外泌多糖 【技术领域】
本发明涉及外泌多糖及其在治疗和预防炎性病症中的用途。
背景技术
胃肠道在内部环境和来自食物来源的抗原以及外部环境中的微生物的不断攻击之间提供保护性界面(Sanderson等，1993)。估计成年人肠内微生物区系的复杂生态系统潜伏了500种不同的细菌物种。由于毒素生成、粘膜侵入或致癌物和炎症应答的激活，这些物种中的一些被认为是潜在有害的(Salminen，1998)。然而，已经鉴定出具有健康促进活性的细菌菌株。
益生菌是有益的细菌，其存在于健康肠微生物区系中，并且被定义为通过改善其肠内微生物平衡给宿主动物带来有益影响的活的微生物群。它们由在实验室条件下培养然后用于使由于例如压力、疾病或者由于使用抗生素而引起的不平衡微生物区系恢复其平衡的“友好细菌”组成。重要地是，已经证明摄入益生菌可能能够通过降低局部促炎细胞因子的产生稳定肠粘膜内的免疫屏障(Isolauri，1993；Majamaa，1997)。通过益生菌治疗所引起的固有微生物区系特性的改变被证明使某些克罗恩氏病(Malin，1996)、食物过敏(Majamaa，1997)和特应性湿疹(Isolauri，2000)特征性的免疫紊乱发生逆转。
肠内微生物区系中存在的主要细菌物种之一为双歧杆菌(Bifidobacterium)。在肠内，双歧杆菌使糖发酵生成乳酸。长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)基因组编码很多专门用于低聚糖分解代谢的蛋白质，使该细菌能够使用所谓的“不易消化”的植物聚合物或宿主来源的糖蛋白和糖缀合物。认为双歧杆菌与其它胃肠细菌竞争以及其在胃肠区域的细菌菌群中占有大百分比的能力可能部分地归因于其能够使用多种分子以提供能量。
尽管婴儿双歧杆菌(B.infantis)、短双歧杆菌(B.breve)和长双歧杆菌是婴儿肠内最大的细菌群，但据说双歧杆菌仅是成年人体内第三或第四大的细菌群(并且仅占成年人粪便菌丛的3-6％)。实际上，人体内这些细菌的数量随着年龄减少。在母乳喂养的婴儿体内，双歧杆菌约构成他们肠内细菌的90％；然而，这个数量在牛奶喂养的婴儿体内较低。当母乳喂养的婴儿的食物改变成牛奶和固体食物时，人体内所发现的诸如拟杆菌和链球菌乳酸杆菌(Streptococci lactobacilli)的其它细菌的增加的数量加入到双歧杆菌中来。
已证明双歧杆菌在免疫系统的调节中起作用。认为短双歧杆菌释放产生抗TNF作用的能够跨越肠屏障的代谢产物。已有报道称通过给受试动物喂食乳酸细菌制剂降低了白细胞介素-10(IL-10)缺陷小鼠内的粘膜炎症(Madsen，K等，1997；O’Mahony等，2001；McCarthy等，2004)。WO 00/41168公开了一种从被切除并经清洗的人的胃肠道中分离出的婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)菌株，其在人体内经口服消耗后具有显著的免疫调节作用。
科学研究显示出可能由微生物区系(消化系统的自然微生物固有种群)缺乏或损害所引起的疾病的发病率增加，所述疾病例如胃肠道(GIT)感染、便秘、肠易激综合征(IBS)、炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病和溃疡性结肠炎、食物过敏、抗生素引起的腹泻、心血管疾病以及诸如结直肠癌的某些癌症。有证据显示单独用婴儿双歧杆菌菌株进行治疗后，IBS症状的严重程度降低(Whorwell等，2006)。有效性与系统免疫应答的调节相关，这表明作用机制部分地是免疫介导的(O’Mahony等，2005)。本发明描述了从婴儿双歧杆菌中分离的化合物，其在体外复制婴儿双歧杆菌的免疫调节活性。
发明简述 本发明提供了由婴儿双歧杆菌产生的表现出免疫调节特性的多糖。该多糖可以是分泌型的(外泌多糖)或非分泌型的。
根据本发明的一个方面，提供了包含以下结构的分离多糖：
[-β(1，3)-D-GalpNAc-β(1，4)-D-Glcp-]
n。
所述多糖可以从细菌双歧杆菌菌株中分离。所述菌株可以是例如NCIMB 41003的菌株。
根据本发明的另一个方面，提供了本发明的多糖作为药物的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了本发明的多糖在制备用于治疗或预防不良炎症活动的药物中的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了本发明的多糖在制备用于治疗或预防不良胃肠炎症活动的药物中的用途。
在一个实施方案中，所述胃肠炎症活动是克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、贮袋炎(pouchitis)、感染后结肠炎、难辨梭菌(Clostridiumdifficile)相关性腹泻、轮状病毒(Rotavirus)相关性腹泻或感染后腹泻。
根据本发明的另一个方面，提供了本发明的多糖在制备用于治疗或预防类风湿性关节炎的药物中的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了本发明的多糖在制备用于治疗或预防自身免疫疾病的药物中的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了药物组合物，其包含本发明的多糖和药用可接受载体。
在本发明进一步的实施方案中，还提供了包含所述分离多糖的食品。例如所述食品可以是选自酸乳酪、谷物、饮料等中的一种或多种。
发明详述 现在将以非限制性实施例的方式描述本发明的各种优选特征和实施方案。
除非另外说明，本发明的实施将采用本领域技术人员能力范围内的化学、微生物学和免疫学的常规技术。这些技术在文献中有所解释。
我们已经鉴定出具有免疫调节特性的双歧杆菌分泌的外泌多糖。
外泌多糖 本发明涉及由婴儿双歧杆菌生物合成的外泌多糖。多糖由多种微生物合成并且通常是与细胞表面保持相连的重复糖单元或是分泌型的或者两者都是。它们在细胞应激反应中起重要作用或者能够促成病原体的毒力。最近，脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)多糖的免疫调节作用已经得到证明(Mazmanian等，2005)。
治疗 要理解本文所有提及治疗都包括根治疗法、姑息疗法和预防疗法。特别优选哺乳动物的治疗。人和兽的治疗都在本发明的范围之内。
炎症 炎症是对细胞损伤的局部应答，其症状为毛细管扩张、白细胞浸润、发红、发热、疼痛、肿胀和经常性功能丧失。在几个水平上对炎症应答实施控制(综述参见Henderson B.和Wilson M.1998)。控制因子包括细胞因子、激素(例如氢化可的松)、前列腺素、活性中间体和白三烯。
细胞因子是低分子量的生物活性蛋白质，其参与免疫应答和炎症应答的产生和控制，同时也调节发育、组织修复和造血。它们提供了白细胞本身之间以及与其他细胞类型之间的沟通手段。大多数细胞因子是多效性的并且表达多重的生物重叠活性。
细胞因子级联和网状系统控制炎症应答，而不是某一特定的细胞因子对某种特定细胞类型的作用(Arai KI等，1990)。炎症应答的减弱引起适当的激活信号和其他炎症介质浓度的降低，导致炎症应答的停止。肿瘤坏死因子α(TNFα)是关键的促炎细胞因子，因为它启动导致炎症状态的细胞因子级联和生物效应。因此，抑制TNFα的试剂目前正被用于炎性疾病的治疗，例如英夫利昔单抗(infliximab)。
促炎细胞因子被认为在包括炎性肠病(IBD)在内的许多炎性疾病的发病机制中起重要作用。目前治疗IBD的治疗方法旨在降低这些促炎细胞因子的水平。本发明的外泌多糖可能在治疗炎性病症中具有潜在的应用。这可以通过，例如增加诸如IL-10但不限于IL-10的非炎性细胞因子的浓度，和/或降低炎性细胞因子的浓度来实现。
炎性肠病 炎性肠病(IBD)的特征是慢性复发性肠炎症。IBD细分为克罗恩氏病和溃疡性结肠炎的表型。克罗恩氏病可能涉及胃肠道的任何部分，但最常见的是末端回肠和结肠。在大约10％的限于直肠和结肠的病例中，不能明确分类成克罗恩氏病或溃疡性结肠炎而将其命名为“不确定性结肠炎”。这两种疾病都包括皮肤、眼和关节的肠外炎症。
克罗恩氏病和溃疡性结肠炎通常被归类为自身免疫疾病，原因是这两种疾病的特点都是导致肠内层中慢性炎症的身体免疫系统的异常应答。在患有其他自身免疫疾病(特别是强直性脊柱炎、银屑病、硬化性胆管炎和多发性硬化)的个体中炎性肠病的患病率增加。
克罗恩氏病 克罗恩氏病是引起消化或胃肠炎症的慢性疾病，其中免疫系统攻击肠。
虽然克罗恩氏病通常影响回肠的末端和结肠的起始端，但它可能累及胃肠道的任何部分。肠炎症是透壁的且不连续的；它可能包含肉芽肿或与肠瘘或肛周瘘相关。CARD15基因和ABCB1基因的等位基因被认为与克罗恩氏病的易感性相关。
溃疡性结肠炎 溃疡性结肠炎是引起大肠内层炎症和疼痛的疾病。它是影响肠的非特异性慢性炎性疾病。在炎症破坏细胞内层的部位形成溃疡并出血。与克罗恩氏病相反，该炎症是连续的且限于直肠和结肠黏膜层；没有观察到瘘和肉芽肿。
在其病因学中遗传和环境因素似乎都是重要的。Fuss等检查了来自溃疡性结肠炎患者固有层的T细胞，并发现它们产生了比对照或克罗恩氏病细胞明显更多量的IL13和IL15，并且几乎不产生IFN-γ。他们的结论是溃疡性结肠炎与由产生IL13并对上皮细胞具有潜在细胞毒性的非典型NKT细胞介导的非典型的Th2应答有关。
贮袋炎 回肠贮袋(ileal reservoir)的慢性和/或急性炎症，所谓的“贮袋炎”，是经常观察到的回肠-肛门贮袋吻合术的长期并发症。在溃疡性结肠炎患者中，贮袋炎的患病率从低于10％到高于40％不等。“贮袋炎”的定义包括临床症状，内窥镜检查下肉眼可见的炎症损害和贮袋黏膜严重的急性炎症的组织学证据。
难辨梭菌相关性腹泻 难辨梭菌是厌氧的革兰氏阳性孢子形成的杆菌，其于1935年首次从健康新生儿的粪便菌丛中分离。直到1978年才建立起其与抗生素引发的假膜性结肠炎(PMC)的关联。几乎所有的抗生素都已经与难辨梭菌腹泻和结肠炎相关，包括万古霉素和甲硝唑(用于其治疗)和癌症化学疗法。关联的频率与使用频率、给药途径和抗生素对结肠微生物区系的影响有关。
肠易激综合征 肠易激综合征(IBS)是干扰大肠(结肠)正常功能的慢性病症。其特点是一组症状-痉挛性腹痛、胃胀气、便秘和腹泻。
IBS引起很大的不适和痛苦，但它不永久损害肠，并且不导致肠出血或任何严重的疾病例如癌症。IBS的体征和症状在人与人之间有着很大的不同并且通常与许多其它疾病并发。
其它活性成分 应当理解本发明的外泌多糖可以进行预防性给药，或者作为治疗方法单独或与其它益生菌和/或益生材料一起给药。而且，所述细菌可以用作使用其它活性材料的预防或治疗方案的一部分，所述其它活性材料例如用于治疗炎症或其它病症(特别是胃肠道的炎症或其它病症)的材料。这种组合可以以单一制剂或分开的制剂，同时或不同时，使用相同或不同的给药途径进行给药。
药物组合物 药物组合物是包含治疗有效量的药物活性剂或由其组成的组合物。优选包含药用可接受载体、稀释剂或赋形剂(包括其组合)。用于治疗用途的可接受载体或稀释剂是药物领域内公知的，并且在例如Remington’sPharmaceutical Science中进行了描述。药用载体、赋形剂或稀释剂的选择可以考虑预期的给药途径和标准药学实践来做出选择。该药物组合物可以包含作为载体、赋形剂或稀释剂或除它们以外的任何合适的粘合剂、润滑剂、助悬剂、包衣剂、增溶剂。
药用可接受载体的实例包括，例如，水、盐溶液、醇、硅酮、蜡、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖类、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、芳香油、单脂肪酸甘油酯和二脂肪酸甘油酯、石化(petroethral)脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
在适当的情况下，所述药物组合物可以通过以下任何一种或多种方式给药：吸入给药、以栓剂或阴道栓剂的形式给药、以洗剂、溶液剂、乳膏剂、软膏剂或喷粉的形式局部给药、通过使用皮肤贴剂给药、以含有诸如淀粉或乳糖的赋形剂的片剂的形式或者以单独或与赋形剂混合在胶囊或卵状小体中的形式口服给药、或以含有调味剂或着色剂的酏剂、溶液剂或混悬剂形式给药，或者它们可以进行肠胃外注射，例如海绵体内、静脉内、肌内或皮下注射给药。为了肠胃外给药，所述组合物最好可以以无菌水溶液形式使用，其可以含有其它物质，例如足够的盐或单糖以使得该溶液与血液等渗。为了含服或舌下给药，所述组合物可以以常规方法配制的片剂或锭剂的形式给药。
可能存在取决于不同给药系统的不同的组合物/制剂要求。举例来说，本发明的药物组合物可以配制成使用微型泵或通过诸如鼻腔喷雾剂或吸入型气雾剂或可吸收溶液剂的粘膜途径进行给药，或者将所述组合物配制成可注射形式通过例如静脉内、肌内或皮下途径进行肠胃外给药。或者，所述制剂可以设计成通过两种途径给药。
现在将通过非限制性实施例并参照附图对本发明的进一步优选的特征和实施方案进行描述。
图1所示为对来源于双歧杆菌35624(NCIMB 41003)产生的条件培养基的外泌多糖(PS1)的纯化方案。
图2所示为双歧杆菌35624(NCIMB 41003)产生的外泌多糖(PS1)的结构。
图3表明了当与人外周血单核细胞在体外共同培养时，从双歧杆菌35624[NCIMB 41003]纯化的外泌多糖(PS1)表现出免疫调节活性。
图4证明在体外PS1限制了响应Toll样受体4(TLR-4)刺激的促炎细胞因子的释放。
图5证明在体内PS1限制了响应Toll样受体4(TLR-4)刺激的促炎细胞因子的释放。
图6证明在体外PS1限制了响应Toll样受体4(TLR-4)再刺激的促炎细胞因子的释放。
在WO 00/42168中描述了所述菌株双歧杆菌35624(NCIMB 41003)菌株，其全部内容以引用的方式并入本文。所述菌株于1999年1月13日保藏于NCIMB。
实施例1-来源于双歧杆菌35624产生的条件培养基的外泌多糖(PS1)的纯化和结构测定 纯化.将100ml添加了0.05％(w/v)半胱氨酸的无菌MRS培养基(CM359MRS Broth，Oxoid Ltd.，Basingstoke，Hampshire，England)置于接种了双歧杆菌35624的250ml无菌锥形瓶中。经接种的培养基在37℃的厌氧条件(10-01Pack-Anaero，Mitsubishi Gas Chemical Company-Ameica，NewYork，NY)下无振荡培养。在以下概述的整个过程中，未经接种的MRS培养基样品用作培养基对照并与经接种的样品进行相同的处理。
生长48小时后，双歧杆菌35624培养物已经达到稳定期并且显示出OD 600nm为大约3(2-3×10
9菌落形成单位/ml)。将该培养物转移到聚碳酸酯离心管中并以40,000X g离心30分钟(JA-20转子，Beckman J2-21离心机，Beckman Coulter，Inc.，Fullerton，CA)，得到澄清的上清液和紧密的细胞颗粒。小心地移除上清液(条件培养基)并用于外泌多糖(EPS)的纯化。将细胞颗粒丢弃。
图1所示为对来源于双歧杆菌35624产生的条件培养基的EPS的纯化方案。除非另外提及，否则所有步骤均在冰上或4℃下进行。将80ml培养物上清液置于具有100,000道尔顿的截留分子量(MW)的超滤装置(VC1042Vivacell 100ml浓缩器，Vivascience，Hannover，Germany)中。样品通过在临床离心机中以2000X g离心进行浓缩。当体积达到约0.5ml后，渗余物(HiMW部分)用磷酸盐缓冲盐水(PBS)渗滤一次并浓缩回约0.5ml。将渗余物转移至标准的15ml离心管中。超滤装置用4ml PBS冲洗，并且将该冲洗物与渗余物合并产生HiMW渗余物部分。
将100％三氯乙酸(TCA)溶液加入到HiMW渗余物部分中至TCA的最终浓度为20％(v/v)。样品在冰上培养2小时，然后以8000X g离心20分钟(JA-20转子)。将含有EPS的上清液转移至30ml透紫外线玻璃(Corex)管中。将含有蛋白质的颗粒丢弃。用3体积的冰冷的95％乙醇处理含有EPS的上清液并在-20℃下培养一整夜。然后该管以8000Xg离心20分钟(JA-20转子)。将上清液丢弃。将含有EPS的颗粒再次悬浮于5ml PBS中，然后与上文一样，用3体积的乙醇使其再次沉淀。该颗粒在冰上风干60分钟，然后再次悬浮于9ml10mM MgCl2、50mM Tris-HCl(pH 7.4)之中。
为了移除核酸，各加入脱氧核糖核酸酶I(LS006331，WorthingtonBiochemical Corporation，Lakewood，NJ)和核糖核酸酶A(R5250，Sigma-Aldrich Corporation，St Louis，MO)至其最终浓度为0.1mg/ml并在37℃下培养2小时。通过加入蛋白酶K(P2308，Sigma-Aldrich)至其最终浓度为0.02mg/ml移除残留的蛋白质，然后在37℃下培养该混合物2小时。如下使蛋白酶K失去活性：在70℃下培养15分钟，然后加入苯甲基磺酰氟(P7626，Sigma-Aldrich)至其最终浓度为0.2mM，在室温下持续15分钟。与上文一样，通过加入3体积的乙醇，从溶液中使纯化的EPS沉淀。将该颗粒再次悬浮于9ml的磷酸盐缓冲盐水之中。将该再次悬浮的样品置于具有3500的截留分子量的SnakeSkin透析管(68035，Pierce Biotechnology，Rockford，IL)中，然后在4℃下用7升水(更换2次)透析48小时。
为了使用Dubios等的标准苯酚/硫酸方法(Anal.Chem.28，350-356(1956))对存在的多糖的量进行定量，移除一小部分的透析样品。一旦测定了EPS的浓度，就制备适当的部分，在干冰上冷冻，并冻干至干燥。冻干的材料于-80℃下贮存。
NMR分析.在Varian Inova 600-MHz波谱仪(Varian Medical Systems，Palo Alto，CA)上进行质子核磁共振(
1H-NMR)分析。将冻干的样品溶于D
2O，并且在使之与氘充分交换后，在25℃下得到波谱。化学位移以内标TSP作为参照。用States-Haberkom-Rubin正交在相敏感模式下收集
1H-
1H相关谱(COSY)、全相关谱(TOCSY)、核欧沃豪斯效应谱(NOESY)和质子-碳异核单量子相关谱(HSQC)数据。所有脉冲序列都由波谱仪供应商提供并且在无变更下使用。将低能量预饱和应用到残留HDO信号中。典型地，以512倍2048综合数据点和16-32扫描/增量收集数据组。TOCSY脉冲程序包含60-ms MLEV-17混合序列并且NOESY混合时间是150ms。
碳水化合物分析.通过对纯化的双歧杆菌35624EPS进行酸性甲醇分解所产生的单糖甲基糖苷的过氧三甲基甲硅烷(TMS)衍生物的气相色谱/质谱联用法(GC/MS)进行糖基成分分析(York等，(1986)；Merkle，R.K.和Poppe，I.1994)。为了糖基连接分析，对EPS样品进行全甲基化、解聚、还原和乙酰化。通过之前所述的GC-MS对所形成的部分甲基化的糖醇乙酸酯(PMAAs)进行分析(York等，(1986)；Merkle，R.K.和Poppe，I.(1994))。
EPS的结构测定.
用
1H-NMR分析纯化的EPS。波谱显示出该材料全部由碳水化合物组成；没有核酸、蛋白质、脂质或小的有机污染物的迹象。使用本领域中已知的和如上所述的实验进行的二维核磁共振(2D-NMR)分析证实大多数存在的碳水化合物包含由二糖重复片段组成的线性多糖。结合成分和连接分析的数据，这种多糖(命名为PS1)的结构为[-β(1，3)-连接-D-N-乙酰基半乳糖胺吡喃糖基-β(1，4)-连接-D-葡萄糖吡喃糖基-]
n，其中n表明该二糖单元重复n次，产生分子量大于100,000道尔顿的多糖。PS1的结构可以缩写为[-β(1，3)-D-GalpNAc-β(1，4)-D-Glcp-]
n，并且如图2中所示。注意在培养基对照样品中没有检测到PS1。
实施例2-当与人免疫系统细胞体外共同培养时，婴儿双歧杆菌35624外泌多糖(PS1)具有免疫调节活性 使用PBMC(外周血单核细胞)细胞因子诱导测定法对EPS部分进行测定。在该测定中，通过密度梯度分离法将PBMCs从血液中分离，并且用对照培养基或增加浓度的源于婴儿双歧杆菌35624的纯化PS1在37℃下将其培养72小时(在青霉素和链霉素存在下)。用Meso Scale Discovery(MSD)试剂盒对上清液的IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α和INF-γ水平进行测定，并用MSD板读数器进行分析。
图3表明了该测定的结果。当用1-5μg/ml PS1刺激PBMCs时，PS1刺激所有受试细胞因子的分泌。当使用10μg/ml PS1时，对很多细胞因子来说细胞因子刺激活性被降低至背景水平。
除了测试休眠的PBMCs，在有或无PS1刺激下，使用TLR-4配体脂多糖(LPS)激活PBMCs。由于在预试验中观察到5μg/ml PS1为最佳剂量，在随后的测定中使用该剂量。这些结果在图4中用以LPS+PS1刺激的细胞的平均细胞因子值减去单独以LPS刺激的细胞的细胞因子值来表示。当与PS1共同培养时，以LPS刺激的PBMCs分泌大幅减少的IL-6和显著减少的IL-8、TNF-α及INF-γ。
实施例3-当给脓毒症的鼠模型注射时，婴儿双歧杆菌35624外泌多糖(PS1)具有抗炎活性 向健康小鼠腹腔内注射PS1并观察这些小鼠24小时。没有记录到明显的痛苦体征，这表明动物对该多糖有良好的耐受力并且PS1没有引发脓毒症或者促炎症反应。经24小时观察期后，为了引发脓毒症样反应，以脂多糖(LPS)对动物进行腹腔内注射。2小时后选取所有动物并在体外测定脾细胞细胞因子的分泌。当与单独接受LPS的小鼠相比时，从以PS1+LPS处理的小鼠中分离的脾细胞释放的TNF-α显著减少(图5)。另外，在体外再次以LPS刺激来自这些动物的脾细胞并且在来自之前与PS1接触动物的脾细胞中再次记录到减弱的促炎细胞因子反应(图6)。
总之，这些数据证明源于婴儿双歧杆菌35624的EPS1具有免疫调节活性并且防止LPS或TLR-4介导的炎症应答。
尽管以上实验描述了分泌型外泌多糖(PS1)，但设想该外泌多糖的非分泌形式，例如该外泌多糖的与细胞缔合的或与膜缔合/结合的或囊状的(capsular)形式，会以与分泌型EPS相似的方式表现。本文所述的实验设计为检测分泌型EPS，但对本领域的技术人员来说显而易见的是，在EPS生成期间和在从细胞转运或者释放EPS之前，一部分分泌型EPS可能与细胞结合(例如与细胞缔合的或囊状的)。
本发明不限于本文以上所述的实施方案，其可以在细节上有所变化。
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