具有校正突变CFTR加工活性的化合物及其应用.pdf

本发明提供了校正突变-囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(如ΔF508 CFTR)的细胞加工(如折叠、运输或翻译后修饰)、用于治疗囊性纤维化(CF)的组合物、药物制剂和方法。本发明的组合物和药物制剂可含有本发明的含氨基苯并噻唑的化合物、含氨基芳基噻唑的化合物、含喹唑啉基氨基嘧啶酮的化合物、含双氨基甲基联噻唑化合物或含苯基氨基喹啉的化合物或者他们的类似物或衍生物中的一种或多种。

1.  一种药物组合物，所述药物组合物含有式(I)化合物；或其药学上可接受的衍生物，如各立体异构体或其混合物；或其药学上可接受的盐：

式中，R₁独立地选自：氢或与R₂稠合的C(＝O或＝S)NH基团，R₂独立地选自：连接于取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基或者取代或未取代的芳环和取代或未取代的杂芳环的N＝CH或N-烷基。

2.  如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物还含有药学上可接受的运载体、药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的赋形剂和药学上可接受的佐剂中的至少一种。

3.  如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物不含可检测的二甲亚砜。

4.  如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，R₁是氢，所述式(II)化合物是具有式(Ia)的化合物：

式中，R₃独立地选自取代或未取代的苯基，R₄是取代或未取代的烷基。

5.  如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，R₃选自：4-(甲氧基)苯基、3-(硝基)苯基、4-(硝基)苯基或4-(氯)苯基。

6.  如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，R₄选自氢或甲基。

7.  如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述化合物是式(Ib)化合物：

式中，R₅和R₆选自取代或未取代的烷基，或者是稠合的取代或未取代的环烷基环基。

8.  如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，R₅是乙基。

9.  如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，R₆是乙基。

10.  如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，R₅和R₆是稠合的叔(丁基)环己烷基。

11.  如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述化合物选自：


12.  一种药物组合物，所述药物组合物含有式(II)化合物；或其药学上可接受的衍生物，如各立体异构体或其混合物；或其药学上可接受的盐：

式中，R₁独立地选自：取代或未取代的苯基，R₂独立地选自氢或烷基，R₃独立地选自：取代或未取代的苯基、取代或未取代的杂芳基、取代的氨基、取代的酰基。

13.  如权利要求12所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物还含有药学上可接受的运载体、药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的赋形剂和药学上可接受的佐剂中的至少一种。

14.  如权利要求12所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物不含可检测的二甲亚砜。

15.  如权利要求12所述的药物组合物，其特征在于，R₁选自未取代的苯基、未取代的联苯基、3，4-二(甲基)苯基、4-(甲基)苯基、3，4-二(甲氧基)苯基、3，4-二(羟基)苯基、4-(溴)苯基、4-(丙烯基)苯基、3-(甲基)-4-(甲氧基)苯基或3-(硝基)-4(甲基)苯基。

16.  如权利要求12所述的药物组合物，其特征在于，R₂选自氢或甲基。

17.  如权利要求12所述的药物组合物，其特征在于，R₃选自：未取代的苯基、或者3-(氯)苯基、4-(氟)苯基、2-(甲基)苯基、2-(乙氧基)苯基、2，5-二(甲氧基)-4-(氯)苯基、4-(乙酰胺)苯基、未取代的嘧啶基、3-(甲基)嘧啶基、二(甲基)亚丁基胺基、酰基-噻吩基、酰基(4-叔丁基-苯基)或酰基-甲硫基-咪唑-5-苯基。

18.  如权利要求12所述的药物组合物，其特征在于，所述化合物选自：


19.  一种药物组合物，所述药物组合物含有式(III)化合物；或其药学上可接受的衍生物，如各立体异构体或其混合物；或其药学上可接受的盐：

式中，R₁选自氢、烷基或烷氧基；R₂选自氢、烷基或烷氧基；R₃是烷基；R₄选自羟基或羰基；R₅和R₆选自：稠合环烷基、氢、烷基或者取代或未取代的苯基。

20.  如权利要求19所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物还含有药学上可接受的运载体、药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的赋形剂和药学上可接受的佐剂中的至少一种。

21.  如权利要求19所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物不含可检测的二甲亚砜。

22.  如权利要求19所述的药物组合物，其特征在于，R₁选自：氢、甲基、乙基、甲氧基或乙氧基。

23.  如权利要求19所述的药物组合物，其特征在于，R₂选自：氢、甲基、乙基、甲氧基或乙氧基。

24.  如权利要求19所述的药物组合物，其特征在于，R₃选自甲基或乙基。

25.  如权利要求19所述的药物组合物，其特征在于，R₄选自羟基或羰基。

26.  如权利要求19所述的药物组合物，其特征在于，R₅选自：氢、甲基、乙基、未取代的苯基或2-甲硫基-1H-苯并咪唑基。

27.  如权利要求19所述的药物组合物，其特征在于，R₆选自：氢、甲基、乙基、未取代的苯基或2-甲硫基-1H-苯并咪唑基。

28.  如权利要求19所述的药物组合物，其特征在于，R₅和R₆是稠合的环戊基。

29.  如权利要求19所述的药物组合物，其特征在于，所述化合物选自：



30.  一种药物组合物，所述药物组合物含有式(IV)化合物；或其药学上可接受的衍生物，如各立体异构体或其混合物；或其药学上可接受的盐：

式中，R₁是烷基，R₂是取代或未取代的苯基；或取代或未取代的苯基。

31.  如权利要求30所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物还含有药学上可接受的运载体、药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的赋形剂和药学上可接受的佐剂中的至少一种。

32.  如权利要求30所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物不含可检测的二甲亚砜。

33.  如权利要求30所述的药物组合物，其特征在于，R₁是甲基。

34.  如权利要求30所述的药物组合物，其特征在于，R₂选自：3-(硝基)苯基、2-甲氧基苯基、2-乙氧基苯基、1-苯基乙基-1-酮基或3-氯-6-甲氧基苯基。

35.  如权利要求30所述的药物组合物，其特征在于，所述化合物选自：


36.  一种药物组合物，所述药物组合物含有式(V)化合物；或其药学上可接受的衍生物，如各立体异构体或其混合物；或其药学上可接受的盐：

式中，R₁选自氢或烷基；R₂选自氢或烷基；R₃是烷基；R₄选自：氢、烷基、烷氧基或卤素基团；R₅选自：氢、烷基、烷氧基或卤素基团。

37.  如权利要求36所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物还含有药学上可接受的运载体、药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的赋形剂和药学上可接受的佐剂中的至少一种。

38.  如权利要求36所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物不含可检测的二甲亚砜。

39.  如权利要求36所述的药物组合物，其特征在于，R₁选自氢或甲基。

40.  如权利要求36所述的药物组合物，其特征在于，R₂选自氢或甲基。

41.  如权利要求36所述的药物组合物，其特征在于，R₃选自氢或甲基。

42.  如权利要求36所述的药物组合物，其特征在于，R₄选自：氢、溴、氯或甲氧基。

43.  如权利要求36所述的药物组合物，其特征在于，R₅选自：氢、溴、氯或甲氧基。

44.  如权利要求36所述的药物组合物，其特征在于，所述化合物选自：


45.  一种治疗患有突变-CFTR相关性疾病对象的方法，所述方法包括给予所述对象治疗有效量的权利要求1、12、19、30或36中任一项所述的药物组合物。

46.  如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述疾病是囊性纤维化。

47.  如权利要求45所述的方法，其特征在于，治疗后，所述对象肺中粘液或细菌滴度降低、咳嗽或打喷嚏减少、胰功能不全减轻或汗液中电解质水平降低。

48.  如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述对象是非人动物。

49.  如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述动物是哺乳动物。

50.  如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述突变-CFTR是ΔF508-CFTR。

51.  一种提高产生突变-CFTR蛋白的细胞的离子通透性的方法，所述方法包括：
使所述细胞接触有效量的权利要求1、12、19、30或36中任一项所述的药物组合物，所述接触能有效提高所述细胞CFTR介导的离子通透性。

52.  如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述细胞含有编码所述突变-CFTR蛋白的重组表达盒。

53.  如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述细胞含有编码所述突变-CFTR蛋白的基因组。

54.  如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述突变-CFTR是ΔF508-CFTR。

具有校正突变-CFTR加工活性的化合物及其应用
关于联邦资助研究的声明
本发明在国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助号HL73856、EB00415、HL59198、EY13574和DK35124的政府支持下完成。政府可以享有本发明的某些权利。
本发明也得到了囊性纤维化基金会和/或囊性纤维化治疗基金会的资助。
发明背景
囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)是哺乳动物呼吸道、小肠、胰腺和睾丸的上皮细胞中表达的cAMP-活化的氯(Cl^-)通道。CFTR是负责cAMP-介导Cl^-分泌的氯离子通道。激素如β-肾上腺素能受体激动剂或毒素如霍乱毒素会导致cAMP增加、cAMP-依赖性蛋白激酶活化和CFTR Cl^-通道的磷酸化，使该通道打开。细胞中Ca²⁺浓度增加也可激活不同的顶端膜通道。蛋白激酶C引起的磷酸化可打开或关闭顶端膜中的Cl^-通道。CFTR主要位于上皮中，为Cl^-离子跨顶端膜移动提供通道，是调节盐和水跨上皮转运速率的关键点。CFTR氯通道功能与各种疾病包括囊性纤维化(CF)以及某些类型的男性不育、多囊性肾病和分泌性腹泻有关。
遗传致死性疾病CF是由CFTR蛋白编码基因中的突变引起的，CFTR蛋白是气道、小肠、胰腺以及其它分泌性和吸收性上皮中表达的cAMP-活化Cl^-通道。CF引起的主要临床问题是反复性肺部感染，导致肺功能进行性退化。最常见的CFTR突变是苯丙氨酸-508缺失(ΔF508-CFTR)，这种突变存在于约90％CF患者的至少一个等位基因中(Egan等，(2004)Science 304：600-602)。ΔF508-CFTR导致Cl^-不能透过，因为ΔF508-CFTR没有被正确加工，使其滞留于内质网(而非质膜)。相对于野生型CFTR，ΔF508-CFTR也降低了固有的Cl^-传导率。
已研究了校正ΔF508-CFTR细胞加工和细胞内固有功能缺陷的方案。在低温下(＜30℃)(Denning等，(1992)Nature 358，761-764)或用高浓度的化学侣伴分子如甘油(Sato等，(1996)J.Biol.Chem.271，635-638；Brown，等(1996)，Cell Stress andChaperons 1，117-125)培养细胞能部分校正ΔF508-CFTR细胞加工的缺陷，其机制可能包括改善蛋白质折叠和稳定性(Sharma等，(2001)J.Biol.Chem.276，8942-8950)。毒胡萝卜素引起的胞内钙浓度持续升高也能校正ΔF508-CFTR加工的缺陷(Egan等，(2002)Nature Med.8，485-492)，机制可能是干扰与分子伴侣的相互作用。化合物如苯基丁酸酯通过改变侣伴分子功能和/或增强转录促进ΔF508-CFTR细胞加工(Rubenstein等，(2000)Am.J.Physiol.278，C259-C267；Kang等，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99，838-843)。虽然这些方法能够使人了解ΔF508-CFTR滞留于内质网的机制，但它们可能无法提供临床上有用的治疗。
即使存在于细胞质膜上，ΔF508-CFTR也明显损伤了该通道的活性(Dalemans等，(1991)Nature 354，526-528)。细胞粘附膜片钳测定显示，即使采用最大的cAMP刺激，ΔF508-CFTR通道开放概率也降低，关闭时间延长(Haws等，(1996)Am.J.Physiol.270，C1544-C1555；Hwang等，(1997)Am.J.Physiol.273，C988-C998)。离体细胞膜中的膜片钳测定表明，与野生型CFTR相比，ΔF508-CFTR磷酸化后活性水平降低了7倍。较高浓度的黄酮类物质染料木黄酮(＞50μM，Hwang，等，(1997)Am.J.Physiol.273，C988-C998；Wang等，(2000)J.Physiol.524，637-638)或黄嘌呤类物质异丁基甲基黄嘌呤(＞1mM，Drumm等，(1991)Science 254，1797-1799)与cAMP激动剂联用能提高ΔF508-CFTR通道活性。但这些研究仍然没能提供任何临床上有用的治疗。
因此，仍然需要能校正突变体CFTR如ΔF508-CTFR的折叠或细胞加工的化合物，和用这种化合物研究和治疗CF以及治疗和控制其它分泌性疾病的方法。本发明解决了这些及其它需要。
发明概述
本发明提供了校正突变-囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(如ΔF508 CFTR)的细胞加工(如折叠、运输或翻译后修饰)、可用于治疗囊性纤维化(CF)的组合物、药物制剂和方法。本发明的组合物和药物制剂可含有本发明的含氨基苯并噻唑的化合物、含氨基芳基噻唑的化合物、含喹唑啉基氨基嘧啶酮的化合物、含双氨基甲基联噻唑的化合物或含苯基氨基喹啉的化合物或者它们的类似物或衍生物中的一种或多种化合物。
本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有式(I)化合物；或其药学上可接受的衍生物，如各立体异构体或其混合物；或其药学上可接受的盐：

式中，R₁独立地选自：氢或与R₂稠合的C(＝O或＝S)NH基团，R₂独立地选自：连接于取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基或者取代或未取代的芳环和取代或未取代的杂芳环的N＝CH或N-烷基。在一个实施方式中，该组合物还含有药学上可接受的运载体、药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的赋形剂和药学上可接受的佐剂中的至少一种。在另一实施方式中，该组合物不含可检测的二甲亚砜。
在某些实施方式中，该组合物的R₁是氢，具有式(II)的化合物是具有式(Ia)的化合物：

式中，R₃独立地选自取代或未取代的苯基，R₄是取代或未取代的烷基。在一个实施方式中，R₃选自：4-(甲氧基)苯基、3-(硝基)苯基、4-(硝基)苯基或4-(氯)苯基。在另一实施方式中，R₄选自氢或甲基。
在其它实施方式中，该化合物为式(Ib)化合物：

式中，R₅和R₆选自取代或未取代的烷基，或者是稠合的取代或未取代的环烷基。在一个实施方式中，R₅是乙基。在另一实施方式中，R₆是乙基。在又一实施方式中，R₅和R₆是稠合的叔(丁基)环己烷基。
在代表性实施方式中，该化合物选自：

本发明也提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有式(II)化合物；或其药学上可接受的衍生物，如各立体异构体或其混合物；或其药学上可接受的盐：

式中，R₁独立地选自取代或未取代的苯基，R₂独立地选自氢或烷基，R₃独立地选自：取代或未取代的苯基，取代或未取代的杂芳基，取代的氨基，取代的酰基。在一个实施方式中，该组合物还含有药学上可接受的运载体、药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的赋形剂和药学上可接受的佐剂中的至少一种。在另一实施方式中，该组合物不含可检测的二甲亚砜。
在一个实施方式中，R₁选自：未取代的苯基、未取代的联苯基、3，4-二(甲基)苯基、4-(甲基)苯基、3，4-二(甲氧基)苯基、3，4-二(羟基)苯基、4-(溴)苯基、4-(丙烯)苯基、3-(甲基)-4-(甲氧基)苯基或3-(硝基)-4(甲基)苯基。在另一实施方式中，R₂选自氢或甲基。在又一实施方式中，R₃选自：未取代的苯基、3-(氯)苯基、4-(氟)苯基、2-(甲基)苯基、2-(乙氧基)苯基、2，5-二(甲氧基)-4-(氯)苯基、4-(乙酰胺)苯基、未取代的嘧啶基、3-(甲基)吡啶基、二(甲基)亚丁基胺基、酰基-噻吩基、酰基(4-叔丁基-苯基)或酰基-甲硫基-咪唑-5-苯基。在代表性实施方式中，该化合物选自：

本发明也提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有式(III)化合物；或其药学上可接受的衍生物，如各立体异构体或其混合物；或其药学上可接受的盐：

式中，R₁选自氢、烷基或烷氧基；R₂选自氢、烷基或烷氧基；R₃是烷基；R₄选自羟基或羰基；R₅和R₆选自稠合环烷基、氢、烷基或者取代或未取代的苯基。在一个实施方式中，该组合物还含有药学上可接受的运载体、药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的赋形剂和药学上可接受的佐剂中的至少一种。在另一实施方式中，该组合物不含可检测的二甲亚砜。
在一个实施方式中，R₁选自：氢、甲基、乙基、甲氧基或乙氧基。在另一实施方式中，R₂选自：氢、甲基、乙基、甲氧基或乙氧基。在又一实施方式中，R₃选自甲基或乙基。在又一实施方式中，R₄选自羟基或羰基。在又一实施方式中，R₅选自：氢、甲基、乙基、未取代的苯基或2-甲硫基-1H-苯并咪唑基。在又一实施方式中，R₆选自：氢、甲基、乙基、未取代的苯基或2-甲硫基-1H-苯并咪唑基。在又一实施方式中，R₅和R₆是稠合的环戊基(cyclopenyl group)。在代表性实施方式中，该化合物选自：

本发明也提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有式(IV)化合物；或其药学上可接受的衍生物，如各立体异构体或其混合物；或其药学上可接受的盐：

式中，R₁是烷基，R₂是取代或未取代的苯基；或者取代或未取代的苯基。在一个实施方式中，该组合物还含有药学上可接受的运载体、药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的赋形剂和药学上可接受的佐剂中的至少一种。在另一实施方式中，该组合物不含可检测的二甲亚砜。
在一个实施方式中，R₁是甲基。在另一实施方式中，R₂选自：3-(硝基)苯基、2-甲氧基苯基、2-乙氧基苯基、1-苯基乙基-1-酮基或3-氯-6-甲氧基苯基。在代表性实施方式中，该化合物选自：

本发明也提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有式(V)化合物；或其药学上可接受的衍生物，如各立体异构体或其混合物；或其药学上可接受的盐：

式中，R₁选自氢或烷基；R₂选自氢或烷基；R₃是烷基；R₄选自氢、烷基、烷氧基或卤素基团；R₅选自氢、烷基、烷氧基或卤素基团。在一个实施方式中，该组合物还含有药学上可接受的运载体、药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的赋形剂和药学上可接受的佐剂中的至少一种。在另一实施方式中，该组合物不含可检测的二甲亚砜。
在一个实施方式中，R₁选自氢或甲基。在另一实施方式中，R₂选自氢或甲基。在又一实施方式中，R₃选自氢或甲基。在又一实施方式中，R₄选自氢、溴、氯或甲氧基。在又一实施方式中，R₅选自氢、溴、氯或甲氧基。在代表性实施方式中，该化合物选自：

本发明也提供了治疗患有突变-CFTR相关性疾病的对象的方法，所述方法包括给予所述对象治疗有效量的选自本发明化合物的化合物。在一些实施方式中，所述疾病是囊性纤维化。在一些实施方式中，治疗后，所述对象肺中粘液的细菌滴度降低、咳嗽或打喷嚏减少、胰功能不全减轻或汗液中电解质水平降低。在一些实施方式中，所述对象是非人动物。在特别感兴趣的实施方式中，所述动物是哺乳动物。在一些实施方式中，所述突变-CFTR是ΔF508-CFTR。
本发明也提供了提高产生突变-CFTR蛋白的细胞的离子通透性的方法，所述方法包括使所述细胞接触有效量的本发明化合物，这种接触能有效提高所述细胞CFTR-介导的离子通透性。在一些实施方式中，所述细胞含有编码所述突变-CFTR蛋白的重组表达盒。在其它实施方式中，所述细胞含有编码所述突变-CFTR蛋白的基因组。在其它实施方式中，所述突变-CFTR是ΔF508-CFTR。
本发明也提供了治疗患有突变-CFTR相关性疾病的对象的方法，所述方法包括给予所述对象治疗有效量的选自本发明化合物的化合物。在一些实施方式中，所述疾病是囊性纤维化。在一些实施方式中，治疗后，所述对象肺中粘液的细菌滴度降低、咳嗽或打喷嚏减少、胰功能不全减轻或汗液中电解质水平降低。在一些实施方式中，所述对象是非人动物。在特别感兴趣的实施方式中，所述动物是哺乳动物。在一些实施方式中，所述突变-CFTR是ΔF508-CFTR。
本发明也提供了提高产生突变-CFTR蛋白的细胞的离子通透性的方法，所述方法包括使所述细胞接触有效量的本发明化合物而提高所述细胞的离子通透性，其中所述化合物选自本发明化合物。在一些实施方式中，所述细胞含有编码所述突变-CFTR蛋白的重组表达盒。在其它实施方式中，所述细胞含有编码所述突变-CFTR蛋白的基因组。在其它实施方式中，所述离子通透性能提高离子转运活性，从而提高离子跨越所述细胞质膜转运的速率。在其它实施方式中，所述突变-CFTR是ΔF508-CFTR。
通过以下详述能明显看出本发明的这些和其它目的和优点。
附图简要说明
参照以下附图，能更充分地理解本发明，以下附图仅为说明目的。
图1显示了对象筛选步骤的示意图。用测试化合物(10μM)在37℃培育共表达ΔF508-CFTR和卤化物-敏感性YFP的FRT细胞。18-24小时后，通过在平板阅读器上测定弗司扣林(20μM)+染料木黄酮(50μM)存在下碘化物淬灭YFP荧光来检测ΔF508-CFTR的功能。
图2是显示在对照条件(37℃)下或27℃，用4-PBA(4mM)或校正化合物(10μM，37℃)培育24小时的碘离子流入的代表性轨迹。
图3的A部分显示了代表性校正化合物的化学结构，B部分显示了所示校正化合物(SE，n＝5)的剂量反应数据。
图4总结了用所示校正化合物于37℃或27℃培育表达ΔF508-CFTR的FRT细胞的最大碘离子流入(标准化至37℃对照)(SE，n＝5)。与对照细胞相比，所有化合物都引起碘离子流入显著增加(p＜0.01)。
图5显示了基底外侧膜通透后和氯离子梯度存在下测定的Ussing小室中顶端膜的氯离子流。浓度：弗司扣林(20μM)，染料木黄酮(50μM)，CFTR_inh-172(10μM)。左下角是FRT裸细胞(null cell)的测定(其它部分是表达ΔF508-CFTR的FRT细胞)。
图6A显示了用所示校正化合物校正的时程。细胞于27℃培育不同时间，用所示校正化合物或4-PBA(4mM)于37℃培育不同时间。测定弗司扣林/染料木黄酮存在下的ΔF508-CFTR活性。图B显示了用所示校正化合物校正的持续性。用所示校正化合物(或27℃)培育细胞24小时。在清洗后不同时间(或者从27℃回复到37℃)测定ΔF508-CFTR活性。
图7显示了用或不用校正化合物于37℃或27℃培育细胞时弗司扣林(20μM)或弗司扣林+染料木黄酮(50μM)的影响。
图8显示了弗司扣林剂量反应关系。用所示校正化合物于37℃或27℃培育后用弗司扣林(没有染料木黄酮)刺激表达ΔF508-CFTR的FRT细胞。
图9显示了用DMSO载体(左)或化合物corr-2b(第2条和第3条曲线)于37℃培育24小时后测定的顶端膜氯离子流。最右边的曲线显示用加入的所示化合物(20μM弗司扣林、20μM corr-2b、50μM染料木黄酮)于27℃培养细胞的结果。
图10，图A是显示所示校正化合物(10μM)对ΔF508-CFTR-C_tHA在BHK细胞中表达模式的影响的western印迹。在不存在或存在校正化合物时于37℃培养所示细胞24小时、或于27℃培养24小时。用抗-HA第一抗体和HRP-偶联的第二抗体观察CFTR有增强的化学发光。实心箭头表示复合物-糖基化形式(条带C)，空心箭头表示核心-糖基化形式(条带B)。图B显示了图A中数据的定量结果。
图11，图A显示了在图10A所示条件下在FRT细胞平行实验中用放射性抗HA抗体结合实验测定的ΔF508-CFTR的细胞表面密度对ΔF508-CFTR顶端膜流作图得到的图表。图B是显示用脉冲追踪分析测定的折叠效率的western印迹。从15分钟脉冲(P)期间掺入的放射性计算出翻译速率。为了测定折叠效率，放射脉冲细胞150分钟，然后追踪120分钟(C)。用磷光图像分析测定核心-(空心箭头)和复合物-糖基化(实心箭头)的量。图C显示了成熟效率，表示为成熟的复合物-糖基化ΔF508-CFTR相对于图B所示脉冲标记库的百分数。
图12，图A显示了在所示校正化合物存在下追踪前和追踪后3小时由抗-HA抗体结合实验测定的拯救的ΔF508-CFTR的细胞表面稳定性。图B显示了表达温度敏感型突变P574H-CFTR的FRT细胞中顶端膜氯离子流的结果。图C显示了图B的顶端膜氯离子流研究的结果。
图13显示了对ΔF508纯合对象(上面3条曲线)和非CF对象(最下面的曲线)的人呼吸道上皮细胞的原代培养物记录到的代表性短路离子流。ΔF508细胞在DMSO载体或化合物corr-4b存在下于37℃维持培养24小时，或者27℃培育。浓度：阿米洛利(10μM)、弗司扣林(20μM)、染料木黄酮(50μM)、CFTR_inh-172(10μM)。
图14，图A是如图13所示一系列实验的CFTR_inh-172可抑制短路离子流(ΔI_sc)的小结(SE，n＝12-14)。^*，P＜0.05，^**，P＜0.01。图B显示了在图13所示条件下培养的纯合N1303K-CFTR对象的人支气管上皮细胞的原代培养物记录的短路离子流。
在描述本发明之前，应理解，本发明不受所述具体实施方式的限制，因为这些实施方式可能改变。也应理解，本文所用术语的目的仅为描述具体实施方式，不意味着限制，因为本发明的范围仅受所附权利要求书限制。
应理解，除非另有明确说明，本文提供数值范围时，也特别公开了该范围上下限之间以下限单位的十分之一为间隔的各居间数值。本发明包括任何所示数值之间的较小范围或所述范围之间的数值和所述范围的任何其它或居间数值。所述范围可独立地包括或排除这些较小范围的上下限，可以特别排除这些范围的端值，以使本发明也包括所述较小范围任一端值、包括两端端值、不包括两端端值的各个范围。所述范围包括一个或两个端值时，本发明也包括排除一个或两个端值的范围。
除非另有说明，本文所用的所有科技术语具有与本发明所属领域普通技术人员所理解的相同含义。虽然类似于或等效于本文所述方法和材料的任何方法和材料均可用于实施或测试本发明，但下面描述了优选的方法和材料。将本文所述的所有发表物纳入本文作参考，与所引用发表物结合起来公开和描述本发明的方法和/或材料。应理解，本文公开的内容代替了与所引用发表物有矛盾的任何公开内容。
必须注意，除非本文另有明确说明，本文和所附权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“这种”包括复数含义。因此，例如，提到“一种化合物”包括多种所述化合物，提到“这种细胞”则包括一个或多个细胞以及本领域技术人员已知的等效形式等。
提供本文所述的发表物仅仅是因为它们在本申请的提交日期之前已公开。在本发明说明书中没有任何内容应被认为是承认本发明在所述发表物之后作出。而且，这些发表物所提供的公开日期可能不同于实际公开日期，实际公开日期可能需要独立确认。
发明详述
本发明提供了至少可用于治疗具有突变囊性纤维化跨膜传导调节(CFTR)蛋白的对象的组合物、药物制剂和方法，尤其是所述CFTR中的突变与CFTR的细胞错误加工(如折叠、运输或翻译后修饰)有关时。这种突变CFTR的一个例子是ΔF508CFTR。如果不受限于理论，本发明的化合物和方法能“校正”所述突变CFTR蛋白的细胞错误加工，可用于治疗囊性纤维化(CF)。
通常，本发明的组合物和药物制剂含有一种或多种含氮的杂芳族化合物，尤其感兴趣的是含氨基苯并噻唑的化合物、含氨基芳基噻唑的化合物、含喹唑啉基氨基嘧啶酮的化合物、含双氨基甲基联噻唑的化合物和含苯基氨基喹啉的化合物，包括类似物或其衍生物。
定义
“突变囊性纤维化跨膜传导调节蛋白”或“突变-CFTR”是相对于野生型由CFTR基因产物的突变如缺失突变、插入突变或点(取代)突变产生的蛋白质。本文所用“突变囊性纤维化跨膜传导调节蛋白”或“突变-CFTR”是与功能性(如野生型)CFTR相比其功能发生障碍的蛋白，所述功能障碍包括以下一种或多种情况：(i)CFTR产生(如转录或翻译水平)异常；(ii)折叠和/或运输异常；(iii)传导调节异常；(iv)氯传导率降低；(v)合成减少；等。“突变-CFTR基因”是编码突变-CFTR的基因或编码序列。出于本申请目的，术语“基因组”和“基因”可互换使用，如“编码突变-CFTR的基因组”和“编码突变-CFTR的基因”可互换使用。
“门控缺陷型突变囊性纤维化跨膜传导调节蛋白”或“门控缺陷型突变-CFTR”是存在于细胞表面对离子通过该通道的门控(如调节离子转运)有缺陷的突变-CFTR。因此，本文所用术语“门控缺陷型突变-CFTR”包括与(i)传导调节异常和/或(ii)氯传导率降低有关的功能障碍。
“突变-CFTR蛋白-介导的疾病”指由存在突变-CFTR如ΔF508-CFTR产生的或与其相关的任何病症、失调或疾病，或者这种病症、失调或疾病的症状，如ΔF508-CFTR的离子转运活性低于野生型CFTR而致的氯离子不通透。“突变-CFTR蛋白-介导的疾病”包括与至少一个等位基因上存在ΔF508-CFTR突变有关的患者疾病，因此包括两个等位基因上都携带ΔF508-CFTR突变的对象以及具有两种不同突变形式的CFTR的复合杂合对象，如具有一个拷贝的ΔF508-CFTR和一个拷贝的不同突变形式的CFTR的对象。
可通过特异性激活突变-CFTR的活性，如激活突变-CFTR的离子转运来治疗这种疾病、失调、疾病或其症状。ΔF508-CFTR与囊性纤维化(CF)的存在有关，国家卫生研究院网站ncbi.nlm.nih.gov上的人类孟德尔遗传在线数据库的登录号602421(名为囊性纤维化跨膜传导调节物；CFTR)和登录号219700(名为囊性纤维化；CF)描述了这种疾病，包括其症状。突变-CFTR蛋白-介导的疾病和症状包括胎粪性肠梗阻、肝病包括胆道阻塞和狭窄、胰功能不全、肺病包括慢性铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)感染和其它肺部感染、与输精管发育异常或宫颈粘液异常有关的不育以及癌症包括腺癌。患有突变-CFTR蛋白-介导的疾病的许多对象是编码ΔF508-CFTR蛋白的基因纯合子。
“ΔF508-囊性纤维化跨膜传导调节蛋白”或“ΔF508-CFTR”是缺失了CFTR基因产物中的508位苯丙氨酸残基的蛋白质。“ΔF508-CFTR基因”是编码ΔF508-CFTR的基因或编码序列。ΔF508-CFTR基因通常由于缺失了对应于编码CFTR基因产物的508位苯丙氨酸残基的三个核苷酸而产生。出于本申请目的，术语“基因组”和“基因”，如“编码ΔF508-CFTR的基因组”和“编码ΔF508-CFTR的基因”可互换使用。编码ΔF508-CFTR的基因的一个例子参见例如WO 91/02796。
本文所用的“突变-CFTR激活物”是相对于不存在该化合物时的离子转运，提高突变-CFTR的离子转运，尤其是氯离子转运水平的化合物。特别感兴趣的本发明CFTR激活物是特异性突变-CFTR激活物，如激活突变-CFTR活性而不影响CFTR细胞错误加工的化合物。突变-CFTR激活物通常是突变-CFTR的高亲和力激活物，如对突变-CFTR的亲和力为至少约1微摩尔、约1-5微摩尔、约200纳摩尔-1微摩尔、约50纳摩尔-200纳摩尔、或低于50纳摩尔。
本文所用的“门控缺陷型突变-CFTR激活物”是相对于不存在该化合物时的离子转运，提高门控缺陷型突变-CFTR的离子转运，尤其是氯离子转运水平的化合物。特别感兴趣的本发明CFTR激活物是特异性门控缺陷型突变-CFTR激活物，如激活门控缺陷型突变-CFTR活性而不影响(例如)CFTR细胞错误加工的化合物。门控缺陷型突变-CFTR激活物通常是门控缺陷型突变-CFTR的高亲和力激活物，如对门控缺陷型突变-CFTR(如ΔF508-CFTR、G551D-CFTR、G1349D-CFTR或D1152H-CFTR)的亲和力为至少约1微摩尔、约1-5微摩尔、约200纳摩尔-1微摩尔、约50纳摩尔-200纳摩尔、或低于50纳摩尔。
本文所用的“ΔF508-CFTR激活物”是相对于不存在该化合物时的离子转运，提高ΔF508-CFTR的离子转运，尤其是氯离子转运水平的化合物。特别感兴趣的本发明CFTR激活物是特异性ΔF508-CFTR激活物，如激活ΔF508-CFTR活性而不影响CFTR细胞错误加工的化合物。ΔF508-CFTR激活物通常是ΔF508-CFTR的高亲和激活物，如对ΔF508-CFTR的亲和力为至少约1微摩尔、约1-5微摩尔、约200纳摩尔-1微摩尔、约50纳摩尔-200纳摩尔、或低于50纳摩尔。
如本文所用和在囊性纤维化领域内，“突变CFTR的增效物”指能提高突变-CFTR(如ΔF508CFTR、G551D-CFTR、G1349D-CFTR或D1152H-CFTR)的离子转运基础水平的化合物，与野生型CFTR相比，突变CFTR(在不存在该化合物时)的离子转运水平异常低。同样，“突变-CFTR的增效物”指相对于不存在该化合物时突变-CFTR的离子转运能力，能提高突变-CFTR的离子转运水平的化合物。
如本文所用和在囊性纤维化领域内，“突变-CFTR的校正物”是通过校正CFTR多肽的根本缺陷，如翻译后加工(如折叠、运输或翻译后修饰，如翻译后糖基化)所产生的缺陷，与不存在该化合物时的离子转运水平相比能提高突变-CFTR的离子转运水平的化合物。特别感兴趣的本发明CFTR校正物是能促进特定突变-CFTR校正的化合物。突变-CFTR校正物通常对一种或多种突变-CFTR有高亲和力，如对突变-CFTR的亲和力为至少约1微摩尔、约1-5微摩尔、约200纳摩尔-1微摩尔、约50纳摩尔-200纳摩尔、或低于50纳摩尔。
本文所用的“联用”指在给予第一种化合物的整个给药期间给予第二种合物；其中所述第一种化合物的给药期间与所述第二种化合物的给药期间重叠，如在给予第二种化合物之前开始给予第一种化合物并且在第二种化合物给药结束前中止第一种化合物的给药；在给予第一种化合物之前开始给予第二种化合物并且在第一种化合物给药结束前中止第二种化合物的给药；在开始给予第二种化合物之前给予第一种化合物并且在第一种化合物的给药结束前中止第二种化合物的给药；在开始给予第一种化合物之前开始给予第二种化合物并且在第二种化合物的给药结束前中止第一种化合物的给药。同样，“联用”也指包括给予两种或多种化合物的方案。本文所用“联用”也指可在同一或不同制剂中、用相同或不同途径和以相同或不同的剂型给药的两种或多种化合物。
术语“分离的化合物”指与天然共存的其它化合物基本分离或相对富集的化合物。以重量计，分离的化合物的纯度通常为至少约80％，更通常为至少90％，更优选为至少98％，最优选为至少约99％。本发明应包括非对映异构体及外消旋和拆分的对映异构纯形式，以及它们的药学上可接受的盐。
疾病或疾病的“治疗”包括：(1)预防该疾病的至少一种症状，即使可能接触或易于发生该疾病但尚未经历或出现该疾病的症状的哺乳动物不产生明显临床症状，(2)抑制该疾病，即阻滞或降低该疾病或其症状的发展，或(3)缓解该疾病，即使该疾病或其临床症状消退。
“治疗有效量”或“有效量”指给予哺乳动物或其它对象治疗疾病时，足以实现所述疾病治疗的化合物用量。“治疗有效量”取决于所用化合物、所治疾病和其严重程度以及治疗对象的年龄、体重等。
术语“对象”和“患者”指可能需要本文所述的药学方法、组合物和治疗的任何哺乳动物或非哺乳动物物种的一个或多个成员。因此，对象和患者包括但不限于：灵长动物(包括人)、犬、猫、有蹄类动物(如马、牛、猪)、禽类和其它对象。特别感兴趣的是有商业价值的人类和非人动物(如家畜和圈养动物)。
“哺乳动物”指任何哺乳动物物种的一个或多个成员，包括例如：犬、猫、马、牛、羊；啮齿动物等和灵长动物，特别是人。非人动物模型，特别是哺乳动物如灵长动物、鼠类、兔类等可用于实验研究。
本文所用术语“单位剂型”指适合用作人和动物对象的单位剂量的物理上分离的单元，各单元含有经计算的预定量的本发明化合物与药学上可接受的稀释剂、运载体或载体联用时该含量足以产生所需效果。本发明新单位剂型的规格取决于所用的具体化合物和准备实现的效果，以及各化合物在宿主中的相关药效。
术语“生理条件”应包括与活细胞相容的条件，如与活细胞相容的温度、pH、盐度等的基本水环境条件。
“药学上可接受的赋形剂”、“药学上可接受的稀释剂”、“药学上可接受的运载体”和“药学上可接受的佐剂”指可用于制备通常为安全、无毒并且没有生物学或其它方面不良作用的药物组合物的赋形剂、稀释剂、运载体和佐剂，包括兽医应用以及人类药学应用上可接受的赋形剂、稀释剂、运载体和佐剂。本说明书和权利要求书所用的“药学上可接受的赋形剂、稀释剂、运载体和佐剂”包括这些赋形剂、稀释剂、运载体和佐剂中的一种或多种。
本文所用“药物组合物”应包括适合给予对象，如哺乳动物尤其是人的组合物。通常，“药物组合物”应无菌，优选不含能够在对象中引发不良反应的污染物(如药物组合物中的化合物应是药物级)。经设计，可通过多种不同给药途径将药物组合物给予需要的对象或患者，包括口服、含服、直肠、胃肠道外、腹膜内、皮内、鞘内等。在一些实施方式中，该组合物适合用除DMSO以外的渗透增强剂通过透皮途径给药。在其它实施方式中，该药物组合物适合通过除透皮给药以外的途径给药。
如本文所用，本发明化合物的“药学上可接受的衍生物”包括其盐、酯、烯醇醚、缩醛、缩酮、原酸酯、半缩醛、半缩酮、酸、碱、溶剂合物、水合物或前药。本领域技术人员运用已知的衍生化方法不难制备这些衍生物。可将所产生的化合物给予动物或人，而没有显著的毒副作用，所产生的化合物具有药物活性或是前药。
化合物的“药学上可接受的盐”指在药学上可接受并具有母体化合物的所需药理活性的盐。这种盐包括：(1)与无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或有机酸如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、延胡索酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰)苯甲酸、肉桂酸、苦杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙烷二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、葡糖庚糖酸、4，4′-亚甲基双(3-羟基-2-烯-1-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、十二烷基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等形成的酸加成盐；或(2)母体化合物中存在的酸性质子被金属离子取代或与有机碱配位所形成的盐，所述金属离子如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子；所述有机碱如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、N-甲基葡糖胺等。
本发明化合物的“药学上可接受的酯”指药学上可接受并具有母体化合物的所需药理活性的酯，包括但不限于酸性基团的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、环烷基和杂环基酯，所述酸性基团包括但不限于：羧酸、磷酸、次膦酸、磺酸、亚磺酸和硼酸。
本发明化合物的“药学上可接受的烯醇醚”指药学上可接受并具有母体化合物的所需药理活性的烯醇醚，包括但不限于式C＝C(OR)的衍生物，式中R是氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、环烷基或杂环基。
本发明化合物的“药学上可接受的烯醇酯”指药学上可接受并具有母体化合物的所需药理活性的烯醇酯，包括但不限于式C＝C(OC(O)R)的衍生物，式中R是氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、环烷基或杂环基。
本发明化合物的“药学上可接受的溶剂合物或水合物”指药学上可接受并具有母体化合物的所需药理活性的溶剂合物或水合物复合物，包括但不限于本发明化合物与一种或多种溶剂或水分子，或1-约100，或1-约10，或者1-约2、3或4种溶剂或水分子的复合物。
“前药”指将其给予哺乳动物对象时能在体内释放式(I)活性母体药物的任何化合物。通过修饰式(I)化合物中存在的官能团制备式(I)化合物的前药，可在体内切割该修饰物以释放母体化合物。前药包括式(I)化合物，其中化合物(I)中的羟基、氨基或巯基键合于可在体内被切割而分别再产生游离的羟基、氨基或巯基的任何基团。前药的例子包括但不限于：式(I)化合物中羟基官能团的酯(如乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物)、氨基甲酸酯(如N，N-二甲基氨基羰基)等。
本文所用术语“有机基团”指任何含碳的基团，包括烃基，分类为脂基、环基、芳基、其官能化衍生物和/或它们的各种组合。术语“脂基”指饱和或不饱和的直链或支链烃基，包括例如烷基、烯基和炔基。术语“烷基”指取代或未取代的饱和直链或支链烃基或链(如C₁-C₈)，包括例如：甲基、乙基、异丙基、叔丁基、庚基、异丙基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基等。合适的取代基包括羧基、保护的羧基、氨基、保护的氨基、卤素、羟基、保护的羟基、硝基、氰基、单取代氨基、保护的单取代氨基、双取代氨基、C₁-C₇烷氧基、C₁-C₇酰基、C₁-C₇酰氧基等。术语“取代的烷基”指用羟基、保护的羟基、氨基、保护的氨基、氰基、卤素、三氟甲基、单取代氨基、双取代氨基、低级烷氧基、低级烷硫基、羧基、保护的羧基、或羧基、氨基和/或羟基盐取代一至三次的上述烷基。与杂芳环的取代基联用时，术语“取代的(环烷基)烷基”和“取代的环烷基”是用与“取代的烷基”中所列基团相同的基团取代的。术语“烯基”指含有一个或多个碳-碳双键的不饱和直链或支链烃基如乙烯基。术语“炔基”指含有一个或多个碳-碳三键的不饱和直链或支链烃基。术语“环基”指闭合的环烃基，分类为脂环基、芳基或杂环基。术语“脂环基”指具有类似于脂基的特性的环烃基。术语“芳基”指单环或多环芳族烃基，可包括一个或多个杂原子，其定义如下。术语“杂环基”指环中一个或多个原子为非碳元素(如氮、氧、硫等)的闭合环烃，进一步定义见下。
“有机基团”可以被官能化，或者连接有其它官能团，如保护或无保护的羧基、氨基、羟基等。例如，术语“烷基”不仅包括纯开链饱和烃烷基取代基，如甲基、乙基、丙基、叔丁基等，而且包括还携带本领域已知的其它取代基如羟基、烷氧基、烷基磺酰基、卤原子、氰基、硝基、氨基、羧基等的烷基取代基。因此，“烷基”包括醚、酯、卤代烷基、硝基烷基、羧基烷基、羟基烷基、硫代烷基等。
术语“卤”和“卤素”指氟、氯、溴和碘基团。可以有相同或不同的一个或多个卤素。特别感兴趣的卤素包括氯和溴基团。
术语“卤代烷基”指用一个或多个卤原子取代的上述烷基。卤原子可以相同或不同。术语“二卤代烷基”指用相同或不同的两个卤基团取代的上述烷基。术语“三卤代烷基”指用相同或不同的三个卤基团取代的上述烷基。术语“全卤代烷基”指烷基中每个氢原子都被卤原子取代的上述卤代烷基。术语“全氟烷基”指烷基中每个氢原子都被氟原子取代的上述卤代烷基。
术语“环烷基”指完全饱和或部分饱和的饱和的单环、双环或三环。这种基团的例子包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、金刚烷基、环辛基、顺式-或反式萘烷、双环[2.2.1]庚-2-烯、环己-1-烯基、环戊-1-烯基、1，4-环辛二烯基等。
术语“(环烷基)烷基”指用上述环烷基环之一取代的上述烷基。这种基团的例子包括(环己基)甲基、3-(环丙基)-正丙基、5-(环戊基)己基、6-(金刚烷基)己基等。
术语“取代的苯基”指用一个或多个基团(在一些情况下是一个、两个或三个基团)取代的苯基，所述基团选自卤素、羟基、保护的羟基、氰基、硝基、三氟甲基、C₁-C₇烷基、C₁-C₇烷氧基、C₁-C₇酰基、C₁-C₇酰氧基、羧基、氧代羧基、保护的羧基、羧甲基、保护的羧甲基、羟甲基、保护的羟甲基、氨基、保护的氨基、(单取代)氨基、保护的(单取代)氨基、(双取代)氨基、羧酰胺基、保护的羧酰胺基、N-(C₁-C₆烷基)羧酰胺基、保护的N-(C₁-C₆烷基)羧酰胺基、N，N-二(C₁-C₆烷基)羧酰胺基、三氟甲基、N-((C₁-C₆烷基)磺酰基)氨基、N-(苯基磺酰基)氨基或取代或未取代的苯基，以致于产生(例如)联苯基或萘基。
术语“取代的苯基”的例子包括单-或二(卤代)苯基如2、3或4-氯苯基，2，6-二氯苯基，2，5-二氯苯基，3，4-二氯苯基，2、3或4-溴苯基，3，4-二溴苯基，3-氯-4-氟苯基，2、3或4-氟苯基等；单或二(羟基)苯基如2、3或4-羟基苯基，2，4-二羟基苯基，其保护的羟基衍生物等；硝基苯基如2、3或4-硝基苯基；氰基苯基，如2、3或4-氰基苯基；单-或二(烷基)苯基如2、3或4-甲基苯基，2，4-二甲基苯基，2、3或4-(异丙基)苯基，2、3或4-乙基苯基，2、3或4-(正丙基)苯基等；单或二(烷氧基)苯基，如2，6-二甲氧基苯基，2、3或4-(异丙氧基)苯基，2、3或4-(叔丁氧基)苯基，3-乙氧基-4-甲氧基苯基等；2、3或4-三氟甲基苯基；单-或二羧基苯基或(保护的羧基)苯基如2、3或4-羧基苯基或2，4-二(保护的羧基)苯基；单-或二(羟甲基)苯基或(保护的羟甲基)苯基如2、3或4-(保护的羟甲基)苯基或3，4-二(羟甲基)苯基；单-或二(氨基甲基)苯基或(保护的氨基甲基)苯基如2、3或4-(氨基甲基)苯基或2，4-(保护的氨基甲基)苯基；或者单-或二(N-(甲磺酰基氨基))苯基如2、3或4-(N-(甲磺酰基氨基))苯基。此外，术语“取代的苯基”也代表取代基不同的二取代的苯基，如3-甲基-4-羟基苯基、3-氯-4-羟基苯基、2-甲氧基-4-溴苯基、4-乙基-2-羟基苯基、3-羟基-4-硝基苯基、2-羟基-4-氯苯基等。
术语“(取代的苯基)烷基”指上述取代的苯基中与上述烷基中的一种相连接的基团。这种基团的例子包括例如：2-苯基-1-氯乙基、2-(4′-甲氧基苯基)乙基、4-(2′，6′-二羟基苯基)-正己基、2-(5′-氰基-3′-甲氧基苯基)-正戊基、3-(2′，6′-二甲基苯基)正丙基、4-氯-3-氨基苄基，6-(4′-甲氧基苯基)-3-羧基(正己基)，5-(4′-氨基甲基苯基)-3-(氨基甲基)-正戊基、5-苯基-3-氧代-正戊-1-基，(4-羟基萘-2-基)甲基等。
如上所述，术语“芳族”或“芳基”指六元碳环。如上所述，术语“杂芳基”指含有1-4个杂原子如氧、硫和/或氮原子(尤其是单独的氮或与硫或氧环原子一起)的任选取代的五元或六元环。
而且，上述任选取代的五元或六元环可任选地与芳族5元或6元环系统稠合。例如，这些环可任选地与芳族5元或6元环系统如吡啶或三唑系统稠合，优选与苯环稠合。
以下环系统是术语“杂芳基”表示的(取代或未取代的)杂环基团的例子：噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡咯烷基、咪唑基、异噁唑基、三唑基、噻二唑基、噁二唑基、四唑基、噻三唑基、噁三唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、噁嗪基、三嗪基、噻二嗪基四唑、1，5-[b]哒嗪基和嘌呤基，以及苯并-稠合衍生物，如苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基和吲哚基。
上述任选取代的杂芳环的取代基是1-3个卤素、三卤代甲基、氨基、保护的氨基、氨基盐、单取代氨基、双取代氨基、羧基、保护的羧基、羧酸盐、羟基、保护的羟基、羟基盐、低级烷氧基、低级烷硫基、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、(环烷基)烷基、取代的(环烷基)烷基、苯基、取代的苯基、苯基烷基和(取代的苯基)烷基。下面定义了杂芳基的取代基，或者在三卤代甲基的情况下，该取代基可以是三氟甲基、三氯甲基、三溴甲基或三碘甲基。与上述杂芳环的取代基联用时，“低级烷氧基”指C₁-C₄烷氧基，相似地，“低级烷硫基”指C₁-C₄烷硫基。
术语“(单取代)氨基”指含有一个取代基的氨基，所述取代基选自苯基、取代的苯基、烷基、取代烷基、C₁-C₄酰基、C₂-C₇烯基、取代的C₂-C₇烯基、C₂-C₇炔基、C₇-C₁₆烷芳基、取代的C₇-C₁₆烷芳基或杂芳基。(单取代)氨基还可具有氨基保护基，如术语“保护的(单取代)氨基”所述。术语“(双取代)氨基”指含有两个取代基的氨基，所述取代基选自：苯基、取代的苯基、烷基、取代烷基、C₁-C₇酰基、C₂-C₇烯基、C₂-C₇炔基、C₇-C₁₆烷基芳基、取代的C₇-C₁₆烷基芳基或杂芳基。这两个取代基可以相同或不同。
术语“杂芳基(烷基)”指用上述杂芳基在任意位置上取代的上述烷基。
“任选的”或“任选地”指紧接其后描述的事件、情况、特征或要素可能但不一定发生，此词语包括上述的事件或情况可发生和不发生。例如，“任选地用烷基单取代或双取代的杂环基”指可能但不一定存在此烷基，此短语包括用烷基单取代或双取代杂环基和不用烷基取代杂环基。
分子式相同但特性或原子键合顺序或原子的空间排列不同的化合物称为“异构体”。原子空间排列不同的异构体称为“立体异构体”。不互为镜像的立体异构体称为“非对映异构体”，彼此的镜像无法重叠的立体异构体称为“对映异构体”。当化合物有不对称中心时，例如，连接有四种不同基团时，可能出现一对对映异构体。对映异构体的特征为其不对称中心的绝对构型，可用Cahn和Prelog的R-和S-顺序法则表述，或用分子旋转偏振光平面称为右旋或左旋(即(+)或(-)-异构体)的方式表述。手性化合物可以一种对映异构体或两种的混合物存在。含有等比例的两种对映异构体的混合物称为“外消旋混合物”。
本发明化合物可具有一个或多个不对称中心；因此，产生的所述化合物可以是(R)-或(S)-立体异构体中的一种或其混合物。除非另有说明，本说明书和权利要求书中的具体化合物的描述或命名包括各自的对映异构体和外消旋体或其它形式和它们的混合物。测定立体化学和分离立体异构体的方法是本领域熟知的(参见例如，“Advanced Organic Chemistry”(高级有机化学)，第4版，J.March，John Wiley&Sons，纽约，1992中第4章的讨论)。
概述
本发明依据发现了能提高突变的囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(突变-CFTR)如ΔF508-CFTR的离子转运的化合物。发现这种化合物可用于治疗突变-CFTR-介导的疾病和疾病，如囊性纤维化(CF)的方法。发现这种化合物也可用于研究CFTR离子转运，尤其是ΔF508-CFTR的离子转运。
在一个实施方式中，本发明提供了能校正突变的囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(如ΔF508CFTR)的细胞加工(如折叠、运输或翻译后修饰)的高亲和力小分子化合物。本发明考虑的化合物包括以下结构类型：(1)含氨基苯并噻唑的化合物；(2)含氨基芳基噻唑的化合物；(3)含喹唑啉基氨基嘧啶酮的化合物；(4)含双氨基甲基联噻唑的化合物；和(5)含苯基氨基喹啉的化合物。
根据设计用于鉴定能校正突变-CFTR的细胞加工(如折叠或运输)的化合物的实验筛选大量候选化合物，从而发现了该主题化合物。通过筛选150,000种化学上不同的化合物，鉴定到几种化合物和类似物是突变-CFTR的有效增效物。主题化合物在化学性质和结构上与目前已知能提高突变-CFTR活性的化合物无关。
下面开始更详细地描述本发明的组合物和方法。
组合物
含2-氨基苯并噻唑的化合物
在某些实施方式中，本发明的校正化合物是本文所述的含2-氨基苯并噻唑的化合物，其含有取代的氨基苯并噻唑基。在特定实施方式中，主题化合物通常是下式(I)的化合物或其各立体异构体或其混合物的药学上可接受的衍生物：

式中，R₁独立地选自：氢或与R₂稠合的C(＝O或＝S)NH基团，R₂独立地选自：连接于取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基或者取代或未取代的芳环和取代或未取代的杂芳环的N＝CH或N-烷基。下面更详细地描述R₁和R₂的示范性取代。
在某些实施方式中，含2-氨基苯并噻唑的化合物通常是式(I)化合物，式中，R₁是氢。这种化合物通常是式(Ia)化合物或其各立体异构体或其混合物的药学上可接受的衍生物：

式中，R₃独立地选自取代或未取代的苯基，R₄是烷基如取代或未取代的饱和直链或支链烃基或链(如C₁-C₈)，包括例如：甲基、乙基、异丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基。下面更详细地描述R₃和R₄的示范性取代。
在一些实施方式中，R₃独立地选自未取代的苯基、未取代的联苯基或取代的苯基，如单-或二-(烷基)苯基、单-或二-(烷氧基)苯基、单-或二-(羟基)苯基、单-或二-(卤代)苯基、单-或二-(烯基)苯基、单-或二-(硝基)苯基、单(烷基)-单(烷氧基)苯基、二(烷氧基)-单(卤代)苯基和单(硝基)-单(烷基)苯基；R₄独立地选自氢或低级烷基，如甲基和乙基。
在代表性实施方式中，R₃独立地选自：单-(烷氧基)苯基如4-(甲氧基)苯基、单-(硝基)苯基如3-(硝基)苯基或4-(硝基)苯基、或单(卤代)苯基如4-(氯)苯基，R₄独立地选自：氢或低级烷基如甲基和乙基。
在某些实施方式中，含2-氨基苯并噻唑的化合物通常为式(I)化合物，式中，R₁和R₂是含有R₅和R₆基团的稠合硫酮取代的三唑烷环。这种化合物通常是式(Ib)化合物或其各立体异构体或其混合物的药学上可接受的衍生物：

式中，R₅和R₆独立地选自取代或未取代的烷基如取代或未取代的饱和直链或支链烃基或链(如C₁-C₈)，包括例如：甲基、乙基、异丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基或者或未取代的环烷基环。下面更详细地描述R₅和R₆的示范性取代。
在一些实施方式中，R₅是低级烷基(如C₁-C₄)如甲基和乙基，R₆是低级烷基(如C₁-C₄)如甲基和乙基。在其它实施方式中，R₅和R₆是取代或未取代的环烷基，如(烷基)环烷基、如叔(丁基)环己烷基。
在本发明的一些实施方式中，含2-氨基苯并噻唑的化合物可包括下式化合物：

含2-氨基-4-芳基噻唑的化合物
在某些实施方式中，本发明校正化合物是本文所述的含2-氨基-4-芳基噻唑的化合物，其含有氨基取代的芳基噻唑基。在特定实施方式中，主题化合物通常是下式(II)的化合物；或其各立体异构体或其混合物的药学上可接受的衍生物：

式中，R₁独立地选自取代或未取代的苯基；R₂独立地选自氢或烷基，如取代或未取代的饱和直链或支链烃基或链(如C₁-C₈)，包括例如：甲基、乙基、异丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基；R₃独立地选自：取代或未取代的苯基、取代或未取代的杂芳基、取代的氨基、取代的酮基。下面更详细地描述R₁、R₂和R₃的示范性取代。
在某些实施方式中，R₁独立地选自：未取代的苯基、未取代的联苯基或取代的苯基，如单-或二-(烷基)苯基、单-或二-(烷氧基)苯基、单-或二-(羟基)苯基、单-或二-(卤代)苯基、单-或二-(烯基)苯基、单-或二-(硝基)苯基、单(烷基)-单(烷氧基)苯基、二(烷氧基)-单(卤代)苯基和单(硝基)-单(烷基)苯基；R₂独立地选自氢或低级烷基(如C₁-C₄)，如甲基和乙基；R₃独立地选自：未取代的苯基，取代的苯基如单-或二-(卤代)苯基、单-或二-(烷基)苯基、单-或二-(烷氧基)苯基、单(酰胺)苯基或者单-或二-(烷氧基)-单-或二-(卤代)苯基，未取代的杂芳基如嘧啶，取代的杂芳基如单-或二-(烷基)嘧啶，取代的氨基如单(烯基)氨基或取代的酰基如酰基-噻吩基，酰基，未取代的苯基，取代的苯基如单-或二-(卤代)苯基、单-或二-(烷基)苯基、单-或二-(烷氧基)苯基、单(酰胺)苯基或者单-或二-(烷氧基)-单-或二-(卤代)苯基，或者酰基烷硫基-咪唑-(5-未取代的苯基，取代的苯基如单-或二-(卤代)苯基、单-或二-(烷基)苯基、单-或二-(烷氧基)苯基、单(酰胺)苯基或者单-或二-(烷氧基)-单-或二-(卤代)苯基或其药学上可接受的衍生物，其各立体异构体或其混合物。
在代表性实施方式中，R₁独立地选自：未取代的苯基，未取代的联苯基，二-(甲基)苯基如3，4-二(甲基)苯基，单-(甲基)苯基如4-(甲基)苯基，二-(甲氧基)苯基如3，4-二(甲氧基)苯基，二-(羟基)苯基如3，4-二(羟基)苯基，单-(溴)苯基如4-(溴)苯基，单-(丙烯)苯基如4-(丙烯)苯基，单(甲基)-单(甲氧基)苯基如3-(甲基)-4-(甲氧基)苯基或单(硝基)-单(甲基)苯基如3-(硝基)-4(甲基)苯基；R₂独立地选自氢或甲基。
在代表性实施方式中，R₃独立地选自：未取代的苯基，单-(氯)苯基如3-(氯)苯基，单-(氟)苯基如4-(氟)苯基，单-(甲基)苯基如2-(甲基)苯基，单-(乙氧基)苯基如2-(乙氧基)苯基，二(甲氧基)-单(氯)苯基如2，5-二(甲氧基)-4-(氯)苯基，单-(乙酰胺)苯基如4-(乙酰胺)苯基，未取代的嘧啶基，单-(甲基)嘧啶基如3-(甲基)嘧啶基，二(甲基)亚丁基胺基，酰基噻吩基，酰基(4-叔丁基-苯基)基团或酰基甲硫基-咪唑-5-苯基。
在本发明的一些实施方式中，含2-氨基-4-芳基噻唑的化合物可包括下式化合物：

含2-喹唑啉基-4-氨基嘧啶酮的化合物
在某些实施方式中，本发明校正化合物是本文所述的含2-喹唑啉基-4-氨基嘧啶酮的化合物，其含有取代或未取代的喹唑啉基和取代或未取代的嘧啶基。在特定实施方式中，主题化合物通常是下式(III)的化合物；或其各立体异构体或其混合物的药学上可接受的衍生物：

式中，R₁和R₂独立地选自氢、烷基如取代或未取代的饱和直链或支链烃基或链(如C₁-C₈)，包括例如：甲基、乙基、异丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基，烷氧基如甲氧基、乙氧基、丙氧基；R₃是烷基如取代或未取代的饱和直链或支链烃基或链(如C₁-C₈)，包括例如：甲基、乙基、异丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基；R₄独立地选自羟基或羰基；R₅和R₆独立地选自稠合环烷基、氢、烷基如取代或未取代的饱和直链或支链烃基或链(如C₁-C₈)，包括例如：甲基、乙基、异丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基或者取代或未取代的苯基，或者取代或未取代的(杂环烷基)烷基。以下更详细地描述R₁、R₂、R₃、R₄、R₅和R₆的示范性取代。
在某些实施方式中，R₁独立地选自：氢、低级烷基(如C₁-C₄)如甲基或乙基、或者烷氧基如甲氧基或乙氧基；R₂独立地选自：氢、低级烷基(如C₁-C₄)如甲基或乙基或者烷氧基如甲氧基或乙氧基；R₃独立地选自低级烷基(如C₁-C₄)如甲基或乙基；R₄独立地选自羟基或羰基；R₅和R₆独立地选自稠合环烷基如环戊基(cyclopenyl group)、氢、低级烷基(如C₁-C₄)如甲基或乙基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的(杂环烷基)烷基如2-甲硫基-1H-苯并咪唑基。
在本发明的一些实施方式中，所述含2-喹唑啉基-4-氨基嘧啶酮的化合物可包括下式化合物：

含双氨基甲基联噻唑的化合物
在某些实施方式中，本发明校正化合物是本文所述的含双氨基甲基联噻唑的化合物，其含有取代的联噻唑基团和未取代的杂芳基。在特定实施方式中，主题化合物通常是下式(IV)的化合物；或其各立体异构体或其混合物的药学上可接受的衍生物：

式中，R₁是烷基如取代或未取代的饱和直链或支链烃基或链(如C₁-C₈)，包括例如：甲基、乙基、异丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基；R₂是取代或未取代的苯基。下面更详细地描述R₁和R₂的示范性取代。
在某些实施方式中，R₁是低级烷基(如C₁-C₄)如甲基；R₂是含有烷氧基如甲氧基或乙氧基、卤素如氯或溴、硝基或者取代或未取代的饱和直链或支链烃基或链(如C₁-C₈)酮基如乙酮基、丙酮基、丁酮基或戊酮基的单-或二-取代的苯基。在代表性实施方式中，R₁是甲基，R₂独立地选自：单-或二-取代的苯基如单(硝基)苯基；单(烷氧基)苯基如2-、3-、4-或5-甲氧基苯基或2-、3-、4-或5-乙氧基苯基，单(酮)苯基如1-苯基丙-1-酮或1-苯基乙基-1-酮；或者二-取代的苯基如2-、3-、4-或5-(卤代)-2-、3-、4-或5-(烷氧基)苯基如3-氯-6-甲氧基苯基。
在本发明的一些实施方式中，所述含双氨基甲基联噻唑的化合物可包括下式化合物：

含2-(N-苯基氨基)喹啉的化合物
在某些实施方式中，本发明校正化合物是本文所述含2-(N-苯基氨基)喹啉的化合物，其含有取代或未取代的苯基和取代的喹啉基。在特定实施方式中，主题化合物通常为下式(V)描述的化合物；或其各立体异构体或其混合物的药学上可接受的衍生物：

式中，R₁独立地选自：氢或烷基如取代或未取代的饱和直链或支链烃基或链(如C₁-C₈)，包括例如：甲基、乙基、异丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基；R₂独立地选自：氢或烷基如取代或未取代的饱和直链或支链烃基或链(如C₁-C₈)，包括例如：甲基、乙基、异丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基；R₃是烷基如取代或未取代的饱和直链或支链烃基或链(如C₁-C₈)，包括例如：甲基、乙基、异丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基；R₄独立地选自：氢或烷基如取代或未取代的饱和直链或支链烃基或链(如C₁-C₈)，包括例如：甲基、乙基、异丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基或烷氧基如甲氧基或乙氧基，或卤素如溴、氯、氟；R₅独立地选自：氢或烷基如取代或未取代的饱和直链或支链烃基或链(如C₁-C₈)，包括例如：甲基、乙基、异丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基或烷氧基如甲氧基或乙氧基，或卤素如溴、氯、氟。下面更详细地描述R₁、R₂、R₃、R₄和R₅的示范性取代。
在某些实施方式中，R₁独立地选自：氢或低级烷基(如C₁-C₄)如甲基；R₂独立地是氢或低级烷基(如C₁-C₄)如甲基；R₃独立地是氢或低级烷基(如C₁-C₄)如甲基；R₄独立地选自：氢、卤素如溴或氯、或者烷氧基如甲氧基或乙氧基；R₅独立地选自：氢、卤素如溴或氯、或者烷氧基如甲氧基或乙氧基。
在本发明的一些实施方式中，含2-(N-苯基氨基)喹啉的化合物可包括下式化合物：

类似物和衍生化合物
本发明也提供了上述主题化合物的类似物和衍生物。术语“类似物”和“衍生物”指与本发明主题化合物结构上相似或具有与本发明主题化合物相同的功能或活性的分子。可筛选主题化合物的类似物和衍生物中能有效校正突变的CFTR如ΔF508-CFTR的折叠或细胞加工的化合物。
在一些实施方式中，可用计算机建模筛选类似物或衍生物的3维文库中能够结合和校正突变的CFTR如ΔF508-CFTR的折叠或细胞加工的化合物。适用于本方法的示范性计算机建模程序是PREDICT^TM 3D建模技术(Predix Pharmaceuticals，WoburnMA)，更详细的内容参见Becker等，PNAS 101(31)：11304-11309(2004)。
本发明化合物的剂型
在药物剂型中，本发明主题化合物可以其药学上可接受的盐形式给药，或者也可单独使用或以适当结合的形式使用，也可与其它药物活性化合物联用。以下方法和赋形剂仅为示范性，而非限制性。
可采用适用于递送常规药物的常规方法和途径，包括全身或局部途径将药物给予宿主。通常，本发明考虑的给药途径包括但不限于：肠、胃肠道外或吸入途径，如肺内或鼻内递送。
常规的药学上可接受的给药途径包括鼻内、肺内、肌肉内、气管内、肿瘤内、皮下、皮内、局部应用、静脉内、直肠、经鼻、口服和其它胃肠道外给药途径。如果需要，可联合各给药途径，或根据药物和/或所需效果调整给药途径。可给予单剂量或多剂量的所述组合物。
在特别感兴趣的实施方式中，通过肺内吸入以气雾剂给予本发明化合物。可用可接受的加压推进剂如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等配制本发明化合物。
设计用于治疗产品肺内递送的机械装置包括但不限于：喷雾器、计量吸入器和粉末吸入器，所有这些装置都是本领域技术人员熟悉的。适合实施本发明的市售装置的具体离子是Mallinckrodt，Inc.，密苏里州圣路易斯生产的Ultravent喷雾器；Marquest Medical Products，Englewood，Colo.生产的Acorn II喷雾器；Glaxo Inc.，Research Triangle Park，北卡罗来纳州生产的Ventolin计量吸入器；Fisons Corp.，马萨诸塞州贝德福德生产的Spinhaler粉末吸入器；Inhale Therapeutic Systems，Inc.，加利福尼亚州圣卡洛斯的“驻云”装置；Alkennes，马萨诸塞州剑桥生产的AIR吸入器；和Aradigm Corporation，加利福尼亚州海达德生产的AERx肺部药物递送系统。特别感兴趣的是PARI Respiratory Equipment，Inc.，加利福尼亚蒙特里的和PARI BABY^TM喷雾器。
用于计量吸入器装置的制剂通常为细粒粉末。可通过冻干液体混合制剂然后研磨来制备这种粉末，也可含有稳定剂如人血清白蛋白(HSA)。一般加入0.5％(w/w)以上HSA。此外，如果需要可将一种或多种糖或糖醇加入该制剂中。例子包括乳糖、麦芽糖、甘露醇、山梨糖醇、山梨糖、海藻糖、木糖醇和木糖。加入该制剂中的用量范围是该混合物的约0.01-200％(w/w)，优选约1-50％。然后冻干该制剂，研磨至所需粒度。
然后，将粒度适当的颗粒悬浮于用表面活性剂加强的推进剂中。推进剂可以是用于此目的的任何常规材料，如氯氟烃、氢氯氟烃、氢氟烃或烃，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷或它们的组合。合适的表面活性剂可包括山梨聚糖三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可用作表面活性剂。然后，可将此混合物加到递送装置中。适用于本发明的市售计量吸入器的例子是Glaxo Inc.，Research Triangle Park，N.C.生产的Ventolin计量吸入器。
用于粉末吸入器的制剂包含含有偶联物的细分干粉，也可包含填充剂，如乳糖、山梨糖醇、蔗糖或甘露醇，其含量应能促进粉末从该装置喷散，如占制剂重量的50％-90％。在肺中具有气动特性的粉末颗粒对应于密度约1g/cm.sup.2，直径中值小于10微米，优选0.5-5微米，最优选1.5-3.5微米的颗粒。适用于本文所述内容的粉末吸入器的例子是Fisons Corp.，马萨诸塞州贝德福德生产的Spinhaler粉末吸入器。可用美国专利5,997,848、5,993,783、5,985,248、5,976574、5,922,354、5,785,049和5,654,007所述的方法产生和/或递送用于这些装置的粉末。
就口服制剂而言，主题化合物可单独使用或加入合适添加剂制成片剂、粉末剂、粒剂或胶囊。常规添加剂如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉；粘合剂如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠；润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁；如果需要，还可加入稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂和调味剂。
吸入给药以外的胃肠道外给药途径包括但不限于：局部、透皮、皮下、肌肉内、眼窝内、囊内、脊柱内、胸骨内和静脉内途径，即消化道以外的任何给药途径。可进行胃肠道外给药以实现药物的全身或局部递送。需要全身递送时，给药一般包括侵入性或全身吸收的经局部或粘膜给予药物制剂。
通过皮肤或粘膜的给药方法包括但不限于：局部施用合适的药物制剂、透皮递送、注射和表皮给药。在透皮递送中，采用吸收促进剂或离子电渗是合适的方法。离子电渗递送可用市售“贴剂”完成，这种剂型能通过电脉冲将其产物连续递送几天或更长时间而不需破损皮肤。
可用水性或非水性溶剂如植物油或其它类似油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇溶解、悬浮或乳化本发明主题化合物，将其配制到注射用制剂中；如果需要，可加入常规添加剂如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。
也可通过肠道给药将该药物递送给对象。肠道给药途径包括但不限于：口服和直肠(如采用栓剂)递送。
而且，可通过与各种碱如乳化碱或水溶性碱混合将主题化合物制成栓剂。可通过直肠栓剂给予本发明化合物。栓剂可包括载体如可可油、碳蜡和聚乙二醇，它们可在体温下融化，但在室温下为固体。
本发明化合物的剂量
根据所治疗的对象和疾病以及给药途径，可以(例如)每天0.1μg-10mg/kg体重的剂量给予主题化合物。剂量范围很广，因为不同哺乳动物的疗效通常差异很大，人用剂量一般比大鼠用剂量小20、30或40倍(每单位体重)。相似地，给药方式可能对剂量有很大影响。因此，例如，口服剂量可能约为注射剂量的十倍。局部递送途径可能要用更高的剂量。
典型剂型可以是适用于静脉内给药的溶液；每天服用2-6次的片剂，或每天服用一次的一次释放胶囊或片剂，其含有含量比例较高的活性成分等。可采用在不同pH值下溶解的胶囊材料、依靠渗透压缓慢释放的胶囊或任何其它已知的控释方式获得时间-释放效应。
本领域技术人员不难理解，剂量水平随具体化合物、症状的严重性和对象对副作用的易感性而不同。本领域技术人员不难通过各种方式确定给定化合物的优选剂量。
虽然所用剂量取决于要实现的临床目标，但合适剂量范围是提供至多约1μg-1,000μg或约10,000μg主题组合物以减轻动物对象的症状的剂量范围。
可提供用于口服或直肠给药的单位剂型如糖浆、酏剂和悬液，其中各剂量单位如茶匙、汤匙、片剂或栓剂含有预定量的组合物，所述组合物含有一种或多种本发明化合物。相似地，用于注射或静脉内给药的单位剂型可包含用无菌水、生理盐水或另一种药学上可接受的载体作为溶液配制化合物的组合物。
用本发明化合物进行联合治疗
在用于所述方法时，可将主题化合物与其它药学活性制剂配制在一起或联合给药，所述其它药学活性制剂包括其它突变CFTR的激活剂或突变-CFTR的增效剂。可用主题化合物提高另一种化学物质如药物(如其它的CFTR-激活剂，或门控缺陷型突变-CFTR的增效剂)的药效，或减少产生所需生物学作用的另一种化学物质如药物(如其它CFTR-激活剂)的用量。
其它CFTR激活剂的例子包括但不限于：胞内cAMP水平提高剂，例如但不限于：弗司扣林、咯利普兰、8-溴-cAMP、茶碱、罂粟碱、cAMP和其盐、类似物或衍生物。其它例子包括β激动剂、妥布拉霉素(Chiron Inc.，Emeryville，加州)和姜黄素(Egan等，(2004)Science 304：600-603)。突变-CFTR的增效剂例子包括但不限于：含有苯基甘氨酸的化合物和含有磺酰胺的化合物，其更详细的描述参见2004年6月4日提交的美国临时专利申请序列号60/576,966，全文纳入本文作参考。
上述化合物也可与其它CF治疗剂联用，包括口服皮质类固醇、布洛芬、利巴韦林(ribovarin)或抗生素如双氯西林、头孢菌素、头孢氨苄、红霉素、阿莫西林-克拉维酸、氨苄青霉素、四环素、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、氯霉素环丙沙星、妥布拉霉素、庆大霉素、头孢菌素、单环β-内酰胺类等。
用于与本发明化合物联合治疗的本文所述化合物可通过与本发明化合物给药途径相同的途径给药(如肺内、口服、肠道等)。或者，用于与本发明化合物联合治疗的化合物可通过不同于本发明化合物给药途径的途径给药。
药盒
提供了含有单位剂量，通常是口服或注射剂量的主题化合物的药盒。在这种药盒中，除了含有该单位剂量的容器外，还有描述该药物在治疗感兴趣病理疾病中的应用和伴随益处的信息性药品说明书。优选的化合物和单位剂量如上所述。
方法
提高突变-CFTR细胞的氯离子通透性的方法
本发明提供了提高含有感兴趣的折叠或加工缺陷性突变-CFTR，如含有特别感兴趣的ΔF508-CFTR而产生突变-CFTR蛋白的细胞的离子通透性的方法。通常，该方法包括使所述细胞接触有效量的能校正突变-CFTR蛋白的折叠或加工缺陷而提高该细胞离子通透性的化合物。在特别感兴趣的一个实施方式中，将本发明化合物与第二种突变-CFTR激活物或增效物联合用于该方法。
在许多实施方式中，细胞突变-CFTR蛋白存在于细胞质膜上。检测质膜上存在突变-CFTR蛋白的方法是本领域熟知的，可包括但不限于(例如)用荧光、化学或生物标签标记结合于CFTR蛋白的分子。结合于CFTR蛋白的分子的例子包括但不限于：抗体(单克隆和多克隆)、FAB片段、人源化抗体和嵌合抗体。美国专利号6,201,107中公开了结合于CFTR蛋白的抗体的一个例子。
在许多实施方式中，为提高细胞对氯离子的通透性，使该细胞接触本发明化合物，特别是与突变-CFTR激活物或增效物联合提供时，能提高该细胞的跨质膜转运氯离子的速率。使所述细胞接触本发明化合物通常能提高突变-CFTR蛋白的活性，从而增加离子转运。
在大多数实施方式中，突变-CFTR的离子转运活性或细胞对离子的通透性可提高至多约10％、至多约20％、至多约50％、至多约100％、至多约150％、至多约200％、至多约300％、至多约400％、至多约500％、至多约800％或至多约1000％或更高。在某些实施方式中，某细胞检测不到突变-CFTR的离子转运活性或细胞对离子的通透性时，使该细胞接触本发明化合物即可导致检测到突变-CFTR的活性或细胞对离子的通透性。
可用任何方便的方法测定突变-CFTR和/或离子通透性的激活，这些方法可采用分子标记物，如卤化物敏感性GFP或另一种分子标记物(如Galietta等，(2001)FEBS Lett.499，220-224)、膜片钳实验和短路试验。
合适的细胞包括含有内源性或引入的突变-CFTR基因的细胞。合适细胞包括携带含有表达突变-CFTR的表达盒的构建物的哺乳动物细胞系统(如COS、CHO、BHK、293、3T3细胞等)。本发明方法所用的细胞可以是体内、离体或体外存在的细胞。本文所用术语“表达盒”指编码突变-CFTR蛋白如ΔF508-CFTR的遗传序列，如DNA或RNA。将表达盒引入细胞的方法是本领域熟知的，参见例如，Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)。Cold Spring HarborLaboratory Press，NY，第1、2、3卷(1989)。
治疗囊性纤维化的方法
本发明也提供了治疗患有突变-CFTR相关性疾病如囊性纤维化的对象的方法。通常，该方法包括给予所述对象有效量的激活突变-CFTR蛋白以提高离子转运的本发明化合物来治疗该疾病。在特别感兴趣的实施方式中，本发明化合物与第二种突变-CFTR激活物或增效物，如提高胞内cAMP的化合物，如弗司扣林、含有苯基甘氨酸的化合物或含有磺酰胺的化合物联合给药。
本文所述化合物可用于治疗突变-CFTR-介导的疾病，如与野生型CFTR相比，因突变-CFTR的存在和/或活性(如突变-CFTR的离子转运活性)所产生的任何疾病、失调或疾病，或者这些疾病、失调或疾病的症状。这些疾病、失调、疾病或其症状可通过校正突变-CFTR的折叠或细胞加工如活化突变-CFTR的氯离子转运的治疗而缓解。囊性纤维化是与突变-CFTR如ΔF508-CFTR有关的遗传病，是可用本发明化合物治疗疾病的一个例子。特别感兴趣的是将本发明化合物与第二种突变CFTR激活物或增效物联用。
囊性纤维化多发于婴儿、儿童和青年，病人有广泛的外分泌腺功能障碍，特征症状是慢性肺病(由于呼吸道产生过多粘液)、胰腺功能不全、汗液中电解质水平异常高和偶发的胆汁性肝硬化。与该疾病相关的还有肺抵抗细菌感染的免疫防御失效。
在病理学上，胰腺显示出无定形嗜曙红结石造成的胰管阻塞，结果是胰酶缺乏，导致脂肪痢和氮溢及小肠吸收不良。涉及器官和腺体系统的程度可能差异很大，结果是临床表现有很大差异。
几乎所有外分泌腺都受到分布和严重程度不同的囊肿性纤维化影响。涉及的腺体有三种类型：腺囊腔被粘性或固体嗜曙红物质阻塞类型(胰腺、肠腺、肝内胆管、胆囊、颔下腺)；组织学异常分泌物产生过量类型(气管支气管腺体和Brunner腺体)；组织学正常但钠和氯分泌过量类型(汗腺、腮腺和小唾液腺)。十二指肠粘性分泌物，含有异常的粘多糖。98％的成年男性不育继发于输精管发育异常或其它形式的阻塞性无精子症。女性不孕减少继发于宫颈粘性分泌物，但许多患有CF的女性能怀孕至足月。然而，母亲的并发症发病率增加。
50％肺囊性纤维化患者通常有反复或慢性肺部感染相关的慢性咳嗽和哮喘。咳嗽是最棘手的主诉，常伴有多痰、恶心、呕吐和睡眠紊乱。随着疾病发展，会发生肋间隔缩小、需使用辅助呼吸肌肉、桶状胸畸形、杵状指和发绀。上呼吸道症状包括鼻息肉和慢性或反复性鼻窦炎。青少年可能发生生长停滞、青春期延迟和运动耐量下降。青少年和成年人中的肺部并发症包括继发于肺高血压的气胸、咯血和右心心力衰竭。
在临床上，85-90％的CF患者显示胰功能不全，通常在生命早期出现，并且可能是进行性的。表现包括常常排出松散、恶臭的油性粪便；腹部隆起；生长模式差，皮下组织和肌肉量减少，但食欲正常或贪吃。20％未治疗的婴儿和学步儿童可发生直肠脱垂。临床表现可能与缺乏脂溶性维生素有关。
天气热时出汗过多或发热可导致发生低渗性脱水和循环衰竭。在干旱天气中，婴儿可能出现慢性代谢性碱中毒。皮肤上形成盐结晶和呈咸味说明很可能患有CF。
10％的CF成年患者发生胰岛素-依赖性糖尿病，4-5％的青少年和成年人可发生伴有血管曲张和门静脉高压的多发性小叶胆汁性肝硬化。慢性和/或反复发作的腹痛可能与肠套叠、消化性溃疡、阑尾周围脓肿、胰腺炎、胃食管反流、食道炎、胆囊疾病或继发于异常粘性粪便的部分肠梗阻。炎性并发症可包括血管炎和关节炎。
可采用本发明化合物，或联用这种化合物与特别感兴趣的第二种突变-CFTR激活物或增效物来治疗CF的任何上述症状。
可用上述方法治疗人或动物的CF和其症状。本领域已知几种CF动物模型。例如，Engelhardt等(J.Clin.Invest.90：2598-2607，1992)将支气管异种移植物移植到大鼠气管上和植入裸小鼠，开发了人气道的动物模型。近年生产了囊性纤维化的转基因模型(如Clarke等，Science 257：1125-1128，1992；Dorin等，Nature 359：211-215，1992)。随着近年来核酸转移和干细胞转化技术的进展，有可能通过改变各种动物的野生型CFTR基因使其成为突变-CFTR基因。
许多动物都显示有人类的CF症状。具体说，许多动物具有可以检测出的气道和肠道上皮离子通透性缺陷，类似于在人CF组织中所见的那些缺陷，和易于感染细菌。而且，大多数缺陷小鼠的肠道病理学类似于胎粪性肠梗阻。此外，似乎杂合子之间杂交产生的幼仔无出生前丧失。
适合用本发明方法治疗的动物包括患有突变-CFTR相关疾病的任何动物，特别是哺乳动物，如非人灵长动物(如猴、黑猩猩、大猩猩等)、啮齿动物(如大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂等)、兔类、猪类(如猪、小型猪)、马、犬、猫等。特别感兴趣的是大型动物。也可采用转基因哺乳动物，如含有嵌合基因序列的哺乳动物。制备转基因动物的方法是本领域熟知的，参见例如，美国专利号5,614,396。一个具有CFTR缺陷的转基因小鼠的例子参见(例如)WO 94/04669。
可测试这些动物，以本发明主题化合物的活性和效力。通过(例如)在治疗前和治疗期间监测对象的最大肺活量(FVC)、一氧化碳扩散容量(DL_CO)和/或静息时室内空气pO₂＞55mmHg来评估肺功能的改善。一种或多种这些参数的显著改善表明有效。普通护理人员(如临床医生)熟知，可根据各种因素(如患者依赖性因素如疾病严重性等)、给予的化合物等调整给药方案和剂量，从而向患者提供最优疗效。
适合治疗的对象
适合用本发明方法治疗的对象包括患有因突变-CFTR(通常有两个等位基因突变的CFTR)的存在而导致或与其相关的突变-CFTR蛋白-介导的疾病、失调或疾病，或有这些疾病、失调或疾病症状的个体。而且，适合用本发明方法治疗的对象包括患有囊性纤维化(CF)的个体。在许多实施方式中，特别感兴趣的是治疗患CF的人。
突变-CFTR蛋白-介导的疾病的症状包括胎粪性肠梗阻，肝病，包括胆道阻塞和和狭窄、胰功能不全、肺病包括慢性铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)感染和其它肺部感染、与输精管发育异常或宫颈粘液异常有关的不育以及癌症包括腺癌。
本发明化合物通过提高突变-CFTR如ΔF508-CFTR介导的低水平离子转运而影响突变-CFTR的离子转运能力。同样，本发明化合物在临床上特别可用于治疗因CFTR基因的突变所产生的突变-CFTR在质膜中表达、并且由于折叠或细胞加工缺陷导致其氯传导能力降低(即该突变-CFTR是折叠或细胞加工缺陷型)类型的CF患者。同样，在临床上，本发明化合物可用于治疗具有折叠或细胞加工突变的-CFTR如ΔF508-CFTR的CF患者。此外，在临床上，本发明化合物与激活门控缺陷型突变-CFTR如ΔF508-CFTR或提高其效力的化合物G551D-CFTR、G1349D-CFTR或D1152H-CFTR来治疗CF患者。
与CF有关的CFTR突变是本领域熟知的。根据CFTR蛋白，可将这些突变分为五大类。这些CFTR功能障碍类型包括CFTR产生有限(如转录和/或翻译)(I类)、折叠和/或运输异常(II类)、传导调节异常(III类)、氯离子传导减少(IV类)和合成减少(V类)。由于缺乏有功能的CFTR，I、II和III类突变一般与较严重的CF表型相关(即胰功能不全)，相比较而言，IV或V类突变可表达非常低水平的有功能的CFTR。在互联网址为genet.sickkids.on.ca/cgi-bin/WebObjects/MUTATION的囊性纤维化突变数据库中能找到CFTR基因中已鉴定到的不同突变的列表，特别纳入本文作参考。
适合用本发明方法治疗的对象可以是具体突变-CFTR的纯合子，即是含具体突变-CFTR如ΔF508-CFTR两个拷贝的纯合子对象。此外，适合用本发明方法治疗的对象也可以是含两种不同CFTR突变的杂合子；即该对象的基因组包含CFTR的两种不同突变形式，如该对象含有一拷贝的ΔF508-CFTR和一拷贝不同突变形式的CFTR。
在本发明的一些实施方式中，突变-CFTR多肽是ΔF508-CFTR。然而，本发明不应仅限于治疗含有这种CFTR突变形式的CF患者。而是，本发明应该包括治疗含有特征相似的，导致突变-CFTR在质膜中表达和氯离子传导能力降低或传导调节异常的其它CFTR突变形式的CF患者。
实施例
提供以下实施例，以便为本领域普通技术人员提供如何制备和应用本发明的完整公开内容和描述，不旨在限制本发明者认定的发明范围，也不意味着下述实验是所进行的所有和仅有的实验。我们努力保证所用数值(如量、温度等)的精确性，但应允许一些实验误差和偏离。除非另有说明，份数是重量份数，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力为大气压或接近大气压。
下述实施例采用以下方法和材料。
细胞系
如前所述(Galietta等，JBC 276：19723-19728(2001)；Ma等，JBC 277：37235-37241(2002))，产生稳定地共表达人ΔF508-CFTR和高灵敏度卤化物-感受型绿色荧光类似物YFP-H148Q/I152L的Fischer大鼠甲状腺(FRT)上皮细胞(Galietta等，FEBS Lett 499：220-224(2001))。用相似方法产生稳定表达P574H-CFTR的FRT细胞。用补充有10％胎牛血清、2mM L-谷胺酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Coon改良F12培养基在塑料板上培养FRT细胞。在初次筛选中，用LabSystems多路分配器将细胞接种到黑色96孔微孔板(Corning-Costar)中，每孔接种50,000个细胞。接种18-24小时后进行筛选。在短路离子流测定中，用Snapwell通透性支持物(Corning-Costar)培养细胞，每块插入板500,000个细胞。用Snapwell插入板培养ΔF508/ΔF508纯合CF对象(或N1303K/N1303K纯合对象)的人鼻上皮细胞，在(Galietta等，Am.J.Physiol.275：L917-L923(1998))所述的补充有激素的培养基中分化。
化合物
总共用150,000种不同的药物类似化合物(＞90％的分子量为250-500道尔顿，ChemDiv and ChemBridge，加州圣地亚哥)进行初筛。为了优化，测试初筛中鉴定的＞1500种活性化合物的市售类似物。制备每孔含有一或四种化合物的平板用于筛选(1mM的DMSO溶液)。用NMR和液相色谱/质谱验证用于后续分析的化合物。
筛选方法
用Beckman集成系统进行筛选，该系统装有3-米机械臂、含有多孔板传送带的CO₂培养室、平板洗涤器、液体操作工作站、条码阅读器、去盖台、平板密封器和两台FluoStar荧光平板阅读器(Optima、BMG Lab Technologies)，这两台荧光阅读器各自装有双注射泵以及500±10nm激发光和535±15nm发射光滤光片(Chroma)。37℃(90％湿度，5％CO₂)培育FRT细胞18-24小时，然后用50μL含有测试化合物(终浓度10μM)的培养基培育18-24小时。试验时，用PBS洗涤细胞，然后用含有弗司扣林(20μM)和染料木黄酮(50μM)的PBS培育。在平板阅读器上连续记录2秒的荧光(200ms/点)测定各孔的I^-流入(基线)，快速(＜1秒)加入165μL其中137mM Cl^-被I^-替代的PBS后再连续记录12秒。I^-流入速率的计算方法如下：将最后11.5秒的数据拟合至指数函数，用于外推初始斜率，然后减去背景的初始荧光标准化。所有化合物平板都含有阴性对照(DMSO载体)和阳性对照(4-PBA，4mM)，还有单独的低温拯救(27℃培育18-24小时)阳性对照板。实验分析显示，Z′-因子＞0.6。
跨上皮流的测定
在Snapwell插入板上培养表达ΔF508-CFTR的FRT细胞7-9天。在测定前18-24小时加入测试化合物。基底外侧溶液含有(以mM计)：130NaCl、2.7KCl、1.5KH₂PO₄、1CaCl₂、0.5MgCl₂、10葡萄糖、10Na-Hepes(pH 7.3)。在顶端浴溶液中，用葡糖酸钠替代了65mM NaCl，CaCl₂增加至2mM。向溶液中鼓入空气泡，并维持在37℃。用250μg/ml两性霉素B通透基底外侧膜。就人支气管上皮细胞而言，顶端和基底外侧室含有126mM NaCl、0.38mM KH₂PO₄、2.1mM K₂HPO₄、1mM MgSO₄、1mM CaCl₂、24mM NaHCO₃和10mM葡萄糖(基底外侧膜不能通透)。通过Ag/AgCl电极和1MKCl琼脂桥将半室连接于DVC-1000电压钳(World Precision Instruments)，以记录顶端膜或短路离子流。
校正机制的分析
生化研究采用了用野生型和ΔF508-CFTR的HA-标记变体稳定转染的BHK细胞。在C-末端尾上标记CFTR(CFTR-C_tHA)，或者用三个HA表位标记它的第四个胞外环(CFTR-3HA)。用如(Sharma等，JBC 276：8942-8950(2001))所述的免疫印迹分析检测复合物-糖基化的CFTR的累积。采用如(Sharma等，JCB 164：923-933(2004))所述的碘化抗小鼠第二抗体或以Amplex-红为底物的辣根过氧化物酶-偶联的第二抗体通过HA抗体结合(在非通透细胞中)测定质膜表达。通过非转染细胞和在转染细胞中省去第一抗体测定非特异性抗体结合(采用相同的实验条件)。如(Du等，Nat.Struct.Mo.Biol.(2005))(有所修改)所述测定折叠效率。表达ΔF508-CFTR-C_tHA的BHK细胞在校正物存在下耗尽了内源性甲硫氨酸和半胱氨酸。为了监测折叠，在0.2mCi/ml³⁵S-甲硫氨酸和³⁵S-半胱氨酸存在下培育细胞150分钟，然后在完全培养基存在下再追踪150分钟。通过脉冲标记等量的细胞15分钟而不追踪来测定掺入新合成CFTR中的放射性。通过免疫沉淀分离CFTR，通过荧光显影观察，采用如(Lukacs等，EMBO J.，13：6076-6086(1994))所述的磷光图像分析定量。
实施例1
ΔF508-CFTR校正物的发现和鉴定
如图1所示，在96孔板中用测试化合物(10μM)37℃培育共表达ΔF508-CFTR和荧光YFP卤化物感受器的FRT细胞18-24小时。然后，洗去化合物加入增效物弗司扣林和染料木黄酮后测定ΔF508-CFTR介导的碘化物流入。最初筛选了150,000种化合物，产生45种使碘化物流入增加(Δd[I^-]/dt)＞0.10mM/s的化合物和15种使碘化物流入增加＞0.20mM/s的化合物。图2中显示了各孔原始数据的例子。阴性对照是单用载体(DMSO)(标为‘37℃’)，阳性对照是4-苯基丁酸酯(4-PBA)和降低温度(27℃)的培育拯救。显示了列举的两种活性化合物。
再次检测活性化合物，通过CFTR_inh-172抑制增加的碘化物流入和缺乏对FRT裸细胞的校正作用证实了ΔF508-CFTR特异性。通过筛选市售类似物初步优化校正物的活性。三轮优化测试了五种化合物骨架的＞1500种化合物，产生的活性校正物是氨基苯并噻唑、氨基芳基噻唑、喹唑啉基氨基嘧啶酮、双氨基甲基联噻唑和苯基氨基喹啉化合物类，其中四种见图3A。图3B显示了剂量反应数据，参照虚线表示的27℃拯救。表1列举了37种校正物和其效力(K_a，V_max)，其中建立了五类校正物的结构-活性数据组。图4小结了几种校正物的V_max数据，与阳性和阴性对照作比较。几种化合物的V_max大于27℃拯救，发现化合物与27℃拯救联用时对碘流入具有加成效应。
图5显示了Ussing小室实验，测定在基底外侧膜通透后、氯梯度存在下(顶端65mM，基底外侧130mM)FRT细胞的顶端膜氯离子流。测定顶端膜氯离子流基线后，加入高浓度的增效物弗司扣林(20μM)，然后加入染料木黄酮(50μM)；各实验结束时加入CFTR_inh-172(10μM)。用电生理学研究验证了获自该荧光试验的数据。图5左侧显示，27℃培养的表达ΔF508-CFTR的细胞离子流比37℃培养的离子流大得多(上部和中部曲线)，以及缺乏对FRT裸细胞的校正作用(底部)。测定前，将表达ΔF508-CFTR的细胞与校正物37℃培育24小时能提高弗司扣林/染料木黄酮刺激的和CFTR_inh-172抑制的氯离子流(图5，右侧)，与27℃拯救产生的效应相当或更大。
表1







图6A小结了四种校正化合物进行校正的时程(37℃培育)，显示了27℃拯救和4-PBA的数据作为比较。早至加入化合物3小时后，就能观察到校正，12-30小时后发生最大效应。相反，27℃培育或4-PBA的校正作用发生得相对较慢。图6B小结了洗去化合物后校正(或者温度从27℃回复至37℃)的持久性数据。对大多数化合物而言，洗涤后校正作用持续了12小时以上，两种校正物在24小时后仍有很高的活性。相反，27℃拯救的细胞24小时后几乎没有校正作用。
进行实验来研究校正化合物可否改变ΔF508-CFTR的特性，如对cAMP-增高剂或对增效化合物的敏感性。图7小结了单用弗司扣林(20μM)与弗司扣林+染料木黄酮(50μM)的V_max。有趣的是，相对于低温处理，校正物处理的细胞中单用弗司扣林与弗司扣林+染料木黄酮产生的组合V_max较高。因此，几种校正化合物能提高单用弗司扣林引起的ΔF508-CFTR活化。化合物corr-2b最有效，弗司扣林反应提供了～80％的V_max。图8显示了弗司扣林剂量反应数据(不存在染料木黄酮)。虽然V_max不同，但在各种情况下弗司扣林反应的K_a约为3μM。如Ussing小室实验所示(图9)，20μM(甚至高达50μM)的化合物corr-2b能提高弗司扣林反应的相对幅度。这并非由化合物corr-2b的固有增效活性所致，因为在27℃拯救的细胞中它不能刺激CFTR的活性，以染料木黄酮作为阳性对照(图9，右侧)。
高通量筛选产生了能校正ΔF508-CFTR细胞错误加工和使质膜表达和卤离子通透性恢复至高于低温拯救所达到的水平的几类小分子。通过电生理学和生化测定证实了校正作用，其中采用了对照(不表达)细胞和CFTR-选择性抑制剂。
选择上皮来源的细胞系(类似于天然的CFTR-表达细胞)用于初步筛选，以便快速评价单层细胞的氯离子流，和产生强大的低温拯救反应。对高通量筛选所用细胞系的其它要求包括在测试平板上快速生长、YFP-H148Q/I152L的表达稳定且明亮、以及卤离子通透性基础水平低。如前所述YFP-H148Q/I152L荧光卤化物指示剂显色(Galietta等，FEBSLett.499：220-224(2001))为明亮的细胞表达水平和超高的碘离子敏感性。筛选许多转染和天然表达的上皮细胞系以及一百种以上的ΔF508-CFTR/YFP-H148Q/I152L转染的FRT细胞克隆后选出所用的转染FRT细胞系。
实施例2
ΔF508-CFTR校正物的机理分析
为了提供在校正物存在下ΔF508-CFTR生物合成加工的生化证据，通过免疫印迹分析，监测成熟的复合物-糖基化ΔF508-CFTR-C_tHA在乳仓鼠肾(BHK)细胞中的累积。用校正物在37℃培育细胞16-24小时导致复合物-糖基化的ΔF508-CFTR累积(图10A)。这通过与核心-糖基化对应物的电泳迁移(表观M.W.～150kDa)相比，复合物-糖基化ΔF508-CFTR免疫反应性条带的电泳迁移较慢(表观M.W.～170kDa)证明了这一点，核心-糖基化是没处理细胞中的主要形式。在表达ΔF508-CFTR的FRT细胞中获得了相似结果。校正物处理的细胞中复合物-糖基化ΔF508-CFTR的累积水平与不用校正物仅用低温培育所产生的水平相当(图10B)。由于ER侣伴分子Grp78的表达水平未改变，表明校正化合物不产生ER应激反应。采用对胞外表位识别的抗-HA抗体结合实验证实了质膜ΔF508-CFTR表达(Ma等，JBC 277：37235-37241(2002))。用校正化合物培育显著提高了质膜ΔF508-CFTR的丰度，伴有弗司扣林/染料木黄酮-刺激的顶端膜氯离子流大致按比例增加(图11A)。
ΔF508突变损伤了内质网上ΔF508-CFTR的构象成熟过程和该通道的输出能力，并使高尔基体后小体(post-Golgi compartments)中的复合物-糖基化ΔF508-CFTR不稳定(Sharma等，2001；Sharma等，2004)。因此，校正化合物可能促进了新合成ΔF508-CFTR的翻译后折叠并提高了成熟的复合物-糖基化ΔF508-CFTR的稳定性。为了确定校正作用的细胞基础，用代谢物脉冲-追踪技术测定新合成的核心-糖基化ΔF508-CFTR转化为复合物-糖基化形式的比例，定量分析了校正物对ΔF508-CFTR翻译后折叠效率的影响(图11B)。通过将放射性脉冲标记的时间从15分钟延长到150分钟，显著提高了该试验的灵敏度。磷光图像分析显示，在37℃培育的BHK细胞中，与野生型CFTR的成熟效率(31±5％)相比，ΔF508-CFTR的成熟效率虽然低，但可测量(0.5±0.15％)。在其它异源表达系统中野生型CFTR成熟效率获得的结果相似(Ward等，1994；Lukacs等，EMBO J13：6076-6086(1994))。在某些校正化合物的存在下，ΔF508-CFTR折叠效率提高了2-3倍(图11C)。下一步评价ΔF508-CFTR-3HA在细胞表面的稳定性。温度降低时，ΔF508-CFTR-3HA首先在细胞表面累积(如图10A)。然后，在校正物的存在下将温度提高到37℃，通过4℃时结合于该通道的抗HA消失监测ΔF508-CFTR的稳定性。虽然在3小时追踪期间，拯救的ΔF508-CFTR细胞表面密度降低约～20％，但校正化合物存在下细胞表面仍有50-90％的ΔF508-CFTR蛋白(图12B和C)。因此，校正化合物也延长了拯救的ΔF508-CFTR蛋白在细胞表面的存留时间。
作为化合物校正缺陷的ΔF508-CFTR错误加工的特异性的初始测试，检测了化合物对P574H-CFTR的作用，P574H-CFTR是类似于ΔF508-CFTR的一种突变CFTR，保留在内质网上，但可通过降温培育24小时而拯救(Ostedgaard等，J.Cell Sci.，112：2091-2098(1999))。用校正物或降低温度培育细胞24小时。测定响应于弗司扣林(它能完全激活这种CFTR突变体，Sheppard等，EMBO J.14：876-883(1995))、然后是CFTR_inh-172的顶端膜氯离子流。图12显示，尽管低温拯救的对照为阳性，但能在表达ΔF508-CFTR的细胞中产生强大氯离子流的corr-4a化合物对P574H-CFTR细胞没有作用。Corr-3a化合物产生的氯离子流增加两倍。
CFTR的细胞加工包括翻译、在ER中折叠、高尔基体运输、翻译后糖基化和顶端质膜靶向。质膜CFTR通过胞吞作用内化，然后再循环至质膜或靶向溶酶体降解(Sharma等，2004；Gentzsch等，MBC 5：2684-2696(2004))。ΔF508-CFTR折叠无效。在BHK细胞中，99.5％新合成的ΔF508-CFTR靶向降解而不到达高尔基体。也有报道称，在其它模式系统中ΔF508-CFTR几乎完全存留在ER中。Corr-4b和corr-4c化合物将ΔF508-CFTR折叠效率提高了将近3倍，但不影响翻译速率，这表明，该校正化合物可部分克服翻译后折叠障碍。根据近年来的结构研究，相信小分子可促进NBD2和/或跨膜结构域的折叠(Du等，Nat.Struct.Biol.，2005，Chen等，JBC 279：39620-39627(2004))。对校正物的外周稳定作用最简单的解释是，与没有校正化合物时拯救的ΔF508-CFTR相比，构象稳定的突变体不易受泛素-依赖性外周质量控制机制和溶酶体降解的影响(Sharma等，2004)。
实施例3
人气道上皮中的ΔF508-校正
检测了校正化合物对ΔF508-CFTR纯合对象的人气道上皮细胞原代分化培养物的作用。将可通透支持物上极化的细胞固定在Ussing小室中，用短路流分析测定氯分泌。用阿米洛利阻断Na⁺流后，单用DMSO载体处理的细胞对弗司扣林、染料木黄酮或CFTR_inh-172几乎没有反应(图13)。经过弗司扣林和染料木黄酮处理后流增加可以看出，27℃培育24小时导致出现了显著的氯离子流，以及CFTR_inh-172的抑制作用。结果表明，用化合物corr-4a在37℃培育24小时也能同等程度地提高氯离子流。显示了非CF支气管上皮细胞的数据(图13，下图)以进行比较。图14A小结了A中所示一系列测定中CFTR_inh-172抑制产生的短路离子流改变，包括第二种双氨基甲基联噻唑的数据。作为这些研究的阴性对照，检测了同一校正化合物对N1303K-CFTR突变纯合对象的人支气管上皮细胞的作用，该对象也表现出CFTR加工缺陷(Gregory等，MCB11：3886-3893(1991))。图14B显示，所用化合物和条件与图13所示ΔF508-CFTR细胞所用的相同时，没有显著校正N1303K-CFTR支气管细胞的短路离子流。
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