预防性治疗禽流感病毒感染的脂质体包裹的聚ICLC方法.pdf

本发明公开了一种用疗效改进的聚ICLC制剂治疗禽流感病毒感染的方法。聚ICLC包裹在脂质体中，脂质体提供了具有缓释特征的药物递送系统，并具有将药物靶向病毒感染部位而不引起正常组织全身性负载的能力，从而增强聚ICLC的免疫学和生理学活性。该聚ICLC制剂被发现在治疗禽流感病毒感染(特别是禽流感病毒H5N1感染)上特别有效。

1.  一种预防性治疗哺乳动物禽流感病毒感染的方法，包括对所述哺乳动物施用一种药物组合物，所述药物组合物包含包裹在脂质体中的以聚-L-赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的多核糖肌苷酸和多核糖胞啶酸。

2.  如权利要求1所述的方法，其中所述禽流感病毒感染是H5N 1亚型。

3.  如权利要求1所述的方法，其中所述脂质体是包含磷脂酰胆碱、阳离子磷脂和胆固醇的阳离子脂质体。

4.  如权利要求2所述的方法，其中所述脂质体是包含磷脂酰胆碱、阳离子磷脂和胆固醇的阳离子脂质体。

5.  如权利要求3所述的方法，其中所述阳离子磷脂是硬脂酰胺。

6.  如权利要求4所述的方法，其中所述阳离子磷脂是硬脂酰胺。

7.  如权利要求3所述的方法，其中所述磷脂酰胆碱、阳离子磷脂和胆固醇分别以9∶1∶1的摩尔比存在。

8.  如权利要求4所述的方法，其中所述磷脂酰胆碱、阳离子磷脂和胆固醇分别以9∶1∶1的摩尔比存在。

9.  如权利要求5所述的方法，其中所述磷脂酰胆碱、硬脂酰胺和胆固醇分别以9∶1∶1的摩尔比存在。

10.  如权利要求6所述的方法，其中所述磷脂酰胆碱、硬脂酰胺和胆固醇分别以9∶1∶1的摩尔比存在。

11.  如权利要求1、3、5、7或9之一所述的方法，其中所述施用包括鼻内给药。

12.  如权利要求1、3、5、7或9之一所述的方法，其中所述施用包括腹腔内给药。

13.  如权利要求1、3、5、7或9之一所述的方法，其中所述施用包括静脉内给药。

14.  如权利要求2、4、6、8或10之一所述的方法，其中所述施用包括鼻内给药。

15.  如权利要求2、4、6、8或10之一所述的方法，其中所述施用包括腹腔内给药。

16.  如权利要求2、4、6、8或10之一所述的方法，其中所述施用包括静脉内给药。

17.  如权利要求1、3、5、7或9之一所述的方法，其中所述施用包括吸入给药。

18.  如权利要求2、4、6、8或10之一所述的方法，其中所述施用包括吸入给药。

预防性治疗禽流感病毒感染的脂质体包裹的聚-ICLC方法
本申请要求以2006年11月3日提交的美国临时专利申请No.60/856,310为优先权。
技术领域
本发明涉及用聚ICLC制剂治疗禽流感病毒感染的方法，其治疗效应获得了改进。
背景技术
当前有一种世界正接近全球性流感大流行的担忧，因为向世界卫生组织报告的已确认禽流感A(H5N1)人类病例的累计数字自2003年以来逐年增长(从2003年的4例至2006年的109例)。
随着季节性和禽流感病毒对抗病毒药物和疫苗的抗性日增及鉴于因病毒结构不断变化所致疫苗设计和生产的困难，有令人注目的理由来开发广谱的和不依赖流感病毒基因构成的抗病毒新途径。这种途径的开发不仅会减少耐药性发生的可能性，而且可提供抗动物传染源流感病毒新变体的保护作用。
禽流感或大流行流感病毒与季节性流感病毒的明显差异在于：前一种病毒引起受感染个体呼吸道重大炎症。禽流感或大流行流感病毒引起的呼吸道炎症比通常季节性流感引起的炎症水平高10倍，是对鸟类流感和大流行流感患者死亡率增高起作用的因素。开发减轻重大炎症的新方法是重要的，但有时忽略抗禽流感和大流行流感的综合策略。
科学家发现，双链RNA(dsRNA)是很强的生物学修饰基因，可对禽流感感染潜在地起到广谱免疫预防作用。dsRNA在nM浓度即对细胞产生极深的影响。dsRNA的调控效应包括分子和细胞水平的广谱作用。在分子水平，dsRNA可引起诸如干扰素合成、蛋白激酶诱导、2-5A聚合酶诱导、组织相容性抗原增强和代谢抑制等生物效应。在细胞水平，dsRNA可引起诸如致热原性、促细胞分裂性、巨噬细胞活化、激活细胞介导的免疫和诱导抗病毒状态等生物效应。dsRNA的一个独特特征是在抗微生物和抗癌治疗上的免疫调节作用。特别是双链RNA聚ICLC(或简称PICLC)，被发现是高度有效的抗病毒或抗肿瘤剂。据信，双链RNA聚ICLC可用于减弱宿主以引出抗病毒途径(如2′-5′寡腺苷酸合成酶途径)的有益组件，而向下调节致炎细胞因子途径的损伤效应。
聚ICLC是合成dsRNA，包括以聚-L-赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的多核糖肌苷酸和多核糖胞啶酸链(聚I.聚C)。所得的聚ICLC比聚I.聚C在热力学上更稳定。聚ICLC在临床试验中显示能有效地治疗神经胶质瘤(Salazar，A，M.& al.，Neurosurgery 38：1096-1104)。很多研究中还显示它在病毒感染包括流感(Wong，J.P.Antimicrob.Agents Chemother，39：574-2576)、狂犬病(Baer，G.M.，J.Infect.Dis.136：286-292)、裂谷热(Kende，M.，J.Biol.Response Modifiers 4：503-511)和Venequelan马脑脊髓炎(Stephen，E.L.，J.Infect.Dis.136：267-272)的免疫治疗上是有效的。尽管聚ICLC在抗微生物和抗癌治疗中是具有很大潜力的有希望的免疫调节剂，但是已证明它对人体产生严重的不良反应，尤其当重复高剂量给药时。已报告的一些不良反应(Levine，A.S.，Cancer Treat.Rep.62：1907-1913)包括发热、低血压、白细胞减少、肌痛、血小板减少和多发性关节炎。必须解决遗传毒性问题，以使聚ICLC在人体上使用时更安全。此外，聚ICLC的治疗效应受其体内稳定性的限制。作为一种核糖核酸，聚ICLC对体内血清RNA酶的降解敏感。虽然聚ICLC受RNA酶降解的程度比起聚I.聚C来改善了很多，但保护不是完全的，聚-L-赖氨酸和羧甲基纤维素本身可能对酶降解敏感并在体内被免疫清除。因此，对改进的聚ICLC制剂存在一种需求，该制剂的治疗效应得到改善，使用于人体时更安全。而且，聚ICLC对禽流感病毒的治疗效应也必须是确定的。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种对禽流感病毒治疗效应增强而对人体毒性降低的聚ICLC制剂。
按照本发明的一个方面，提供了一种预防性治疗哺乳动物禽流感病毒感染的方法，该方法包括对哺乳动物施用包含包裹在脂质体中的聚ICLC的免疫调节剂。
所用的脂质体较佳为单层或多层，包含至少一种阳离子磷脂，如硬脂酰胺、1，2-二酰基-3-三甲基铵丙烷(TAP)或1，2-三酰基-3-二甲基铵丙烷(DAP)。最佳为，脂质体是由脂质磷脂酰胆碱和硬脂酰胺及甾类化合物胆固醇分别以9∶1∶1的摩尔比制备而成的单层或多层脂质体。脂质体表面可被覆聚乙二醇以延长脂质体的循环半衰期，并可被覆抗体用于靶向体内的特异位点。
也可将电中性脂质体用于聚ICLC的脂质体捕获。这样的电中性脂质体可用例如磷脂酰胆碱和胆固醇加以制备。
本发明所包含的禽流感病毒包括可感染鸟类的流感病毒A的任何亚型。有16种已知的流感病毒HA亚型和9种已知的NA亚型。已知既可感染鸟类又可感染人类的禽流感病毒A的三种主要亚型是流感A H5(9种可能的H5亚型是已知的)、流感A H7(9种可能的H7亚型是已知的)和流感A H9(9种可能的H9亚型是已知的)。其中最佳的是H5N1禽流感病毒。
按照本发明的另一个方面，提供制备脂质体聚ICLC的方法，包括冷冻干燥脂质体和聚ICLC混合物的步骤。该方法方便地包括从磷脂混合物中除去有机溶剂、将所得磷脂混合物用含聚ICLC的水性缓冲液再水合、冷冻干燥所得的磷脂-聚ICLC混合物、重建所得的干燥混合物，以及在使用前用缓冲液再悬浮所得的脂质体沉淀物以得到想要的药物浓度。合适的缓冲液可以是磷酸盐缓冲盐水、生理盐水或去离子水。重要的是要用无RNA酶的水制备缓冲液，从而可使聚ICLC的酶促降解减到最小。
制备脂质体的另一种方法包括去垢剂透析、挤压、反相蒸发(REV)和超声处理。用被动捕获和主动方式如移动式装填，可将聚ICLC装填到脂质体中。未捕获的聚ICLC可通过离心、柱分离或透析除去。
将聚ICLC捕获在脂质体中的优点是降低聚ICLC的毒性，同时增加聚ICLC的治疗效应。而且，脂质体聚ICLC在体内保护聚ICLC不被RNA酶降解，从而增强了聚ICLC的免疫学和生物学活性。
附图说明
图1显示关于游离聚ICLC与脂质体聚ICLC的治疗效应比较试验结果。
图2显示关于游离聚ICLC与脂质体聚ICLC的毒性比较试验结果。
图3显示在小鼠上脂质体聚ICLC与对照组对于低病毒攻击剂量H5N1禽流感病毒的治疗效应比较试验结果。
图4显示在小鼠上脂质体聚ICLC与对照组对于高病毒攻击剂量H5N1禽流感病毒的治疗效应比较试验结果。
具体实施方式
聚ICLC
聚ICLC由Pharmaceutical Services，College of Pharmacy University ofIowa(Iowa City，Iowa.)制备，由美国国立卫生研究院(Bethesda，Md.)提供。每毫升聚ICLC包含2mg聚I.聚C、1.5mg聚-L-赖氨酸和5mg羧甲基纤维素，在0.9％氯化钠中。
被覆脂质体的聚ICLC
脂质体是由一种或几种脂质双层和水性成分组成的微细脂质囊泡。脂质体的主要成分通常是磷脂和甾类化合物如胆固醇的组合。磷脂可以是正电性、中性和负电性的。从正电性和负电性磷脂制成的脂质体分别称为阳离子脂质体和阴离子脂质体。DNA和RNA通常带负电荷，因此阳离子脂质体是制备脂质体聚ICLC制剂所选择的脂质体。用于制备脂质体聚ICLC的阳离子磷脂优选硬脂酰胺、1，2-二酰基-3-三甲基铵丙烷(TAP)或1，2-三酰基-3-二甲基铵丙烷(DAP)。脂质体中包括胆固醇是为了稳定双层。脂质体表面可被覆聚乙二醇以延长其循环寿命。蛋白质也可与脂质体膜结合以促进与特异性细胞受体的结合。
用于捕获聚ICLC的脂质体可以是多层大囊泡(MLV)、单层小囊泡(SUV)或单层大囊泡(LUV)。较佳为用MLV制备脂质体聚ICLC。
现已知道，脂质体用作药物递送系统时，具有缓释特征和将药物靶向感染和肿瘤部位而不引起正常组织全身性负载的能力。脂质体已被成功地用于捕获很多治疗药物，包括抗生素、抗病毒剂和抗癌剂。由于这些贡献，脂质体聚ICLC是很好的药物递送系统，可明显地降低聚ICLC的剂量依赖性毒性。而且，脂质体包囊保护聚ICLC不受体内RNA酶的降解。从而增强聚ICLC的治疗效应。
制备
采用210mg磷脂酰胆碱(210μmol)、23.2mg硬脂酰胺(23.2μmol)和8.1mg胆固醇(30μmol)制备脂质体。将脂类物质加到100ml圆底烧瓶中，加入2ml氯仿溶解脂类物质。将圆底烧瓶在45℃水浴中旋转蒸发直至形成所需要的脂质薄膜。然后将烧瓶放在真空干燥箱(45℃，-80Kpa)中一小时，除去残余的有机溶剂。然后将脂质薄膜用3ml聚ICLC(2mg/ml)、接着用3ml 0.9％ NaCl进行重建。其它合适的缓冲液可以是磷酸盐缓冲盐水、生理盐水或去离子水。重要的是要用无RNA酶的水制备缓冲液，以使聚ICLC的酶促降解减到最小。然后将脂质-药物混合物转移到有螺盖试管中，充分混合，并将试管浸入液氮中冷冻。然后将样品冷冻干燥过夜直至液体被除去，得到白色干燥粉末。冷冻干燥后，将样品用100～150μl0.9％ NaCl再水合，于45℃培养15分钟，室温下静置2小时。将脂质体聚ICLC以灭菌的0.9％ NaCl稀释，并用超速离心步骤洗涤。然后将脂质体沉淀物用缓冲液再悬浮成所需的药物浓度用于对小鼠给药。
脂质体表面可被覆聚乙二醇以延长循环寿命，并被覆抗体以增加脂质体对感染和肿瘤特异性部位的亲和力。
电中性脂质体也可用于聚ICLC的脂质体捕获。例如，可用磷脂酰胆碱和胆固醇制备电中性脂质体。
产生脂质体的其它制备方法包括去垢剂透析、挤压、反相蒸发(REV)和超声处理。用被动捕获或主动方式如移动式装填，可将聚ICLC装填到脂质体中。未捕获的聚ICLC可通过离心、柱分离或透析除去。
在小鼠上进行鸡蛋繁殖的流感病毒A/PR/8的适应
用常规方法，利用鸡蛋繁殖的病毒(得自ATTC，Parklawn，Md.)作为起始接种物通过四次盲目传代从肺途径将流感病毒A/PR/8感染小鼠。病毒在早至第三次传代时即在小鼠上成为致病原。流感的症状是竖毛、体重骤降、集聚在一起、笼内动物的活动明显减少。感染小鼠的尸检显示严重的肺损伤，一些小鼠也观察到肺扩大。
试验
通过鼻内、腹腔或静脉途径对小鼠给予脂质体捕获的聚ICLC。所用的接种物体积是鼻内途径50μl，腹腔和静脉途径100μl。对于鼻内和腹腔途径，给药前用戊巴比妥钠麻醉小鼠。在动物麻醉状态，小心地用手撑起它们的鼻子，用微量滴管将抗病毒剂轻轻地滴进鼻子。所给予的体积自然地吸入肺中。
各组麻醉小鼠(每组5～10只小鼠)通过腹腔或静脉途径给以一次或两次剂量(20μl/次)聚ICLC或脂质体包裹的聚ICLC。在病毒攻击前7天、14天和21天对小鼠给以这些剂量。然后用10LD₅₀的小鼠适应的流感病毒A/PR/8鼻内感染小鼠。病毒感染后第14天，记录病毒攻击幸存的小鼠数。
结果
游离的和脂质体包裹的聚ICLC对小鼠抗流感A感染致死性攻击的预防性保护效应如图1所示。相比之下，病毒感染前7天内给予游离聚ICLC的小鼠在病毒感染后第14天存活率为100％。但是，病毒感染前14天和21天给予游离聚ICLC预处理的小鼠，第14天的存活率降低。相反，病毒感染前7天和14天内给予脂质体包裹的聚ICLC(MLV聚ICLC)的小鼠在病毒感染后第14天具有100％的存活率。这些结果显示，脂质体包裹不会对聚ICLC的抗病毒和免疫调节活性产生不利影响，而是通过延长抗病毒状态增强这些活性。
参见图2，该图显示游离和脂质体包裹的聚ICLC对小鼠的毒性效应，以体重测量为指标。接受毒性剂量聚ICLC的小鼠会出现诸如体重急速下降、竖毛和机体活动减少等症状。对小鼠给予每天两次剂量游离聚ICLC，30μg/只。参见图2，第一次剂量在给药后第2天给予，第二次剂量在给药后第0天给予。实验发现，小鼠在每次给药后1～3天内失重可达2g(接近总体重的10％)。除了体重减少外，这些小鼠还显示竖毛(波缘毛)和机体活动减少的异常症状或体征。相反，给予同样剂量脂质体包裹的聚ICLC的小鼠体重并无明显减少，也不显示竖毛和机体活动减少的任何体征。因此，我们发现未包裹的聚ICLC毒性高，而脂质体包裹的聚ICLC毒性低，如图2结果所示。给予脂质体聚ICLC的小鼠并不显示明显的体重减少。
结论：结果显示游离聚ICLC直接给予小鼠时对流感病毒A只提供有限的保护。此外，显示重复高剂量聚ICLC对小鼠产生毒副作用。相反，脂质体包裹的聚ICLC通过增强治疗效应的同时减少聚ICLC的毒性来有效地治疗病毒感染。
脂质体包裹的聚ICLC在小鼠上对抗禽流感病毒H5N1感染
为了证明脂质体包裹的聚ICLC对抗禽流感病毒H5N1的预防效应，用从感染小鸡分离得到的野生型H5N1流感病毒A建立致死性呼吸道小鼠模型。在小鼠上这种禽类来源的H5N1流感病毒感染模型在脂质体聚ICLC抗病毒活性的效应测定上是非常重要的。
在效应研究中，对各组Balb/c小鼠(20g)用两个剂量20μg脂质体聚ICLC以48小时间隔进行鼻内给药预处理。药物治疗后24小时，这些小鼠鼻内给以低剂量(一个LD₅₀)或高剂量(4LD₅₀)禽流感病毒进行攻击。然后每天监测病毒对照和受治疗动物的存活率，并在感染后第14天进行测定。
脂质体包裹的聚ICLC对于预防性保护小鼠对抗低剂量和高剂量禽流感病毒H5N1攻击的效应分别见于图3和4。如图3所示，感染低剂量或高剂量病毒的对照组小鼠在感染后开始的5～6天里死于禽流感感染。感染低剂量病毒攻击的一半对照组小鼠在感染后约9天时死亡。高剂量病毒攻击中，所有小鼠在感染后约14天死亡。相反，如图4所示，脂质体包裹的聚ICLC对于低剂量病毒攻击提供完全的保护(100％存活)，对于高剂量病毒攻击提供63～75％的保护。脂质体聚ICLC提供的存活率增加的这些水平具有统计学意义(低剂量组和高剂量组与对照组相比，分别为p＜0.0402和p＜0.0014)。用脂质体聚ICLC预处理的小鼠平均存活时间与对照组小鼠相比也有增加。
这些结果显示，脂质体包裹的聚ICLC提供了对抗禽流感病毒感染的有效保护。
应当注意，在H5N1效应的本研究中所用的脂质体聚ICLC的剂量是每次剂量20μg。然而，抗禽流感病毒的其它剂量方案一般来说，更具体地说，H5N1病毒也可用诸如每次剂量1～200μg，其中以每次剂量1～100μg为佳。当然，按照常规的理解，剂量方案也可根据受治疗者的体重来确定。应当理解，本说明书所示和所描述的实施方案及其变更仅仅是对本发明原理的举例说明，本领域技术人员可实施各种修改而不背离本发明的范围和精神。
而且，除非上下文中另有所指，无论本说明书中提供的数值范围如何，其中插入的每一个数值和范围均包含在本发明中。此外，除非上下文另有清楚的指明，本发明包括每一个数值所标明下限的十分位。除非另指，本发明还包括所述范围的上限和下限。较小范围的上限和下限(包括插入范围)可独立地包括在该较小范围中。当所述范围包括一个或两个界限时，排除一个或两个所包括界限的范围也包括在本发明中。
简言之，在动物实验研究中脂质体聚ICLC提供抗季节性病毒和禽流感病毒的保护。关于脂质体聚ICLC有效对抗各种流感病毒A亚型(H1N1，H3N2和H5N1)的观察确立了它特别适合于处理不断改变的突变体病毒，如流感病毒，特别是禽流感病毒。本说明书提供的实验结果共同确立了脂质体聚ICLC是一个重要的药物，可用于补充现有的对抗禽流感、流行性和季节性流感的抗流感药物和疫苗武器库。