一种羊血红蛋白降血压肽及制备方法 【技术领域】
本发明属于保健药品或功能性食品领域，具体地说涉及一种羊血红蛋白降血压肽及其制备方法。
背景技术
高血压是最为普遍的心血管疾病，据世界卫生组织(WHO)估计，全球患病人数已愈5亿。在高血压人群中有95％以上的患者是原发性高血压，通过抑制血管紧张素转化酶I(angiotensin I converting enzyme，简称ACE)的酶活性可有效地降低原发性高血压。目前人工合成的ACE抑制剂虽能有效地降低高血压，但临床有许多不良反应，因此，如果能通过非药物方法达到治病防病的目的，是一种很好的途径。源于食品蛋白质的血管紧张素转化酶抑制肽(angiotensin Iconverting enzyme inhibitory peptides，简称ACEIP)是一类具有ACE抑制活性的多肽物质，无副作用，可长期服用达到预防、控制、缓解和辅助治疗高血压的目的。
ACEIP广泛存在于各种食物蛋白中，从来源上大致可分为三类：一是来自乳蛋白，乳蛋白是许多生物活性肽的重要来源，如可从牛奶的酪蛋白和乳清蛋白中提取ACEIP(Mullally M M等.International dairy journal，1997，7：299-303；FEBS letter，1997，402：99-101；Amhar A等.Journal of dairy science，1998，81：3131-3138；Cornelly V D V等.International dairy journal，2002，12：813-820；NakamuraY等.Journal of dairy science，1995，78：777-783；Vermeirssen V等.Journal of dairy science，2003，86：429-438)。二是来自鱼贝类蛋白；如可从鱼蛋白质中提ACEIP(FujitaH等.Immunopharmacology，1999，44：123-127；Je J Y等.Food Chemistry，2005，90：809-814)。三是来自植物蛋白，如大豆多肽、玉米多肽等。以及其它植物蛋白来源的ACE抑制肽(Shin Z L等.Food science andtechnol，1995，27：230-234；Gibbs B F等.Food Research International，2004，37：123-131)。
动物血液富含大量优质蛋白质，特别是血红蛋白占血液总蛋白质含量的60～70％。其生物学效价高并且含有丰富的必需氨基酸。蛋白包含有多种生物活性序列，用适当的蛋白酶水解并从血红蛋白中释放出来之后，成为具有生理活性的肽段。Kazue Mito等以猪血为原料酶解制备的珠蛋白得到了4种具有抑制ACE活性，降血压的活性肽(Kazue Mito等.European Journal of Pharmacology，1996，304：93-98)。来自血红蛋白的ACE抑制肽，安全性高、无毒副作用，动物实验证实可使SHR降低血压。
目前羊血大部分被以污水的形式排放或丢弃，导致大量宝贵营养资源流失，并且给环境造成了严重污染。将血液中蛋白质可以开发为功能食品、医药及化妆品等具有高附加值的生物制品，而且有助于改善环境。经检索，未发现有关从羊血红蛋白中提取降血压肽的报道。
【发明内容】
本发明第一目的是提供一种羊血红蛋白降血压肽。食用该降血压肽可达到预防、抑制、缓解和辅助治疗高血压的作用，且安全性高、无毒副作用。
本发明第二目的是提供上述羊血红蛋白降血压肽的制备方法。
本发明第三目的是提供上述羊血红蛋白降血压肽的用途。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明一种羊血红蛋白降血压肽，按照如下方法制备：
(1)按照2～8％的重量百分比取羊血红蛋白干粉，并溶于蒸馏水中，得羊血红蛋白溶液；
(2)将羊血红蛋白溶液在70～80℃保温5～10min，调节pH值至7.5～8.5，加入碱性蛋白酶，然后在50～60℃、pH7.5～8.5条件下进行水解反应4～6h，得到羊血红蛋白酶解液；
(3)在15～20℃、压力为0.1～0.16MPa条件下将羊血红蛋白酶解液通过孔径为3～6KDa的超滤膜过滤，再通过离子交换树脂进行脱盐，得血红蛋白水解产物溶液；
(4)将血红蛋白水解产物溶液在90～95℃保温5～10min，然后进行离心喷雾干燥，即得血红蛋白降血压多肽。
上述羊血红蛋白降血压肽步骤(2)加入碱性蛋白酶的数量为：碱性蛋白酶与羊血红蛋白干粉之间重量比为0.3～1.0：100。
上述羊血红蛋白降血压肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)按照2～8％的重量百分比取羊血红蛋白干粉，并溶于蒸馏水中，得羊血红蛋白溶液；
(2)将羊血红蛋白溶液在70～80℃保温5～10min，调节pH值至7.5～8.5，加入碱性蛋白酶，然后在50～60℃、pH7.5～8.5条件下进行水解反应4～6h，得到羊血红蛋白酶解液；
(3)在15～20℃、压力为0.1～0.16MPa条件下将羊血红蛋白酶解液通过孔径为3～6KDa的超滤膜过滤，再通过离子交换树脂进行脱盐，得羊血红蛋白水解产物溶液；
(4)将羊血红蛋白水解产物溶液在90～95℃保温5～10min，然后进行离心喷雾干燥，即得血红蛋白降血压多肽。
上述制备方法步骤(2)加入碱性蛋白酶的数量为：碱性蛋白酶与羊血红蛋白干粉之间重量比为0.3～1.0：100。
所述的碱性蛋白酶可以从市场上购买，如北京东华强盛生物技术有限公司生产的2709碱性蛋白酶。
上述羊血红蛋白干粉可以是羊血经离心喷雾干燥制得。
上述超滤膜可自市场上购买，如北京旭成超滤设备厂生产的超滤膜。
上述羊血红蛋白降血压肽作为营养保健品的应用。
上述营养保健品可以是保健药品或保健食品。
本发明具有的优点和有益效果：(1)本发明降压能力强，其IC50值为0.78～0.86mg/mL，ACE抑制活性达到92-95％；(2)本发明只对高血压患者起到降压作用，对血压正常者无降压作用，因而不会产生降压过度的问题；(3)本发明是经食用级酶在温和条件下获得的，其安全性极高，无毒副作用；(4)本发明除具有降压作用外，同时具有免疫促进、降胆固醇、易消化吸收等作用；(5)本发明羊血红蛋白多肽回收率90％以上，生产成本低，可比同类产品(如乳蛋白多肽)生产成本低35％以上。
【附图说明】
图1本发明羊血红蛋白降血压肽的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱
其中A：血红蛋白降血压肽；B：标准蛋白
【具体实施方式】
实施例1
羊血红蛋白降血压肽的制备
(1)将2g羊血红蛋白干粉(羊血经离心喷雾干燥制得)溶于100ml蒸馏水中，得2％羊血红蛋白溶液；
(2)将羊血红蛋白溶液在70℃保温8min；再用1N HCL或NaOH调节羊血红蛋白溶液pH至7.8，加入0.02g 2709碱性蛋白酶(北京东华强盛生物技术有限公司生产)，然后在52℃、pH7.8条件下进行水解反应5h；得羊血红蛋白酶解液，
(3)在18℃、压力为0.15MPa的条件下将羊血红蛋白酶解液通过3KDa的中空纤维超滤膜(北京旭成超滤设备厂生产)进行过滤，再通过离子交换树脂进行脱盐，得羊血红蛋白水解产物溶液；
(4)将羊血红蛋白水解产物溶液在95℃保温8min，再进行离心喷雾干燥(进风温度200℃，出口温度65℃)，得到羊血红蛋白降血压肽1.80g。
利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测所得羊血红蛋白降血压肽，结果(见图1)本发明所得羊血红蛋白降血压肽为分子量小于14KD的小分子量多肽。说明羊血红蛋白经过水解后所得到的为易于人体吸收的小分子量多肽。
实施例2
羊血红蛋白降血压肽的制备
(1)取5g羊血红蛋白干粉(按照常规方法，利用羊血经离心喷雾干燥制得)，溶于400ml蒸馏水中，得1.2％的羊血红蛋白溶液；
(2)将羊血红蛋白溶液在75℃保温6min，然后用1N HCL或NaOH调节pH至8.0，接着加入0.04g 2709碱性蛋白酶(北京东华强盛生物技术有限公司生产)，然后在55℃、pH8.0条件下进行水解反应6h，得羊血红蛋白酶解液；
(3)在温度为20℃，压力为0.12MPa的条件下将羊血红蛋白酶解液通过5KDa的中空纤维超滤膜(北京旭成超滤设备厂生产)进行过滤，所得滤液通过离子交换树脂进行脱盐，得羊血红蛋白水解产物溶液；
(4)将羊血红蛋白水解产物溶液在92℃保温9min，再进行离心喷雾干燥(进风温度200℃，出口温度65℃)，得到羊血红蛋白降血压肽4.60g。
实施例3
本发明羊血红蛋白降血压肽的成分测定
按照如下方法进行
(1)蛋白质含量的测定
称取待测样品(实施例1或实施例2)0.1～0.3g或3mL于消化管中，加入10mL H2SO4，0.3g k2SO4，0.03g CuSO4，置于消化装置上消化，先在250℃下消化约1h，直到没有碳粒蹦出，然后逐渐生温至500℃消化至透明并呈淡兰色或淡绿色，然后用全自动凯氏定氮仪蒸馏并滴定。蛋白质含量为：
式中：V为滴定时所消耗盐酸溶液的毫升数(mL)；N为标准盐酸溶液的当量浓度(mol/L)；0.014为1mg当量氮的克数；6.38为氮的蛋白质换算系数；W为样品克数(g)。
(2)灰分的测定
取5mL液体样品于已恒重的瓷坩埚中，在电炉上加热使水分蒸发并炭化，炭化完全后置于马福炉中550℃灼烧至残渣呈白色或浅灰色为止，冷却后称量。灰分的含量计算公式为：
式中：m1：坩埚质量；m2：样品+坩埚质量；m3：残灰+坩埚质量。
(3)水分的测定
称1～3克实施例1或实施例2羊血红蛋白降血压肽置于已干燥、冷却并称至恒重的有盖的称量瓶中移至105℃烘箱中，开盖烘2～4h后取出，加盖置于干燥器内冷却0.5h后称重。重复此操作，直至前后2次质量差不超过2mg即视为恒重。水分的含量计算公式为：
其中：m1：干燥前样品+称量瓶质量；m2：干燥后样品+称量瓶质量；m3：称量瓶质量。
结果(见表1)本发明所得羊血红蛋白降血压肽灰分含量较低，蛋白多肽含量达到88％以上。说明本发明除了具有较好的降血压功能外，也是一种很好的蛋白营养补充剂。
表1 羊血红蛋白降血压肽成分含量测定结果
产品蛋白质(％)水分(％)灰分(％)实施例1羊血红蛋白降血压肽88.643.112.23实施例2羊血红蛋白降血压肽88.773.232.37
实施例4
羊血红蛋白降血压肽活性的检测
(1)药品的配制：
1)硼酸盐缓冲溶液：用去离子水配制，其中含硼酸盐0.1moL/L，NaCl0.375moL/L，然后用6M的NaOH调pH到8.3。
2)ACE：所使用的ACE为来源于兔肺的具有ACE活性的粉状物。将0.1U的ACE用2mL的去离子水溶解，配成0.05u/mL，然后分装后-20℃保藏。
3)HHL：溶于硼酸盐缓冲溶液，配成8.3×10-3moL/L浓度，于-20℃保藏。
4)抑制剂：羊血红蛋白水解物，用硼酸盐缓冲溶液溶解样品，用于测定。
(2)测定方法
根据表2将各试剂加入到试管中，在37℃水浴中反应30min，反应结束后马上加入1moL/L HCl以终止反应(样品c需提前加入HCl)；然后于各试管中加入乙酸乙酯1.7mL，旋涡混合后进行离心(4000r/min，10min)；吸取1.4mL乙酸乙酯于另一试管中，放入烘箱中，120℃挥发溶剂30min，冷却后加入去离子水3mL，旋涡混合后在228nm下测定其吸光值。ACE抑制率的计算公式为：
其中：Ab：是在反应中不加抑制剂的光密度值；Aa：是在反应中ACE和ACE抑制剂同时存在的光密度值；Ac：是ACE与HHL空白反应的光密度值。
表2 ACE抑制率检测所用试剂表
(3)半抑制浓度的测定
称取一定重量样品配制成不同浓度的溶液，按照ACE抑制肽体外检测方法测定其抑制活性，以浓度为横坐标，ACE抑制率为纵坐标绘成圆滑的曲线，从曲线中计算出IC50值。
结果实施例1得到的羊血红蛋白降血压肽的ACE抑制率为92.3％，IC50为0.97mg/mL；实施例2得到的羊血红蛋白降血压肽的ACE抑制率分别为92.1％，IC50为0.98mg/mL。说明羊血红蛋白降血压肽具有较好的ACE抑制效果。