使用选择性信号抑制剂的非分离式测定 背景技术 特异性结合测定是用于检测物质存在或含量的测试方法， 并且是以特异性识别和 与特异性结合伴侣结合一起为基础的。免疫测定是特异性结合测定的实例， 其中抗体可结 合于特定的蛋白质或化合物。在这些实例中， 抗体是特异性结合配对成员中的成员。核酸 结合性测定是另一种类型， 其中互补核酸链是特异性结合配对。特异性结合测定构成了较 宽的和正在发展的技术领域， 其能够精确地检测疾病状态、 传染性生物体和药物滥用。 在过 去的几十年中， 一直进行这些工作， 以便设计出具有所要求的灵敏度、 动态范围、 实用性、 广 泛适用性和适合自动化的分析和测定方法。这些方法能够被大体分组为两个类型。
均相方法利用特异性结合分析物的反应来调节或者产生可检测信号， 无需要求在 对分析物特异性的反应物和对分析物非特异性的反应物之间的分离步骤。 异相形式则依赖 于被分析物结合的和游离的 ( 未被结合于分析物 ) 的可检测地标记的特异性结合伴侣之间 的物理分离。分离典型地要求关键的反应物被固定化到一些类型的固体基材上， 以使得一 些类型的物理过程例如过滤、 沉积、 聚结或者磁力分离可以被采用 ； 并且典型地还要求洗涤 步骤， 以便除去游离的可检测地标记的特异性结合伴侣。
依赖于产生化学发光信号并且与分析物含量相关联的测定方法已经经历越来越 多的应用。这些方法能够使用相对简单的仪器进行， 仍然可显示良好的分析特性。特别地， 使用酶标记的用于分析物的特异性结合伴侣和化学发光的检测用酶底物的方法已经得到 了广泛应用。普通的标记酶包括碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。
美国专利 6,911,305 公开了一种方法， 用于在第一薄膜上检测结合于敏化剂、 或 用敏化剂标记的探针的多聚核苷酸分析物。 该薄膜和携带有固定化化学发光前体的第二薄 膜相接触。激发在夹心薄膜中的敏化剂可产生单线态氧， 单线态氧可与化学发光前体反应 从而在第二薄膜上产生可引发的化学发光化合物。 该可引发的化学发光化合物可与试剂起 反应从而在第二薄膜上产生化学发光， 用于检测分析物。这些方法并不依赖于用于使反应 物进行接触的特异性结合反应 ； 相反， 第二薄膜用作试剂输送装置。
美国专利 6,406,913 公开的测定方法包括在一定条件下处理怀疑含有分析物的 介质， 使得该分析物可以引起光敏剂和化学发光化合物获得密切接近。该光敏剂当用光源 辐照时可产生单线态氧 ； 单线态氧可通过溶液扩散至化学发光化合物， 并且当密切接近化 学发光化合物时， 单线态氧可激活该化学发光化合物。被激活的化学发光化合物随后产生 光。产生的光量与介质中的分析物含量有关。在一种实施方式中， 至少一种光敏剂或化学 发光化合物与悬浮的颗粒相关联， 并且特异结合性配对成员被与其相结合。
美国专利申请公开 US20070264664 和 US20070264665 公开了用于进行特异性结合 配对分析的测定方法， 涉及固定化化学发光化合物与活化剂化合物的反应， 所述固定化化 学发光化合物和活化剂化合物借助于特异性结合反应而进入反应性构造中。 其不要求分离 或者除去过量的未结合的化学发光化合物或者活化剂。与现有测定技术相比， 这些测定形 式提供了优良的操作便利性和在自动化中的灵活性。尽管具有这些优点， 在测定方法设计 和性能中附加的改进始终是分析方法开发人员的目标。 本发明公开的测定方法通过提供简
单的灵敏度改进的测定法而满足了这些需要。 发明内容 定义
烷基 -- 含有 1-20 个碳的支链、 直链或者环烃基团， 其可以用 1 个以上除 H 之外的 取代基取代。在此使用的低级烷基是指含有 8 个以下碳原子的那些烷基。
分析物 -- 测定中在待检测样品中的物质。一种以上对分析物具有特异性结合亲 合力的物质将被用于检测分析物。 该分析物可以是蛋白质、 肽、 抗体、 或半抗原， 与这些分析 物结合的抗体可以被制备。该分析物可以是核酸或低聚核苷酸， 其可以被互补的核酸或低 聚核苷酸结合。该分析物可以是任何其他可形成特异性结合配对成员的物质。其他示例性 的分析物类型包括 ： 药物比如甾族化合物、 激素、 蛋白质、 糖蛋白、 粘蛋白、 核蛋白、 磷蛋白、 滥用药物、 维生素、 抗菌药物、 抗真菌药物、 抗病毒药物、 嘌呤、 抗肿瘤药试剂、 安非他明、 氮 杂化合物、 核苷酸、 和前列腺素、 以及所有这些药物的代谢产物、 杀虫剂和杀虫剂的代谢产 物、 以及受体。分析物还包括细胞、 病毒、 细菌和真菌。
活化剂 -- 一种化合物， 还可被认为是标记， 其具有活化化学发光化合物的功能以 使得在引发剂存在的条件下产生化学发光。 被活化剂标记的特异性的结合成员 (sbm) 或者活化剂特异性的结合成员共轭 物 -- 在测定混合物中的反应物， 该混合物至少包括连接构造中的下述物质 ： a) 用于分析物 的特异性结合成员 ； 和 b) 具有活化化学发光化合物效果的活化剂化合物或标记。 抗体 -- 包括天然的和基因工程化的全长免疫球蛋白以及免疫球蛋白的天然的和基因 工程化的部分和片段。
芳烷基 -- 用芳基取代的烷基。例子包括苯甲基、 二苯甲基、 三苯甲基、 和苯乙基。
芳基 -- 含有芳香环的基团， 该基团含有 1 至 5 个碳环的芳香环， 其可以用 1 个以 上除 H 之外的取代基取代。
生物材料 -- 包括， 例如 ： 全血、 抗凝血的全血、 血浆、 血清、 组织、 动植物细胞、 细胞 内容物、 病毒、 以及真菌。
化学发光化合物 -- 一种化合物， 其还可以被称为标记， 其可例如通过被转化为另 一种在电子激发态下形成的化合物而参与引起光辐射的反应。 该激发态可以是单线激态或 三重激态。该激发态可以刚一衰减成基态就直接发光， 或者可以将激发能传递至发射能受 体， 借此返回到基态。在该过程中， 能量受体跃迁至激发态并发光。
化学发光标记的固定化的特异性的结合成员 (sbm)-- 在测定混合物中的反应物， 该混合物至少包括连接构造中的下述物质 ： a) 用于分析物的特异性结合成员 ； b) 化学发光 化合物或标记 ； 和 c) 固相。
连接 -- 在此使用的该术语是指两个以上化学物种或者支持材料被通过化学法连 接， 例如通过一个以上共价键， 或者被动地附着例如通过吸附、 离子吸引， 或者特异性结合 过程比如亲合性结合。当这些物种或者材料彼此相连接时， 能够涉及一种以上连接类型。
杂烷基 -- 一种烷基， 其中至少一个环或非末端链中的碳原子被选自 N、 O、 或S的 杂原子取代。
杂芳基 -- 一种芳基， 其中 1 至 3 个的环中碳原子被选自 N、 O、 或 S 的杂原子取代。
例举的基团包括 ： 吡啶基、 吡咯基、 噻吩基、 呋喃基、 喹啉基和吖啶基。
磁性粒子 -- 在此使用的磁性粒子包含具有磁性响应成分的颗粒材料。磁性响应 材料包括强铁磁性、 顺磁性和超顺磁性材料。一种示例性的磁性响应材料是磁铁矿。粒子 可以具有磁性响应、 并且被一种以上非磁性响应层包围的实心部分。 可选地， 磁性响应部分 可以是围绕层， 或者可以是设置在非磁性响应核内部的粒子。
样品 -- 在测定中含有或者怀疑含有待测分析物的混合物。分析物包括， 例如 ： 蛋 白质、 肽、 核酸、 激素、 抗体、 药物、 和甾族化合物。 可以在本公开的方法中使用的典型样品包 括： 身体的液体， 比如血液， 其可以是当收集血液标本时通常见到的抗凝血的血液、 血浆、 血 清、 尿液、 精液、 唾液、 细胞培养物、 组织提取液等等。其他类型的样品包括 ： 溶剂、 海水、 工 业用水样品、 食品样品和环境样品比如土壤或水、 植物材料、 真核生物、 细菌、 质粒、 病毒、 真 菌、 以及源于原核生物的细胞。
SSIA(Selective Signal Inhibiting Agent， 选择性信号抑制剂 )-- 一种在本公 开的测定反应混合物中提供的化合物， 其使得非特异性信号或者背景信号与从测定反应混 合物的化学发光产生反应所产生的对分析物特异的信号相比会以更大量降低。
固体支持物 -- 具有测定成分被固定化在其上的表面的材料。材料可以呈如下形 式： 颗粒、 微粒、 纳米颗粒、 金属胶体、 纤维、 纸张、 珠子、 膜片、 滤纸及其他支撑物比如试管、 微孔板、 芯片、 载玻片、 和微阵列。 可溶性的、 溶解性、 增溶 -- 一种物质与另一种物质均匀混合的能力或者趋势。在 本公开中， 溶解性和相关术语一般指的是固体在液体中的特性， 例如在缓冲水溶液中的 SSIA。固体的可溶性是指它们在溶剂 ( 例如液体 ) 中丧失它们的结晶形状并变成呈分子状 态或呈离子状态溶解或者分散、 从而形成真溶液的程度。相反 ： 二相系统， 其中一个相由分 布在整个一体物质内的小颗粒 ( 包括微粒或者胶体大小的颗粒 ) 组成， 不论是否被稳定化 以阻止沉淀、 还是未被稳定化。
取代 -- 是指基团上至少一个氢原子被非氢基团置换。应该注意， 关于被取代基 团， 本文中指的是可以存在多个置换位点， 除非另有明确说明。
试验设备 -- 用于包含根据本发明测定法的样品及其他成分的容器或装置。其包 括， 例如 ： 各种尺寸和形状的试管、 微孔板、 芯片以及其上形成或印刷阵列的载玻片、 试验条 和膜片。
附图说明 图 1A 是曲线图， 显示了 pH 对在实施例 10 中描述的本发明方法的化学发光反应中 背景化学发光的影响。
图 1B 是曲线图， 显示了 pH 对在实施例 10 描述的本发明方法中化学发光反应中特 异性信号化学发光的影响。
图 2A 是曲线图， 显示了在实施例 17 描述的免疫测定方法中 cTnI 的检测。
图 2B 是曲线图， 显示了在实施例 17 描述的免疫测定方法中在稀释度系列中 cTnI 的检测。
图 2C 是曲线图， 显示了在实施例 17 描述的免疫测定方法中在稀释度系列中 cTnI 的检测。
图 3 是曲线图， 显示了通过本发明方法进行的 cTnI 测定与在实施例 18 描述的参 比方法中的结果相比较的结果对比。 具体实施方式
本发明公开提供了改进的用于确定样品中分析物的测定方法。尤其是， 该公开描 述了特异性结合分析物的测定法， 其不需要分离步骤， 并且可提供在分析物特异性信号反 应中相比非特异性信号或者背景的改进。
申请人惊讶地发现， 这样的测定方法能够通过利用选择性信号抑制剂 SSIA 而被 进一步改进。在本发明的方法中， 向测定体系中添加 SSIA 可显著地提高进行敏感的、 特异 性的、 分析物浓度依赖性的结合性测定的能力， 该体系中过量的活化剂和 / 或过量的化学 发光化合物不被除去。测定精确度和灵敏度借此被提高， 导致更可靠的和更有用的测试。 这一改进是预料不到的或不可预测的。通过使用 SSIA， 通过在固定的化学发光标记和活化 剂标记 ( 在被标记的特异结合性配对成员的复合体中， 两者与分析物相连接 ) 之间的反应 产生的信号与来自现有的 ( 但不存在于这样的复合体中的 ) 标记的信号的比率被显著地提 高。另外， 在低分析物含量处的背景效果被最小化。
此前在文献美国专利申请公开 US20070264664 和 US20070264665 中公开的方法提 供了改进的、 快速的和简单的测定方法， 用于通过利用分析物特异性的结合反应来检测物 质的存在、 位置或含量。 这些测定方法涉及固定化化学发光化合物与活化剂化合物的反应， 固定化化学发光化合物与活化剂化合物借助于分析物介导的特异性结合反应而被带入反 应性构造中。 在游离的特异性结合伴侣与复合体中被结合的特异性结合伴侣不进行分离的 情况下， 进行测定和方法。
本发明的方法要求使用 ： 与化学发光标记相连接的固定化的分析物特异性结合成 员； 未固定化的分析物特异性结合成员， 其用于与活化剂相连接的分析物， 所述活化剂用于 与化学发光标记进行反应 ； 以及选择性信号抑制剂。添加引发剂溶液可启动化学发光的发 射， 用于检测分析物。在游离的特异性结合伴侣与复合体中被结合的特异性结合伴侣不进 行分离的情况下， 进行测定和方法。
本发明公开涉及改进的、 快速的并且简单的测定方法， 用于利用分析物特异性的 结合反应来检测物质的存在、 位置或含量。方法要求使用固定化的分析物特异性结合成员 和用于分析物的未固定化的分析物特异性结合成员。 一种分析物特异性结合成员被与化学 发光标记相连接， 而另一种分析物特异性结合成员被与活化剂相连接。 在许多实施方式中， 在含有分析物、 增强剂、 选择性信号抑制剂和引发剂溶液的水溶液中， 当通过与分析物结合 的分析物特异性结合成员之一或两者介导时， 使可诱导化学发光反应的活化剂化合物接近 在固体支持物上的化学发光标记， 借此产生可检测的与分析物浓度相关的化学发光发出信 号。在其他实施方式中， 在含有分析物、 增强剂、 选择性信号抑制剂和引发剂溶液的水溶液 中， 当通过与分析物竞争结合另一种分析物特异性结合成员的一种分析物特异性结合成员 介导时， 在固体支持物上， 可诱导化学发光反应的活化剂化合物被阻断接近化学发光标记， 借此产生可检测的与分析物浓度逆向相关的化学发光信号。
在许多实施方式中， 一种分析物特异性结合成员 (specific binding member， “sbm” ) 与固体支持物和化学发光标记 (“化学发光标记的固定化 sbm” ) 相连接， 而另一种分析物特异性结合成员与在水溶液中未固定化的活化剂相连接 ( “活化剂标记的 sbm” )。当 使活化剂可操作地接近固定化化学发光化合物以使得该活化剂有效地活化反应时， 化学发 光标记的固定化 sbm、 被活化剂标记的 sbm、 增强剂、 选择性信号抑制剂、 样品和引发剂溶液 可产生可检测的信号， 从而刚一添加引发剂溶液就产生化学发光。术语 “可操作地接近” 是 指， 化学发光化合物和活化剂足够接近， 包括并且直至物理接触， 这样它们能够进行反应。 在许多实施方式中， 向该体系提供的被活化剂标记特异性结合成员过量至需要的量， 以便 确定分析物的存在、 位置或浓度。
在一个方面， 本发明的方法区别于大多数常规试验方法的地方在于， 经由在固体 支持物处一种或多种分析物特异性结合成员可操作地接近、 从而允许化学发光反应刚一添 加引发剂溶液就进行的分析物特异性结合反应， 化学发光化合物和活化剂两者都在空间上 受制约。 通常， 授权的 PCT 专利申请 WO 2007/013398 教导的测定方法中， 存在过量的未固定 化的或固定化的成员， 如果不除去， 就不会失去进行敏感的特异性结合测定的能力。例如， 在添加引发剂溶液和检测之前不除去未固定化的活化剂， 因为未固定化的活化剂的存在不 会抑制化学发光检测信号与分析物含量相关联。
参考示意图 1， 可以理解 SSIA 在改进的测定灵敏度中的功能。当加入引发剂溶液 时， 游离的和复合的化学发光标记的 sbm 与被活化剂标记的 sbm 的组合能够对观察到的化 学发光信号做出贡献。 示意图 1 1 被结合的活化剂标记的 sbm+ 被结合的化学发光标记的 sbm-- ＞特异性信号 2 被结合的活化剂标记的 sbm+ 游离的化学发光标记的 sbm-- ＞非特异性信号 3 游离的活化剂标记的 sbm+ 被结合的化学发光标记的 sbm-- ＞非特异性信号 4 游离的活化剂标记的 sbm+ 游离的化学发光标记的 sbm-- ＞非特异性信号 如该示意图所示， 在测定中反应 1 产生可与分析物含量相关的信号。相对于反应 1 的 信号量， 通过选择性地抑制或者降低反应 2 的信号量， SSIA 至少部分地取得了令人惊奇的 功能。SSIA 也可以通过抑制由外源性干扰物质产生的信号而改善信噪比。
在一种实施方式中， 提供了测定方法， 尤其是结合性测定方法， 其中通过至少一种 因分析物的存在而进行的特异性结合反应， 使化学发光标记的固定化 sbm 化合物和被活化 剂标记的 sbm 可操作地接近。其中， 在存在选择性信号抑制剂和增强剂的条件下， 被结合的 活化剂共轭物激活刚一添加引发剂溶液就产生化学发光的反应， 用于检测分析物的存在、 位置或含量。
在其它的实施方式中， 竞争性测定形式被使用， 其中， 对于与化学发光标记的固定 化 sbm 的结合， 被活化剂标记的 sbm 与分析物相竞争， 借此产生与分析物浓度或竞争性测定 呈反比关系的化学发光。在这些实施方式中， 通过活化剂标记的 sbm 结合于化学发光标记 的固定化 sbm， 使活化剂可操作地接近固定化化学发光化合物， 从而活化反应， 在存在增强 剂的条件下， 刚一添加引发剂溶液就产生化学发光。 随着分析物浓度增加， 化学发光信号会 降低， 借此竞争性地阻断被活化剂标记的 sbm 对于化学发光标记的固定化 sbm 的结合。
测定组分比如含有分析物的样品、 被活化剂标记的 sbm、 化学发光标记的固定化 sbm、 选择性信号抑制剂和增强剂能够以各种顺序和组合被加入至试验容器中， 无需洗涤或 分离、 以及刚一添加引发剂溶液就得进行发光读数。在一种实施方式中， 例如， 样品和被活化剂标记的 sbm 和 / 或化学发光标记的固定化 sbm 能够被预混合。 在一种实施方式中， SSIA 能够被包含于含有被活化剂标记的 sbm 和 / 或化学发光标记的固定化 sbm 和 / 或样品的预 混合物中。增强剂能够被包含于预混合物中， 或者与引发剂溶液一起加入。不需要洗涤或 分离过量的未结合的反应物。
使用化学发光底物和酶标记的共轭物的常规测定法要提供大大过量于标记酶的 量的化学发光底物。 通常， 底物 / 酶的摩尔比率可以超过十的九次幂， 即， 过量十亿倍。 据相 信， 在常规的测定中有必要供应这样极大过量的化学发光化合物， 以便确保充分的底物供 应， 用于连续的酶法转化， 并且该过程确保在测定方法中足够的检测灵敏度。申请人发现， 有可能设计出高灵敏度的测定方法， 其将化学发光化合物对活化剂的比率减小了几个数量 级。就这点来说， 在此描述的这些方法本质上不同于已知的酶联测定方法。
通过省去如上所述和如下所述示例性测定中显示的洗涤和分离步骤， 提供了使测 定方案设计简单化的机会。操作步骤数量的减少可以降低测定时间、 由不完全的洗涤带来 的组间分析误差、 以及成本。同时， 增强了自动化和小型化测定性能的能力， 具有自动化和 小型化伴随的所有固有优点。
一般地， 在根据本发明的方法进行的测定中， 固体支持物被提供于试验设备中， 用 于特异性地捕获所关注的分析物。 该固体支持物上设有固定化的用于直接或间接地结合待 检测的分析物的特异性结合成员。该固体支持物上进一步设有标记。在许多实施方式中， 化学发光标记被固定化在其上。 被活化剂标记的 sbm 也被引入该试验设备中。在含有分析物的样品存在的条件 下， 被活化剂标记的 sbm 和化学发光标记的固定化 sbm 允许形成特异性结合复合体。样品、 被活化剂标记的 sbm、 化学发光标记的固定化 sbm、 SSIA、 以及增强剂可以被分别地依序添 加或同时添加， 或者可以被预混合并作为组合物添加。 在引发反应之前， 允许结合反应发生 (“温育” ) 的时间周期能够被插在在添加之间或者在添加之后。
最后， 加入引发剂溶液来产生用于检测分析物的化学发光， 并且检测化学发光。 引 发剂溶液最低限度地含有如下文所述的过氧化物， 但还可以含有增强剂， 并且有时还可以 含有 SSIA。 典型地， 或者测量峰值光强度水平， 即在整个指定时间周期内的全部的 RLU′ s ； 或者测量总的积分光强度。该光量可以根据通常已知的方法绘制校准曲线而与分析物含 量相关联。当刚一添加引发剂溶液就紧跟着发生光发射时， 优选或者用机械方法来定时测 量的开始从而进行利用合适注射器的添加， 或者用已暴露于检测器的试验设备进行添加。 通过参考进行特异性结合测定方法方面的标准文献、 并且利用作为指导的如下详述具体例 子， 通过常规实验， 可以轻易地确定最优的反应物的数量、 体积、 稀释度、 特异性结合配对反 应温育时间、 反应物的浓度等。
在本发明的方法和测定中采用的分析物特异性结合成员的浓度或含量将取决于 如下这些因素 ： 分析物浓度、 期望的结合速度 / 测定时间、 成本和共轭物的有效性、 分析物 特异性结合成员的非特异性结合的程度。通常， 分析物特异性结合成员以至少等于最低的 预期分析物的浓度存在， 更通常以等于至少最高的预期的分析物浓度存在。 并且， 对于非竞 6 争性测定， 分析物特异性结合成员的浓度可以是最高分析物浓度的 10-10 倍， 但通常小于 -4 -6 -11 -7 10 M、 优选小于 10 M、 经常在 10 和 10 M 之间。活化剂或者与 sbm 成员相连的化学发光 化合物的含量通常是至少 1 个分子 / 每个分析物特异性结合成员， 并且当活化剂或者化学
发光分子被固定化在颗粒上时， 所述含量可以高达 105 个分子、 通常至少 10-104 个分子。例 举的活化剂对化学发光化合物的比率被提供于工作实施例中。 选择性信号抑制剂 (SSIA)
本发明的选择性信号抑制剂是这样的化合物 ： 当其被包括在包含游离的和 / 或被 分析物结合的化学发光标记的 sbm、 游离的和 / 或被分析物结合的被活化剂标记的 sbm、 增 强剂和引发剂溶液的测定反应混合物中时， 从被分析物结合的标记 sbm 成员得到的信号超 过背景信号的程度显著地大于没有 SSIA 时发生的超出程度。
反应方法中存在的一种以上选择性信号抑制剂的浓度在 10-6M 和 10-1M 之间、 常常 -6 -2 -5 -3 -5 -4 在 10 M 和 10 M 之间、 经常在 10 M 和 10 M 之间、 有时在 10 M 和 10 M 之间。在一些实施 方式中， 在根据本发明方法的反应中选择性信号抑制剂存在的浓度在 5x10-6M 和 5x10-4M 之 间。在更进一步的实施方式中， 在根据本发明方法的反应中选择性信号抑制剂存在的浓度 -5 -4 在 5x10 M 和 5x10 M 之间。
选择性信号抑制剂能够被作为单独的试剂或者浓度比在待进入的反应溶液中更 高的溶液提供。 本实施方式中， 实测量的工作溶液被定量加入反应溶液中， 以达到期望的反 应浓度。 在另一个实施方式中， 选择性信号抑制剂被合并进入含有一种或多种被标记的 sbm 成员的溶液中。在另一个实施方式中， 选择性信号抑制剂被作为引发剂溶液的组分提供。 选择性信号抑制剂提高信噪比的程度将依据除了其它因素外的化合物的特性和 使用时的浓度而改变。该程度能够被作为提高倍数的术语， 其中该倍数为在特定的分析物 浓度下通过使用选择性信号抑制剂而进行的测定中的信噪比与在相同的分析物浓度下在 不含选择性信号抑制剂情况下进行的测定中的信噪比相比较的倍数。提高倍数＞ 1 是改进 的测定方法的量规和选择性信号抑制剂的有益效果的证据。在本发明的实施方式中， 可取 得至少 2 比如至少 5、 并包括至少 10、 或至少 50 的提高倍数。参照下述实施例， 将可看到， 提高倍数能够在测定范围内作为分析物浓度的函数而改变。例如， 提高倍数可以随着分析 物浓度增加而提高。在另一个实施方式中， 提高倍数随浓度的变化可以导致较为线性的校 准曲线， 即化学发光强度对分析物浓度的曲线。
下面的表中列出了， 但不限于， 能够有效地具有选择性信号抑制剂功能的化合物。 利用本发明的公开教导， 包括测定法的常规应用和在实施例中描述的筛选试验方法， 能够 找到未明确叙述的另外的化合物。 表 1. 选择性信号抑制剂
在一些实施方式中， 选择性信号抑制剂选自于二烷基羟胺。 在一些实施方式中， 选 择性信号抑制剂选自于具有至少两个定位于邻位或对位关系的羟基的芳香化合物。 例举的 化合物包括 ：
在一些其它的实施方式中， 选择性信号抑制剂选自于具有至少一个羟基和位于邻 位或对位的氨基的芳香化合物。例举的化合物包括 ：
在另一些其他的实施方式中， 选择性信号抑制剂选自于具有至少两个在碳 - 碳双 键上取代的羟基的化合物， 亦称烯二醇。例举的化合物包括 ：
在一种实施方式中， 选择性信号抑制剂选自于氮杂环化合物。例举的化合物包括：在一种实施方式中， 选择性信号抑制剂以作为如下受保护的化合物形式被提供 ： 其刚一接触过氧化物就能转变为活性的 SSIA。合适的受保护的 SSIA 化合物例如选自于羟 基或氨基被取代的芳基硼酸化合物。例举的化合物包括 ：
在一种实施方式中， 选择性信号抑制剂选自于 ：在各种实施方式中， 一种或多种上述选择性信号抑制剂在本发明公开的测定方 法、 测定或者试剂盒中被组合使用。
在一些实施方式中， 选择性信号抑制剂在水溶液中的溶解度为 10 倍于工作溶液 中的溶解度。工作溶液定义为浓缩水溶液， 如此将一部分浓缩液加至反应混合物中就可在 添加引发剂溶液之后得到所要求的终浓度。
合适的用于选择性信号抑制剂工作溶液的水溶液可包含一种或多种下述附加成 分： 盐， 生物学缓冲液， 醇类包括乙醇、 甲醇、 乙二醇， 以及除垢剂。在一些实施方式中， 水溶 液包括 ： Tris 缓冲水溶液， 比如缓冲液 II(Tris 缓冲盐水、 表面活性剂、 ＜ 0.1％叠氮化钠、 以及 0.1％ ProClin 300( 罗门哈斯公司 )， 购自贝克曼考尔特公司， Brea， 加利福尼亚州 ) ； 25％乙醇 /75％缓冲液 II ； 25％乙醇 /75％ TRITON-X-100(1％ ) ； 或 10％的 0.1NNaOH/90％ 缓冲液 II 。
固相支持物
在本发明公开的方法的许多实施方式中， 将化学发光标记固定化至测试体系的一 种成分。可以以如下详述的许多不同方式提供标记。在各个变体中， 标记都以稳定地或者 不可逆地使其固定不动的方式被附着于物质或材料上。 所谓 “不可逆地” ， 意思是指， 在想要 进行的测定中， 在使用条件下基本上不从固体支持物上除去该标记。 在使用的条件下， 还期 望提供被动的或非共价的连接方法， 只要该标记被稳定地附接并保留在固体支持物上。这 可以以数种方式中的任一方式完成。
在本发明公开用于进行测定的实施方式中， 将化学发光标记变得被固定化至固体 支持物的表面。分析物例如被未标记分析物特异性的结合成员吸引到固体支持物的表面。 借助于可使活化剂接近附着于固体支持物的固定化化学发光标记的特异性结合反应， 使该 化学发光标记与活化剂形成一种反应性构造。然后， 添加引发剂溶液并且测量化学发光。
在一种实施方式中， 化学发光标记被共价联接至固定化的分析物特异性结合成 员。一个实施例将是固定化在微孔板的孔上或粒子上的被标记的捕获抗体或抗体片段。分析物特异性结合成员的固定化可以通过共价连接或者通过吸附方法进行。在这种方式中， 借助于在 “夹心” 形式中的都结合分析物的两种特异性结合伴侣， 使化学发光标记与活化剂 形成反应性构造。
在另一个实施方式中， 化学发光标记被共价连接于以任意方式固定化在固体支持 物上的辅助物质。辅助物质的固定化可以通过共价连接或者通过吸附方法进行。借此该标 记被近乎均匀地分配在固体支持物表面的周围。 分析物例如被未标记分析物特异性的结合 成员吸引到固体支持物的表面。 借助于可使活化剂接近附着于辅助物质的化学发光标记的 特异性结合反应， 使得该化学发光标记与活化剂形成反应性构造， 该辅助物质被附接或者 被动地涂到支持物表面上。
在另一个实施方式中， 化学发光标记被共价连接至固定化的通用抗体， 所述通用 抗体对于分析物特异性捕获抗体具有结合亲合力。
在另一个实施方式中， 与化学发光标记共价连接的辅助物质是蛋白质或肽。例举 的蛋白质包括白蛋白或链霉抗生物素蛋白 (SA)。通过使用生物素 - 化学发光化合物共轭 物， 可以提供化学发光化合物用于固定化。这类测定形式可以提供作为生物素共轭物的分 析物特异性结合成员， 或者被直接固定化至固体支持物、 或者通过通用的捕获成分比如种 类特异性抗免疫球蛋白而间接连接。 在另一个实施方式中， 与化学发光标记共价连接的辅助物质是合成聚合物。使用 聚合的辅助物用于固定化化学发光化合物的测定形式或者通过直接固定化至固体支持物、 或者通过使用通用捕获成分比如种类特异性免疫球蛋白的间接连接， 可以提供作为生物素 共轭物的分析物特异性结合成员。
在另一个实施方式中， 化学发光标记被共价连接至固体支持物的表面。在这样的 一个实施方式中， 标记因此被近乎均匀地分配在固体支持物表面的周围。分析物例如被未 标记分析物特异性的结合成员吸引到固体支持物的表面。 借助于可使活化剂接近直接附着 于支持物表面的化学发光标记的特异性结合反应， 使得该化学发光标记与活化剂形成反应 性构造。然后， 无需洗涤或分离， 添加引发剂溶液并且测量化学发光。
在另一个实施方式中， 使用分析物的类似物， 包括活化剂 - 分析物类似物共轭物。 在另一个实施方式中， 使用被标记的分析物， 包括活化剂 - 分析物共轭物。活化剂 - 分析物 类似物共轭物或者活化剂 - 分析物共轭物与分析物将竞争性地与分析物特异性结合成员 相结合。 显而易见， 在这类测定方法中， 在样品中的分析物含量和化学发光强度之间将呈负 相关性。
除通过用于结合抗原或其他蛋白质的抗体或其他抗体经由免疫测定法进行化学 发光标记的连接之外， 本发明的方法可以使用化学发光标记的核酸， 用于通过互补核酸的 结合来检测核酸。在这点上， 该使用就核酸的大小而言没有特别限定， 仅有的标准是， 互补 伴侣有足够的长度以允许稳定的杂交。在此使用的核酸包括基因长度的核酸、 核酸的较短 碎片、 多聚核苷酸和低聚核苷酸， 其中任何一种可以是单链的或者是双链的。 在本公开的使 用核酸作为分析物特异性结合成员的实施方式中， 核酸被共价连接或者物理地固定化在固 体支持物的表面上， 以捕获分析物核酸。 该化学发光标记能够被附接于俘获核酸， 或者该标 记能够与支持物按如上所述方式相连接。 该俘获核酸将具有与分析物核酸的序列区域完全 的或者基本上完全的序列互补性。
当基本上互补时， 俘获核酸可以具有不与分析物互补的末端突出部分、 末端环部 分或内部环状部分， 只要其不会妨碍或者抑制与分析物的杂交。反向位置也可以出现在分 析物核酸内部突出或环位于的位置。俘获核酸、 分析物核酸、 活化剂共轭物、 以及第三核酸 允许杂交。该第三核酸与分析物核酸的序列区域基本上互补， 所述序列区域不同于与俘获 核酸互补的区域。 俘获核酸和活化剂共轭物核酸与分析物的杂交可以依序或者是同时地连 续进行。该工艺的结果是， 借助于可使活化剂接近附接于支持物表面的化学发光标记的特 异性杂交反应， 该化学发光标记变得与活化剂相连接。按如上所述提供引发剂溶液并且检 测化学发光。
另一种实施方式包括一种变化， 其中， 使用分析物与活化剂的共轭物。 该分析物核 酸 - 活化剂共轭物和分析物核酸将竞争性地与分析物特异性结合成员相结合。显而易见， 在这类测定方法中， 在样品中的分析物含量和化学发光强度之间将呈负相关性。
除基于抗体和基于核酸的体系之外， 例如通常为本领域的普通技术人员所熟知的 结合测定法的其他特异性结合配对， 可以用作根据本公开的测试方法的基础。也可以使用 抗体 - 半抗原配对。示例性的配对有 ： 荧光素 / 抗荧光素配对、 地高辛配基 / 抗地高辛配基 配对、 以及硝基苯基 / 抗硝基苯基配对。作为另一个例子， 可以使用众所周知的 ( 链霉 ) 抗 生物素蛋白 / 生物素结合配对。为显示其中可以使用该结合配对的一种方式， 可以将链霉 抗生物素蛋白 - 化学发光标记共轭物共价连接或者吸附到固体支持物上。然后添加用生物 素标记的分析物和活化剂共轭物， 其中共轭物被附接于抗生物素抗体或者抗分析物抗体。 在复合物允许形成后， 添加引发剂溶液并且按上述方法进行检测。 在另一个实施方式中， 抗 生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白被沉积在固体支持物上。生物素 - 化学发光化合物共轭物 被结合于抗生物素蛋白， 并且生物素化抗体也被结合。 在另一个实施方式中， 生物素被连接 于固体支持物， 并且被用于捕获抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。生物素化抗体也被结 合。或者通过将生物素 - 化学发光化合物共轭物结合于 ( 链霉 ) 抗生物素蛋白、 或者通过 将表面直接用化学发光化合物标记， 可以将化学发光化合物附着于固体支持物。本技术领 域已知的附加的分析物特异性结合成员包括 ： 抗体的 Fab 部分、 凝集素 - 碳水化合物、 蛋白 质 A-IgG、 以及激素 - 激素受体。 应理解， 可以使用化学发光化合物间接结合于固体支持物， 以服务于本发明公开。对于本领域的技术人员而言， 这些例子及其他例子皆被认为在发明 的方法范围之内。
在本公开的实施方式中有用的固体支持物可以是各种材料、 各种孔隙度、 各种形 状、 和各种尺寸。已经用于结合性测定的材料包括 ： 96 孔微孔板、 384 孔微孔板、 或更高数 量种类的微孔板、 试管、 样品杯、 塑料微球、 纤维素、 纸张或者塑料测试条、 胶乳粒子、 直径为 0.10-50μm 的聚合物颗粒、 直径为 0.10-50μm 的二氧化硅颗粒、 磁性粒子尤其是平均直径 为 0.1-10μm 的磁性粒子、 各种材料的纳米颗粒、 以及金属胶体。这些材料都能够提供有用 的固体支持物用于化学发光标记的附着、 并且用于固定化分析物特异性结合成员。磁性粒 子可以包括磁性金属、 金属氧化物或金属硫化物核心， 其通常被吸附结合层或共价结合层 包围， 以便屏蔽磁性成分。磁性成分可以是铁、 氧化铁或者硫化铁、 其中铁是 Fe2+ 或 Fe3+ 或 两者的混合物。该类可使用的材料包括， 例如， 磁铁矿、 磁赤铁矿、 和黄铁矿。其他磁性金属 氧化物包括 MnFe2O4、 NiFe2O4、 和 CoFe2O4。磁性成分可以， 例如， 是被非磁性壳包围的实心， 或者可以是散布磁性和非磁性材料的核， 或者可以是包围非磁性核的层、 其任选地被另一种非磁性的壳包围。 在这样的磁性粒子中的非磁性材料可以是 ： 二氧化硅、 合成聚合物比如 聚苯乙烯、 氯甲基树脂 (Merrifield resin)、 聚丙烯酸酯或苯乙烯 - 丙烯酸酯共聚物， 或者 其可以是天然聚合物比如琼脂糖或葡聚糖。
本发明公开教导了使这些材料功能化的方法， 用于本发明的测定方法。 特别地， 公 开了一些方法， 用于将化学发光标记化合物和分析物特异性结合成员例如抗体这两者都附 接至相同的表面、 尤其附接至微孔板的孔或微粒。 在测定中使用的合适支持物包括 ： 合成聚 合物支持物， 比如聚苯乙烯、 聚丙烯、 取代聚苯乙烯 ( 例如， 胺化聚苯乙烯或羧基化聚苯乙 烯 )、 聚丙烯酰胺、 聚酰胺、 聚氯乙烯， 玻璃珠， 二氧化硅粒子， 功能化的二氧化硅粒子， 金属 胶体， 琼脂糖， 硝化纤维， 尼龙， 聚偏二乙烯氟代物， 表面改性的尼龙等等。 活化剂标记
活化剂化合物形成了被活化剂标记的 sbm 的一部分， 其还可以被认为是活化剂特 异性结合成员共轭物。被活化剂标记的 sbm 具有双重作用 ： 1) 在测定中， 通过特异性结合 伴侣部分直接地或者通过中间的特异性结合伴侣而经受与分析物含量成比例的特异性结 合反应， 和 2) 通过活化剂部分激活化学发光化合物。被活化剂标记的 sbm 的活化剂部分是 具有活化化学发光化合物的效果的化合物， 使得当存在引发剂溶液时产生化学发光。能够 用作活化剂标记的化合物包括具有过氧化物酶类活性的含有过渡金属盐和复合物以及酶 的化合物， 尤其是含有过渡金属的酶， 更尤其是过氧化物酶。 在活化剂化合物中有用的过渡 金属包括周期表中第 3-12 族的那些过渡金属， 尤其是铁、 铜、 钴、 锌、 锰、 铬、 以及钒。
可以经受化学发光反应的过氧化物酶包括， 例如 ： 乳过氧化物酶、 微小过氧化物 酶、 髓过氧化物酶、 卤素过氧化物酶、 钒溴过氧化物酶、 辣根过氧化物酶、 真菌的过氧化物 酶、 木质素过氧化物酶和来源于 Arthromyces ramosus 的过氧化物酶、 以及在白腐真菌中产 生的 Mn 依赖性过氧化物酶、 以及大豆过氧化物酶。其他已知并不是酶、 但是具有过氧化物 酶状活性的仿过氧化物酶的化合物包括 ： 铁复合物， 比如亚铁原卟啉、 以及 Mn-TPPS4(Y.-X. Ci， et al.， Mikrochem.J.， 52 ： 257-62(1995))。 上述这些物质可催化底物的化学发光氧化， 并且应明确地认为包含于在此使用的过氧化物酶含义的范围内。
在一些实施方式中， 在用于产生化学发光的方法中， 被活化剂标记的 sbm 可以包 括过氧化物酶和生物分子的共轭物或复合物， 唯一的附带条件是 ： 该共轭物可显示出过氧 化物酶活性或过氧化物酶状活性。可以结合于一种以上过氧化物酶分子的生物分子包括 ： DNA、 RNA、 低聚核苷酸、 抗体、 抗体片段、 抗体 -DNA 嵌合体、 抗原、 半抗原、 蛋白质、 肽、 凝集 素、 抗生物素蛋白、 链霉抗生物素蛋白和生物素。 还可以在本发明公开的方法中使用包含或 者结合过氧化物酶的复合物， 比如脂质体、 胶束、 囊泡和因连接生物分子而具功能化的聚合 物。 引发剂溶液和增强剂
引发剂溶液提供了产生化学发光所需的激发态化合物所需要的反应物。 该反应物 可以是一种对于通过直接与化学发光标记反应而进行化学发光反应所必需的反应物。 其可 以具有代替该功能或者除该功能之外的促进活化剂化合物作用力的作用。例如， 当活化剂 是过氧化物酶时， 将会发生这种情况。在一种实施方式中， 引发剂溶液包含过氧化物化合 物。该过氧化物成分是任何能够与过氧化物酶反应的过氧化物或者烷基氢过氧化物。例举 的过氧化物包括过氧化氢、 过氧化脲和过硼酸盐。在引发剂溶液中使用的过氧化物浓度可以在一定数值范围内变化， 典型该范围为约 10-8M 至约 3M、 更通常为约 10-3M 至约 10-1M。在 另一个实施方式中， 引发剂溶液包含过氧化物和增强化合物， 所述增强化合物可促进具有 过氧化物酶活性的活化剂的催化转化。 有代表性的实施方式使用作为活化剂的过氧化物酶 共轭物、 被 9， 10- 二氢化吖啶标记的分析物的特异性结合伴侣 ( 其中， 通过特异性结合伴侣 与下文中所述的 9， 10- 二氢化吖啶标记化合物进行反应而提供 9， 10- 二氢化吖啶标记 )、 以 及包含过氧化氢的引发剂溶液。该过氧化物与过氧化物酶反应， 估计可能是在酶的活性部 位将铁的氧化态变成了不同的氧化态。这种改变状态的酶与增强剂分子反应， 促进酶的催 化转化。由增强剂或酶形成的反应性种类可和保持与酶接近的标记的 9， 10- 二氢化吖啶反 应。化学发光反应包含由化学发光化合物与过氧化物形成的中间体的进一步反应， 以产生 最终的反应产物和光。
将某些增强剂化合物并入引发剂溶液可以促进酶的反应性或者减少背景信号， 或 者同时具有这两种功能。 被包括在这些增强剂中的物质是已知可增强过氧化物酶反应的酚 类化合物和芳香胺。在美国专利 5,171,668 中公开的吩噁嗪或者吩噻嗪化合物与靛酚或靛 苯胺化合物的混合物可以在本发明中被用作增强剂。取代的羟基苯并噁唑、 2- 羟基 -9- 芴 酮、 以及在美国专利 5,206,149 中公开的化合物也可以在本发明中用作增强剂。在美国专利 No.5,512,451 中公开了取代的和未被取 代的芳基硼酸化合物和它们的酯和酐衍生物， 在此也考虑将其归入在本发明公开中有用的 增强剂范围内。例举的酚类增强剂包括， 但不限于 ： 对苯基苯酚、 对碘苯酚、 对溴苯酚、 对羟 基桂皮酸、 对咪唑基苯酚、 醋氨酚、 2， 4- 二氯苯酚、 2- 萘酚以及 6- 溴 -2- 萘酚。还可以使用 选自如上所述这些种类的一种以上增强剂的混合物。
在本发明的实施方式中有用的另外的增强剂包括羟基苯并噻唑化合物和具有如 下化学式的吩噁嗪以及吩噻嗪。在吩噁嗪和吩噻嗪增强剂氮原子上的被取代的 R 基包括 ： 1-8 个碳原子的烷基， 以及用 磺酸盐或羧酸盐基团取代的 1-8 个碳原子烷基。例举的增强剂包括 ： 3-(N- 吩噻嗪基 )- 丙 烷磺酸盐、 3-(N- 吩噁嗪基 ) 丙烷磺酸盐、 4-(N- 吩噁嗪基 ) 丁烷磺酸盐、 5-(N- 吩噁嗪基 (phenoxazinyl))- 戊酸盐、 以及 N- 甲基吩噁嗪 (N-methylphenoxazine) 和相关同系物。 在 -5 引发剂溶液中使用的增强子浓度可以在一定数值范围内变化， 典型地， 该范围为约 10 M 至 -1 -4 -2 约 10 M、 更通常为约 10 M 至约 10 M。
本发明公开的检测反应是用引发剂溶液进行的， 该引发剂溶液是典型的缓冲水溶 液。合适的缓冲液包括任何常用的能够保持允许化学发光反应进行的环境的缓冲液。典型 地， 引发剂溶液将具有约 5 至约 10.5 的 pH 值。示例性的缓冲液包括 ： 磷酸盐、 硼酸盐、 醋酸 盐、 碳酸盐、 三 ( 羟基 - 甲基氨基 ) 甲烷 [tris]、 甘氨酸、 Tricine、 2- 氨基 -2- 甲基 -1- 丙醇、 二乙醇胺 MOPS、 HEPES、 MES 等等。
引发剂溶液还可以含有一种以上除垢剂或者聚合物表面活性剂， 以增强产光反应 的发光效率或者提高测定的信 / 噪比。在本发明公开的实施方式中有用的非离子表面活性 剂包括， 例如 ： 聚环氧乙烷烷基酚类、 聚环氧乙烷醇类、 聚环氧乙烷醚类和聚环氧乙烷山梨 糖醇酯类。可以使用包括季铵盐化合物比如 CTAB 和季鏻盐化合物在内的单体阳离子表面 活性剂。 还可以使用包括那些含有季铵和膦盐基团的阳离子表面活性剂的聚合型阳离子表 面活性剂。
在一种实施方式中， 引发剂溶液是组合物， 其包含缓冲水溶液、 浓度为约 10-5M 至 约 1M 的过氧化物、 以及浓度为约 10-5M 至约 10-1M 的增强剂。该组合物可以任选地含有包括 表面活性剂、 金属螯合剂以及防腐剂在内的添加剂， 以抑制或最小化微生物污染。 特异性结合配对
特异结合性配对成员或特异性结合伴侣 (sbm) 在此定义为一种分子， 其对于另一 种物质具有特异性结合亲合力， 包括生物分子。 特异结合性配对成员包括 ： DNA、 RNA、 低聚核 苷酸、 抗体、 抗体片段、 抗体 -DNA 嵌合体、 抗原、 半抗原、 蛋白质、 肽、 凝集素、 抗生物素蛋白、 链霉抗生物素蛋白和生物素。 特异性结合配对中的每一个特异结合性配对成员对于相同的 物质 ( 例如分析物 ) 具有特异性结合亲合力。在特异性结合配对中， 每一个特异结合性配 对成员与另一个特异结合性配对成员是不相同的， 至少体现在如下方面 ： 特异结合性配对 成员将不会竞争相同或者重叠的分析物上的结合位点。例如， 如果特异性结合配对由两个 抗体组成， 则每个 sbm 抗体具有在分析物上不同的、 非竞争性的表位。
特异性结合物质包括， 但不限于 ： 抗体和抗体片段、 抗原、 半抗原和它们的同源抗 体、 生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白、 蛋白质 A 和 IgG、 互补核酸或低聚核苷酸、 凝集素和碳水化合物。
除上述的抗原 - 抗体、 半抗原 - 抗体或者抗体 - 抗体配对之外， 特异性结合配对还 可以包括互补的低聚核苷酸或多聚核苷酸、 抗生物素蛋白 - 生物素、 链霉抗生物素蛋白 - 生 物素、 激素 - 受体、 凝集素 - 碳水化合物、 IgG- 蛋白质 A、 结合性蛋白 - 受体、 核酸 - 核酸结 合蛋白、 以及核酸 - 抗核酸抗体。在筛选药物候选对象中使用的受体测定法是本发明方法 的另一应用领域。 这些结合性配对的任何一种皆可以适合于在本发明方法的三组分夹心技 术或者如上所述的二组分竞争性技术中使用。 化学发光化合物
在本发明公开的实施方式中用作的化学发光标记的化合物具有通式 ： CL-L-RG， 其 中， CL 表示化学发光的部分， L 表示连接化学发光部分和活性基团的连接部分， 并且 RG 表示 用于偶联于另一种材料的活性基团部分。术语 “化学发光基团” 并且和 “化学发光部分” 与 术语 “连接部分” 和 “连接基团” 可互换地使用。化学发光部分 CL 包括经受与活化剂的反 应的化合物， 该反应导致其被转化为激活的化合物。激活的化合物与引发剂溶液的反应形 成电子激发态化合物。该激发态可以是单线激态或三重激态。该激发态可以刚一衰减成基 态就直接发光， 或者可以将激发能传递至发射能受体， 借此返回到基态。在该过程中， 能量 受体跃迁至激发态并发光。优选地， 但并非必需， CL 基团、 活化剂和引发剂溶液的化学发光 反应快速发生在非常短暂的时间间隔的整个期间 ； 在一种实施方式中， 发光反应在几秒内 达到峰强度。在本公开的一个具体实施方式中， 当存在活化剂和引发剂溶液时， 化学发光化合 物能够被氧化， 从而产生化学发光。通过结合连接物和反应性基团而能够用作化学发光标 记的示例性种类的化合物包括 ： 芳香环二酰基酰肼， 比如氨基苯二酰一肼 ( 鲁米诺 ) ； 和在 结构上相关的环状酰肼， 包括异氨基苯二酰一肼、 氨丁基乙基异氨基苯二酰一肼 (ABEI)、 氨 己基乙基异氨基苯二酰一肼 (AHEI)、 7- 二甲氨基萘 -1， 2- 二羧酸酰肼、 环上取代的氨基邻 苯二甲酰肼、 蒽 -2， 3- 二羧酸酰肼、 菲 -1， 2- 二羧酸酰肼、 芘二羧酸酰肼、 5- 羟基 - 邻苯二 甲酰肼、 6- 羟基邻苯二甲酰肼 ； 以及在 Masuya 等人的美国专利 No.5,420,275 和 Yamaguchi 的美国专利 No.5,324,835 中公开的其他 2， 3- 二氮杂萘二酮类似物。
据认为， 任何已知可以在过氧化氢和过氧化物酶的作用下产生化学发光的化合物 将具有本发明公开中使用的化学发光标记化合物的化学发光部分的功能。 本技术领域已知 有许多各种结构分类的化合物在这些条件下可以产生化学发光， 这样的化合物包括 ： 呫吨 染料例如荧光素、 曙红、 罗达明染色剂、 或对甲氨基酚染料、 芳香胺和杂环胺。 另一个例子是 化合物 MCLA， 即， 2- 甲基 -6-( 对甲基苯基 )-3， 7- 二氢化咪唑并 [1， 2-a] 吡嗪 -3- 酮。另 一个例子是吲哚基醋酸， 另一个是异丁醛， 后者典型地附有用于提高可见光产出的荧光能 量受体。三羟基芳香化合物焦性没食子酸、 间苯三酚和红培酚个别地或者其组合是其他的 化合物例子， 可以用作本公开的化学发光标记化合物中的化学发光的部分。
在一种实施方式中， 包括本公开方法中有用的 9， 10- 二氢化吖啶乙烯酮二硫缩醛 (AK) 在内的化学发光标记化合物组， 包括具有化学式 IV 的 9， 10- 二氢化吖啶类化合物 ：其中， 基团 R1-R11 中的至少一个是该化学式 -L-RG 的标记性取代基， 其中， L 是连接基 团， 其可以是化学键或另一种二价或多价的基团 ； RG 是活性基团， 其使化学发光标记化合 1 2 3 物能够被结合于另一种化合物 ； R、 R 和 R 是含有 1 到 50 个非氢原子的有机基团， 并且 4 11 1 2 R -R 中的每一个是氢或无干扰性的取代基。标记性取代基 -L-RG 能够存在于 R 或 R 中的 一个上， 虽然其还可以作为取代基存在于 R3 上或者 R4-R11 之一上。
在化学式 IV 的化合物中的基团 R1 和 R2 可以是含有 1 到约 50 个选自于 C、 N、 O、 S、 P、 Si 和卤素原子的非氢原子的任何有机基团， 其允许光产生。而上句的后一句话是指， 当 通式 I 的化合物经受本发明公开的反应时， 产生激发态产物化合物并且其可以涉及一种以 上化学发光中间体的产生。激发态产物可以直接地发射光， 或者可以通过能量传递而将激 发能传递至荧光受体， 引起光从荧光受体发出。在一种实施方式中， R1 和 R2 选自于含 1-20 个碳原子的取代或未取代的烷基、 取代或未取代的烯基、 取代或未取代的炔基、 取代或未取 1 2 代的芳基、 以及取代或未取代的芳烷基。当 R 或 R 是取代基时， 其可以用 1-3 个原子或基 团取代， 所述基团选自于羰基、 羧基、 三 (C1-C8 烷基 ) 甲硅烷基、 SO3- 基团、 OSO3-2 基团、 糖基、 -2 PO3 基团、 OPO3 基团、 卤素原子、 羟基、 硫醇基、 氨基、 C( ＝ O)NHNH2、 季铵、 以及季鏻基团。 在 1 2 一种实施方式中， R 或 R 用化学式 -L-RG 的标记性取代基取代， 此处 L 是连接基团， 而 RG 是活性基团。基团 R3 是含有 1 到 50 个除满足基团中原子的原子价所要求的必需数量的 H 原子 之外的非氢原子的有机基团， 所述非氢原子选自于 C、 N、 O、 S、 P、 Si 和卤素原子。在一种实 3 施方式中， R 含有 1 到 20 个非氢原子。在另一个实施方式中， 有机基团选自由含 1-20 个碳 原子的烷基、 取代烷基、 取代或未取代的烯基、 取代或未取代的炔基、 取代或未取代的芳基、 以及取代或未取代的芳烷基所构成的组。在另一个实施方式中， 用于 R3 的基团包括取代 或未取代的 C1-C4 烷基、 苯基、 取代或未取代的苯甲基、 烷氧基烷基、 羧基烷基和烷基磺酸基 3 团。当 R 是取代基时， 其可以用 1-3 个基团取代， 所述基团选自于羰基、 羧基、 三 (C1-C8 烷 -2 -2 基 ) 甲硅烷基、 SO3 基团、 OSO3 基团、 糖基、 PO3 基团、 OPO3 基团、 卤素原子、 羟基、 硫醇基、 3 7 8 氨基、 C( ＝ O)NHNH2、 季铵、 以及季鏻基团。基团 R 可以被结合于 R 或 R 以构成 5 元环或 6 元环。在一种实施方式中， R3 用化学式 -L-RG 的标记性取代基取代。
在化学式 IV 的化合物中， 基团 R4-R11 各自独立地是 H 或取代基团， 其允许产生激 发态产物并且通常含有 1 到 50 个选自于 C、 N、 O、 S、 P、 Si 和卤素的原子。有代表性的取代 基团可以包括， 但不限于 ： 烷基、 取代烷基、 芳基、 取代芳基、 芳烷基、 烯基、 炔基、 烷氧基、 芳 氧基、 卤素、 氨基、 取代氨基、 羧基、 烷氧羰基、 氨甲酰、 氰基、 以及磺酸酯基团。 相邻基团的配 4 8 8 6 对， 例如 R -R 或者 R -R ， 可以被结合一起， 从而形成包括至少一种融合于环中的附接有两 个基团的 5 元环或 6 元环的碳环或杂环体系。这样融合的杂环可以含有 N、 O 或 S 原子， 并 4 11 且可以如上所述含有除 H 之外的环取代基。一种以上的基团 R -R 可以是化学式 -L-RG 的 标记性取代基。在一种实施方式中， R4-R11 选自氢、 卤素和烷氧基比如甲氧基、 乙氧基、 叔丁 8 6 9 10 4 氧基等等。在另一个实施方式中， 化合物的基团以 R 、 R、 R 或 R 之一为卤素， 而 R -R11 中 的其他基团是氢原子。
取代基团可以以各种量并入、 并且选择在 9， 10- 二氢化吖啶环上的环或者链位 置， 以便改变化合物的特性或者便于合成。 这些特性包括， 例如， 化学发光量子产率、 酶反应 速度、 最大光强度、 光发射持续时间、 光的发射波长以及在反应介质中的溶解度。具体的取 代基和它们的效果被显示在下述具体的实施例中， 然而， 无论如何不应将其视为对本公开 保护范围的限制。为便于合成， 优选通式 I 的化合物具有皆为氢原子的 R4 至 R11 中的每一 个。
在另一个实施方式中， 化合物组具有下述化学式 V， 其中， R4 至 R11 中的每一个都是 氢。基团 R1、 R2 和 R3 被限定如上。通式 IV 或 V 的标记性化合物具有作为基团 R1 或 R2 上取代基的基团 -L-RG。在一 种实施方式中， 标记性化合物具有化学式 VI。
有代表性的标记化合物具有如下结构。 附加的示例性化合物以及它们在连接于其 他分子和固体表面的用途在下述具体的实施例中有描述。如下显示的结构显示了化学式 CL-L-RG 的示例性化合物。
上述特异性的 AK 化合物和上述通式 IV、 V 和 VI 的化合物能够被有机化学家通过 使用一般已知的方法制备出来， 这些方法包括在公布的专利申请 US2007/0172878 中被公 开的方法。在一个示例性的方法中， 使 N- 取代的以及任选地环上取代的 9， 10- 二氢化吖啶 环化合物与强碱起反应， 接着与 CS2 反应， 从而形成 9， 10- 二氢化吖啶二硫代羧酸酯。该二硫代羧酸酯可通过惯常的方法进行酯化， 以便安置 R1 表示的取代基之一。得到的 9， 10- 二 氢化吖啶二硫酯被再次在非质子溶剂中用强碱比如正丁基锂 (n-BuLi) 或 NaH 去除质子化， 并且用含有离去基团和 R2 部分的合适试剂进行 S- 烷基化。对有机化学领域的技术人员而 言， 显而易见 R2 部分可以经受进一步的操作， 以便安置合适的反应基团。
另一类化学发光部分包括在美国专利 No.5,491,072、 5,523,212、 5,593,845 和 6,030,803 中公开的 9， 10- 二氢化吖啶酯、 硫酯和氨磺酰。在该类中， 化学发光标记化合物 11 具有下述化学式 VII 所示的化学发光部分 CL， 其中， Z 是 O、 S 或 NR SO2Ar， 其中 R11 是烷基 或芳基， 其中 Ar 是芳基或烷基取代芳基， 其中 R1 是 C1-8 烷基、 卤素取代的 C1-8 烷基、 芳烷基、 芳基、 或者用下述基团取代的芳基 ： 烷基、 烯基、 炔基、 芳烷基、 芳基、 烷氧基、 烷氧基烷基、 卤 2 素、 羰基、 羧基、 氨甲酰、 氰基、 三氟甲基、 三烷基铵、 硝基、 羟基、 氨基和巯基 ； 其中， R 选自于 3-10 烷基、 杂烷基、 芳基、 以及芳烷基 ； 并且其中， R 皆是氢或者 1 个或 2 个选自于烷基、 烷氧 3-10 3-10 基、 羟基、 以及卤素的取代基 ； 并且 R 的其余是氢。在一种实施方式中， R 皆是氢并且 1 3-10 R 是标记性取代基。在另一个实施方式中， R 之一是标记性取代基并且 R3-10 中的其它是 氢。另一类化学发光部分包括在美国专利 No.5,922,558、 6,696,569 和 6,891,057 中 公开的杂环化合物。在一种实施方式中， 这些化合物包括杂环， 该杂环包含氮、 氧或者其上 可键结环外双键的含硫五元环或六元环或多元环基团， 该杂环的末端碳原子可用选自氧和 硫原子的两种原子取代。
在另一个实施方式中， 化学发光标记化合物包含如下化学式 VIII 所示的化学发 光的 9， 10- 二氢化吖啶烯醇衍生物， 其中， R1 选自于烷基、 烯基、 炔基、 芳基、 以及含 1-20 个 碳原子的芳烷基， 所述碳原子中的任何一个可以用 1-3 个基团取代， 所述基团选自于羰基、 -2 羧基、 三 (C1-C8 烷基 ) 甲硅烷基、 SO3 基、 OSO3 基、 糖基、 PO3 基、 OPO3-2 基、 卤素原子、 羟基、 硫醇基、 氨基团、 季铵基团或季鏻基团 ； 其中， X 选自于 C1-C8 烷基、 芳基、 芳烷基、 烷基或包 含 1-20 个碳原子的芳基羧基、 三 (C1-C8 烷基 ) 甲硅烷基、 SO3 基、 糖基和化学式 PO(OR′ ) (OR″ ) 所示的磷酰基 ( 其中 R′和 R″是独立地选自于 C1-C8 烷基、 氰基烷基、 芳基和芳烷 基 )、 三烷基甲硅烷基、 碱金属阳离子、 碱土金属阳离子、 铵以及三烷基鏻阳离子， 其中 Z 选 6 自于 O 和 S 原子， 其中 R 选自于取代或未取代的 C1-C4 烷基、 苯基、 苯甲基、 烷氧基烷基和羧 7-14 基烷基， 其中 R 各自是氢、 或者 1 个或 2 个取代基是选自于烷基、 烷氧基、 羟基、 以及卤素， 7-14 7-14 1 并且其余的 R 是氢。在一个实施方式中， R 中的每一个都是氢， 并且 R 是标记性取代 7-14 7-14 基。在另一个实施方式中， R 之一是标记性取代基， 并且 R 中的其它是氢。
在另一个实施方式中， 化学发光标记化合物包含如下化学式 IX 所示的化学发光 1 化合物， 其中， R 选自于烷基、 烯基、 炔基、 芳基、 以及含 1-20 个碳原子的芳烷基， 所述碳原子 中的任何一个可以用 1-3 个基团取代， 所述基团选自于羰基、 羧基、 三 (C1-C8 烷基 ) 甲硅烷 -2 -2 基、 SO3 基、 OSO3 基、 糖基、 PO3 基团、 OPO3 基团、 卤素原子、 羟基、 硫醇基、 氨基团、 季铵基 团或季鏻基团 ； 其中， X 选自于 C1-C8 烷基、 芳基、 芳烷基、 包含 1-20 个碳原子的烷基或芳基 羧基、 三 (C1-C8 烷基 ) 甲硅烷基、 SO3 基团、 糖基和化学式 PO(OR′ )(OR″ ) 所示的磷酰基 ( 其中 R′和 R″是独立地选自于 C1-C8 烷基、 氰基烷基、 芳基和芳烷基 )、 三烷基甲硅烷基、 1 2 碱金属阳离子、 碱土金属阳离子、 铵以及三烷基鏻阳离子， 其中， Z 和 Z 各自选自于 O 和 S 2 3 原子， 并且其中 R 和 R 独立地选自于氢和 C1-C8 烷基。
连接基团 (L). 在本发明公开中使用的任何化学发光化合物中的连接基团可以是 化学键、 原子、 二价基团和多价基团、 或者是直链或支链原子， 其中一些可以是环状结构的 一部分。该取代基通常含有 1 至约 50 个非氢原子、 更通常 1 至约 30 个非氢原子。在另一 个实施方式中， 含有链的原子选自 C、 O、 N、 S、 P、 Si、 B 以及 Se 原子。在另一个实施方式中， 含有链的原子选自 C、 O、 N、 P 以及 S 原子。在链中除碳原子以外的原子的数量通常是 0-10。 卤素原子可以作为取代基存在于链或环上。典型的包含可连接的取代基的官能团包括 ： 亚 烷基， 亚芳基， 亚链烯基， 醚， 过氧化物， 羰基例如酮、 酯、 碳酸酯、 硫酯， 或者酰胺基， 胺， 脒， 氨基甲酸酯， 脲， 亚胺， 二酰亚胺， 二酰亚胺盐， 碳二亚胺， 肼， 重氮， 磷酸二酯， 磷酸三酯， 磷 酸酯， 硫醚， 二硫化物， 亚砜， 砜， 磺酸酯， 硫酸酯， 以及硫脲基团。在另一个实施方式中， 连 接基团是含 1-20 个原子的亚烷基链， 其末端为 ： -CH2-、 -O-、 -S-、 -NH-、 -NR-、 -SiO-、 -C( ＝ O)-、 -OC( ＝ O)-、 -C( ＝ O)O-、 -SC( ＝ O)-、 -C( ＝ O)S-、 -NRC( ＝ O)-、 -NRC( ＝ S)-、 或 者 -C( ＝ O)NR- 基团， 其中 R 是 C1-8 烷基。在另一个实施方式中， 连接基团是含 3-30 个原
子的聚 ( 亚烷氧基 ) 链， 其末端为 ： -CH2-、 -O-、 -S-、 -NH-、 -NR-、 -SiO-、 -C( ＝ O)-、 -OC( ＝ O)-、 -C( ＝ O)O-、 -SC( ＝ O)-、 -C( ＝ O)S-、 -NRC( ＝ O)-、 -NRC( ＝ S)-、 或者 -C( ＝ O)NR- 基 团， 其中 R 是 C1-8 烷基。
活性基团 . 活性基团 RG 是原子或基团， 其存在可以促进通过共价连接或者物理力 而键合于另一种分子。 在一些实施方式中， 例如， 当活性基团是离去基团比如卤素原子或甲 苯磺酸盐基团、 并且化学发光标记化合物被通过亲核置换反应而共价连接于另一种化合物 上时， 本发明公开的化学发光标记化合物连接至另一种化合物或者物质将涉及从活性基团 上丧失一种以上原子。
在一种实施方式中， RG 是 N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 酯基团。本领域的技术人员将很容易理解， 待被用这样一种包含 NHS 酯基的标记化合物所标记的物质将会与该物质上 的一部分 ( 典型地为胺基 ) 反应， 在该过程中会断开酯 C-O 键， 释放 N- 羟基琥珀酰亚胺， 并 且在所述物质的原子 ( 如果为胺基， 就是 N) 和所述标记化合物的羰基碳之间形成新的化学 键。
在另一个实施方式中， RG 是肼部分 -NHNH2。如同本技术领域已知的那样， 该基团 会与待标记的物质中的羰基反应， 从而形成酰肼连接物。
在其他实施方式中， 当发生加成反应例如 Michael 加成时、 或者当活性基团是异 氰酸酯或者异硫氰酸酯基团时， 化学发光标记化合物通过形成共价键而连接至另一种化合 物将涉及活性基团内部化学键的重构。在另一些其他的实施方式中， 连接不会涉及共价键 形成， 但涉及物理力， 而在这样情况下活性基团保持不变。而物理力是指吸引力， 比如氢键 吸引力、 静电吸引力或者离子吸引力 ； 疏水性吸引力比如碱基堆积 ； 以及特异性亲合力交 互作用比如生物素 - 链霉抗生物素蛋白交互作用、 抗原 - 抗体交互作用、 以及核苷酸 - 核苷 酸交互作用。
用于将标记化学结合至有机分子和生物分子的活性基团包括， 但不限于， 下述基 团： a) 胺活性基团 ： -N ＝ C ＝ S、 -SO2Cl、 -N ＝ C ＝ O、 -SO2CH2CF3、 N- 羟基琥珀酰亚胺酯 ； b) 硫醇活性基团 ： -S-S-R ； c) 羧酸活性基团 ： -NH2、 -OH、 -SH、 -NHNH2 ； d) 羟基活性基团 ： -N ＝ C ＝ S、 -N ＝ C ＝ O、 -SO2Cl、 -SO2CH2CF3 ； e) 醛类 / 酮活性基团 ： -NH2、 -ONH2、 -NHNH2 ； 以及 f) 其他活性基团， 例如、 R-N3、 R-C ≡ CH。
在一种实施方式中， 活性基团包括 OH、 NH2、 ONH2、 NHNH2、 COOH、 SO2CH2CF3、 N- 羟基琥 珀酰亚胺酯、 N- 羟基琥珀酰亚胺醚和顺丁烯二酰亚胺基团。
双功能偶联剂还可以用于用适度活性基团将标记偶联到有机分子和生物分子上 ( 参见 L.J.Kricka， 配体 - 结合物测定法。 Marcel Dekker 公司出版， 纽约， 1985 年， 第 18-20 页， 表 2.2 ； 和 T.H.Ji， “双功能试剂” ， 酶学方法。91， 580-609(1983))。有两种类型的双功 能试剂 ： 并入最终结构的双功能试剂， 以及不并入最终结构、 并且仅起偶联两种反应物作用 的双功能试剂。 水溶液
适合本发明公开的水溶液一般是含有大于 50％的水的溶液。在此描述的水溶液 适合于使用包括反应混合物、 样品稀释剂、 校准溶液、 化学发光标记的 sbp 溶液、 被活化剂 标记的 sbp 溶液、 增强剂溶液、 以及引发剂溶液 ； 或者一种以上下述溶液的浓缩液 ： 化学发 光标记的 sbp、 被活化剂标记的 sbp、 增强剂、 引发剂、 样品、 和 / 或选择性信号抑制剂。在许 多实施方式中， 水溶液是缓冲水溶液。合适的缓冲水溶液包括常用缓冲液中的任何一种， 这些缓冲液能够维持水溶液中环境、 维持分析物溶解性、 维持反应物溶解性、 并且允许化学 发光反应进行。缓冲液包括 ： 磷酸盐、 硼酸盐、 醋酸盐、 碳酸盐、 三 ( 羟基 - 甲基氨基 ) 甲烷 [tris]、 甘氨酸、 Tricine、 2- 氨基 -2- 甲基 -1- 丙醇、 二乙醇胺、 MOPS、 HEPES、 MES 等等。典 型地用于本发明公开的水溶液将具有大约 5 至约 10.5 范围内的 pH。
合适的水溶液可包含一种或多种下述附加成分 ： 盐， 生物学缓冲液， 醇类包括乙 醇、 甲醇、 乙二醇， 以及除垢剂。在一些实施方式中， 水溶液包括 Tris 缓冲液水溶液比如缓 冲液 II( 贝克曼考尔特公司 )。
在一些实施方式中， 使用模拟人类血清的水溶液。一个这样的合成基质是具有0.1％ ProClin 300 的 20mM PBS、 7％ BSA、 pH 7.5。合成基质可以用于， 但不限于， 样品稀释 剂、 校准溶液、 化学发光标记的 sbp 溶液、 被活化剂标记的 sbp 溶液、 增强剂溶液、 以及引发 剂溶液。术语 “PBS” 涉及通常意义的本技术领域已知的磷酸盐缓冲盐水。术语 “PBS” 涉及 通常意义的本技术领域已知的牛血清白蛋白。 检测
通过任何合适的已知装置或技术比如光度计、 X 射线底片、 高速感光胶片、 CCD 摄 像机、 闪烁计数器、 化学光量计、 或者可见光手段， 能够检测通过本发明的方法发射的光。 每 种检测装置或技术具有不同的光谱灵敏度。人眼是优选地对绿光灵敏， CCD 摄像机显示出 对红光的最高灵敏度， X 射线底片具有对紫外线、 蓝光或绿光的最大应答， 这些都是可利用 的。检测装置的选择将取决于本申请和成本、 方便性考虑、 以及是否需要产生经常记录。在 那些光发射时程较快的实施方式中， 优选进行引发剂反应以便在使用检测装置时产生化学 发光。 作为例子， 可以在适合于接受试管或微孔板的壳体内， 在放置于光度计中或者被置于 CCD 摄像机前的试管或微孔板中进行检测反应。 应用
本发明的测定方法发现了在许多类型的特异性结合配对测定法中的应用性。 在这 些应用中， 首要的应用是化学发光酶联免疫分析法， 比如 ELISA。进行免疫化学步骤的各种 测定形式和方案已为本领域技术人员所熟知， 并且包括竞争性测试和夹心法测试。可以通 过根据本发明公开的免疫测定法测试的物质种类包括 ： 蛋白质、 肽、 抗体、 半抗原、 药物、 甾 族化合物及其他通常在免疫测定技术领域已知的物质。 本发明公开的方法还可用于核酸检测。在一种实施方式中， 一种方法利用了酶标 记的核酸探针。例举的方法包括 ： 溶液杂交测定法、 Southern blotting 中的 DNA 检测、 通 过 Northern blotting 的 RNA 检测、 DNA 测序、 DNA 指纹图谱法、 集落杂交以及噬斑杂交法 (plaque lift)， 其进行过程对本领域的技术人员而言是众所周知的。 测试材料和试剂盒
本公开的目的还在于提供根据本发明公开的方法进行测定的试剂盒。 试剂盒在包 装产品组合中可以包括 ： 化学发光标记， 其或者是游离的标记化合物、 化学发光标记的分析 物特异性的结合成员、 化学发光衍生的固体支持物比如颗粒或者微孔板， 或者是化学发光 标记的辅助物质比如阻断蛋白质 ； 同时还有引发剂溶液和使用说明书。如果化学发光标记 是由使用者进行的话， 试剂盒还可以任选地含有活化剂共轭物、 分析物标准、 对照物、 稀释 剂和反应缓冲液。
在本发明公开的另一个实施方式中， 提供包含在其上固定有化学发光化合物的固 体支持物的测试材料。在一种实施方式中， 化学发光化合物选自如上所述化学发光化合物 组。在另一个实施方式中， 化学发光化合物是过氧化物酶的底物。固定化在固体支持物上 的化学发光化合物的量可以在荷载密度范围内变化。作为实施例， 当固体支持物是颗粒材 料时， 能够使用的荷载范围是每毫克粒子上 100-0.01μg 化学发光化合物。在另一个实施 例中， 能够使用的荷载范围是每毫克粒子上 5-0.1μg 化学发光化合物。该化学发光化合物 通常随机或均匀地分布到固体支持物之上。 其可以被固定化在固体支持物的表面上或者在 可到达的孔内部。化学发光化合物可以通过共价连接而被固定化到固体支持物上。本实 施方式中， 具有活性基团的化学发光标记化合物与存在于固体支持物上的官能团起反应，
以便在化学发光化合物和固体支持物之间形成共价键。在一个可替代的实施方式中， 可以 通过利用一种以上中间物质将化学发光化合物固定到固体支持物上。在一个实施例中， 生 物素被共价附接于固体支持物， 共价附接的生物素被结合于链霉抗生物素蛋白， 并且生物 素 - 化学发光化合物共轭物然后被结合。在另一个实施例中， 链霉抗生物素蛋白被吸附到 固体支持物上， 并且生物素 - 化学发光化合物共轭物然后被结合。在另一个实施例中， 结合 于辅助蛋白质比如白蛋白的化学发光化合物被吸附或者共价连接到固体支持物上。 在另一 个实施例中， 结合于抗体的化学发光化合物被吸附或者共价连接到固体支持物上。
固体支持物可以是各种材料、 孔隙度、 形状、 以及尺寸， 比如 ： 微孔板， 有 96 孔板、 384 孔板、 或更高孔数的微孔板 ； 试管 ； 样品杯 ； 塑料微球 ； 纤维素 ； 纸或塑料测试条 ； 胶乳 粒子 ； 直径为 0.10-50μm 的聚合物颗粒 ； 直径为 0.10-50μm 的二氧化硅粒子 ； 磁性粒子， 尤其是那些平均直径为 0.1-10μm 的磁性粒子， 以及纳米颗粒。在一种实施方式中， 固体支 持物包含直径为 0.10-50μm 的聚合物颗粒或二氧化硅粒子， 并且可以是如上限定的磁性 粒子。
本发明公开的固定化化学发光化合物包括附着于固体支持物的化学发光标记， 其 中， 通过具有通式 CL-L-RG 的化学发光标记性化合物而提供化学发光标记， 其中， CL 代表化 学发光部分， L 代表将化学发光部分连接至活性基团的连接部分， 并且 RG 代表用于偶联于 另一种材料的活性基团部分。化学发光部分 CL 包括经受与活化剂的反应的化合物， 该反应 导致该化合物被转化为激活的化合物。 激活的化合物与引发剂溶液的反应形成电子激发态 化合物。在术语 “化学发光标记化合物” 包括， 但不限于， 氨基苯二酰一肼 ( 鲁米诺 )、 以及 在结构上相关的环状酰肼、 9， 10- 二氢化吖啶酯、 硫酯和氨磺酰、 以及 9， 10- 二氢化吖啶乙 烯酮二硫缩醛类化合物的条件下， 化学发光部分包括各类如上所述的化合物。
在本发明公开的另一个实施方式中， 提供包含其上固定有化学发光化合物的固体 支持物的测试材料和至少一种特异性结合物质， 所述特异性结合物质对于分析物有特异性 结合亲合力， 或者对于另一种物质有特异性结合亲合力， 所述另一种物质对于分析物有特 异性结合亲合力。在这些实施方式中， 固定化化学发光化合物是如上刚刚描述的包含其上 固定有化学发光化合物的固体支持物的实施方式。 固定化的特异性结合物质通过一种以上 特异性亲合力结合反应而直接或间接地结合分析物。 该特异性的结合物质包括， 但不限于 ： 抗体和抗体片段、 抗原、 半抗原和它们的同源抗体、 生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素 蛋白、 蛋白质 A 和 IgG、 互补核酸或低聚核苷酸、 凝集素和碳水化合物。
本发明公开的另一种实施方式包括在测定中形成的信号系统， 该信号系统包含固 体支持物， 在该固体支持物上固定化有 ： 1) 化学发光化合物， 2) 至少一种对于一种分析物 有特异性结合亲合力的、 或者对于另一种物质有特异性结合亲合力的特异性结合物质， 所 述另一种物质对于一种分析物有特异性结合亲合力， 3) 分析物， 以及 4) 活化剂结合物。术 语 “固体支持物” 、 “化学发光化合物” 和 “特异性结合物质” 的含义和被这些术语包含的实 施方式与如上所述被认为是本发明公开的组合物的测试材料的意义和实施方式相同。 可以 形成本发明信号系统的组成部分的分析物包括上述限定的任何分析物， 其存在、 位置或含 量在测定中被确定。活化剂共轭物包括被连接至分析物 - 特异性结合伴侣共轭物的活化剂 化合物。该共轭物具有双重作用 ： 1) 在测定中， 通过分析物特异性结合成员部分直接地或 者通过中间的分析物特异性结合成员而特异性地结合至分析物上， 和 2) 通过活化剂部分激活化学发光化合物。 共轭物的活化剂化合物部分是具有激活化学发光化合物的效果的化 合物， 使得当存在引发剂溶液时产生化学发光。能够用作活化剂的化合物包括具有过氧化 物酶状活性的含有过渡金属盐和复合物以及酶、 尤其是含有过渡金属的酶、 更尤其是过氧 化物酶的化合物。在活化剂化合物中有用的过渡金属包括周期表中第 3-12 族的那些过渡 金属， 尤其是铁、 铜、 钴、 锌、 锰和铬。可以经受化学发光反应的过氧化物酶包括， 例如 ： 乳过 氧化物酶、 微小过氧化物酶、 髓过氧化物酶、 卤素过氧化物酶、 钒溴过氧化物酶、 辣根过氧化 物酶、 真菌的过氧化物酶、 木质素过氧化物酶、 来源于 Arthromyces ramosus 的过氧化物酶、 在白腐真菌中产生的 Mn 依赖性过氧化物酶、 以及大豆过氧化物酶。具有过氧化物酶状活性 的其他化合物包括铁复合物， 比如亚铁原卟啉、 和 Mn-TPPS4。 系统
通过使用一个系统， 本发明公开所述的测定方法可以自动用于快速进行。用于进 行本公开的测定的系统要求流体处置能力， 能够等分并释放引发剂溶液至含有其他反应物 的反应容器中， 并读取所产生的化学发光信号。 在这样一种系统的实施方式中， 光度计被定 位于当注射引发剂溶液时最接近反应容器的位置处。另外， 用于进行本公开的测定的自动 化系统具有流体处置能力， 能够等分并释放其他反应物和样品至反应容器中。
改进的 DXI 800 仪器被改进， 以便进行本发明公开的测定方法。 未进行改变的 DXI 800 仪器的进一步说明可购买贝克曼考尔特公司的 UniCel DXI 使用指南 2007， 在此引入 本文以供参考。为了用于进行在此描述的方法， DXI 800 免疫测定仪器通过并入光子计数 光度计 ( 与商业化使用的 DXI 800 仪器为相同型号 ) 而改进， 设置该光子计数光度计用于 检测， 其在注射引发剂溶液期间、 以及在注射引发剂溶液后即刻进行检测时靠近反应容器 的位置 ( 离反应容器大约 19mm)。
在 DXI 800 免疫测定仪内部的底物输送系统被用于输送引发剂溶液。为了方便 起见， 根据在此描述的方法的测定中并不需要的 DXI 800 免疫测定仪上的一些附加部件 被移去， 这些附加部件例如是磁铁和用于分离和洗涤的抽吸系统， 这些部件是常规的免疫 测定所必需的， 但是在本发明的方法中不使用。为了便于自动反应容器处理、 吸取试剂、 检 测， 使用改进的 DXI 800 免疫测定仪， 并且温度控制在 37℃。可以类似地使用商品化的测 试设备， 来进行在此描述的测定方法， 只要该设备能够或者可以被改进得能将引发剂溶液 注入反应容器中、 并且以并行的或几乎并行的方式启动化学发光信号检测即可。其他仪器 实例在下文中列出。 化学发光信号的检测可以历时非常短， 为几个毫秒， 比如一个循环的光 电倍增管 (PMT)， 或者可以延长为几秒钟。 收集的全部或部分信号可以被用于后续的数据分 析。
化学发光信号的检测可以历时非常短， 为几个毫秒， 比如一个循环的光电倍增管 (PMT)， 或者可以延长为几秒钟。 收集的全部或部分信号可以被用于后续的数据分析。 例如， 在如下所述的典型工艺中， 光强度合计为 0.25 秒、 集中闪光。在其他的工艺中， 光强度合计 为 5 秒， 第一个 0.5 秒是注射之前的延迟。 实施例 词汇 ：
AHTL ： N- 乙酰基高半胱氨酸内酯
AK ： 9， 10- 二氢化吖啶乙烯酮二硫缩醛CKMB ： 肌酸激酶同工酶
DMF ： 二甲基甲酰胺
EDC ： 1- 乙基 -3-(3- 二甲基氨基丙基 ) 碳二亚胺
HRP ： 辣根过氧化物酶
MS-PEG ： 胺类 - 反应性线型聚乙烯乙二醇聚合物， 具有末端甲基
Na2EDTA ： 乙二胺四乙酸钠盐
NHS ： N- 羟基琥珀酰亚胺
PEG ： 聚乙二醇 ； 具体地说低聚物、 或者分子量为＜ 20,000g/mol 的聚合物
PEO ： 聚环氧乙烷 ； 具体地说分子量为＞ 20,000g/mol 的聚合物
PMP ： 1- 苯基 -3- 甲基 -5- 吡唑啉酮 PSA ： 前列腺特异性抗原
Sulfo-SMCC ： 硫代琥珀酰亚胺 -4-(N- 马来酰亚胺甲基 ) 环己烷 -1- 羰酸酯
TBS ： Tris- 缓冲盐水
TnI ： 肌钙蛋白 I ； cTnI 是心脏的肌钙蛋白 I
Tris ： 2- 氨基 -2- 羟甲基 - 丙烷 -1， 3- 二醇， 亦称三 ( 羟甲基 ) 氨基甲烷
Tween -20 ： 聚氧化乙烯 (20) 单月桂酸钠 ； 购自 Sigma-Aldrich 公司， 圣路易斯 市 ( 密苏里州 )。 材料 ：
包含有增强剂的引发剂溶液 ： 在许多下述实施例中使用的引发剂水溶液称为引发 剂溶液 A。引发剂溶液 A 含有在 25mM Tris 缓冲水溶液 pH 8.0 中的 8mM 对羟基桂皮酸、 1mM Na2EDTA、 105mM 过氧化脲、 3％乙醇、 以及 0.2％吐温 -20。所有组分都是购自各个供应商 比如密苏里州圣路易市的 Sigma 公司。 缓冲液 II ： (Tris 缓冲盐水、 表面活性剂、 ＜ 0.1 ％叠氮化钠、 以及 0.1 ％ ProClin 300( 罗门哈斯公司 )， 购自加利福尼亚州 Brea 市的贝克曼考尔特公司 )。 仪器 ：
改进的 DXI 800 免疫测定仪 ( 贝克曼考尔特公司 ) ： 改进的 DXI 800 仪器被用 于进行下述几个实施例中标注的测定方法。为了用于进行在此描述的方法， DXI 800 免疫 测定仪器通过并入光计数光度计 ( 与商业化使用的 DXI 800 仪器为相同型号 ) 而改进， 设 置该光计数光度计用于检测， 其在注射引发剂溶液期间、 以及在注射引发剂溶液后即刻进 行检测时靠近反应容器的位置 ( 离反应容器大约 19mm)。在 DXI 800 免疫测定仪内部的 底物输送系统被用于输送引发剂溶液。为了方便起见， 根据在此描述的方法的测定中并不 需要的 DXI 800 免疫测定仪上的一些附加部件被移去， 这些附加部件例如是磁铁和用于 分离和洗涤的抽吸系统， 这些部件是常规的免疫测定所必需的， 但是在本发明的方法中不 使用。为了便于自动的反应容器处理、 吸取试剂、 检测， 使用改进的 DXI 800 免疫测定仪， 温度控制在 37℃。 可以类似地使用商品化的测试设备， 来进行在此描述的测定方法， 只要该 设备能够或者可以被改进得能将引发剂溶液注入反应容器中、 并且以并行的或几乎并行的 方式启动化学发光信号检测即可。其他仪器实例在下文中列出。 化学发光信号的检测可以历时非常短， 为几个毫秒， 比如一个循环的光电倍增管 (PMT)， 或者可以延长为几秒钟。收集的全部或部分信号可以被用于后续的数据分析。化学发光信号的检测可以历时非常短， 为几个毫秒， 比如一个循环的光电倍增管 (PMT)， 或者可以延长为几秒钟。 收集的全部或部分信号可以被用于后续的数据分析。 例如， 在如下所述的典型工艺中， 光强度合计为 0.25 秒、 集中闪光。在其他的工艺中， 光强度合计 为 5 秒， 第一个 0.5 秒是注射之前的延迟。
Luminoskan Ascent 平板光度计， (Thermo Fischer 科学公司， Waltham， 麻萨诸 塞州 ) 未被改变。在室温下进行这些方法。
SpectraMax L 微孔板光度计， (Molecular Devices 公司， Sunnyvale， 加利福尼 亚州 )， 未被改变。在室温下使用快速读数动力学模式进行所述测定方法。 实施例 1 ： 使用模型体系筛选 SSIA
还开发出模型体系， 并且将其用于筛选并选出具有一定特征的化合物， 该特征在 本发明公开的测定中具有选择性信号抑制剂的功能。该模型体系使用连结于 BSA( 牛血清 白蛋白 ) 的微粒、 以及生物素化 HRP 作为被活化剂标记的特异性结合配对。该 BSA 用链霉 抗生物素蛋白和 9， 10- 二氢化吖啶乙烯酮二硫缩醛化学发光标记 (AK1) 进行了标记， 作为 化学发光标记的 sbp。在模型体系中， 将含量变化的 Btn-HRP 以 0、 1、 10、 100 和 250ng/ml 的 浓度加至所述化学发光标记的特异性结合配对中。 加入另外的未标记的 HRP， 达到在每个反 应混合物中总的 HRP 浓度为 500ng/ml。向化学发光标记的 sbp 微粒提供未标记 HRP 与被活 化剂标记的 sbp 的组合， 以便模拟样品。还加入作为 SSIA 的用于评估的化合物。然后以一 种本发明公开的测定的方式， 通过添加引发剂溶液来引发该模型体系的反应混合物。 用于模型体系的材料制备 ：
为了制备在微粒上的化学发光标记的 sbp， 用 4 倍摩尔过量的生物素 -LC- 硫代 NHS(Pierce 生物技术公司， Rockford， 美国伊利诺伊州 ) 对牛血清白蛋白 (BSA) 进行生物 素化。经由脱盐或者透渗析除去未被结合的反应物。该生物素 -BSA 然后在 20mM 磷酸钠 pH 7.2 ∶二甲亚砜 75 ∶ 25(v/v) 中与 5 倍摩尔过量的 9， 10- 二氢化吖啶乙烯酮二硫缩醛 AK1 起反应， 接着在相同的缓冲液中脱盐。该二元标记 ( 生物素和 AK1) 的 BSA 然后在 0.1M 硼 酸盐缓冲液 pH 9.5 中， 以每 mg 微粒大约 20μg 标记的 BSA 的浓度， 在 40℃处， 与甲苯磺酰 基活化的 M-280 微粒 (Invitrogen 公司， Carlsbad， 美国加利福尼亚州 ) 偶联 16-24h。在 偶联后， 微粒用 0.2M TRIS 碱、 2％ SDS、 pH ～ 11 在 40℃下解吸 1h。解吸过程重复一个附加 的时间。微粒然后被悬浮于 0.1％ BSA/Tris 缓冲盐水 (BSA/TBS) 缓冲液中， 并且以每 mg 微 粒大约 15μg 链霉抗生物素蛋白加入链霉抗生物素蛋白 (SA)。 在室温下将链酶抗生物素蛋 白与微粒混合 45-50 分钟。然后微粒洗涤三次， 并且悬浮于相同的 BSA/TBS 中。研究显示， 这些碱性微粒的每 mg 微粒能够结合大约 5μg 的生物素化蛋白质。
用 4 倍摩尔过量的生物素 -LC- 硫代 NHS(Pierce 生物技术公司， Rockford， 美国伊 利诺伊州 ) 对 HRP( 罗氏诊断公司， 美国印第安纳州印第安纳波利斯市 ) 进行生物素化。经 由脱盐或者透析除去未被结合的反应物。
将每个用于评估的 SSIA 化合物以至少 10 倍于反应混合物中终浓度的浓度 ( 在添 加引发剂溶液之后 ) 溶于缓冲液 II 中。 顺磁性颗粒 (PMP) ： (M280)-(Btn-BSA-AK)-( 链霉抗生物素蛋白 ) ；
样品模拟器 ： B-HRP ∶ HRP ； 500ng/ml 全部用 B-HRP ∶ HRP 滴定， 总的 HRP 浓度为 500ng/ml， Btn-HRP 变化率 ： 0、 1、 10、 100 和 250ng/ml。SSIA ： 根据下表在缓冲液 II 中， 使其终浓度为 100μM。
引发剂溶液 A 被限定如上。 使用模型体系的测试工序
将 25μL 的 1mg/mL 二元标记 ( 生物素和 AK1) 的 BSA M280 颗粒与 45μL 的缓冲 液 II 中工作浓度 SSIA 相混合。通过加入 15μl 的缓冲液 II 将测定体积调整为 85μl。加 入 15μl 含有不同比率 Btn-HRP ∶ HRP( 生物素化 HRP 的含量为 0、 1、 10、 100 和 250ng/ml 不等 ) 的样品。反应混合物于 37℃下孵育 30 分钟， 然后加入 100μl 的引发剂溶液， 记录光 强度。包括引发剂溶液在内的反应混合物总体积是 200μL， SSIA 的终浓度为 100μM。 表2表3表 4. 用作 SSIA 的不足效果结论
显示可作为 SSIA 使用的化合物包括抗坏血酸、 抗坏血酸的 6- 棕榈酸酯和 5， 6- 异亚丙基衍生物、 以及 TROLOX( 水溶性维生素 E)、 生育酚的衍生物、 2- 氨基苯酚、 4- 氨 基 -3- 羟基苯甲酸、 4- 氨基间苯二酚盐酸盐、 4- 氯代儿茶酚、 以及 2- 氯 -1， 4- 对苯二酚， 它 们通过与对照物比较 S0 值而显示出背景信号减少， 并且通过提高 S1/S0 值而显示出信噪比 提高。
在模型系统中显示出没有效果的化合物是 ： 谷胱甘肽、 半胱氨酸、 N- 乙酰半胱氨 酸、 硫辛酸 ( 一种二硫化物 )、 聚乙二醇化生育酚、 N- 乙酰 -5- 甲氧基色胺 ( 色胺衍生物 )、 TEMPOL( 稳定的硝基氧 )、 烟碱酰肼、 烟酸、 以及两种丙烯酰胺 / 二丙烯酰胺溶液。包括 α和 γ- 生育酚、 尿酸、 以及阿魏酸在内的第二个化合物组显示出在 75-88％范围内的 S0 信号 减少， 但并没有显示出 S1/S0 的提高直至第三校准剂水平在 10ng/mL Btn-HRP。 实施例 2. 通过均相 PSA 免疫测试筛选 SSIA
该实施例提供了一个用于测试在本发明公开的测定中具有 SSIA 功能的候选化合 物的方法。 在蛋白质 PSA 的模型筛选免疫测试中进行测试。 使用 96 孔微量滴定板形式进行 小鼠抗 PSA 测试。 含有 30μl 小鼠抗 PSA-AK1(66ng)、 30μl 小鼠抗 PSA-HRP 偶联物 (7.8ng)、 36μl 的人类女性血清、 以及 24μl 的 PSA 校准剂的溶液被移入每个孔中。 孔板在 37℃下孵 育 10 分钟。将 5μL 等分的受测化合物 ( 多种浓度 ) 加至每个孔中。通过加入 100μL 的 引发剂溶液 A 的溶液引发化学发光。在加入引发剂溶液后， 使用 Luminoskan Asent 平板 光度计 (Thermo Fischer 科学公司， Waltham， 麻萨诸塞州 )， 将化学发光闪光整合 5 秒钟。
每个候选化合物都测试至少两个水平的 PSA ： 0 和 129ng PSA/mL( 校准剂 S5) 和 / 或 2ng PSA/mL( 校准剂 S2)。 为简便起见， 对于每个候选化合物仅给出了一个有代表性的浓 度的结果。如果 S5/S0 相对于对照物得到提高， 则化合物在提高测定性能方面被认为是有 效的。 在本发明筛选中， 优选提高倍数至少是 2(S5/S0 ≥大约 20-30)， 并且优选提高倍数至 少是 5(S5/S0 ≥大约 50)， 更优选 S5/S0 是≥ 100。在该筛选试验中， 发现许多化合物显示 出作为 SSIA 有效的， 但发现其它化合物没有效果或者效果有限。 表5： 受测化合物、 终浓度和 S5/S0实施例 3 ： 制备具有 AK1 和 AB1 的颗粒
该实施例描述了一种用于制备具有 AK 化学发光标记和特异性结合配对成员 Ab1 的固体表面 (LodeStars 羧基顺磁性颗粒 “LodeStar PMP” ) 的方法。Ab1 是用于在后实施 例中述及的分析物 (CK-MB、 βhCG、 肌红蛋白、 cTnI、 以及 PSA) 的单克隆抗体。根据本技术 领域的习惯， 术语 “Ab” 可选择地后接数量或者字母标志符， 是指一种具有指示数或者字母 命名的抗体。类似地， 术语 “Ag” 在上下文的抗体 - 抗原相互作用中是指抗原。
将 Lodestar PMP(8.33mL， 30mg/mL) 悬 浮 在 0.1M MES/ 二 甲 亚 砜 (75 ∶ 25) (9.95mL) 中。将 EZ- 连接生物素 -PEO4- 酰肼 (31.6mL， 20mg/mL)、 EDC(25mg/mL 终浓度 )、 以 及具有酰肼标记部分的 AK4(15.6mL， 80mmol/L) 加至 Lodestar PMP， 在室温下 140-160rpm 搅拌 1 分钟， 然后在 4℃下过夜 (16-24 小时 )。洗涤粒子， 然后再悬浮于缓冲液 II。将 SA21 链霉抗生物素蛋白 -Plus(0.49mL， 10.2mg/mL) 加至 PMP， 从而形成 AK- 链霉抗生物素蛋白 Lodestar 颗粒。
抗体是使用下述两个有代表性的方案之一标记的生物素 ：
1) 将 10 倍 摩 尔 过 量 的 NHS-LC- 生 物 素 (Thermo Scientific 公 司， Rockford， 伊利诺伊州 ) 加至抗 cTnI 单克隆抗体中， 并且将混合物在室温下温育 2 小时。生物素化抗体通过在 PBS、 pH 7.2 中透析进行纯化。当使用商品化的生物素定量试剂盒 (Thermo Scientific 公司 ) 确定时， 生物素∶抗体摩尔比是 4.9。或者
2) 通过将溶于二甲亚砜 2mg/mL 的 6 倍摩尔过量的 NHS-(PEO)4- 生物素 (Thermo Fisher Scientific 公司， Waltham， 麻萨诸塞州 ) 加入 6mg 的 MxPSA 抗体 ( 在 PBS 中 7.6mg/ ml， pH 7.4) 制备出生物素化 PSA 抗体。在室温下温育 60 分钟后， 按照厂家说明书， 在用 PBS、 pH 7.4 平衡后的 Sephadex G-25 柱子 (Ge 保健公司， Piscataway， 新泽西州 ) 上纯化 生物素化抗体。
AK- 链霉抗生物素蛋白 Lodestar 颗粒 (5mg/ml) 被置于缓冲液 II 中。计算出需要 的 Ab1 含量， 并且将其加入 AK- 链霉抗生物素蛋白 Lodestar 颗粒 ( 通常 5μg/mg， 不同之 处在于对于 βhCG 为 10μg/mg)。旋涡振荡反应混合物， 并且在 4℃下温育过夜， 从而形成 AK-Ab1 颗粒。 实施例 4 ： HRP-AB2 共轭物的制备
使用本技术领域已知的方法制备出 HRP-Ab2 共轭物。将 HRP 结合至抗体以便生 产 HRP-Ab2 共轭物的详细方法在文献例如 Journal of Immunoassay， Vol.4， No.3， 1983， p209-321 中有描述。Ab2 是用于在后的实施例中描述的分析物 (CK-MB、 βhCG、 肌红蛋白、 以及 TnI) 的单克隆抗体， 其结合于分析物上不同于 Ab-1 的抗原位点。
通常， 通过使用产物依赖性浓度的 N- 乙酰基 -DL- 高半胱氨酸硫内酯 (AHTL)， 将游 离的硫醇附着于抗体 (Ab2)。通过脱盐， 从抗体上除去过量的 AHTL。通过使用摩尔过量的 硫代琥珀酰亚胺 4-(N- 马来酰亚胺甲基 ) 环己烷 -1- 羧酸酯 ( 硫代 -SMCC)， 将马来酰亚胺 附着于 HRP。通过脱盐， 从 HRP 上除去过量的硫代 SMCC。以 4HRP 对 1Ab2 的摩尔比合并抗 体和 HRP， 在反应物基团之间形成共价键。抗体被定量加入 HRP 中， 同时保持 HRP 过量。在 温育适当的时间后， 通过用 β- 巯基乙醇 (βME) 和 N- 乙基顺丁烯二酰亚胺 (NEM) 封闭未 反应的官能团来终止反应。浓缩结合产物 (HRP-Ab2 共轭物 )， 并且通过凝胶过滤与任何聚 集物结合产物和未反应的抗体或 HRP 分离。基于 OD280 和 OD403 活性来汇集结合产物。 实施例 5 ： CK-MB
该实施例描述了一种通过使用按照在实施例 3 中描述的方法制备的 AK-Ab1 颗粒 和按照在实施例 4 中描述的方法制备的 HRP-Ab2 共轭物检测 CK-MB( 肌酸激酶心肌带 ) 的 方法， 其中， Ab2 代表对于 CK-MB 的抗体。该方法使用抗坏血酸来降低背景信号。 制备出 HRP-Ab2 共轭物混悬液， 浓度为 1.0μg/ml， 并且含有 0 或 1mM 抗坏血酸。由人 类血清样品组成的样品具有标明量的 CK-MB， 添加或不含作为对照物的 CK-MB。检测过程 包括向反应容器中加入 15μL 的 1.0μg/ml HRP-Ab2 共轭物和 35μL 含有 1mg/mlBSA 和 1.0mg/mL MIgG、 pH 5.9 的 MES 缓冲液。接着， 加入 25μL 患者血清样品， 接着加入 25μL 的 1.0mg/ml AK-Ab1 共轭物混悬液， 从而在反应容器中获得 100μL 的总体积。在 15.2 分 钟后， 将 100μL 引发剂溶液 A 加至反应容器， 并且在改进的 DxI 仪上记录光强度。化学发 光强度表示为相对光单位 (RLU)。 表6实施例 6 ： BETA HCG(β 人绒膜促性腺激素 )
该实施例描述了一种通过使用按照在实施例 3 中描述的方法制备的 AK-Ab1 颗粒 和按照在实施例 4 中描述的方法制备的 HRP-Ab2 共轭物检测 β 人绒膜促性腺激素 (beta hCG 带 ) 的方法， 其中， Ab2 代表对于 betahCG 的抗体。该方法使用抗坏血酸来降低背景信 号。
制备出 HRP-Ab2 共轭物混悬液， 浓度为 1.0μg/ml， 并且含有 0 或 1mM 抗坏血酸。 由人类血清样品组成的样品具有标明量的 beta hCG， 添加或不含作为对照物的 beta hCG。 检测过程包括向反应容器中加入 20μL 的 1.0μg/ml HRP-Ab2 共轭物和 30μL 含有 1mg/ml BSA 和 1mg/mLMIgG、 pH 5.9 的 MES 缓冲液。 接着， 加入 25μL 患者血清样品， 接着加入 25μL 的 10mg/ml AK-Abl 共轭物混悬液， 从而在反应容器中获得 100μL 的总体积。在 15.2 分钟 后， 将 100μL 引发剂溶液 A 加至反应容器， 并且在改进的 DxI 仪上记录光强度。化学发光 强度表示为相对光单位 (RLU)。 表7实施例 7 ： 肌红蛋白
该实施例描述了一种通过使用按照在实施例 3 中描述的方法制备的 AK-Abl 颗粒 和按照在实施例 4 中描述的方法制备的 HRP-Ab2 共轭物检测肌红蛋白的方法， 其中 Ab2 代 表对于肌红蛋白的抗体。该方法使用抗坏血酸来降低背景信号。
制备出 HRP-Ab2 共轭物混悬液， 浓度为 1.0μg/ml， 并且含有 0 或 1mM 抗坏血酸。 由人类血清样品组成的样品具有标明量的肌红蛋白， 添加或不含作为对照物的肌红蛋白。 检测过程包括向反应容器中加入 20μL 的 1.0μg/ml HRP-Ab2 共轭物和 30μL 含有 1mg/ ml BSA 和 1.0mg/mL MIgG、 pH 5.9 的 MES 缓冲液。接着， 加入 25μL 患者血清样品， 接着加 入 25μL 的 5.0mg/ml AK-Abl 共轭物混悬液， 从而在反应容器中获得 100μL 的总体积。在 15.2 分钟后， 将 100μL 引发剂溶液 A 加至反应容器， 并且在改进的 DxI 仪上记录光强度。 化学发光强度表示为相对光单位 (RLU)。 表8实施例 8 ： 通过异相测定的 CTNI 检测
该实施例描述了一种通过使用例如按照在实施例 3 中描述的方法制备的 AK-Ab1 颗粒和例如按照在实施例 4 中描述的方法制备的 HRP-Ab2 共轭物来检测 cTnI( 心脏肌钙蛋 白 I) 的方法， 其中 Ab2 代表对于 cTnI 的抗体。研究了抗坏血酸对背景信号的影响。
制备出 HRP-Ab2 共轭物混悬液， 浓度为 1.0μg/ml， 并且含有 0 或 1mM 抗坏血酸。 由人类血清样品组成的样品具有标明量的 cTnI， 添加或不含作为对照物的 cTnI。检测过程 包括向反应容器中加入 20μL 的 1.0μg/ml HRP-Ab2 共轭物和 30μL 含有 1mg/mlBSA 和 1.0mg/mL MIgG、 pH 5.9 的 MES 缓冲液。接着， 加入 25μL 患者血清样品， 接着加入 25μL 的 1.0mg/ml AK-Ab1 共轭物混悬液， 从而在反应容器中获得 100μL 的总体积。在 15.2 分 钟后， 将 100μL 引发剂溶液 A 加至反应容器， 并且在改进的 DxI 仪上记录光强度。化学发 光强度表示为相对光单位 (RLU)。在下表中提供的结果表明， 在存在抗坏血酸的条件下， 背 景信号明显减小。 表9实施例 9 ： 用于 GM-CSF 的异相测定
术语 “GM-CSF” 是指粒细胞巨噬细胞结肠刺激因子， 一种为造血祖细胞的存活、 增 殖和分化所需要的蛋白质， 具有人类基因图谱基因座位 5q31.1。 多种 GM-CSF 的抗体市场上 可买到。
针对 GM-CSF 的异相测定是通过使用如在实施例 3 中描述的被 AK4 和生物素 / 链 霉抗生物素蛋白标记的 LodeStars PMP(AK-PMP-SA)、 抗体 - 生物素共轭物和结合于 GM-CSF 的抗体 -HRP 共轭物进行的。抗体 -HRP 共轭物、 ( 抗 GM-CSF-HRP) 购自 Antigenix。
抗体 - 生物素 ( 抗 GM-CSF- 生物素 ) 共轭物通过将溶于二甲基甲酰胺 (1mg/ml) 的 25 倍摩尔过量的 (9.28μg) 的硫代 NHS- 生物素 (Pierce) 加入在 0.1mL 的 0.1M 硼酸钠 pH 8.25 中的 0.1mg 抗体中 (Antigenix) 而合成的。在室温下温育 60 分钟后， 将反应物继 续于 4℃下温育过夜。按照厂家说明书， 在用 PBS、 pH 7.4 平衡后的 SephadexG-25 柱子 (Ge 保健公司 ) 上纯化生物素化抗体。
为 了 进 行 异 相 测 定， 将 30μL 抗 GM-CSF- 生 物 素 共 轭 物 溶 液 (0.75μg/mL， 22.5ng)、 30μL 具有 0-30,000pg/mL 范围内的 GM-CSF 的校准溶液、 30μL 的抗 GM-CSF-HRP 共轭物 (2.25μg/mL， 67ng)、 以及 30μL 的 AK- 链霉抗生物素蛋白磁性颗粒溶液 (10μg 的 颗粒 ) 移液至白色微量滴定板的孔中。滴定板在室温下温育 60 分钟。加入 5μL 的 2- 氨 基苯酚溶液 (11mM， 55 纳摩尔 ) 作为 SSIA。把滴定板放入注射平板光度计中。通过光度计 加入 100μL 的引发剂溶液 A， 并且读取化学发光信号 5 秒钟。
平均化学发光强度 (RLU)、 以及相对于反应混合物中缺少 GM-CSF 时的比率、 (S/ S0) 与反应混合物中 GM-CSF 浓度的关系列于下表中。 表 10浓度 (pg/mL) 30000 10000 1000 100 10 5 3 1 0 平均 RLU 2180 580.6 47.89 5.2805 1.284 0.9205 0.8865 0.8045 0.7805 S/S0 2793.081 743.882 61.358 6.765 1.645 1.179 1.135 1.030 1.000实施例 10 ： 引发剂溶液 PH 的影响
A. 按照在实施例 3 中描述的方法， 通过使用实施例 1 的生物素 HRP 模型系统， 在直接与 AK4 和生物素酰肼偶联的 LodeStars 颗粒上， 在测定模型中评价 pH 对异相固相测定性 能的影响。如上所述， 颗粒然后被动地用 SA 涂覆， 接着进行冲洗以便除去未结合生物素的 SA。筛选缓冲盐以使 pH 在 6-9 的范围内。pH 对测定中的背景化学发光的影响关系如图 1A 所示。pH 对使用比率为 16 ∶ 184 的 btn-HRP ∶ HRP 的特异性信号的影响被描述图 1B 中。
B. 为了确定引发剂溶液 pH 对多种测试测定体系的影响， 通过改变引发剂 pH 进 行一系列实验。下述表 11A 提供了平均化学发光强度与在使用 pH 范围为 6.2-8.4 的 LodeStars 颗粒上 PSA 的测定中 PSA 浓度的关系。表 11B 提供了对于在 pH 范围为 5.9-8.6 的 LodeStars 颗粒上的 CK-MB 的对应结果。表 11C 提供了对于在 pH 范围为 5.9-8.7 的 LodeStars 颗粒上 TnI 的对应结果。在这些表中， 对于每个数据组列举出两个 pH 值。第一 个是加入反应混合物中的缓冲样品的 pH。第二个是得到的最终反应混合物的 pH。 表 11A. 在具有抗坏血酸盐的 LodeStars 颗粒上的 PSA表 11B. 在具有抗坏血酸盐的 LodeStars 颗粒上的 CK-MB表 11C. 在具有抗坏血酸盐的 LodeStars 颗粒上的 TnI实施例 11 ： PH 对 PMP 模型系统中测定信号的影响
在具有按照实施例 1 中一般描述的生物素 -HRP 的模型系统中， 对于使用 Dynal M-280 和 LodeStars 颗粒的测定， 进一步研究 pH 对异相固相测定性能的影响。用 AK1- 链霉 抗生物素蛋白 -PMP 标记的 LodeStars 颗粒是在实施例 3 中描述的 LodeStars 颗粒。通过 用实施例 1 中描述的 AK-BSA- 生物素、 接着用链霉抗生物素蛋白共价偶合标记的 M-280 颗 粒进行甲苯磺酰基活化。 缓冲液
就表 12 而言， 缓冲液是 100mM 缓冲液离子、 在 TRITON X-100 中 0.2％、 以及在 NaCl 中 150mM。通过组合 1 份缓冲液、 1 份 25mM Tris， pH 8、 以及 2 份引发剂溶液 A， 确定 “引发 剂后” pH。读取 pH 时的温度是 37.4℃。 表 12. 缓冲液 pH 研究杯中样品 Tris pH 8.0 Tris pH 8.5 Tris pH 9.0 碳酸盐 pH 9.5 碳酸盐 pH 10.0 碳酸盐 pH 10.7 碳酸盐 pH 11.2 引发剂后 7.53 7.74 7.95 7.91 8.44 9.07 9.3244102333885 A CN 102333900说明书8.04 8.4740/51 页硼酸盐 pH 9.4 硼酸盐 pH 10.0
用于该实验的样品 pH、 引发剂后 pH、 相对化学发光和信噪比 (S/N) 结果显示在分 别用于 LodeStars 和 Dynal M-280PMP 的表 13A 和 13B 中。 表 13A. 对于 LodeStars PMP 的测定结果表 13B. 对于 Dynal M-280PMP 的测定结果结论
已经观察到 pH 会显著影响对于 LodeStars 和 Dynal M-280PMP 两者的化学发光， 并且这种影响在 PMP 类型之间稍有不同。 实施例 12 ： 抗坏血酸温育时间对化学发光的影响
在一系列实验中研究了样品暴露于抗坏血酸的持续时间对观察到的化学发光强 度降低的影响， 这些实验使用实施例 11 中描述的 Dynal M-280PMP 颗粒和生物素 -HRP 体系。 简言之， 使生物素 - 标记的 PMP、 以及多种生物素 -HRP/HRP 溶液结合， 并且加入抗坏血酸溶 液。在从 80 至 330 秒钟的延迟周期后， 注射引发剂溶液 A 并且整合化学发光强度。生物 素 -HRP/HRP 溶液含有以 1 ∶ 200、 8 ∶ 192、 以及 32 ∶ 168 生物素 -HRP ∶ HRP 的比例的总 共 200ng/mL HRP。 进行实验通过使用不同浓度的抗坏血酸作为水中 0、 25、 50、 100 和 200μM 的样品。
这些研究的结果显示， 抗坏血酸在 80-330 秒钟范围内的温育时间未显示出会引 起对观察的化学发光的显著影响。该结果基本上相同， 与生物素 -HRP/HRP 的比率无关。 实施例 13 ： 抗坏血酸的加工对 CTNI 测定的影响通过使用具有多种磁性颗粒的 cTnI 分析物， 研究了抗坏血酸在提高呈微粒形式的 测定性能中的效果。 被评价的磁性颗粒包括 LodeStars PMP、 乳液 PMP 和羧酸酯改进的聚苯 乙烯胶乳 PMP。 “Lot B 磁性颗粒” 是 6.2μm 直径的羧基 PMP(Bangs Laboratories， Fishers， 印第安纳州 )。 “Lot D 磁性颗粒” 是 8.1μm 直径的羧基 PMP(Bangs Laboratories)。 “Lot F 乳液颗粒” 是 3.1μm 直径的羧基 PMP(Seradyn Products， Thermo-Fisher， 印第安纳波利 斯， 印第安纳州 )。 “CML PMP” 是 2.9μm 直径的羧酸酯改进的胶乳粒子 (Invitrogen 公司、 Carlsbad， 加利福尼亚州 )。LodeStars PMP 通过 EDC 偶联用 AK4 和生物素标记， 并且用实 施例 3 的一般方案链霉抗生物素蛋白涂覆。Lot B、 Lot D、 以及 Lot F 和 CML PMP 用根据实 施例 1 的 AK-BSA- 生物素标记。这些颗粒然后用链霉抗生物素蛋白涂覆， 并且结合于被生 物素标记的抗 cTnI。实验方案按照通常实施例 8 中描述的方法进行， 温育时间为 10.2 分 钟。cTnI( 即 S0-S6) 的浓度列在表 9 中。 结果
在初始的实验中， 在反应混合物中不含抗坏血酸时进行 cTnI 测定。如表 14 所示， LodeStars 颗粒具有最高的特异性信号 ； 然而， 背景信号覆盖许多低校准剂信号。 表 14. 不含抗坏血酸盐的 cTnI 分析物在加入引发剂之前， 用 150μM 抗坏血酸重复实验时， 得到了表 15 中显示的结果。 该情况下， LodeStars 颗粒保留了比另一个颗粒类型多得多的特异性信号， 甚至在背景降低 几乎 300％的时候。 表 15. 具有 150μm 抗坏血酸盐的测定颗粒。
结论
该实施例中得到的结果显示， 在测定反应混合物中包含抗坏血酸可明显提高测定 灵敏度。 实施例 14. 颗粒类型影响的研究
为了进一步研究特异性固相颗粒对在此描述的测定的影响， 进行多种颗粒类型的对比， 包括二氧化硅、 聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA) 在内。按照在实施例 3 中描述的方法用 AK 和生物素标记羧基改性的聚甲基丙烯酸甲酯颗粒 (PolyAn GmbH， 柏林 )， 接着用链霉抗生物 素蛋白涂敷。二氧化硅颗粒与 3- 氨丙基硅氧烷在 1mM 乙酸中反应， 从而提供胺反应性的基 团。胺官能团被是与反应 AK-3 和生物素 -LC- 硫代 NHS 反应， 接着用链霉抗生物素蛋白涂 敷。
使用二氧化硅和 PMMA 颗粒的信号产生。通过使用按照实施例 1 中一般描述的 HRP 模型体系， 在反应混合物中有和没有抗坏血酸的情况下， 在二氧化硅粒子和 PMMA 颗粒 上进行测定。如上所述， 该测定在改进的 DXI 仪上进行。测定条件包括 ： 合并 45μL 缓冲液 II( 有或者没有抗坏血酸 )、 25μL 的颗粒悬浮液、 以及 15μL 的样品， 并温育 30 分钟。然后 将 100μL 引发剂溶液 A 加至反应容器中， 并且记录光强度。
结果列于表 15A( 二氧化硅 ) 和表 15B(PMMA) 中， 浓度条件如表中所示。 表 16A. 在 HRP 模型体系中二氧化硅粒子的结果。表 16B. 在 HRP 模型体系中 PMMA 颗粒的结果。实施例 15. 颗粒类型影响的研究
使用二氧化硅和 PMMA 颗粒的信号产生。 通过如上所述使用 cTnI 测定， 进行 Dynal M-280、 3μm CML、 6μm CML、 PMMA、 二氧化硅和 LodeStars 颗粒的对比。携带链霉抗生物素 蛋白涂层的每种颗粒的制备按前述实施例描述的方法进行。当含有抗坏血酸时， 其浓度为 150μM。结果列于下述表 17 中。在每种受测的颗粒系统中， 150μM 抗坏血酸的存在显著地 提高了在最高校准剂水平处的 S/S0， 当被测试时， 在最低水平处同样如此。 表 17. 在 cTnI 测定系统中各种颗粒的结果。表 17( 续 ). 在 cTnI 测定系统中各种颗粒的结果。实施例 16. 抗坏血酸浓度的影响的研究
抗 坏 血 酸 对 使 用 各 种 颗 粒 的 cTnI 测 定 的 影 响。 对 于 使 用 Dynal M-280、 6μMCML、 以及 LodeStars 颗粒的测定， 研究在 150μM 至 9.4μM 范围内改变抗坏血酸浓度 对化学发光的影响。 用于 cTnI 的测定按照实施例 8 中描述的一般方法， 使用提供于表 18A-C 中的浓度。每种受测试的颗粒类型都显示， 所有浓度的抗坏血酸都通过提高信号 / 背景而 改进了分析的灵敏度。 表 18A. 在 cTnI 测定系统中 DynalM-280 颗粒的结果。表 18B. 在 cTnI 测定系统中 CML 颗粒的结果。表 18C. 在 cTnI 测定系统中 LodeStarsTM 颗粒的结果。实施例 17 ： 用于 cTnI 分析的方法对比 ： 测定线性
在此描述测定工艺的改进对于本领域的技术人员而言是可利用的， 其包括， 但不 限于 ： 包含附加的试剂用于降低背景信号、 减少测定所要求的时间、 除去不希望有的化学相 互作用等。因此， 为了进一步表征在此描述的用于分析物检测的方法， 进行一系列实验， 其 中测定组分如下所述。
PMP 是 在 100mM Tris、 0.15M NaCl、 0.1mM EDTA、 0.2 ％ 吐 温 20、 1 ％ BSA、 0.1 ％ Proclin、 pH 8.0 中浓度为 1mg/mL 的 LodeStars， 被用 AK1 和抗体 (Ab1) 偶联至 cTnI， 通过 TM 按照实施例 3 中的一般工艺制备。 根据生产厂商的方案， 使用 Lightning-Link 方法 (Novus Biologicals， Littleton， 科罗拉多州 ) 得到 HRP-Ab2 共轭物， 使用浓度为 1μg/mL 的该 HRP-Ab2 共轭物与 50μg/mL PolyMak-33( 罗氏 )、 1mg/mL MIgG( 鼠的 IgG)、 以及 0.5M NaCl 合并。提供标准的 TnI 溶液 (SCIPAC) 和正常的临床人类样品。通过 AccuTnI 测定 ( 贝克 曼考尔特公司 ) 确定校准剂的 TnI 数值。
cTnI 测定方案包括 ： 吸移 25μL 的 1mg/mL AK-Ab1 颗粒悬浮液、 45μL 的 333μM 抗坏血酸、 15μL 的 1μg/mL HRP-Ab2、 以及 15μL 样品。将混合物于 37℃下温育 5 分钟， 然 后通过注射 100μL 的引发剂溶液 A 进行引发。刚一添加引发剂启动， 就即刻在整个 250 毫秒期间测量得到的闪光。
在有代表性的具有图 2A 中描绘的结果的实验中， 通过如上所述程序分析了一系 列 cTnI 校准标准 ( 浓度范围 ： 0-25.92ng/mL)。在所述实验条件下， 在该浓度范围内观察到 2 直线性结果 (R ＝ 0.9999)。
通过稀释阳性 cTnI 样品 (2x)、 然后在 0 ∶ 10、 1 ∶ 9、 2 ∶ 8、 3 ∶ 7、 4 ∶ 6、 5 ∶ 5、 6 ∶ 4、 7 ∶ 3、 8 ∶ 2、 9 ∶ 1 和 10 ∶ 0 的稀释系列中系统地稀释该样品， 研究了样品稀释度 对反应线性的影响。在 10 ∶ 0 稀释度 ( 即， 最大的 cTnI 浓度 ) 处， 绝对 RLU 值是 418,256， 其对应于约 9.6ng/mL 的浓度。如图 2B 所示， 在这些稀释度条件下， 在所观察的 RLU 值和期 2 望的 RLU 值之间观察到较好的线性 ( 即， R ＝ 0.9948)。
通过利用具有图 11B 描述的系统稀释度示意图的 8x 稀释的阳性 cTnI 样品， 进一 步研究稀释试验方案。在这些条件下， 8x 稀释的样品给出了 RLU 值为约 76,832， 其对应的 cTnI 浓度为约 1.8ng/mL。 如图 2C 所示， 甚至在这样的稀释条件下， 也观察到合理的线性 (R2 ＝ 0.9785)。
通过产生 20 个重复的零分析物标准和随后 2x 标准偏差的计算， 来测量测定的分 析灵敏度。 设计 2x 标准偏差作为在用已知的 cTnI 浓度收集的校准曲线上的行幅 (swath)， 对于所述工序， 假定灵敏度估计值为 0.005ng/mL cTnI。 实施例 18 ： 使用 Access AccuTnI 的 cTnI 分析方法的对比
通过本发明方法进行的 cTnI 测定结果与参比方法 Access AccuTnI 系统 ( 贝克曼 考尔特公司 ) 的结果相比较。按照在前实施例中描述的方法进行本发明的方法， 不同之处 在于在反应混合物中加入抗坏血酸试剂， 为 45μL 的 500μM 抗坏血酸。
得到如下所述临床样品 ： 没有分析物 (cTnI) 存在 (25 个样品 )、 来自相同病人 (N ＝ 15) 的阳性锂肝素血浆病人样品、 阳性血清、 以及匹配的血浆和血清样品。使用标准的 cTnI 溶液， 假定 cTnI 剂量范围为 0-17.48ng/mL。
通过使用如上所述工艺 ( 重复 3 次 )、 以及 Access AccuTnI 工艺 ( 重复 2 次 )， 进 行包括 54 个血浆样品和 41 个血清样品在内的 95 个临床样品的分析。按照生产厂商的说 明书， 得到 Access AccuTnI 系统的结果。通过与 cTnI 的标准校准剂浓度相比较， 制得用于 当前工艺的分析物浓度。
用于当前工艺和 Access AccuTnI 工艺的配对结果的分布图描绘在图 3 中。在该 图中， 纵座标是用当前的工艺观察的 cTnI 浓度， 横坐标是对应的用 Access AccuTnI 工艺确 定的 cTnI 浓度。数据的 Deming 回归分析 ( 本技术领域已知 ) 提供于图 12 中， 得到 R2 ＝ 0.9169 和 R ＝ 0.958(N ＝ 95)。 实施例 19 ： 用于 DNA 分析物的异相测定
通过使用被 AK 和链霉抗生物素蛋白标记的顺磁性颗粒 (AK-PMP-SA)、 两个生物素 化捕获寡核苷酸、 一组荧光素标记的报告寡核苷酸、 以及抗荧光素 -HRP 共轭物， 进行使用 磁性粒子并且针对 2868 碱基对 pUC18 质粒 DNA 的异相测定。按照实施例 1 和 2 中的一般 描述制备 AK- 链霉抗生物素蛋白顺磁性颗粒共轭物。通过惯常的合成法制备生物素和荧 光素标记的寡核苷酸， 并且设定为与模板互补。抗体 -HRP 共轭物可商业购买 ( 罗氏 )。人 gDNA( 罗氏 ) 被用作阴性对照。 退火缓冲液含有 10mM TRIS.Cl pH 8.3、 50mMKCl、 以及 1.5mM MgCl2。 杂交缓冲液含有 6x SSC pH 7( 氯化钠 / 柠檬酸钠， 用 NaOH 调节 pH)、 0.1％ SDS、 24％甲酰胺、 0.37％乙酸、 以及 1μg/mL 生物素。 工艺
1. 生物素标记的寡核苷酸结合至颗粒。 将这两种寡核苷酸 ( 每一种 100ng/μL 溶 液都是 10μL) 和颗粒 (1μL 的 5μg/μL LodeStars 悬浮液 ) 在 150μL 的 1x PBS 缓冲液、 pH 7.4 中旋转振荡混合， 并且置于 37℃摇床保温箱 30 分钟。在磁铁上使颗粒集中在试管 的一侧， 并且弃去上清液。颗粒用含有 0.05％吐温 -20 的 1x PBS 洗涤两次， 颗粒被再悬浮 于 140μL 的退火缓冲液中， 并且以 20μL/ 试管等分入标号 1 至 6 的 6 个 1.5mL 微型离心 试管中。
2. 寡核苷酸 - 模板杂交和捕获。下述退火反应在 250μL 试管中进行。试管在 95℃下加热 5 分钟， 并且在 50℃保持。在 5 分钟后， 将 50℃、 200μL 的杂交缓冲液加至每个 试管中并混合。将退火反应转移至对应编号的含有 20μL 结合于生物素标记的寡核苷酸的 颗粒的 1.5mL 试管中。将混合物在 37℃摇床保温箱中进行杂交 1 小时。将试管置于磁铁上 1min， 并且除去杂交缓冲液。 使用磁力分离， 洗涤颗粒三次， 以便通过重悬浮在具有 0.05％吐温 -20 的 1x PBS 中除 去未结合的核酸。 表 19A试管 pUC 18 1 20pg 2 2pg 3 200fg 4 20fg 5 2fg 6 阴性对照无核酸酶的 H2O 10x 退火缓冲液 5FAM 寡核苷酸的等分混合物 (10ng/μL)(μL) (μL) (μL)9 2 59 2 59 2 59 2 59 2 511 2 5人类基因组 DNA 200ng/μL pUC18(μL)222222(μL)222220总计(μL)2020202020203. 抗荧光素 -HRP 抗体结合至杂交的荧光素寡核苷酸。将来自步骤 2 的洗涤后的 颗粒再悬浮于 1 ∶ 150,000 稀释的抗荧光素 -HRP 抗体中， 并且在室温下温和摇动温育 30 分钟。通过磁力分离除去未被结合的抗体。通过重悬浮在具有 0.05％吐温 -20 的 1x PBS 中、 保持在磁铁上 1min、 以及除去洗涤缓冲液， 洗涤颗粒三次。
4. 化学发光 SPARCL 检测。将来自步骤 3 的洗涤后的颗粒再悬浮于 100μL 的 1x PBS 中。该颗粒被等分地分入 ( 每个孔中约 48μL) 白色微孔板 (Nunc.) 的两个孔中。通 过将微孔板放置在 Luminoskan 光度计 (Labsystems) 中、 注射 100μL 的引发剂溶液 (25mM
TRIS pH8.0、 0.1％吐温 -20、 1mM EDTA、 8mM 对羟基桂皮酸、 100mM 过氧化脲 )， 测量化学发 光， 并刚一注射就即刻读数 5 秒。 表 19B实施例 20 ： 制备用 AK 化学发光标记和抗 PSA 抗体标记的二氧化硅粒子
在氩气保护下， 用 3- 氨丙基硅氧烷 (Silicycle， 魁北克市， 加拿大 ) 衍生的二氧 化硅粒子 (5.0g) 与 AK 标记化合物 AK3(2.5mg) 和 1mL 的三乙胺在 50mL 的 DMF 中搅拌下反 应过夜。将混合物过滤， 并且颗粒用 DMF 洗涤， 然后在空气干燥之前用 1 ∶ 1 的 CH2Cl2/ 甲 醇洗涤。起始颗粒含有 1.77mmol/g 的 NH2x 5g ＝ 8.85mmol 的 NH2。使用的 AK 标记化合物 是 2.5mg/659mg/mmol ＝ 3.8μmol。经由形成酰胺键而结合标记因此少于可购买的 NH2 基 团的 0.05％。将 25mg 部分的 AK 标记的颗粒加至在微型离心试管中 1.0mL 含有 2 ％三乙胺的 DMF 中， 试管摇动 10 分钟， 并且倒出溶剂。粒子用 DMF 洗涤， 并且悬浮于在 1.2mL 的 DMF 中 含 50mg 双功能连接物 DSS 的溶液中。在摇床温育 30 分钟后， 倒出溶液， 并且颗粒用 DMF 洗 涤。通过与在 1.0mL 的 pH 8.25 硼酸盐缓冲液中稀释的 25μL 的 9.0mg/ml 抗体保藏液所 得的溶液在 4℃下反应 20 个小时， 使活化的粒子结合于小鼠抗 PSA(MxPSA， 贝克曼公司 )。 实施例 21 ： 采用化学发光检测和 Et2NOH 作为 SSIA 的异相 PSA 免疫测定。 材料
实施例 19 的标记的颗粒 ( 在 1x PBS 中 3.3mg/mL 溶液 )
测定缓冲液 ： 在 1x PBS 中 0.2％ BSA、 0.2％蔗糖、 0.2％吐温 -20
在 1x PBS 中 Et2NOH 9.73mM 溶液
MxPSA-HRP 共轭物 ( 在测定缓冲液中 0.0152μg/ml)
PSA 校准剂 ： S0、 S1、 S5
引发剂溶液 A( 实施例 1)
在预先用 1x PBS 中 0.2％ BSA、 0.2％蔗糖封闭的试管中加入 30μL 的标记颗粒、 30μL 的 MxPSA-HRP 共轭物、 36μL 的测定缓冲液、 24μL 的 PSA 校准剂、 以及 20μL 的 Et2NOH 溶液。将各个试管置于具有用计算机控制的注射和数据收集的光度计中。注射引发剂溶液
A(100μL)， 并且光强度合计 5 秒， 在注射之前延迟第一个 0.5 秒。结果是重复测量的平均 值。 表 20在本说明书中的所有公开和专利申请是本领域技术人员水平的表示， 并且将其全 部内容和用于所有用途的内容引入本发明作为参考。
如上所述各种实施方式被仅作为说明而被提供， 并不用于限制本发明。本领域的 技术人员将容易地认识到， 在不违背本发明的精神和保护范围的情况下， 本发明可以做出 各种改进和变化， 无需与在此描述的实施例实施方式和应用相同。下述权利要求书中阐述 了本发明的精神和保护范围。