用于对细胞培养物控释培养组分的微量滴定板
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2012年9月20日提交的美国临时专利申请No.USSN 61/703,394的权益，该临时专利申请的内容据此以引用方式全文并入。
背景技术
微量滴定板通常用于温育和培养异源细胞或菌株库。例如，可在单个 96孔微量滴定板中通过在每个孔中培养不同的株系来比较96个细胞株的 库。因此，可在小格式中观察细胞间的差异(例如，生长速率、碳利用 率、群体密度、活力、蛋白质产率以及抗生素抗性)。在常规的微量滴定 板中，通常对培养的细胞分批提供固定量的碳和其他营养物质。随着细胞 生长，营养物质中的一者或多者可快速变成有限的或耗尽，并且在可观察 到细胞间的差异之前导致细胞减缓或停止生长。因此，常规的微量滴定板 并不非常适于筛选细胞库。
为了解决常规微量滴定板中的碳限制问题，开发了用于葡萄糖递送的 缓释系统即“![]()
”技术(Jeude et al.,Biotechnol Bioeng 95:433-445, 2006(Jeude等人，《生物技术与生物工程》，第95卷，第433-445页， 2006年))以用于制备预培养物。![]()
盘(AdolfKühner AG)为包埋有 糖的有机硅盘。然而，![]()
盘具有若干局限性。第一，仅相对少量的 糖可装进此类固相。第二，供培养物使用的糖的总量受到盘的几何形状的 限制(该盘不包含用于持续生产的足够的碳)。第三，在细胞量最低并且 溢流代谢的风险最高的培养初期，来自此类固相的糖释放速率最快。第 四，由于例如可装进微珠的糖的量并且缺乏精确控制糖释放的方法，因此 该方法具有有限的可扩展性。最后，![]()
盘或其他固定化控释系统 (例如，涂层、附件)在孔中的存在妨碍了筛选应用中的批量移液。由于 这些原因，该技术主要限于预培养物(Huber et al.,Biotechnol Bioeng 103:1095-1102,2009(Huber等人，《生物技术与生物工程》，第103卷， 第1095-1102页，2009年))。
附图说明
图1：(A)用于96孔控释聚二甲基硅氧烷(PDMS)微量滴定板的CNC机 加工模具的示意图；(B)96孔柱模具；(C)24孔柱模具；(D)具有空气管路 的模具盖。铝模具中的凸起管路变为PDMS srMTP的底部中的半通道，然 后用高粘性丙烯酸膜密封该半通道。空气管路允许氧气在板下方流动，氧 气通过每个孔下方的400微米厚的区域扩散，以提高对生长细胞的氧气传 递速率。
图2：(A)PDMS微量滴定板中的葡萄糖释放；(B)模塑有不同浓度的分 批葡萄糖的板的srMTP孔中的葡萄糖浓度。
图3：(A)芽孢杆菌属(Bacillus)细胞在cMTP与srMTP中的生长；(B)芽 孢杆菌属菌株A在常规与缓释PDMS 96孔微量滴定板中的生长；(C)芽孢 杆菌属菌株B在常规与缓释PDMS 96孔微量滴定板中的生长；(D)芽孢杆 菌属菌株C在常规与缓释PDMS 96孔微量滴定板中的生长；(E)芽孢杆菌 属菌株D在常规与缓释PDMS 96孔微量滴定板中的生长。
图4：(A)在常规与缓释PDMS 96孔板中生长的芽孢杆菌属菌株A的 AAPF活性；(B)在常规与PDMS缓释96孔板中生长的芽孢杆菌属菌株B 的AAPF活性；(C)在常规与PDMS缓释96孔板中生长的芽孢杆菌属菌株 C的AAPF活性。
图5：通过在cMTP与srMTP中生长的木霉属(Trichoderma)变体进行 的玉米棒水解。
图6：在PDMS srMTP中在含有20％乳糖的确定成分培养基中(泳道 1-4)生长的或在常规微量滴定板中在含有2.4％乳糖的确定成分培养基中 (泳道5-8)生长的表达葡糖淀粉酶的木霉属菌株的聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)。
图7：(A)REM H8_12在17.5％葡萄糖控释板中的生长速率。X轴为时 间(小时)；Y轴为光密度(在600nm波长下测量)。对于每个测量时间 点显示平均2个工艺平行测定孔，其中通过误差线指示标准偏差。趋势 线：对于1，实线空心圆为3μl接种孔；2实线空心正方形为12μl接种孔； 3虚线实心三角形为24μl接种孔；4虚线影线标记为48μl接种孔。更多细 节参见方法；(B)REM I4_18在17.5％葡萄糖缓释板中的生长速率。X轴为 时间(小时)；Y轴为光密度(在600nm波长下测量)。对于每个测量时 间点显示平均2个工艺平行测定孔，其中通过误差线指示标准偏差。趋势 线：对于1，实线空心圆为3μl接种孔；2实线空心正方形为12μl接种孔； 3虚线实心三角形为24μl接种孔；4虚线影线标记为48μl接种孔。更多细 节参见方法；(C)REM F2_18在17.5％葡萄糖缓释板中的生长速率。X轴为 时间(小时)；Y轴为光密度(在600nm波长下测量)。对于每个测量时 间点显示平均2个工艺平行测定孔，其中通过误差线指示标准偏差。趋势 线：对于1，实线空心圆为3μl接种孔；2实线空心正方形为12μl接种孔； 3虚线实心三角形为24μl接种孔；4虚线影线标记为48μl接种孔。更多细 节参见方法；(D)异戊二烯在44个小时的单位产量。X轴示出了菌株标记： A代表REM H8_12；B代表REM I4_18；C代表REM F2_18。Y轴指示异 戊二烯μg/L/OD/小时(单位产量)。对于针对3μl接种孔测量的44小时时 间点显示平均2个工艺平行测定孔，其中通过误差线指示标准偏差。
图8：cMTP与srMTP之间的葡糖淀粉酶活性比较。
图9：(A)来自DASGIP的FACS筛选菌株相对于LVS GFP(亲本)的 总蛋白质水平；(B)来自DASGIP的FACS筛选菌株相对于LVS GFP(亲 本)的GFP水平。
图10：分批补料发酵罐与控释微量滴定板之间的相关性。
发明内容
本发明提供了具有培养孔的培养板，其中该板由掺入了可释放到孔中 的培养基中的培养组分的聚合物制成。任选地，板基本上由掺入了培养组 分的聚合物组成，或者培养孔基本上由掺入了培养组分的聚合物组成。任 选地，板为由掺入了培养组分的聚合物形成的一体件，其中该聚合物通过 模具中单体的聚合而形成。任选地，板为整料。一些此类培养板为具有例 如至少24或96个孔的微量滴定板。培养组分可为营养物质，诸如糖，例 如葡萄糖。葡萄糖相对于聚合物的浓度可为15重量％-25重量％或17.5重 量％-22.5重量％或20重量％。培养组分还可为抗生素或缓冲液。聚合物可 为有机硅聚合物，诸如聚二甲基硅氧烷(PDMS)。在一些培养板中，一个或 多个孔连接至模塑到培养板中的空气管路。
本发明还提供培养细胞的方法，包括在如上所述培养板的孔中培养细 胞，从而在培养细胞时将培养组分释放到孔中。任选地，在微量滴定板的 多个孔中培养多个细胞。任选地，其中培养组分除了从聚合物释放到培养 基以外，培养基不含培养组分。任选地，培养组分释放至少48小时。任选 地，该方法还包括比较由来自多个孔的细胞产生的蛋白质或其他代谢物的 产量。任选地，该方法还包括比较来自多个孔的细胞的生长速率。任选 地，该方法还包括根据高于平均的生长速率或高于平均的产量选择细胞。 例如，该方法还包括根据高于蛋白质或代谢物的平均的产量选择细胞。在 一些方法中，比较细胞的不同株系或变体的生长速率或蛋白质/代谢物产 量。在一些方法中，比较不同培养基中的细胞的生长速率或蛋白质/代谢物 产量。一些方法还包括将培养物从孔转移到较大体积培养中。任选地，较 大体积培养为分批补料培养或分批培养。
本发明还提供了用于形成培养板的模具，该模具包括：多个细长孔 柱；具有多个凹陷部分的底板，凹陷部分中的每一个被配置成接纳并支承 多个细长孔柱中的一个；包含多个孔的释放板，孔中的每一个被配置成接 纳多个细长孔柱中的一个的至少一部分穿过；具有多个壁部分的侧壁板， 壁部分被配置成基本上围绕多个细长孔柱；以及盖板，其中侧壁板和释放 板被定位成基本上在盖板和底板中间，以便限定由至少释放板和多个细长 孔柱占据的内部腔体。任选地，至少盖板、侧壁板和底板包括多个孔；并 且多个孔中的每一个被配置成接纳螺钉，以便至少使盖板、侧壁板和底板 相对于彼此牢固地固定并将模具保持在一起。任选地，底板还包括多个通 道，以形成多个空气管路。任选地，多个空气管路被配置成有利于空气、 氧气或其他气体流扩散到多个孔柱中的每一个的一部分。
本发明还提供了形成培养板的方法，包括组装如上文所定义的模具； 将单体、培养组分和聚合引发剂引入模具中，在该模具中发生聚合，从而 在盖板、侧板和释放板之间形成聚合物；以及拆卸模具，其中聚合物与孔 柱的分离产生培养板的孔。
定义
一体件或单一体的培养板意指所有部件都是相连的，诸如当通过在模 具中聚合单体(以及培养组分)或
通过在模具中使用交联剂固化液体聚合物而形成时。
通过组装培养板的组件而形成整料培养板，每个组件通过如上针对单 一体所述的聚合而形成。优选地，每个组件由相同单体和固化剂形成。在 不同组件中，培养组分可为相同或不同的，其浓度也可为相同或不同的。 通过固化使得组件中的聚合物之间形成共价键而接合组件。例如，整料的 组件可为培养板的层或部分。虽然不可通过眼睛区分整料与单层的外部外 观，但在观察整料的横截面时，组件之间的连接至少通过显微镜(例如， 用电子显微镜)可见。
根据惯例使用“基本上由…组成”限定对象的基本特征和新颖特征。 因此，基本上由聚合物组成的培养板意指，聚合物为培养板的负责其基本 功能的主要组分，但不排除添加不由聚合物制成的附属部件，诸如标记、 装饰或柄部。
“代谢物”为来源于细胞中的代谢过程的化合物、物质、副产物、中 间物或产物。
“分批培养”是培养细胞的一种方法，其中在培养过程开始时提供最 终将用于培养细胞的所有组分(包括培养基(参见下文“培养基”的定 义))以及细胞本身。通常在某个时间点停止分批培养，并在培养基中收 获细胞和/或组分并任选地纯化。
“分批补料培养”是培养细胞的一种方法，其中在培养过程开始之后 的一定时间处提供用于培养的另外的组分。提供的组分通常包括在培养过 程中已耗尽的细胞的营养补充剂。通常在某个时间点停止分批补料培养， 并在培养基中收获细胞和/或组分并任选地纯化。
术语“单体”是指能够与类似分子反应并从而形成包含不止一种初始 单体的较大实体(例如，聚合物)的任何化学实体。因此，“单体”也涵 盖仍能够进行聚合反应的“低聚物”。术语“聚合物”是指聚合反应的产 物，并且包括均聚物、共聚物、三聚物、无规聚合物、接枝聚合物、嵌段 聚合物等。
如本文所用，术语“控释”和“缓释”可互换使用。例如，术语“控 释微量滴定板”或“crMTP”可与“缓释微量滴定板”或“srMTP”互换使 用。控释或缓释微量滴定板与常规微量滴定板(cMTP)截然不同。
具体实施方式
I.概述
本发明提供了包含一个或多个培养孔的培养板(例如，微量滴定 板)，该培养板由掺入了可释放到孔中的培养基中的培养组分的聚合物形 成。与悬浮于培养基中或固定或以其他方式附接到板孔的壁或底部上(例 如，以涂层或内衬形式)的![]()
盘不同，培养板的整体可由掺入了培 养组分的聚合物基体制成。这种培养板可例如通过使用包埋有一种或多种 培养组分的聚合物浇注整个板而制成。
与其他培养组分释放系统(诸如![]()
盘(AdolfKühner AG))相 比，本发明培养板具有显著提高的表面积体积比，能够在用于生产宿主的 正常培养时间范围内提供实际上不受限制的培养组分储库。本发明培养板 的表面积保持恒定或随时间推移而略微增大(例如，基体内的通道)。因 此，使用本发明培养板的培养组分的释放速率保持恒定或随时间推移而增 大(例如，在发酵开始时最慢)。相比之下，由于培养组分的可用量的损 耗，![]()
盘的释放速率随时间推移而减小。
在常规的分批培养系统中，观察到与分批补料培养系统不同的细胞生 理学。然而，本发明培养板可提供具有更类似于分批补料培养系统(例 如，生物反应器或大规模生产系统)的细胞生理学的培养物。因此，本发 明培养板中的表达谱与分批补料培养系统中的表达谱类似。因此，在本发 明培养板中获得的蛋白质产量对于分批补料培养系统(诸如工业级发酵工 艺)的转移和按比例扩大更具有可再现性。
在常规的培养系统或培养组分释放系统中，针对不同株系或变体的培 养物观察到不均等的生长动力学。本发明的培养板可避免该问题或至少使 该问题最小化，从而导致不同株系和变体中的生长归一化。此外，可在高 浓度下持续产生蛋白质。板中产生的蛋白质可直接用于下游应用，从而避 免了浓缩裂解物或上清液的需要。另外，可延长培养时间，从而能够对以 不同速率(即，g/L/小时)产生产物的株系之间的滴度的较大绝对差值进行 检测。因此，本发明的培养板可用于筛选具有改善的酶生产能力的株系、 工艺优化、培养基配制和优化，以及筛选分子库。
II.培养板
培养板可具有不同的形状和尺寸。培养板通常包括基本上平坦的表 面，其中孔从该表面向下延伸以包封单独的培养物。平坦表面的合适的形 状包括圆形、矩形、方形、多边形等等。角可以为圆的或直角的。
可将孔看作是具有底部和与底部邻接并从底部向上延伸的壁，从而形 成孔。一些孔具有基本上平坦的底部和竖直的壁。其他孔具有圆锥形状， 在这种情况下，在底部和壁之间可能没有清晰的分界线。孔可以为任何形 状，诸如基本上圆形或基本上矩形。孔还可包括一个或多个有利于例如液 体培养物的混合或通气的结构或形状。例如，孔可包括沿着孔的底部或侧 面的挡板。
培养板可用一个或多个通道功能化。一些培养板包含用于向培养板的 孔中递送空气或氧气的通道(即，“空气管路”)。一些培养板包含板底 部中的通道，空气或氧气通过该通道扩散到每个孔中。一些培养板(例 如，微米级和/或纳米级装置，诸如微流体装置和/或微量滴定板)包含至少 一个微米级或纳米级通道。
本发明培养板可具有一个或多个孔，例如，每个板具有4、6、8、 12、24、48、96、384或1536个孔或每个板具有更多孔。通常，板上的所 有孔基本上相同(如制造公差允许的)。一个孔的最大体积取决于板的尺 寸、孔的数量和孔的高度。标准微量滴定板的尺寸和孔的尺寸为人们熟知 的。在一些96孔板中，一个孔的最大体积为约500μl。在一些384孔板 中，一个孔的最大体积为约50μl。具有最大体积小于1ml并且通常不超过 500μl的孔的板被视为微量滴定板。例如，常规的96孔板通常被称为微量 滴定板。具有最大体积小于1μl的孔的板被称为纳米滴定板。
可根据如美国国家标准学会(American National Standards Institute,ANSI) 于2003年提出的用于孔间距、深度和直径等的标准化测量值制备培养板。
可将培养板设置为无菌的，不含脱氧核糖核酸酶(DNase)、核糖核酸酶 (RNase)或热原或它们的任何组合。
III.聚合物基体
本发明培养板由包埋有一种或多种培养组分的聚合物基体制成。可通 过物理或化学方法将聚合物与培养组分混合，例如通过将培养组分散布到 聚合物材料中。因此，培养孔的整个内表面(例如，底部和壁)构成聚合 物基体。例如，可通过在模具内聚合单体或通过在模具内交联和固化液体 聚合物来制造本发明培养板。可使用其他模塑技术，诸如注射成型、压印 或冲压。优选地，培养板基本上由聚合物和包埋的培养组分组成，并且更 优选地为聚合物和包埋的培养组分的一体件或单一体。在单独地倾注板的 多个层然后粘合在一起的情况下，可以添加另外的结构。此类系统可被制 造成两个或更多个组件的多组件结构。两个或更多个组件可具有任何合适 的相对空间关系并且可以通过任何合适的粘合机制彼此附接。另外，培养 板可被制成具有不止一层，然后所述层固化成单个整料(即，“多层光 刻”)。这些层可包含相同或不同的培养组分。此外，可将包括但不限于 泵和阀门、空气管路、透镜和传感器的结构结合到此类培养板中。另外， 在一些情况下，培养板可被制成具有光学透明的底层，以供诸如分光光度 计、倒置显微镜和/或板扫描仪的仪器使用。在一些情况下，该底层可包含 或可不包含任何培养组分。在其他情况下，培养板可被制成不具有底部， 并且随后以多种方式粘合到光学性能玻璃或石英、塑料或任何合适的材 料，以有利于通过各种类型的仪器分析孔内容物。由于过量的培养组分可 包埋于聚合物中并且从聚合物释放，因此可在不具有包埋式聚合物的内衬 或粒子的情况下使用本发明的培养板。
具有宽粒度分布(例如，1μm至5mm、5μm至2mm、更优选地50μm 至500μm)的培养组分可掺入到聚合物基体中。优选地，使用具有均匀粒 度分布或窄粒度分布的粒子，用这种粒子时可在限定的动力学下释放培养 组分。还可使用具有不同的限定粒度分布的粒子或两个或更多个小部分的 混合物，每个小部分具有窄粒度分布。粒子可以为结晶的或无定形的。另 外，可将液体微滴掺入到培养板中，在一些情况下，通过乳化促进，具体 取决于诸如待加入板的组分的载量的因素(这例如可影响疏水性)。
培养组分可以各种浓度(例如，0.1重量％-60重量％、1重量％-40重 量％、更优选地10重量％-30重量％)包埋于聚合物基体中。按照与聚合混 合物(例如，培养组分、单体和固化剂)预聚合的总重量相比的培养组分 的重量比测定浓度。期望的浓度可根椐所用的培养组分而显著变化。当使 用诸如碳源(例如，葡萄糖)的营养物质时，浓度通常为至少1重量％、2 重量％、5重量％、10重量％、以及至多5重量％、10重量％、15重量％、 20重量％、25重量％、30重量％、35重量％、40重量％、45重量％、50重 量％，包括下限和上限的所有排列和组合。例如，葡萄糖浓度可为约5重量 ％、10重量％、15重量％、20重量％、25重量％、30重量％、35重量％、 40重量％、45重量％、50重量％。优选的葡萄糖浓度为15重量％-30重量 ％、优选地15重量％-25重量％、更优选地17.5重量％-22.5重量％。其他培 养组分诸如抗生素或矿物质可以低得多的浓度存在，例如0.1重量％-5重量 ％。所提及的浓度为初始浓度并且随着培养组分释放到培养基而降低。可 将两种或更多种培养组分包埋于相同的聚合物基体。
培养组分可从培养板释放到板的孔内的培养基中。释放的培养组分的 比例可为与培养板或其组成聚合物相关联的培养组分的至少1％、5％、 10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％。在 释放之前在培养板内或在释放之后在培养基中，培养组分可经历或可不经 历降解(例如，纤维素到葡萄糖的转化)。通常，培养组分以可溶形式释 放。掺入到聚合物基体中的培养组分可释放最少一小时至最多若干周的时 间段范围。例如，培养组分可释放至少1、5、10、24、36、48、72小时。 在一些培养物中，培养组分释放至少1、2、3、4、5周。
可延迟培养组分的释放，即，可将培养组分在从发酵开始的一定延迟 之后供应到培养基。延迟允许供应适应于微生物或细胞的迟滞期。例如， 可通过用不包含所需的培养组分的水溶性或水不溶性涂层涂覆培养板的孔 来延迟释放。涂层延迟了培养组分从聚合物基体中的释放。此类涂层包括 水溶性或可渗透组合物，诸如羟丙基甲基纤维素、糖等。根椐水溶性或可 渗透涂层的厚度和孔隙度，由于首先需要涂层溶解才能释放培养组分，此 类涂层延迟了聚合物基体中培养组分的释放。合适的水溶性涂层包括水溶 性聚合物(例如，聚乙酸乙烯酯)、食品级虫胶(参见例如US 4,673,577)、水不溶性蜡涂层(参见例如US 4,885,175)、玉米蛋白以及脂 肪酸。合适的涂层还包括蛋白质，诸如酪蛋白、淀粉、糊精、改性或未改 性的纤维素(例如，乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤 维素)、阿拉伯树胶、脂肪、碳水化合物以及二氧化硅。
聚合物
天然聚合物和合成聚合物可用作聚合物基体的聚合物材料。合适的聚 合物材料包括塑料，诸如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA)、聚碳酸酯、聚四氟乙烯(TEFLONTM)、聚乙烯化合物、聚氯乙烯 (PVC)、聚砜、聚苯乙烯、聚甲基戊烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏氟乙烯、 ABS(丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物)等等。合适的聚合物材料还包括多糖 和它们的衍生物；聚硅氧烷；聚丙烯酸及其衍生物；聚碳酸酯；聚烯烃和 它们的衍生物；多元羧酸和它们的衍生物；聚醚和它们的衍生物；聚酯和 它们的衍生物；聚胺和酰胺以及它们的衍生物；聚砜和它们的衍生物；聚 氨酯；聚乙烯化合物和它们的衍生物，尤其是聚乙烯醇。合适的聚合物材 料还包括上述聚合物与通过改性获得的衍生物的共聚物。可通过使单体和 培养组分的溶液与聚合引发剂接触来实现聚合。液体聚合物还可通过交联 剂来固化。合适的聚合物材料还包括琼脂、琼脂糖和例如低熔点琼脂糖。 合适的聚合物材料还包括明胶和其官能化衍生物。
用于聚合物基体中的一种或多种聚合物可以各种浓度使用，并且根据 重量比测定。期望的浓度可根据所用的一种或多种聚合物而显著变化。例 如，所用的一种或多种聚合物的浓度可为至少1重量％、2重量％、5重量 ％、10重量％、20重量％、25重量％、30重量％、40重量％、50重量％、 60重量％、70重量％、75重量％、80重量％、90重量％、99重量％、99.9 重量％或更大，包括下限和上限的所有排列和组合。
培养组分
可将各种培养组分包埋于聚合物基体中。此类培养组分包括由细胞生 长消耗的组分(例如，营养物质)。此类组分的例子包括用于细胞生长的 各种营养物质，包括碳源(例如，糖)、矿物质和盐。
合适的碳源包括碳水化合物(诸如单糖、二糖、低聚糖或多糖)、酵 母提取物或酵母提取物的一种或多种组分。示例性的单糖包括葡萄糖和果 糖；示例性的低聚糖包括乳糖和蔗糖，示例性的多糖包括淀粉和纤维素。 示例性的碳水化合物包括C6糖(例如，果糖、甘露糖、半乳糖或葡萄糖) 和C5糖(例如，木糖或阿拉伯糖)。
合适的盐和矿物质包括含氮材料(例如，硝酸盐、铵盐)、含磷材料 (例如，磷酸盐)、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐以及含硫盐(例如，硫酸 盐)。其他盐和矿物质包括含铁、锰、锌、硼、氯化物、碘、铜、钴和钼 的材料。适用于聚合物基体的其他培养组分包括各种缓冲液(例如，磷酸 盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐)、辅因子、维生素(例如，硫胺、 烟酸、吡哆醇、肌醇)、氨基酸或其他氮补充剂、抗生素(例如，氨苄青 霉素、庆大霉素、链霉素、新霉素和多粘菌素B)、蛋白表达诱导物(例 如，异丙基-β-D-硫代-半乳糖苷)、多肽和蛋白质(例如，酶)以及小分子 药物(例如，用于筛选候选药物)。适用于聚合物基体的示例性培养组分 包括5-氨基水杨酸盐、5HT3受体拮抗剂、金刚烷抗病毒药、肾上腺皮质类 固醇、肾上腺皮质类固醇抑制剂、肾上腺素性的支气管扩张剂、高血压急 症试剂、肺动脉高压试剂、醛固酮受体拮抗剂、烷基化剂、α-葡糖苷酶抑 制剂、替代药物、抗阿米巴药、氨基糖甙类、氨基青霉素、氨基水杨酸 盐、糊精类似物、止痛药组合、止痛药、雄激素和合成代谢类固醇、血管 紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素II抑制剂、肛门直肠制剂、减食欲剂、 抗酸剂、驱肠虫剂、抗血管生成眼科药、抗-CTLA-4单克隆抗体、抗感染 药物、作用于中枢的肾上腺素能阻断剂、作用于外周的肾上腺素能阻断 剂、抗雄激素、抗心绞痛药、抗心律失常药、平喘药组合、抗生素/抗肿瘤 药、抗胆碱能止吐药、抗胆碱能抗帕金森病药、抗胆碱能支气管扩张剂、 抗胆碱能变时性药物、抗胆碱能/解痉药、抗凝血剂、抗痉挛药、抗抑郁 药、抗糖尿病药、抗糖尿病药组合、止泻剂、抗利尿激素、解毒剂、止吐 剂/抗眩晕药、抗真菌剂、抗促性腺激素药、抗痛风剂、抗组胺药、抗高血 脂药物、抗高血脂药物组合、抗高血压药物组合、抗高尿酸血症药物、抗 疟疾剂、抗疟疾剂组合、抗疟疾喹啉、抗代谢物、抗偏头痛药、抗肿瘤解 毒剂、抗肿瘤干扰素、抗肿瘤药物、抗帕金森病药物、抗血小板药、抗假 单胞菌青霉素、治牛皮癣药、抗精神病药、抗风湿药、防腐剂和杀菌剂、 抗甲状腺类药物、抗毒素和抗蛇毒素、抗结核药、抗结核药组合、止咳 药、抗病毒药、抗病毒药组合、抗病毒干扰素、抗焦虑药、镇静剂和催眠 药、芳香化酶抑制剂、非典型抗精神病药、唑类抗真菌剂、细菌疫苗、巴 比妥类抗痉挛药、巴比妥类药物、BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂、苯二氮平 类抗痉挛药、苯二氮平类药物、β-肾上腺素能阻断剂、β-内酰胺酶抑制剂、 胆汁酸螯合剂、生物制剂、二膦酸盐、骨吸收抑制剂、支气管扩张剂组 合、支气管扩张剂、钙调磷酸酶抑制剂、降钙素、钙通道阻断剂、氨基甲 酸酯抗痉挛药、碳青霉烯类、碳酸酐酶抑制剂抗痉挛药、碳酸酐酶抑制 剂、心脏加压药、心脏选择性β-阻断剂、心血管药、儿茶酚胺、中枢神经 系统药物、头孢菌素、溶耳耵聍剂(cerumenolytics)、CFTR增效剂、螯合 剂、趋化因子受体拮抗剂、氯离子通道活化剂、胆固醇吸收抑制剂、类胆 碱能激动剂、类胆碱能肌肉兴奋剂、胆碱酯酶抑制剂、CNS兴奋剂、凝固 改性剂、集落刺激因子、避孕药、促肾上腺皮质激素、香豆素和茚二酮、 环氧化酶-2抑制剂、减充血剂、皮肤病药物、诊断用放射性药物、二苯并 氮卓类抗痉挛药、消化酶、二肽基肽酶-4抑制剂、利尿剂、多巴胺能抗帕 金森病药、用于酒精依赖的药物、棘白菌素、EGFR抑制剂、雌激素受体拮 抗剂、雌激素、祛痰剂、Xa因子抑制剂、脂肪酸衍生物抗痉挛药、纤维酸 衍生物、第一代头孢菌素、第四代头孢菌素、功能性肠病药物、胆结石增 溶剂、γ-氨基丁酸类似物、γ-氨基丁酸再摄取抑制剂、胃肠药物、全身麻醉 药、泌尿生殖道药物、GI兴奋剂、糖皮质激素、升血糖药、糖肽抗生素、 糖蛋白血小板抑制剂、甘氨酰环素、促性腺激素释放激素、促性腺激素释 放激素拮抗剂、促性腺激素、I类抗心律失常药、II类抗心律失常药、III类 抗心律失常药、IV类抗心律失常药、V类抗心律失常药、生长激素受体阻 断剂、生长激素、幽门螺旋杆菌根除剂、H2拮抗剂、hedgehog途径抑制 剂、造血干细胞动员剂、肝素拮抗剂、肝素、HER2抑制剂、草药产品、组 蛋白脱乙酰酶抑制剂、激素、激素/抗肿瘤药、乙内酰脲抗痉挛药、违禁 (街头)药物、免疫球蛋白、免疫制剂、免疫刺激剂、免疫抑制剂、阳痿 药物、体内诊断生物制剂、肠促胰岛素类似物、吸入性抗感染药物、吸入 皮质类固醇、正性肌力药、胰岛素、胰岛素样生长因子、整合酶链转移抑 制剂、干扰素、白介素抑制剂、白介素、静脉内营养品、碘化造影剂、离 子碘化造影剂、铁制品、酮内酯、轻泻剂、抗麻风病药、白三烯调节剂、 林可霉素衍生物、局部注射麻醉剂、袢利尿剂、肺表面活性剂、淋巴染色 剂、溶酶体酶类、大环内酯衍生物、大环内酯类、磁共振成像造影剂、肥 大细胞稳定剂、医用气体、氯茴苯酸类、代谢药物、甲基黄嘌呤、盐皮质 激素、矿物质和电解质、其他药剂、其他止痛药、其他抗生素、其他抗痉 挛药、其他抗抑郁药、其他抗糖尿病剂、其他止吐药、其他抗真菌剂、其 他降血脂药物、其他抗疟疾药、其他抗肿瘤药、其他抗帕金森病药、其他 安定药、其他抗结核药、其他抗病毒药、其他抗焦虑药、镇静剂和催眠 药、其他骨吸收抑制剂、其他心血管药、其他中枢神经系统药物、其他凝 固改性剂、其他利尿剂、其他泌尿生殖道药物、其他GI药物、其他激素、 其他代谢药物、其他眼科药物、其他耳部药物、其他呼吸道药物、其他性 激素、其他局部药物、其他未分类药物、其他阴道药物、有丝分裂抑制 剂、单胺氧化酶抑制剂、口腔和喉部产品、mTOR抑制剂、黏液溶解剂、 多重激酶抑制剂、肌肉松弛剂、瞳孔放大剂、麻醉性止痛药组合、麻醉性 止痛药、鼻腔抗感染药、鼻腔抗组胺药和减充血剂、鼻腔润滑剂和冲洗 剂、鼻腔制剂、鼻腔类固醇、天然青霉素、神经氨酸苷酶抑制剂、神经肌 肉阻断剂、神经元钾通道开放剂、新一代头孢菌素、烟酸衍生物、 NNRTI、非心脏选择性β-阻滞剂、非碘化造影剂、非离子碘化造影剂、非 磺脲类、非类固醇抗炎剂、核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)、营养保健品、营 养品、眼科麻醉剂、眼科抗感染药物、眼科抗炎剂、眼科抗组胺药和减充 血剂、眼科诊断剂、眼科青光眼药物、眼科润滑剂和冲洗剂、眼科制剂、 眼科类固醇、眼科抗感染类固醇、眼科手术药物、口服营养补充剂、其他 免疫刺激剂、其他免疫抑制剂、耳部麻醉剂、耳部抗感染药物、耳部制 剂、耳部类固醇、耳部抗感染类固醇、噁唑烷二酮抗痉挛药、甲状旁腺激 素和类似物、耐青霉素酶青霉素、青霉素、外周阿片类受体拮抗剂、外周 血管扩张剂、外周作用减肥药、吩噻嗪类止吐药、吩噻嗪类抗精神病药、 苯基哌嗪类抗抑郁药、血浆扩容剂、血小板聚集抑制剂、血小板刺激剂、 多烯、保钾利尿剂、益生菌、孕酮受体调节剂、孕酮、催乳素抑制剂、前 列腺素D2拮抗剂、蛋白酶抑制剂、质子泵抑制剂、补骨脂素、心理治疗 剂、心理治疗剂组合、嘌呤核苷、吡咯烷抗痉挛药、喹诺酮、放射性造影 剂、放射学添加剂、放射学药物、放射学轭合剂、放射性药物、重组人红 细胞生成素、肾素抑制剂、呼吸道药物、呼吸道吸入制剂、利福霉素衍生 物、水杨酸盐类、硬化剂、第二代头孢菌素、选择性雌激素受体调节剂、 选择性免疫抑制剂、选择性磷酸二酯酶-4抑制剂、选择性5-羟色胺再摄取 抑制剂、5-羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂、含血清素神经管原肠调节 剂、性激素组合、性激素、骨骼肌松弛剂组合、骨骼肌松弛剂、戒烟药 物、生长激素抑制素和生长激素抑制素类似物、杀精子剂、他汀类药物、 无菌灌洗液、链霉菌衍生物、琥珀酰亚胺抗痉挛药、磺胺类药、磺酰脲类 药物、合成排卵刺激剂、四环类抗抑郁药、四环素、治疗用放射性药物、 治疗性疫苗、噻嗪类利尿剂、噻唑烷二酮类、噻吨、第三代头孢菌素、凝 血酶抑制剂、溶栓剂、甲状腺药物、TNFα抑制剂、抑制分娩药、局部抗 痤疮药、局部药物、局部麻醉剂、局部抗感染药物、局部抗生素、局部抗 真菌剂、局部抗组胺药、局部抗肿瘤药、局部抗牛皮癣药、局部的抗病毒 药、局部收敛药、局部清创药、局部脱色素剂、局部润肤剂、局部角质剥 脱剂、局部非甾体抗炎剂、局部光化学治疗剂、局部发红剂、局部类固 醇、局部抗感染类固醇、三嗪抗痉挛药、三环类抗抑郁药、三官能单克隆 抗体、超声造影剂、上呼吸道制剂、泌尿抗痉挛药、泌尿抗感染药物、泌 尿解痉药、泌尿pH调节剂、子宫收缩剂、疫苗组合、阴道抗感染药物、阴 道制剂、血管扩张剂、加压素拮抗剂、血管加压药、VEGF/VEGFR抑制 剂、病毒疫苗、透明质酸补充剂、维生素和矿物质组合、维生素。
基于酶的控释
当掺入到聚合物基体时，培养组分可以低聚物或聚合物形式提供。一 些聚合物或低聚物可被某些微生物或细胞直接利用，而其他微生物或细胞 仅利用单体。当培养组分的低聚物或聚合物形式不能被微生物或细胞直接 利用时，它们可通过化学品或酶降解为单体(参见例如US2012/0045836和 US2010/0099164)。
在使用聚合物或低聚物时，可延迟并控制将单体释放到培养基中。在 发酵开始时(迟滞期)，聚合物或低聚物未转变为单体或仅部分转变为单 体。单体的有限可用性避免了溢流代谢的风险。当微生物或细胞进入生产 期时，更多聚合物或低聚物已转变为单体，从而提供生产所需的营养物质 的连续供应。
降解化学品或酶可以足以降解基体中的低聚物或聚合物的量掺入到聚 合物基体中。它们也可以是培养基的组分。例如，许多动物血清包含水解 酶，诸如降解淀粉的淀粉酶和麦芽糖酶。或者，化学品或酶可以为培养基 中微生物或细胞的产物、副产物或代谢物。例如，当培养板中培养的微生 物或细胞分泌葡糖淀粉酶或α-淀粉酶到培养基中时，淀粉可用作培养组 分。在这种情况下，聚合物基体或培养基中不需要具有外源淀粉降解酶。
优选的低聚物或聚合物为水溶性的、部分水溶性的。还可以使用水不 溶性低聚物或聚合物(例如，纤维素)。例如，葡萄糖的低聚物或聚合物 形式可以为淀粉、葡聚糖、纤维素(β-1,4-葡聚糖)、凝胶多糖(β-1,3-葡 聚糖)、右旋糖酐(α-1,6-葡聚糖)、糖原(α-1,4-葡聚糖和α-1,6-葡聚 糖)、昆布多糖(β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖)、香菇多糖(β-1,6:β-1,3- 葡聚糖)、地衣多糖、平菇多糖(pleuran)(β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖)、 支链淀粉(α-1,4-葡聚糖和α-1,6-葡聚糖)、淀粉(α-1,4-葡聚糖和α-1,6-葡 聚糖)以及酵母多糖(β-1,3-葡聚糖)或其衍生物(例如，糊精)。葡萄糖 聚合物的衍生物的例子包括可溶性淀粉衍生物和糊精、纤维素衍生物、甲 基纤维素以及羧甲基纤维素。
根椐所用葡萄糖的低聚物或聚合物形式，可使用多种酶来降解它们。 胞外酶和胞内酶两者或它们的组合均可使用。示例性酶包括α-淀粉酶、葡 糖淀粉酶(γ-淀粉酶)、异淀粉酶、β-葡萄糖苷酶以及其他纤维素分解酶。 当期望恒定的葡萄糖释放时，优选消化聚合物或低聚物的末端(还原或非 还原末端)的胞外酶。葡糖淀粉酶可用于降解富含α-1,4-键的葡萄糖聚合 物，而对于富含β-1,4-键的葡聚糖，优选β-葡萄糖苷酶和其他纤维素分解 酶。对于降解富含α-1,6-键的葡聚糖优选脱支酶，诸如异淀粉酶。α-淀粉酶 和γ-淀粉酶可用于降解淀粉或可溶淀粉衍生物。可通过葡糖淀粉酶，任选 地与其他淀粉酶(例如，α-淀粉酶、异淀粉酶)组合降解糊精。可用葡糖 淀粉酶降解麦芽糖、麦芽三糖和其他较短的α-1,4-键合葡萄糖聚合物。可用 于降解低聚物或聚合物形式的培养组分的其他酶包括蛋白酶、肽酶、核酸 酶和酰胺酶。
IV.形成培养板的方法
可使用模具制备培养板。可通过常规的加工工艺(诸如车削、镗削、 钻孔、铣削、拉削、锯削、成形、刨削、扩孔以及开孔或磨削)制造模 具。另外，可通过例如电火花加工、电化学加工、电子束加工、光化学加 工以及超声波加工等制造模具。合适的模具包括底板、释放板、侧壁板和 盖板。底板具有多个凹陷部分(例如，压痕)，每个凹陷部分被配置成接 纳并支承多个孔柱中的一个的至少基部。释放板包含一个或多个孔，当释 放板定位成基本上邻近底板(例如，在底板之上)时，每个孔类似地被配 置成接纳多个细长孔柱中的一个的至少一部分穿过。模具还包括具有多个 壁部分的侧壁板，该侧壁板形成并限定周边，该周边基本上限定模具的周 边。侧壁板定位在盖板和释放板中间。这样，盖板、侧壁板和基板配合以 基本上围绕并包封盖板与释放板之间的空间。基板、盖板和侧壁板还包括 围绕其周边定位的多个孔。使用多个螺钉占据多个孔，从而使基板、盖板 和侧壁板相对于彼此固定，这样便将模具保持在一起。盖板还可包括多个 通道，以在完整部件中形成多个空气或液体通道。培养板可由单个组件制 成一体结构，或制成两个或更多个组件的多组件结构。在单独倾注板的多 个层并且然后粘合在一起的情况下，可使用不止一个模具来制备板的每个 层。两个或更多个层可具有任何合适的相对空间关系并且可以通过任何合 适的粘合机制彼此附接。在一些情况下，相对薄的层不需要模具，可以倾 注所述层并切割成一定尺寸。在一些情况下，层的厚度为10至100微米。 在一些情况下，层的厚度可以为20至50微米，在其他情况下厚度为50至 300微米。在其他情况下，层的厚度可以为0.1至4厘米，或者在其他情况 下，厚度为0.5cm并且最多至10cm或更大。
为了制备培养板，将单体、一种或多种培养组分以及任选地聚合引发 剂的混合物倾注到如上所述模具中。可一起或单独地以任何顺序引入组 分。聚合在模具内发生，从而在盖板、侧板和释放板之间形成聚合物。然 后拆除模具。聚合物与孔柱分离，从而产生培养板的孔。在使用多个聚合 物层的情况下，通过包括将部分固化的层直接彼此聚合等在内的多种技 术，或通过由例如氧等离子体处理使每个层功能化，来将这些层粘合到一 起。
或者，可通过向如上所述的模具中引入一种液体聚合物或多种液体聚 合物的混合物、一种或多种培养组分和交联剂来制备培养板。同样，可一 起或以任何顺序引入组分。交联过程在模具内发生，从而固化盖板、侧板 和释放板之间的聚合物。然后拆除模具。固化的聚合物与孔柱分离，从而 产生培养板的孔。
V.培养微生物和细胞系的方法
本发明培养板可用于培养各种微生物、细胞系或其他细胞培养物。由 于培养组分随着培养物生长而释放到孔内，因此在培养基中可供应，也可 不供应可释放的培养组分。可在初始具有对于生长期足够量的培养组分的 培养基中培养细胞，或可在除从聚合物基体释放到培养基中的培养组分外 不含培养组分的培养基中培养细胞。随着培养物进入生产期，另外的量的 培养组分释放到培养物中。
可根据蛋白质、代谢物或生化物质产量(数量或活性)或根据生长速 率选择细胞。例如，在一些方法中，可筛选一定时间范围内的生长速率， 以选择例如在最短时间内达到生产期的快速生长株系。
此外，当前方法避免了不同株系或变体的培养物中的不均等生长动力 学的问题或至少使该问题最小化。由于控释培养板的线性释放动力学，培 养组分的控释使得生长速率均等，即，不同株系或变体全部消耗相同量或 至少更相似量的碳。因此，不同株系或变体具有相似的生长速率，在大约 相同时间诱导表达，并且在生产期停留大约相同时间，从而导致各种株系 和变体的生长归一化。因此，观察到的产量差异比初始生长速率更能代表 固有生产能力。因此，可根据蛋白质或代谢物的最高单位产量来选择微生 物、杂交瘤、昆虫细胞和其他类型的细胞。由于培养时间可延长到分批培 养的正常限度之外，因此可测得具有不同单位生产率的株系或克隆之间的 较大绝对差值。这就能够选择具有较小生产能力差异的株系，因为在一些 情况下，较大的绝对差值可允许蛋白质或代谢物测量值超出给定测定的噪 音范围。
在一些实施例中，培养组分进入微量滴定板的孔的控释动力学取决于 模塑到微量滴定板中的培养组分的浓度。培养组分的浓度可以是0.01％至 50％中的任何数，包括下限和上限的所有排列和组合。例如，培养组分的 浓度可以是0.01％、0.1％、0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、 10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、或其间的任何百分比。这些 百分比并非意图为限制性的，而仅是为了示例性目的。可在0小时至288 小时中的任何时间点或其间的任何时间(包括下限和上限的所有排列和组 合)观察到控释培养板的线性释放动力学。例如，线性释放动力学可开始 于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大小时处。可迟至50、60、 70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275或288小时观察 到线性释放动力学。例如，可在0-24小时、0-48小时、0-72小时、0-96小 时、2-24小时、2-48小时、2-72小时、2-96小时、或任何其他范围(包括 下限和上限的所有排列和组合)观察到线性释放动力学。这些范围并非意 图为限制性的，而仅是为了示例性目的。线性释放动力学可取决于模塑到 微量滴定板中的培养组分。
当前方法还可用于选择对于蛋白质、代谢物或生化物质产量或者细胞 的生长速率而言最佳的培养基。例如，可以比较产生提高的蛋白质产量、 代谢物产量、或生化物质产量的条件。
当前方法可用于比较例如，蛋白质、代谢物、小分子、或生化物质的 产量。例如，该方法可用于比较蛋白质的产量，所述蛋白质为诸如激素、 酶、生长因子、生化物质、报告基因、或细胞因子。可以产生的酶包括， 例如，蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶(例如，α-淀粉酶或β-淀粉酶)、葡糖 淀粉酶、木聚糖酶、植酸酶、甘露聚糖酶、半纤维素酶、糖酶、水解酶、 酯酶、过氧化氢酶、乳糖酶、氧化酶、透性酶、支链淀粉酶、漆酶、脂肪 酶、还原酶、异构酶、表异构酶、果胶酶、互变异构酶、转移酶、激酶和 磷酸酶。在一些方法中，所产生的酶是为枯草杆菌蛋白酶的蛋白酶。
在一些方法中，当前的方法可用于比较例如生化物质(诸如烃或醇) 的产量。可产生的示例性烃或醇包括萜类化合物、半萜类化合物、单萜类 化合物、倍半萜类化合物、二萜类化合物、二倍半萜类化合物、丙二醇 (例如，1,3-丙二醇)、乙醇、或丁醇。在一些方法中，所产生的烃是异戊 二烯。
在一些方法中，比较生长速率和蛋白质、代谢物、或生化物质产量的 组合。可选择具有提高的蛋白质产量、代谢物产量、或生化物质产量同时 不降低生长速率的株系或条件。
本发明培养板在不同的孔中可掺入不同类型和/或不同浓度的化合物。 例如，培养板的不同孔可涂覆有不同的化合物和/或不同的浓度。还可通过 软光刻技术将不同的化合物掺入本发明培养板中，特别是在培养板由粘合 在一起的多个层或部分组成时。例如，各自包括单个孔的多个模具可用在 每个孔中包含不同化合物的聚合物制成，并且这些孔随后可粘合或固化在 一起而制成单个整体式微量滴定板。因此，本发明培养板可用于小分子药 物筛选、DNA微阵列、基因分析、细胞培养、单细胞分析、干细胞诱导和 干细胞分化。一些培养板将化合物的混合物包埋于一个或多个孔中。
本发明培养板可用于各种下游应用。例如，培养板可用于筛选、工艺 优化研究、培养基优化、培养基配方的添加剂筛选和检测、细胞系开发/克 隆、细胞培养优化、培养基添加剂优化、生物反应器条件、细胞建库、细 胞放大培养、转染、基因治疗、干细胞制备和研究、蛋白质表达、采样和 工艺开发。
适用于通过本发明方法培养的细胞包括细菌、酵母、真菌和高等真核 细胞诸如植物细胞或动物细胞。微生物细胞是优选的。
合适的酵母细胞包括酵母属物种(Saccharomyces sp.)、裂殖酵母属物种 (Schizosaccharomyces sp.)、毕赤酵母属物种(Pichia sp.)、汉逊酵母属物种 (Hansenula sp.)、克鲁维酵母菌属物种(Kluyveromyces sp.)、法夫酵母属物种 (Phaffia sp.)或假丝酵母属物种(Candida sp.)，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、白假丝酵母 (Candida albicans)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德毕赤酵 母(Pichia pastoris)、加拿大毕赤酵母(P.canadensis)、马克斯克鲁维酵母 (Kluyveromyces marxianus)和红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)。
合适的真菌细胞包括曲霉属(Aspergillus)(例如，米曲霉(A.oryzae)和 黑曲霉(A.niger))、酵母属物种(例如，酿酒酵母)、裂殖酵母属物种 (例如，粟酒裂殖酵母)和木霉属物种(例如，里氏木霉(T.reesei))。
合适的细菌细胞包括革兰氏阳性菌(例如，链霉菌属(Streptomyces)和 芽孢杆菌属)和革兰氏阴性菌(例如，大肠杆菌(Escherichia coli)和假单胞 菌属物种(Pseudomonas sp.))。例子包括芽孢杆菌属的菌株(例如，地衣芽 孢杆菌(B.lichenformis)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、乳杆菌属 (Lactobacillus)的菌株、链球菌属(Streptococcus)的菌株、泛菌属(Pantoea)的 菌株(例如，柠檬泛菌(P.citrea))、假单胞菌属的菌株(例如，产碱假单 胞菌(P.alcaligenes))、链霉菌属的菌株(例如，白色链霉菌(S.albus)、变 铅青链霉菌(S.lividans)、鼠灰链霉菌(S.murinus)、锈赤链霉菌(S. rubiginosus)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)或灰色链霉菌(S.griseus))、或埃 希氏菌属(Escherichia)的菌株(例如，大肠杆菌)。
合适的植物细胞包括来自蝶形花科(Fabaceae)，诸如蝶形花亚科 (Faboideae)的植物细胞，来自野葛(kudzu)、杨树(poplar)(诸如银白杨与欧 洲山杨的杂种(Populus alba x tremula)CAC35696或银白杨(Populus alba)) (Sasaki et al.,FEBS Letters 579(11):2514-2518,2005(Sasaki等人，《欧洲 生物化学学会联合会通讯》，第579卷，第11期，第2514-2518页，2005 年))、白杨(aspen)(诸如美洲山杨(Populus tremuloides))或英国栎 (Quercus robur)的植物细胞。
合适的藻类细胞包括绿藻、红藻、灰胞藻(glaucophytes)、绿蜘藻 (chlorarachniophytes)、裸藻(euglenids)、色藻(chromista)、或沟鞭藻类 (dinoflagellates)。
合适的古生菌细胞包括蓝细菌细胞，诸如根据形态分类为以下任何一 组的蓝细菌：色球藻目(Chroococcales)、宽球藻目(Pleurocapsales)、颤藻目 (Oscillatoriales)、念珠藻目(Nostocales)或真枝藻目(Stigonematales)。
合适的哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓 鼠肾(BHK)细胞、COS细胞、产单克隆抗体B细胞或得自例如美国典型培 养物保藏中心(American Type Culture Collection)的任何数量的其他无限增殖 化细胞系。
合适的昆虫细胞包括来自蛾(秋粘虫(Spodoptera frugiperda))的各种 品系等等，诸如Sf21和Sf9。
实例
实例1：缓释聚二甲基硅氧烷(PDMS)板的设计与构造
PDMS板的设计：在内部设计用于构建缓释PDMS弹性体板的96孔和 24孔模具。由合同供应商对设计进行绘图并使用计算机数控(CNC)加工来 制造。组装模具由4个主要部件组成。所设计的模具中的一个的示意图在 图1A中示出。孔柱附接至盖子、侧面、释放板和板的底部。在该实例中， 只示出了96个柱中的一个。除了释放板为不锈钢之外，整个模具由铝加工 而成。该模具使用螺钉装配。96柱和24柱模具的照片分别在图1B和图1C 中示出。
PDMS板的浇注：在将PDMS浇注在模具内之前，模具涂覆有5微米 的镍/特氟隆层。PDMS硅酮树脂弹性体184(PDMS Sylgard Elastomer 184) 是通过将硅氧烷基料与试剂盒中提供的固化剂结合而制成的。将两个部分 以约10:1的比率混合在一起，随后通过有机金属交联反应固化以形成 PDMS的固体件。
材料：道康宁硅酮树脂184有机硅密封剂(Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant)(货号：2065622，威斯康辛州日耳曼敦的安士澳粘合 剂公司(Ellsworth Adhesives,Germantown,WI))；VWR微机控制烘箱(VWR Microprocessor controlled oven)、1330GM(加利福尼亚州布里斯班的VWR 国际公司(VWR International,Brisbane,CA))；NUNC 1孔盘(未处理)， 127.8×85.5mm(纽约罗彻斯特的Nalge NUNC国际公司(Nalge NUNC International,Rochester,NY)，部件号：267060)；24孔和96孔模具(螺 钉、封盖、托盘、侧板)；干燥器；刮刀；铝箔(部件号：29952-172，加 利福尼亚州布里斯班的VWR国际公司)；天平；称量皿；53μ(目录号： 57334-484)和20μ筛(目录号：57334-494)(加利福尼亚州布里斯班的 VWR国际公司)；3M 444双面膜胶带(3M 444Double-sided Film Tape)(型 号：S-10085，伊利诺伊州沃基根的Uline公司(Uline,Waukegan,IL))；食 用乳糖H2O(细磨5020MFR080808，加利福尼亚州希尔马的希尔玛乳制品 公司(Hilmar Ingredients,Hilmar,California))；葡萄糖右旋糖H2O(葡萄 糖，伊利诺伊州韦斯切斯特的美国谷物公司(Corn Products US,Westchester, IL)，PN 020010-102)。
模具组件：将释放板插入96柱或24柱(又称“孔”)模具的基部。 使用螺钉将模具的侧壁附接到模具的底部。PDMS以约10:1的比率与固化 剂混合，并且以期望的浓度与糖混合。使用对于96孔板而言最终重量为 100g或对于24孔板而言最终重量为110g的PDMS、固化剂和糖。将糖和 PDMS混合物混合60秒，并在干燥器中脱气20-30分钟。将混合物倾注到 24孔或96孔模具中，并将该模具在干燥器中另外放置10-15分钟。将模具 板从干燥器中移除，并允许在室温下放置约10分钟直至所有可见气泡消 失。用螺钉将盖子固定在适当的位置，并且整个设备被包裹在铝箔中，并 且使其翻转以使盖子正面朝下。在其他情况下，在不使用盖子的情况下倾 注和固化模具。将板放置在60℃的烘箱4小时(最长至过夜)以使其完全 固化。固化之后，移除箔并拧下顶盖从而移除模具。通过使用刮刀将浇注 设备的侧面从基座拧下，从而使其移除。将释放板从浇注模具的底部升高 以使其离开孔柱。
PDMS板附接到对应的矩形NUNCTM塑料盘，并在使用之前密封。将 PDMS板置于冷冻箱(-20℃)中直至准备使用。
在一些情况下，使用包括凸起区域或“管路”的模具形成PDMS板， 所述凸起区域或“管路”被加工到板的底部上以在模塑部件中形成半通 道，用于将气体(诸如空气或氧气)从单个输入装置递送至所有孔(图 1D)。使用双面的高粘性丙烯酸胶带(明尼苏达州明尼阿波利斯的3M公 司(3M,Minneapolis,MN))将在PDMS-糖板底部上所得的空气通道密封， 以允许氧气经由空气管路充入生长中的培养物。
实例2：从PDMS微量滴定板的葡萄糖释放
用如实例1中描述的含有17.5％、20％或22.5％葡萄糖的PDMS浇注 24孔MTP。添加水(1mL)至板的每个孔，并在20、24、40、48和60小时 的时间点处从每个板中取出50微升的等分试样，并使用如下描述的ABTS 测定法测定葡萄糖浓度。在ABTS测定法中，使用葡萄糖标准品执行线性 曲线拟合。通过改变PDMS中的糖的百分比，可获得不同的释放速率。在 不同浓度下，释放速度保持线性(图2A)。
重复上述实验并在另外的时间点处测量。用如实例1中描述的含有 17.5重量％、20.0重量％、22.5重量％、或25.0重量％葡萄糖的PDMS浇注 24孔MTP。添加水(1mL)至板的每个孔，随后在37摄氏度下温育48小 时。在0、2、4、6、8、24和48小时处，取出50微升等分试样，并使用 下文描述的ABTS测定法测定葡萄糖浓度。在ABTS测定法中，使用葡萄 糖标准品拟合线性曲线(图2B)。通过多项式回归确定随时间推移的葡萄 糖浓度和释放速率。在48小时的时间点处达到葡萄糖的最大浓度，葡萄糖 浓度达到20.22g/L(17.5％时)、23.37g/L(20.0％时)、23.39g/L(22.5％ 时)和28.89g/L(25.0％时)。
用于葡萄糖测定的ABTS测定法：用于葡萄糖测定的ABTS(2,2'-联氮 双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))测定法基于在存在O2的情况下葡萄糖氧化 酶催化葡萄糖的氧化同时产生化学计量的过氧化氢(H2O2)的原理。该反应之 后为辣根过氧化物酶(HRP)催化的ABTS氧化，其与H2O2的浓度线性相 关。由绿色的演变指示氧化的ABTS的出现，其在OD 405nm处定量。在 50mM醋酸钠缓冲液pH 5.0中制备ABTS粉末(西格玛公司(Sigma)， #A1888-5g 2.74mg/mL)、0.1U/mL HRP(100U/mL，西格玛公司， #P8375)和1U/mL葡萄糖氧化酶(5379U/mL，![]()
)的混合物，并 保持在暗处(底物)。在50mM醋酸钠缓冲液pH 5.0中制备葡萄糖标准品 (0、2、4、6、8、10nmol)，将10μL各标准品一式三份地加到96孔平底 MTP中。将十微升连续稀释的样品也加到MTP中。向每个孔添加一百微升 的ABTS底物溶液，并将该板置于分光光度读板机上。在用含有2％SDS 的50mM醋酸钠缓冲液pH 5.0猝灭反应后，在温育15-30分钟之后，测量 作为终点读数的OD值。
实例3：缓释PDMS板中的芽孢杆菌属细胞的生长
将缓释PDMS板中的枯草芽孢杆菌细胞的生长与常规96孔MTP中的 枯草芽孢杆菌细胞的生长进行比较。枯草芽孢杆菌SC6.1(又称 BG3594comK)(DaprE,DnprE,degU.sup.Hy32,oppA,DspoIIE3501, amyE::xylRPxylAcomK-phleo)的表达绿色荧光蛋白的衍生物是通过用绿色荧 光蛋白(GFP)转化而形成的，该绿色荧光蛋白在启动子aprE后面，还包含 comK和氯霉素标记(PaprE:PtGFPcomK-cmp)。在常规培养基或在没有在含 有20％葡萄糖的缓释PDMS板中添加糖的相同培养基中，将SC6.1-GFP细 胞在37℃下以250rpm在培养基[基于MOP缓冲液的富集的半成分确定的培 养基，尿素作为主要氮源，葡萄糖作为主要碳源，并且补充有1％大豆胨用 于茁壮的细胞生长]中培养24小时和48小时。在生长之后，将板置于荧光 读板机(Spectramax，加利福尼亚州福斯特市分子仪器公司(Molecular Devices,Foster City,CA))上分析，按照释放的相对荧光测量GFP表达。已 经发现，在该板中培养48小时之后枯草芽孢杆菌细胞比在常规微量滴定板 中产生更多的GFP蛋白质(图3A)。
在18、23、40和47小时测量培养于常规微量滴定板(cMTP)或缓释微 量滴定板(srMTP)的另外三种芽孢杆菌菌株(A、B和C)的生长(图3B-图 3E)。这些菌株是SC6.1菌株的衍生物，均缺失comK。菌株B和菌株C 还具有突变，涵盖于USPTO申请号：#20110045571-分类：435221。在 24、48和72小时，测量另外的菌株(D，也称为BG8010)的生长。 BG8010是BG2942(ΔnprE,degU(Hy)32,amyE::PxylRA-comK-eryR)的衍生菌 株。除了BG2942的这些修饰，使用Cre-lox重组酶系统执行aprE和spoIIE 基因的缺失。通过在oppA基因座中引入腐草霉素标记来缺失opp操纵子。 所得的实验室菌株BG8010具有如下基因型ΔnprE,ΔaprE,degU(Hy)32, spoIIE312,oppA:phleoR,amyE::PxylRA-comK-eryR.(D)。
实例4：在缓释PDMS板中生长的芽孢杆菌属细胞的蛋白酶产量
使用如下所述的AAPF测定法，在生长18、23、40和47小时之后， 测量在常规(c MTP)或缓释(srMTP)微量滴定板中生长的芽孢杆菌属菌株 A、B和C的枯草杆菌蛋白酶表达(图4A-图4C)。
AAPF测定法：为了测定蛋白酶活性，对N-琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨 酰-L-脯氨酰-L-苯基-对硝基苯胺(suc-AAPF-pNA)的水解进行了测量。使用 的试剂溶液是：100mM Tris/HCl，pH 8.6，含有0.005％![]()
-80(Tris 稀释缓冲液)；100mM Tris缓冲液，pH 8.6，含有10mM CaCl2和0.005％ ![]()
-80(Tris/Ca缓冲液)；和DMSO中的160mM suc-AAPF-pNA (suc-AAPF-pNA储备溶液)(西格玛公司：S-7388)。为制备suc-AAPF- pNA工作溶液，将1ml suc-AAPF-pNA储备溶液添加至50ml Tris/Ca缓冲液 并反复混合。通过添加5μl的稀释培养物上清液至含有150μl Tris稀释缓冲 液的每个孔，随即添加100μL 2mg/ml suc-AAPF-pNA工作溶液来进行该测 定法。将溶液混合5秒，25℃下在MTP读板机中在405nm处读取动力学模 式的吸光度变化(2分钟内11个读数)。蛋白酶活性表示为405nm处的 AU吸光度。
实例5：通过在缓释PDMS板中生长的木霉属变体进行的玉米棒水解
在该研究中，研究了通过在不同格式中生长的木霉属变体从预处理的 玉米棒中释放的葡萄糖。
根据PCT/US2010/049849、公开为WO/2011/038019的描述制备H3A 整合型里氏木霉表达菌株的突变幼殖体并进行修饰以包含含有cbh1启动子 的额外拷贝和潮霉素抗性标记的GFP表达盒(pcbh1:gfp:hph)，根据GFP表 达进行分选。将来自每个GFP表达库的独立幼殖体分选到微量滴定板的孔 中(每孔一个幼殖体)，使幼殖体在含有2.4％乳糖的甘氨酸基本培养基中 在氧气腔室中生长(cMTP)，或者在缓释微量滴定板(20重量％乳糖)的基 本培养基中在氧气腔室中生长(srMTP)。所有板在28℃下生长大约170小 时。
在温育之后，测定来自所有培养物的上清液的葡萄糖，所述葡萄糖从 稀氨水预处理的玉米棒释放(根据WO061109所述的方法与处理范围，在 水解之前对玉米棒进行预处理)。以每孔7％纤维素固体底物，向70mg稀 氨水预处理的玉米棒中添加二十微升的培养上清液和60μl的50mM醋酸钠 缓冲液pH 5.0。将测定板在室温下温育10分钟。用铝质封板膜覆盖该测定 板，并且将该板在50℃、200rpm下温育三天。在温育期结束时，通过向每 个孔测定添加100μl的100mM甘氨酸缓冲液pH 10.0猝灭糖化反应，并且 使板以3000rpm离心五分钟。通过实例2描述的ABTS测定法，测定十微 升上清液的释放的葡萄糖。结果示于图5中。
实例6：通过在缓释PDMS板中生长的木霉属菌株进行的葡糖淀粉酶 表达
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)比较在含有20％乳糖(重量/重量)的 PDMS srMTP的确定成分培养基中生长或在常规微量滴定板的含有2.4％乳 糖(重量/体积)的确定成分培养基中生长的木霉属菌株(美国专利No. 5,847,276&7,919,299)的葡糖淀粉酶表达。将在28℃、250rpm下生长约 96小时的菌株的等体积培养上清液在90℃经受还原环境15分钟，然后添 加上样染料，并在4-12NuPageTM(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司 (Invitrogen,Carlsbad CA))聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。凝胶用 SimplyBlueTM(英杰公司(Invitrogen))染色并成像(图6)。
实例7：在缓释PDMS板中生长的大肠杆菌的生长量和异戊二烯产量
介绍：我们项目期望在严密复制14L(又称生物反应器分批补料)发 酵中施加的葡萄糖受限缓慢生长条件的条件下对大肠杆菌菌株进行小规模 培养和研究。要产生所需条件以便监测我们增加数量的所关注大肠杆菌菌 株的相关高细胞密度行为，14-L发酵过于昂贵和费时。具体地讲，需寻找 在经过较快的葡萄糖过量指数生长之后，允许相对高细胞密度(在600nm 处测得>10)和较缓慢的葡萄糖受限生长的条件。
所关注的观察结果是菌株REM H8_12在14-L发酵的缓慢生长期期间 相较于菌株REM F2_18显示出降低的异戊二醇产量水平，其中两种菌株在 指数生长期期间均产生较高和较类似水平的异戊二烯(参见提交于2010年 12月22日的美国临时专利申请No.61/426,505)。我们试图以小规模调查 这一行为，但目前受限于所采用的小规模分批条件。使用本文描述的缓释 葡萄糖24孔板以尝试并实现允许更类似于14-L细胞密度并且目前分批条 件所不支持的较高细胞密度(在600nm处测得>10)，以及在较快的葡萄糖 过量指数生长之后允许较慢的葡萄糖受限生长的生长条件。
在这里展示了来自对大肠杆菌菌株REM H8_12、REM I4_18和REM F2_18进行的3个实验中的一个的结果，并且旨在反映缓释葡萄糖24孔板 在实现所期望的小规模条件上的成功。此外，显示了异戊二烯产量数据， 以展示在缓释葡萄糖24孔板内温育44小时之后细胞仍具有活力并且产生 异戊二烯。类似于14-L结果，观察到菌株REM H8_12在较慢生长期期间 比REM F2_18菌株产生更少的异戊二烯。我们根据所示的结果认为在较慢 的葡萄糖受限生长期期间14-L发酵中REM I4_18菌株可能表现得更类似于 REM F2_18菌株而不是REM H8_12菌株。发现确实如此。
在小规模内筛选该类型行为的菌株的能力将有助于选择能进一步推进 为大规模14-L发酵的菌株，还提供研究该行为和影响该行为的因素的机 会。14-L的该小规模替代形式提供了一次评估多个菌株和/或培养基条件的 机会，与进行14-L发酵相比其还另外节省了时间和金钱。
方法：使细胞在3ml培养物中在30℃下在用0.1％酵母提取物和1.0％ 葡萄糖补充至最终浓度的TM3液体培养基(参见TM3的描述，例如，美 国专利申请No.:12/335,071和PCT/US2008/086809)中过夜生长。在适当 的时候，将卡那霉素(Kan)和/或羧苄青霉素(Carb)和/或壮观霉素(Spec)各以 50μg/ml添加至生长培养基。菌株REM H8_12在Pct.国际公开No.WO 2010/148150A1中有所描述并且具有Carb、Spec和Kan抗性；菌株REM F2_18在2010年12月22日提交的美国临时专利申请No.61/426,505中有所 描述并且具有Carb、Spec和Kan抗性；菌株REM I4_18除了不具备附加的 Spec抗性GI1.6fldA-ispG/pCL构建体之外，具有与菌株REM F2_18相同的 基因型(详见2010年12月22日提交的美国临时专利申请No. 61/426,505)并且具有Carb和Kan抗性。
早上，将培养物在5ml新鲜TM3液体培养基内稀释到600nm处测得 为大约0.4至0.6的光密度(OD)，所述新鲜TM3液体培养基包含最终浓度 为0.1％的酵母提取物、1.0％的葡萄糖和25μM的IPTG以及适当的抗生 素。使细胞在30℃下生长大致2.5小时，然后通过在15ml Falcon管中于室 温下以5,000rpm离心10分钟收获细胞。(Eppendorf离心机5840R 15amp 型)。弃去所得的上清液并且将细胞沉淀悬浮在160μl的TM3液体培养基 中，所述TM3液体培养基包含无葡萄糖的0.1％酵母提取物(达到180μl的 最终细胞悬浮液的体积)。将3μl、12μl、24μl和48μl的每个培养物接种 到17.5％葡萄糖缓释24孔板(重量/重量)的2个单独的孔中(允许对4个 接种物中的每个进行工艺平行测定；具有4个接种物的3种菌株各一式两 份，共计24个孔)，该24孔板已经用1.2ml TM3液体培养基预温育大约 20小时，所述TM3液体培养基在每个孔中包含无葡萄糖的0.1％酵母提取 物和适当的抗生素，将该24孔板在ATR公司(ATR Inc.)的型号AJ150培养 箱内的EnzyScreenTM盒内以250rpm在30℃下振荡。紧接着之前的接种，向 24孔中的每一个添加最终浓度为200μM IPTG和附加的50μg/L羧苄青霉 素。在2天的过程中，通过OD监测细菌的生长(图7A-图7C)。
在倒数第二个时间点(大约44小时)处，测定3μl接种孔中每一个的 异戊二烯的单位产量(图7D)。异戊二烯的单位产量的计算和用于对其进 行测定的方法可见于US20110046422。
实例8：cMTP和srMTP之间的葡糖淀粉酶活性比较
评估该里氏木霉菌株在cMTP和srMTP的条件之间的葡糖淀粉酶活性 (图8)。所用的培养基包含2％或4％的分批糖。使菌株在250RPM、5cm 摆度、28℃、85％湿度下在振荡培养箱中总共生长8天。对于两个时间点， 从每个孔(共8个孔)中取出200μl样品并且放入96孔滤板中。
对于葡糖淀粉酶测定，过滤后的上清液随后用100mM醋酸钠缓冲液 pH 4.3稀释5倍。其中20μl加入到100μl底物溶液并且在室温下温育10分 钟。通过添加硼砂终止缓冲液pH 9.2终止该反应，并在405nm的OD处分 析。将该活性与已测量活性的标准品进行比较。根据每个条件对所有8个 孔取平均值。
除了cMTP 4％分批糖之外(其含糖量是其他条件的两倍)，所有培养 基组分在上述3个条件之间是相同的。cMTP 2％分批糖和srMTP 2％分批糖 条件相同，并且差异仅在于板的类型。srMTP由20％乳糖(重量/重量)和 PDMS制成。
与两种cMTP条件相比，srMTP显示葡糖淀粉酶活性增加。与cMTP 2％分批糖相比较，其活性增加大约8倍；并且与cMTP 4％分批糖相比较， 其活性增加了近2倍(图8)。
实例9：cMTP和srMTP之间的蛋白质产量比较
该实例描述了一些筛选数据，从而比较一个实例(图9A)的总分泌蛋 白和另一个实例(图9B)的GFP。在这种情况下，亲本菌株是LVS GFP， 其经过诱变处理，在分批补料发酵罐(生产环境)中生长，并且然后根据 高GFP表达进行FACS分选。将单个变体分选到常规96W板中并在其中进 行培养，并且测量GFP、总蛋白和酶活性。然后将最佳候选物并行转移至 常规24W板和控释(乳糖)板并与对照组(LVS Hemi是祖系亲本(grand- parent)菌株，LVS GFP是亲本菌株(即，未筛选的)，LVS GFP是在cbh1 启动子上具有GFP的LVS hemi)一起培养6天。变体包括P9A9、P9H4、 P4B11、P9H9、P3A8和P2H1。当候选物在控释格式中生长时，观察到亲 本和变体之间的更显著的差异(图9A-图9B)。
实例10：分批补料发酵罐和控释MTP之间的相关性
在48小时内将具有预定单位产量(每克干细胞重量每小时产生的蛋白 质的克数)的里氏木霉的六个菌株与24孔、20％乳糖(重量/重量)PDMS 板的4个平行测定孔的平均值相比较(图10)。通过缩二脲测定法测定蛋 白质浓度并与已知标准品相比较。使用Minitab软件测定皮尔森相关值。
为了确定在控释微量滴定板中产生的总蛋白与分批补料发酵罐中的单 位产量之间的相关程度，选择六种木霉属菌株(“A”、“B”、“C”、 “D”、“E”、&“F”)。计算分批补料发酵罐的特定进料速率值。每 隔大约4小时从六种试验菌株的生长培养物中取出发酵肉汤，并且测定总 蛋白质和干细胞重量。使用缩二脲测定法在Konelab化学分析仪(马萨诸 塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific,Waltham,MA))上 测定总蛋白质浓度(克每升)。缩二脲测定法的原理如下：在碱性条件下 铜离子和蛋白质分子的反应产生显色反应。血清蛋白与Cu+2离子形成紫色 复合物。当与已知浓度的标准品比较时，该颜色的强度与样品中蛋白质的 量成比例。简而言之，Konelab仪器以适当的比率结合发酵肉汤和总蛋白试 剂(目录号T7528，波音特科技公司(Pointe Scientific Inc.))。将读数与已 知标准品(总蛋白标准品，目录号T7528-STD)相比较，以测定蛋白质浓 度。通过使用OmnimarkμWave仪器(纽约波西米亚的赛多利斯公司 (Sartorius,Bohemia,NY))在滤纸上干燥2.5g发酵肉汤来测定干细胞重量。 简而言之，涡旋肉汤样品并称取2.5g到50mL试管中，并且随后转移至4 英寸的玻璃-石英过滤垫，短暂地真空干燥，同时用20mL去离子水冲洗。 将包含部分干燥的发酵肉汤的石英垫进行干燥，并且在Omnimark仪器上称 重。通过该仪器得出干细胞重量(克)，然后通过将最终重量乘以 1000g/mL再除以2.5g来换算成克每升。
对于控释微量滴定板样品，使用无菌棉拭子将六种示例性菌株的孢子 从培养板转移至发酵培养基。将体积为1.25mL的培养基和孢子一式四份地 加入到20％乳糖控释MTP的孔中。在固定的时间点处，取出100μL的发酵 肉汤以便使用上述相同的试剂(波音特科技公司)进行缩二脲测定法。对 于控释MTP样品，使用Hamilton Microlab Star自动处理工作站将发酵肉汤 和总蛋白标准品与总蛋白试剂结合。
使用Minitab软件(版本16，Minitab公司，宾夕法尼亚州州立大学 (Minitab,Inc.,State College,PA))中的相关性函数计算在各个时间点(上述 实例中只示出了48小时时间点)处的分批补料发酵中的单位产量和总蛋白 之间的相关性统计值，所述Minitab软件报告皮尔森积矩相关系数，其中值 为1表示完全相关。
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