治疗胆管癌的药物组合物、抑制胆管癌生长或侵入的方法和治疗胆管癌的方法.pdf

本文公开的是抑制胆管癌的生长或转移的药物组合物，其包括L1CAM活性抑制物或表达阻抑物，以及使用该组合物的治疗方法。这是基于如下的发现：L1CAM在胆管癌中过量表达和在胆管癌的生长和转移中发挥重要作用，以及胆管癌患者的死亡率随L1CAM表达率的增加而增加。而且，发现抑制L1CAM活性的抗体或阻抑L1CAM表达的siRNA降低胆管癌细胞的生长和侵入。识别胆管癌细胞表面上的L1CAM蛋白和特异性结合胆管癌组织的小鼠单克隆抗体、或siRNAs、反义寡核苷酸或shRNAs可通过抑制胆管癌细胞的生长、侵入和迁移来用于胆管癌的治疗。

1.  抑制胆管癌的生长或转移的药物组合物，其包括L1CAM活性或表达抑制物，所述L1CAM活性抑制物选自抑制L1CAM活性的抗L1CAM抗体、所述抗L1CAM抗体的抗原结合片段、所述抗L1CAM抗体的变体和所述抗L1CAM抗体的所述抗原结合片段的变体，所述L1CAM表达抑制物是阻抑L1CAM表达的寡核苷酸。

2.  根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述L1CAM活性抑制物识别膜结合形式或可溶形式的L1CAM。

3.  根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述阻抑L1CAM表达的寡核苷酸选自针对编码L1CAM的基因的反义寡核苷酸、siRNA和shRNA。

4.  根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述抗体是4-63，其由具有登录号KCTC 10966BP或UJ127的杂交瘤分泌。

5.  根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述siRNA具有5′-TGGTACAGTCTGGGdtdt-3′或5′-CAGCAACTTTGCTCAGAGGdtdt-3′的序列。

6.  一种治疗胆管癌的方法，其包括施用权利要求1所述的组合物。

7.  一种抑制胆管癌的生长或转移的方法，通过抑制L1CAM的活性或阻抑L1CAM的表达来进行。

8.  一种诊断胆管癌的方法，其使用对L1CAM特异的抗L1CAM抗体。

治疗胆管癌的药物组合物、抑制胆管癌生长或侵入的方法和治疗胆管癌的方法
技术领域
【0001】本发明涉及抑制胆管癌的生长或转移的药物组合物，其包括抑制L1CAM活性或表达的物质——这种物质是存在于胆管癌细胞表面的蛋白，以及使用该组合物的治疗方法。
【0002】
背景技术
【0003】胆管癌是胆管的癌症，胆管将胆汁从肝脏排至小肠。最近的证据已表明肝癌可起因自多能肝脏干细胞(Sell和Dunsford Am J.Pathol.134：1347-1363，1989)。胆管癌全世界发生的发病率远远低于肝癌，其在东南亚的发生远远高于欧洲或北美。胆管癌不能通过手术切除来有效治疗，原因在于它的高返回率(return rate)。普通的化学疗法和放射疗法也不可用于胆管癌的治疗(Pederson等，Cancer Res.4325-4332，1997)。另外，胆管癌难于诊断，并且已观察到由于细菌或寄生虫的感染进入胆管引起的慢性炎症有发展成胆管癌的倾向(Roberts等，Gastroenterology 112：269-279，1997)。
【0004】尽管有大量的研究结果，但是胆管癌的发病机理仍然未知。用于治疗胆管癌的靶向分子也了解甚少。作为某些细胞遗传研究的结果，仅建立了几个细胞系(Yamaguchi等，J.Nat′l Cancer Inst 75：29-35，1985；Ding等，Br J Caner 67：1007-1010，1993)。但是，没有使用这些细胞系制备胆管癌特异性抗体的方法的报道。
【0005】最近，从患有胆管癌的韩国患者建立了胆管癌细胞系Choi-CK和SCK(Kim等，Genes，chromosome&Cancer，30：48-56，2001)。如果从用胆管癌细胞系注射小鼠来制备对细胞表面特异的单克隆抗体，那么它们可应用于胆管癌治疗。
【0006】表皮生长因子受体(EGFR)——已知为预后因子(prognostic factor)——的基因是原癌基因。EGFR涉及肿瘤发生和攻击生长行为。EGFR在各种癌症中过量表达，包括乳腺癌、肺癌、直肠癌、肾癌、胆囊癌、头颈癌、卵巢癌、前列腺癌、癌性宫颈肿瘤和胃癌(Modjtahedi，H.和Dean，C.，The receptor for EGF and its ligands：expression，prognostic value and target for therapy in Cancer.Int.J.Oncol.4：277-296，1994)。另外，EGFR的表达与癌症预后的相关性在一种癌症和另一种癌症之间有所不同(Nicholson，R.I.等EGFR and Cancer prognosis.Eur.J.Cancer 37，S9-S15，2001)。例如，EGFR可用作膀胱癌、癌性宫颈肿瘤、食道癌、头颈癌症和卵巢癌的强预后因子，但被识别为非小细胞肺癌(NSCLC)的弱预后指示物。但是，还不知道关于胆管癌预后因子的信息。
【0007】当针对EGFR的抗体应用于癌症治疗时，发现它们对癌细胞生长的抑制活性对每种癌症类型的功效在15-50％范围内变化。而且，即使在相同癌症类型中，体外和体内生长抑制作用之间存在差别(Dassonville，O.等，EGFR targeting therapies：monoclonal antibodies versus tyrosine kinase inhibitors similarities and differences.Critical Reviews in Oncology/Hematology 62，53-61，2007)。目前，针对EGFR的抗体用于直肠癌和头颈癌的治疗剂，但不应用于上述所有EGFR过量表达的示例性癌性疾病的治疗。
【0008】如上所述，在癌细胞中表达不能简单地保证蛋白是该癌症的预后因子。而且，蛋白在癌细胞中表达是否与癌症预后相关取决于癌症类型。癌症的强和弱预后因子不但可用于容易地预测治疗剂对癌症的治疗和预后效果，而且可用于发展预后因子-靶向治疗剂，其可选择性地和有效地应用于感兴趣的癌症。因此，这种对癌症特异性的预后因子的发现在癌症的诊断和治疗中十分重要。
【0009】
【0010】L1细胞粘附分子(L1CAM)——一种220kDa的整合膜糖蛋白——是细胞粘附分子(CAMs)免疫球蛋白超家族的成员，其介导细胞表面上的细胞与细胞粘附。L1CAM——最初在神经元中鉴定(Bateman等，EMBO J.15：6050-6059；1996)——在神经迁移、神经突起和细胞迁移中发挥关键作用。使用源自小鼠和大鼠的L1CAM同源物的简并寡核苷酸作为探针，从人胚胎脑cDNA文库分离人L1CAM基因(Hlavin，M.L.和Lemmon，V.Genomics 11：416-423，1991；1999年2月16日公布的美国专利号5,872,225)。L1CAM主要在脑中表达，还可在某些正常组织中检测到它的表达，并且最近在几种癌症中检测到它的表达。
【0011】
【0012】L1CAM和癌症之间似乎存在联系。已报道L1CAM在许多肿瘤细胞类型中表达，包括黑色素瘤、成神经细胞瘤、卵巢癌和直肠癌(Takeda等，J.Neurochem.66：2338-2349，1996；Thies等，Eur.J.Cancer，38：1708-1716，2002；Arlt等，Cancer Res.66：936-943，2006；Gavert等，J.Cell Biol.168：633-642，2005)。已发现L1CAM不但以膜结合形式，而且还作为切割产物被分泌到细胞外基质(Gutwein等，FASEP J.17(2)：292-4，2003)。最近，已经显示L1CAM是在肿瘤细胞生长中发挥重要作用的分子(Primiano等，Cancer Cell.4(1)：41-532003)并且正开始作为一种癌症治疗的新靶标(2004年6月17日提交的US2004/0115206A1)。最近的研究还显示L1CAM在人结肠癌症组织的侵入前端表达(Gavert等，J Cell Biol.14；168(4)：633-42.2005)和抗L1CAM抗体发挥抑制卵巢癌细胞生长和转移的功能(Arlt等，Cancer Res.66：936-943.2006)。
【0013】以前的报道没有提到L1CAM在胆管癌细胞中的表达。此外，还没有L1CAM是否涉及胆管癌的生长和转移的任何信息。而且，根本没有公开关于当L1CAM在癌细胞中以较高水平表达时，胆管癌患者是否显示较高死亡率的数据，即L1CAM是否是胆管癌的不良预后因子。因此，在本发明之前，针对L1CAM的抗体通过抑制胆管癌的增殖和转移作为治疗药物的潜能也是未知。
【0014】
【0015】EP 1,172,654A1和美国专利公开号2004/0259084公开了用于卵巢或子宫内膜肿瘤的诊断和预后的方法，该方法的特征在于测定患者样品中L1CAM的水平，基于L1CAM的存在表明卵巢或子宫内膜肿瘤的存在或是这种肿瘤的素因；以及在需要这种治疗的患者中治疗卵巢或子宫内膜肿瘤的方法，其包括施用给患者足够量的L1CAM抗体或其偶联至细胞毒性药物的片段。如这些专利所公开的，L1CAM蛋白仅描述为卵巢或子宫内膜肿瘤的特异性标志。
【0016】
【0017】美国专利公开号2004/0115206公开了在肿瘤细胞中使用特异性结合L1CAM的抗体诱导细胞死亡的方法和试剂，以及包括L1CAM抗体的药物组合物。该方法的特征为以足够在肿瘤细胞中抑制细胞生长或诱导细胞死亡的时间和浓度，用有效量的抗L1CAM抗体接触肿瘤细胞。提及乳腺癌、结肠癌和宫颈癌细胞作为表达L1CAM肿瘤细胞的例子，该专利公开仅提供体外测试结果，但没有体内数据支持。文中没有说明L1CAM和胆管癌之间的关系。此外，该专利公开仅显示肿瘤细胞接触抗L1CAM抗体用以抑制细胞生长和诱导细胞死亡，而没有任何暗示抗L1CAM抗体能够抑制肿瘤细胞的迁移、侵入和转移。
【0018】国际专利申请号PCT/EP2005/008148公开了在卵巢和子宫内膜癌中过量表达的LICAM蛋白、干扰L1CAM表达的药物组合物和使用该组合物预防和治疗卵巢和子宫内膜癌的方法。所述药物组合物，其包括抗L1CAM抗体或其衍生物，被描述为能够通过抑制癌细胞的迁移和生长治疗卵巢和子宫内膜癌。该专利申请也仅提及卵巢和子宫内膜癌，在其中LICAM以细胞结合形式或可溶形式发挥功能来促进癌细胞的迁移。
【0019】简言之，先于本发明的文献没有公开L1CAM在胆管癌中以高水平表达，并且因此可用作胆管癌特异的不良预后因子，以及L1CAM抑制物——例如L1CAM的抗体——因此可用于胆管癌的诊断和治疗。
【0020】
公开内容
技术问题
【0021】本发明人对用于癌症诊断和治疗的抗体的发展进行了深入透彻的研究。用最近建立的胆管癌细胞系免疫小鼠(Kim等，Genes，Chromosomes&Cancer30：48-56，2001)，从而获得特异性结合胆管癌细胞表面的L1CAM的单克隆抗体。所获得的单克隆抗体命名为“A10-A3”，并且发现该抗体特异性识别L1CAM。
【0022】而且，用A10-A3抗体和已知的抗L1CAM抗体分析，发现L1CAM在胆管癌细胞表面表达，而不在正常细胞——例如外周淋巴细胞、肝细胞、血管内皮细胞等——的表面表达。已知L1CAM在乳腺癌、卵巢癌、直肠癌、皮肤癌等中表达，但在胆管癌的表达仍然未知。使用A10-A3抗体，由本发明人进行的实验显示L1CAM在42个肝内胆管癌患者的45.2％和103个肝外胆管癌患者的39.8％中过量表达，特别是在侵入前端，其说明胆管癌的转移起始。而且，L1CAM表达率和存活率之间的相关性的统计分析显示具有高L1CAM表达率的胆管癌患者的死亡率远远高于具有低L1CAM表达率的胆管癌患的死亡率。证明L1CAM是胆管癌的不良预后因子，该结果显示L1CAM可以是胆管癌治疗的重要靶标。
【0023】
【0024】虽然EGFR在胆管癌中高水平表达，但是相反，EGFR——其用作当前临床用于结肠癌治疗的治疗剂的靶标(例如cetuximab，EGFR的嵌合抗体)——证明不是胆管癌的不良预后因子，原因是在EGFR表达率和存活率之间的相关性分析中未发现统计学显著性。因此，EFGR不被识别为胆管癌的不良预后因子。因此，不是所有在癌症中过量表达的分子都可用作其治疗的重要靶标。
【0025】
【0026】当通过将针对L1CAM的siRNA引入至表达L1CAM的胆管癌细胞系(Choi-CK，SCK)来阻抑L1CAM表达时，发现它的生长、迁移和侵入被阻抑。这些结果显示L1CAM在胆管癌的生长和转移中发挥重要作用。
【0027】如通过用A10-A3抗体或已知的抗L1CAM抗体(UJ127)治疗胆管癌细胞系(Choi-CK，SCK)所分析，发现L1CAM的抗体具有针对胆管癌细胞生长、迁移或侵入的抑制活性。另外，在移植胆管癌细胞系的裸鼠中，注射A10-A3抗体抑制胆管癌细胞的生长。此外，由获自用人胚胎干细胞免疫的小鼠的杂交瘤(KCTC10966BP)产生的单克隆抗体4-63识别癌细胞表面的L1CAM，并且抑制胆管癌的生长。因此，引导本发明的，由本发明人进行的深入而广泛的研究已得出抗L1CAM抗体可用于胆管癌诊断和治疗的结论。
【0028】
技术方案
【0029】因此，本发明的一个目的是提供用于抑制胆管癌的生长和转移的药物组合物，其包括抑制L1CAM活性或阻抑L1CAM表达的物质。
【0030】本发明的另一个目标是提供基于药物组合物的使用治疗胆管癌的方法。
【0031】本发明进一步的目的是提供抑制L1CAM活性的抗L1CAM抗体。
【0032】本发明更进一步的目的是提供抑制L1CAM表达的寡核苷酸。
【0033】本发明还有的另一个目的是提供基于药物组合物的使用抑制胆管癌细胞增殖或转移的方法。
【0034】

附图描述
【0035】图1显示了小鼠单克隆抗体A10-A3(A)和4-63(B)以及已知抗体5G3(C)和UJ127(D)与包括胆管癌的各种癌细胞系和正常细胞的细胞表面结合能力的荧光细胞染色和流式细胞术结果。
【0036】图2显示了免疫沉淀和蛋白质印迹的结果，表明A10-A3特异性地结合L1CAM。A：Choi-CK胆管癌的细胞表面被生物素化，并用A10-A3抗体或已知的抗L1CAM单克隆抗体(UJ127)进行免疫沉淀。被沉淀的蛋白用于10％SDS-PAGE和用链酶抗生物素-HRP的蛋白质印迹。通过蛋白质印迹检测L1CAM。B：用A10-A3抗体免疫沉淀蛋白，在10％SDS-PAGE上分离并使用已知的抗L1CAM抗体(UJ127)进行蛋白质印迹。通过蛋白质印迹检测L1CAM。作为阴性对照“预清除”表示不存在抗体的情况下进行的免疫沉淀(IP)，“用A10-A3的IP”表示使用A10-A3抗体进行的IP，“用抗-L1CAM的IP”表示使用已知的抗L1CAM单克隆抗体进行的IP以及“仅A10-A3”表示只有抗体的SDS-PAGE。C：表达可溶性L1的HEK293T细胞用于使用已知的抗体UJ127和5G3，以及A10-A3和4-63抗体进行的蛋白质印迹。“-”表示不携带L1表达载体的细胞培养上清液，以及“+”表示含有可溶性L1表达载体的细胞培养上清液。
【0037】图3显示了Q-TOF分析的结果。来自Choi-CK细胞的蛋白使用A10-A3抗体进行免疫沉淀，在SDS-PAGE上分离，并且用胰蛋白酶消化。使用Q-TOF分析所获得的肽，其显示免疫沉淀的蛋白是L1CAM。下面的氨基酸序列代表全长L1CAM，上面的氨基酸序列代表所分析的肽的序列，与全长L1CAM序列的下划线部分一致。
【0038】图4显示了使用A10-A3(A和C)以及4-63(B)抗体对来自癌症患者的癌组织免疫组织化学染色的结果。发现抗体结合人胆管癌组织，但不结合正常肝组织。
【0039】图5提供了表格，其中概括了肝内胆管癌(A)和肝外胆管癌(B)中L1CAM的表达与临床病理性质之间的相关性。
【0040】图6提供显示L1CAM表达率与肝外胆管癌患者(60例)存活率之间相关性的图，其表示为OS(总存活，overall survival)和DFS(无病存活，disease freesurvival)。
【0041】图7显示用针对L1CAM的siRNA和非特异的siRNA转染的胆管癌细胞中L1CAM的表达水平(A)以及被转染的细胞增殖、侵入和迁移程度(B)。
【0042】图8显示抗L1CAM抗体A10-A3(A)、4-63(B)以及UJ127和5G3(C)对胆管癌细胞系Choi-CK和SCK生长的抑制作用。卵巢癌细胞系SK-OV3和A10-A3抗体不结合的肾癌细胞系ACHN分别用作阳性细胞对照和阴性细胞对照。对于阴性抗体对照，不用抗体(对照)处理、用热灭活抗体(煮沸的A10-A3b或4-63b)或正常小鼠IgG进行处理。细胞生长程度表示为在用10μg/ml的抗体温育细胞72小时后，相对于不含有任何抗体的对照的百分比。
【0043】图9显示抗L1CAM抗体A10-A3、4-63和5G3对胆管癌细胞(Choi-CK，SCK)侵入和迁移的抑制作用。A10-A3抗体不结合的肾癌细胞系被用作阴性细胞对照，而对于阴性抗体对照，不用抗体(对照)处理、用热灭活抗体(煮沸的A10-A3b或4-63b)或正常小鼠IgG进行处理。细胞生长程度表示为在用10μg/ml的抗体温育细胞72小时后，相对于不含有任何抗体的对照的百分比。
【0044】图10显示A10-A3抗体抑制涉及癌细胞生长、迁移和存活的信号转导。用A10-A3抗体或小鼠IgG处理胆管癌细胞系Choi-CK或SCK，或不用任何抗体处理，然后收集。细胞裂解物使用针对PCNA(A)、磷酸-MAPK(A)、磷酸-AKT(B)和磷酸-FAK(C)的抗体进行蛋白质印迹。抗-β-肌动蛋白抗体用于检测作为加样对照的β-肌动蛋白。
【0045】图11显示A10-A3抗体对人胆管癌异种移植小鼠模型中癌症生长的抑制作用。图A显示在5只施用抗体(A10-A3组)的小鼠和5只未施用抗体(对照)的小鼠中，肿瘤体积随时间的变化。图11B显示癌细胞移植三周后的肿瘤重量。图C以图片显示癌症组织。图D是监测小鼠体重一段时间的图。
【0046】
最佳实施方式
【0047】一方面，本发明涉及抑制胆管癌生长或转移的药物组合物，其包括抑制L1CAM活性或阻抑L1CAM表达的物质。
【0048】在其中的一个实施方式中，本发明提供药物组合物，其包括抑制L1CAM活性的物质。优选地，所述抑制活性的物质是特异性地识别胆管癌细胞表面抗原或分泌的表面抗原(L1CAM)的抗体。所述抗体包括所有单克隆抗体和其嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。新的抗体，以及本领域已知的抗体，落入本发明的范围内。优选的是新的抗L1CAM单克隆抗体A10-A3或4-63，已知的抗L1CAM单克隆抗体UJ127或其嵌合、人源化或人抗体。A10-A3和4-63抗体分别由具有KCTC登录号KCTC10909BP和KCTC 10966BP的杂交瘤分泌。
【0049】只要它们具有L1CAM的结合特异性，所述抗体包括具有两条全长轻链和两条全长重链的完整形式，或可以是抗体分子的功能片段的形式。如本文所用，术语“抗体分子的功能片段”的意图是指至少保留抗原结合功能的片段，其示例性的为Fab、F(ab)、F(ab′)₂和Fv。
【0050】在这一方面的另一个实施方式中，根据本发明，药物组合物可包括阻抑L1CAM表达的物质。当它在表达L1CAM的肿瘤细胞中的表达水平被L1CAM表达抑制物阻抑时，肿瘤细胞的生长和转移降低，其因此可应用于这些癌症的治疗。优选地，L1CAM表达抑制物选自siRNAs、shRNAs和反义寡核苷酸，并且优选地是含有5′-TGGTACAGTCTGGGdtdt-3′或5′-CAGCAACTTTGCTCAGAGGdtdt-3′序列的siRNA。
【0051】如本文所用，术语“siRNA”的意图是指约20个核苷酸的小核酸分子，其介导RNA干涉或基因沉默。术语“shRNA”是指短发夹RNA，其中siRNA靶向序列的正义和反义序列被5至9个碱基的环状结构分隔开。最近，已研究RNA干涉(RNAi)现象以应用于在基因水平控制蛋白表达的方法。典型地，已显示siRNA通过特异性结合mRNA来抑制蛋白表达，所述mRNA具有与靶向基因互补的序列。
【0052】siRNA，其包含在根据本发明的组合物中，可用直接化学合成(Sui G等，(2002)Proc Natl Acad Sci USA 99：5515-5520)或体外转录(Brummelkamp TR等，(2002)Science 296：550-553)制备，但本发明不限于这些方法。而且，shRNAs被设计以克服siRNAs的缺点，其包括昂贵的siRNA生物合成和低转染效率，导致RNA干涉作用的短期持续，shRNAs可由包含在腺病毒、慢病毒或质粒表达载体系统中的基于RNA聚合酶III的启动子来表达，所述系统已被引入细胞。使用细胞中的siRNA加工酶(Dicer或RNase III)，shRNA分子被加工成功能siRNA分子，并随后诱导靶向基因的沉默。
【0053】如本文所用，术语“反义”意图指具有核苷酸碱基序列和亚基-至-亚基骨架的寡聚体，其使反义寡聚体与RNA中的目标序列通过Watson-Crick碱基配对而杂交，以在目标序列内形成RNA：寡聚体异源双链体，通常是与mRNA。寡聚体可与目标序列具有精确的序列互补性或与其接近的互补性。这些反义寡聚体可阻断或抑制mRNA的翻译，和/或修饰mRNA加工以产生该mRNA的剪接变体。因此，本发明的反义寡聚体是与L1CAM基因的mRNA互补的反义寡聚体。
【0054】优选地，根据本发明的组合物可包括已知的治疗剂，其直接地或间接地与抗体偶联或以非偶联形式存在。能够结合抗体的治疗剂包括但不限于放射性核素、药物、淋巴因子、毒素和双特异性抗体。只要当偶联至抗体或与siRNA、shRNA或反义寡核苷酸组合施用时，它可对癌症发挥治疗效果，那么任何已知的治疗剂都可用于本发明。
【0055】放射性核素的实施例包括但不限于：³H、¹⁴C、³²P、³⁵S、³⁶Cl、⁵¹Cr、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I和¹⁸⁶Re。
【0056】可用于本发明的药物和毒素包括：表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、阿霉素、柔红霉素、洋红霉素、氨喋呤、更生霉素、丝裂霉素、顺铂以及顺铂的类似物、博来霉素、埃斯波霉素、5-氟尿嘧啶、苯丙氨酸氮芥、氮芥、但不限于此。
【0057】优选地，根据本发明的组合物可包括适合于其给药方式的可接受的载体。
【0058】适合于给药方式的配方是本领域已知的。而且，本发明的药物组合物可以以用于癌症治疗的药学上有效的量施用。通常的剂量可使用标准临床技术来最优化。
【0059】根据其另一方面，本发明涉及基于药物组合物的使用来治疗胆管癌的方法。
【0060】更详细地，该方法包括将药学上有效量的药物组合物施用给机体。药物组合物可肠胃外、皮下、肺内或鼻内施用。对于局部免疫阻抑治疗，如果期望，组合物可使用合适的方法施用，包括病灶内施用。肠胃外注射包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内和皮下途径。优选的给药方式包括静脉内、皮下、皮内、肌肉内和滴注。
【0061】可通过将本发明药物组合物施用给机体来治疗胆管癌，其中组合物中含有的L1CAM特异性抗体结合癌细胞表面抗原L1CAM，从而抑制胆管癌细胞的增殖或转移。
【0062】而且，可通过将本发明药物组合物施用给机体以使抗体能够结合分泌的L1CAM来治疗胆管癌，其诱导癌细胞生长和转移的阻断。可选地，当被注射时，抗体结合癌细胞表面抗原L1CAM，以使免疫细胞识别这种结合，从而导致癌细胞的吞噬、凋亡或杀死。
【0063】也可通过使用本发明药物组合物中含有的L1CAM表达抑制物抑制L1CAM的表达来实现胆管癌的治疗。在这种情况下，L1CAM对胆管癌细胞的生长和转移的刺激性作用降低。
【0064】根据其进一步方面，本发明涉及用于抑制L1CAM活性的针对L1CAM的抗体，或用于抑制L1CAM表达的针对L1CAM的寡核苷酸。
【0065】在这方面的一个实施方式中，如根据本发明的组合物所述，只要抗体特异性地结合L1CAM，抗体包括具有两条全长轻链和两条全长重链的完整形式，以及抗体分子的功能片段。抗体分子的功能片段是至少保留抗原结合功能的片段，并且包括Fab、F(ab)、F(ab′)₂和Fv。
【0066】优选地，抗体识别胆管癌细胞表面抗原或分泌的表面抗原(L1CAM)。抗体的特征是它结合胆管癌细胞表面蛋白L1CAM以抑制或中和L1CAM的作用；以及通过结合癌细胞，它抑制细胞的生长和转移、吞噬细胞、在细胞内诱导凋亡或杀死细胞。
【0067】如申请US20040115206中所述，抗L1CAM抗体不总是抑制L1CAM的作用。本抗体的特征是它不刺激L1CAM的作用，而抑制L1CAM的活性。
【0068】更优选地，抗体是新的单克隆抗体A10-A3或4-63。
【0069】在另一个实施方式中，针对L1CAM的本发明寡核苷酸——功能为阻抑L1CAM的表达——选自针对L1CAM的siRNAs、shRNAs和反义寡核苷酸，其针对本发明组合物被详细说明。
【0070】在进一步的实施方式中，大量培养胆管癌细胞并将其注射至小鼠的爪垫。从小鼠的淋巴结提取淋巴细胞并与骨髓瘤的肿瘤细胞融合以产生小鼠杂交瘤，该小鼠杂交瘤产生结合胆管癌细胞的抗体。
【0071】详细地，将胆管癌细胞系SCK和Choi-CK注射至小鼠的爪垫，并且从小鼠的淋巴结提取淋巴细胞。所分离的淋巴细胞与F0骨髓瘤细胞融合，并且选择表达抗体的克隆。在所选择的克隆中，测试相对稳定地分泌单克隆抗体的杂交瘤上清液结合胆管癌细胞的能力。由此建立的单克隆抗体-分泌杂交瘤命名为“杂交瘤A10-A3”。该杂交瘤于2006年2月20日保藏于国际保藏机构KCTC(韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures)；韩国生物科学和生物技术研究所(Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology，KRIBB)，韩国)并给予登录号KCTC10909BP。
【0072】
【0073】分别地，使用人胚胎干细胞获得识别L1CAM的另一个抗体4-63，并发现该抗体结合胆管癌和肺癌细胞。分泌4-63抗体的杂交瘤保藏于KCTC并给予登录号KCTC10966BP。详细地，发现单克隆抗体结合癌细胞系——例如胆管癌(参见图1)，但不结合正常细胞——包括肝细胞、HUVEC(人脐静脉内皮细胞)或外周血淋巴细胞(参见图1)。该抗体抑制胆管癌的生长、迁移或侵入。而且，观察到已知的抗L1CAM抗体5G3结合胆管癌细胞，但只能以低效率抑制癌症生长(参见图8)；而发现另一个已知的抗L1CAM抗体UJ127结合胆管癌细胞并因此抑制细胞的生长。这些结果显示抗L1CAM抗体不总是抑制L1CAM的作用。
【0074】
【0075】在本发明的另一个实施方式中，发现在分别用5-TGGTACAGTCTGGGdtdt-3和5-CAGCAACTTTGCTCAGAGGdtdt-3的siRNA序列转染的Choi-CK和SCK细胞系中，L1CAM的表达水平低于在用非特异性寡核苷酸转染的同样的细胞系中的水平。而且观察到，与正常表达L1CAM的癌细胞组相比，L1CAM的siRNA敲除的癌细胞组的增殖、侵入和迁移被降低。
【0076】如本发明的实施例证实(参考实施例5、6和7)，本发明人首次发现在约40％的胆管癌患者中，L1CAM在胆管癌细胞中以过量表达的程度被表达。本发明人还首次揭示，L1CAM是不良预后因子，其在胆管癌细胞的肿瘤进展中发挥重要作用，从而增加死亡的危险；并且以前已知是癌症不良预后因子的EGFR，不是胆管癌的不良指示物。因此，根据本发明的针对LiCAM活性或表达的抑制物可特异性地应用于表达L1CAM的癌症——特别是胆管癌——的诊断和治疗。
【0077】此外，免疫组织化学染色分析显示，LiCAM在非小细胞肺癌(NSCLC)细胞上以低于10％的水平被表达。当用A10-A3抗体处理表达L1CAM的NSCLC细胞系A549和NCI-H522时，它们的生长被分别抑制14％和24％的量，其远远低于40％——A10-A3对胆管癌生长的近似抑制率，这说明本发明的组合物对于胆管癌在治疗上是特别有效的。这种比较进一步地描述于与本申请同日提交的韩国专利申请(名称为：治疗胆管癌的药物组合物、抑制胆管癌生长或侵入的方法和治疗胆管癌的方法)中，其全部内容通过引用并入本文。
【0078】可通过如下实施例获得对本发明的更好的理解，实施例用于说明，而不被解释为对本发明的限制。
【0079】
发明实施方式
【0080】实施例1：癌细胞的培养
【0081】
【0082】使用如下培养基——含有10％胎牛血清(FBS；Gibco)——在37℃、5％CO₂的培养箱中培养癌细胞系。使用MEM培养基(Gibco)培养SH-J1(肝细胞癌)、SCK(胆管癌)、Choi-CK(胆管癌)和ACHN(肾细胞腺癌)细胞；和使用McCoy 5A培养基(Gibco)培养SK-OV3(卵巢腺癌)细胞。在Ham′s F12K培养基中培养A549(非小细胞肺癌)细胞，以及在RPMI1640培养基中培养CI-H522(非小细胞肺癌)、DMS114(小细胞肺癌)、DMS53(小细胞肺癌)和NCI-H69(小细胞肺癌)细胞。SH-J1、SCK和Choi-CK细胞系获赠自Daegon Kim博士(全北国立大学医学院(Medical School，Chonbuk National University))以及其它癌细胞系购自ATCC。正常肝细胞和HUVEC(人脐静脉内皮细胞)均购自Cambrax，使用含有10％FBS(Gibco)的EGM-2培养基(Hyclone)在37℃、5％CO₂的培养箱中培养。通过Ficoll-梯度离心从人血分离外周淋巴细胞(PBL)。
【0083】
【0084】实施例2：结合癌细胞Choi-CK和SCK的A10-A3单克隆抗体的制备
【0085】
【0086】使用细胞解离缓冲液(Invitrogen)分离培养的Choi-CK和SCK癌细胞，并且5×10⁵个细胞悬浮于30μl的PBS。用Choi-CK细胞注射Balb/c小鼠的右爪垫，并且3天后用SCK细胞注射左爪垫。然后以3-4天的间隔，小鼠被加强6次，并且最后在细胞融合的前一天进行免疫。在细胞融合前两周，待与淋巴结细胞融合的F0骨髓瘤细胞(ATCC，USA)的培养在含有10％FBS的DMEM(Gibco)中开始。从用Choi-CK和SCK细胞免疫的小鼠去除腘淋巴结，用DMEM培养基(Gibco)充分洗涤并精细切片。将细胞悬浮液转移至15-ml管。通过离心收集F0骨髓瘤细胞，悬浮于10ml的DMEM培养基中，并连同淋巴结细胞一起计数。然后，将10⁶个F0骨髓瘤细胞和10⁷个淋巴结细胞在50-ml管中混合，并且以200×g离心5min。弃除上清液后，将管在含有水的烧杯在37℃中温育2min。轻打管以松动细胞沉淀后，将1ml的PEG(Gibco)在超过一分钟的时间里缓慢地加入管中，同时在37℃水浴中轻摇管。在100×g离心细胞2min后，将5ml的DMEM培养基以超过3min缓慢地加入管中，并且将5ml的DMEM培养基以超过2min进一步地缓慢加入。然后通过200×g离心收集细胞。为了增加细胞融合效率和细胞存活率，基本培养基(DMEM+20％FBS)预先补充10％杂交瘤克隆因子(BioVeris，USA)。回收的细胞被小心地悬浮在30ml补充杂交瘤克隆因子的正常培养基(DMEM+20％FBS)中。将细胞悬浮液在37℃在CO₂培养箱中温育30min后，10⁵个细胞(70μl)被等分至96孔板并在37℃在CO₂培养箱中温育。第二天，将70μl的HAT培养基加入每个孔，并且以3天为间隔在超过2周的时间内，观察板内是否在HAT培养基中形成集落。通过淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合获得的杂交瘤集落的培养上清液用于下面的测试，其中淋巴细胞从用Choi-CK细胞免疫的小鼠淋巴结中和从用SCK细胞免疫的小鼠的淋巴结中分离。
【0087】使用夹层ELISA(酶联免疫吸附分析)选择表达抗体的克隆。将100μl的杂交瘤培养物加入用2μg/ml的抗-小鼠IgG或IgM抗体包被的板，并使其在37℃反应1小时。然后在1∶5,000稀释的辣根过氧化物酶(HRP；Sigma)-偶联的抗-小鼠IgG或IgM抗体中温育板1小时。用含有0.08％Tween 20的磷酸盐缓冲液洗涤板后，将含有OPD(Sigma)和H₂O₂的底物溶液加至每个孔，并且使用分光光度计在492nm测定吸光率用以选择产生抗体的克隆。
【0088】在所选择的克隆中，测试相对稳定地分泌单克隆抗体的杂交瘤的培养上清液与SCK和Choi-CK细胞的结合能力。详细地，用细胞解离缓冲液(Gibco)在37℃处理培养的Choi-CK细胞20min以将其解离至单个细胞，并将其通过40-μm的渗滤器。5×10⁵个细胞用于流式细胞术。将解离至单个细胞的SCK和Choi-CK细胞悬浮于PBA(PBS中1％BSA)，并使抗体上清液在4℃反应30min。以1200rpm离心细胞5min后，弃除100μl的上清液，并且使细胞与1∶200稀释的抗-小鼠Ig-FITC(BD)在4℃反应30min。用PBA洗涤细胞两次后，选择碘化丙锭(propidium iodide，PI)阴性细胞并使用流式细胞仪(FACS caliber)评价与SCK和Choi-CK细胞的结合能力。
【0089】选择分泌与SCK和Choi-CK细胞结合的抗体的各种杂交瘤，其通过连续亚培养(传代培养)来稳定，然后亚克隆。选择分泌抗体A10-A3的杂交瘤，其通过亚克隆稳定地保持对SCK和Choi-CK细胞的特异性。
【0090】分泌A10-A3抗体的杂交瘤命名为“杂交瘤A10-A3”。该杂交瘤于2006年2月20日保藏于KCTC(韩国典型培养物保藏中心；韩国生物科学和生物技术研究所(KRIBB)，52，Oun-dong，Yusong-ku，韩国大田市)并指定登录号KCTC10909BP。
【0091】
【0092】实施例3：在肺癌细胞系中评价L1CAM的细胞表面表达
【0093】
【0094】在无血清培养基(PFHM，Invitrogen)中培养杂交瘤A10-A3细胞系，并且使用G蛋白-琼脂糖柱(Pharmacia，Sweden)纯化分泌的A10-A3抗体(Fike等，Focus 12：79，1990)。使用荧光染色，根据与实施例3相同的方法(图1)评价纯化的A10-A3抗体对胆管癌细胞的结合能力。图1中，用实线描绘轮廓的空峰代表用单克隆抗体A10-A3和4-63以及已知的抗L1CAM抗体5G3(Pharmingen，San Diego，USA)和UJ127(Chemicon)处理的样品，而实峰是单独存在第二抗体的背景荧光。使用流式细胞仪分析A10-A3、4-63、5G3和UJ127抗体对各种癌细胞的结合能力。FACS分析揭示，单克隆抗体结合NCI-H522、A549、DMS114、DMS53和NCI-H69肺癌细胞(图1的图A、B、C和D)，而它们不结合ACHN癌细胞、正常细胞、肝细胞、HUVEC或外周淋巴细胞(PBL)。
【0095】
【0096】实施例4：单克隆抗体A10-A3识别的抗原的分离和鉴定
【0097】
【0098】实施例4-1：抗原分离
【0099】
【0100】按如下分离单克隆抗体A10-A3识别的细胞表面蛋白。首先，用PBS洗涤Choi-CK细胞并用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素(Pierce，Rockford，IL)生物素化该细胞。在裂解缓冲液(25mM Tris-HCl，pH 7.5，250mM NaCl，5mM EDTA，1％Nonidet P-40，2μg/ml牛胰蛋白酶抑制剂，100μg/ml苯甲基磺酰氟，5μg/ml抑蛋白酶醛肽)中以4℃温育细胞20min。离心细胞去除细胞碎片后，回收上清液，并使用二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白分析试剂盒(Pierce)测定蛋白浓度。
【0101】在4℃将细胞裂解物与20μlG蛋白plus-琼脂糖(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz)反应2小时，并离心去除非特异性结合G蛋白plus-琼脂糖的蛋白。回收上清液并将其与约1μg抗体在4℃反应12小时。将20μl的G蛋白plus-琼脂糖加入反应混合物，然后在4℃温育2小时。离心反应混合物并回收沉淀物。用细胞裂解缓冲液洗涤回收的沉淀物十次以上，并使用10％SDS-PAGE分离保留的蛋白。
【0102】将蛋白转移至硝酸纤维素膜上并进行蛋白质印迹。用含有5％脱脂奶的PBST(PBS+0.1％Tween 20)封闭硝酸纤维素膜1小时，并用PBST洗涤两次以上。然后，将印迹(blot)与链酶抗生物素-辣根过氧化物酶(HRP)偶联物(1∶1,500；Amersham Biosciences)温育1小时。用PBST洗涤印迹五次后，用ECL试剂(AmershamBiosciences)显影生物素化的蛋白。
【0103】发现A10-A3抗体结合约200kDa的蛋白(图2中的图A)。为了收集被A10-A3抗体免疫沉淀的蛋白，将1×10⁸Choi-CK细胞的细胞裂解物根据如上所述的相同方法进行免疫沉淀，并在SDS-PAGE凝胶上电泳。用考马斯G250(Biorad)染色凝胶。
【0104】
【0105】实施例4-2：使用质谱鉴定抗原
【0106】
【0107】用考马斯G250(Coomassie G250)(BIO-RAD)染色含有被A10-A3抗体疫沉淀的蛋白的SDS凝胶。从凝胶上切割蛋白条带，用30％甲醇洗涤5min，并精细切割。凝胶片用100％乙腈脱水10min，并在真空离心机中完全干燥30min。将干燥的凝胶片与50mM碳酸氢铵中的300ng胰蛋白酶(Promega)在37℃温育16小时。用100μl的50mM碳酸氢铵提取消化的肽三次，并在真空离心机中干燥。使用电喷雾四极杆飞行时间串联质谱(electrospray quadrupole time-of-flight tandem massspectrometry，ESI Q-TOF MS/MS)(Q-TOF micro，MicroMass)分析肽混合物。A10-A3抗体识别的蛋白被鉴定为L1细胞粘附分子(L1CAM)(图3)。图3中，下划线区域表示由Q-TOF实际鉴定的氨基酸序列。因此，如实施例3-1所述，用购自Chemicon(USA)的抗L1CAM单克隆抗体JU127.11免疫沉淀生物素标记的Choi-CK细胞裂解物，并用ECL显影印迹。如图2(A)所示，发现A10-A3抗体和抗L1CAM抗体免疫沉淀了约200kDa的相同分子量的蛋白。
【0108】
【0109】实施例4-3：使用蛋白质印迹鉴定L1CAM抗原
【0110】
【0111】为了确定A10-A3抗体识别L1CAM，使用A10-A3抗体在Choi-CK细胞裂解物中进行免疫沉淀。
【0112】在4℃将细胞裂解物与20μl G蛋白plus-琼脂糖(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz)反应2小时，并离心去除非特异性结合G蛋白plus-琼脂糖的蛋白。回收上清液并将其与约1μg抗体在4℃反应12小时。将20l的G蛋白plus-琼脂糖加入反应混合物，然后在4℃温育2小时。离心反应混合物并回收沉淀物(图2的预洗)。用细胞裂解缓冲液洗涤回收的沉淀物多于十次，并使用不含巯基乙醇的10％SDS-PAGE分离保留的蛋白。
【0113】将蛋白转移至硝酸纤维素膜上并进行蛋白质印迹。用含有5％脱脂奶的PBST(PBS+0.1％Tween 20)封闭硝酸纤维素膜1小时，并用PBST洗涤两次以上。然后，用作为初次抗体的已知抗L1CAM抗体UJ127(Chemicon)温育印迹1小时。用PBST洗涤五次后，用抗小鼠IgG-HRP偶联物(1∶1,500；Sigma)温育印迹1小时。用PBST洗涤印迹五次后，用ECL试剂(Amersham Biosciences)显影生物素化的蛋白。发现抗L1CAM抗体结合约200kDa的蛋白，该蛋白用A10-A3抗体免疫沉淀(图2的图B)。该结果证实A10-A3抗体识别L1CAM。
【0114】
【0115】实施例4-4：可溶性L1CAM的表达
【0116】
【0117】为了构建表达可溶性L1CAM的表达载体，使用RNA提取试剂盒(Rocheco.)从Choi-CK癌细胞分离总RNA。使用RT-PCR试剂盒(Roche Co.)进行PCR，该PCR使用该分离的总RNA作为模板，两个末端引物为Ig-dom-F(5′-GAG GAG GAATTC CGG CGC CGG GAA AGA TGG TCG TGG CG-3′，38mer)和L1-Fn-Stop-R(5′-CTC TAG AGT TCT CGA GTC AGA GCC TCA CGC GGC C-3′，34mer)以及pfu聚合酶(Solgent Co.)。PCR条件包括在95℃预温育5min，以95℃30sec、58℃30sec和72℃2min进行25个循环，以及最终在72℃延伸10min。
【0118】用EcoR I和Xho I消化被扩增的可溶性L1DNA片段，并在1％琼脂糖凝胶上电泳。将L1DNA片段从凝胶上切离，并用凝胶纯化试剂盒(Intron co.)纯化。使用T4DNA连接酶(Roche co.)，在16℃将消化的L1DNA片段与用EcoR I和XhoI消化的pJK-dhfr2表达载体(Aprogen)连接30min，并通过热击转化至大肠杆菌DH5α。从转化的细胞分离质粒DNA，并测定其DNA序列。DNA测序显示成功克隆可溶性L1CAM的cDNA。如此获得的表达载体被命名为“pJK-dhfr2-L1-单体”。
【0119】为了以单体形式表达可溶性L1CAM，将pJK-dhfr2-L1-单体DNA转染至HEK293T细胞(ATCC CRL11268，下文中称为293T)。
【0120】将10μg的表达载体DNA和Lipofectamine 2000(脂转染试剂)(Invitrogenco.)单独地加至500μl Opti-MEM培养基(Gibco BRL)，并使其在室温静置5min。然后，将该载体DNA与lipofectamine混合，并且使混合物在室温反应15min。在DNA-lipofectamine复合物形成过程中，小心地用PBS(pH 7.4)洗涤293T细胞，并将Opti-MEM培养基小心地加至细胞，然后去除。将DNA-lipofectamine复合物与4mlOpti-MEM培养基混合，并小心地滴在细胞上。将细胞于37℃在培养箱内温育。6小时后，细胞再次给予5ml Opti-MEM培养基，并进一步培养3天。
【0121】
【0122】实施例4-5：抗体与可溶性L1CAM的结合特异性的评价
【0123】
【0124】将表达可溶性L1CAM的293T细胞的培养液和另一种不表达可溶性L1CAM的293T细胞培养液进行10％ SDS-PAGE，然后进行蛋白质印迹。用含有5％脱脂奶的TBST(TBS+0.05％ Tween 20)在4℃封闭硝酸纤维素膜1小时，并用TBST洗涤两次以上。然后，用初次抗体——已知的抗L1CAM抗体UJ127(Chemicon)和5G3(Pharmingen)以及A10-A3和4-63抗体温育印迹1小时，每种抗体在含有5％脱脂奶的TBST中稀释1∶10,000。用TBST洗涤五次后，用抗小鼠IgG-HRP偶联物(1∶1,500；Sigma)温育印迹1小时。用PBST洗涤印迹五次，并用ECL试剂(AmershamBiosciences)显影。发现每种抗体结合约200kDa的可溶性L1CAM(图2(C))。而且，使用上述抗体对表达L1的细胞培养物的ELISA显示，每种抗体对表达的可溶性L1CAM具有结合特异性。
【0125】
【0126】实施例5：胆管癌组织的免疫组织化学染色
【0127】
【0128】制备肿瘤的3μm厚的切片用于胆管癌组织的免疫组织化学染色。将切片放置于用聚-L-赖氨酸包被的载玻片上，并在60℃干燥3小时。然后在室温将切片在二甲苯中脱蜡5min，三次，并在100％、90％、80％以及随后在70％的醇中水合，每种1min。将载玻片浸泡在靶标恢复液(target retrieval solution)(DAKO，Carpinteria，CA)中以恢复抗原性，并用TBST(Tris缓冲盐-Tween 20)洗涤，使用压力锅将TBST预先煮沸4min。将无生物素的酪胺信号扩增系统，CSA II(DAKO，Carpinteria，CA)用于免疫组织化学染色的高灵敏检测。将载玻片在3％过氧化氢中温育5min以阻断抗体的非特异性结合。用TBST洗涤两次，每次5min后，用充分地无血清的蛋白封闭液温育切片5min以阻断蛋白的非特异性结合。用初次抗体(A10-A3和4-63，1∶50稀释)温育组织切片15min，然后用抗小鼠免疫球蛋白-HRP温育15min。然后用扩增试剂和抗-荧光素-HRP温育切片，每种温育15min。最后，用DAB染色切片5min，并且用Meyer′s苏木精复染，随后用TBST洗涤5min，两次。根据如上所述的相同方法来染色阴性对照，除了用不含有初次抗体的正常绵羊血清或正常小鼠IgG1血清代替初次抗体。发现A10-A3或4-63抗体都不结合正常组织，但观察到它们结合胆管癌组织(图4)。
【0129】该结果说明L1CAM在胆管癌组织中的表达。
【0130】
【0131】使用A10-A3抗体进行免疫组织化学染色分析，在42位肝内胆管癌患者的45.2％和103位肝外胆管癌患者的39.8％中观察到L1CAM的表达(图5)。特别地，在侵入前端L1CAM以高水平表达，这解释了胆管癌的转移起始(图4)。
【0132】
【0133】实施例6：胆管癌中L1CAM表达率和胆管癌患者存活率的统计学分析
【0134】
【0135】在患有肝外胆管癌的患者(60例)中分析L1CAM表达率和存活率之间的相关性。在显示高L1CAM表达率的患者组中发现其总存活(OS)与无病存活(DFS)的统计学显著性降低，即：与那些具有低L1CAM表达率的患者组相比，死亡风险增加(图6)。如存活曲线所示，在显示高和低L1CAM表达率的胆管癌患者之间2年OS中存在很大差异和统计学显著性。而且，具有低L1CAM表达率的胆管癌患者的2年DFS与具有高L1CAM表达率的胆管癌患者的2年DFS之间存在具有统计学显著性的差异。
【0136】相反，患者的存活与EGFR(表皮生长因子受体)表达率之间的相关性不存在统计学显著性(图6)，已知EGFR在胆管癌或其他肿瘤中过量表达。这些结果暗示L1CAM的抗体对胆管癌的诊断和治疗有用，并可应用于胆管癌转移的早期诊断，从而增加其对疾病的治疗作用。从L1CAM表达率与存活之间相关性的统计分析数据明显得出，具有L1CAM高表达率的胆管癌患者发生比L1CAM低表达率患者更高的死亡率。
【0137】
【0138】通过说明L1CAM是不良预后因子，其结果显示L1CAM可以是治疗胆管癌的靶标。虽然EGFR在胆管癌中高水平表达，但是相反，由EGFR表达率和存活率的相关性推断，EGFR——其已作为治疗剂的靶标目前临床上用于结肠癌的治疗(例如cetuximab，EGFR的嵌合抗体)——被证实不是胆管癌的不良预后因子。这证实不是所有在癌症中过量表达的分子都是癌症的不良预后因子并因此作为其治疗的重要靶标。
【0139】
【0140】实施例7：L1CAM表达的阻抑对胆管癌细胞的影响
【0141】
【0142】实施例7-1：使用siRNAs在胆管癌细胞中抑制L1CAM表达
【0143】
【0144】在Choi-CK和SCK细胞中敲除L1CAM的表达。为此，用L1CAM的两条siRNA寡核苷酸(5′-TGGTACAGTCTGGGdtdt-3′和5′-CAGCAACTTTGCTCAGAGGdtdt-3′)或非特异性寡核苷酸(5′-CAGTCGCGTTTGCGACTGGdtdt-3′)转染癌细胞并将其培养72小时。通过流式细胞术、RT-PCR和使用A10-A3抗体的蛋白质印迹，评价L1CAM的敲除。结果，与用非特异性siRNA处理的对照相比，经测定用siRNAs处理的Choi-CK和SCK细胞在L1CAM的总表达和细胞表面L1CAM水平上降低(图7中的图A)。
【0145】
【0146】实施例7-2：用针对L1CAM的siRNA处理后胆管癌细胞活性的评价
【0147】
【0148】比较用针对L1CAM的siRNA和非特异性siRNA转染的胆管癌细胞之问的细胞增殖、侵入和迁移。通过培养相同数目的细胞72小时后借助台盼蓝计算细胞数目来评价增殖程度。分别使用QCM24孔细胞侵入分析试剂盒(Chemicon)和QCM 24孔比色细胞迁移分析试剂盒(Chemicon)分析侵入和迁移程度。用siRNA敲除L1CAM的癌细胞，与正常水平表达L1CAM的癌细胞相比，前者显示出增殖、侵入和迁移程度的降低。这些结果显示，L1CAM在胆管癌细胞的生长、迁移和侵入中发挥作用(图7中的图B)。
【0149】
【0150】实施例8：L1CAM特异性的抗体对胆管癌细胞生长的抑制
【0151】
【0152】评价抗L1CAM抗体对胆管癌细胞生长的抑制效果。A10-A3抗体可结合的Choi-CK和SCK细胞用于该测试，而卵巢癌细胞系(SK-OV-3)和ACNH分别作为阳性对照和阴性对照。将这些细胞以2×10⁵细胞/孔的密度接种于每孔含有3ml培养基的24孔板并培养。将单克隆抗体以10μg/ml的浓度加至每孔，随后将细胞在37℃培养箱中温育10天。收集后，使用0.2％台盼蓝对存活的和死亡的细胞计数，并且细胞的存活率表达为总细胞数的百分比。当用A10-A3抗体处理时，Choi-CK和SCK细胞的生长速率明显地降低，类似SK-OV3细胞，而ACHN细胞正常增殖(图8中图A)。另一方面，发现4-63抗体抑制胆管癌细胞的生长(图8中图B)。
【0153】当以此治疗胆管癌细胞时，已知特异性地结合L1CAM的UJ127(Chemicon)抗体显著抑制癌细胞的生长。但是，在5G3(Pharmingen)的情况下——其也特异性地结合L1CAM——仅微微抑制胆管癌细胞(Choi-CK)的生长(图8中的图C)。发现5G3抗体结合Choi-SK细胞(图1中图C)。这些结果显示，抗L1CAM抗体与肿瘤细胞的结合不一定抑制肿瘤细胞的生长。
【0154】
【0155】实施例9：L1CAM特异性抗体对胆管癌细胞侵入和迁移的抑制作用
【0156】
【0157】使用QCM 24孔细胞侵入分析试剂盒(CHEMICON)进行细胞侵入分析。使用300μl的预热无血清培养基(RPMI，10mM HEPES，pH 7.4)在室温再水合每个插入物(insert)的ECM层30min。用PBS洗涤Choi-CK、SCK、SK-OV3和ACHN细胞两次，并用3ml胰蛋白酶-EDTA在培养箱中于37℃处理。收集分开的细胞并在200μl侵入培养基(RPMI，10mM HEPES，pH 7.4，0.5％BSA)中调整至密度1×10⁵细胞。然后将细胞插入至每个插入物，并用A10-A3抗体、4-63抗体、5G3抗体(10μg/ml)和正常小鼠IgG(10μg/ml)温育。用补充10％FBS的侵入培养基填充下室(lowerchamber)，并在培养箱中于37℃温育72小时。然后，去除保留在每个插入物中的细胞和培养基，并将每个插入物转移至新孔。将每个插入物置于225μl预热的细胞脱离溶液(detachment solution)，并在培养箱中于37℃温育30min。振荡插入物以使保留的细胞完全脱离，并将75μl的裂解缓冲液/染液加入到每个含有细胞和细胞脱离溶液的孔，然后在室温温育15min。将200μl的混合物转移至96孔板，在480/520nm读取荧光。发现A10-A3抗体抑制Choi-SK、SCK和SK-OV3的细胞侵入，但不诱导细胞侵入的抑制(图9中的图A)。而且，4-63抗体降低Choi-SK细胞的侵入(图9中的图A)。5G3抗体对Choi-SK细胞侵入抑制的效果低于A10-A3和4-63抗体(图7中的图A)。
【0158】用如上所述的相同方法进行细胞迁移分析，除了将胶原I型以10g/ml的浓度铺层于插入物的底部。观察到A10-A3抗体抑制Choi-SK、SCK和SK-OV-3的细胞迁移，但不抑制ACHN的细胞迁移(图9)。而且，所述抗体抑制Choi-SK、SCK和SK-OV-3的迁移(图9)。
【0159】
【0160】实施例10：A10-A3抗体对癌细胞信号转导的抑制作用
【0161】
【0162】实施例10-1：A10-A3抗体对癌细胞的PCNA表达的抑制
【0163】
【0164】进行蛋白质印迹以检测是否增殖性细胞核抗原(PCNA)的表达——说明细胞增殖——被A10-A3抗体抑制。在这一点上，用A10-A3或IgG 10温育Choi-SK细胞72小时，收集并溶解于细胞裂解缓冲液。使用BCA(二辛可宁酸)蛋白分析试剂盒(Pierce)测定蛋白浓度。将40μg的蛋白在8％SDS-PAGE上电泳，并以25V 90min转移至硝酸纤维素膜上。将印迹在5％脱脂奶中4℃过夜封闭，并用小鼠单克隆抗-PCNA(Novocastra Laboratories 1∶500)抗体和抗β肌动蛋白(Oncogene，1∶4000)抗体温育1小时。然后，用抗小鼠辣根过氧化物酶-偶联抗体(Cell Signaling，1∶1000)处理膜并用PBST洗涤，之后用增强的化学发光试剂(ECL)(Amersham PharmaciaBiotech)使得PCNA和β-肌动蛋白可见。观察到只有用A10-A3抗体处理的Choi-SK细胞存在显著降低的PCNA表达。
【0165】
【0166】实施例10-2：PCNA的表达对ERK磷酸化的抑制
【0167】
【0168】进行蛋白质印迹以检测A10-A3抗体是否降低参与肿瘤细胞生长、迁移和存活的促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)。用10μg/ml的A10-A3抗体或小鼠IgG温育Choi-SK细胞72小时，收集并用细胞裂解缓冲液裂解。使用二辛可宁酸(BCA)蛋白分析试剂盒(Pierce)测定蛋白浓度，并将40μg的蛋白在12％SDS-PAGE上电泳。以25V 90min将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。将印迹用5％脱脂奶于4℃过夜封闭，并用在1％脱脂奶中的兔多克隆抗磷酸MAPK抗体(Ab cam，以1∶1000稀释)过夜温育。根据如上所述的相同方法处理相同量的蛋白，以研究非磷酸化MAPK的表达，并且用抗-MAPK抗体(Ab cam，以1∶1000稀释)温育被封闭的硝酸纤维素膜1小时。用抗兔HRP偶联抗体(Cell Signaling，以1∶10000稀释)温育印迹。用PBST洗涤印迹后，使用ECL(Amersham Pharmacia Biotech)检测磷酸MAPK和MAPK。在表达相同MAPK的Choi-CK细胞中，只有那些用A10-A3抗体处理的细胞在磷酸-MAPK水平上显著降低(图10A)。
【0169】
【0170】实施例10-3：用A10-A3抗体抑制AKT的磷酸化
【0171】
【0172】进行蛋白质印迹以检测A10-A3抗体是否降低参与肿瘤细胞存活的AKT磷酸化。用10μg/ml的A10-A3或小鼠IgG温育Choi-CK细胞1、1.5和2小时，收集并用细胞裂解缓冲液裂解细胞。使用BCA蛋白分析试剂盒(Pierce)测定蛋白浓度，并将40μg的蛋白在12％SDS-PAGE上电泳。以25V、90min将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。将因此形成的印迹用5％脱脂奶于4℃过夜封闭，并用在1％脱脂奶中的兔多克隆抗磷酸Akt抗体(Ab cam，1∶1000稀释)和兔多克隆抗Akt(Abcam，1∶1000稀释)过夜温育，随后用抗兔IgG HRP(Santa Cruz 1∶1000稀释)反应1小时。用PBST洗涤印迹后，使用ECL(Amersham Pharmacia Biotech)检测磷酸Akt和总Akt。只有在A10-A3抗体处理的Choi-CK细胞中，磷酸-Akt水平显著降低(图10B)。
【0173】
【0174】实施例10-4：用A10-A3抗体抑制FAK激活
【0175】
【0176】进行蛋白质印迹以检测A10-A3抗体是否降低在肿瘤细胞的生长和迁移中发挥重要作用的黏着斑激酶(FAK)的磷酸化。用10μg/ml的A10-A3抗体温育Choi-SK和SCK细胞0.5、1、1.5和2小时，收集并用细胞裂解缓冲液裂解细胞。使用BCA蛋白分析试剂盒(Pierce)测定蛋白浓度，并将40μg的蛋白在7.5％SDS-PAGE上电泳。以25V 90min将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。用5％脱脂奶将如此形成的印迹4℃过夜封闭，并用在1％脱脂奶中的兔多克隆抗磷酸FAK抗体(Ab cam，1∶1000稀释)和抗-β-肌动蛋白(Oncogene，1∶4000稀释)温育1小时。然后用抗兔HRP-偶联抗体(Cell Spring，1∶10000稀释)温育1小时。用PBST洗涤印迹后，使用增强的化学发光试剂(ECL)(Amersham Pharmacia Biotech)检测磷酸FAK和β-肌动蛋白水平。在用A10-A3抗体处理的Choi-CK和SCK细胞中都观察到磷酸-FAK水平的降低(图10C)。
【0177】
【0178】实施例11：在小鼠模型中A10-A3抗体对癌细胞的抑制活性的分析
【0179】
【0180】通过Central Lab.Animal Inc.从Japan SLC购买6～8周龄且体重18～22g的裸鼠Balb/c nu/nu，并在韩国生物科学和生物技术研究所的实验室习服(驯化)一周。将Choi-CK细胞(3×10⁶)皮下移植入小鼠并在第20天生长成具有390mm³大小的肿瘤块(图10A)。根据公式V＝长轴(mm)×短轴(mm)×高度(mm)×1/2来估定肿瘤体积。在最后一天，用CO₂气体处死小鼠，并且分离和称重肿瘤。还测量小鼠体重以测定毒性。使用ANOVA(Prism，GraphPad Software，USA)和t检验(students t-test)来评价标准偏差(SDs)和p值。
【0181】
【0182】当从第1天起，一周三次将A10-A3抗体以10mg/kg的剂量注射入尾静脉时，直到第20天观察到有效的抗癌症效果(图1A)。将小鼠IgG抗体以相同剂量注射作为对照。经测定标准肿瘤体积为232mm³，其说明抗癌症活性比对照高约40％(图11A)。在最后一天(第20天)，分离并称重肿瘤(图11B)。对照组和A10-A3-施用组的标准肿瘤重量分别为872mg和516mg，其说明的事实是A10-A3抗体的抗癌症活性比对照的抗癌症活性高40％。
【0183】监测裸鼠体重20天以预测A10-A3的毒性。而且，用裸眼观察小鼠的行为(图11D)。在第20天观察到与对照相比，用感兴趣抗体处理的小鼠既没有体重变化，又没有异常行为。
【0184】
工业实用性
【0185】到目前所述为止，本发明首次发现L1CAM表达在胆管癌的细胞表面上，在癌症的生长和侵入中发挥重要作用并且是胆管癌的不良预后因子。因此，抗体——结合胆管癌细胞表面的L1CAM蛋白，或siRNAs、反义寡核苷酸或shRNAs——在胆管癌细胞中阻抑L1CAM表达，和包括根据本发明的抗体、siRNAs、反义寡核苷酸或shRNAs的药物组合物可应用于胆管癌的治疗，原因在于它们被证实抑制胆管癌的生长、侵入和迁移。
【0186】