具体实施方式
本发明的制备过程，不仅可以将缓冲溶液，与含处方量的顺铂和脂溶性膜材的有机相混合，通过自组装过程制得表面有柔性亲水链的顺铂柔性泡囊，还可通过处方调整，采用同样的制备过程，制备得到表面带不同电荷的顺铂泡囊、表面带不同蛋白质的顺铂柔性泡囊，以及普通顺铂泡囊。
在主要处方成分及用量基本不变前提下，调整个别处方成分与比例，得到表面不带电荷的普通泡囊与带正荷的泡囊、负电荷的泡囊；通过分别加入Chol-PEG4000、Chol-PEG6000、Chol-PVA、Chol-Plu、Plu等两亲性物质，得到不同的顺铂柔性泡囊。将制得的各类泡囊溶液保存于4℃，用于有关性质研究。
另外，本发明还可通过调整模型药物---主药，制备得到维甲酸柔性泡囊。
由于泡囊包载水溶性药物时药物处于泡囊的双分子层中间；而当其包载疏水性药物时，药物位于泡囊的疏水内腔中。经过对部分考察项目进行比较发现：顺铂柔性泡囊，对模型药物没有特定要求，可以采用同样处方，包载不同性质的药物---维甲酸。
因此该领域技术熟练者，对该处方作非实质性调整，还可应用于包载其它各类药物。
实施例：
1 亲水聚合物-胆固醇(A)的合成：
根据末端含有羟基的亲水性或两亲性大分子聚合物，如：聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、PluronicF68(Plu)等亲水性或两亲性大分子物质，可采用合成路线：PEG-OH+(CH3CO)2O+CH3SOCH3→PEGOCH2CHO得到聚合物缩醛(称聚合物-醛)，即以甲亚砜(DMSO)为溶剂，在室温下与乙酸酐反应，得到相应的缩醛衍生物聚合物-醛。再与胆固醇在无水乙醇和稀盐酸中回流反应，逐步经水、稀氢氧化钠溶液精制处理，抽滤后干燥，即得相应亲水性聚合物-Chol的结合物A。
2.顺铂柔性泡囊的制备
将前述处方量的脂溶性膜材A、B、C、D用有机溶剂溶解完全后，与处方量顺铂混合超声，再采用注入法或薄膜法与缓冲溶液混合，在20-40℃搅拌并超声，有机溶剂挥发后得到表面载有柔性亲水链的顺铂柔性泡囊溶液。
3、顺铂柔性泡囊的形态观察
倒置显微镜下观察，结果微粒均匀度好，基本为圆形，见附图1。
4、顺铂柔性泡囊的平均粒径及表面Zeta电位测定
鉴于癌细胞带负电性，为使柔性泡囊的肿瘤靶向药效学试验所检验的靶向作用更为可靠，本发明制备的泡囊均带有不同的负电性，在排除正电荷对癌细胞的趋向作用后，检验其被动靶向作用。结果见文后表1。
从表1中可以看出：不同带电脂质对柔性泡囊的粒径、电位有不同程度的影响：当加入DCP或GC制得的F1、F2，平均粒径比F略有变大，电位变化与带电脂质本身性质一致。
5、顺铂柔性泡囊的包封率测定
因顺铂比重大，对泡囊混悬液的均一性有影响，故将处方量泡囊液全部转入预先处理好的透析袋中，室温下悬于透析介质(pH6.4的0.9％生理盐水)中，120r/min搅拌，每隔0.5h更换透析液，1.5h后停止(此时空白泡囊加处方比例的顺铂透析率为93％以上)，测定透析液中累计顺铂量即为游离药物的量。将透析袋内泡囊全部转入容量瓶中，用0.1mol·L-1盐酸-异丙醇处理后，测定袋内药物量。计算得到表面性质不同的柔性泡囊的包封率，结果见表1。
表1 各类柔性泡囊的均粒径、表面Zeta电位及包封率
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其中，F：柔性泡囊；F1：处方中加DCP(可增加正负性)的柔性泡囊；F2：处方中加GC(可增加正电性，即部分抵消原有负电性)的柔性泡囊。
由表1可知，处方中加入带电脂质会引起包封率下降，加入DCP或GC制得的F1、F2与F相比，包封率为F2＜F1＜F，说明带电脂质GC对包封率的影响比DCP大。
6、顺铂柔性泡囊制备的投药量对包封率和载药量的影响
为体内研究时用较小的给药体积达到较高的药物治疗浓度，将药量改变后，包封率及载药量结果，见表2。
表2 处方中顺铂用量对包封率及载药量的影响
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由表2可知，当增大投药量柔性泡囊F包封率有所下降，载药量提高。
7、顺铂柔性泡囊体外实验研究结果
1)顺铂柔性泡囊体外释放规律考察
在预试的基础上，以氯化钠溶液作透析介质，以等量游离药物溶液作对照，考察柔性泡囊的释放特性。于37℃100ml氯化钠溶液中，透析顺铂溶液和柔性泡囊F，120r/m搅拌，于0.5～264h中设置不同时间点取透析外液1ml，同时补加1ml释放介质维持漏槽条件继续透析至终点。样品经测定计算药物累积释放百分率(Q％)。结果，游离药物释放快，2.5h已基本释放完全，而柔性泡囊F的释放明减缓，t1/2为10h，Q264h91.92％，释放曲线符合Weibulldistribution模型，拟合方程为：lnln100/(100-Q)＝0.3353lnt-1.1539(r2＝0.9810)。可见顺铂柔性泡囊体外累积释放具有明显的缓释作用，半衰期也显著增加。
2)顺铂柔性泡囊的体外单核巨噬细胞吞噬试验
通常阳离子微粒对抗癌靶向给药具有一定优势。为排除因正电何带来的趋向作用，保持处方基本一致，在柔性泡囊表面水化层相对完整，仅表面的负电荷量不同的条件下，柔性泡囊规避吞噬系统识别的差异，如图2。
由于不加入带电脂质的柔性泡囊F已带有较高的负电位，加入DCP后的F1负电位更高，加入GC后的F2负电位降低，各处方的电荷量为F2(-25)＜F(-66.5)＜F1(-77)(见表1)。由图2可知，各柔性泡囊规避巨噬细胞吞噬的作用显著，被吞噬率呈现规律变化F2＜F＜F1，与具表面电荷量排列一致，即泡囊负电位的绝对值越大，越易被识别、吞噬。该结果与DCP会使脂质体因带负电而在体内循环时间缩短的文献结果相符。
3)顺铂柔性泡囊对癌细胞的生长抑制试验
将柔性泡囊(包载顺铂的处方2-2、包载维甲酸的处方2-5)、空白柔性泡囊(处方2-4)、顺铂溶液(处方4，750μg/ml)，均含相同浓度的泡囊或顺铂的溶液，用含5％新生牛血清的RPMI-1640培养液按倍量稀释，即以1∶50～1∶1600不同比例稀释后，每孔细胞培养板中加入100μl，再每孔加入人肺鳞癌细胞(YTMLC-90)悬液100μl，在CO2孵箱中37℃培育68h后取出，加5mg/ml MTT溶液10μl，继续培育4h后，将液体吸出，每孔加入DMSO 100μl，用酶标仪在570nm处测定吸光度，计算抑制率并绘出细胞生长抑制曲线，结果见附图3。
从附图3可看出，空白柔性泡囊(处方2-4)对癌细胞的抑制很小，顺铂柔性泡囊(处方2-2)与顺铂溶液(处方4)对癌细胞的抑制有较好的一致性，且对浓度有显著依赖性。维甲酸柔性泡囊(处方2-5)对癌细胞的抑制较小。说明主药以外的处方组成毒性很小，抗癌活性与药物本身的抗癌作用关系密切，所得到的柔性泡囊既能保持原药的抗癌活性，又没有显示原药以外的毒性。
4)顺铂柔性泡囊对不同细胞株的生长抑制试验
将顺铂柔性泡囊混悬液用含5％新生牛血清的RPM1-1640培养液按1∶50～1∶1600不同倍数稀释，每孔加入100μl，再在每孔分别加入HBE(正常人支气管上皮细胞)、YTMLC-90悬液100μl。同前操作并测定吸光度、计算抑制率后，绘出细胞生长抑制曲线，结果见附图4。
从附图4可以看出，顺铂柔性泡囊对正常细胞和癌细胞的生长抑制率相似，毒性在顺铂浓度为0.467～9.375μg/ml的范围内增大显著，在柔性泡囊细胞毒性比较研究中，肺癌细胞和与之结构很接近的正常支气管上皮细胞的抑制几乎没有区别，说明顺铂柔性泡囊对细胞的毒性无针对性，正好与顺铂可作用于各类细胞DNA，细胞毒性无选择性的作用机理相吻合。
又采用同样方法，以顺铂含量9.375μg/ml的样品，对巨噬细胞进行生长抑制试验，结果柔性泡囊的对细胞的生长抑制率为63.69％，与同样条件下的顺铂原药(为63.88％)几乎完全一致。说明顺铂原药采用本发明自制胆固醇-亲水性聚合物结合物，经过制剂制备工艺过程，所得的柔性泡囊给药系统，没有出现原药以外的细胞毒性。
5)通过其他方面的毒性考察，顺铂柔性泡囊溶液的pH为中性，完全满足注射剂要求。体外溶血试验结果发现，顺铂柔性泡囊无溶血现象。
9.顺铂柔性泡囊动物试验研究结果：
经过将常大鼠分组(①原料药溶液组；②含药泡囊F组)，同上自尾静脉分别注射顺铂原药溶液或含药泡囊溶液，于给药后1～144h处死各组相应大鼠，取出血及完整心、肝、脾、肾、肺各脏器，HPLC测定顺铂在血中及体内各组织的浓度，得到以下有关正常大鼠的结果。
裸鼠经接种YTMLC-90人肺鳞癌细胞后，观察肿瘤生长情况。由于瘤块生长不明显，观察以及触摸都不能判断是否接种成功。但在接种后第16天，有一只未给药的裸鼠死亡，解剖后发现其肺和肝部有明显炎症，说明已经感染肺癌并出现转移，因此认为建模成功。于接种癌细胞后第19天给其余荷瘤裸鼠分为原料药溶液对照组和含药柔性泡囊F组，尾静脉给药并观察，每三天给1次药，共3次；末次给药三天后将小鼠拉断颈锥处死，完整取出主要脏器及肿瘤组织，称重并经样品预处理后，用HPLC测定顺铂体内各组织的浓度，或制作切片观察，得到以下有关荷瘤裸鼠的结果。
针对顺铂柔性泡囊对肺癌的抗癌活性与原药注射液进行了比较研究，以揭示其隐形性、靶向性和抗癌活性。
1)正常大鼠的药代动力学与体内分布研究：
考察了药物经尾静脉注射后，在大鼠心、肝、脾、肺、肾及血液中的分布。
将测得的柔性泡囊F在血中及各组织中药物浓度数据经DAS2.0软件处理后再进行体内组织分布的比较。由于原药组代谢太快时间点不够，无法用软件进行数据拟合，因此只有含药柔性泡囊的体内分布参数，见表3。
表3 顺铂柔性泡囊在下常大鼠体内的药代动力学参数
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对于缓释制剂，体内组织药时曲线下面积AUC表示的生物利用度和平均滞留时间MRT更具有研究意义。由表3可知，柔性泡囊F在正常大鼠体内的MRT(0-t)为90h，大大延长了顺铂在血浆中的滞留时间，具有长循环效果。体内半衰期为20h，AUC0-t＝6.965，生物利用度高。
药物在各主要脏器的最大浓度依次为：肾、心、脾、肺、肝。
2)荷瘤鼠体内药物分布、代谢与药效学及毒性初步观察
(1)药物在荷瘤鼠体内的分布情况
在接种了肺癌细胞后的荷瘤裸鼠体内各组织中，顺铂柔性泡囊相对于顺铂溶液，药物的相对分布结果为：非靶标组织中，除脾组织中几乎无变化外，心组织中下降49.17％，肝组织中下降7.45％(大体解剖发现肝转移)，肾组织中下降15.19％；而对靶标，肺组织中增加18.67％，肿瘤组织中增加43.02％，充分显示了本专利给药系统对药物分布的靶向调节作用。预示肺癌的治疗效果将会得到提高，并降低其毒性。
(2)药物代谢情况
以荷瘤鼠组织中的药量总和，评价药物代谢情况。对已经肺癌转移的大鼠，以∑(各组织中药物浓度×各组织重量)计算所测定的全部组织中药物量的总和可知，柔性泡囊组为0.490μg；而原料药溶液组为0.272μg。说明本专利减缓了药物的代谢，使药物被清除的时间减慢，有利于持续发挥治疗作用。
(3)抑瘤率考察及毒性初步考察
称量记录各组荷瘤裸鼠给药前体重W1和处死前体重W2，观察各组动物给药部位，并比较体重的前后变化及瘤重占体重百分率，以及以原药溶液组的瘤重/体重评价含药柔性泡囊的抗癌作用效果，结果见表4。
表4 顺铂柔性泡囊对荷瘤裸鼠癌块的抑瘤作用及对体重的影响
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有表4可知，柔性泡囊组的肿瘤生长抑制率比原药组提高31.19％，提高抑瘤效果显著。
另外，因药物的毒性对动物生长有影响，原药溶液组动物给药后体重减轻46.41％；含药柔性泡囊组的体重仅下降7.29％，下降幅度仅为原药溶液组的15.7％。并且，其瘤重占体重百分率为原药组的80.7％，说明本专利给药系统改善药物毒性效果显著。
经与正常裸鼠器官对照，对大体检查发现异常的肝、肺及瘤块，以HE染色切片后检查，显示了柔性泡囊具有较为明显的抑制肿瘤生长及转移的作用。此外，比较动物给药部位(尾巴)针口愈合情况，发现顺铂原药组的鼠尾巴都有红肿(裸鼠尤为明显)。说明本专利给药系统不仅本身毒性低，还降低了原药的局部刺激性。
充分显示了顺铂柔性泡囊治疗肺癌的高效低毒特点。