猪骨髓间充质干细胞体外向心肌细胞分化的方法学体系构建.pdf

猪骨髓间充质干细胞体外向心肌细胞分化的方法学体系构 建
    【技术领域】
     本发明涉及骨髓间充质干细胞体外向心肌细胞分化的方法学体系构建。背景技术 近年来， 干细胞再生医学在心血管疾病治疗中取得了突破性进展， 该技术又被称 为细胞心肌成形术 (cellular cardiomyoplasty)， 即通过移植干细胞或心肌细胞， 或者动 员外周循环血干细胞或骨髓干细胞迁移到心肌受损部位来实现损伤心肌的修复。 移植干细 胞实施细胞心肌成形术是改善心肌梗死造成的血液动力学和神经体液紊乱的一种可行的 方法。各种前期动物实验表明干细胞具有修复心肌细胞的能力， 能改善梗死区的灌注和心 功能 [Schuster MD， Kocher AA， Seki T， Martens TP， Xiang G， Homma S， et al.Myocardial neovascularization bybone marrow angioblasts results in cardiomyocyte regeneration.Am JPhysiol Heart CircPhysiol 2004 ； 287 ： H525-532.(Schuster MD， KocherAA， Seki T， Martens TP， Xiang G， Homma S 等， 骨髓成血管细胞引起的血管新生导致 心肌细胞再生 . 美国生理杂志心脏和循环分册 2004 ； 287 ： H525-532.)]。
     在 用 于 移 植 的 的 多 种 细 胞 类 型 中， 尤 以 骨 髓 来 源 的 间 充 质 干 细 胞 (bone marrow-derived mesenchymal stem cells， MSCs) 成为关注的焦点， 因为其有着获取方便、 自体移植从而免除免疫排斥反应、 强大的体外增殖潜能和向三胚层组织类型的细胞分化能 力等显著的优点， 体外和在体移植实验均证实 MSCs 可以向心肌细胞分化 [Tomita S， Li RK， Weisel RD， et al.Autologous transplantation of bone marrow cellsimproves damaged heart function.Circulation.1999 ； 100 ： II247-56.(Tomita S， Li RK， Weisel RD 等， 自体 骨髓干细胞移植改善 受损的心功能 . 循环， 1999 ； 100 ： II247-56.)]。 然而也有一些资料显 示 MSCs 在体移植后不能横向分化为心肌， 即使是经过 5- 氮胞苷的诱导后也不能分化为心 肌细胞 [Liu Y， Song J， Liu W， et al.Growth anddifferentiation of rat bone marrow stromal cells ： does 5-azacytidinetrigger their cardiomyogenic differentiation ？ Cardiovasc.Res.2003 ； 58 ： 460-8.(Liu Y， Song J， Liu W， 等 . 大鼠骨髓间充质干细胞的增 殖和分化 ： 5- 氮胞苷能启动其向心肌细胞分化吗？心血管研究 .2003 ； 58 ： 460-8.)]。
     导致上述结果争议的原因很多， 其中最主要的是现有的诱导方法不足以提供确切 的实验证据。
     而本课题组前期研究在国际上首次发现， 猪骨髓 MSCs 在体外培养到一定代数， 即 自发出现向心肌细胞分化的现象。 基于此， 本研究在前期实验的基础上， 创新实验方法及干 预手段， 选择特定培养代数的猪骨髓 MSCs， 并给予特定浓度的 5- 氮胞苷进行诱导， 以探索 构建骨髓 MSCs 向心肌细胞横向分化的新体系。
     发明内容
     1. 本发明表明特定浓度的 5- 氮胞苷可以诱导 P10 代 MSCs 成心肌分化， 且分化的心肌细胞结构成熟， 形态更典型， 分化效率更高。
     2. 本发明结果提示 MSCs 培养状态下增殖潜能呈不均一性。
     3. 本发明首次发现猪骨髓来源的 MSCs(10.3±1.8％ ) 在 P10 代时能自发分化为 心肌样细胞， 即使在传代到 30 代时仍保持这种自发分化能力。免疫组化、 电镜和 RT-PCR 均 表明分化而成的是心肌样细胞， 而非骨骼肌细胞。这些自发分化的 MSCs 可能就是 MSCs 培 养过程中的定型的亚群。本发明发现猪骨髓 MSCs 在 P1， P4 和 P8 代时增殖较快， 从 P10 代 开始减缓， 并出现自发分化现象， 也支持上述观点。
     4. 本发明发现 5- 氮胞苷 (10μM) 能够诱导 P1， P4， P8 和 P10 代 MSCs 成心肌分 化， 重要的是电镜发现 P10 代分化细胞有相对比较成熟的心肌样结构， 如排列整齐的肌丝、 肌节、 横纹和闰盘， 而在其他早期代 数的分化细胞中只发现一些肌丝。这些超微结构上的 差异可能是由于 P10 代 MSCs 包含有定型的细胞前体， 这些定型前体已经开始表达心肌表 型， 这样在为期 4 周的诱导观察期内更加成熟， 而早期代数的 MSCs 大多处于未定型的 “干细 胞” 阶段， 5- 氮胞苷只是启动了这些细胞的分化方向， 因此在相同的观察期内并未达到相对 成熟的阶段。这些在超微结构上的差异也被定量 RT-PCR 结果所证实。
     综上所述， 本发明首次发现猪骨髓来源的 MSCs 在体外培养状态下增殖到 P10 代时 有部分组分出现增速减缓、 形态改变、 自发成心肌分化现象 ； 并且在 5- 氮胞苷诱导下 P10 代 MSCs 分化比率显著高于早期各代细胞， 超微结构更趋成熟。 具体实施方式 材料与方法
     实验动物
     10 月龄的中华小型猪， 体重 (30kg±5kg)， 由中国农业大学实验动物中心提供。 所有实验动物均受到人道对待， 符合美国国立卫生研究院颁布的 《实验动物管理和使用指 南》 。 并且， 所有实验方案均得到了中国医学科学院实验动物管理委员会和中国协和医科大 学阜外心血管病医院实验动物伦理委员会的认可。
     猪骨髓单个核细胞 (MNCs) 的分离、 培养和鉴定
     肌肉注射氯胺酮和地西泮对猪进行麻醉， 两种药物剂量分别为 25mg/kg 和 1mg/ kg。在无菌操作下对猪的左髂嵴处备皮、 铺单， 用含 12,500 单位肝素的注射器抽取约 50ml 骨髓。所有实验动物在送回饲养间之前均肌肉注射丁丙诺啡 0.3mg 止痛。
     MNCs 的分离按以前报道方法略作修改。即抽取的骨髓用磷酸盐缓冲液 (PBS) 稀 释 1 倍， 加入硅石胶态悬浮液 (Percoll 分离液， 1.077g/ml， Sigma 公司 )， 在 4 ℃条件下， 5 2 2 800g 离心 30 分钟分离出 MNCs。以 5×10 /cm 密度接种于 75cm 培养瓶中， 置入 37℃、 5％ CO2 饱和湿度培养箱中培养。正常生长培养基为低糖 Dulbecco’ s Modified Eagle’ s Medium(LG-DMEM， Gibco)、 13％胎牛血清 (FBS， Gibco)。
     形态学观察和增殖能力测定
     取第 1， 4， 8， 10 代 MSCs(passage 1， 4， 8， 10， P1， P4， P8， P10) 按照 300 个细胞 / 孔 密度接种于 96 孔培养板上， 每代细胞取 4 孔样品消化后以 2ml PBS 稀释， 在相差显微镜下 以细胞计数板进行计数， 每 24h 进行一次计数直至细胞停止增殖为止。计算平均活细胞数 并绘制增殖曲线。细胞倍增时间 (population doubling time， TD) 按照下列公式计算 ： TD
     ＝ t(log 2)/(logNt-logNo)， t 为培养时间， No 和 Nt 分别为接种前后的细胞数。
     体外成心肌分化的诱导
     为检测 5- 氮胞苷是否能诱导 MSCs 成心肌分化， 选取 P1， P4， P8， P10 代 MSCs， 按 5 照 2×10 /ml 密度接种， 接种后第二天向培养瓶中加入 5- 氮胞苷 (10μM)， 作用 24h 后洗去 5- 氮胞苷， 继续传代 4 周， 观察细胞形态变化并作进一步检测。
     RT-PCR 和实时荧光定量 RT-PCR
     从待检细胞中以 Trizol(Gibco) 提取总 RNA， 合成 cDNA。扩增以下基因 ： GATA4， α-MHC， MLC， phospholamban， connexin 43，心 肌 troponin I， α-sarcomeric actin， desmin， 骨骼肌 α-skeletal actin。选取 GAPDH 基因作为内参。来源于同一头猪的心肌细 胞的总 RNA 同时进行 RT-PCR 扩增以作为阳性对照， 以水代替 cDNA 作为阴性对照。
     实时荧光定量 RT-PCR ： 每个循环结束荧光光谱测量 SYBR Green 强度， 循环完成后 在 75℃ -95℃温度范围和连续荧光监测基础上分析溶解曲线， 所有反应独立重复 3 次以确 保结果的可重复性。
     透射电镜观察超微结构
     贴壁培养的细胞以 37℃预热的 PBS 洗 2 次， 加 0.2％戊二醛固定 30min 后以 PBS 洗 2 次， 以细胞刮轻轻刮下细胞转入离心管进行离心， 800rpm×6min， 弃上清， PBS 洗 1 次， 转至 EP 管中， 加入等体积的 10％琼脂糖混匀， 离心弃上清， 以 5％戊二醛固定， 环氧树脂包 埋， 60-nm 超薄切片 (Sorvall MTB2 ultramicrotome)， 切片以醋酸铀柠檬 酸铅双染， 75KV 透射电镜下观察超微结构 (Nihon Denshi)。
     免疫组化
     MSCs 达 到 80 ％ 融 合 时 弃 培 养 基， 检测以下抗体 ： CD34(1 ∶ 50， Santa Cruz)， CD 45(1 ∶ 50， Santa Cruz)， CD 90(1 ∶ 50， Santa Cruz)， SH2(1 ∶ 50， Santa Cruz)， α-sarcomeric actin(α- 横纹肌肌动蛋白， 1 ∶ 100， DAKO)， α-MHC(α- 肌球蛋白重链， 1 ∶ 100， DAKO)， cardiac troponin T( 心肌肌钙蛋白 T， cTn-T， 1 ∶ 50， Sigma)， connexin 43( 连接蛋白 43， Cx43， 1 ∶ 50， Sigma)。为确定成心肌细胞分化比率， 以 cTn-T 阳性作为成 心肌分化细胞， 每份样品取 2 张玻片， 每张玻片随机取 5 个视野 (400×)， 计数细胞总数和 cTn-T 阳性细胞数。
     统计分析
     连续变量以 means±SD 表示， 各组样品分化比率差别以 X2 检验进行统计分析， 以P ＜ 0.05 作为统计学差异显著性标志。
     结果
     1. 猪骨髓来源的 MSCs 体外培养的特性
     形态学观察
     猪骨髓单个核细胞接种后 3 天开始有部分细胞呈现成纤维细胞样贴壁、 变长， 逐 渐形成小克隆， 7-10 天后， 贴壁细胞达到 80 ％融合时呈现为相对均一的成纤维细胞样形 态， 免疫组化表型鉴定可见＞ 95％贴壁细胞为 CD90、 SH2 阳性， 而 CD34、 CD45 阴性。
     MSCs 增殖模式
     原代培养后 3-7 天， 大多贴壁细胞形成克隆， 开始进入对数生长期直至平台期。 P1、 P4 和 P8 代 MSCs 增殖速率相似， 15 天观察期内未见显著性差异 (P ＝ 0.908)， 倍增时间(PD) 约为 48h。自接种后第 3 天起， P10 代 MSCs 增殖速率则相对变慢 (P ＜ 0.05)， PD 约为 72h， P10 以上代数的 MSCs 增殖速率和 P10 相似。
     2. 不同代数 MSCs 在正常生长和诱导条件下成心肌分化潜能
     形态学和增殖能力变化
     在正常培养状态下， P1、 P4 和 P8 代 MSCs 形态相似， 但是自 P10 代开始有部分细胞 出现形态学变化， 表现为多核、 胞浆延长、 和邻近细胞形成连接， 转变为克隆样、 球样或者肌 管样形态。5- 氮胞苷诱导后 1 周， P1、 P4 和 P8 代 MSCs 均表现为较长的胞浆形态和多核化， 4 周后更多细胞相互连接形成不规则的管样结构， 而 P10 代 MSCs 则形成相对规则的肌管样 结构。
     RT-PCR 和实时荧光定量 RT-PCR
     RT-PCR 结果表明 P1、 P4 和 P8 代 MSCs 在正常培养状态下没有心肌特异性转录因 子和功能基因的表达， 而 P10 代 MSCs 则有心肌特异性转录因子 GATA4 和功能基因 connexin 43、 desmin、 phospholabman、 α-MHC 和 MLC 的 表 达， 未 观 察 到 骨 骼 肌 actin 基 因 的 表 达。5- 氮胞苷诱导后 4 周， 所有代数的 MSCs 均有上述基因的表达。实时定量 PCR 结果表 明， GATA4 和 MLC 在 P10 代诱导 MSCs 的表达丰度显著高于 P4 代诱导细胞 (P ＝ 0.018， P ＜ 0.0001， n ＝ 3)， 骨骼肌 actin 基因在所有检测样品中均未见表达。 免疫组化分析
     在正常培养状态下， P1、 P4 和 P8 代 MSCs 未检测到心肌特异性结构蛋白的表达， 而在 P10 代 MSCs 则有 10.3±1.8％的细胞表达以下心肌特异蛋白 ： α-sarcomeric actin、 α-cardiac MHC、 cardiac troponin T 和 connexin 43。
     5- 氮胞苷诱导后 4 周， P1、 P4、 P8 和 P10 代 MSCs 均表达上述心肌特异性结构蛋白， P1、 P4 和 P8 代 MSCs 分化比率相似 (18.31±8.2％ vs17.62±11.9％ vs 16.52±5.0％， respectively， P ＞ 0.05)， 但 均 显 著 低 于 P10 代 MSCs 分 化 比 率 (44.52±4.2 ％， P＝ 0.0001)。
     透射电镜超微结构观察
     电镜显示在正常生长状态下， P1、 P4 和 P8 代 MSCs 未见任何肌细胞样结构， 而 P10 代 MSCs 有部分细胞出现不规则肌丝， 但是未见心肌特异性的横纹、 肌节和闰盘等结构。 5- 氮胞苷诱导后 4 周 P1、 P4 和 P8 代 MSCs 显示有较多不规则肌丝、 散乱肌节和横纹， 而 P10 代 MSCs 则见丰富的肌丝、 规则的肌节和横纹， 并可见闰盘样结构。
     结论
     本研究结果表明特定浓度的 5- 氮胞苷可以诱导 P10 代 MSCs 成心肌分化， 且分化 的心肌细胞结构成熟， 形态更典型， 分化效率更高。
     在光镜下观察， MSCs 似乎是相当均一的成纤维样细胞， 然而我们发现 MSCs 在 P10 代时有一小部分开始呈现特化的细胞形态， 不再表现为成纤维样细胞的形态， 提示 MSCs 培 养状态下增殖潜能的不均一性。我们结果也显示 MSCs 体外培养时具有不同层级的增殖潜 能。
     我们首次发现猪骨髓来源的 MSCs(10.3±1.8％ ) 在 P10 代时能自发分化为心肌 样细胞， 即使在传代到 30 代时仍保持这种自发分化能力。免疫组化、 电镜和 RT-PCR 均表明 分化而成的是心肌样细胞， 而非骨骼肌细胞。这些自发分化的 MSCs 可能就是 MSCs 培养过
     程中的定型的亚群。我们发现猪骨髓 MSCs 在 P1， P4 和 P8 代时增殖较快， 从 P10 代开始减 缓， 并出现自发分化现象， 也支持上述观点。
     我们研究发现 5- 氮胞苷 (10μM) 能够诱导 P1， P4， P8 和 P10 代 MSCs 成心肌分化， 重要的是电镜发现 P10 代分化细胞有相对比较成熟的心肌样结构， 如排列整齐的肌丝、 肌 节、 横纹和闰盘， 而在其他早期代数的分化细胞中只发现一些肌丝。 这些超微结构上的差异 可能是由于 P10 代 MSCs 包含有定型的细胞前体， 这些定型前体已经开始表达心肌表型， 这 样在为期 4 周的诱导观察期内更加成熟， 而早期代数的 MSCs 大多处于未定型的 “干细胞” 阶 段， 5- 氮胞苷只是启动了这些细胞的分化方向， 因此在相同的观察期内并未达到相对成熟 的阶段。这些在超微结构上的差异也被定量 RT-PCR 结果所证实。
     综上所述， 本研究首次发现猪骨髓来源的 MSCs 在体外培养状态下增殖到 P10 代时 有部分组分出现增速减缓、 形态改变、 自发成心肌分化现象 ； 并且在 5- 氮胞苷诱导下 P10 代 MSCs 分化比率显著高于早期各代细胞， 超微结构更趋成熟。7