五味子木脂素类成分在制备抗肺癌的药物中的应用
技术领域
本发明涉及五味子木脂素成分逆转非小细胞肺癌细胞对靶向性抗肿瘤药物耐受的新用途。
背景技术
恶性肿瘤是危害人类健康的重大疾病。江苏省近几年开展了以恶性肿瘤为主的全人口死因回顾性调查，结果显示男女性第1位死因均为恶性肿瘤，其死亡率占全部死因的27.41％。资料显示，2003年江苏省城市地区位于恶性肿瘤死亡前4位的分别是肺癌、胃癌、肝癌、食管癌；而农村地区为肝癌、肺癌、食管癌、胃癌。肺癌和胃癌死亡率城市明显高于农村。尤其是通过分析1973至2004年几种主要恶性肿瘤的死亡情况发现，肺癌死亡率大幅上升，2004年肺癌死亡率是1973年的5.65倍。由此可见，肺癌已经成为我省恶性肿瘤数一数二的“杀手”，严重威胁着我省人民的生存健康。
为什么在短短的几十年间，肺癌的发病率及死亡率有如此迅猛的发展趋势？1：大样品调查研究表明肺癌的主要危险因素为吸烟和大气污染，而近年来吸烟人数有增加的趋势，汽车尾气和工业废气的大量排放，又加重了大气环境污染的程度。因此，随着我省经济的发展，城市化、工业化进程的加快，空气污染将会越来越严重，这将不可避免地导致肺癌死亡率进一步增加。2：肺癌在早期时往往没有明显的症状，当有症状被诊断出来时，常常已经是局部晚期或晚期无法手术切除的情形。一般而言，新诊断的肺癌仅约不到20％的病人属于早期可以有机会接受手术切除的病患。而另外80％的晚期肺癌病人则失去了外科手术根治的最佳时机。3：到目前为止，对肺癌的治疗，尤其是晚期肺癌病人缺乏非常有效的治疗干预手段。
临床上，肺癌通常分为小细胞与非小细胞肺癌两种类型，总的肺癌病例中，非小细胞肺癌(包括肺鳞癌，肺腺癌)约占80％。因此针对非小细胞肺癌的治疗研究是攻克肺癌的一项极其重要的课题，引起了全世界医学界的广泛关注。
如上所述，虽然手术治疗是治疗非小细胞肺癌的重要手段，但对绝大部分晚期肺癌病人来说手术治疗并不能有效解决肿瘤转移的问题。因此对于这些晚期或已经有远端转移的肺癌病人，全身性的化学治疗是非小细胞肺癌多学科综合治疗的主要策略之一。尤其是化疗与手术、放射等疗法综合运用能明显防止癌肿转移、复发，提高长期生存率。现在，非小细胞肺癌化疗已经初步形成共识，通常采用顺铂加泰索帝、紫杉醇、健择、诺维本等中的一种。根据患者的具体情况，选择不同的组合，可以达到提高疗效，降低毒性反应的目的，特别是出现了一些极具前景的新型靶向药物，其作用机制与传统化疗药物不同。传统化疗药物属于细胞毒性药物，是通过毒性杀死肿瘤细胞，但同时不可避免会伤害正常细胞。而靶向药物进入肿瘤细胞后，可以通过特异性作用于肿瘤生长的细胞信号途径，抑制肿瘤细胞的增殖、浸润、转移，不良反应轻，患者可以很好耐受。
在这些靶向药物中，TRAIL(肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体)越来越受到人们的关注。TRAIL是由Wiley于1995年检索EST时首次发现并克隆的，是一种II型糖蛋白，属于肿瘤坏死因子家族，与相应受体结合后，可以快速诱导细胞发生凋亡。但与其它凋亡诱导分子显著不同的是，TRAIL主要杀伤转化细胞和肿瘤细胞，而正常细胞可以逃逸它的杀伤作用。体内研究表明，TRAIL可以明显抑制肿瘤生长，甚至彻底清除肿瘤。TRAIL的这种肿瘤细胞选择性杀伤作用使该蛋白在抗肿瘤方面具有很强的开发价值与潜力。但是值得注意的是，并非所有的肿瘤细胞对TRAIL都具有很强的敏感性。体外研究表明，有些肿瘤细胞对TRAIL诱导凋亡作用具有很强的耐受性。这可能与肿瘤细胞表面缺乏TRAIL受体(DR4，DR5)，或分布有假受体(DcR1，DcR2)，或过度表达一些抗凋亡蛋白如bcl-2，FLIP，survivin有关。因此TRAIL的抗肿瘤作用因不同的肿瘤类型而异。
研究表明，非小细胞肺癌细胞对TRAIL有明显的耐受性，但具体的机理目前并不清楚。为了充分发挥TRAIL对肿瘤细胞的选择杀伤作用，有必要寻找新的策略以逆转非小细胞肺癌细胞株对TRAIL的敏感性，从而达到运用TRAIL有效治疗非小细胞肺癌的目的。
五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果实，习称“北五味子”，始载于《神农本草经》。五味子具有收敛固涩，益气生津，补肾宁心之效。临床用于久嗽虚喘，梦遗滑精，遗尿尿频，久泻不止，自汗，盗汗，津伤口渴，短气脉虚，内热消渴，心悸失眠。
五味子的化学成分主要分为木脂素类、挥发油类与有机酸等三类成分，具体的木脂素成分如五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素，五味子酯乙，戈米辛A、B、C、F、G，戈米辛H等(见以下式A-F)。挥发油类成分如α-蒎烯，莰烯等。有机酸类成分有枸橼酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸等。此外还有柠檬醛(citral)，叶绿素、甾醇、维生素C、E，树脂，鞣质及少量糖类。![]()
目前，国内外对五味子的药理作用机理研究已经相当深入，主要体现在，1：抗肝损伤；2：抑制中枢神经系统；3：提高机体免疫力；4：抗衰老。五味子这些药理作用都是以五味子的多种有效成分为物质基础的，如五味子木脂素类成分具有显著的抗肝伤作用，以木脂素类成分为基础开发的联苯双酯已经用于广泛用于临床肝炎的治疗，而五味子多糖在提高机体免疫力与抗衰老方面也有明显的作用。但是近几年来，五味子活性成分增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性已经成为五味子研究的一个新的热点与亮点，并已逐渐受到人们的重视。著名药学家刘耕陶指出，肿瘤细胞多药耐药是目前临床上肿瘤化疗失败的重要原因之一。所谓“多药耐药”，是指肿瘤细胞先天存在的或经化疗药物诱导后产生的对一系列结构和作用机制不同的抗肿瘤药物耐药。因此，逆转肿瘤细胞的多药耐药性，从而使肿瘤细胞恢复对化疗剂的敏感性，具有非常重要的临床价值。在刘耕陶及其他人员的相关研究中表明，五味子粗提物及其有效成分五味子甲素逆转多药耐药的效果很明显。在与抗肿瘤药物长青新碱、紫衫醇、阿霉素合用对抑制小鼠肉瘤S180生长的增强作用的实验中，发现五味子粗提物与这三种药物合用后，三药抑瘤作用均有一定程度的增强，抑瘤率分别达到51.66％、38.11％和53.05％。
为了充分发挥TRAIL对非小细胞肺癌细胞的选择杀伤作用，有必要寻找新的策略以逆转非小细胞肺癌细胞株对TRAIL的耐受性。而作为一个理想干预手段必须具备以下特点：1：显著性增强非小细胞肺癌细胞对TRAIL的敏感性；2：对正常细胞产生较小的毒副作用。
发明内容
为了克服非小细胞肺癌细胞对TRAIL的耐受性问题，本发明提供了五味子木脂素成分的新用途，有效地解决了非小细胞肺癌细胞对TRAIL的耐受性问题。
本发明所采用的技术方案是：五味子木脂素在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。
上述所说的应用，具体可以是将五味子木脂素与TRAIL制成治疗非小细胞肺癌的组合物。当然，五味子木脂素也可单独制成逆转非小细胞肺癌对TRAIL耐受的制剂(增敏剂)。
上述所说的五味子木脂素成分优选五味子甲素，五味子乙素或五味子丙素，但以五味子乙素为最佳。五味子其它部位，如有机酸、多糖、挥发油等部位增效作用并不明显。
细胞死亡通常采取多种方式，其中细胞凋亡与坏死是最主要的2种死亡方式，在本发明中发现五味子乙素(50μM)与TRAIL(100ng/ml)联用时，Annexin(+)/PI(-)细胞明显增多，表明五味子乙素能显著增强TRAIL诱导非小细胞肺癌细胞凋亡。
本发明表明五味子木脂素本身对正常细胞(PMBC、HEK293)的无明显毒副作用，表明五味子木脂素与TRAIL的联合用药是一种新的可用于治疗非小细胞肺癌的中西药物组合。
附图说明
图1五味子不同组分联合TRAIL对A549细胞存活率的影响图2不同五味子木脂素成分联合TRAIL对A549细胞存活率的影响图3五味子乙素增强TRAIL诱导A549细胞凋亡图4细胞周期法检测五味子乙素增强TRAIL诱导的A549细胞凋亡图5五味子乙素增强TRAIL诱导的A549细胞caspase 3激活图6五味子乙素与TRAIL的联用对非小细胞肺癌细胞A549的选择性诱导细胞凋亡作用图7五味子乙素与TRAIL联用的体内抗肿瘤效果。
具体实施方式
实验材料A549、NCI H460、H157、H226等非小细胞肺癌细胞株均购自ATCC公司。DMEM细胞培养液、胰酶购自美国Hyclone公司。MTT、PI、RNAase购自美国Sigma公司。五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素购自中国药品生物制品检定所，五味子醇乙、五味子丙素购自上海顺勃生物工程有限公司。Caspase 3检测试剂盒购自美国Biovision公司。EGFP标记的Annexin V由本实验室自行制备获得。
实施例一：五味子不同组分对TRAIL诱导的非小细胞肺癌细胞(A549)死亡的影响肺癌细胞于DMEM+10％胎牛血清培养液中培养，培养条件为37℃，5％CO2的湿润无菌环境。细胞长至80％-90％融合时，用PBS洗涤2次，0.25％胰酶消化。按细胞量5×103/孔接种于96孔细胞培养板中。A549细胞至对数生长时进行药物处理，分别为TRAIL(100ng/ml)，TRAIL(100ng/ml)+五味子挥发油提取部位、TRAIL(100ng/ml)+五味子总木脂素、TRAIL(100ng/ml)+五味子总多糖、TRAIL(100ng/ml)+五味子总有机酸，每孔加入100μL MTT(1mg/ml)，细胞继续于37℃培养4h。弃去上清，PBS洗涤2遍，加入200μLDMSO。将96孔板置于微振荡器上振荡10min，于酶标仪上测定每孔在492nm的吸收度。细胞活性用下列公式计算：![]()
结果：细胞活性通过MTT法进行测定。该方法基本原理在于细胞线粒体酶能将底物MTT转化为结晶紫产物。TRAIL使用剂量为100ng/ml，其它挥发油、总木脂素部位、多糖、挥发油部位均换算成等生药材量，结果表明五味子木脂素成分能显著增强非小细胞肺癌细胞对抗肿瘤药物TRAIL的敏感性，而其它部位，如有机酸、多糖、挥发油等部位增效作用并不明显(图1)。表明五味子木脂素成分能显著增强非小细胞肺癌细胞对TRAIL的敏感性。
实施例二：五味子木脂素类增效活性成分的筛选肺癌细胞于DMEM+10％胎牛血清培养液中培养，培养条件为37℃，5％CO2的湿润无菌环境。细胞长至80％-90％融合时，用PBS洗涤2次，0.25％胰酶消化。按细胞量5×103/孔接种于96孔细胞培养板中。A549细胞至对数生长时进行药物处理，分别为TRAIL(100ng/ml)，TRAIL(100ng/ml)+五味子素(50μM)，TRAIL(100ng/ml)+五味子甲素(50μM)，TRAIL(100ng/ml)+五味子乙素(50μM)，TRAIL(100ng/ml)+五味子醇乙(50μM)，TRAIL(100ng/ml)+五味子丙素(50μM)，TRAIL(100ng/ml)+五味子酯甲(50μM)，药物处理12h，按实施例一项下MTT法测定细胞存活率。
结果：通过对五味子木脂素成分中含量较高的6种化合物(五味子素，五味子醇乙，五味子酯甲，五味子甲素，五味子乙素，五味子丙素)进行了增效活性的筛选，发现单用TRAIL(100ng/ml)，A549细胞对TRAIL并不敏感，但分别与上述五味子木脂素(50μmol/L)联用后发现，五味子甲素，五味子乙素，五味子丙素均表现为较强的增效结果，其中五味子乙素作用最强(图2)。
实施例三：Annexin V/PI流式细胞仪法检测TRAIL与五味子乙素联用致A549细胞凋亡非小细胞肺癌细胞A549于DMEM+10％胎牛血清培养液中培养，培养条件为37℃，5％CO2的湿润无菌环境。细胞长至80％-90％融合时，用PBS洗涤2次，0.25％胰酶消化。按细胞量6×104/孔接种于24孔细胞培养板中。待细胞贴壁生长完全后，加入药物分别为TRAIL100ng/ml，TRAIL 100ng/ml+五味子乙素50μM，TRAIL 100ng/ml，每组3个孔(图3)。细胞经药物处理12h后收集，用预冷PBS洗2遍，加入EGFP标记的Annexin V(2μL)，冰上孵育20min，迅速加入PI(1μg/mL)，于流式细胞仪上检测细胞凋亡情况，Annexin V(+)/PI(-)为早期凋亡细胞。
结果：Annexin V/PI双染流式细胞仪法是检测细胞凋亡最常用的手段。当细胞处于凋亡状态时，会引起细胞膜PS外翻，在Ca2+存在的情况下，annexin V能与PS相结合。因此用annexin V能定量检测细胞膜PS数目，进而反映细胞凋亡情况。在本发明中，采用annexin V-EGFP为PS结合蛋白，复染PI区分正常与坏死细胞。结果表明用五味子乙素(50μmol/L)或低浓度TRAIL(50ng/ml)A549细胞凋亡不明显。但TRAIL与五味子乙素联用时，细胞凋亡明显增强。表明五味子乙素能显著增强TRAIL诱导非小细胞肺癌细胞凋亡(图3)。
实施例四：流式细胞仪细胞周期法检测TRAIL与五味子乙素联用致A549细胞凋亡非小细胞肺癌细胞A549于DMEM+10％胎牛血清培养液中培养，培养条件为37℃，5％CO2的湿润无菌环境。细胞长至80％-90％融合时，用PBS洗涤2次，0.25％胰酶消化。按细胞量6×104/孔接种于24孔细胞培养板中。待细胞贴壁生长完全后，加入药物分别为TRAIL100ng/ml，TRAIL 100ng/ml+五味子乙素50μM，TRAIL 100ng/ml，每组3个孔(图4)。细胞经药物处理12h后收集，用预冷PBS洗2遍，70％乙醇进行固定，过夜。于第二天离心收集细胞(6000rpm)，加入5μg/mL RNAase进行消化30min后，再加入PI(1ug/ml)进行染色30min后，流式细胞仪分析细胞周期。
结果：为进一步确认该结果，采用流式细胞仪法进行细胞周期检测。PI能掺入到细胞DNA中，经过一系列细胞固定处理后，流式细胞仪检测细胞DNA的分布。结果表明单用TRAIL(100ng/mL)或五味子乙素(50μM)的细胞中，A549细胞周期分布基本正常。单用TRAIL，发现出现少量的亚二倍体峰，但TRAIL与五味子乙素的联用能显著增强亚二倍体峰的比例。因此该结果进一步表明五味子乙素能增强TRAIL诱导的细胞凋亡(图4)。
实施例五：TRAIL与五味子乙素对caspase 3水解酶活性的影响非小细胞肺癌细胞A549、H460、H226、H157于DMEM+10％胎牛血清培养液中培养，培养条件为37℃，5％CO2的湿润无菌环境。细胞长至80％-90％融合时，用PBS洗涤2次，0.25％胰酶消化。按细胞量6×104/孔接种于24孔细胞培养板中。加入药物处理，分别为对照组、TRAIL 100ng/ml，TRAIL 100ng/ml+五味子乙素50μM，TRAIL 100ng/ml，TRAIL100ng/ml+五味子乙素50μM，每组重复3个孔(图4)。处理12h后，将细胞用胰酶消化后，加入FITC标记的DEVD.fmk 1-2μl，于冰上孵育30min后，PBS洗2遍，流式细胞仪分析FITC荧光强度。
结果：caspase 3的激活是细胞凋亡的重要指标，无论是死亡受体介导的，还是线粒体通路所介导的细胞凋亡，最终均体现在caspase 3的激活上，因此通过测量caspase 3的活性可以作为细胞凋亡的重要指标。在本研究中，采用FITC标记的caspase 3底物，与细胞共孵育，该底物能穿透细胞膜进入到细胞内部，遇激活的caspase 3时被酶切，释放出FITC，从而被流式细胞仪检测到。结果与免疫荧光相符(图5)，在单用TRAIL时，细胞内caspasee3部分激活，而单用五味子乙素对caspase 3酶活性无太大影响，细胞内caspase 3酶激活不明显，但是两药的联用，细胞内caspase 3被激活。
实施例六：毒性实验HEK293、A549细胞于DMEM+10％胎牛血清培养液中培养，培养条件为37℃，5％CO2的湿润无菌环境。细胞长至80％-90％融合时，用PBS洗涤2次，0.25％胰酶消化。按细胞量5×103/孔接种于96孔细胞培养板中。PMBC细胞由捐献的正常人血液，通过淋巴细胞分离液制备获得。加入药物TRAIL 100ng/ml+五味子乙素50μM处理，每组重复3个孔，处理12h后，收集细胞，按实施例三检测A549与HEK293细胞凋亡。
结果：为研究五味子乙素增强非小细胞肺癌细胞对TRAIL敏感性的选择性，本发明考察TRAIL+五味子乙素对PMBC与HEK293正常细胞的杀伤作用，结果表明TRAIL+五味子乙素能选择性地杀死肿瘤化的A549细胞，而对PMBC或HEK293正常细胞无明显影响，表明TRAIL+五味子乙素是很有前景的抗肿瘤药物组合(图6)。
实施例七：五味子乙素联合用TRAIL用药的体内抗肿瘤作用取指数生长期的A549细胞，经胰酶消化后，用PBS洗2遍。将每只100μL 107个A549细胞皮下注射到7周龄的裸鼠右侧背部皮下，一周后形成原位肿瘤，将小鼠分成4组，每组8只。然后开始治疗，分别用PBS、五味子乙素80μg/只、TRAIL 100μg/只、五味子乙素/TRAIL联合治疗组进行裸鼠腹腔注射，每天注射一次，共治疗15次。从开始治疗后每三天测量肿瘤大小，并按下列公式计算肿瘤体积：0.5236×L1×(L2)2，其中L1为肿瘤长轴，L2为肿瘤短轴。开始治疗后第25天，处死小鼠，进行数据分析结果：接种A549细胞于裸鼠形成人源肺癌实体瘤，由结果可知，A549肺癌细胞对TRAIL不敏感，因此单用TRAIL对肿瘤大小影响不大，单用五味子乙素对肿瘤抑制率也不十分明显，但二者联用对肿瘤的抑制作用显著。达到近80％(图7)。