， 药物结构部分上的亲核基团包括但不限于 ： 胺、 硫醇、 羟基、 酰肼、 肟、 肼、 缩氨基硫脲、 肼羧酸酯、 和芳基酰肼基团， 它们能够与接头部分上的亲电子基团反应而形成共 价键， 而接头试剂包括 ： (i) 活性酯类， 诸如 NHS 酯、 HOBt 酯、 卤代甲酸酯、 和酸性卤化物 ； (ii) 烷基和苯甲基卤化物， 诸如卤代乙酰胺 ； (iii) 醛类、 酮类、 羧基、 和马来酰亚胺基团。
     或者， 可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒性剂的融合蛋白。 DNA 的长度可包含各自编码缀合物两个部分的区域， 或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区 域分开， 该接头肽不破坏缀合物的期望特性。
     在又一个实施方案中， 可将抗体与 “受体” ( 诸如链霉亲和素 ) 缀合从而用于肿瘤 预先靶向， 其中对患者施用抗体 - 受体缀合物， 接着使用清除剂由循环中清除未结合的缀 合物， 然后施用与细胞毒性剂 ( 如放射性核苷酸 ) 缀合的 “配体” ( 如亲合素 )。
     重组方法和组合物
     抗体可以使用例如在美国专利 4,816,567 中描述的重组方法和组合物产生。在一 个实施方案中， 提供了编码本文描述的抗 HER 抗体的分离的核酸。此类核酸可编码包含抗 体 VL 的氨基酸序列和 / 或包含其 VH 的氨基酸序列 ( 例如抗体的轻链和 / 或重链 )。在又 一个实施方案中， 提供了包含此类核酸的一个或多个载体 ( 例如表达载体 )。 在又一个实施 方案中， 提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中， 宿主细胞包含 ( 例如， 用下述各项转化 ) ： (1) 包含核酸的载体， 所述核酸编码包含抗体的 VL 的氨基酸序列和包含 抗体的 VH 的氨基酸序列， 或 (2) 包含核酸的第一载体， 所述核酸编码包含抗体的 VL 的氨基 酸序列， 和包含核酸的第二载体， 所述核酸编码包含抗体的 VH 的氨基酸序列。在一个实施 方案中， 宿主细胞是真核的， 例如中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞或淋巴样细胞 ( 例如， Y0， NS0， Sp20 细胞 )。在一个实施方案中， 提供了制备抗 HER 抗体的方法， 其中所述方法包括， 在适 合抗体表达的条件下， 培养包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞， 如上文所提供的， 和任选 地从所述宿主细胞 ( 或宿主细胞培养基 ) 回收所述抗体。
     为了重组生产抗 -HER 抗体， 分离编码抗体 ( 例如上文所描述的抗体 ) 的核酸， 并 插入一个或多个载体， 用于在宿主细胞中进一步克隆和 / 或表达。此类核酸易于使用常规 规程分离和测序 ( 例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷 酸探针进行 )。
     用于克隆或表达编码抗体的载体的适当宿主细胞包括本文描述的原核或真核细 胞。例如， 抗体可在细菌中产生， 特别当不需要糖基化和 Fc 效应子功能时。对于抗体片段 和多肽在细菌中的表达， 见， 例如， 美国专利 5,648,237， 5,789,199 和 5,840,523。( 还见 Charlton， 分子生物学中的方法 (Methods in Molecular Biology)， 卷 248(B.K.C.Lo， 编 辑， Humana 出版社， Totowa， NJ， 2003)， 第 245-254 页， 描述抗体片段在大肠杆菌中的表达 )。 在表达后， 抗体可以从可溶级分中的细菌细胞糊状物分离， 并且可以进一步纯化。
     除了原核生物以外， 真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是关于编码抗体的载体的 合适克隆或表达宿主， 包括真菌和酵母菌株， 其糖基化途径已经进行 “人源化” ， 导致生产具 有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见 Gerngross， Nat.Biotech.( 自然生物技术 )22 ： 1409-1414(2004) 和 Li 等， Nat.Biotech.( 自然生物技术 )24 ： 210-215(2006)。
     适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体 ( 无脊椎动物和脊椎动 物 )。 无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。 已经鉴定了许多杆状病毒株， 其可与昆 虫细胞联合使用， 特别是用于转染草地夜蛾 (Spodoptera frugiperda) 细胞。还可利用植物细胞培养物作为宿主。见， 例如， 美国专利 5,959,177， 6,040,498， 6,420,548， 7,125,978 和 6,417,429( 描述在转基因植物中生产抗体的 PLANTIBODIESTM 技 术 )。
     也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如， 可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺 乳动物细胞系。 有用哺乳动物宿主细胞系的其它实例是用 SV40 转化的猴肾 CV1 系 (COS-7) ； 人 胚 肾 系 (293 或 293 细 胞， 如 例 如 Graham 等， 遗 传 病 毒 学 杂 志 (J.Gen Virol.)36 ： 59(1977) 中所描述的 ) ； 幼仓鼠肾细胞 (BHK) ； 小鼠塞托利 (sertoli) 细胞 (TM4 细胞， 如例 如在 Mather， 生物繁殖 (Biol.Reprod.)23 ： 243-251(1980) 中描述的 ) ； 猴肾细胞 (CV1) ； 非 洲绿猴肾细胞 (VERO-76) ； 人宫颈癌细胞 (HELA) ； 犬肾细胞 (MDCK) ； 布法罗大鼠 (buffalo rat) 肝细胞 (BRL 3A) ； 人肺细胞 (W138) ； 人肝细胞 (Hep G2) ； 小鼠乳瘤 (MMT 060562) ； TRI 细胞， 如例如 Mather 等， Annals N.Y.Acad.Sci.383 ： 44-68(1982) 中所描述的 ； MRC5 细胞 ； 和 FS4 细胞。 其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞， 包括 DHFR-CHO 细胞 (Urlaub 等， 美国国家科学院学报 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA)77 ： 4216(1980)) ； 和骨 髓瘤细胞系如 Y0， NS0 和 Sp2/0。关于适合生产抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述见 例如 Yazaki 和 Wu， 在分子生物学中的方法 (Methods in Molecular Biology)， 卷 248(B. K.C.Lo， ed.， Humana Press， Totowa， NJ)， 第 255-268 页 (2003)。
     治疗用途
     本文描述的抗体和抗体片段可用于治疗癌症， 包括癌前的、 非转移性的、 转移性的 和癌性肿瘤 ( 例如， 早期癌症 )， 或用于治疗有发生癌症 ( 例如乳腺癌 ) 风险的受试者。抗 体和抗体片段也可用于治疗或预防非恶性疾病， 诸如神经变性病症、 精神病学病症或自身 免疫性疾病。
     术语癌症包括一组增殖性病症， 包括但不限于癌前生长、 良性肿瘤、 和恶性肿瘤。 良性肿瘤维持局限在原始位点并且没有浸润、 侵袭或转移至远方位点的能力。恶性肿瘤将 侵袭并破坏其周围的其它组织。 它们也获得了从其起始处剥离并扩散至身体其它部分的能 力 ( 转移 )， 通常通过血流或通过淋巴结所在的淋巴系统转移。 原发肿瘤通过它们所发生的 组织类型进行分类 ； 转移瘤通过衍生癌细胞的组织类型进行分类。 经过一段时间， 恶性肿瘤 的细胞变得更加异常并显得更不像正常细胞。这种癌细胞的外观变化称为肿瘤分级， 并且 癌细胞被描述为良好分化的、 中度分化的、 较差分化的或未分化的。 良好分化的细胞显得非 常正常并且类似于它们所来源的正常细胞。 未分化的细胞是变得如此异常的细胞以至于不 能确定该细胞的来源。
     肿瘤可以是实体瘤或非实体瘤或软组织肿瘤。软组织肿瘤的实例包括白血病 ( 例 如， 慢性髓细胞性白血病 (chronic myelogenous leukemia)、 急性髓细胞性白血病 (acute myelogenous leukemia)、 成 人 急 性 淋 巴 细 胞 性 白 血 病 (adult acute lymphoblastic leukemia)、 急性骨髓性白血病 (acute myelogenous leukemia)、 成熟急性 B 细胞型淋巴细 胞性白血病 (mature B-cell acute lymphoblastic leukemia)、 慢性淋巴细胞性白血病 (chronic lymphocytic leukemia)、 前淋巴细胞性白血病 (polymphocytic leukemia)、 或 毛细胞性白血病 (hairy cell leukemia))、 或淋巴瘤 (lymphoma)( 例如， 非霍奇金淋巴瘤 (non-Hodgkin′ s lymphoma)、 皮肤 T 细胞淋巴瘤 (cutaneous T-cell lymphoma)、 或霍奇森 病 (Hodgkin′ s disease)。实体瘤包括血液、 骨髓、 或淋巴系统之外的任何身体组织的癌症。实体瘤可进一步分为上皮细胞来源的那些和非上皮细胞来源的那些。上皮细胞实体瘤 的实例包括胃肠道、 结肠、 乳房、 前列腺、 肺、 肾、 肝、 胰、 卵巢、 头和颈、 口腔、 胃、 十二指肠、 小 肠、 大肠、 肛门、 胆囊、 阴唇、 鼻咽、 皮肤、 子宫、 男性生殖器、 泌尿器官、 膀胱的肿瘤及皮肤的 肿瘤 ( 包括黑素瘤 )。 非上皮来源的实体瘤包括肉瘤 (sarcomas)、 脑肿瘤 (brain tumors)、 和骨肿瘤 (bone tumors)。
     上皮癌 (epithelial cancers) 通常从良性肿瘤发展为前侵袭期 ( 例如， 原位癌 )， 至恶性癌症， 其已经渗透基底膜并侵入上皮下基质。
     在一个实施方案中， 多特异性抗体特异性结合 EGFR 和至少一个其它 HER 受体， 诸 如 HER2 或 HER3 或 HER4， 并且在预防和 / 或治疗实体瘤， 特别是结肠直肠肿瘤， 肺肿瘤 ( 诸 如非小细胞肺癌和鳞状细胞癌 )， 头和颈肿瘤， 卵巢肿瘤， 皮肤肿瘤， 胰肿瘤和 / 或乳房肿瘤 中有用。
     多特异性抗体也可用于减少或预防对靶向 HER 途径的治疗的抗性。在使用靶向 HER 途径的治疗中的显著限制是许多癌症患者显示的对所述治疗的治疗效果的抗性。一 些癌症患者对靶向 HER 途径的治疗显示无反应。其他癌症患者可能显示初始反应， 但是然 后对所述治疗变成抗性的。癌症对治疗是抗性的， 如果在接受治疗时癌症有进展 ( 难治性 的 )， 或如果在完成治疗方案的 12 个月内癌症有进展 ( 复发 )。
     在一个实施方案中， 靶向 HER 途径的治疗包括用靶向 HER 途径的抗体 ( 例如， EGFR 抗体， HER2 抗体， HER3 抗体和 / 或 HER4 抗体 ) 进行治疗。在另一个实施方案中， 靶向 HER 途径的治疗包括用化疗剂进行治疗。
     剂量和制剂
     可以与优良医学实践一致的方式配制、 剂量给药和施用本文的抗体或抗体片段组 合物。 在此内容中考虑的因素包括所治疗的具体病症、 所治疗的具体哺乳动物、 患者个体的 临床状态、 病症的起因、 投递药剂的部位、 施药的方法、 施药的日程安排、 和医学从业人员知 道的其它因素。确定待施用的抗体或抗体片段的 “治疗有效量” 需要考虑以上因素， 这是预 防、 缓解或治疗癌症所需的最小量。抗体或抗体片段不是必需而是任选与目前用于预防或 治疗癌症或发生癌症的风险的一种或多种药剂一起配制。 此类其它药剂的有效量取决于制 剂中存在的抗体或抗体片段的量、 病症或治疗的类型、 和上文讨论的其它因素。 这些通常是 以与上文所用相同剂量和施用途径使用， 或是迄今所用剂量的大约 1-99％。一般而言， 对 癌症的减轻或治疗涉及减少与癌症相关的一种或多种症状或医学问题。 药物的治疗有效量 可通过下述各项之一或其组合获得 ： 减少 ( 至少 10％、 20％、 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％、 100％或更多 ) 癌细胞数量 ； 减小或抑制肿瘤大小或肿瘤负荷 ； 抑制 ( 即减慢到 一定程度和 / 或停止 ) 癌细胞浸润到周围器官中 ； 在腺瘤的情况下减少激素的分泌 ； 减小 血管密度 ； 抑制肿瘤转移 ； 降低或抑制肿瘤生长 ； 和 / 或在一定程度上缓解一或多种与癌症 相关的症状。在一些实施方案中， 抗体或抗体片段用于预防受试者中癌症的发生或复发。
     一个实施方案中， 本发明可用于延长易患或被诊断患有癌症的人类患者的生存 期。生存期定义为首次给予药物到死亡的时间。生存期可通过治疗组相对于对照组的分段 危险率 (stratified hazard ratio)(HR) 来测定， 其代表治疗过程中患者死亡的危险性。
     另一实施方案中， 本发明的治疗显著增加易患或被诊断患有癌症的人类患者组中 的反应率， 所述患者用多种抗癌疗法治疗。反应率定义为对所述治疗有反应的被治疗患者的百分比。 一方面， 与单独的手术、 放疗、 或化疗治疗的组相比， 本发明利用抗体或抗体片段 和手术、 放疗、 或一或多种化疗剂的联合治疗显著增加被治疗患者组中的反应率， 该增加具 有低于 0.005 的 χ2(Chi-square)p- 值。
     在美国专利申请公开 20050186208 中描述了癌症治疗中疗效的另外的测量。
     治疗制剂通过混合具有需要纯度的活性成分和任选的生理可接受的载体、 赋 形剂或稳定剂使用本领域已知的标准方法进行制备 ( 雷明顿药物科学 (Remington ′ s Pharmaceutical Sciences)(20.sup.th edition)， A.Gennaro 编 辑， 2000， Lippincott， Williams & Wilkins， Philadelphia， Pa.)。可接受的载体包括盐水或缓冲剂如磷酸盐、 柠 檬酸盐和其它有机酸 ； 抗氧化剂包括抗坏血酸 ； 低分子量 ( 少于约 10 个残基 ) 多肽 ； 蛋白 质， 如血清白蛋白、 明胶或免疫球蛋白 ； 亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮， 氨基酸如甘氨酸、 谷氨酰胺、 天冬酰胺、 精氨酸或赖氨酸 ； 单糖、 二糖和其它碳水化合物包括葡萄糖、 甘露糖或 糊精 ； 螯合剂如 EDTA ； 糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇 ； 形成盐的平衡离子如钠 ； 和 / 或非离子 TM TM 表面活性剂如 TWEEN ， PLURONICS 或 PEG。
     任选地， 但优选地， 所述制剂包含药用盐、 优选地氯化钠并且优选地在约生理浓度 包含药用盐。任选地， 本发明的制剂可以包含药用防腐剂。在一些实施方案中， 防腐剂的浓 度范围是 0.1 到 2.0％， 典型地以 v/v 计。适合的防腐剂包括在药物领域中已知的那些。苄 醇、 苯酚、 间甲苯酚、 羟苯甲酯和羟苯丙酯是优选的防腐剂。 任选地， 本发明的制剂可以包含 浓度为 0.005 到 0.02％的药用表面活性剂。
     本文制剂也可以包含超过一种活性化合物， 如被治疗的特定适应症所需要， 优选 地是对彼此没有不良影响具有补充活性的那些。 所述分子适当地以对于意欲目的有效的量 组合存在。
     活性成分也可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊剂中， 例如 分别在胶状药物递送系统 ( 例如， 脂质体， 白蛋白微球体， 微乳， 纳米颗粒和纳米胶囊 ) 或在 粗乳状液中的羟甲基纤维素或明胶 - 微囊剂和聚 -( 甲基丙烯酸甲酯 ) 微囊剂。所述技术 在雷明顿药物科学 (Remington′ s Pharmaceutical Sciences) 见上文中公开。
     可以制备缓释制剂。 缓释制剂的适合的实例包括包含抗体的固体疏水性聚合物的 半透性基质， 所述基质以成形的制品的形式存在， 例如薄膜或微囊剂。 缓释基质的实例包括 聚酯、 水凝胶 ( 例如， 聚 (2- 羟乙基 - 甲基丙烯酸酯 ) 或聚 ( 乙烯醇 ))， 聚丙交酯 ( 美国专 利号 3,773,919)， L- 谷氨酸和 .γ. 乙基 -L- 谷氨酸酯的共聚物， 不可降解的乙烯 - 乙酸 TM 乙烯酯， 可降解的乳酸 - 羟基乙酸共聚物如 LUPRON DEPOT ( 由乳酸 - 羟基乙酸共聚物和醋 酸亮丙瑞林组成的可注射的微球体 ) 和聚 -D-(-)-3- 羟丁酸。聚合物如乙烯 - 乙酸乙烯酯 和乳酸 - 羟基乙酸能够释放分子超过 100 天， 而某些水凝胶则在更短的时间阶段释放蛋白。 当包封的抗体仍旧在体内较长时间时， 它们可能由于在 37℃暴露于水分而变性或聚集， 导 致生物学活性的损失和免疫原性的可能变化。根据涉及的机制， 可以设计合理的策略来进 行稳定。例如， 如果发现聚集机制是通过硫 - 二硫化物交换的分子间 S--S 键形成， 那么稳 定可以通过修饰巯基残基、 从酸性溶液冷冻干燥、 控制水分含量、 使用适合的添加剂并且开 发特定的聚合物基质组合物来实现。
     本文描述的抗体和抗体片段依照已知的方法施用给人类受试者， 诸如， 作为推注 或通过一段时间的连续输注的静脉内施用， 通过肌肉内的、 腹膜内的、 脑脊内的、 皮下的、 关节内的、 滑膜内的、 鞘内的、 口服的、 局部的、 或吸入途径。如果 HER( 例如 EGFR， HER2， HER3， HER4 等 ) 的拮抗作用与广泛的副作用或毒性相关， 局部施用可以是特别期望的。先体外后 体内 (ex vivo) 策略也可在治疗性应用中使用。先体外后体内策略涉及通过编码抗体或抗 体片段的多核苷酸转染或转导从受试者获得的细胞。 该转染或转导的细胞然后回输至受试 者。该细胞可以是许多类型， 包括但不限于造血细胞 ( 例如骨髓细胞、 巨噬细胞、 单核细胞、 树突细胞、 T 细胞或 B 细胞 )、 成纤维细胞、 上皮细胞、 内皮细胞、 角质细胞或肌细胞。
     在一个实例中， 当病症或肿瘤的位置允许时， 抗体或抗体片段局部施用， 例如通过 直接注射， 并且该注射可周期性地重复。抗体或抗体片段也可全身投递给受试者或直接投 递至肿瘤细胞， 例如投递至肿瘤或手术切除肿瘤后的瘤床， 以预防或降低局部复发或转移。
     为了预防或治疗疾病， 本发明的抗体的适合剂量 ( 当单独使用或与一种或多种其 它另外的治疗剂组合 ) 将取决于待治疗的疾病类型， 抗体的类型， 疾病的严重性和进程， 而 不管施用抗体是用于预防还是治疗目的、 以前的疗法、 患者的临床病史和对抗体的响应， 以 及主治医师的判断。将抗体以一次或以一系列治疗适当地施用于患者。根据疾病的类型和 严重性， 约 1μg/kg 到 20mg/kg( 例如 0.1mg/kg-15mg/kg) 的抗体可以是施用于患者的起始 候选剂量， 而不管例如是通过一次或多次单独施用还是通过持续输注进行施用。一种典型 的每日剂量范围可以在约 1μg/kg 到 100mg/kg 或更多， 这取决于上述因素。对于在数日或 更长时间内的重复施用， 取决于病况， 治疗通常将持续直到对疾病症状需要的抑制发生。 抗 体的一个示例性剂量是在约 0.05mg/kg 到约 20mg/kg 的范围内。 因此， 可以将约 0.5mg/kg， 2.0mg/kg， 4.0mg/kg， 10mg/kg， 12mg/kg， 15mg/kg 或 20mg/kg 的一个或多个剂量 ( 或其任何 组合 ) 施用于患者。可以将所述剂量间歇性地施用， 例如每周、 每两周、 或每三周 ( 例如， 从 而使所述患者接受约 2 到约 20 或例如约 6 个剂量的抗体 ) 施用。可以开始施用更高的负 载剂量， 随后施用一剂或多剂更低的剂量。示例性的给药方案包括施用约 4mg/kg 的起始负 载剂量， 随后每周一次施用约 2mg/kg 抗体的维持剂量。然而， 其它剂量方案可以是有用的。 该疗法的进程容易通过常规技术和测定法进行监测。
     组合疗法
     本发明的抗体可以与具有抗癌性质的第二化合物组合在药物组合制剂中， 或组合 在给药方案中， 作为组合疗法。药物组合制剂或给药方案的第二化合物可以对组合中的抗 体具有补充活性从而使它们不会对彼此存在不利的影响。在一个实施方案中， 多特异性抗 体与另一个抗 HER 抗体 ( 诸如 培妥珠单抗和 / 或西妥昔单抗 ) 组合使用。 本发明的抗体也可与放射疗法组合使用。
     第二化合物可以是化疗剂、 细胞毒性剂、 细胞因子、 生长抑制剂、 抗激素剂、 和/或 保心药。所述分子以对于意欲的目的是有效的量适当地组合存在。包含本发明抗体的药物 组合物也可以含有治疗有效量的化疗剂如微管蛋白 - 形成抑制剂、 拓扑异构酶抑制剂、 DNA 嵌入剂或 DNA 结合剂。
     其它的治疗方案可以与根据本发明鉴定的抗癌剂的施用组合。 所述组合疗法可以 作为同时或顺序方案进行施用。当顺序施用时， 组合可以以两次或更多次施用进行施用。 所述组合的施用包括使用单独的制剂或单一药物制剂的共同施用， 和以任意顺序的连续施 用， 其中存在两种 ( 或全部 ) 活性剂同时发挥它们的生物学活性时的时期。
     此 类 组 合 疗 法 的 实 例 包 括 与 化 疗 剂 的 组 合， 所述化疗剂如厄洛替61102356092 A CN 102356102说赛 瓦明书59/79 页尼 (erlotinib)( 它 ( f u l v e s t r an t) 来 曲 唑 (letrozole) mesylate) (oxaliplatin)Genentech/OSI Pharm.)、 Millenium Pharm.)、 氟 维 斯 群 Ast raZe neca) 、s ut ent(S U1 1248 ，P fiz e r) 、 Novartis)、甲 磺 酸 伊 马 替 尼 (imatinib硼 替 佐 米 (bortezomib)Novartis)、 PTK787/ZK 222584(Novartis)、 奥 沙 利 铂 Sanofi)、 5-FU(5- 氟 尿 嘧 啶 (5-fluorouracil))、亚 叶 GSK572016， GlaxoSmithKline)、 氯那法 AstraZeneca)、 AG1478、 AG1571(SU 5271 ； Sugen)，酸 (leucovorin)、 雷 帕 霉 素 (Rapamycin)( 西 罗 莫 司 (Sirolimus)、 Wyeth)、 拉 帕 替 尼 (lapatinib) 非 替 尼 (gefitinib) 尼 (lonafarnib)(SCH 66336)、 索 拉 非 尼 (sorafenib)(BAY43-9006， Bayer Labs.) 和 吉 烷 化 剂 类 (alkylating agents)， 诸 如 塞 替 哌 (thiotepa) 和 环磷酰 胺 (cyclophosphamide) ； 烷 基 磺 酸 酯 (alkyl sulfonates)， 诸 如 白 消 安 (busulfan)、 英 丙 舒 凡 (improsulfan) 和 哌 泊 舒 凡 (piposulfan) ； 抗 叶 酸 剂 (antifolate) 抗 肿 瘤 诸 如 培 美 曲 塞 (pemetrexed) Eli Lilly)， 吖 丙 啶 类 (aziridines)，诸 如 苯 佐 替 派 (benzodopa)、 卡 波 醌 (carboquone)、 美 妥 替 哌 (meturedopa) 和 乌 瑞 替 哌 (uredopa) ； 乙 撑 亚 胺 类 (ethylenimines) 和 甲 基 蜜 胺 类 (methylamelamines)， 包 括 六 甲 蜜 胺 (altretamine)、 曲 他 胺 (triethylenemelamine)、 三乙烯硫代磷酸胺 (triethylenephosphoramide)、 三 乙 撑 硫 代 磷 酰 胺 (triethylenethiophosphoramide) 和 三 羟 甲 蜜 胺 (trimethylomelamine) ； 聚 乙 酸 类 (acetogenins)( 尤 其 是 布 拉 他 辛 (bullatacin) 和布拉他辛酮 (bullatacinone)) ； 喜树碱 (camptothecin)( 包括合成类似 物托泊替康 (topotecan) ； 苔藓抑素 (bryostatin) ； callystatin ； CC-1065( 包括其阿多 来新 (adozelesin)、 卡折来新 (carzelesin) 和比折来新 (bizelesin) 合成类似物 ) ； 隐 藻素类 (cryptophycins)( 特别是隐藻素 1 和隐藻素 8) ； 多拉司他汀 (dolastatin) ； 倍癌 霉素 (duocarmycin)( 包括合成类似物， KW-2189 和 CB1-TM1) ； 艾榴素 (eleutherobin) ； pancratistatin ； 匍 枝 珊 瑚 醇 (sarcodictyin) ； 海 绵 素 (spongistatin) ； 氮芥类 (nitrogen mustards)， 诸 如 苯 丁 酸 氮 芥 (chlorambucil)、 萘 氮 芥 (chlornaphazine)、 胆 磷 酰 胺 (cholophosphamide)、 雌 莫 司 汀 (estramustine)、 异 环 磷 酰 胺 (ifosfamide)、 氮 芥 (mechlorethamine)、盐 酸 氧 氮 芥 (mechlorethamine oxide hydrochloride)、 美 法 仑 (melphalan)、 新 氮 芥 (novembichin)、 苯 芥 胆 甾 醇 (phenesterine)、 泼尼莫司 汀 (prednimustine)、 曲 磷 胺 (trofosfamide)、 尿 嘧 啶 氮 芥 (uracil mustard) ； 亚硝 脲 类 (nitrosoureas)， 诸 如 卡 莫 司 汀 (carmustine)、 氯 脲 菌 素 (chlorozotocin)、 福 莫 司 汀 (fotemustine)、 洛 莫 司 汀 (lomustine)、 尼 莫 司 汀 (nimustine) 和 雷 莫 司 汀 (ranimnustine) ； 抗生素类， 诸如烯二炔类抗生素类， 加利车霉素 (calicheamicin)， 加利 车霉素 γ1I 和加利车霉素 ωI1 ； 烯二炔蒽环类抗生素 (dynemicin)， 包括烯二炔蒽环类 抗生素 A(dynemicinA) ； 二膦酸盐类 (bisphosphonates)， 诸如氯膦酸盐 (clodronate) ； 埃斯波霉素 (esperamicin) ； 以及新制癌菌素 (neocarzinostatin) 发色团和相关色蛋 白 烯 二 炔 类 抗 生 素 发 色 团、 阿 克 拉 霉 素 (aclacinomysins)、 放 线 菌 素 (actinomycin)、 氨茴霉素 (anthramycin)、 偶氮丝氨酸 (azaserine)、 博来霉素 (bleomycins)、 放线菌素C(cactinomycin)、 carabicin、 洋 红 霉 素 (carminomycin)、 嗜 癌 霉 素 (carzinophilin)、 色 霉 素 (chromomycinis)、 放 线 菌 素 D(dactinomycin)、 柔 红 霉 素 (daunorubicin)、 地 托 比 星 (detorubicin)、 6- 重 氮 基 -5- 氧 -L- 正 亮 氨 酸、 多柔比星 (doxorubicin)( 包括吗啉代多柔比星 (morpholino-doxorubicin)、 氰基吗啉代 - 多柔比星 (cyanomorpholino-doxorubicin)、 2- 吡 咯 啉 代 - 多 柔 比 星 (2-pyrrolino-doxorubicin) 和脱氧多柔比星 (deoxydoxorubicin))、 表柔比星 (epirubicin)、 依索比星 (esorubicin)、 伊 达 比 星 (idarubicin)、 马 塞 罗 霉 素 (marcellomycin)、 丝 裂 霉 素 类 (mitomycins) 诸 如 丝 裂 霉 素 C、 麦 考 酚 酸 (mycophenolic acid)、 诺 拉 霉 素 (nogalamycin)、 橄榄 霉 素 (olivomycins)、培 洛 霉 素 (peplomycin)、紫 菜 霉 素 (porfiromycin)、嘌 呤 霉 素 (puromycin)、三 铁 阿 霉 素 (quelamycin)、罗 多 比 星 (rodorubicin)、链 黑 霉 素 (streptonigrin)、 链 佐 星 (streptozocin)、 杀 结 核 菌 素 (tubercidin)、 乌苯美司 (ubenimex)、 净司他丁 (zinostatin)、 佐柔比星 (zorubicin) ； 抗代谢物类， 诸如甲氨喋呤 (methotrexate) 和 5- 氟尿嘧啶 (5-FU) ； 叶酸类似物， 诸如二甲叶酸 (denopterin)、 甲氨喋 呤 (methotrexate)、 蝶罗呤 (pteropterin)、 三甲曲沙 (trimetrexate) ； 嘌呤类似物， 诸如 氟达拉滨 (fludarabine)、 6- 巯基嘌呤 (mercaptopurine)、 硫咪嘌呤 (thiamiprine)、 硫鸟 嘌呤 (thioguanine) ； 嘧啶类似物， 诸如安西他滨 (ancitabine)、 阿扎胞苷 (azacitidine)、 6- 氮 尿 苷 (azauridine)、 卡 莫 氟 (carmofur)、 阿 糖 胞 苷 (cytarabine)、 双脱氧尿苷 (dideoxyuridine)、 去 氧 氟 尿 苷 (doxifluridine)、 依 诺 他 滨 (enocitabine)、 氟尿苷 (floxuridine) ； 雄激素类， 诸如卡鲁睾酮 (calusterone)、 丙酸屈他雄酮 (dromostanolone propionate)、 环 硫 雄 醇 (epitiostanol)、 美 雄 烷 (mepitiostane)、 睾 内 酯 (testolactone) ； 抗肾上腺类， 诸如氨鲁米特 (aminoglutethimide)、 米托坦 (mitotane)、 曲 洛 司 坦 (trilostane) ； 叶 酸 补 充 剂， 诸 如 亚 叶 酸 (frolinic acid) ； 醋葡醛内酯 (aceglatone) ； aldophosphamide glycoside ； 5- 氨 基 酮 戊 酸 (aminolevulinic acid) ； 恩 尿 嘧 啶 (eniluracil) ； 安 吖 啶 (amsacrine) ； bestrabucil ； 比 生 群 (bisantrene) ； 依 达 曲 沙 (edatraxate) ； defofamine ； 秋 水 仙 胺 (demecolcine) ； 地 吖 醌 (diaziquone) ； elfornithine ； 依利醋铵 (elliptinium acetate) ； epothilone ； 依托格鲁 (etoglucid) ； 硝 酸 镓 (gallium nitrate) ； 羟 脲 (hydroxyurea) ； 香 菇 多 糖 (lentinan) ； 氯尼达明 (lonidainine) ； 美登木素生物碱类 (maytansinoids)， 诸如美登素 (maytansine) 和安丝 菌 素 (ansamitocins) ； 米 托 胍 腙 (mitoguazone) ； 米 托 蒽 醌 (mitoxantrone) ； 莫哌达醇 (mopidanmol) ； 尼曲吖啶 (nitraerine) ； 喷司他丁 (pentostatin) ； 异丙嗪 (phenamet) ； 吡 柔比星 (pirarubicin) ； 洛索蒽醌 (losoxantrone) ； 鬼臼酸 (podophyllinic acid) ； 2- 乙 基 酰 肼 (2-ethylhydrazide) ； 丙 卡 巴 肼 (procarbazine) ； 多 糖 复 合 物 (JHS 天 然 产物， Eugene， OR) ； 雷佐生 (razoxane) ； 利索新 (rhizoxin) ； 西佐喃 (sizofiran) ； 锗螺 胺 (spirogermanium) ； 细交链孢菌酮酸 (tenuazonic acid) ； 三亚胺醌 (triaziquone) ； 2， 2’ ， 2” - 三 氯 三 乙 胺 (2， 2’ ， 2” -trichlorotriethylamine) ； 单端孢霉烯族化合物 (trichothecenes)( 尤其是 T-2 毒素、 verracurin A、 杆孢菌素 (roridin)A 和蛇形菌素 (anguidine)) ； 乌拉坦 (urethan) ； 长春地辛 (vindesine) ； 达卡巴嗪 (dacarbazine) ； 甘 露莫司汀 (mannomustine) ； 二溴甘露醇 (mitobronitol) ； 二溴卫矛醇 (mitolactol) ； 哌 泊溴烷 (pipobroman) ； gacytosine ； 阿糖胞苷 (arabinoside)(“Ara-C” )； 环磷酰胺 ； 塞替 派 (thiotepa) ； 紫 杉 烷 类 化 合 物 (taxoid)， 例 如 紫 杉 醇 (paclitaxel) Bristol-Myers Squibb Oncology， Princeton， N.J.)、无 克 列 莫 佛 (Cremophor) 的 TM ABRAXANE 、 紫杉醇的白蛋白改造的纳米颗粒制剂 (American Pharmaceutical Partners， Schaumberg， Illinois)、和 多 西 他 塞 (doxetaxel) Rorer， Antony， France) ；苯 丁 酸 氮 芥 (chloranbucil) ； 吉 西 他 滨 (gemcitabine) ； 6- 硫 鸟 嘌 呤 (thioguanine) ； 巯 嘌 呤 (mercaptopurine) ； 甲 氨 蝶 呤 (methotrexate) ； 铂 类 似 物 如 顺 铂 (cisplatin) 和 卡 铂 (carboplatin) ； 长春 碱 (vinblastine) ；铂 (platinum) ；依 托 泊 苷 (etoposide)(VP-16) ；异 环 磷 酰 胺 (ifosfamide) ； 米 托 蒽 醌 (mitoxantrone) ； 长 春 新 碱 (vincristine) ； 长 春 瑞 滨 (vinorelbine) ； 诺 安 托 (novantrone) ； 替 尼 泊 苷 (teniposide) ； 依达曲沙 (edatrexate) ； 道 诺 霉 素 (daunomycin) ； 氨 基 蝶 呤 (aminopterin) ； 希 罗 达 (xeloda) ； 伊 本 膦 酸 盐 (ibandronate) ； CPT-11 ； 拓 扑 异 构 酶 抑 制 剂 RFS 2000 ； 二氟甲基鸟氨酸 (difluoromethylornithine)(DMFO) ； 类 视 黄 酸 类 (retinoids) 如 视 黄 酸 (retinoic acid) ； 卡培他滨 (capecitabine) ； 和上述任一种的药用盐， 酸或衍生物。
     所述组合疗法还包括 ： (i) 抗激素剂， 其作用于调节或抑制激素对肿瘤的作用如 抗 - 雌激素和选择性雌激素受体调节剂 (SERMs)， 包括， 例如他莫昔芬 (tamoxifen)( 包 括 他莫昔芬 )、 雷洛昔芬 (raloxifene)、 屈洛昔芬 (droloxifene)、 4- 羟 基 他 莫 昔 芬、 曲 沃 昔 芬 (trioxifene)、 keoxifene、 LY117018、 奥 那 司 酮 (onapristone) 和 FARESTON· 托瑞米芬 (toremifene) ； (ii) 抑制芳香酶的芳香酶抑制剂， 其调节肾上 腺中的雌激素产生， 如例如， 4(5)- 咪唑、 氨鲁米特 (aminoglutethimide)、 醋 酸 甲地 孕酮 (megestrol acetate)、 益西美 坦 (exemestane)、 福美坦 (formestanie)、 法倔唑 (fadrozole)、 伏氯唑 (vorozole)、 来曲 唑 (letrozole) 和 阿那曲唑 (anastrozole) ； (iii) 抗 - 雄激素如氟他胺 (flutamide)、 尼鲁米特 (nilutamide)、 比卡鲁胺 (bicalutamide)、 亮丙立德 (leuprolide) 和戈舍瑞林 (goserelin) ； 以及曲沙他滨 (troxacitabine)(1， 3- 二氧戊环核苷胞嘧啶类似 物)； (iv) 蛋白激酶抑制剂 ； (v) 脂质激酶抑制剂 ； (vi) 反义寡核苷酸， 特别是抑制在涉及 异常细胞增殖的信号传导途径中基因的表达的那些， 如例如 PKC-α， Ralf 和 H-Ras ； (vii) 核酶如 VEGF 表达抑制剂 ( 例如， 核酶 ) 和 HER2 表达抑制剂 ； (viii) 疫 苗如基因治疗疫苗， 例如 疫苗， 疫苗和 疫苗 ； rIL-2 ； 拓扑异构酶 1 抑制剂 ； rmRH ； (ix) 抗生血管药剂如贝伐珠单抗 Genentech) ； 和 (x) 上述任一种的药用盐、 酸或衍生物。
     关于所述化疗剂的制备和给药时间表可以根据生产商的说明书使用或由熟练的 从业者根据经验确定。关于所述化疗法的制备和给药时间表也在 Chemotherapy Service， (1992)Ed.， M.C.Perry， Williams & Wilkins， Baltimore， Md 中进行描述。
     组合疗法可以提供 “协同性” 并证实 “协同作用” ， 即一起使用活性成分时获得的作 用大于由单独使用化合物获得的作用的总和。当活性成分 (1) 共同配制和施用或在组合的 单位剂量制剂中同时递送 ； (2) 交替地或平行地作为单独的制剂递送 ； 或 (3) 通过一些其他 方案时， 获得协同作用。当在交替疗法中递送时， 当顺序施用或递送所述化合物 ( 例如通过在单独的注射器中不同的注射 ) 时， 获得协同作用。一般地， 在交替疗法过程中， 每种活性 成分的有效剂量顺序地， 即连续地进行施用， 而在组合疗法中， 将两种以上的活性成分的有 效剂量一起施用。
     制品和试剂盒
     本发明另一个实施方案是制品， 其含有在治疗癌症中有用的材料。该制品包括容 器和在容器上或与容器一起的标签或包装说明书 (package insert)。适合的容器包括， 例 如， 瓶子、 小瓶、 注射器等。所述容器可以由各种材料诸如玻璃或塑料制成。容器装有对于 所述疾患的治疗有效的组合物， 并且可以具有无菌的存取口 ( 例如， 所述容器可以是具有 可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶 )。组合物中至少一种活性试剂是本发 明的多特异性抗体或抗体片段。标签或包装说明书标明该组合物是用于治疗特定的病症。 标签或包装说明书还包括向患者施用抗体组合物的说明书。 也考虑了包含本文描述的联合 治疗的制品和试剂盒。
     包装说明书是指常规地在治疗产品的商业化包装中包含的说明书， 其含有关于适 应症、 用法、 剂量、 施用、 禁忌症和 / 或关于使用此类治疗产品的警告的信息。在一个实施方 案中， 包装说明书标明该组合物是用于治疗实体瘤， 如例如， 结肠直肠癌、 肺癌、 和 / 或乳腺 癌。
     另外， 制品可以进一步包括第二容器， 其中装有制药学可接受的缓冲液， 例如抑菌 性注射用水 (BWFI)、 磷酸盐缓冲盐水、 林格氏溶液和右旋糖溶液。 它可以进一步包括从商业 和用户立场出发所需的其它材料， 包括其它的缓冲剂、 稀释剂、 滤器、 针和注射器。
     还提供多种目的中有用的试剂盒， 例如从细胞中纯化或免疫沉淀 HER 受体。为分 离和纯化 EGFR 和 / 或 HER2 和 / 或 HER3 和 / 或 HER4， 该试剂盒可含有偶联至珠子 ( 例如 珠子 ) 的 EGFR/HER2 和 / 或 EGFR/HER3 和 / 或 EGFR/HER4 抗体。可提供试 剂盒， 其含有用于体外 ( 例如在 ELISA 或蛋白质印迹中 ) 检测和定量所需 HER 受体的抗体。 如同制品中一样， 该试剂盒包含容器和伴随该容器或在容器上的标签或说明书。该容器装 有包含至少一种本发明的多特异性抗体或抗体片段的组合物。可包括另外的容器， 该容器 含有， 例如， 稀释剂和缓冲剂或对照抗体。 标签或说明书可提供对组合物的描述以及对预期 的体外或诊断用途的说明。 认为前文的书面描述足以使本领域技术人员实施本发明。 提供下述实施例仅为了 举例说明目的， 无意以任何方式限制本发明的范围。事实上， 根据前文描述， 对本文显示和 描述的发明以外的多种修改对本领域技术人员来说是明显的并落入所附权利要求的范围。
     除非另有说明， 实施例中提及的商业上可获得的试剂根据生产商的说明书使用。 在以下实施例中及在整个说明书中以 ATCC 登记号鉴定的那些细胞的来源是美国典型培养 物保藏中心 (American Type CuIture Collection， Manassas， VA)。除非另有说明， 本发 明使用重组 DNA 技术的标准程序， 如上文描述的和下述教科书中的那些 ： Sambrook 等人， 见上文 ； Ausubel 等人， Current Protocols in Molecular Biology( 现代分子生物学实验 方案 )(Green Publishing Associates and Wiley Interscience， N.Y.， 1989) ； Innis 等 人， PCR Protocols ： A Guide to Methods and Applications(PCR 实验方案 ： 方法和应用 指南 )(Academic Press ( 学术出版社 )， Inc. ： N.Y， 1990) ； Harlow 等人， Antibodies ： A Laboratory Manual ( 抗体 ： 实验室手册 )( 冷泉港出版社 (Cold Spring Harbor Press)) ：
     冷泉港， 1988) ； Gait， Oligonucleotide Synthesis ( 寡核苷酸合成 )(IRL Press ： Oxford， 1984) ； Freshney， Animal Cell Culture ( 动物细胞培养 )， 1987 ； Coligan 等人， Current Protocols in Immunology( 现代免疫学学实验方案 )， 1991。 实施例 实施例 1
     分离和表征结合人 EGFR 的抗体
     材料
     酶和 M13-KO7 辅助噬菌体购自 New England Biolabs( 新英格兰生物实验室 )。 大 肠杆菌 (E.coli)XL1-Blue 来自 Stratagene。牛血清清蛋白 (BSA)、 卵清蛋白、 和吐温 20 购 自 Sigma( 西格玛 )。Neutravidin、 酪蛋白、 和 Superblock 购自 Pierce。抗 M13 缀合的辣 根过氧化物酶 (HR) 购自 Amersham Pharmacia。Maxisorp 免疫板购自 NUNC(Roskilde， 丹 麦 )。四甲基联苯胺 (TMB) 底物购自 Kirkegaard 和 Perry 实验室 (Gaithersburg， MD)。
     文库构建
     噬菌体展示抗体文库基于来自人源化的 4D5(h4D5， 曲妥珠单抗 ) 的人抗体构架产 生， 其中侧链和长度多样性在第一文库 ( 文库 1) 中引入到重链互补决定区 (CDR1， CDR2， CDR3)， 在第二文库 ( 文库 2) 中引入到重链 CDRs 和轻链 CDR3 中， 仍然集中于重链中的多样 化， 如所描述的 (Lee 等， J.Mol.Biol( 分子生物学杂志 )， 340 ： 1073-1093(2004))。文库如 所描述的进行构建 (Lee 等， J.Mol.Biol( 分子生物学杂志 )， 340 ： 1073-1093(2004))， 除了 所使用的简并寡核苷酸进行了适当修饰。
     两个文库的分选
     文库 1 和文库 2 直接进行靶标 (hEGFR-ECD-Fc( 人 EGFR 胞外结构域融合到人 IgG1 的 Fc 区 ) 和 EGFRvIII-Fc) 结 合 选 择。EGFRvIII-Fc 蛋 白 是 EGFR 的 变 体， 缺失大 部分结构域 II(E1-P353( 不包括信号肽 ))， 融合到 hIgG1 的 Fc 区。参见 Kuan， C-T， 等， Endocrine-Related Canc.8 ： 83-96(2001) ； Bigner， S H， 等， Cancer Research( 癌症研究 )， 50 ： 8017-8022(1990)。96 孔 Nunc Maxisorp 板用 PBS(0.05M Sodium Carbonate buffer， pH9.6) 中 100μl/ 孔 的 靶 抗 原 (hEGFR-ECD-Fc， EGFRvIII-Fc)(5μg/ml) 在 4 ℃ 包 被 过 夜或在室温包被 2 小时。该板用交替封闭试剂进行封闭。在第一轮选择中， 1013 噬菌体 / ml(3-5OD/ml) 的噬菌体溶液与包被的抗原温育 18h。在每轮选择中噬菌体输入如下降低 ： 第一轮 3-5O.D/ml， 第二轮 3O.D/ml， 第三轮 0.5 ～ 1O.D/ml 和第四轮输入 0.1 ～ 0.5O.D/ ml。 稀释的噬菌体在冰上温育 30 分钟。 1μM 的 Fc- 融合蛋白添加到来自第三轮的封闭的噬 菌体中以去除 Fc 结合物。噬菌体溶液 (100μl/ 孔至 8 个靶抗原包被的孔和 2 个未包被的 孔 ) 在免疫板上温育以允许结合固定的抗原 ( 对于第一轮过夜， 对于剩余的轮次进行 2 小 时 ) 之后， 用 PBS 和 0.05％ Tween 20 连续洗涤免疫板至少 10 次。结合的噬菌体用 100ul/ 孔的 100mM HCl 室温洗脱 20 分钟。洗脱的噬菌体 ( 来自包被的孔 ) 和背景噬菌体 ( 来自 未包被的孔 ) 通过添加 1/10 体积的 1M Tris pH 11.0 和 BSA 至最终 0.1％进行中和。计算 噬菌体回收 / 抗原包被免疫板孔， 并与无包被抗原的封闭孔进行比较， 以研究展示特异性 结合靶抗原的 Fabs 的噬菌体克隆的富集。洗脱的噬菌体在大肠杆菌中扩增并用于下轮选 择。
     高通量表征 hFGFR 结合克隆
     来自第 4 轮的随机克隆被选择以进行筛选， 并利用噬菌体 ELISA 来测定， 其中将与 靶标和抗 gD 的结合与无关蛋白 (BSA， HER2， 抗 EGFR 抗体， 曲妥珠单抗 ) 的结合进行比较。
     384 孔形式的免疫板包被以 1μg/ml 的靶标， 抗 gD 和无关蛋白质， 4℃过夜或室温 2 小时， 并用 PBS 中 1％ BSA 封闭 1h。大肠杆菌 XL1-Blue 中的噬菌粒克隆在增补了羧苄西 林 (carbenicillin) 和 M13-KO7 辅助噬菌体的 150μl 的 2YT 肉汤中生长 ； 该培养物在 96 孔形式中在 37℃摇动生长过夜。包含噬菌体的培养物上清在 PBST( 具有 0.05％吐温 20 和 0.5％ (w/v)BSA 的 PBS) 中稀释 5 倍。30μl 的混合物添加到 384- 孔包被板的每个象限并 在室温下温育 1 小时。该板用 PBT( 具有 0.05％吐温 20 的 PBS) 洗涤并与在 PBST 中稀释 5000 倍达到 1nM 的抗 M13 抗体辣根过氧化物酶缀合物一起温育 30 分钟。将该板洗涤， 用 TMB 底物显色约 5 分钟， 用 1.0M H3PO4 猝灭， 并在 450nm 处通过分光光度法读数。
     结合抗 gD 抗体和靶标但是不结合非特异性蛋白质的克隆被认为是特异性阳性。 VH 文库允许分离对于 EGFR-ECD-Fc 和 EGFRvIII-Fc 两者的特异性结合物。
     溶液结合竞争 ELISA
     选择的结合克隆的结合亲和力通过溶液结合竞争 ELISA 确定。
     在 大 肠 杆 菌 XL1-Blue 中 选 择 的 噬 菌 粒 克 隆 在 补 充 了 羧 苄 青 霉 素 (carbenicillin)、 卡那霉素 (kanamycin) 和 M13-KO7 辅助噬菌体的 20ml 2YT 肉汤中生长 ； 培养物在 30℃振荡过夜生长。噬菌体的上清液在 20％ PEG/2.5M NaCl 中两次沉淀进行纯 化， 在 PBS 中重新悬浮， 在 268nM 分光光度计读数用于浓度确定 ( 以 OD/ml)。
     纯化的噬菌体在用 1μg/ml 的 hEGFR-ECD-Fc 包被的免疫板上滴定， 以确定溶液竞 争 ELISA 的最优浓度。
     提供在 450nM 处 1OD/ml 信号的稀释物用于溶液结合测定中， 其中噬菌体首先与渐 增浓度的抗原 (hEGFR-ECD) 一起温育一小时并然后转移至抗原包被的免疫板 15 分钟， 以捕 获未结合的噬菌体。 IC50 计算为抑制 50％噬菌体结合固定抗原的溶液结合阶段中抗原的浓 度。溶液结合竞争 ELISA 在室温进行。选择的克隆的 IC50 值范围为 36.2nM 至＞ 1000nM。
     噬菌体展示 F(ab)zip 转变为人 IgG
     为精确确定亲和力、 特异性和其它性质， 选择的克隆作为游离 hIgG 表达。
     轻链和重链的可变结构域克隆到以前设计的用于在哺乳动物细胞中瞬时人 IgG 表达的载体中。(Leet 等， J.Mol.Biol.( 分子生物学 )23 ： 340 ： 1073-1093(2004))。
     噬 菌 粒 DNA 的 VL 区 用 限 制 酶 消 化， 所 述 限 制 酶 切 割 编 码 CDR L1 的 区 的 上 游 (EcoRV) 和编码 CDR L3 的区的下游 (KpnI) 的 DNA。
     噬菌粒 DNA 的 VH 区用限制酶消化， 所述限制酶切割编码 CDR H1 的区的上游 (ApaI) 和编码 CDR H3 的区的下游 (BsiwI) 的 DNA。
     分泌的游离 IgG 用蛋白质 A 亲和色谱纯化并在直接结合 ELISA 中在 hEGFR 包被的 免疫板上测试。
     抗 hEGFR 表位的比较
     为了确定被抗 hEGFR 抗体识别的表位， 研究了分离的抗 EGFR 抗体与另一个已知结 合 EGFR 的结构域 III 的抗 hEGFR 抗体竞争的能力。
     测 定 以 竞 争 ELISA 形 式 进 行。 对 于 竞 争 ELISA， EGFR-ECD-Fc 以 2μg/ml 固定于 Maxisorp 免疫板上。固定浓度的抗 EGFR 抗体 ( 或非特异性抗体对照 ) 被包被的 EGFR-ECD-Fc 捕获， 添加纯化的选择的抗 EGFR 噬菌体 -Fabs， 用 α-M13- 缀合的 HRP 检测。 被阻断结合 EGFR-ECD-Fc 包被的板的抗体可能共享重叠的表位。
     对于 TGF-α 竞争 ELISA， EGFR-ECD-Fc 首先被包被的抗人 Fc 抗体捕获， 然后固定 浓度的 TGF-α 被 EGFR-ECD-Fc 捕获。添加纯化的噬菌体 -Fabs， 用 α-M13- 缀合的 HRP 检 测。
     最后， 评估选择的克隆与具有 EGFR 暴露和缺失的结构域的构建体的结合， 以确认 以前的竞争 ELISA。 指定为 D1 的克隆与抗 EGFR 抗体竞争， 并且可能在结构域 III 结合 EGFR。
     实施例 2
     表征针对人表皮生长因子受体的抗体
     抑制配体结合
     为了确定选择的抗 EGFR 抗体 D1 是否抑制 125I-EGF 与 H1666 细胞 (ATCC CRL-5885， Manassas， Va.) 的结合， 纯化的 IgGs 形式的 D1 在如下的配体结合测定中测试。H1666 细胞 在 12 孔板中铺板。次日去除生长培养基， 用 200nM 抗体在室内 RT 预处理细胞 2 小时。添 加 20μl/ 孔放射性标记的 EGF( 使用浓度低于细胞系的 Kd)， 细胞在室温处理另外 2 小时。 细胞用结合缓冲液洗涤并溶解、 转移， 样品使用 iso Data γ- 计数器计数。未标记的 EGF 用作冷竞争剂 (cold competitor)。结果证明 D1 抑制 125I-EGF 配体结合 H1666 细胞。
     在稳定转染的 EGFR-NR6 细胞中抑制 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化
     为了确定抗 EGFR 抗体 D1 是否选择性阻断 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化， 对稳定转染 的 EGFR-NR6 细胞血清饥饿 2-3 小时， 并与多种浓度的 D1 预温育 2 小时。 细胞用 1nM TGF-α 刺激。全细胞溶胞产物进行 SDS-PAGE 分析， 免疫印迹用抗磷酸酪氨酸探测， 抗 EGFR 作为装 载对照。商购的抗 EGFR 抗体用作阳性对照。数据证明在基于细胞的测定中 D1 抑制 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化。
     实施例 3
     D1 的亲和力成熟
     文库构建
     使用寡核苷酸定向诱变产生两个噬菌体展示文库 (L3/H3 和 L3/H1H2 文库 )， 如所 描述的 (Lee 等， Blood( 血液 )， 108， 3103-3111， 2006)。 文库模板载体含有植入 CDR-L3 中的 终止密码子 (TAA)， 其在诱变反应中使用与编码 CDR-L3( 所有文库 )， CDR-H3(L3/H3 文库 )， CDR-H2 和 CDR H1(L3/H1H2 文库 ) 的序列退火的简并寡核苷酸修复。文库诱变反应根据 Kunkel 等， (Methods Enzymol.( 酶学方法 )1987 ； 154 ： 367-82) 的方法进行。 寡核苷酸以不 同比例组合以便精细调节多样性从而反应在所选择的位置天然库 (natural repertoire) 中氨基酸的频率。汇合诱变产物成一个反应 / 文库， 电穿孔至大肠杆菌 SS320 细胞中， 在补 充了 KO7 辅助噬菌体中生长， 如所描述的 (Lee 等， 2004， 见上文 )。
     文库分选和筛选
     对于亲和力改善选择， 噬菌体文库第一轮针对 hEGFR-ECD-Fc 进行板分选， 随后进 行三轮溶液分选。
     进行三轮增加选择严格性的溶液分选。 免疫板用 5ug/ml 的 Neutravidin 在 4℃包 被过夜， 并用 Superblock(Pierce) 和 PBST 封闭。3-5OD/ml 繁殖的噬菌体与 100nM 的生物素化的 EGFR-ECD 在 Superblock 中预温育， 然后稀释 10x 并添加到封闭的免疫板中 5-10 分 钟。洗涤板 8 次， 洗脱噬菌体并繁殖， 用于次轮溶液分选， 降低噬菌体输入 (0.5OD/ml) 和生 物素化的 EGFR-ECD 的浓度至 1nM。
     高通量亲和力筛选 ELISA( 单点竞争 )
     挑选来自溶液分选最后一轮的随机克隆用于筛选并使用噬菌体单点竞争 ELISA 测定， 其中比较与 hEGFR-ECD 预温育 ( 或不预温育 ) 的噬菌体上清液和靶标的结合。
     大肠杆菌 XL1-Blue 中的噬菌粒克隆在 150ul 补充了羧苄青霉素和 M13-KO7 辅助 噬菌体的 2YT 肉汤中生长 ； 培养物在 96 孔格式中在 37℃振荡生长过夜。含有噬菌体的培 养物上清液在 PBST( 具有 0.05％ Tween 20 和 0.5％ (w/v)BSA 的 PBS)， 伴有或不伴有 5nM EGFR-EC 中稀释五倍。通过下述方程计算 OD 降低 (％ ) ：
     OD450nm 降 低 ( ％ ) ＝ ( 具 有 竞 争 剂 的 孔 的 OD450nm)/( 不 具 有 竞 争 剂 的 孔 的 OD450nm)*100
     OD 降低大于 25％的克隆选择用于溶液结合竞争 ELISA。
     溶液结合竞争 ELISA
     通过单点 ELISA 选择的结合克隆的结合亲和力通过溶液结合竞争 ELISA 确定， 如 上所述。
     从 D1 母体克隆亲和力成熟 (D1.5) 选择的一个克隆的噬菌体 ICS0s 如上所述进行 确定。D1.5 的 IC50 是 0.39nM。D1.5 重新格式化 (reformatted) 成 mIgG2A 用于进一个表 征， 使用上文描述的相同限制位点和设计用于哺乳动物中瞬时鼠 IgG 表达的载体。
     实施例 4
     表征作为游离 mIgG 的抗 EGFR 改善抗体
     BIAcore 测量
     在 BIAcoreTM-2000 上的表面等离子共振测定用于确定抗 EGFRmIgG2A 的亲和力。 在 BIAcore 测定中使用在 CM5 芯片上～ 150 反应单位 (RU) 的固定的 mIgG D1.5。从 12.5nM 至 200nM 增加浓度的 EGFR-ECD 以 30μl/min 在 25℃注射。结合反应通过从空白流动细胞 中减去 RU 来校正。对于动力学分析， 使用 kon 和 koff 同时拟合的 1 ∶ 1 Languir 模型。通 过这种方法确定的 D1.5 的 KD 是 1.2nM。
     表位定位
     评估选择的克隆对具有 EGFR 暴露和缺失的结构域的构建体的结合， 以确认从母 体克隆继承的结合表位。从 D1 分选中选择的亲和力改善克隆， D1.5， 在结构域 III 结合 EGFR。
     在 EGFR-NR6 细胞中抑制 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化
     测试 D1.5 以确定其是否以与母体克隆相比更高的效力抑制 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化。所述抗体在 EGFR-NR6 细胞上测试， 该测定如上文实施例 2 中的描述进行。商购的 抗 EGFR 抗体用作阳性对照。
     结果证明， 当与母体克隆 D1 相比时， D1.5 显示对配体诱导的 EGFR 磷酸化更大的 抑制。
     在 H1666 细胞中抑制细胞增殖
     进行测定以确定 D1.5 是否抑制 NSCLC 癌细胞系 H1666 的细胞增殖， 该细胞系以中等水平表达 EGFR、 HER2 和 HER3。H1666 细胞 (ATCC CRL-5885， Manassas， Va.) 以 5000 细胞 的密度接种于 96 孔板中。次日， 细胞用含 1％血清培养基中不同浓度的抗体 ( 多至 50ug/ ml) 同时处理。3 天后， 添加 Alamar Blue 并使用荧光计检测荧光。结果以 RFUs 表达。
     结果证明 D1.5 显示比 D1 更大的细胞生长抑制。
     A431 异种移植研究
     A431 异种移植模型用于验证亲和力成熟的抗 EGFR 抗体 D1.5 的体内功效。A431 细胞是 EGFR 扩增的， 对抗 EGFR 试剂反应非常好。研究在 nu/nu 小鼠中进行， 商购的抗 EGFR 抗体用作参照。
     在 第 一 步 中， D1.5 与 鼠 EGFR 的 交 叉 反 应 性 在 竞 争 ELISA 中 评 估。 免 疫 板 用 hEGFR-ECD-Fc 包被。连续稀释的 mEGFR-ECD-Fc 与固定浓度的 D1.5 温育。结果显示 D1.5 与鼠 EGFR 交叉反应。为了评估体内功效研究所需的剂量， D1.5 首先以单剂量 (50mg/kg) 注射， 并且通过 ELISA 测量血清 IgG 浓度。D1.5 被更快清除， 注射七天后见到降低的浓度。 功效研究 (A431 异种移植模型 ) 揭示 D1.5 完全抑制肿瘤生长。在 50mg/kg D1.5 与抗 EGFR 抗体一样有效。在更低剂量组 (25mg/kg) 其降低的效力是由于抗体的更快清除。( 图 1)
     实施例 5
     轻链文库设计和筛选双特异性抗体
     文库设计和构建
     设计基于 D1.5 模板的文库用于多样化抗体轻链的氨基酸组成和 CDR 长度。定制 一个亚组的随机化位置， 用于代表这些位点天然库一部分的氨基酸， 而剩余位点进行随机 化以包括所有 20 种天然存在的氨基酸。此外， 定制 CDR L3 中的随机化位置， 并且使其偏向 模板的天然序列， 因为这一 CDR 被认为对于 D1.5 的结合是重要的。对于 CDR L1， 每个长度 对于位置 28-33 是含三个寡核苷酸的密码子的混合物。对于更长的 L1， NNK 插入在位置 30 和 31 之间。
    
    对于 CDR L2， 1 ∶ 1 ∶ 2 ∶ 10 混合四种寡核苷酸。
    N ＝ A/C/G/T， D ＝ A/G/T， V ＝ A/C/G， B ＝ C/G/T， H ＝ A/C/T， K ＝ G/T， M ＝ A/C，R ＝ A/G， S ＝ G/C，
     W ＝ A/T， Y ＝ C/T.
     *G70A70C70 允许 70％的指定核苷酸和 10％的其它三种中的每种， 以编码大约 50％ Glu 和 50％的其它氨基酸。参见美国专利公开 20080069820 和 Bostrom， J. 等， Science( 科 学 )323 ： 1610-1614(2009)。
     CDR L3 的多样性源自下述寡核苷酸的混合物。D1.5CDR_L3 寡核苷酸
     F693 ACTTATTAC TGT CAG CAA 878 NNK 776 RST CCT TAC ACG TTC GGA(SEQ ID ： 70)
     F694 ACTTATTAC TGT CAG CAA 878 TAC 776 RST CCT TAC ACG TTC GGA(SEQ ID ： 71)
     F695 ACTTATTAC TGT CAG CAA DGG NNK 776 577 CCT TAC ACG TTC GGA(SEQ ID ： 72)
     F696 ACTTATTAC TGT CAG CAA KMT NNK 776 577 CCT TAC ACG TTC GGA(SEQ ID ： 73)
     F697 ACTTATTAC TGT CAG CAA 878 NNK 776 NNK CCT TAC ACG TTC GGA(SEQ ID ： 74)
     F698 ACTTATTAC TGT CAG CAA DGG NNK NNK RST CCT TAC ACG TTC GGA(SEQ ID ： 75)
     F699 ACTTATTAC TGT CAG CAA KMT NNK NNK RST CCT TAC ACG TTC GGA(SEQ ID ： 76)
     5 ＝ 70％ A， 6 ＝ 70％ G， 7 ＝ 70％ C， 8 ＝ 70％ T(10％为剩余三种核苷酸 )
     在所有文库中， 重链与母体克隆序列保持恒定。所有文库模板含有植入 CDR L1 的 终止密码子， 防止在噬菌体展示抗体文库成员中存在模板轻链。
     文库通过诱变法 (Kunkel 诱变 ) 构建， 使用含有终止密码子的单链 DNA 模板， 用于 同时与三个 CDR L1， L2 和 L3 的寡核苷酸组退火。来自诱变的文库 DNA 通过电穿孔转化至 细菌细胞株 SS320 并且与辅助噬菌体 KO7 一起生长。通过检测轻链 C 末端的 gD 标签评价 来自构建文库的单集落关于展示水平和关于在单点 ELISA 形式中对初级抗原 (EGFR) 结合 的保留。 平均 35％的来自 D1.5 文库的评价的单集落显示高水平的展示并保留 EGFR 结合性 质。
     文库分选和对双重特异性克隆分离的筛选
     文库进行与作为捕获靶标的抗 gD 抗体的初轮结合选择， 以去除其中 Fab 基因已 经缺失或未表达的克隆， 以及与 hEGFR-ECD-Fc 的结合选择， 随后是 4 轮铺板抗原的选择 (HER2-ECD， HER2-ECD-Fc， HER2-I-III-Fc， HER3-ECD-Fc， HER4-ECD-Fc( 每种情况中融合构 建体中的 Fc 是来自 hIgG1 的补体结合片段 )。 备选地， 它们直接进行靶标结合选择， 而不进 行与抗 gD 和 hEGFR-ECD-Fc 的预选择。
     每轮板选择如以前实施例 3 中描述的进行。选择来自第 3 轮和第 4 轮的随机克隆 用于筛选并使用噬菌体 ELISA 测定， 其中将对靶标和抗 gD 的结合与对不相关蛋白质 (BSA) 的结合进行比较用于检查非特异性结合。认为结合抗 gD 抗体和靶标但是不结合非靶标蛋 白对照 ( 诸如牛血清白蛋白， 其它 IgGs) 的克隆是特异性阳性的。
     阳性克隆的轻链可变结构域区通过 PCR 扩增并测序。阳性特异性结合物的 DNA 序列分析揭示对 EGFR 和 HER2 两者的 1 个独特结合物 (D1.5-201(SEQ ID NO ： 36))， 对 EGFR 和 HER3 两者的 7 个独特结合物， (D1.5-100(SEQ ID NO ： 40)， D1.5-103(SEQ ID NO ： 41)， D1.5-113(SEQ ID NO ： 42)， D1.5-115(SEQ ID NO ： 43)， D1.5-116(SEQ ID NO ： 44)， D1.5-121(SEQ ID NO ： 45)， D1.5-122(SEQ ID NO ： 46))， 对 EGFR 和 HER4 两者的 1 个独特结 合物 (D1.5-400， (SEQ ID NO ： 39))。
     九个双特异性克隆中的八个保留了 HVR L3 中位置 93 的脯氨酸， 由于这一位置采用脯氨酸 ( 与位置 96 的酪氨酸 ) 与其母体克隆 D1 相比显著增加 D1.5 对 EGFR 的亲和力， 可能它在保留对 EGFR 的结合中有贡献。
     评价双特异性 hEGFR/HER2， hEGFR/HER3， hEGFR/HER4 噬菌体克隆的特异性
     为了确定具有双重活性的九个克隆是否特异于它们的同族靶标， 评价了它们在直 接板 ELISA 形式中对一组抗原的结合。
     2μg/ml 的数种蛋白在 4℃过夜包被于免疫板上。板用 PBST 中 1％ BSA 封闭， 如在 实施例 1 中的描述所生长的噬菌体 -Fab 上清液的稀释物施加到板上 30 分钟。
     洗涤板， 记录结合信号并分析， 如实施例 1 所述。结果显示所有具有双重特异性的 克隆特异于它们的同族靶标。克隆 D1.5-4 和母体克隆 D1.5 用作对照。( 图 2)
     实施例 6
     表征作为游离 mIgG 的具有双重特异性的抗体
     所有具有双重特异性的克隆重新格式化成 mIgG 2A 用于进一步表征， 使用如上描 述的相同限制位点， 以及以前设计用于在哺乳动物细胞中瞬时鼠 IgG 表达的载体。
     抑制 EGFR-NR6 细胞中 TGF-αl 诱导的 EGFR 磷酸化
     为确定七个选择的具有双重特异性的抗体是否阻断 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化， 稳定转染的 EGFR-NR6 细胞如实施例 2 所述进行处理。 图 3 中的数据证明 EGFR/HER3 和 EGFR/ HER2 抗体在高浓度抑制 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化。商购的抗 EGFR 抗体用作阳性对照。
     对克隆 D1.5-100 和 D1.5-103 的剂量反应显示克隆 D1.5-100 丧失了其母体克隆 (D1.5) 抑制 EGFR 磷酸化的高效力。然而， D1.5-103 在这个测定中具有与 D1.5 相似的效 力。
     通过抗 EGFR/HER3 抗体抑制调蛋白结合 HER3
     为确定选择的抗 EGFR/HER3 抗体是否能够抑制调蛋白结合 HER3-ECD-Fc 蛋白， 纯 化的 IgGs 在放射性标记的配体结合测定中进行测试。
     结合测定在 Nunc 可拆条 (break-apart strip) 的孔中进行。 板子在 4℃用 100μl 的 5mg/mL 山羊抗人 Ab 在 50mM 碳酸盐缓冲液 (pH 9.6) 中包被过夜。板子用洗涤缓冲液 (PBS/0.005％ Tween20) 冲洗两次并用 100μl 1％ BSA/PBS 封闭 30min。去除缓冲液， 每孔 与 200ng 的 HER3-ECD-Fc 在 1％ BSA/PBS 中温育 1.5h。用洗涤缓冲液冲洗板子三次， 在 1％ 125 BSA/PBS 中的抗体在 4℃预结合 HER3-IgG 过夜。添加 I-HRG， 板子在室温温育 2 小时。冲 洗板子三次， 单个孔用 100 系列 Iso Dataγ- 计数器计数。( 图 4)。结果证明所有七个对 EGFR 和 HER3 具有双重特异性的抗体能够抑制调蛋白结合 HER3-ECD-Fc。
     通过抗 EGFR/HER4 抗体抑制调蛋白结合 HER4
     为 了 确 定 选 择 的 抗 EGFR/HER4 抗 体 D1.5-400 是 否 能 够 抑 制 调 蛋 白 结 合 HER4-ECD-Fc， 进 行 如 上 所 述 的 配 体 结 合 测 定。 使 用 25ngHER4-ECD-Fc， 而不使用 HER3-ECD-Fc。结果证明 D1.5-400 抑制调蛋白结合 HER4。
     抑制 MCF7 细胞中调蛋白诱导的 HER2/HER3 磷酸化
     为了确定选择的七个对 EGFR 和 HER3 具有双重特异性的抗体是否能够抑制 MCF7 细胞中调蛋白诱导的 HER2/HER3 磷酸化， 在受体磷酸化测定中对它们进行测试 ： MCF-7 细胞 (ATCC HTB 22， Manassas， Va.) 在 12 孔板中铺板。血清饥饿之后， 细胞与所示抗体 (75ug/ ml 或 150ug/ml) 温育 2 小时。细胞用 0.5nM HRG 刺激 8 分钟， 总细胞溶胞产物在 SDS-PAGE上运行， 蛋白质印迹用抗磷酸 -HER3、 抗 pTyr 或作为装载对照的抗微管蛋白探测。( 图 5)。 结果证明所有抗 EGFR/HER3 抗体在高浓度抑制调蛋白诱导的 HER2/HER3 磷酸化。培妥珠单 抗 (Pmab) 用作阳性对照。
     抑制 MDA-175 细胞增殖
     为了确定抗 EGFR/HER3 抗体对 HRG 驱动的细胞生长的生长抑制潜力， MDA-175 细胞 (ATCC HTB 25， Manassas， Va.)(20000 细胞 / 孔 ) 在 96 孔板中铺板。次日， 细胞用含 1％血 清的培养基中不同浓度的抗体 ( 多至 50ug/ml) 同时处理。 4 天或 5 天后， 添加 Alamar Blue， 使用荧光计检测荧光。结果以 RFUs 表示。选择 MDA-175 细胞是因为它们的生长是 HRG 自 分泌刺激的结果。抗 EGFR/HER3 抗体 D1.5-100 和克隆 D1.5-122 显示抑制 MDA-175 细胞生 长。培妥珠单抗 (Pmab) 用作阳性对照。( 图 6)。
     实施例 7
     D1.5-100 和 D1.5-103， 抗 hEGFR/HER3 双特异性抗体的诱变定位研究
     使用组合的噬菌体展示文库进行丙氨酸和同系物鸟枪法扫描分析 (Vajdos 等， J.Biol.Biol.320 ： 415-28(2002))， 以研究每种抗体与其两个抗原 (EGFR 和 HER3) 之间的相 互作用。
     对抗原 (hEGFR 和 HER3) 的结合选择用于分离功能性克隆， 随后进行 DNA 测序， 允 许计算在每个改变的位置的野生型 / 突变比率。然后用这些比率确定每个扫描的侧链对 EGFR 和 HER3 结合的贡献。
     该结果允许定位结合 EGFR 和 HER3 的功能性互补位。
     D1.5-100 和 D1.5-103 鸟枪文库设计
     CDR 中的溶剂暴露残基利用噬菌体 - 展示文库来筛选， 其中允许野生型残基作为 丙氨酸或野生型 ( 丙氨酸扫描 ) 或作为同系物残基或野生型 ( 同系物扫描 ) 变化。遗传密 码的性质还需要使除 Wt/ 丙氨酸或 Wt/ 同系物残基以外一些其他置换包括在该文库中。构 建单独的重链和轻链丙氨酸和同系物扫描文库。简并性范围为 1.3x105 至 7.5x107。
     构建鸟枪扫描文库
     文库如前所述进行构建， 除了单个 Fab 在细菌噬菌体表面上表达， 该 Fab 融合到 M13 基因 -3 小外壳蛋白的 C 末端结构域， 所述外壳蛋白通过 kunkel 诱变 ( 寡聚 F220 ： TCT TGT GAC AAA ACT CAC AGT GGC GGT GGC TCT GGT)(SEQ ID NO ： 77) 去除来自原始质粒的 亮氨酸拉链。
     轻链丙氨酸和同系物扫描文库在 HVR-L1， HVR-L2 和 HVR-L3 中具有终止密码子， 并且重链丙氨酸和同系物文库在各重链 HVRs 含有终止密码子。文库通过前述方法 (Sidhu 等， J.Mol.Biol.( 分子生物学杂志 )338 ： 299-310(2004))， 利用 Kunkel 诱变 (Kunkel 等， 1987， 见上文 )， 在各自终止模板上构建。丙氨酸扫描文库是允许选择的侧链改变为野生型 或丙氨酸的噬菌体展示文库。 同系物扫描意指允许选择的侧链改变为野生型或类似氨基酸 的噬菌体展示文库。
     文库选择
     NUNC 96 孔 Maxisorp 免疫板用 5μg/ml 捕获靶标 (EGFR-ECD-Fc， HER3-ECD-Fc 或 蛋白质 -L) 来包被并用处于 PBS 中的 1％ BSA(w/v) 来封闭。如所述， 来自上述文库的噬菌 体与 KO7 辅助噬菌体 (NEB) 一起繁殖 (Lee 等， 2004， 见上文 )。加入文库噬菌体溶液， 从而以浓度 1013 个噬菌体颗粒 /ml 包被板并在 RT 温育 1-2 小时。该板用 PBST 洗涤 8 次， 并随 后用 0.1MHCl 洗脱结合的噬菌体 30 分钟。如前所述确定各轮选择后的富集。2 轮靶标选择 后， 选择来自各文库的许多随机克隆来测序， 如 (Sidhu 等， 2004， 见上文 ) 所描述的。
     结合克隆的 DNA 序列用于确定在各改变的位置的野生型 / 突变比率。该比率用于 评估各选择的侧链对抗原的结合贡献。来自抗原选择的 wt/mut 比率除以来自展示选择的 wt/mut 比率提供了对于各突变对抗原结合亲和力效应的定量估计 ( 功能比率 Fwt/mut)。 如果 该比率大于 1， 突变是有害的。如果该比率小于 1， 突变是有益的。测序了 2500 个克隆。
     基于丙氨酸和同系物扫描的结果， 抗体 D1.5-100 用于结合 EGFR 和 HER3 的热点在 已知抗 HER2 抗体 4D5-Fv 的结构上定位。如图 7 所示， 定位表明对于 EGFR 结合， 重链占优 势， 对于 HER3 的结合， 重链和轻链一起作用。酸性 (E， D) 残基在结合 EGFR 和 HER3 两者中 均起重要作用， 尤其是结合 HER3 中。
     亲和力成熟
     图 8 图示了使用上述鸟枪文库的 D1.5-100 的亲和力成熟。在这种亲和力成熟策 略中， D1.5-100 重链同系物文库如前所述进行分选。在 HER3-ECD-Fc 包被的板上进行两轮 板分选后， 三轮溶液交替靶标在增加严格性下进行分选 (EGFR-ECD 和 HER3-ECD-Fc)。挑选 单克隆并在单点 ELISA 中评估， 以便分离保留双重结合活性的克隆。 在评估的克隆中， 94 个 中的 79 个显示对 EGFR/HER3 两者的结合， 而 11 个丧失 EGFR 结合并且显示对 HER3 的特异 性结合。
     通过单点竞争分离克隆
     挑选来自最后一轮分选的单集落， 噬菌体如实施例 1 中所述进行生长。384 个孔 用 1μl/ml EGFR-ECD-Fc 包被。对于各集落生长， 25μl 的噬菌体上清液或 ELISA 缓冲 液与 25μl 的 EGFR-ECD(50nM) 和 HER3-ECD-Fc(10nM) 一起温育。4μl 的温育物添加至 EGFR-ECD-Fc 包被的板中， 所述板洗涤八次。添加 60μl 的 1/5000 抗 M13-HR 缀合抗体， 洗 涤板八次， 用 TMB+H3PO4 显影。
     使用下述单点竞争方案， 选择八个独特克隆， 其对于 EGFR 和 HER3 显示比 D1.5-100 更大的抑制 ：
     1. 挑选来自最后一轮分选的单集落， 噬菌体如前所述进行生长 ；
     2.384 孔板用 1μg/ml EGFR-ECD-Fc 包被 ；
     3. 对 于 各 集 落 生 长， 25μl 的 噬 菌 体 上 清 液 或 ELISA 缓 冲 液 与 25μl 的 EGFR-ECD(50nM) 和 HER3-ECD-Fc(10nM) 一起温育 ；
     4.4μl 的温育物添加至 EGFR-ECD-Fc 包被的板 ；
     5. 洗涤板 8 次 ；
     6. 添加 60μl 的 1/5000 抗 M13-HRP 缀合抗体 ；
     7. 洗涤板 8 次 ；
     8. 板用 TMB+H3PO4 显影。
     选择 8 个独特克隆， 其对于 EGFR 和 HER3 两者显示比 D1.5-100 更大的抑制 (DL6， SEQ ID NO ： 63 ； DL7， SEQ ID NO ： 64 ； DL8， SEQ ID NO ： 65 ； DL9， SEQ ID NO ： 66 ； DL10， SEQ ID NO ： 67 ； DL11， SEQ ID NO ： 28 ； DL12， SEQ ID NO ： 68 ； DL13， SEQ ID NO ： 69)。对于抗 HER3 抗 体， 选择 7 个独特克隆， 其对于 HER3 显示比 D1.5-100 更大的抑制。表征亲和力成熟的双特异性和抗 HER3 抗体
     选择的亲和力成熟的双特异性抗体的结合特异性通过直接结合一组不同蛋白进 行评估， 如实施例 5 中所述。如图 9 中所示， 选择的抗体显示对 EGFR 和 HER3 两者的结合特 异性。
     对于两个选择的双特异性抗体 (DL7 和 DL11) 如实施例 1 所述计算 IC50 值， 并且 与 D1.5-100 母体克隆相比较。两个选择的双特异性抗体显示对于 HER3-ECD-Fc 相似的亲 和力， 以及对于 EGFR 增加的亲和力。DL1.5-100 具有对于 EGFR-ECD 44nM 的 IC50， 对于 HER3-FC 为 0.1nM 的 IC50 ； DL7 具有对于 EGFR-ECD 6.1nM 的 IC50， 对于 HER3-FC 为 0.25nM 的 IC50 ； DL11 具有对于 EGFR-ECD 5.7nM 的 IC50， 对于 HER3-FC 为 0.43nM 的 IC50。
     选择的抗 HER3 抗体的结合特异性通过直接结合一组不同蛋白进行评估， 如前所 述。选择的抗体 (DL3.5， DL3.6， DL3.7) 仅对 HER3 显示结合特异性。
     对于选择的抗体的噬菌体 IC50 值如上所述进行计算并且与 D1.5-100 母体克隆进 行比较。所有抗体 (DL3.1-3.7) 显示对于 HER3-ECD-Fc 增加的亲和力， 具有 1 和 3.8nM 之 间的 IC50s。母体 DL1.5-100 具有 4.6nM 的 IC50。
     使用上文描述的竞争 ELISA 将选择的双特异性抗体和抗 HER3 抗体的结合与 HER3 结构域 III 蛋白 (N- 末端 His 标签 ) 的结合进行比较。EGFR/HER3 和单特异性抗 HER3 抗体 对于 HER3ECD-Fc 和 HER3 结构域 III 构建体具有相似的亲和力 ( 噬菌体 IC50)。
     选择的亲和力成熟的双特异性抗体和抗 HER3 抗体重新格式化成 mIgG2A 并在竞争 ELISA 中验证， 如上所述。mIgG2A 双特异性抗体显示对于 EGFR-ECD 和 HER3 结构域 III 两 者与 D1.5-100 母体克隆相比增加的亲和力。
     使用 BIAcore 300 对亲和力成熟的 EGFR/HER3 抗体 DL7 和 DL11 和抗 HER3 特异性 抗体 DL3.6 和 DL3.7 进行动力学分析， 各抗体 (DL1.5-100， DL7， DL11， DL3.6， DL3.7) 纯化 的 mIgG2A 偶联到 CM5 芯片上， 数种抗原 (EGFR-ECD， HER3 结构域 III， HER3-ECD) 的稀释液 在实施例 4 所述的条件下流过包被的芯片。CM5 芯片在抗原的每次注射之间进行再生。最 后， 使用 1 ∶ 1 结合分析用质量转移确定 KD。亲和力成熟的 EGFR/HER3 抗体 DL7 和 DL11 对 于两种靶标均具有改善的 KD(M)。
     为了评估亲和力成熟的抗体 DL7、 DL11 和母体抗体 D1.5 对 EGFR 的抑制功能， 仅 表达 EGFR 的 EGFR-NR6 细胞用不同量的抗体 ( 多至 20ug/ml) 预处理一小时， 随后， 通过 TGFα(5nM) 诱导 EGFR 的磷酸化。 抗体对受体的磷酸化的抑制使用抗磷酸酪氨酸抗体检测。 也看到剂量依赖性方式的 MAPK 活化的抑制。抗体 DL11 在抑制 EGFR 和 ERK1/2 磷酸化中比 DL7 效力更大。( 图 10A)。
     比较了 DL7、 DL11 和单特异性抗 HER3 抗体 DL3.6 对 HER3 反式激活的抑制功能。 ( 图 10B)。表达 HER2、 HER3 和 EGFR 的 MCF-7 细胞用标示量的抗体 ( 多至 50ug/ml) 预处理 一小时， HER3 的活化和 HER3 的磷酸根转移通过 HRG 诱导。HER3 磷酸化的抑制使用抗磷酸 HER3 抗体检测。看到剂量依赖性方式的下游信号传导分子 ERK1/2 以及 Akt 的抑制。DL11 再次比 DL7 效力更大。
     DL11 的生长抑制功能与商购的抗 EGFR 抗体 ( 培妥珠单抗 ) 和抗 HER3 抗体的生 长抑制功能相比较， 或与 DL3.6， D1.5 或 D1.5+DL3.6 的组合的生长抑制功能相比较。H1666 细胞 (ATCC CRL-5885， Manassas， Va.)(NSCLC 细胞系， 其表达 HER2， HER3， EGFR 和 EGFR 配体 )(6000 细胞 / 孔 ) 用 HRG(3nM) 刺激生长。抗体以剂量依赖性方式检测， 生长抑制特性 与所有其它单特异性抗体相比较。如图 11A 所示， DL11 以比单特异性抗体或其组合更大的 程度抑制细胞生长。
     当用 HRG(3nM)+TGFα(6nM) 刺激 H1666 细胞生长重复所述测定时， 获得了相似的 结果。( 图 11B)。
     DL11 的生长抑制功能与培妥珠单抗 ( 一种抗 EGFR 抗体 ) 和抗 HER3 抗体， 或 DL3.6， D1.5 或 D1.5+DL3.6 的组合在 HCA-7 细胞中进行比较。HCA-7 是表达 HER2， HER3 和 EGFR 的结肠直肠细胞系。细胞生长用 HRG(3nM) 在 1％血清的存在下进行刺激。抗体以剂 量依赖性方式测试， 在 3 天后使用 Alamar Blue 试剂检测细胞活力。如图 12A 所示， 与所有 其它处理相比， DL11 显示优异的生长抑制特性。
     HCA-7 细 胞 生 长 的 抑 制 如 图 12A 相 关 描 述 进 行 研 究，除 了 生 长 用 HRG(3nM)+TGFα(5nM) 刺激。如图 12B 所示， 与所有其它处理相比， DL11 显示优异的生长抑 制特性。
     研究了 DL11 对 Calu-3 生长的抑制与抗 EGFR 抗体培妥珠单抗和抗 HER3 抗体比 较。NSCLC 细胞系 Calu-3(ATCC HTB-55， Manassas， Va.) 过表达 HER2， 并且具有正常水平 的 HER3 和 EGFR。细胞生长 (10,000 细胞 / 孔 ) 用 HRG(3nM) 在 1％血清存在下进行刺激， 抗体以剂量依赖性方式测试。如图 13 所示， 与单特异性抗体相比， DL11 显示优异的活性。
     实施例 8
     D1.5-201 和 D1.5-201-2， 抗 hEGFR/HER2 双特异性抗体的诱变定位研究
     对于 D1.5-201 的亲和力成熟， 对选择的氨基酸设计轻链软 / 同系物文库。一些软 残基 (soft residues) 进行软随机化 (soft randomized)， 其中野生型残基频率为 50％。 一 些残基使用编码野生型残基或同系物残基的密码子进行随机化。 一些同系物随机化允许野 生型和同系物残基以外 1 或 2 个额外残基。最后， 一些残基未改变。
     图 14 图示了对于 D1.5-201 的亲和力成熟的另一种分选策略。在这种策略中， D1.5-201 轻链软 / 同系物文库如前所述进行分选。在 HER2/ECD 上进行增加的严格性的三 轮交替板 / 溶液分选之后， 挑选单克隆并且在单点 ELISA 中评估， 以便分离保留对 EGFR 和 HER2 双重结合活性的克隆。在所评估的克隆中， 77/192 显示对 EGFR 和 HER2 两者的结合。
     确 定 了 选 择 的 亲 和 力 成 熟 的 EGFR/HER2 双 特 异 性 抗 体 的 轻 链 可 变 区 序 列 (D1.5-201(SEQ ID NO ： 36)， D1.5-201-2(SEQ ID NO ： 37)， D1.5-201-3(SEQ ID NO ： 38))。 对于两个选择的亲和力成熟的双特异性抗体 (D1.5-201-2， D1.5-201-3) 如前所述计算噬 菌体 IC50 并且与 D1.5-201 母体克隆进行比较。两种亲和力成熟的双特异性抗体均显示对 于 HER2-ECD 和 EGFR-ECD 增加的亲和力。
     实施例 9
     DL11 亲和力成熟
     DL11 如上所述进一步亲和力成熟， 产生对于 EGFR 和 HER3 具有特异性的两种另 外的双特异性抗体 (DL11b 和 DL11f) 和特异于 HER3 的两种抗体 (DL3-11fb 和 DL3-11f)。 DL11b 的重链和轻链氨基酸序列分别显示于 SEQ ID NOs ： 12 和 13 中。DL11f 的重链和轻链 氨基酸序列分别显示于 SEQ ID NOs ： 14 和 13 中。 DL3-11b 的重链和轻链氨基酸序列分别显 示于 SEQ ID NOs ： 19 和 13 中， DL3-11f 的重链和轻链氨基酸序列分别显示于 SEQ ID NOs ：20 和 13 中。
     Biacore 亲和力测定
     DL11b 和 DL11f 对于它们的 EGFR 和 HER3 靶标的结合亲和力在下述 Biocore 测定 中确定。DL11b 和 DL11f 两者均显示与 DL11 相比对于它们的靶标改善的亲和力。
     测量使用表面等离子共振在 BIAcoreTM 2000 仪器 (GE Healthcare， BIAcore Life Sciences， Piscataway， NJ) 上进行。编码人 EGFR 的胞外结构域 (ECD)( 氨基酸 1-637) 和 人 HER3 的胞外结构域 (ECD)( 氨基酸 1-640) 的 cDNAs 克隆到含有编码人 IgG1 的 Fc 区的 序列的哺乳动物表达载体中， 从而产生人 Fc 融合蛋白。重组的人 EGFR-IgG1(2.65mg/ml)， 人 HER3-IgG1(3.35mg/ml) 通过瞬时转染中国仓鼠卵巢细胞产生， 并且通过蛋白质 A 亲和色 谱法纯化。编码人 EGFR 胞外结构域 ( 氨基酸 1-637) 的 cDNA 克隆到含有 N 末端标志序列 的哺乳动物表达载体中。
     确定作为 Fab 和 IgG 抗体的 DL11f 的结合亲和力。对于 Fab 测定， DL11f Fab 是分 析物， 使其流过 CM5 芯片， 其中不同配体 - 人 EGFR-Fc 和人 HER3-Fc- 首先使用 BIAcore 人抗 体捕获试剂盒 (BR-1008-39， Lot 10020611) 捕获。 2 倍稀释系列的 DL11f Fab 以 PBS、 0.05％ Tween20 中 0.244-250nM 的范围以 30μl/ 分的流速于 25℃注射。 Fc 融合配体和分析物的各 次注射之间， 使用 3M 氯化镁再生传感器芯片 (5μl， 以 10μl/min 的流速 )。 为了确定 DL11f Fab 对人 EGFR 和人 HER3Fc 融合蛋白的亲和力常数， 从观察的测试传感图 (sensorgram) 中 减去来自参照细胞的信号。 通过数据的非线性回归拟合根据 1 ∶ 1 Langmuir 结合模型使用 BIAcore 评价软件 (GE Healthcare)4.1 版 ( 由制造商提供 ) 计算动力学常数。DL11f Fab 代表性浓度 (125nM) 的两个重复给出对于所有 Fc 融合蛋白的非常相似的拟合和动力学常 数。DL11fFab 以 1.92nM 的 KD 值结合人 EGFR-Fc， 以 0.39nM 的 KD 值结合人 HER3-Fc。
     探索了第二个实验条件以获得作为 IgG 的来自 DL11f 的结合动力学。在此， DL11f 人 IgG1 固定于传感器芯片 CM5 上， 单体的人 EGFR-ecd 和人 HER3-ecd 用作分析物。 2 倍稀释 系列的人 EGFR-ecd 和人 HER3-ecd 以 PBS、 0.05％ Tween20 中 0.244-250nM 的范围以 30μl/ 分的流速于 25℃注射。确定对于 Fab 的结合动力学。DL11f 分别以 19.9nM 和 2.63nM 的 KD 值结合人 EGFR-ecd 和人 HER3-Fc。在两个实验中， 我们观察到 DL11f 抗体对于 HER3 比对于 EGFR 具有一致性地 5-8 倍更高的亲和力。与实验 1 相比时， 在实验 2 中发现对于两种受体 更低的亲和力， 可能由于将 EGFRecd 或 HER3ecd 作为溶液中的分析物和将受体作为 Fc 融合 物固定于流动细胞芯片上之间的差别。可能作为游离的 ECD 的这些多 - 结构域受体在溶液 中时可能遇到更多结合能的熵罚分 (entropic penalty)， 由此导致更弱的亲和力。
     在相似条件下在单独的 Biacore 分析中， DL11b 显示与 DL11f 相似的对 EGFR 和 HER3 的结合亲和力。
     DL3-11b 和 DL3-11f 丧失特异性结合 EGFR 的能力， 而保留特异性结合 HER3 的能 力。
     抑制 MDA-175 细胞增殖
     通过 DL11b 和 DL11f 抑制 MDA-175 细胞增殖如上所述进行研究。DL11b 和 DL11f 两者均以与 DL11 抗体相似的程度抑制 MDA-175 细胞的增殖。图 15。DL11， DL11f 和 DL11b 的 IC50s 都是大约 0.8-1.0ug/ml。
     抑制 MCF7 细胞中调蛋白诱导的 HER3 磷酸化为了确定 DL11f 是否能够抑制 MCF7 细胞中调蛋白诱导的 HER3 磷酸化， 如实施例 6 所述进行受体磷酸化测定。结果证明 DL11f 以剂量依赖性方式抑制调蛋白诱导的 HER3 磷 酸化。图 16。
     抑制稳定转染的 EGFR-NR6 细胞中 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化
     为了确定 DL11f 是否选择性阻断 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化， 如实施例 2 所述进 行受体磷酸化测定。图 16 中的数据证明在这种基于细胞的测定中， DL11f 以剂量依赖性方 式抑制 TGF-α 诱导的 EGFR 磷酸化。
     DL11 和 DL11f 在体内模型中抑制肿瘤生长
     HCA-7 肿瘤移植模型测定用于确定 DL11 和 DL11f 对体内肿瘤生长的效应。 测定如 下进行。
     SCID beige 小鼠 (Charles River Laboratories， San Diego， CA) 皮下移植 HCA-7 肿瘤块。当肿瘤达到平均体积 100 至 250mm3， 具有相似大小肿瘤的小鼠随机分到如下处理 组群 (n ＝ 9/ 组 ) ： 赋形剂 (PBS)， 培妥珠单抗 (10mg/kg)， D1.5(25mg/kg)， D1.5+DL3.6( 各 25mg/kg)， DL11(25mg/kg)， 或 DL11f(25mg/kg)。处理通过腹膜内施用， 在随机化当天以 2x 负荷剂量 (20 或 50mg/kg) 开始， 每周继续， 进行总计三次处理。 在研究期间每周两次用测径 器测量肿瘤。小鼠居住于标准啮齿动物微隔离笼 (microisolator cages) 中。动物室的环 境控制设定为维持温度大约 70° F， 相对湿度大约 40％ -60％， 大约 14- 小时光 /10- 小时暗 周期。小鼠根据实验室动物护理和使用 (Care and Use of Laboratory Animals) 的 ILAR 指南维持， 研究经在 Genentech 的研究所动物护理和使用委员会 (Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)) 考查和批准。
     在这种异种移植模型中， DL11 和 DL11f 在降低平均肿瘤体积中同样有效。图 17。
     DL11f 在非小肺细胞癌模型中有活性
     在具有源自人 NSCLC 系 H358(ATCC CRL-5807， Manassas， Va.) 建立肿瘤的小鼠中 6 测试抗体。5x10 H358 细胞与基质胶皮下接种于 CB17 SCID 小鼠中。具有相似大小肿瘤的 动物随机分到如下处理组群 (n ＝ 9/ 组 ) ： 赋形剂 (DL11f 制剂缓冲液 )， D1.5(25mg/kg)， DL3.11b(25mg/kg)， DL11f(30mg/kg)， 或 D1.5+DL3.11b( 各 25mg/kg)。处理通过腹膜内施 用， 在随机化当天以 2x 负荷剂量 (50 或 60mg/kg) 开始， 每周继续， 进行总计四次处理。在 研究期间每周两次用测径器测量肿瘤。
     如图 18 所示， 双特异性抗体 DL11f 在这种 NSCLC 模型中有活性， 并且比抗 EGFR 特 异性和抗 HER3 特异性抗体的组合 (D1.5+DL3.11b) 在抑制肿瘤生长中更有效。
     实施例 10
     DL3.6 亲和力成熟
     DL3.6 如上所述进一步亲和力成熟， 产生另外的抗 HER3 抗体。DL3.6b 显示与母体 抗体 DL3.6 相比对于其靶标的亲和力的增加。 DL3.6b 的重链和轻链氨基酸序列分别显示于 SEQ ID NOs ： 17 和 13。
     如图 19 和 20 所示， DL3-11b， DL3.6 和 DL3.6b 抑制 HRG 诱导的 HER3 磷酸化和 MDA-175 细胞增殖。测定如上所述进行。
     实施例 11
     在 Fadu 异 种 移 植 模 型， 头 和 颈 鳞 状 细 胞 癌 (head and neck sauamous cellcarcinoma) 模型中的体内活性
     在具有源自 Fadu 细胞 (ATCC HTB-43， Manassas， Va.) 建立肿瘤的小鼠中测试 6 DL11f， 商购抗 EGFR 抗体和抗 HER3 抗体。5x10 FaDu 细胞皮下接种于 CB17SCID 小鼠中。具 有相似大小肿瘤的动物随机分到如下处理组群 (n ＝ 9/ 组 ) ： 赋形剂 (DL11f 制剂缓冲液 )， 抗 EGFR 抗体 (25mg/kg)， 抗 HER3 抗体 (50mg/kg) 和 DL11f(25mg/kg)。处理通过腹膜内施 用， 在随机化当天以 2x 负荷剂量 ( 分别为 50 或 100mg/kg) 开始， 每周继续， 进行总计四次 处理。在研究期间每周两次用测径器测量肿瘤。
     如图 21 所示， DL11f 在 FaDu 头和颈癌模型中有活性， 并且比抗 EGFR 特异性或抗 HER3 特异性抗体在抑制肿瘤生长中更有效。
     实施例 12
     在 BxPC3 异种移植模型， HER3 驱动的胰腺模型 (pancreatic model) 中的体内活 性
     在具有源自胰腺细胞系 BxPC3(ATCC CRL-1687， Manassas， Va.) 建立肿瘤的小鼠 6 中测试 DL11f， 抗 EGFR 抗体， 培妥珠单抗， 和抗 HER3 抗体。10x10 BxPC3 细胞皮下接种于 CB17SCID 小鼠中。具有相似大小肿瘤的动物随机分到如下处理组群 (n ＝ 8/ 组 ) ： 赋形剂 (DL11f 制剂缓冲液 )， 抗 EGFR 抗体 (25mg/kg)， 培妥珠单抗 (25mg/kg)， 抗 HER3 抗体 (50mg/ kg)， 和 DL11f(25mg/kg)。 处理通过腹膜内施用， 在随机化当天以 2x 负荷剂量 (50 或 100mg/ kg) 开始， 每周继续， 进行总计四次处理。在研究期间每周两次用测径器测量肿瘤。
     DL11f 在 BxPC3 胰腺癌模型中有活性， 并且比抗 EGFR 特异性或抗 HER3 特异性抗体 在延缓肿瘤生长中更有效。( 图 22)。
     实施例 13
     在 NSCLC Calu-3 异种移植模型中的体内活性
     在具有源自 NSCLC 系 Calu-3(ATCC HTB-55， Manassas， Va.) 建立肿瘤的小鼠中测 6 试 DL11f， 商购抗 EGFR 抗体， 和抗 HER3 抗体。5x10 Calu-3 细胞皮下接种于 SCID Beige 小 鼠中。具有相似大小肿瘤的动物随机分到如下处理组群 (n ＝ 9/ 组 ) ： 赋形剂 (DL11f 制剂 缓冲液 )， 抗 EGFR 抗体 (25mg/kg)， 抗 HER3 抗体 (25mg/kg)， 和 DL11f(25mg/kg)。处理通过 腹膜内施用， 在随机化当天以 2x 负荷剂量 (50) 开始， 每周 ( 抗 HER3 每两周 ) 继续， 进行总 计四 ( 八 ) 次处理。在研究期间每周两次用测径器测量肿瘤。
     DL11f 在 Calu-3 非小细胞肺癌模型中有活性， 并且比抗 EGFR 特异性或抗 HER3 特 异性抗体在延缓肿瘤生长中更有效。( 图 23)。
     实施例 14
     在表皮 A431 异种移植模型中的体内活性
     在具有源自表皮样细胞系 A431(ATCC CRL-2592， Manassas， Va.) 建立肿瘤的小鼠 6 中测试 DL11f， 商购抗 EGFR 抗体， 和抗 HER3 抗体。5x10 A431 细胞皮下接种于 SCID Beige 小鼠中。具有相似大小肿瘤的动物随机分到如下处理组群 (n ＝ 8/ 组 ) ： 赋形剂 (DL11f 制 剂缓冲液 )， 抗 EGFR 抗体 (12.5mg/kg)， 抗 HER3(50mg/kg) 和 DL11f(12.5 和 25mg/kg)。处 理在随机化当天通过腹膜内施用一次。在研究期间每周两次用测径器测量肿瘤。
     由于在小鼠中与抗 EGFR 抗体相比 DL11f 更快的清除， DL11f 以与抗 EGFR 抗体相 比 2x 浓度给药， 以便获得可比的暴露水平。总之， DL11f 与抗 EGFR 抗体同样好地抑制 A431表皮癌模型中的肿瘤生长。( 图 24)。
     实施例 15
     在携带患者来源的乳腺癌 MAXF449 的异种移植物的裸鼠中的体内活性
     DL11f， 商购抗 EGFR 抗体和抗 HER3 抗体在 Oncotest GmbH， Freiburg， Germany 进 行测试。在直接移植来自供体患者的肿瘤后， Oncotest 在裸鼠中作为皮下异种移植物传代 患者肿瘤， 像乳腺癌 MAXF 449。根据 Oncotest 的方案， 具有相似大小肿瘤的动物随机分到 如下处理组群 (n ＝ 10/ 组 ) ： DL11f(30mg)， 抗 EGFR 抗体 (30mg/kg)， 抗 HER3(60mg/kg) 和 赋形剂 (DL11f 制剂缓冲液 )。处理通过腹膜内施用， 在随机化当天以 2x 负荷剂量 ( 分别为 60 或 120mg/kg) 开始， 每周继续， 进行总计四次处理。
     DL11f 和抗 HER3 抑制 MAXF44 乳腺癌模型中的肿瘤生长， 而抗 EGFR 抗体无效应 ( 图 25)。
     实施例 16
     在前列腺 DU145 异种移植模型中的体内活性
     DL11f，商 购 抗 EGFR 抗 体 和 抗 HER3 抗 体 在 Piedmont Research Center， Morrisville 根据 Piedmont 的方案进行测试。具有相似大小肿瘤的动物随机分到如下处 理组群 (n ＝ 10/ 组 ) ： DL11f(25mg)， 抗 EGFR 抗体 (25mg/kg)， 抗 HER3(50mg/kg) 和赋形剂 (DL11f 制剂缓冲液 )。处理通过腹膜内施用， 在随机化当天以 2x 负荷剂量 ( 分别为 50 或 100mg/kg) 开始， 每周继续， 进行总计四次处理。DL11f 在 DU145 前列腺癌模型中有活性， 并 且比抗 EGFR 特异性或抗 HER3 特异性抗体在抑制肿瘤生长中更有效。( 图 26)。
     实施例 17
     在携带患者来源的卵巢癌 OVXF550 异种移植物的裸鼠中的体内活性
     DL11f， 商购抗 EGFR 抗体和抗 HER3 抗体在 Oncotest GmbH， Freiburg， Germany 进 行测试。在直接移植来自供体患者的肿瘤后， Oncotest 在裸鼠中作为皮下异种移植物传代 患者肿瘤， 像卵巢癌 OVXF550。 根据 Oncotest 的方案， 具有相似大小肿瘤的动物随机分到如 下处理组群 (n ＝ 10/ 组 ) ： DL11f(30mg)， 抗 EGFR 抗体 (30mg/kg)， 抗 HER3 抗体 (60mg/kg) 和赋形剂 (DL11f 制剂缓冲液 )。处理通过腹膜内施用， 在随机化当天以 2x 负荷剂量 ( 分别 为 60 或 120mg/kg) 开始， 每周继续， 进行总计五次处理。
     DL11f 在 OVFX550 卵巢癌模型中有活性。( 图 27)。
     实施例 18
     DL11f 在体外和体内介导抗体依赖性细胞的细胞毒性 (ADCC)
     DL11f 在体外介导 ADCC。A431， H292(ATCC CRL-1848， Manassas， Va.)， FaDu， BxPC3 和 MDA468(ATCC HTB-132， Manassas， Va.) 细胞 ( 均来自 ATCC) 在存在标示浓度的抗体时在 96 孔板中铺板。在 37℃预温育 30 分钟后， 添加分离的外周血单核细胞 (PBMC)， 在 37℃继 续温育另外 4 小时。4 小时后， 离心板并且收获上清液。上清液中的 LDH 活性根据 Promega CytoTox-One 同质膜完整性测定程序确定。 为了确定百分数细胞介导的细胞毒性， 计算平均 吸光度并且减去背景。如图 28 所示， DL11f 以剂量依赖性方式减轻在 EGFR 表达细胞系中 的 ADCC。
     向 DL11f 引入氨基酸置换 N297A 以缺失效应子功能。N297 是 FcRγ 和 / 或补体结 合必需的。DL11f-N297A 在体外显示丧失 ADCC。如所预期的， DL11f 体外生长抑制功能未受该突变的影响。( 图 29)。
     在具有源自 NSCLC 细胞系 H292(ATCC CRL-1848， Manassas， Va.) 建立肿瘤的小 6 鼠中测试 DL11f 和 DL11f-N297A。5x10 A431 细胞皮下接种于 C.B17-SCID 小鼠中。具有 相似大小肿瘤的动物随机分到如下处理组群 (n ＝ 10/ 组 ) ： 赋形剂 (DL11f 制剂缓冲液 )， DL11f(6mg/kg) 和 DL11f-N297A(6mg/kg)。处理在随机化当天通过腹膜内施用一次。在研 究期间每周两次用测径器测量肿瘤。最初， DL11f 和 DL11f N297A 通过抑制 HER 途径信号 传导等价地抑制肿瘤生长。但当剂量减少时， 与 DL11f N297A 相比， DL11f 由于其 ADCC 能 力显示延长的抗肿瘤活性。( 图 30)。
     实施例 19
     在食蟹猴中 DL11f 比西妥昔单抗毒性更低
     进行研究以确定 DL11f 和西妥昔单抗的相对毒性。食蟹猴分为三组并且给药 DL11f 或西妥昔单抗 (Capital Wholesale Drug， Columbus， OH)， 每周一次进行六周， 如下所 述：
     组1： 西妥昔单抗 25mg/kg ；
     组2： DL11f25mg/kg ；
     组3： DL11f 12.5mg/kg。
     所有 3 组西妥昔单抗给药的动物在第 3 和第 4 次给药之间发生皮肤损害， 表明毒 性。这种结果基于以前 FDA 批准西妥昔单抗过程中所做的食蟹猴研究是预料到的。在所述 研究中在这一点没有 DL11f 给药的动物显示毒性体征。
     接受 25mg/kg 剂量 DL11f 的动物中的一个在第 6 次给药后一周发生皮肤损害。这 一损害测量为大约 4cm x 7cm， 当与西妥昔单抗处理的动物中观察到的损害相比时， 是非常 轻度的并且限制在更小的区域。
     基于在这种毒理学研究中的毒性动力学参数分析， 在以 25mg/kg 给药各测试化合 物的动物中， 西妥昔单抗和 DL11f 的暴露是相似的。
     在下述条件下进行第二个、 更大规模的研究。
     食蟹猴分为六组， 通过静脉内施用 DL11f 或赋形剂对照来给药， 每周一次进行 十二周， 如下所述 ：
     组1： 10 只猴 (5 雄性 /5 雌性 )- 赋形剂对照
     组2： 10 只猴 (5 雄性 /5 雌性 )DL11f5mg/kg
     组3： 10 只猴 (5 雄性 /5 雌性 )DL11f 15mg/kg
     组4： 10 只猴 (5 雄性 /5 雌性 )DL11f30mg/kg
     组5： 4 只猴 (2 雄性 /2 雌性 ) 赋形剂对照
     组6： 4 只猴 (2 雄性 /2 雌性 )DL11f30mg/kg
     在研究过程中或在 DL11f 最后一次给药之后的恢复期间， 没有动物显示任何明显 的皮肤毒性。
     也在食蟹猴中进行了单次剂量、 IV 施用 PK 研究。在这种研究中， 每组 3 只猴用 1、 10 或 30mg/kg 的 DL11f 静脉内给药。所探索的剂量范围中的 PK 是非线性的， 与已经在其它 靶向 EGFR 的抗体中看到的可饱和的清除一致。
     将在本说明书中引用或提及的所有的专利、 专利申请、 专利申请公开物和其它公开物的全文通过引用并入本文， 其程度如同将每个独立专利、 专利申请、 专利申请公开物或 公开物特别地和单独地指定通过引用并入本文中的程度一样。82102356092 A CN 102356102
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