猪圆环病毒 II 型、 猪细小病毒和猪伪狂犬病毒的多重 PCR 检测及其专用引物 【技术领域】
本发明涉及生物技术领域， 尤其涉及一种猪圆环病毒 II 型、 猪细小病毒和猪伪狂 犬病毒的多重 PCR 检测及其专用引物。背景技术
猪圆环病毒 II(PCVII)， 猪细小病毒 (PPV) 和猪伪狂犬病毒 (PRV) 的 PCR 检测方法 是目前快速检测这三种病原的常用方法， 被广泛应用于实验室病原诊断， 与病毒分离的方 法相比较， PCR 方法诊断更快速简便， 病毒分离相对来说时间太长， 在临床上不利于快速诊 断， 所以目前病毒病的实验室诊断主要应用 PCR/RT-PCR 方法。目前有一些 PCVII， PPV， PRV 的 PCR 试剂盒已经商品化并投入临床应用。
目前猪病多病毒混合感染相当严重。商品化的 PCVII、 PPV、 PRV 的 PCR 试剂盒都是 单项 PCR， 1 个试剂盒 1 次试验仅能检测一种病毒， 对于混合感染了 PCVII、 PPV、 PRV 的同份 猪病料要确诊病原就需要 3 种试剂盒并且要做 3 次 PCR 实验， 不仅费时费力， 检测成本也较 高， 既不经济也不快捷。 发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测病毒的专用引物。
本发明提供的检测病毒的专用引物， 包括引物对 A、 引物对 B 和引物对 C，
所述引物对 A 包括引物 1 和引物 2，
所述引物对 B 包括引物 3 和引物 4，
所述引物对 C 包括引物 5 和引物 6，
所述引物 1、 所述引物 2、 所述引物 3、 所述引物 4、 所述引物 5 和所述引物 6 的核苷 酸序列分别为序列表中的序列 1、 序列 2、 序列 3、 序列 4、 序列 5 和序列 6。
所述专用引物由引物对 A、 引物对 B 和引物对 C 组成，
所述引物对 A 由引物 1 和引物 2 组成，
所述引物对 B 由引物 3 和引物 4 组成，
所述引物对 C 由引物 5 和引物 6 组成。
所述引物对 A、 所述引物对 B 和所述引物对 C 可独立包装。
所述病毒为如下 3 种病毒中的至少一种 ： 猪圆环病毒 II、 猪细小病毒 (PPV) 和猪 伪狂犬病毒。
本发明的第二个目的是提供一种制备检测病毒的 PCR 试剂。
本发明提供的 PCR 试剂， 由所述的专用引物中的引物对 A、 引物对 B、 引物对 C、 dNTP、 DNA 聚合酶和 PCR 缓冲液组成 ；
所述专用引物中所述引物对 A 的各引物在所述 PCR 试剂中的终浓度各为 2.0μM， 所述引物对 B 的各引物在所述 PCR 试剂中的终浓度 0.8μM， 所述引物对 C 的各引物在所述PCR 试剂中的终浓度 1.5μM ；
每种所述 dNTP 在所述 PCR 试剂中的终浓度均为 0.2mM ；
所述 DNA 聚合酶在所述 PCR 试剂中的终浓度均为 0.05U/μL。
所述 dNTP、 DNA 聚合酶和 PCR 缓冲液购自天根生化科技有限公司， 产品目录号为 ET101。
所述病毒为如下 3 种病毒中的至少一种 ： 猪圆环病毒 II、 猪细小病毒 (PPV) 和猪 伪狂犬病毒。
本发明的第三个目的是提供一种制备检测病毒的试剂盒。
本发明提供的试剂盒为含有所述的 PCR 试剂的试剂盒。
所述病毒为如下 3 种病毒中的至少一种 ： 猪圆环病毒 II、 猪细小病毒 (PPV) 和猪 伪狂犬病毒。
所述专用引物或所述试剂或所述试剂盒在检测病毒或制备检测检测病毒产品中 的应用 ； 所述病毒具体为如下 3 种病毒中的至少一种 ： 猪圆环病毒 II、 猪细小病毒和猪伪狂 犬病毒。
本发明的第四个目的是提供一种检测或辅助检测待测样本病毒的方法。
本发明提供的方法， 包括如下步骤 ：
用所述引物或所述试剂或所述试剂盒中的所述引物对 A、 引物对 B 和引物对 C 对待 测样本进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物 ； 检测扩增产物，
若仅得到大小为 1265bp 的 PCR 产物， 则样本中含有或候选含有猪圆环病毒 II ；
若仅得到大小为 748bp 的 PCR 产物， 则样本中含有或候选含有猪细小病毒 ；
若仅得到大小为 342bp 的 PCR 产物， 则样本中含有或候选含有猪伪狂犬病毒 ；
若得到大小为 1265bp 的 PCR 产物和大小为 748bp 的 PCR 产物， 则样本中含有或候 选含有猪圆环病毒 II 和猪细小病毒 ；
若得到大小为 1265bp 的 PCR 产物和大小为 342bp 的 PCR 产物， 则样本中含有或候 选含有猪圆环病毒 II 和猪伪狂犬病毒 ；
若得到大小为 748bp 的 PCR 产物和大小为 342bp 的 PCR 产物， 则样本中含有或候 选含有猪细小病毒和猪伪狂犬病毒 ；
若得到大小为 1265bp 的 PCR 产物、 大小为 748bp 的 PCR 产物和大小为 342bp 的 PCR 产物， 则样本中含有或候选含有猪圆环病毒 II、 猪细小病毒和猪伪狂犬病毒。
所述 1265bp 的 PCR 产物的核苷酸序列为序列表中的序列 7 ；
所述 748bp 的 PCR 产物的核苷酸序列为序列表中的序列 8 ；
所述 342bp 的 PCR 产物的核苷酸序列为序列表中的序列 9 ；
所述 PCR 扩增中， 以待测样本的基因组 DNA 为模板 ；
所述 PCR 扩增的退火温度为 55℃ -60℃， 所述 PCR 扩增的退火温度具体为 58℃ ；
所述检测扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。
本发明的第五个目的是提供一种检测圆环病毒 II 的引物对。
本发明提供的引物对， 由引物 1 和引物 2 组成， 所述引物 1 和所述引物 2 的核苷酸 序列分别为序列表中的序列 1 和序列 2。
或提供一种检测猪伪狂犬病毒的引物对。本发明提供的引物对， 由引物 5 和引物 6 组成， 所述引物 5 和所述引物 6 的核苷酸 序列分别为序列表中的序列 5 和序列 6。
本发明的实验证明， 本发明提供的猪圆环病毒 II， 猪细小病毒和猪伪狂犬病毒的 多重 PCR 检测方法， 一次反应能同时检测出 PCVII、 PPV、 PRV 三种病毒， 所用 3 对引物特异性 较好， 引物相互之间有较低的同源性及互补性 ； 所述引物敏感性较好最低能检测到 DNA 含 量为 1.0ng/ul ； 所述的多重 PCR 方法简便、 快速、 经济、 高效， 并且经过与商品试剂盒比对， 简便、 快速、 经济、 高效， 可以大大节约检测时间， 及时对猪的三种常见病做出诊断， 而且还 大大节约了检测成本， 特别适用于临床的大量检测， 在临床诊断上具有很好的应用前景。 附图说明
图 1 为 PCVII、 PPV、 PRV 多重 PCR 以及单项 PCR 电泳图结果
图 2 为 PCVII、 PPV、 PRV 多重 PCR 特异性电泳图结果
图 3 为 PCVII、 PPV、 PRV 多重 PCR 敏感性电泳图结果 具体实施方式 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。
实施例 1、 圆环病毒 II(PCVII)、 猪细小病毒 (PPV) 和猪伪狂犬病毒 (PRV) 的多重 PCR 检测方法构建
1、 引物设计
在 GenBank 中 查 出 PCVII(Genbank 号 EF524528)、 PPV(Genbank 号 AY502114)、 PRV(Genbank 号 AF257079) 的部分已知序列。对病毒各基因区进行同源性分析， 分别选取 PCVII 的全基因， PPV 的 NS1 基因， PRV 的 gB 基因中的一段基因为各病毒扩增的靶序列。利 用 DNAMAN 对上述保守区进行引物设计， 对设计出来的 3 种病毒引物利用 DNAstar 进行引 物二聚体分析， 以避免引物之间形成稳定的引物二聚体。选出扩增序列为 PCVII(1265bp)、 PPV(748bp)、 PRV(342bp) 的如下 3 对引物， 并对每对引物扩增序列的同源性或互补性进行 分析。避免它们之间有较高的同源性或互补性， 从而确定 3 种病毒的多重 PCR 引物如下 ：
引物对 A ： 引物 1 ： 5’ agaatccaagaagcggaccc 3’ ( 序列 1) ；
引物 2 ： 5’ tcacctatgacccctatgt 3’ ( 序列 2) ；
引物对 B ： 引物 3 ： 5’ caggcaacagacttggaatg 3’ ( 序列 3) ；
引物 4 ： 5’ ctcctccgctttgagccatc 3’ ( 序列 4) ；
引物对 C ： 引物 5 ： 5’ cggaggggttcgccgtgctcttca 3’ ( 序列 5)
引物 6 ： 5’ tcttggtgtaggtgtcgttggt 3’ ( 序列 6)
2、 PCR 反应条件优化
分别提取猪圆环病毒 II(PCVII)、 猪细小病毒 (PPV) 和猪伪狂犬病毒 (PRV) 的基因 组 DNA。
猪圆环病毒 II(PCVII， Porcine circovirus type 2) 记载在 SYBR Green I 荧光 定量 PCR 检测猪圆环病毒 2 型方法的建立， 李俊， 丁鹏， 时建立， 徐绍建， 孙文博， 吴家强， 王 金宝， ≤中国兽医杂志≥， 2010 年 12 期， 山东省农业科学院， 公众可从山东省动物疫病预防
与控制中心获得 ；
猪伪狂犬病毒 (PRV， Pseudorabies virus) 记载在 1 例猪伪狂犬病毒分离和鉴定， 韩勇， 李文刚， 项朝荣， 高卫科， 王鑫， 魏娟， 《中国动物检疫》 ， 2007 年， 第 4 期， 公众可从山东 省动物疫病预防与控制中心获得 ；
猪细小病毒 (PPV， Porcine parvovirus) 记载在猪细小病毒的分离鉴定， 李刚明， 姜天童， 方雨玲， 中国兽医科技 1994 年第 24 卷第 10 期， 公众可从山东省动物疫病预防与控 制中心获得 ；
分 别 以 PCVII 基 因 组 DNA、 PPV 基 因 组 DNA、 PRV 基 因 组 DNA 和 PCVII+PPV+PRV 混 合 基 因 组 DNA( 体 积 比 为 1 ∶ 1 ∶ 1) 为 模 板， 均 以 引 物 对 A、 引物对 B 和引物对 C 混 合 作 为 引 物， 按 照 如 下 体 系 和 程 序 进 行 PCR 扩 增 ： PCR 扩 增 体 系 25μL ： 10×PCR 2+ Buffer(Mg Plus)2.5μL( 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司， 产 品 目 录 号 为 ET101)， 上下游混 合引物： 引 物 对 分 别 为 引 物 对 A( 各 25μM)2μL( 终 浓 度 各 为 2μM)、 引 物 对 B( 各 25μM)0.8μL( 终浓度各为 0.8μM)、 引物对 C( 各 25μM)1.2μL( 终浓度各为 1.2μM)， DNA 模板 2μL， dNTPs( 各 2.5mM)2μL( 终浓度 0.2mM)， Taq 酶 (5U/μL)0.25μL 或 (2.5U/ μL)0.5μL( 终浓度 0.05U/μL)， 最后用水补充至 25μL。 优化后的程序为 ： 94℃预变性 3min ； 94℃变性 30s， 58℃退火 30s， 72℃延伸 30s， 30 个循环 ； 72℃延伸 10min， 4℃保存。
结果如图 1 所示， 其中 1 为 PCVII+PPV+PRV 基因组 DNA， 2 为 PCVII 基因组 DNA， 3 为 PPV 基因组 DNA， 4 为 PRV 基因组 DNA， 可以看出， 1 得到 1265bp、 748bp 和 342bp 产物， 2得 到 1265bp， 3 得到 748bp， 4 得到 342bp。
分别将上述 PCR 产物送去测序， 结果为 ：
1265bp 的 PCR 产物的核苷酸序列为序列表中的序列 7(PCVII 的 6enbank 号的 EF524528 的第 63-1327 位核苷酸 ) ；
748bp 的 PCR 产 物 的 核 苷 酸 序 列 为 序 列 表 中 的 序 列 8(PPV 的 6enbank 号 的 AY502114 的第 207-954 位核苷酸 ) ；
342bp 的 PCR 产物的核苷酸序列为序列表中的序列 9(PRV 的 6enbank 号 AF257079 的第 468-809 位核苷酸 )。
因此扩增产物通过测序， 其序列与 6enBank 中查出 PCVII、 PPV、 PRV 的已知序列比 较， 证实是目的基因。
3、 特异性检测
分别检测上述涉及的 PCR 反应的引物对 A、 B、 C 的特异性， 方法如下 ：
1) 引物对 A 特异性
分别提取 PRRSV( 猪繁殖与呼吸综合征病毒 )、 CSFV( 猪瘟病毒 )、 BVDV( 牛病毒性 腹泻病毒 ) 的 RNA， 分别反转录得到 PRRSV 的 cDNA、 CSFV 的 cDNA、 BVDV 的 cDNA ；
猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 病 毒 (PRRSV， Porcine reproductive and respiratory syndrome virus) 记载在高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学 分析， 童光志， 周艳君， 郝晓芳， 田志军， 仇华吉， 彭金美， 安同庆， 中国预防兽医学报， 2007 年 05， 公众可从山东省动物疫病预防与控制中心获得 ；
猪瘟病毒 (CSFV， Classic swine fever virus) 记载在猪瘟病毒 6SLZ 株的分离与
鉴定， 何小兵， 贾怀杰， 陈国华， 房永祥， 李玩生， 曾爽， 景志忠， 《中国兽医科学》 ， 2011 年， 第2 期， 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共 卫生重点开放实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室， 公众可从山东省动物疫病预防与控 制中心获得 ；
牛病毒性腹泻病毒 (BVDV， Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus) 记 载在牛病毒性腹泻病毒 BVDV-JL 株的分离与鉴定， 张淑琴， 郭利， 冷雪， 张亭亭， 吴永旺， 武 华， 《中国预防兽医学报》 ， 2011 年 03 期， 公众可从山东省动物疫病预防与控制中心获得 ；
分别以 PRRSV 的 cDNA、 CSFV 的 cDNA、 BVDV 的 cDNA、 PCVII 基因组 DNA、 PPV 基因组 DNA、 PRV 基因组 DNA 为模板， 以引物对 A 为引物， 按照上述步骤 2 中的 PCR 体系和程序进行 扩增， 结果如图 2 的 1-6 所示， 其中 1 为 PCVII， 2 为 PRRSV， 3 为 CSFV， 4 为 BVDV， 5 为 PPV， 6 为 PRV， 可以看出， 只有 PCVII 有 1265bp 目的条带， 未见其他非特异性带， 说明引物对 A 特异 性高。
分别以 PRRSV 的 cDNA、 CSFV 的 cDNA、 BVDV 的 cDNA、 PCVII 基因组 DNA、 PPV 基因组 DNA、 PRV 基因组 DNA 为模板， 以引物对 B 为引物， 按照上述步骤 2 中的 PCR 体系和程序进行 扩增， 结果如图 2 的 7-12 所示， 其中 7 为 PPV， 8 为 PRRSV， 9 为 CSFV， 10 为 BVDV， 11 为 PCVII， 12 为 PRV， 可以看出， 只有 PPV 有 748bp 目的条带， 未见其他非特异性带， 说明引物对 B 特异 性高。 分别以 PRRSV 的 cDNA、 CSFV 的 cDNA、 BVDV 的 cDNA、 PCVII 基因组 DNA、 PPV 基因组 DNA、 PRV 基因组 DNA 为模板， 以引物对 C 为引物， 按照上述步骤 2 中的 PCR 体系和程序进行 扩增， 结果如图 2 的 13-18 所示， 其中 13 为 PRV， 14 为 PRRSV， 15 为 CSFV， 16 为 BVDV， 17 为 PCVII， 18 为 PPV， 可以看出， 只有 PRV 有 342bp 目的条带， 未见其他非特异性带， 说明引物对 C 特异性高。
4、 敏感性检测
通过分光光度计测 OD 测得由步骤 2 得到的 PCVII 基因 DNA 的浓度为 15000μg/ μl， 由步骤 2 得到的 PPV 基因 DNA 的浓度为 15000μg/μl， 由步骤 2 得到的 PRV 基因 DNA 的浓度为 10000μg/μl。
分别将 PCVII 基因 DNA、 PPV 基因 DNA 和 PRV 基因 DNA 进行 10 倍系列稀释后分别 作为模板， 以引物对 A、 B、 C 为引物， 按照步骤 2 的体系和程序进行扩增。
结果见图 3 的 B 所示， 1-7 分别为 PCVII 基因 DNA 的 101-107 倍稀释的模板 ； 8-14 1 7 1 7 分别为 PPV 基因 DNA 的 10 -10 倍稀释的模板 ； 15-21 分别为 PRV 基因 DNA 的 10 -10 倍稀 4 释的模板 ； 可以看出， 无论哪种模板， 10 倍稀释的模板有比较清晰地目的条带， 105 倍稀释 的模板有比较弱的目的条带， 稀释 106 倍及以上的模板已完全看不到目的条带。
将由步骤 2 得到的 PCVII 基因 DNA、 PPV 基因 DNA 和 PRV 基因 DNA 混合 ( 体积比为 1 ∶ 1 ∶ 1)， 将混合后 DNA 进行 10 倍系列稀释后分别作为模板， 以引物对 A、 B、 C 为引物， 按 照步骤 2 的体系和程序进行扩增。
结果见图 3 的 A 所示， 其中 1-9 分别为混合后的 DNA 的 101-109 倍稀释的模板， 可 4 5 以看出， 10 倍稀释的模板有比较清晰地目的条带， 10 倍稀释的模板有比较弱的目的条带， 6 稀释 10 倍及以上的模板已完全看不到目的条带。
实验证明本发明的多重 PCR 可以检测到 PCVII 基因 DNA 的最小浓度为 1.5ng/μl，
PPV 基因 DNA 的最小浓度为 1.5ng/μl， PRV 基因 DNA 的最小浓度为 1.0ng/μl。而多重 PCV 的敏感性与单项 PCR 的敏感性无明显差别。
5、 重复性
对 PCVII、 PPV、 PRV 多重 PCR 方法进行多次重复试验实验结果稳定。
6、 样本检测
对 106 份临床疑似病料 ( 山东省动物疫病预防与控制中心附设兽医院门诊送检的 病死猪肝、 肾、 肺组织混合样品 ( 质量比约为 1 ∶ 1 ∶ 1) 进行检测， 具体如下 ：
提取 106 份临床疑似病料的基因组 DNA( 编号为 1-106)， 用引物对 A、 B 和 C 作为 引物， 按照步骤 2 的体系和程序进行 PCR 扩增，
得到 1265bp 的 PCR 产物 ( 序列表中的序列 7) 为 PCVII 阳性 ；
得到 748bp 的 PCR 产物 ( 序列表中的序列 8) 为 PPV 阳性 ；
得到 342bp 的 PCR 产物 ( 序列表中的序列 9) 为 PRV 阳性。
得到 1265bp 和 748bp 的为 PCVII 和 PPV 阳性 ；
得到 1265bp 和 342bp 的为 PCVII 和 PRV 阳性 ；
得到 748bp 和 342bp 的为 PPV 和 PRV 阳性 ；
得到 1265bp、 748bp 和 342bp 的为 PCVII、 PPV 和 PRV 阳性 ；
均没有 1265bp、 748bp 或 342bp 的为 PCVII、 PPV 和 PRV 阴性 ；
结果如下 ：
编号为 1-47 的得到 1265bp 的 PCR 产物 ( 序列表中的序列 7) 为 PCVII 阳性 ( 共 47 份 ) ；
编号为 48-69 的得到 748bp 的 PCR 产物 ( 序列表中的序列 8) 为 PPV 阳性 ( 共 21 份)；
编号为 70-80 的得到 342bp 的 PCR 产物 ( 序列表中的序列 9) 为 PRV 阳性 ( 共 10 份)；
编号为 81-82 的得到 1265bp 和 748bp 的为 PCVII 和 PPV 阳性 ( 共 2 份 ) ；
编号为 83-87 的得到 1265bp 和 342bp 的为 PCVII 和 PRV 阳性 ( 共 42 份 ) ；
编号为 88-106 的均没有 1265bp、 748bp 或 342bp 的扩增， 说明没有感染 PCVII、 PPV 和 PRV 中的任一种。
本发明涉及生物技术领域， 尤其涉及一种猪圆环病毒 II 型、 猪细小病毒和猪伪狂 犬病毒的多重 PCR 检测及其专用引物。背景技术
猪圆环病毒 II(PCVII)， 猪细小病毒 (PPV) 和猪伪狂犬病毒 (PRV) 的 PCR 检测方法 是目前快速检测这三种病原的常用方法， 被广泛应用于实验室病原诊断， 与病毒分离的方 法相比较， PCR 方法诊断更快速简便， 病毒分离相对来说时间太长， 在临床上不利于快速诊 断， 所以目前病毒病的实验室诊断主要应用 PCR/RT-PCR 方法。目前有一些 PCVII， PPV， PRV 的 PCR 试剂盒已经商品化并投入临床应用。
目前猪病多病毒混合感染相当严重。商品化的 PCVII、 PPV、 PRV 的 PCR 试剂盒都是 单项 PCR， 1 个试剂盒 1 次试验仅能检测一种病毒， 对于混合感染了 PCVII、 PPV、 PRV 的同份 猪病料要确诊病原就需要 3 种试剂盒并且要做 3 次 PCR 实验， 不仅费时费力， 检测成本也较 高， 既不经济也不快捷。 发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测病毒的专用引物。
本发明提供的检测病毒的专用引物， 包括引物对 A、 引物对 B 和引物对 C，
所述引物对 A 包括引物 1 和引物 2，
所述引物对 B 包括引物 3 和引物 4，
所述引物对 C 包括引物 5 和引物 6，
所述引物 1、 所述引物 2、 所述引物 3、 所述引物 4、 所述引物 5 和所述引物 6 的核苷 酸序列分别为序列表中的序列 1、 序列 2、 序列 3、 序列 4、 序列 5 和序列 6。
所述专用引物由引物对 A、 引物对 B 和引物对 C 组成，
所述引物对 A 由引物 1 和引物 2 组成，
所述引物对 B 由引物 3 和引物 4 组成，
所述引物对 C 由引物 5 和引物 6 组成。
所述引物对 A、 所述引物对 B 和所述引物对 C 可独立包装。
所述病毒为如下 3 种病毒中的至少一种 ： 猪圆环病毒 II、 猪细小病毒 (PPV) 和猪 伪狂犬病毒。
本发明的第二个目的是提供一种制备检测病毒的 PCR 试剂。
本发明提供的 PCR 试剂， 由所述的专用引物中的引物对 A、 引物对 B、 引物对 C、 dNTP、 DNA 聚合酶和 PCR 缓冲液组成 ；
所述专用引物中所述引物对 A 的各引物在所述 PCR 试剂中的终浓度各为 2.0μM， 所述引物对 B 的各引物在所述 PCR 试剂中的终浓度 0.8μM， 所述引物对 C 的各引物在所述PCR 试剂中的终浓度 1.5μM ；
每种所述 dNTP 在所述 PCR 试剂中的终浓度均为 0.2mM ；
所述 DNA 聚合酶在所述 PCR 试剂中的终浓度均为 0.05U/μL。
所述 dNTP、 DNA 聚合酶和 PCR 缓冲液购自天根生化科技有限公司， 产品目录号为 ET101。
所述病毒为如下 3 种病毒中的至少一种 ： 猪圆环病毒 II、 猪细小病毒 (PPV) 和猪 伪狂犬病毒。
本发明的第三个目的是提供一种制备检测病毒的试剂盒。
本发明提供的试剂盒为含有所述的 PCR 试剂的试剂盒。
所述病毒为如下 3 种病毒中的至少一种 ： 猪圆环病毒 II、 猪细小病毒 (PPV) 和猪 伪狂犬病毒。
所述专用引物或所述试剂或所述试剂盒在检测病毒或制备检测检测病毒产品中 的应用 ； 所述病毒具体为如下 3 种病毒中的至少一种 ： 猪圆环病毒 II、 猪细小病毒和猪伪狂 犬病毒。
本发明的第四个目的是提供一种检测或辅助检测待测样本病毒的方法。
本发明提供的方法， 包括如下步骤 ：
用所述引物或所述试剂或所述试剂盒中的所述引物对 A、 引物对 B 和引物对 C 对待 测样本进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物 ； 检测扩增产物，
若仅得到大小为 1265bp 的 PCR 产物， 则样本中含有或候选含有猪圆环病毒 II ；
若仅得到大小为 748bp 的 PCR 产物， 则样本中含有或候选含有猪细小病毒 ；
若仅得到大小为 342bp 的 PCR 产物， 则样本中含有或候选含有猪伪狂犬病毒 ；
若得到大小为 1265bp 的 PCR 产物和大小为 748bp 的 PCR 产物， 则样本中含有或候 选含有猪圆环病毒 II 和猪细小病毒 ；
若得到大小为 1265bp 的 PCR 产物和大小为 342bp 的 PCR 产物， 则样本中含有或候 选含有猪圆环病毒 II 和猪伪狂犬病毒 ；
若得到大小为 748bp 的 PCR 产物和大小为 342bp 的 PCR 产物， 则样本中含有或候 选含有猪细小病毒和猪伪狂犬病毒 ；
若得到大小为 1265bp 的 PCR 产物、 大小为 748bp 的 PCR 产物和大小为 342bp 的 PCR 产物， 则样本中含有或候选含有猪圆环病毒 II、 猪细小病毒和猪伪狂犬病毒。
所述 1265bp 的 PCR 产物的核苷酸序列为序列表中的序列 7 ；
所述 748bp 的 PCR 产物的核苷酸序列为序列表中的序列 8 ；
所述 342bp 的 PCR 产物的核苷酸序列为序列表中的序列 9 ；
所述 PCR 扩增中， 以待测样本的基因组 DNA 为模板 ；
所述 PCR 扩增的退火温度为 55℃ -60℃， 所述 PCR 扩增的退火温度具体为 58℃ ；
所述检测扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。
本发明的第五个目的是提供一种检测圆环病毒 II 的引物对。
本发明提供的引物对， 由引物 1 和引物 2 组成， 所述引物 1 和所述引物 2 的核苷酸 序列分别为序列表中的序列 1 和序列 2。
或提供一种检测猪伪狂犬病毒的引物对。本发明提供的引物对， 由引物 5 和引物 6 组成， 所述引物 5 和所述引物 6 的核苷酸 序列分别为序列表中的序列 5 和序列 6。
本发明的实验证明， 本发明提供的猪圆环病毒 II， 猪细小病毒和猪伪狂犬病毒的 多重 PCR 检测方法， 一次反应能同时检测出 PCVII、 PPV、 PRV 三种病毒， 所用 3 对引物特异性 较好， 引物相互之间有较低的同源性及互补性 ； 所述引物敏感性较好最低能检测到 DNA 含 量为 1.0ng/ul ； 所述的多重 PCR 方法简便、 快速、 经济、 高效， 并且经过与商品试剂盒比对， 简便、 快速、 经济、 高效， 可以大大节约检测时间， 及时对猪的三种常见病做出诊断， 而且还 大大节约了检测成本， 特别适用于临床的大量检测， 在临床诊断上具有很好的应用前景。 附图说明
图 1 为 PCVII、 PPV、 PRV 多重 PCR 以及单项 PCR 电泳图结果
图 2 为 PCVII、 PPV、 PRV 多重 PCR 特异性电泳图结果
图 3 为 PCVII、 PPV、 PRV 多重 PCR 敏感性电泳图结果 具体实施方式 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。
实施例 1、 圆环病毒 II(PCVII)、 猪细小病毒 (PPV) 和猪伪狂犬病毒 (PRV) 的多重 PCR 检测方法构建
1、 引物设计
在 GenBank 中 查 出 PCVII(Genbank 号 EF524528)、 PPV(Genbank 号 AY502114)、 PRV(Genbank 号 AF257079) 的部分已知序列。对病毒各基因区进行同源性分析， 分别选取 PCVII 的全基因， PPV 的 NS1 基因， PRV 的 gB 基因中的一段基因为各病毒扩增的靶序列。利 用 DNAMAN 对上述保守区进行引物设计， 对设计出来的 3 种病毒引物利用 DNAstar 进行引 物二聚体分析， 以避免引物之间形成稳定的引物二聚体。选出扩增序列为 PCVII(1265bp)、 PPV(748bp)、 PRV(342bp) 的如下 3 对引物， 并对每对引物扩增序列的同源性或互补性进行 分析。避免它们之间有较高的同源性或互补性， 从而确定 3 种病毒的多重 PCR 引物如下 ：
引物对 A ： 引物 1 ： 5’ agaatccaagaagcggaccc 3’ ( 序列 1) ；
引物 2 ： 5’ tcacctatgacccctatgt 3’ ( 序列 2) ；
引物对 B ： 引物 3 ： 5’ caggcaacagacttggaatg 3’ ( 序列 3) ；
引物 4 ： 5’ ctcctccgctttgagccatc 3’ ( 序列 4) ；
引物对 C ： 引物 5 ： 5’ cggaggggttcgccgtgctcttca 3’ ( 序列 5)
引物 6 ： 5’ tcttggtgtaggtgtcgttggt 3’ ( 序列 6)
2、 PCR 反应条件优化
分别提取猪圆环病毒 II(PCVII)、 猪细小病毒 (PPV) 和猪伪狂犬病毒 (PRV) 的基因 组 DNA。
猪圆环病毒 II(PCVII， Porcine circovirus type 2) 记载在 SYBR Green I 荧光 定量 PCR 检测猪圆环病毒 2 型方法的建立， 李俊， 丁鹏， 时建立， 徐绍建， 孙文博， 吴家强， 王 金宝， ≤中国兽医杂志≥， 2010 年 12 期， 山东省农业科学院， 公众可从山东省动物疫病预防
与控制中心获得 ；
猪伪狂犬病毒 (PRV， Pseudorabies virus) 记载在 1 例猪伪狂犬病毒分离和鉴定， 韩勇， 李文刚， 项朝荣， 高卫科， 王鑫， 魏娟， 《中国动物检疫》 ， 2007 年， 第 4 期， 公众可从山东 省动物疫病预防与控制中心获得 ；
猪细小病毒 (PPV， Porcine parvovirus) 记载在猪细小病毒的分离鉴定， 李刚明， 姜天童， 方雨玲， 中国兽医科技 1994 年第 24 卷第 10 期， 公众可从山东省动物疫病预防与控 制中心获得 ；
分 别 以 PCVII 基 因 组 DNA、 PPV 基 因 组 DNA、 PRV 基 因 组 DNA 和 PCVII+PPV+PRV 混 合 基 因 组 DNA( 体 积 比 为 1 ∶ 1 ∶ 1) 为 模 板， 均 以 引 物 对 A、 引物对 B 和引物对 C 混 合 作 为 引 物， 按 照 如 下 体 系 和 程 序 进 行 PCR 扩 增 ： PCR 扩 增 体 系 25μL ： 10×PCR 2+ Buffer(Mg Plus)2.5μL( 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司， 产 品 目 录 号 为 ET101)， 上下游混 合引物： 引 物 对 分 别 为 引 物 对 A( 各 25μM)2μL( 终 浓 度 各 为 2μM)、 引 物 对 B( 各 25μM)0.8μL( 终浓度各为 0.8μM)、 引物对 C( 各 25μM)1.2μL( 终浓度各为 1.2μM)， DNA 模板 2μL， dNTPs( 各 2.5mM)2μL( 终浓度 0.2mM)， Taq 酶 (5U/μL)0.25μL 或 (2.5U/ μL)0.5μL( 终浓度 0.05U/μL)， 最后用水补充至 25μL。 优化后的程序为 ： 94℃预变性 3min ； 94℃变性 30s， 58℃退火 30s， 72℃延伸 30s， 30 个循环 ； 72℃延伸 10min， 4℃保存。
结果如图 1 所示， 其中 1 为 PCVII+PPV+PRV 基因组 DNA， 2 为 PCVII 基因组 DNA， 3 为 PPV 基因组 DNA， 4 为 PRV 基因组 DNA， 可以看出， 1 得到 1265bp、 748bp 和 342bp 产物， 2得 到 1265bp， 3 得到 748bp， 4 得到 342bp。
分别将上述 PCR 产物送去测序， 结果为 ：
1265bp 的 PCR 产物的核苷酸序列为序列表中的序列 7(PCVII 的 6enbank 号的 EF524528 的第 63-1327 位核苷酸 ) ；
748bp 的 PCR 产 物 的 核 苷 酸 序 列 为 序 列 表 中 的 序 列 8(PPV 的 6enbank 号 的 AY502114 的第 207-954 位核苷酸 ) ；
342bp 的 PCR 产物的核苷酸序列为序列表中的序列 9(PRV 的 6enbank 号 AF257079 的第 468-809 位核苷酸 )。
因此扩增产物通过测序， 其序列与 6enBank 中查出 PCVII、 PPV、 PRV 的已知序列比 较， 证实是目的基因。
3、 特异性检测
分别检测上述涉及的 PCR 反应的引物对 A、 B、 C 的特异性， 方法如下 ：
1) 引物对 A 特异性
分别提取 PRRSV( 猪繁殖与呼吸综合征病毒 )、 CSFV( 猪瘟病毒 )、 BVDV( 牛病毒性 腹泻病毒 ) 的 RNA， 分别反转录得到 PRRSV 的 cDNA、 CSFV 的 cDNA、 BVDV 的 cDNA ；
猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 病 毒 (PRRSV， Porcine reproductive and respiratory syndrome virus) 记载在高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学 分析， 童光志， 周艳君， 郝晓芳， 田志军， 仇华吉， 彭金美， 安同庆， 中国预防兽医学报， 2007 年 05， 公众可从山东省动物疫病预防与控制中心获得 ；
猪瘟病毒 (CSFV， Classic swine fever virus) 记载在猪瘟病毒 6SLZ 株的分离与
鉴定， 何小兵， 贾怀杰， 陈国华， 房永祥， 李玩生， 曾爽， 景志忠， 《中国兽医科学》 ， 2011 年， 第2 期， 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共 卫生重点开放实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室， 公众可从山东省动物疫病预防与控 制中心获得 ；
牛病毒性腹泻病毒 (BVDV， Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus) 记 载在牛病毒性腹泻病毒 BVDV-JL 株的分离与鉴定， 张淑琴， 郭利， 冷雪， 张亭亭， 吴永旺， 武 华， 《中国预防兽医学报》 ， 2011 年 03 期， 公众可从山东省动物疫病预防与控制中心获得 ；
分别以 PRRSV 的 cDNA、 CSFV 的 cDNA、 BVDV 的 cDNA、 PCVII 基因组 DNA、 PPV 基因组 DNA、 PRV 基因组 DNA 为模板， 以引物对 A 为引物， 按照上述步骤 2 中的 PCR 体系和程序进行 扩增， 结果如图 2 的 1-6 所示， 其中 1 为 PCVII， 2 为 PRRSV， 3 为 CSFV， 4 为 BVDV， 5 为 PPV， 6 为 PRV， 可以看出， 只有 PCVII 有 1265bp 目的条带， 未见其他非特异性带， 说明引物对 A 特异 性高。
分别以 PRRSV 的 cDNA、 CSFV 的 cDNA、 BVDV 的 cDNA、 PCVII 基因组 DNA、 PPV 基因组 DNA、 PRV 基因组 DNA 为模板， 以引物对 B 为引物， 按照上述步骤 2 中的 PCR 体系和程序进行 扩增， 结果如图 2 的 7-12 所示， 其中 7 为 PPV， 8 为 PRRSV， 9 为 CSFV， 10 为 BVDV， 11 为 PCVII， 12 为 PRV， 可以看出， 只有 PPV 有 748bp 目的条带， 未见其他非特异性带， 说明引物对 B 特异 性高。 分别以 PRRSV 的 cDNA、 CSFV 的 cDNA、 BVDV 的 cDNA、 PCVII 基因组 DNA、 PPV 基因组 DNA、 PRV 基因组 DNA 为模板， 以引物对 C 为引物， 按照上述步骤 2 中的 PCR 体系和程序进行 扩增， 结果如图 2 的 13-18 所示， 其中 13 为 PRV， 14 为 PRRSV， 15 为 CSFV， 16 为 BVDV， 17 为 PCVII， 18 为 PPV， 可以看出， 只有 PRV 有 342bp 目的条带， 未见其他非特异性带， 说明引物对 C 特异性高。
4、 敏感性检测
通过分光光度计测 OD 测得由步骤 2 得到的 PCVII 基因 DNA 的浓度为 15000μg/ μl， 由步骤 2 得到的 PPV 基因 DNA 的浓度为 15000μg/μl， 由步骤 2 得到的 PRV 基因 DNA 的浓度为 10000μg/μl。
分别将 PCVII 基因 DNA、 PPV 基因 DNA 和 PRV 基因 DNA 进行 10 倍系列稀释后分别 作为模板， 以引物对 A、 B、 C 为引物， 按照步骤 2 的体系和程序进行扩增。
结果见图 3 的 B 所示， 1-7 分别为 PCVII 基因 DNA 的 101-107 倍稀释的模板 ； 8-14 1 7 1 7 分别为 PPV 基因 DNA 的 10 -10 倍稀释的模板 ； 15-21 分别为 PRV 基因 DNA 的 10 -10 倍稀 4 释的模板 ； 可以看出， 无论哪种模板， 10 倍稀释的模板有比较清晰地目的条带， 105 倍稀释 的模板有比较弱的目的条带， 稀释 106 倍及以上的模板已完全看不到目的条带。
将由步骤 2 得到的 PCVII 基因 DNA、 PPV 基因 DNA 和 PRV 基因 DNA 混合 ( 体积比为 1 ∶ 1 ∶ 1)， 将混合后 DNA 进行 10 倍系列稀释后分别作为模板， 以引物对 A、 B、 C 为引物， 按 照步骤 2 的体系和程序进行扩增。
结果见图 3 的 A 所示， 其中 1-9 分别为混合后的 DNA 的 101-109 倍稀释的模板， 可 4 5 以看出， 10 倍稀释的模板有比较清晰地目的条带， 10 倍稀释的模板有比较弱的目的条带， 6 稀释 10 倍及以上的模板已完全看不到目的条带。
实验证明本发明的多重 PCR 可以检测到 PCVII 基因 DNA 的最小浓度为 1.5ng/μl，
PPV 基因 DNA 的最小浓度为 1.5ng/μl， PRV 基因 DNA 的最小浓度为 1.0ng/μl。而多重 PCV 的敏感性与单项 PCR 的敏感性无明显差别。
5、 重复性
对 PCVII、 PPV、 PRV 多重 PCR 方法进行多次重复试验实验结果稳定。
6、 样本检测
对 106 份临床疑似病料 ( 山东省动物疫病预防与控制中心附设兽医院门诊送检的 病死猪肝、 肾、 肺组织混合样品 ( 质量比约为 1 ∶ 1 ∶ 1) 进行检测， 具体如下 ：
提取 106 份临床疑似病料的基因组 DNA( 编号为 1-106)， 用引物对 A、 B 和 C 作为 引物， 按照步骤 2 的体系和程序进行 PCR 扩增，
得到 1265bp 的 PCR 产物 ( 序列表中的序列 7) 为 PCVII 阳性 ；
得到 748bp 的 PCR 产物 ( 序列表中的序列 8) 为 PPV 阳性 ；
得到 342bp 的 PCR 产物 ( 序列表中的序列 9) 为 PRV 阳性。
得到 1265bp 和 748bp 的为 PCVII 和 PPV 阳性 ；
得到 1265bp 和 342bp 的为 PCVII 和 PRV 阳性 ；
得到 748bp 和 342bp 的为 PPV 和 PRV 阳性 ；
得到 1265bp、 748bp 和 342bp 的为 PCVII、 PPV 和 PRV 阳性 ；
均没有 1265bp、 748bp 或 342bp 的为 PCVII、 PPV 和 PRV 阴性 ；
结果如下 ：
编号为 1-47 的得到 1265bp 的 PCR 产物 ( 序列表中的序列 7) 为 PCVII 阳性 ( 共 47 份 ) ；
编号为 48-69 的得到 748bp 的 PCR 产物 ( 序列表中的序列 8) 为 PPV 阳性 ( 共 21 份)；
编号为 70-80 的得到 342bp 的 PCR 产物 ( 序列表中的序列 9) 为 PRV 阳性 ( 共 10 份)；
编号为 81-82 的得到 1265bp 和 748bp 的为 PCVII 和 PPV 阳性 ( 共 2 份 ) ；
编号为 83-87 的得到 1265bp 和 342bp 的为 PCVII 和 PRV 阳性 ( 共 42 份 ) ；
编号为 88-106 的均没有 1265bp、 748bp 或 342bp 的扩增， 说明没有感染 PCVII、 PPV 和 PRV 中的任一种。
采用商品 PCVII 检测试剂盒 ( 北京世纪元亨 )、 PPV 检测试剂盒 ( 北京世纪元亨 ) 以及 PRV 检测试剂盒 ( 北京世纪元亨 ) 分别对上述 106 份样品进行单项 PCR， 结果与本发明 上述的结果一致， 比对结果符合率为 100％。9102329893 A CN 102329903
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