猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒和猪伪狂犬病毒的多重PCR检测及其专用引物.pdf

1、10申请公布号CN102329893A43申请公布日20120125CN102329893ACN102329893A21申请号201110283930922申请日20110922C12Q1/70200601C12Q1/68200601C12N15/1120060171申请人山东省动物疫病预防与控制中心地址250022山东省济南市槐村街68号72发明人李云岗杜兰荣张栋孙圣福兰邹然74专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人关畅54发明名称猪圆环病毒型、猪细小病毒和猪伪狂犬病毒的多重PCR检测及其专用引物57摘要本发明公开了一种猪圆环病毒II型、猪细小病毒和猪伪狂犬病毒的多重PCR

2、检测及其专用引物。本发明提供了检测病毒的专用引物，包括引物对A、引物对B和引物对C，所述引物对A包括引物1和引物2，所述引物对B包括引物3和引物4，所述引物对C包括引物5和引物6，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。本发明的实验证明，本发明提供的猪圆环病毒II，猪细小病毒和猪伪狂犬病毒的多重PCR检测方法，简便、快速、经济、高效，在临床诊断上具有很好的应用前景。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书6页序列表4页附图2页CN102329903

3、A1/2页21一种检测病毒的专用引物，包括引物对A、引物对B和引物对C，所述引物对A包括引物1和引物2，所述引物对B包括引物3和引物4，所述引物对C包括引物5和引物6，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。2根据权利要求2所述专用引物，其特征在于所述专用引物由引物对A、引物对B和引物对C组成，所述引物对A由引物1和引物2组成，所述引物对B由引物3和引物4组成，所述引物对C由引物5和引物6组成。3根据权利要求1或2所述专用引物，其特征在于所述病毒为如下3种病毒中的至少一种猪圆环病毒II、猪

4、细小病毒和猪伪狂犬病毒。4一种制备检测病毒的PCR试剂，由权利要求13中任一所述的专用引物中的引物对A、引物对B、引物对C、DNTP、DNA聚合酶和PCR缓冲液组成；所述专用引物中所述引物对A的各引物在所述PCR试剂中的终浓度各为20M，所述引物对B的各引物在所述PCR试剂中的终浓度08M，所述引物对C的各引物在所述PCR试剂中的终浓度15M；每种所述DNTP在所述PCR试剂中的终浓度均为02MM；所述DNA聚合酶在所述PCR试剂中的终浓度均为005U/L。5根据权利要求4所述PCR试剂，其特征在于所述病毒为如下3种病毒中的至少一种猪圆环病毒II、猪细小病毒和猪伪狂犬病毒。6一种制备检测病毒的

5、试剂盒，为含有权利要求4或5所述的PCR试剂的试剂盒。7根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于所述病毒为如下3种病毒中的至少一种猪圆环病毒II、猪细小病毒和猪伪狂犬病毒。8权利要求13中任一所述引物或权利要求4或5所述试剂或权利要求6或7所述试剂盒在检测病毒或制备检测检测病毒产品中的应用；所述病毒具体为如下3种病毒中的至少一种猪圆环病毒II、猪细小病毒和猪伪狂犬病毒。9一种检测或辅助检测待测样本病毒的方法，包括如下步骤权利要求13中任一所述引物或权利要求4或5所述试剂或权利要求6或7所述试剂盒中的所述引物对A、引物对B和引物对C对待测样本进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测扩增产物，若仅得到

6、大小为1265BP的PCR产物，则样本中含有或候选含有猪圆环病毒II；若仅得到大小为748BP的PCR产物，则样本中含有或候选含有猪细小病毒；若仅得到大小为342BP的PCR产物，则样本中含有或候选含有猪伪狂犬病毒；若得到大小为1265BP的PCR产物和大小为748BP的PCR产物，则样本中含有或候选含有猪圆环病毒II和猪细小病毒；若得到大小为1265BP的PCR产物和大小为342BP的PCR产物，则样本中含有或候选含有猪圆环病毒II和猪伪狂犬病毒；权利要求书CN102329893ACN102329903A2/2页3若得到大小为748BP的PCR产物和大小为342BP的PCR产物，则样本中含有

7、或候选含有猪细小病毒和猪伪狂犬病毒；若得到大小为1265BP的PCR产物、大小为748BP的PCR产物和大小为342BP的PCR产物，则样本中含有或候选含有猪圆环病毒II、猪细小病毒和猪伪狂犬病毒；所述1265BP的PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序列7；所述748BP的PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序列8；所述342BP的PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序列9；所述PCR扩增中，以待测样本的基因组DNA为模板；所述PCR扩增的退火温度为5560，所述PCR扩增的退火温度具体为58；所述检测扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。10一种检测圆环病毒II的引物对，由引物1和引物2组成，所

8、述引物1和所述引物2的核苷酸序列分别为序列表中的序列1和序列2；或一种检测猪伪狂犬病毒的引物对，由引物5和引物6组成，所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分别为序列表中的序列5和序列6。权利要求书CN102329893ACN102329903A1/6页4猪圆环病毒II型、猪细小病毒和猪伪狂犬病毒的多重PCR检测及其专用引物技术领域0001本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种猪圆环病毒II型、猪细小病毒和猪伪狂犬病毒的多重PCR检测及其专用引物。背景技术0002猪圆环病毒IIPCVII，猪细小病毒PPV和猪伪狂犬病毒PRV的PCR检测方法是目前快速检测这三种病原的常用方法，被广泛应用于实验室病原诊

9、断，与病毒分离的方法相比较，PCR方法诊断更快速简便，病毒分离相对来说时间太长，在临床上不利于快速诊断，所以目前病毒病的实验室诊断主要应用PCR/RTPCR方法。目前有一些PCVII，PPV，PRV的PCR试剂盒已经商品化并投入临床应用。0003目前猪病多病毒混合感染相当严重。商品化的PCVII、PPV、PRV的PCR试剂盒都是单项PCR，1个试剂盒1次试验仅能检测一种病毒，对于混合感染了PCVII、PPV、PRV的同份猪病料要确诊病原就需要3种试剂盒并且要做3次PCR实验，不仅费时费力，检测成本也较高，既不经济也不快捷。发明内容0004本发明的一个目的是提供一种检测病毒的专用引物。0005本

10、发明提供的检测病毒的专用引物，包括引物对A、引物对B和引物对C，0006所述引物对A包括引物1和引物2，0007所述引物对B包括引物3和引物4，0008所述引物对C包括引物5和引物6，0009所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。0010所述专用引物由引物对A、引物对B和引物对C组成，0011所述引物对A由引物1和引物2组成，0012所述引物对B由引物3和引物4组成，0013所述引物对C由引物5和引物6组成。0014所述引物对A、所述引物对B和所述引物对C可独立包装。0015所述病毒为如

11、下3种病毒中的至少一种猪圆环病毒II、猪细小病毒PPV和猪伪狂犬病毒。0016本发明的第二个目的是提供一种制备检测病毒的PCR试剂。0017本发明提供的PCR试剂，由所述的专用引物中的引物对A、引物对B、引物对C、DNTP、DNA聚合酶和PCR缓冲液组成；0018所述专用引物中所述引物对A的各引物在所述PCR试剂中的终浓度各为20M，所述引物对B的各引物在所述PCR试剂中的终浓度08M，所述引物对C的各引物在所述说明书CN102329893ACN102329903A2/6页5PCR试剂中的终浓度15M；0019每种所述DNTP在所述PCR试剂中的终浓度均为02MM；0020所述DNA聚合酶在所

12、述PCR试剂中的终浓度均为005U/L。0021所述DNTP、DNA聚合酶和PCR缓冲液购自天根生化科技有限公司，产品目录号为ET101。0022所述病毒为如下3种病毒中的至少一种猪圆环病毒II、猪细小病毒PPV和猪伪狂犬病毒。0023本发明的第三个目的是提供一种制备检测病毒的试剂盒。0024本发明提供的试剂盒为含有所述的PCR试剂的试剂盒。0025所述病毒为如下3种病毒中的至少一种猪圆环病毒II、猪细小病毒PPV和猪伪狂犬病毒。0026所述专用引物或所述试剂或所述试剂盒在检测病毒或制备检测检测病毒产品中的应用；所述病毒具体为如下3种病毒中的至少一种猪圆环病毒II、猪细小病毒和猪伪狂犬病毒。0

13、027本发明的第四个目的是提供一种检测或辅助检测待测样本病毒的方法。0028本发明提供的方法，包括如下步骤0029用所述引物或所述试剂或所述试剂盒中的所述引物对A、引物对B和引物对C对待测样本进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测扩增产物，0030若仅得到大小为1265BP的PCR产物，则样本中含有或候选含有猪圆环病毒II；0031若仅得到大小为748BP的PCR产物，则样本中含有或候选含有猪细小病毒；0032若仅得到大小为342BP的PCR产物，则样本中含有或候选含有猪伪狂犬病毒；0033若得到大小为1265BP的PCR产物和大小为748BP的PCR产物，则样本中含有或候选含有猪圆环病毒I

14、I和猪细小病毒；0034若得到大小为1265BP的PCR产物和大小为342BP的PCR产物，则样本中含有或候选含有猪圆环病毒II和猪伪狂犬病毒；0035若得到大小为748BP的PCR产物和大小为342BP的PCR产物，则样本中含有或候选含有猪细小病毒和猪伪狂犬病毒；0036若得到大小为1265BP的PCR产物、大小为748BP的PCR产物和大小为342BP的PCR产物，则样本中含有或候选含有猪圆环病毒II、猪细小病毒和猪伪狂犬病毒。0037所述1265BP的PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序列7；0038所述748BP的PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序列8；0039所述342BP的PCR

15、产物的核苷酸序列为序列表中的序列9；0040所述PCR扩增中，以待测样本的基因组DNA为模板；0041所述PCR扩增的退火温度为5560，所述PCR扩增的退火温度具体为58；0042所述检测扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。0043本发明的第五个目的是提供一种检测圆环病毒II的引物对。0044本发明提供的引物对，由引物1和引物2组成，所述引物1和所述引物2的核苷酸序列分别为序列表中的序列1和序列2。0045或提供一种检测猪伪狂犬病毒的引物对。说明书CN102329893ACN102329903A3/6页60046本发明提供的引物对，由引物5和引物6组成，所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分

16、别为序列表中的序列5和序列6。0047本发明的实验证明，本发明提供的猪圆环病毒II，猪细小病毒和猪伪狂犬病毒的多重PCR检测方法，一次反应能同时检测出PCVII、PPV、PRV三种病毒，所用3对引物特异性较好，引物相互之间有较低的同源性及互补性；所述引物敏感性较好最低能检测到DNA含量为10NG/UL；所述的多重PCR方法简便、快速、经济、高效，并且经过与商品试剂盒比对，简便、快速、经济、高效，可以大大节约检测时间，及时对猪的三种常见病做出诊断，而且还大大节约了检测成本，特别适用于临床的大量检测，在临床诊断上具有很好的应用前景。附图说明0048图1为PCVII、PPV、PRV多重PCR以及单项

17、PCR电泳图结果0049图2为PCVII、PPV、PRV多重PCR特异性电泳图结果0050图3为PCVII、PPV、PRV多重PCR敏感性电泳图结果具体实施方式0051下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。0052下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。0053实施例1、圆环病毒IIPCVII、猪细小病毒PPV和猪伪狂犬病毒PRV的多重PCR检测方法构建00541、引物设计0055在GENBANK中查出PCVIIGENBANK号EF524528、PPVGENBANK号AY502114、PRVGENBANK号AF257079的部分已知序列。对病毒各基因

18、区进行同源性分析，分别选取PCVII的全基因，PPV的NS1基因，PRV的GB基因中的一段基因为各病毒扩增的靶序列。利用DNAMAN对上述保守区进行引物设计，对设计出来的3种病毒引物利用DNASTAR进行引物二聚体分析，以避免引物之间形成稳定的引物二聚体。选出扩增序列为PCVII1265BP、PPV748BP、PRV342BP的如下3对引物，并对每对引物扩增序列的同源性或互补性进行分析。避免它们之间有较高的同源性或互补性，从而确定3种病毒的多重PCR引物如下0056引物对A引物15AGAATCCAAGAAGCGGACCC3序列1；0057引物25TCACCTATGACCCCTATGT3序列2；

19、0058引物对B引物35CAGGCAACAGACTTGGAATG3序列3；0059引物45CTCCTCCGCTTTGAGCCATC3序列4；0060引物对C引物55CGGAGGGGTTCGCCGTGCTCTTCA3序列50061引物65TCTTGGTGTAGGTGTCGTTGGT3序列600622、PCR反应条件优化0063分别提取猪圆环病毒IIPCVII、猪细小病毒PPV和猪伪狂犬病毒PRV的基因组DNA。0064猪圆环病毒IIPCVII，PORCINECIRCOVIRUSTYPE2记载在SYBRGREENI荧光定量PCR检测猪圆环病毒2型方法的建立，李俊，丁鹏，时建立，徐绍建，孙文博，吴家

20、强，王金宝，中国兽医杂志，2010年12期，山东省农业科学院，公众可从山东省动物疫病预防说明书CN102329893ACN102329903A4/6页7与控制中心获得；0065猪伪狂犬病毒PRV，PSEUDORABIESVIRUS记载在1例猪伪狂犬病毒分离和鉴定，韩勇，李文刚，项朝荣，高卫科，王鑫，魏娟，中国动物检疫，2007年，第4期，公众可从山东省动物疫病预防与控制中心获得；0066猪细小病毒PPV，PORCINEPARVOVIRUS记载在猪细小病毒的分离鉴定，李刚明，姜天童，方雨玲，中国兽医科技1994年第24卷第10期，公众可从山东省动物疫病预防与控制中心获得；0067分别以PCVII

21、基因组DNA、PPV基因组DNA、PRV基因组DNA和PCVIIPPVPRV混合基因组DNA体积比为111为模板，均以引物对A、引物对B和引物对C混合作为引物，按照如下体系和程序进行PCR扩增PCR扩增体系25L10PCRBUFFERMG2PLUS25L天根生化科技有限公司，产品目录号为ET101，上下游混合引物引物对分别为引物对A各25M2L终浓度各为2M、引物对B各25M08L终浓度各为08M、引物对C各25M12L终浓度各为12M，DNA模板2L，DNTPS各25MM2L终浓度02MM，TAQ酶5U/L025L或25U/L05L终浓度005U/L，最后用水补充至25L。0068优化后的程

22、序为94预变性3MIN；94变性30S，58退火30S，72延伸30S，30个循环；72延伸10MIN，4保存。0069结果如图1所示，其中1为PCVIIPPVPRV基因组DNA，2为PCVII基因组DNA，3为PPV基因组DNA，4为PRV基因组DNA，可以看出，1得到1265BP、748BP和342BP产物，2得到1265BP，3得到748BP，4得到342BP。0070分别将上述PCR产物送去测序，结果为00711265BP的PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序列7PCVII的6ENBANK号的EF524528的第631327位核苷酸；0072748BP的PCR产物的核苷酸序列为序列表中

23、的序列8PPV的6ENBANK号的AY502114的第207954位核苷酸；0073342BP的PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序列9PRV的6ENBANK号AF257079的第468809位核苷酸。0074因此扩增产物通过测序，其序列与6ENBANK中查出PCVII、PPV、PRV的已知序列比较，证实是目的基因。00753、特异性检测0076分别检测上述涉及的PCR反应的引物对A、B、C的特异性，方法如下00771引物对A特异性0078分别提取PRRSV猪繁殖与呼吸综合征病毒、CSFV猪瘟病毒、BVDV牛病毒性腹泻病毒的RNA，分别反转录得到PRRSV的CDNA、CSFV的CDNA、BVD

24、V的CDNA；0079猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV，PORCINEREPRODUCTIVEANDRESPIRATORYSYNDROMEVIRUS记载在高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析，童光志，周艳君，郝晓芳，田志军，仇华吉，彭金美，安同庆，中国预防兽医学报，2007年05，公众可从山东省动物疫病预防与控制中心获得；0080猪瘟病毒CSFV，CLASSICSWINEFEVERVIRUS记载在猪瘟病毒6SLZ株的分离与说明书CN102329893ACN102329903A5/6页8鉴定，何小兵，贾怀杰，陈国华，房永祥，李玩生，曾爽，景志忠，中国兽医科学，2011年，

25、第2期，中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室，公众可从山东省动物疫病预防与控制中心获得；0081牛病毒性腹泻病毒BVDV，BOVINEVIRALDIARRHEAMUCOSALDISEASEVIRUS记载在牛病毒性腹泻病毒BVDVJL株的分离与鉴定，张淑琴，郭利，冷雪，张亭亭，吴永旺，武华，中国预防兽医学报，2011年03期，公众可从山东省动物疫病预防与控制中心获得；0082分别以PRRSV的CDNA、CSFV的CDNA、BVDV的CDNA、PCVII基因组DNA、PPV基因组DNA、PRV基因组DNA为模板，以

26、引物对A为引物，按照上述步骤2中的PCR体系和程序进行扩增，结果如图2的16所示，其中1为PCVII，2为PRRSV，3为CSFV，4为BVDV，5为PPV，6为PRV，可以看出，只有PCVII有1265BP目的条带，未见其他非特异性带，说明引物对A特异性高。0083分别以PRRSV的CDNA、CSFV的CDNA、BVDV的CDNA、PCVII基因组DNA、PPV基因组DNA、PRV基因组DNA为模板，以引物对B为引物，按照上述步骤2中的PCR体系和程序进行扩增，结果如图2的712所示，其中7为PPV，8为PRRSV，9为CSFV，10为BVDV，11为PCVII，12为PRV，可以看出，只有

27、PPV有748BP目的条带，未见其他非特异性带，说明引物对B特异性高。0084分别以PRRSV的CDNA、CSFV的CDNA、BVDV的CDNA、PCVII基因组DNA、PPV基因组DNA、PRV基因组DNA为模板，以引物对C为引物，按照上述步骤2中的PCR体系和程序进行扩增，结果如图2的1318所示，其中13为PRV，14为PRRSV，15为CSFV，16为BVDV，17为PCVII，18为PPV，可以看出，只有PRV有342BP目的条带，未见其他非特异性带，说明引物对C特异性高。00854、敏感性检测0086通过分光光度计测OD测得由步骤2得到的PCVII基因DNA的浓度为15000G/L

28、，由步骤2得到的PPV基因DNA的浓度为15000G/L，由步骤2得到的PRV基因DNA的浓度为10000G/L。0087分别将PCVII基因DNA、PPV基因DNA和PRV基因DNA进行10倍系列稀释后分别作为模板，以引物对A、B、C为引物，按照步骤2的体系和程序进行扩增。0088结果见图3的B所示，17分别为PCVII基因DNA的101107倍稀释的模板；814分别为PPV基因DNA的101107倍稀释的模板；1521分别为PRV基因DNA的101107倍稀释的模板；可以看出，无论哪种模板，104倍稀释的模板有比较清晰地目的条带，105倍稀释的模板有比较弱的目的条带，稀释106倍及以上的模

29、板已完全看不到目的条带。0089将由步骤2得到的PCVII基因DNA、PPV基因DNA和PRV基因DNA混合体积比为111，将混合后DNA进行10倍系列稀释后分别作为模板，以引物对A、B、C为引物，按照步骤2的体系和程序进行扩增。0090结果见图3的A所示，其中19分别为混合后的DNA的101109倍稀释的模板，可以看出，104倍稀释的模板有比较清晰地目的条带，105倍稀释的模板有比较弱的目的条带，稀释106倍及以上的模板已完全看不到目的条带。0091实验证明本发明的多重PCR可以检测到PCVII基因DNA的最小浓度为15NG/L，说明书CN102329893ACN102329903A6/6页

30、9PPV基因DNA的最小浓度为15NG/L，PRV基因DNA的最小浓度为10NG/L。而多重PCV的敏感性与单项PCR的敏感性无明显差别。00925、重复性0093对PCVII、PPV、PRV多重PCR方法进行多次重复试验实验结果稳定。00946、样本检测0095对106份临床疑似病料山东省动物疫病预防与控制中心附设兽医院门诊送检的病死猪肝、肾、肺组织混合样品质量比约为111进行检测，具体如下0096提取106份临床疑似病料的基因组DNA编号为1106，用引物对A、B和C作为引物，按照步骤2的体系和程序进行PCR扩增，0097得到1265BP的PCR产物序列表中的序列7为PCVII阳性；009

31、8得到748BP的PCR产物序列表中的序列8为PPV阳性；0099得到342BP的PCR产物序列表中的序列9为PRV阳性。0100得到1265BP和748BP的为PCVII和PPV阳性；0101得到1265BP和342BP的为PCVII和PRV阳性；0102得到748BP和342BP的为PPV和PRV阳性；0103得到1265BP、748BP和342BP的为PCVII、PPV和PRV阳性；0104均没有1265BP、748BP或342BP的为PCVII、PPV和PRV阴性；0105结果如下0106编号为147的得到1265BP的PCR产物序列表中的序列7为PCVII阳性共47份；0107编号为

32、4869的得到748BP的PCR产物序列表中的序列8为PPV阳性共21份；0108编号为7080的得到342BP的PCR产物序列表中的序列9为PRV阳性共10份；0109编号为8182的得到1265BP和748BP的为PCVII和PPV阳性共2份；0110编号为8387的得到1265BP和342BP的为PCVII和PRV阳性共42份；0111编号为88106的均没有1265BP、748BP或342BP的扩增，说明没有感染PCVII、PPV和PRV中的任一种。0112采用商品PCVII检测试剂盒北京世纪元亨、PPV检测试剂盒北京世纪元亨以及PRV检测试剂盒北京世纪元亨分别对上述106份样品进行单项PCR，结果与本发明上述的结果一致，比对结果符合率为100。说明书CN102329893ACN102329903A1/4页1000010002序列表CN102329893ACN102329903A2/4页110003序列表CN102329893ACN102329903A3/4页120004序列表CN102329893ACN102329903A4/4页13序列表CN102329893ACN102329903A1/2页14图1图2说明书附图CN102329893ACN102329903A2/2页15图3说明书附图CN102329893A