用 ISSR 分子标记法对新疆药用阿魏品种进行快速鉴别的 方法 【技术领域】
本发明涉及一种用 ISSR 分子标记法对新疆药用阿魏品种进行快速鉴别的方法。背景技术 阿魏是我国传统中药材， 其应用历史悠久。本品为伞形科植物新疆阿魏 （Ferula sinkiangensis K.M.Shen） 或阜康阿魏 （Ferula fukanensis K.M.Shen） 的树脂， 为 《中华 人民共和国药典》 2005 年版所收载。
阿魏始载于唐代 《新修本草》 ， 记有 ： “苗叶根酷似白芷。倒根汁， 日煎做饼者为上， 揭根穿暴干者为次。体性及臭而能止臭， 亦为奇物。 ” 因疗效显著， 唐以后， 历代本草都有记 载。
阿魏药用价值 ： 阿魏味苦、 辛、 性温。归脾、 胃经。有消积， 散脾， 杀虫等功效。用于 肉食积滞， 瘀血、 腹中痞块， 虫积腹痛等症。阿魏成分 ： 阿魏主要含有树脂， 树胶和挥发油等 有效成分。树脂主要含有阿魏酸及其脂类， 还有香草醛等 ； 挥发油中主要含有蒎烯， 并伴有 多种二硫化合物。主要药理作用 ： 阿魏有双向调节平滑肌、 抗过敏、 抗生育、 抗溃疡、 抑菌等 生理作用。
我国药用阿魏过去主要靠进口， 解放前为少数民族用药。目前的阿魏药材主要来 源于野生资源， 而且主要产于新疆地区。
由于阿魏要 8 年才能开花结实， 而药材又在开花结实前采割， 50 年代阿魏年产量 几千公斤， 由于大量垦荒造田和不合理采收使植株死亡或失去生长繁殖能力， 加之春季阿 魏生育期正值牧草缺少季节， 放牧影响了阿魏生长。自从 70 年代以来， 随着阿魏资源的过 度开发和生态环境的破坏， 阿魏药用植物资源在自然条件下濒临灭绝， 现在新疆阿魏和阜 康阿魏皆被列为国家三级保护植物， 其植物资源处于濒危的边缘。
同时， 新疆地区的阿魏植物中仅具蒜样异臭的少数几种阿魏所提取的树脂才能作 为药用， 其他多达 16 种阿魏虽然数量和面积都非常大， 也有块状树脂溢出， 但无特异臭味， 称为香阿魏， 不能药用。
目前药用阿魏一般通过以下方法鉴定 ： 一是性状鉴别， 通过外观、 颜色、 气味等进 行鉴别， 误鉴率较高， 二是化学鉴定， 虽然鉴别相对性状鉴别比较准确， 但实施要求较高， 不 易进行， 而且仍有很高的误鉴率。
ISSR 分子标记是简单序列重复区间 (Inter Simpie Sequence Repeat， ISSR)DNA 标记技术， 结合了 SSR 和 RAPD 的优点， 具有模板需要量少， 多态性丰富， 成本低， 操作简单 ， 稳定性高等优点， 而较之 AFLP 又具技术要求较低的特点。
近年来 ISSR 已广泛应用于品种鉴定、 种质资源和遗传多样性研究等领域。
由于 ISSR 分子标记技术是基于 PCR 的一种分子标记技术， 其扩增结果受模板 DNA 2+ 浓度、 引物浓度、 Taq DNA 聚合酶浓度、 Mg 浓度、 dNTP 浓度等多种因素的综合影响， 因此有 必要筛选出 ISSR 分析对反应体系的最佳方法。
因此一种用 ISSR 分子标记法对新疆药用阿魏进行快速鉴别的方法就应运而生。发明内容 本发明的目的是提供一种能够快速鉴别新疆药用阿魏的方法， 特别是一种用 ISSR 分子标记法对新疆药用阿魏品种进行快速鉴别的方法， 以实现在人工繁育中保证品种的准 确性和繁育的高效性。
本发明通过以下技术方案实现 ： 以新疆阿魏幼苗为材料， 具体方法是将解除休眠的新疆阿魏种子播于穴盘萌发幼苗， 待幼苗长出两片真叶时取样， 液氮冷冻后于 -70~ -100℃保存， 待用 ； 所使用的引物序列 （5---3） 为： (CT)8RC， 所用的引物浓度为 ：0.6 ～ 0.85vmol/L ； 基因组 DNA 的提取及 DNA 质量检测 ： 采用改良的 CTAB 微量法提取基因组总 DNA， 用 0.6~1.0% 的琼脂糖电泳检测 DNA 质 量， DNA 的纯度和浓度用紫外分光光度计法测定， 并将 DNA 浓度稀释到 10~30ng/vL， 于 -18~ -25℃保存备用 ； 检测所用的试剂 ： dNTPs 浓度为 ： 0.4 ～ 0.8mmol ／ L， Mg2+ 浓度为 ： 浓度为 1.0 ～ 1.5mmol/L， Taq DNA 聚合酶浓度 ：1.0 ～ 1.5U。
采用本 ISSR 分子标记法对新疆药用阿魏进行品种鉴定、 种质资源和遗传多样性 进行研究， 具有模板需要量少、 多态性丰富、 成本低、 操作简单、 稳定性高等优点， 而较之 AFLP 又具技术要求较低的特点。
具体实施方式
实施例 1 ： 材料处理 ： 将解除休眠的新疆阿魏种子播于穴盘萌发幼苗， 待幼苗长出两片真叶时取 样， 液氮冷冻后于 -80℃保存， 待用。
所选引物与试剂 ： 实验所用 TaqDNA 聚合酶、 dNTP、 DNAmarker(DL2000) 均购自 TaKaRa( 宝 ) 生物工程 （大连） 有限公司。ISSR 引物采用加拿大哥伦比亚大学 （Uniwersity of British Columbia,UBC） 所设计的引物， 由上海生物工程技术服务有限公司合成。所使 用的引物序列如下 （5---3） ： (CT)8RC。
DNA 提取及检验方法 ： 采用改良的 CTAB 微量法提取基因组总 DNA（欧文军等， 2008） ， 用 1.0% 的琼脂糖电泳检测 DNA 质量， DNA 的纯度和浓度用紫外分光光度计法测定， 并将 DNA 浓度稀释到 20ng/vL， 于 -20℃保存备用。
实验条件 ： 引物浓度 ： 0.6vmol/L 作为 ISSR-PCR 反应体系中引物的最佳浓度。
DNTP ： 因此选用 0.4mmol/L 浓度即可。 2+
Mg 浓度 ： 为 1.0mmol/L 时， 谱带清晰。
DNA 聚合酶浓度 ： 为 1.0U 时观察是否扩增出的一些条带及清晰度。当出现条带并 比较清晰的情况出现， 即表明是我们需要的品种， 否则或不出现条带则是我们不需要的品 种。
PCR 产物检测 ： 用含 EB(0.48 g·mL-1 ) 的 1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。在凝胶成像系统上观察电泳结果并记录凝胶图像。
实施例 2 ： 材料处理 ： 将解除休眠的新疆阿魏种子播于穴盘萌发幼苗， 待幼苗长出两片真叶时取 样， 液氮冷冻后于 -75℃保存， 待用。
所选引物与试剂 ： 实验所用 TaqDNA 聚合酶、 dNTP、 DNAmarker(DL2000) 均购自 TaKaRa( 宝 ) 生物工程 （大连） 有限公司。ISSR 引物采用加拿大哥伦比亚大学 （Uniwersity of British Columbia,UBC） 所设计的引物， 由上海生物工程技术服务有限公司合成。所使 用的引物序列如下 （5-----3） ： (CT)8RC。
DNA 提取及检验方法 ： 采用改良的 CTAB 微量法提取基因组总 DNA（欧文军等， 2008） ， 用 0.7% 的琼脂糖电泳检测 DNA 质量， DNA 的纯度和浓度用紫外分光光度计法测定， 并将 DNA 浓度稀释到 25ng/vL， 于 -20℃保存备用。
实验条件 ： 引物浓度 ： 0.65vmol/L 作为 ISSR-PCR 反应体系中引物的最佳浓度。
DNTP ： 因此选用 0.8mmol/L 浓度即可。 2+
Mg 浓度 ： 为 1.2mmol/L 时， 谱带清晰。
DNA 聚合酶浓度 ： 为 1.2U 时观察是否扩增出的一些条带及清晰度。当出现条带并 比较清晰的情况出现， 即表明是我们需要的品种， 否则或不出现条带则是我们不需要的品 种。
PCR 产物检测 ： 用含 EB(0.5 g·mL-1 ) 的 1.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。 在凝胶成像系统上观察电泳结果并记录凝胶图像。
实施例 3 ： 材料处理 ： 将解除休眠的新疆阿魏种子播于穴盘萌发幼苗， 待幼苗长出两片真叶时取 样， 液氮冷冻后于 -85℃保存， 待用。
所选引物与试剂 ： 实验所用 TaqDNA 聚合酶、 dNTP、 DNAmarker(DL2000) 均购自 TaKaRa( 宝 ) 生物工程 （大连） 有限公司。ISSR 引物采用加拿大哥伦比亚大学 （Uniwersity of British Columbia,UBC） 所设计的引物， 由上海生物工程技术服务有限公司合成。所使 用的引物序列如下 （5-----3） ： (CT)8RC。
DNA 提取及检验方法 ： 采用改良的 CTAB 微量法提取基因组总 DNA（欧文军等， 2008） ， 用 0.8% 的琼脂糖电泳检测 DNA 质量， DNA 的纯度和浓度用紫外分光光度计法测定， 并将 DNA 浓度稀释到 20ng/vL， 于 -18℃保存备用。
实验条件 ： 引物浓度 ： 0.75vmol/L 作为 ISSR-PCR 反应体系中引物的最佳浓度。
DNTP ： 因此选用 0.8mmol/L 浓度即可。 2+
Mg 浓度 ： 为 1.5mmol/L 时， 谱带清晰。
DNA 聚合酶浓度 ： 为 1.4U 时观察是否扩增出的一些条带及清晰度。当出现条带并 比较清晰的情况出现， 即表明是我们需要的品种， 否则或不出现条带则是我们不需要的品 种。
PCR 产物检测 ： 用含 EB(0.52 g·mL-1 ) 的 1.2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。 在凝胶成像系统上观察电泳结果并记录凝胶图像。实施例 4 ： 材料处理 ： 将解除休眠的新疆阿魏种子播于穴盘萌发幼苗， 待幼苗长出两片真叶时取 样， 液氮冷冻后于 -80℃保存， 待用。
所选引物与试剂 ： 实验所用 TaqDNA 聚合酶、 dNTP、 DNAmarker(DL2000) 均购自 TaKaRa( 宝 ) 生物工程 （大连） 有限公司。ISSR 引物采用加拿大哥伦比亚大学 （Uniwersity of British Columbia,UBC） 所设计的引物， 由上海生物工程技术服务有限公司合成。所使 用的引物序列如下 （5-----3） ： (CT)8RC。
DNA 提取及检验方法 ： 采用改良的 CTAB 微量法提取基因组总 DNA（欧文军等， 2008） ， 用 0.6% 的琼脂糖电泳检测 DNA 质量， DNA 的纯度和浓度用紫外分光光度计法测定， 并将 DNA 浓度稀释到 20ng/vL， 于 -22℃保存备用。
实验条件 ： 引物浓度 ： 0.85vmol/L 作为 ISSR-PCR 反应体系中引物的最佳浓度。
DNTP ： 因此选用 0.8mmol/L 浓度即可。 2+
Mg 浓度 ： 为 1.5mmol/L 时， 谱带清晰。
DNA 聚合酶浓度 ： 为 0.9U 时观察是否扩增出的一些条带及清晰度。当出现条带并 比较清晰的情况出现， 即表明是我们需要的品种， 否则或不出现条带则是我们不需要的品 种。 PCR 产物检测 ： 用含 EB(0.55 g·mL-1 ) 的 0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。 在凝胶成像系统上观察电泳结果并记录凝胶图像。
实施例 5 ： 材料处理 ： 将解除休眠的新疆阿魏种子播于穴盘萌发幼苗， 待幼苗长出两片真叶时取 样， 液氮冷冻后于 -78℃保存， 待用。
所选引物与试剂 ： 实验所用 TaqDNA 聚合酶、 dNTP、 DNAmarker(DL2000) 均购自 TaKaRa( 宝 ) 生物工程 （大连） 有限公司。ISSR 引物采用加拿大哥伦比亚大学 （Uniwersity of British Columbia,UBC） 所设计的引物， 由上海生物工程技术服务有限公司合成。所使 用的引物序列如下 （5-----3） ： (CT)8RC。
DNA 提取及检验方法 ： 采用改良的 CTAB 微量法提取基因组总 DNA（欧文军等， 2008） ， 用 0.6% 的琼脂糖电泳检测 DNA 质量， DNA 的纯度和浓度用紫外分光光度计法测定， 并将 DNA 浓度稀释到 25ng/vL， 于 -20℃保存备用。
实验条件 ： 引物浓度 ： 0.70vmol/L 作为 ISSR-PCR 反应体系中引物的最佳浓度。
DNTP ： 因此选用 0.7mmol/L 浓度即可。 2+
Mg 浓度 ： 为 1.3mmol/L 时， 谱带清晰。
DNA 聚合酶浓度 ： 为 0.8U 时观察是否扩增出的一些条带及清晰度。当出现条带并 比较清晰的情况出现， 即表明是我们需要的品种， 否则或不出现条带则是我们不需要的品 种。
PCR 产物检测 ： 用含 EB(0.5 g·mL-1 ) 的 0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。 在凝胶成像系统上观察电泳结果并记录凝胶图像。
实施例 6 ：
材料处理 ： 将解除休眠的新疆阿魏种子播于穴盘萌发幼苗， 待幼苗长出两片真叶时取 样， 液氮冷冻后于 -78℃保存， 待用。
所选引物与试剂 ： 实验所用 TaqDNA 聚合酶、 dNTP、 DNAmarker(DL2000) 均购自 TaKaRa( 宝 ) 生物工程 （大连） 有限公司。ISSR 引物采用加拿大哥伦比亚大学 （Uniwersity of British Columbia,UBC） 所设计的引物， 由上海生物工程技术服务有限公司合成。所使 用的引物序列如下 （5-----3） ： (CT)8RC。
DNA 提取及检验方法 ： 采用改良的 CTAB 微量法提取基因组总 DNA（欧文军等， 2008） ， 用 0.6% 的琼脂糖电泳检测 DNA 质量， DNA 的纯度和浓度用紫外分光光度计法测定， 并将 DNA 浓度稀释到 25ng/vL， 于 -22℃保存备用。
实验条件 ： 引物浓度 ： 0.75vmol/L 作为 ISSR-PCR 反应体系中引物的最佳浓度。
DNTP ： 因此选用 0.7mmol/L 浓度即可。 2+
Mg 浓度 ： 为 1.2mmol/L 时， 谱带清晰。
DNA 聚合酶浓度 ： 为 0.8U 时观察是否扩增出的一些条带及清晰度。当出现条带并 比较清晰的情况出现， 即表明是我们需要的品种， 否则或不出现条带则是我们不需要的品 种。
PCR 产物检测 ： 用含 EB(0.5 g·mL-1 ) 的 0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。 在凝胶成像系统上观察电泳结果并记录凝胶图像。7