一种驴皮胶原的制备方法 【技术领域】
本发明属于胶原的制备技术领域， 特别涉及一种驴皮胶原的制备方法。背景技术 胶原是动物体内含量最多、 分布最广的一类蛋白质家族， 广泛存在于从低等脊椎 动物到哺乳动物的一切组织中 ； 具有其他合成材料无法比拟的生物相容性、 可生物降解性 以及生物活性。现已至少发现了 30 余种胶原链的编码基因， 可以形成 16 种以上的胶原分 子。 根据它们在体内的分布和功能特点， 目前将胶原分成间质胶原、 基底膜胶原和细胞外周 胶原， 间质型胶原分子占整个机体胶原的绝大部分， 包括 I 型、 Ⅱ型、 Ⅲ型胶原分子， 其主要 分布于皮肤、 肌腱等组织 ； 基底膜胶原通常是指Ⅳ型胶原．其主要分布于基底膜 ； 细胞周胶 原通常中指 V 型胶原， 在结缔组织中大量存在。
近年来， 养驴慢慢受到畜牧业人士的关注， 因为， 不仅驴肉本身具有较高的经济使 用价值， 驴皮还具有很高的药用价值， 具有天然的补血、 止血作用， 是制作阿胶的主要原料。
驴皮生皮料是极其复杂的物质， 基本上是由蛋白质和非蛋白质两大组分组成， 其 中， 蛋白质占鲜皮的 30% ～ 35%。新剥下来的生皮 pH 值为 6.8 ～ 7.8， 在存放过程中随皮料 的逐渐变质， pH 值亦随之变化。组成生皮的蛋白质种类很多， 皮料蛋白质分为纤维蛋白 （结 构蛋白） 、 非纤维蛋白 （非结构蛋白） 和酶等。纤维蛋白由胶原、 角朊、 弹性硬朊组成。胶原约 占生皮总量 （除皮下层） 的 29%， 约占全部蛋白质总量的 88%。
目前， 驴皮的应用主要是作为熬制阿胶的重要原料。根据中国药典 2005 年版一部 的记载， 阿胶的制法如下 ： 将驴皮 （马科动物驴 EquusasinusL. 的干燥皮或鲜皮） 浸泡去毛， 切块洗净， 分次水煎， 小组过， 合并滤液， 浓缩 （可分别加入适量的黄酒、 冰糖和豆油） 至稠膏状， 冷凝， 切块， 晾干， 即得。
上述简单的熬制方法， 没有针对驴皮中所含胶原成分的特性进行选择性提取和精 制， 使阿胶中除含胶原外， 还含有部分水解产生的赖氨酸、 精氨酸、 组氨酸等多种氨基酸， 以 及钙、 硫等成分 ； 并且阿胶的水溶性差， 只能烊化服用， 也不能作为化妆品等使用， 其使用受 到较大限制。
发明内容 本发明的主要目的是针对上述现有技术中存在的对驴皮的应用仅限于熬制阿胶， 而阿胶中成分复杂、 水溶性差， 除作为口服药物外其它应用受到较大限制等问题， 提供一种 驴皮胶原的制备方法， 以驴皮为原料， 通过特定的提取和精制方法， 得到水溶性好的驴皮胶 原， 不仅保留生物活性， 与人肌体、 皮肤同源性及相容性， 并且具有生物可降解性和低抗原 性等特点， 能被水以任性比例稀释， 可用于制备外科植入物和组织工程医疗产品， 开发医 药、 医学试剂、 及保健品等。
为了实现上述发明目的， 本发明采用的技术方案如下 ：
一种驴皮胶原的制备方法， 包括下述主要步骤 ： （1） 脱毛、 脱脂 ： 以检验、 检疫合格的鲜驴皮为原料， 采用常规方法脱毛、 脱脂后， 再用水洗至中性， 0℃ 以下冷冻保存备用 ； 由于胶原在常温及高温条件下容易变性失活， 因而需要冷冻保存。
（2） 碎皮、 碱液浸泡 ： 取上述步骤 （1） 处理后备用的驴皮解冻， 碎皮成 20-40 目的颗粒， 加入 pH 为 7.5-9.5 （可优选为 7.5-9.0） 的氢氧化钠溶液， 其加入量按照驴皮颗粒质量 : 氢氧化钠溶液体积 =1g:(8-12)ml 计算， 浸泡软化 48-96h ； 用去离子水冲洗至 pH 为 6.0-7.0， 得到中性驴皮颗 粒； 发明人通过大量试验发现， 由于驴皮的表皮结构紧密， 不容易软化， 需要先将其碎成一 定细度的小颗粒， 才有利于后续的软化处理， 发明人通过大量试验证实， 当颗粒粗于 20 目 时， 由于颗粒太粗， 加入碱液后浸泡处理超过 96h 也难以全部软化 ； 理论上， 碎皮的颗粒越 细越有利于软化， 但由于鲜驴皮的理化特性， 又很难将其碎成超过 40 目的更细的颗粒， 因 此， 综合考虑， 以 20-40 目为好 ； 进一步的， 将碎至 20-40 目的驴皮颗粒放入适宜 pH 值的碱液中进行浸泡处理， 可软化 胶质， 有利于提高后续步骤酶解的效率， 但 pH 值过低或过高都不利于软化效果， 大量试验 证实， 以 pH 为 7.5-9.5 的氢氧化钠溶液较好 ； 而浸泡时间的选择， 则与驴皮颗粒的细度及碱 液的 pH 值等密切相关， 互相影响， 在驴皮颗粒为 20-40 目、 pH 为 7.5-9.5 范围内， 浸泡时间 通常在 48-96h 内可获得理想的软化效果 ； 通过本步骤特定条件的碎皮、 碱液浸泡处理， 可有效软化驴皮中的胶质， 为后续酶解等 步骤有效提取驴皮胶原提供必要的保证。 （3） 低温酶解 ： 取上述步骤 （2） 处理后的中性驴皮颗粒， 加入 pH 为 4.3-6.5（可优选为 4.5-6.0） 的 盐酸溶液， 其加入量按照中性驴皮颗粒质量 : 盐酸溶液体积 =1g:(45-50)ml 计算， 再加入 8-10UI（UI 是酶活力国际单位， 指在特定条件下， 1 分钟内转化 1 微摩尔底物， 或者底物中 1 微摩尔有关基团所需的酶量 ； 在胃蛋白酶的活力测定中是指 ： 在 37℃ ±0.5℃， 每分钟能 催化水解血红蛋白生成 1μmol 酪氨酸所需的胃蛋白酶量） 的胃蛋白酶， 低温 （10℃以下） 放 置 3-4d， 搅拌和静置间隔处理， 搅拌的总时间与静置的总时间比约为 1:(1.5-2.5)， 得到含 有驴皮胶原的初液 ； 本步骤通过在盐酸溶液中、 胃蛋白酶作用下低温酶解处理， 使驴皮中的胶原充分溶解 到溶液中， 有利于后续步骤有效的提取驴皮胶原。
（4） 提取、 纯化 ： 将上述步骤 （3） 得到的初液离心， 取得上清液， 加入 NaCl， 充分搅拌， 使驴皮胶原从溶 液中析出、 沉淀， 静置 8-16 小时， 取沉淀， 用去离子水洗涤 1-2 次， 得到酸溶性驴皮胶原沉 淀； 本步骤通过离心处理， 将酶解后溶于溶液中的胶原提取出来， 并进一步通过盐析处理， 使驴皮胶原从溶液中析出沉淀， 而其它杂质则保留在溶液中被除去， 从而达到纯化驴皮胶 原的目的 ；
但该步骤得到的是酸溶性的胶原， 不宜直接与皮肤接触， 发明人通过大量试验研究发 现， 通过特定的改性手段， 可使之变为水溶性的胶原， 从而满足多种应用的需要。
（5） 改性 ： 将上述步骤 （4） 得到的酸溶性驴皮胶原沉淀用 0.2-1.0M（可优选为 0.4-0.6M） 的醋 酸溶液溶解， 其用量按照酸溶性驴皮胶原沉淀质量 : 醋酸溶液体积 =1g:(45-50)ml 倍量计 算； 测定蛋白质含量， 加入丙酮 （C3H6O） 作为改性剂， 其加入量按照蛋白质质量 : 丙酮体积 =1g:(10-15)ml 计算， 在 4-8℃下， 用氢氧化钠调节溶液 pH 为 10-12， 反应 5-9h， 再用 HCl 调 节 pH 为 4.0-4.2， 析出沉淀， 静置 8-16 小时 ； 取沉淀， 甩干， 用 pH 为 4.0-4.2 的盐酸溶液洗 涤 1-3 次， 得到改性后的驴皮胶原产品， 即可。
本步骤通过在碱性条件下、 以丙酮作为改性剂对驴皮胶原进行改性， 可有效除去 酸溶性驴皮胶原中的端肽， 成为水溶性的改性驴皮胶原， 为Ⅰ型活性胶原 ； 由于仅仅只是去 除了端肽， 蛋白的三股螺旋结构并没有被破坏， 故仍然能保留其原有的生物活性。同时， 本 步骤中将改性静置后的沉淀进行甩干处理也是非常必要的， 可有效除去溶解于醋酸溶液中 的非纤维蛋白等杂质， 以提高产品中改性驴皮胶原的纯度。
发明人通过大量对比试验， 从众多理论上可用作蛋白改性剂的物质中进行筛选， 发现以丙酮对前述步骤 （4） 所得酸溶性驴皮胶原进行改性， 可获得理想的水溶性胶原， 并且 还具有一些其它改性剂所不能兼具的特点， 如生物活性、 与人肌体、 皮肤的相容性、 低抗原 性、 生物可降解性等。
本发明中用到的各种溶液， 在未作特别说明时， 均是指水溶液。
与现有技术相比， 本发明的有益效果是 ： 本发明方法以鲜驴皮为原料， 通过特定组合的工艺步骤及参数条件进行提取和精制处 理得到酸溶性胶原， 再采用丙酮在碱性条件下对酸溶性胶原进行改性， 得到水溶性的驴皮 胶原产品， 该水溶性的驴皮胶原具有下述特点 ： （1） 改性后的胶原的三股螺旋结构并没有被破坏， 仍然保留其原有的生物活性 ； （2） 产品中主要成分为分子量约 300KD 左右的Ⅰ型活性胶原， 水溶性好， 能被水以任意 比例稀释 ； （3） 来源于脊椎动物的胶原与人肌体、 皮肤具有良好的同源性和相容性， 其分子量和结 构相似 ； 涂于皮肤后可快速溶入表皮 ； （4） 该胶原的变性温度约为 36.5℃， 经人肌体、 皮肤吸收后， 在人体正常体温和体内胶 原酶的作用下， 可生物降解为小分子多肽、 单肽， 又可在其他酶的作用下继续分解成二十余 种氨基酸， 易被吸收， 继续发挥营养作用 ； （5） 通过测定， 与改性前有端肽的胶原相比， 改性后无端肽的胶原与胶原抗原的结合力 差， 具有低抗原性。
因此， 这种保留了生物活性、 且具有水溶性好、 与人肌体、 皮肤同源性及相容性好、 生物可降解性和低抗原性等特点的活性驴皮胶原产品， 可用于制备外科植入物和组织工程 医疗产品， 开发医药、 医学试剂、 及保健品等。附图说明 图 1 是本发明实施例 1 中步骤 （4） 所得的酸溶性驴皮胶原、 步骤 （5） 所得的水溶性 胶原分别与胶原抗体的结合曲线图 ； 图 1 中， a 是步骤 （4） 所得的酸溶性驴皮胶原与胶原抗 体的结合曲线， b 是步骤 （5） 所得的水溶性胶原与胶原抗体的结合曲线。
图 2 是本发明实施例 1 所得胶原随温度变化的变性曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。
但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。 在不脱离本发明上 述技术思想情况下， 根据本领域普通技术知识和惯用手段， 做出各种替换和变更， 均应包括 在本发明的范围内。
实施例 1 本实施例驴皮胶原通过包括下述步骤的方法制备 ： （1） 脱毛、 脱脂 ： 以检验、 检疫合格的鲜驴皮为原料， 脱毛、 脱脂后， 用水洗至中性， 0℃以下冷冻保存备 用； （2） 碎皮、 碱液浸泡 ： 取上述步骤 （1） 处理后备用的驴皮解冻， 碎皮成 20-40 目的颗粒， 取 500g 驴皮颗粒， 加 入 pH 为 7.5 的氢氧化钠溶液 6000ml， 浸泡软化 96h ； 用去离子水冲洗至 pH 约为 6.0， 得到 中性驴皮颗粒 ； （3） 低温酶解 ： 取上述步骤 （2） 处理后的中性驴皮颗粒 200g， 加入 pH 为 6.5 的盐酸溶液 9000ml， 再加 入 8UI 的胃蛋白酶， 10℃以下低温放置 3d， 搅拌和静置间隔处理， 搅拌的总时间与静置的总 时间比为 1:2.5， 得到含有驴皮胶原的初液 ； （4） 提取、 纯化 ： 将上述步骤 （3） 得到的初液离心， 取得上清液， 加入 NaCl， 充分搅拌， 使驴皮胶原从溶 液中析出、 沉淀， 静置 8 小时， 取沉淀， 用去离子水洗涤 1 次， 得到酸溶性驴皮胶原沉淀 ； （5） 改性 ： 取上述步骤 （4） 得到的酸溶性驴皮胶原沉淀 10g， 用 1.0M 的醋酸溶液 400ml 溶解， 测定 蛋白质含量 （为 6.9mg/ml） ， 加入丙酮约 27600ml 作为改性剂， 在约 4℃， 用氢氧化钠调节溶 液 pH 为 10.0， 反应 9h， 再用 HCl 调节 pH 为 4.0， 析出沉淀， 静置 16 小时 ； 取沉淀， 甩干， 用 pH 为 4.0 的盐酸溶液洗涤 3 次， 得到改性后的驴皮胶原产品， 即可。
发明人委托四川医疗器械生物材料和制品检验中心对上述实施例得到的改性驴 皮胶原产品进行检验， 检验报告显示在电泳图中有 α、 β、 γ 的对应色带， 分子量分别为 100KD、 200KD 和 300KD。
进一步的水溶性、 抗原性、 与人肌体、 皮肤的相容性等测试显示 ： 该产品能被水以 任意比例稀释， 水溶性好 ； 与胶原抗原的结合力差， 在胶原与胶原抗体的结合曲线图 （如图 1 所示） 中几乎为一直线， 具有低抗原性 ； 涂于人肌体、 皮肤后迅速溶入表皮， 与人肌体、 皮肤 相容性好 ； 在 36.5℃左右变性降解而粘度降低 （如图 2 所示） 。实施例 2 本实施例驴皮胶原通过包括下述步骤的方法制备 ： （1） 脱毛、 脱脂 ： 以检验、 检疫合格的鲜驴皮为原料， 脱毛、 脱脂后， 用水洗至中性， 0℃以下冷冻保存备 用； （2） 碎皮、 碱液浸泡 ： 取上述步骤 （1） 处理后备用的驴皮解冻， 碎皮成 20-40 目的颗粒， 取 500g 驴皮颗粒， 加 入 pH 为 9.5 的氢氧化钠溶液 4000ml， 浸泡软化 48h ； 用去离子水冲洗至 pH 约为 7.0， 得到 中性驴皮颗粒 ； （3） 低温酶解 ： 取上述步骤 （2） 处理后的中性驴皮颗粒 200g， 加入 pH 为 4.3 的盐酸溶液 10000ml， 再 加入 10UI 的胃蛋白酶， 10℃以下低温放置 4d， 搅拌和静置间隔处理， 搅拌的总时间与静置 的总时间比为 1:1.5， 得到含有驴皮胶原的初液 ； （4） 提取、 纯化 ： 将上述步骤 （3） 得到的初液离心， 取得上清液， 加入 NaCl， 充分搅拌， 使驴皮胶原从溶 液中析出、 沉淀， 静置 16 小时， 取沉淀， 用去离子水洗涤 2 次， 得到酸溶性驴皮胶原沉淀 ；（5） 改性 ： 取上述步骤 （4） 得到的酸溶性驴皮胶原沉淀 10g， 用 0.2M 的醋酸溶液 500ml 溶解， 测定 蛋白质含量 （为 4.1mg/ml） ， 加入丙酮约 30750ml 作为改性剂， 在约 8℃， 用氢氧化钠调节溶 液 pH 为 12.0， 反应 5h， 再用 HCl 调节 pH 为 4.2， 析出沉淀， 静置 8 小时 ； 取沉淀， 甩干， 用 pH 为 4.2 的盐酸溶液洗涤 2 次， 得到改性后的驴皮胶原产品， 即可。
实施例 3 本实施例驴皮胶原通过包括下述步骤的方法制备 ： （1） 脱毛、 脱脂 ： 以检验、 检疫合格的鲜驴皮为原料， 脱毛、 脱脂后， 用水洗至中性， 0℃以下冷冻保存备 用； （2） 碎皮、 碱液浸泡 ： 取上述步骤 （1） 处理后备用的驴皮解冻， 碎皮成 20-40 目的颗粒， 取 500g 驴皮颗粒， 加 入 pH 为 8.0 的氢氧化钠溶液 5000ml， 浸泡软化 72h ； 用去离子水冲洗至 pH 约为 6.5， 得到 中性驴皮颗粒 ； （3） 低温酶解 ： 取上述步骤 （2） 处理后的中性驴皮颗粒 200g， 加入 pH 为 4.5 的盐酸溶液 9500ml， 再加 入 8UI 的胃蛋白酶， 10℃以下低温放置 3d， 搅拌和静置间隔处理， 搅拌的总时间与静置的总 时间比为 1:2， 得到含有驴皮胶原的初液 ； （4） 提取、 纯化 ： 将上述步骤 （3） 得到的初液离心， 取得上清液， 加入 NaCl， 充分搅拌， 使驴皮胶原从溶 液中析出、 沉淀， 静置 12 小时， 取沉淀， 用去离子水洗涤 2 次， 得到酸溶性驴皮胶原沉淀 ； （5） 改性 ： 取上述步骤 （4） 得到的酸溶性驴皮胶原沉淀 10g， 用 0.4M 的醋酸溶液 460ml 溶解， 测定蛋白质含量 （为 7.5mg/ml） ， 加入丙酮约 41400ml 作为改性剂， 在约 6℃， 用氢氧化钠调节溶 液 pH 为 11.0， 反应 6h， 再用 HCl 调节 pH 为 4.2， 析出沉淀， 静置 12 小时 ； 取沉淀， 甩干， 用 pH 为 4.2 的盐酸溶液洗涤 2 次， 得到改性后的驴皮胶原产品， 即可。
实施例 4 本实施例驴皮胶原通过包括下述步骤的方法制备 ： （1） 脱毛、 脱脂 ： 以检验、 检疫合格的鲜驴皮为原料， 脱毛、 脱脂后， 用水洗至中性， 0℃以下冷冻保存备 用； （2） 碎皮、 碱液浸泡 ： 取上述步骤 （1） 处理后备用的驴皮解冻， 碎皮成 20-40 目的颗粒， 取 500g 驴皮颗粒， 加 入 pH 为 9.0 的氢氧化钠溶液 5500ml， 浸泡软化 60h ； 用去离子水冲洗至 pH 约为 6.8， 得到 中性驴皮颗粒 ； （3） 低温酶解 ： 取上述步骤 （2） 处理后的中性驴皮颗粒 200g， 加入 pH 为 6.0 的盐酸溶液 9800ml， 再加 入 9UI 的胃蛋白酶， 10℃以下低温放置 4d， 搅拌和静置间隔处理， 搅拌的总时间与静置的总 时间比为 1:2， 得到含有驴皮胶原的初液 ； （4） 提取、 纯化 ： 将上述步骤 （3） 得到的初液离心， 取得上清液， 加入 NaCl， 充分搅拌， 使驴皮胶原从溶 液中析出、 沉淀， 静置 12 小时， 取沉淀， 用去离子水洗涤 1 次， 得到酸溶性驴皮胶原沉淀 ； （5） 改性 ： 取上述步骤 （4） 得到的酸溶性驴皮胶原沉淀 10g， 用 0.6M 的醋酸溶液 480ml 溶解， 测定 蛋白质含量 （为 5.2mg/ml） ， 加入丙酮约 25000ml 作为改性剂， 在约 4℃， 用氢氧化钠调节溶 液 pH 为 11.0， 反应 7h， 再用 HCl 调节 pH 为 4.1， 析出沉淀， 静置 14 小时 ； 取沉淀， 甩干， 用 pH 为 4.1 的盐酸溶液洗涤 1 次， 得到改性后的驴皮胶原产品， 即可。 发明人委托同一单位对上述各实施例得到的改性驴皮胶原产品进行电泳测试、 及 水溶性、 抗原性、 与人肌体、 皮肤的相容性等测试， 结果均与实施例 1 所得的原产品的测试 结果相似。